JPH09503642A - プロリンイミノペプチダーゼ、その生産方法並びに食品組成物の風味付けに対する使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７から得られ、計算上の分子量が４５ｋＤａの金属依存性セリンペプチダーゼ活性を示す新規プロリンイミノペプチダーゼ。当該プロリンイミノペプチダーゼは図３のユニークな配列のアミノ酸配列を有する。６０％を超える相同性を示し、かつ同一の機能を有する遺伝的変異体も本発明に包含される。当該プロリンイミノペプチダーゼは、遺伝子改変微生物を使用して大量に生産することができる。このプロリンイミノペプチダーゼは、食品の風味改良、特に食品の苦味の低減に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 プロリンイミノペプチダーゼ、その生産方法 並びに食品組成物の風味付けに対する使用 本発明は、プロリンイミノペプチダーゼ、その生産方法並びに食品組成物の風 味改良に対する使用に関する。 発明の背景 プロリンイミノペプチダーゼ（ＥＣ ３.４.１１.５）は、タンパク質又はポリ ペプチド鎖からのＮ末端プロリン残基の遊離を触媒する活性をもつという共通の 性質をもった酵素群に対して用いられる総括名称である。触媒という用語は、こ こでは、酵素不在下ではプロリンの遊離が起こらず、その過程において酵素が変 化しないことを意味する。 プロリンイミノペプチダーゼは動物、植物（キノコ類、アプリコット種子など ）及び微生物など様々な生物で発見されており、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ やＢａｃｉｌｌｕｓやＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの細菌だけでな く、哺乳類（ブタ腎）でもその存在が確認されている。それら本来の起源である 生体中では、プロリンイミノペプチダーゼはごく少量しか産生されず、何等の実 用性ももたない。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍは産業上重要な細菌であ ってスイスチーズの製造に用いられている。 （Ａ） Ｌａｉｔ(１９９０)，７０，４３９-４５２には、プロリンイミノペプチ ダーゼの、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ １３６ ７３株（私的保存菌株）の細胞抽出液からの精製及び同定について記載されてい る。Ｍ_Rは６１ｋＤａであり、至適活性は４０℃及びｐＨ８.０である。 （Ｂ） Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．(１９７８)，６１，３０３-３０８には、Ｐｒ ｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉＰ-５９株をペプチド添 加培地で培養すると大量のプロリンを生ずることが開示されている。 （Ｃ） 特開平２-１１３８８７号公報には、プロリンイミノペプチダーゼ産生菌 株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株由来のＤＮＡフラグ メントのクローンバンクとの相同的形質転換に付したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの菌株を培養することによって、プロリンイミノペプチダーゼを生産す る方法が記載されている。選出されたプロリンイミノペプチダーゼ産生形質転換 株は元の菌株よりもかなり大量のプロリンイミノペプチダーゼを産生した。 （Ｄ） 特開平３-１０８４８３号公報には、キノコ類で見出だされたＭ_Rが１５ ０ｋＤａ（二量体）で等電点がほぼｐＨ４．３のプロリンイミノペプチダーゼが 記載されている。至適活性はｐＨ７.２付近にある。この酵素はフェニルメチル スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で阻害されない。この文献には、タンパク加 水分解物の苦味が含プロリンペプチドによって引き起こされると考えられ、プロ リンの除去が有効であると考えられると記載されている。このキノコ酵素はＮ末 端プロリンを取り除く。苦味ペプチドが分解され、加工タンパクの苦味が除去さ れた。 （Ｅ） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ(１９９２)，１７４，７９１９-７９２５ には、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ由来のプロリンイミノペプチダーゼ（Ｍ_R＝３３ ｋＤａ）の遺伝子のクローニング、配列決定及び発現について開示されている。 宿主生物はＥ．ｃｏｌｉ株である。 食品組成物にプロリンイミノペプチダーゼを存在させると風味が改良されるこ とが示されている。この酵素はスイスチーズ、特にエメンタールチーズに微かな 甘味をもたらすといわれている。そのうえ、この酵素は加工タンパク質中の苦味 を取り去ることができる。しかし、これらの様々なプロリンイミノペプチダーゼ は物質としては異なるものであって、共通の酵素活性を有しているに過ぎない。 さらに、これらのプロリンイミノペプチダーゼは、各々に固有の官能的性質の変 化に富んだ側面を含め、各々独自の性質を有している。各々のプロリンイミノペ プチダーゼを食品に添加したときの食品の風味（フレーバー）に対する寄与の仕 方はそれぞれに独自であり、チーズの熟成に関与する微生物から分泌されるペプ チダーゼによってチーズの風味が形成される過程と極めて類似した過程である。 したがって、新規プロリンイミノペプチダーゼ並びにそのようなプロリンイミノ ペプチダーゼを大量に利用可能にできるようにするための方法に対するニーズが 存在する。 発明の開示 本発明は、金属依存性セリンペプチダーゼ型のプロリンイミノペプチダーゼ活 性をもつ新規ポリペプチドにして、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈ ｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７株から得られる計算上の分子量が４５ｋＤａ のプロリンイミノペプチダーゼの少なくともプロリンイミノペプチダーゼ活性を 担うアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド又はプロリンイミノペプチダーゼ活 性を保持した当該アミノ酸配列の誘導体を含んでなるポリペプチドを提供する。 本発明は、さらに、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドに して図３及び配列番号：３に示すユニークなアミノ酸配列に基本的に一致したア ミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、又はその誘導体にして当該誘導体のアミ ノ酸配列と上記ユニークなアミノ酸配列との間の相同性の高さが６０％を超える 、好ましくは７５％を超える、さらに好ましくは９０％を超える誘導体を提供す る。本発明のポリペプチドは好ましくは食品中での使用に適した食品グレードの ポリペプチドである。図３のアミノ酸配列に一致したポリペプチド又は図３のア ミノ酸配列と６０％を超える相同性を示すその誘導体は、好ましくは金属依存性 セリンペプチダーゼでもある。特に、本発明のポリペプチドはフェニルメチルス ルホニルフルオリドに対して感受性である。このようなプロリンイミノペプチダ ーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（本明細書中ではｐ ｉｐ遺伝子と称する）も本発明の一部をなす。このようなプロリンイミノペプチ ダーゼ活性をもつポリペプチドを産生し得る遺伝子改変微生物並びにプロリンイ ミノペプチダーゼ活性をもつ上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を 保有する微生物から得られる子孫も本発明の一部をなす。本発明のもう一つの実 施態様は、プロリンイミノペプチダーゼ活性をもつポリペプチドを生産するため の方法にして、適当な増殖培地中で上記微生物を増殖させ、任意段階として上記 微生物の細胞を破壊した後、発酵培地から酵素を回収することを含んでなる方法 である。 本発明のさらに別の実施態様は、食品組成物の風味を改良する方法にして、 当該食品組成物又はその成分を、本発明のポリペプチドのプロリンイミノペプチ ダーゼ活性の作用下或いはかかるプロリンイミノペプチダーゼ活性をもつポリペ プチドを産生する食品グレードの微生物の酵素活性の作用下におくことを含んで なる方法である。本発明の別の実施態様は、食品組成物にして、当該食品組成物 自体又はその成分を本発明のプロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリペプ チドの活性にさらしておいた食品組成物、或いはプロリンイミノペプチダーゼ活 性をもつポリペプチド又は本発明の遺伝子改変微生物を配合した食品組成物であ る。 発明の詳細 今回発見したプロリンイミノペプチダーゼは細胞内酵素であって、その本来の 起源生物であるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ Ａ ＴＣＣ９６１７株からは微量でしか得られない。本発明は、遺伝子改変した好ま しくは食品グレードの微生物を利用して、当該プロリンイミノペプチダーゼを実 用的見地からみて十分大量に入手できるようにする方法を提供する。本発明は、 また、このプロリンイミノペプチダーゼの機能的に等価なポリペプチド、すなわ ち、今回発見したプロリンイミノペプチダーゼの少なくともプロリンイミノペプ チダーゼ活性を担うアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドにも関する。 今回発見した酵素は計算上の分子量が４５ｋＤａであって、図３及び配列番号 ：３に示すユニークなアミノ酸配列で特徴付けられる。この酵素はその至適活性 がｐＨ７.５及び４０〜４５℃にある。この酵素は金属依存性セリンペプチダー ゼであって、その活性は金属キレート化合物及びフェニルメチルスルホニルフル オリドによって低下する。プロリンイミノペプチダーゼ活性をもつポリペプチド にして図３及び配列番号：３のユニークなアミノ酸配列に基本的に一致したアミ ノ酸配列を含んでなるポリペプチド、又はその誘導体にして当該誘導体のアミノ 酸配列と上記ユニークなアミノ酸配列との間の相同性の高さが６０％を超える、 好ましくは７５％を超える、さらに好ましくは９０％を超える誘導体も、本発明 の範囲に含まれる。 図３及び配列番号：３には、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒ ｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７から得られるプロリンイミノペプチダー ゼをコードするＤＮＡ配列を単離して決定した配列も記載されている。 本発明には、上述の本発明のプロリンイミノペプチダーゼ活性をもつポリペプ チドをコードするすべてのＤＮＡ配列が包含される。 宿主細胞の優先コドン使用頻度に適合したコドンの異型遺伝子を採用したほう が都合のよい場合もあることは当業者には明らかであろう。したがって、別の同 義語コドンが使われたＤＮＡ配列も本発明の範囲に含まれる。 その「配列に基本的に一致したアミノ酸配列」とは、上記のユニーク配列によ る酵素の機能的性質を保持した遺伝的変異体を包含した意味で用いられる。遺伝 的変異体は、図３に示すアミノ酸配列に対して、当該ポリペプチドの機能（すな わち、プロリンイミノペプチダーゼ活性）に実質的な悪影響を与えない改変を加 えたものである。これには、アミノ酸配列の改変によってポリペプチドの機能が 改良される可能性も含まれる。したがって、本発明の範囲は、図３のユニークな アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列だけでなく、異なるアミノ酸配列で はあるがプロリンイミノペプチダーゼ活性を依然として発揮し得るアミノ酸配列 （すなわち、上記で定義されるポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列に も及ぶ。 プロリンイミノペプチダーゼのアミノ酸配列群と図３に示すユニーク配列との 間の相同性の高さ（アミノ酸配列の類似性のパーセンテージ）を決定するための 普及法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの標準アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏ ｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３-４４５，１９７０）である。類似性パーセンテー ジの計算には「Ｇａｐ」と呼ばれるコンピュータープログラムを好適に使用する ことができる。このプログラムはＧ.Ｃ.Ｇ.から出されている配列解析ソフトウ ェアパッケージ（ヴァージョン６.１）の一部をなす（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ他(１９ ８４)，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.，１２，３８７-３９５も参照され たい）。 本発明には、図３及び配列番号：３に示すユニークなアミノ酸配列との相同性 の高さが６０％を超える、好ましくは７５％を超える、さらに好ましくは８５％ を超える、最も好ましくは９０％を超えるプロリンイミノペプチダーゼも包含さ れる。 本発明のもう一つの態様は、プロリンイミノペプチダーゼ活性をもつポリペプ チドを産生し得る遺伝子改変微生物にして、本発明のプロリンイミノペプチダー ゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を保有する微生物に関 する。そのコード化ＤＮＡ配列は発現ベクター（例えばプラスミド）に存在する か、或いは染色体に組込まれた形で存在する。プロリンイミノペプチダーゼ活性 をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の片側又は両側に宿主生物中 での当該遺伝子の発現を実現可能又は促進するようなヌクレオチド配列が位置し ていてもよい。一般に、プロリンイミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド 配列は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ-ＤＮＡ）であって、そのｄｓ-ＤＮＡのプラス鎖の５ ′末端の前にはフレーム（トリプレットの枠）の一致した翻訳開始コドンが位置 していてその翻訳開始コドンの上流には発現レギュロンが位置しており、一方ｄ ｓ-ＤＮＡのプラス鎖のコーディング領域の３′末端の後には翻訳終止コドンが 位置しており、場合によってはその後に転写終結配列が続いていてもよい。好ま しくは、微生物中のプロリンイミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列 の前に、微生物の増殖する培地中にプロリンイミノペプチダーゼを分泌させるの に有効なシグナルペプチドをコードする配列がある。そうすると生成物の回収が 簡単になり、菌体が連続的に所望ポリペプチドを生産できるようになる。分泌ポ リペプチドについては幾多の配列が当業者に知られている。 プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を宿主生物の細胞に導入し発現させるため に、コーディング配列を好適なベクター、いわゆる組換え発現ベクターに挿入し てもよい。次に、上記プロリンイミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド配 列を含んだ組換えベクターを宿主微生物中に導入すると、当該微生物は上記プロ リンイミノペプチダーゼを発現できるようになる。 ベクターは、宿主細胞中で独立した遺伝因子として存続するプラスミドであっ てもよい。或いは、このコーディング配列は、細胞内に入った後でその微生物の 染色体ＤＮＡに組込まれてもよい。このようにコーディング配列が組込まれると 、プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子は容易には失われなくなるの で、その形質転換微生物が同様のプロリンイミノペプチダーゼ産生能をもつ子孫 を何世代にもわたって生じるという効果を有する。 したがって、プロリンイミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列のフ ランキングＤＮＡは、そのプロリンイミノペプチダーゼをコードするヌクレオチ ド配列の宿主ゲノム中への組込みを助長するようなヌクレオチド配列を含んでい るのが都合がよい。 こうした配列の具体例は、Ｍａｙｏ他(１９９１)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ ．Ｍｉｃｏｒｏｂｉｏｌ．５７，３８-４４に記載されているＸ-プロピル-ジペ プチジルアミノペプチダーゼをコードする遺伝子（ｐｅｐｘｐ）のフラグメント であり、この場合、組込み体はＧｌｙ-Ｐｒｏ-ＢＮＡを用いた平板検定によって 容易に検出することができる（Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ他(１９９１)，Ｊ．Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌｏｇｙ，１２３，４７９４-４７９８）。ベクターは適宜少なくとも １種類のマーカー遺伝子を含んでいてもよく、そのマーカーとしては抗生物質に 対する耐性又は好ましくは食品グレードの天然バクテリオシンに対する耐性を微 生物に与えるようなタンパク質が可能である。ただし、栄養要求性マーカー配列 を使用するのがさらに好ましい。栄養要求性マーカー配列として好適なものの具 体例には、炭水化物代謝に関与する酵素群をコードしたＤＮＡ配列、特に、ラク トースやスクロースやラフィノースのような糖類の代謝に関与する酵素、例えば ホスホ-β-ガラクトシダーゼ及びα-ガラクトシダーゼをコードしたＤＮＡ配列 が包含される。このようなＤＮＡ配列は食品グレードの微生物から得るのが好ま しい。このような栄養要求性マーカーの好適な具体例は欧州特許第０３５５０３ ６号に記載されている。 本発明には、直接形質転換された微生物だけでなく、その子孫も包含される。 ただし、本発明のプロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子がその子孫に 受け継がれていることを条件とする。形質転換プロセスは、それまでプロリンイ ミノペプチダーゼを生産することのできなかった微生物をプロリンイミノペプチ ダーゼ産生微生物へと形質転換するのに使用することができる。また、形質転換 プロセスは、既にプロリンイミノペプチダーゼを生産できていた微生物のプロリ ンイミノペプチダーゼ活性を増大させるのに使用することもできる。適当な微生 物中での本遺伝子の発現が実現されると、当該微生物は通例従来の発酵技術で繁 殖させることができる。 本発明には、上記プロリンイミノペプチダーゼ活性をもつポリペプチドを産生 し得る微生物も包含される。このような微生物には、上記で定義した組換え体の 導入された宿主微生物並びにかかる微生物の子孫が包含される。宿主微生物には 、細菌、菌類及び酵母が包含される。好適な微生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。食品グレードの微生物、特に乳酸菌が好ましい。好ましくは、 本発明の微生物は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ 、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂ ａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅr、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＺｙｍｏｍｏｎａｓ属から選択される。 本発明のさらに好ましい実施態様では、微生物はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔ ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏ ｃ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｓｐ ｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属から選択される。 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓが最も好ましい種である。本発明の別の 実施態様では、微生物は酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ株である。 形質転換された宿主を増殖培地中で適当な条件下で増殖させると、プロリンイ ミノペプチダーゼが発現されるはずである。生産されるプロリンイミノペプチダ ーゼの量は、増殖培地の温度、組成及び通気量によってかなり影響される。一般 に、増殖培地は普通の培地であって、主に、水、炭素源、窒素源、無機イオン類 からなり、必要に応じてアミノ酸を含む。培地は、プロリンイミノペプチダーゼ （ｐｉｐ）遺伝子の発現の最適な誘導に何が必要とされるかに応じて、微生物の 至適増殖又は限定増殖又は微生物の単なる維持というそれぞれの目的に適した培 地を選択し得る。 酵素を含んだ溶液は、例えば宿主菌体の破砕（超音波処理などによる）及び菌 体残渣の遠心などによって得ることができる。 上清のプロリンイミノペプチダーゼ活性は、実施例１及び実施例４に記載の方 法にしたがって、プロリン-ｐ-ニトロアニリドについての加水分解活性を測定す ることによって調べることができる。表Ｉは、本来の起源生物であるＰｒｏｐｉ ｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７株と本発明 の形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株の上清の活性を示したものであり、一方、表IIは本発 明の形質転換Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株の上清の活性を示したも のである。本来の起源生物がプロリンイミノペプチダーゼ産生菌としては非常に 非効率的であって、本発明の微生物の７分の１程度のプロリンイミノペプチダー ゼ活性しか生じないことが分かる。さらに、本来の起源微生物の増殖は非常に遅 く、定常期に達するまでに３〜４日を要するのに対して、本発明の形質転換Ｅ． ｃｏｌｉ又はＬ．ｌａｃｔｉｓ株では１６時間以内に最大増殖（ｆｕｌｌ ｇｒ ｏｗｔｈ）に達する。 さらに好ましい実施態様では、プロリンイミノペプチダーゼ構造遺伝子に先行 するＤＮＡの中の有効なシグナル配列の存在によって、上記酵素を増殖培地中に 直接分泌し得る微生物を用いる。 この酵素は、所望に応じて、当業者に公知の１段階以上の精製工程によってあ る程度まで精製し得る。或いは、粗上清又は組換え微生物をそのまま使用するこ ともできる。 本発明のプロリンイミノペプチダーゼは主に食品組成物の処理に向けられる。 プロリンイミノペプチダーゼを産生する従来の微生物は食品グレードものでない か、或いはプロリンイミノペプチダーゼを能率的に生産できないもののいずれか であった。今回、食品グレードのプロセスで大量のプロリンイミノペプチダーゼ を得ることができるようになった。 食品組成物とは、その製造に使用される複数の食材からなるもので、人間の食 用に適しかつ食用のための食品を意味する。 本発明の別の態様によれば、プロリンイミノペプチダーゼは食品組成物の風味 の改良に使用される。これは、食品組成物又はその成分を、本発明のポリペプチ ドのプロリンイミノペプチダーゼ活性の作用下或いは本発明の食品グレードの微 生物の細胞溶解物の酵素活性の作用に付すことによって達成される。 もっと詳しく述べると、食用組成物を適当な条件下で本発明のプロリンイミノ ペプチダーゼに付すと、加工タンパク質含有食品に存在する苦味（Ｎ末端プロリ ン残基を有する加水分解タンパク質又はペプチドに由来する苦味）を消去又は低 減することができる。タンパク加水分解物の添加された食品組成物（例えば乳児 用食品、スポーツ食品及びダイエット食品など）は、有効に、苦味の少ないもの にすることができる。或いは、タンパク加水分解物自体を苦味の少ないものにす ることができる。本発明のプロリンイミノペプチダーゼの苦味低下特性の官能的 評価法のない場合、前述のＮ末端プロリン残基の除去と苦味の低下との関係から 、Ｎ末端プロリン残基の放出を測定することが最適の次善策であると考えられる 。 本発明のプロリンイミノペプチダーゼは新規物質であるので、食品組成物に配 合するとその組成物に予想外の官能的性質を与える可能性がある。 本発明は、特に、例えばチーズやクォークのような微生物カゼイン又はカゼイ ネートを含有する製品で、当該微生物が本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺 伝子を保有しているような製品の製造に使用することができる。 本発明には、本発明のプロリンイミノペプチダーゼの活性にさらしておいた食 品組成物、或いは本発明のプロリンイミノペプチダーゼ又は本発明の食品グレー ドの微生物（好ましくは乳酸菌）を配合した食品組成物も包含される。 パンのような小麦粉ベークト製品の焼き上り際の心地好い風味は、ベーキング 中の揮発性フレーバー成分の形成によるものである。このようなフレーバー成分 はベーキングの過程において様々な前駆体から形成され、アミノ酸及び遊離糖類 として同定されている（Ｓｐｉｃｈｅｒ，Ｇ.及びＮｉｅｒｌｅ，Ｗ.(１９８８) ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.，２８，４８７-４９ ２）。ベーキングの過程で、これらのアミノ酸及び還元糖が前駆体として相互作 用して、特徴的なパン風味をもった各種のメイラード（Ｍａｉｌｌａｒｄ）中間 体を形成する。サワードゥ発酵の際に生成する遊離アミノ酸の量を高めると、パ ンの風味に貢献する。これに関してプロリンは重要なアミノ酸の一つであると 同定されている。プロリンとグルコースの反応は２-アセチル-１−ピロリンの形 成を導くが、この２-アセチル-１-ピロリンは精白パン（ホワイトブレッド）及 びパン皮の最も重要な揮発性成分として同定されている（Ｓｃｈｉｅｂｅｒｌｅ Ｐ.及びＧｒｏｓｃｈ，Ｗ.(１９８５)，Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ．Ｕｎｔｅｒｓ．Ｆ ｏｒｓｃｈ．１８０，４７４-４７８）。模擬パン作成系でプロリン濃度を高め ると、パン皮の色調及びパンのフレーバーが改善された（Ｆａｄｅｌ，Ｈ.Ｈ.Ｍ .及びＨｅｇａｚｙ，Ｎ.Ａ.(１９９３)，Ｄｉｅ Ｎａｈｒｕｎｇ ３７，３８６ -３９４）。プロリンイミノペプチダーゼの作用によって小麦粉ドゥの中の遊離 プロリンの量を増加させると、パンその他のドゥ発酵製品のフレーバーが改善及 び／又は高めることができるはずである。 したがって、別の実施態様では、プロリンイミノペプチダーゼを、ドゥから作 られる食品組成物（例えばパン）のフレーバーを高めるために使う。これは、プ ロリンイミノペプチダーゼをコードする配列が導入されていてプロリンイミノペ プチダーゼを発現し得る酵母（特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ株）でドゥを発酵させることによって達成し得る。勿論本発明のその他 の食用微生物も使用することができるが、酵母は既にドウに使われているので、 これがすこぶる適した微生物であると思われる。 図面の説明 図１及び配列番号：１は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍ ａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７株から単離した精製プロリンイミノペプチダーゼの 、気相シークエンサーで決定したＮ末端側アミノ酸配列を示す。 図２及び配列番号：２は、プロリンイミノペプチダーゼのＮ末端アミノ酸配列 から導かれる混合型ＤＮＡプローブで、この酵素をコードする遺伝子の単離に使 用した混合型ＤＮＡプローブを示す。 図３及び配列番号：３は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍ ａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７株から単離したプロリンイミノペプチダーゼのヌク レオチド配列と対応アミノ酸配列及びそのフランキングヌクレオチド配列を示す 。関連制限部位をｐｉｐ遺伝子の開始及び終止（＊）と共に示す。 Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７ の染色体ＤＮＡである。 図５は、プラスミドｐＭＭＢ６７ＥＨの制限酵素地図を示す。 Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７ の染色体ＤＮＡである。 図７Ａは、プラスミドｐＭＧ３６Ｅの制限酵素地図を示す。 図７Ｂは、プラスミドｐＭＧ３６Ｅの制限酵素地図及び多重クローニング部位 （配列番号：７）を示す。ＴはｐｒｔＰの転写ターミネーターである。 図８は、プラスミドｐＵＧ３７の制限酵素地図を示す。ＴはｐｒｔＰの転写タ ーミネーターである。 図９は、プラスミドｐＵＧ３８の制限酵素地図を示す。ＴはｐｒｔＰの転写タ ーミネーターである。 図１０は、プラスミドｐＵＧ３９の制限酵素地図を示す。ＴはｐｒｔＰの転写 ターミネーターである。 図１１は、プラスミドｐＵＧ４０の制限酵素地図を示す。ＴはｐｒｔＰの転写 ターミネーターである。 図１２は、プラスミドｐＵＧ４１の制限酵素地図を示す。ＴはｐｒｔＰの転写 ターミネーターである。 図１３は、プラスミドｐＧＫＶ２２３Ｄの制限酵素地図を示す。 図１４は、プラスミドｐＵＧ４２の制限酵素地図を示す。 図１５は、プラスミドｐＫＬ１５Ａの制限酵素地図を示す。 図１６は、プラスミドｐＵＫ３９の制限酵素地図を示す。 図１７は、プラスミドｐＯＲＩ２８の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。 図１８は、プラスミドｐＯＲＩ２２の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。 図１９は、プラスミドｐＩＮＴ１２４の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａ ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。 図２０は、プラスミドｐＩＮＴ１２５の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａ ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。 図２１は、プラスミドｐＩＮＴ２９の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。 図２２は、プラスミドｐＩＮＴ５１の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒｔ Ｐの転写ターミネーターである。 図２３は、プラスミドｐＩＮＴ６１の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒｔ Ｐの転写ターミネーターである。 図２４は、プラスミドｐＯＲＩ２８０の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａ ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒ ｔＰの転写ターミネーターである。 図２５は、プラスミドｐＵＧ１３９の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒｔ Ｐの転写ターミネーターである。 図２６は、プラスミドｐＵＧ１３９Ｒの制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａ ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒ ｔＰの転写ターミネーターである。 図２７は、プラスミドｐＵＧ２３９の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒｔ Ｐの転写ターミネーターである。 図２８は、プラスミドｐＵＧ３３９の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒｔ Ｐの転写ターミネーターである。 図２９は、プラスミドｐＵＧ４３９の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒｔ Ｐの転写ターミネーターである。 図３０は、プラスミドｐＩＮＴ２５０の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋は ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。 図３１は、プラスミドｐＵＧ５３９の制限酵素地図を示す。ＯＲＩ＋はｌａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来のプラスミドｐＷＶ０１の複製起点である。Ｔはｐｒｔ Ｐの転写ターミネーターである。 図３２は、プラスミドｐＵＲ２７７８の制限酵素地図を示す。 図３３は、プラスミドｐＵＲ５３０５の制限酵素地図を示す。 図３４は、プラスミドｐＵＲ５３０６の制限酵素地図を示す。 本発明を下記の実施例によって例示する。 分子生物学的な常法は、すべて、Ｍａｎｉａｔｉｓ他(１９８２)，Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，米国ニューヨーク州コール ドスプリングハーバー）の記載にしたがって実施した。酵素インキュベーション は供給元（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＬＣ，英国）の推 奨にしたがって行った。 百分率（パーセンテージ）は特記しない限りすべて重量％（ｗｔ％）である。 実施例１ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７からのプロリンイミノペプチダーゼの単離 酵素プロリンイミノペプチダーゼを単離するため、１５０ｌの乳酸ナトリウム 培地（１％乳酸ナトリウム，１％トリプチカーゼ-ペプトン，０．０２５％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄，０．０００５％ ＭｎＳＯ₄，１％酵母エキス，ｐＨ７．０に調整）中 で、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６ １７の菌体を嫌気的に増殖させた。遠心で菌体を回収し、０.５Ｍ ＮａＣｌで３ 回洗浄した後、２時間機械的に撹拌しながら４℃の２０％スクロース溶液中に懸 濁した。遠心して菌体を回収し、室温で３ｌのリゾチーム緩衝液（０．５Ｍスク ロース，０．３Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＳＯ₄，１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ及び２ｍｇリゾチーム/ｍｌ，ｐＨ７．８）に再懸濁して、８ 時間撹拌した。遠心してスフェロプラストを回収し、５ｌの５ｍＭリン酸ナトリ ウム溶液（ｐＨ７.５）中で４時間室温で撹拌することで溶 菌した。粗抽出液を超遠心して未破砕細胞及び細胞残渣を除去した。この細胞抽 出液に(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を１５％飽和に達するまで加えた。遠心で沈殿を取り除い て、その上清にさらに(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を加えて４５％飽和とした。遠心で沈殿を 回収して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.０）に溶解し、同じ緩衝 液に対して透析した。この試料を、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液で平衡化しておいた Ｑ-セファロース・ファーストフロー（Ｑ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ ｗ）陰イオン交換カラムにかけた。結合試料はＮａＣｌの０〜０.５Ｍ直線濃度 勾配で溶離した。溶離した画分を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７. ０）中でのプロリン-ｐ-ニトロアニリドの加水分解活性について試験した。ｐ- ニトロアニリンの放出は４０５ｎｍでの分光光度法で測定した。活性画分を、Ｐ Ｍ１０メンブランを用いたＡｍｉｃｏｎ濃縮装置で濃縮した。濃縮試料を、同じ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液で平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１ Ｂｉｏ ｐｉｌｏｔカラムにかけ、各画分の加水分解活性を調べた。活性画分を再度透析 し、濃縮した。濃縮物を、上記Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液で平衡化しておいたＭｏ ｎｏ Ｑ陰イオン交換カラムにかけた。結合試料を同じ緩衝液中のＮａＣｌの直 線濃度勾配（０〜０.５Ｍ）で溶離した。加水分解活性をもつ画分をプールした 。Ｎ末端配列を気相シークエンサー（オンラインＰＴＨアナライザー・タイプ１ ２０Ａを取付けたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ）で決定した 。最初の部分を図１及び配列番号：１に示す。 実施例２ プロリンイミノペプチダーゼをコードする 遺伝子のＥ．ｃｏｌｉでのクローニング 染色体ＤＮＡを単離するため、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅ ｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７の菌体を１００ｍｌの乳酸ナトリウム培地（１ ％乳酸ナトリウム，１％トリプチカーゼ-ペプトン，０.０２５％ Ｋ₂ＨＰＯ₄， ０.０００５％ ＭｎＳＯ₄，１％酵母エキス，ｐＨ７.０に調整）中で３０℃で３ ６時間嫌気的に増殖させた。遠心で菌体を回収し、１２ｍｌのＴｒｉｓ-スクロ ース緩衝液（６.７％スクロース，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ，ｐＨ８.０）に再懸濁して３７℃で２分間加熱した。これに ３ｍｌのリゾチーム緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.０及び１０ｍ ｇリゾチーム/ｍｌ）を添加して、その混合物を３７℃で３０分間インキュベー トした。続いて、３７℃で３０分間予めインキュベートしておいた３０ｍｇ/ｍ ｌ ｐｒｏｎａｓｅ Ｅ水溶液７５０μｌを添加し、混合物を３７℃でさらに１ ０分間インキュベートした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌと０.２５Ｍ ＥＤＴＡ（ ｐＨ８.０）の溶液１.５ｍｌを加え、混合物を倒置により穏やかに混合して９０ ０μｌの２０％ ＳＤＳを加えた。この混合物を再度倒置により混合して３７℃ で１０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム（１：１）混液でか なり粘稠な溶液を抽出し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ，１ｍＭ Ｅ ＤＴＡ，ｐＨ７.５）で平衡化し、核酸を含む水相を遠心分離した。水相を回収 して、再度抽出した。続いて、１倍容の冷エタノール（−２０℃）を加えて、水 相から核酸を沈殿させた。ＤＮＡ凝塊をガラス棒にて回収してＴＥ緩衝液に溶解 した。得られた染色体ＤＮＡのクローンバンクを作製するため、１５０μｇのＤ ＮＡを、最終容積が５００μｌとなる量の制限酵素Ｓａｕ３Ａを使ってＤＮＡ断 片の平均分子量が５ｋｂとなるように部分消化した。この消化物をフェノール／ クロロホルム（１：１）混液で抽出し、２倍容のエタノールで沈殿させ、１５０ μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、１Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ及び５ ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）の緩衝液中の１０〜４０％ショ糖密度勾配でサイズ 分画した。上記密度勾配はＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ２５ローターを用いて２２００ ０ｒｐｍで２０時間遠心した。０.５ｍｌ画分を回収し、２０μｌをアガロース ゲルで分画し、分子量５〜１０ｋｂの画分をプールして、２倍容のエタノールで 沈殿し、ＴＥ緩衝液に溶解した。このようにして得たＤＮＡ３μｇを、ＢａｍＨ Ｉで切断しておいたｐＢＲ３２２に連結し、連結混合物でコンピテントＥ．ｃｏ ｌｉ ２９４菌株（ｅｎｄｏ Ｉ~，ＢＩ~，ｒ_k~，ｍ_k~；Ｂａｃｋｍａｎ他(１９ ７６)，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３，４１７４-４１ ７８）を形質転換した。４２００のａｍｐ^rコロニーからなるクローンバンクが 得られた。 このクローンバンクをプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子保有コロニーについ てスクリーニングするため、２０ヌクレオチドの長さの混合型ＤＮＡプローブを 、 上記Ｎ末端プロリンイミノペプチダーゼ配列の最初の７個のアミノ酸基に基づい て（実施例１参照、図２及び配列番号：２も参照されたい）、ＤＮＡ合成装置（ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，モデル３８０Ａ）で合成した。このプ ローブでプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を検出できるか否かを調べるため、 放射性標識したプローブを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ で消化した染色体ＤＮＡのサザーンブロットにハイブリダイズさせた。ハイブリ ダイゼーションを０.２％ウシ血清アルブミン，０.２％ポリビニルピロリドン， ０.２％フィコール，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７.４），１０ｍＭ ＥＤ ＴＡ，１Ｍ ＮａＣｌ，０.５％ ＳＤＳ及び０.１％ピロリン酸ナトリウムからな る混液中において３７℃で１６時間実施したとき、すべてのレーンにおいてハイ ブリッド形成バンドが検出された。このプローブを使って、コロニーハイブリダ イゼーション法で上記４２００個のコロニーのうちの１５００をスクリーニング した。これらのコロニーの中の６つがプローブとハイブリダイズし、それらのプ ラスミドＤＮＡを単離した。 実施例３ プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の解析 実施例２で得られた６つのコロニーについて予備的な制限地図解析を行ったと ころ、それらすべてが、実施例２に記載の特定条件下で上記混合型ＤＮＡプロー ブとハイブリダイズする１ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを含んでいることが判 明した。したがって、このフラグメントをプラスミドｐＥＭＢＬ９のＢａｍＨＩ 部位にサブクローニングして、ｐＵＲ５３０１を得た。上記１ｋｂインサートの ＤＮＡ配列を、サンガーのジデオキシチェインターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ 他（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４ ６３-５４６７）にＢｉｇｇｉｎ他の修正（１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，３９６３-３９６５）を加えた方法で、ユニバ ーサルＭ１３プライマー、クレノウ酵素及びα-³⁵Ｓ-ＡＴＰ（２０００Ｃｉ/ｍ ｍｏｌ）を用いて決定した。この配列解析によって、プロリンイミノペプチダー ゼ遺伝子が実際にクローニングされていることが明らかになった。上記ＢａｍＨ Ｉフラグメントは実際にプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の開始コド ンの２４０ｂｐ上流から開始コドンの６８０ｂｐ下流までのフラグメントを含ん でいる（図３及び配列番号：３）。プロリンイミノペプチダーゼの全配列及びそ のフランキング配列は、最初の６つのクローンのうちの１つ（ｐＵＲ５３０２、 図４及び配列番号：４）について、その二本鎖プラスミドを鋳型として用いて、 ＨａｔｔｏｒｉとＳａｋａｋｉｓの方法（１９８６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．１５２，２３２-２３８）にしたがって決定した。プライマーは実施例２の記 載と同様に合成した。 ＤＮＡ配列の解析、配列の整合及び配列データベース検索については、次の２ 種類の異なるソフトウェアプログラムを使用した。 ａ） Ｓｔａｄｅｎの報文（１９８６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４ ，２１７-２３１）に記載された「Ｓｔａｄｅｎ」配列決定用プログラム； ｂ） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ 大学，米国ウィスコンシン州マディソン，Ｄｅｖｅｒｅｕｘ他（１９８４），Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，３８７-３９５）からのライセンスを 受けた配列解析ソフトウェアパッケージ，ヴァージョン６.１。 図３及び配列番号：３に示すヌクレオチド配列の解析から、４１４個のアミノ 酸残基からなる計算上の分子量４５.３７６ｋＤａのタンパク質をコードする１ ２４２ｂｐのオープンリーディングフレーム（読取り枠）が判明した（配列番号 ：３及び配列番号：４）。５０４位の開始コドンＡＴＧの前方領域には、Ｅ．ｃ ｏｌｉのそうした領域にみられるような、明瞭に識別されるプロモーター領域と リボソーム結合部位はみつからなかった。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに比して Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉゲノムのＧＣ含量が 著しく高いという事実でこの現象を説明できるかも知れない。 実施例４ Ｅ．ｃｏｌｉ 中でのプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の発現 上記プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させるには、 当該遺伝子をＥ．ｃｏｌｉの強力なプロモーターの後に置くのが好ましい。した がって、ｔａｃプロモーターとＥ．ｃｏｌｉ リボソーム結合部位を含む発現 プラスミドｐＭＭＢ６７ＥＨ（図５；Ｆｕｒｓｔｅ他（１９８６），Ｇｅｎｅ４ ８ ，１１９-１３１）に上記遺伝子を導入した。このベクターにプロリンイミノ ペプチダーゼ遺伝子をクローニングするために、最初に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版(１９８９)；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｐｒｅｓｓ発行）に記載された方法にしたがって、下記のプライマー対を用 いて、ｐＵＲ５３０２上でＰＣＲフラグメントを作製した。 プライマーＡ（配列番号：５）は上記プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の開 始部分（５０３〜５２３位）と同一であって、ＥｃｏＲＩ部位を追加して延長し たものである。プライマーＢ（配列番号：６）は上記プロリンイミノペプチダー ゼ遺伝子内のＢａｍＨＩ部位周辺領域（１１７４〜１１９７位）に相補的である 。得られた７００ｂｐフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩで消化して、得ら れた６００ｂｐフラグメントをアガロースゲル上で単離した。次いで、ｐＵＲ５ ３０２をＰｖｕＩ及びＰｖｕIIで消化して、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子 の残りの部分を含んだ９１０ｂｐのＰｖｕＩ-ＰｖｕIIフラグメント（図３）を アガロースゲル上で単離した。これら２つのフラグメントを連結して、制限酵素 ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで切断しておいたプラスミドｐＭＭＢ６７ＥＨ（図５） に導入した。この連結混合物でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換し、期待 されるプラスミドｐＵＲ５３０３（図６）を含んだａｍｐ^r形質転換株をピック アップした。 プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子がｔａｃプロモーターの調節下で発現され るか否かを調べるために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＵＲ５３０３）を１０ ０ｍｌのＬｕｒｉａ培地中でＯＤ₆₆₀が１.５となるまで増殖させた。０.４ｍＭ のＩＰＴＧ（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）を添加してｔａｃプ ロモーターを誘導した。菌体をさらに１.５時間増殖させて、遠心で 菌体を回収し、２０ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）で洗浄 し、同じ緩衝液２０ｍｌに再懸濁した。この懸濁液５ｍｌに３ｇのガラスビーズ （直径０.１５ｍｍ）を加え、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｂ１２ Ｓｏｎｉｆｉｅｒで小型 チップを用いて上記混合物を６回にわけて３０秒間超音波処理した。細胞破砕後 、懸濁を１５０００×ｇで１０分間遠心した。得られた上清のプロリンイミノペ プチダーゼ活性を、プロリン-ｐ-ニトロアニリドを基質として用いてアッセイし た（１０ｍＭリン酸ナトリウム中、１ｍＭ ｐ-ニトロアニリド，ｐＨ７.０，２ ０℃）。ｐ-ニトロアニリンの放出量を４０５ｎｍでの分光光度測定で求めた。 活性は、１ｇタンパク当りの活性単位（Ｕ／ｇタンパク質）で表した。１Ｕは、 ｐＨ７.０のリン酸緩衝液中２０℃で１分間にｐ-ニトロアニリン１モル（ε₄₀₅ ＝９６２０Ｍ^-1・ｃｍ^-1）を生ずる。タンパク量は、ウシ血清アルブミンを対照 タンパク質として用い、Ｂｉｏｒａｄ製プロテインアッセイで求めた。表Ｉから 分かる通り、２２４Ｕ/ｇタンパク質の活性がみられたが、この活性は元のＰｒ ｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ ＡＴＣＣ９６１７株で みられる活性の７倍も高い。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＭＭＢ６７ＥＨ）は 、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を保有していない対照生物である。 活性は、１ｇタンパク当りの活性単位で表した。１活性単位は、ｐＨ７.０のリ ン酸緩衝液中２０℃で１分間にｐ-ニトロアニリン１マイクロモル（ε₄₀₅＝９６ ２０Ｍ^-1・ｃｍ^-1）を生ずる。 実施例５ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ 中でのｐｉｐ遺伝子の発現 Ｌ．ｌａｃｔｉｓ中でｐｉｐ遺伝子を発現させるには、当該遺伝子をｌａｃｔ ｏｃｏｃｃｕｓ属由来の強力なプロモーターの後に置くのが好ましい。強力なプ ロモーターｐ３２及びｐ２３が単離されており（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ他 (１９８７)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３，２４５２ -２４５７）、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の広宿主域プラスミドｐＷＶ０１由来 の誘導体に存在している（Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ他(１９９１)，Ｐｌａｓｍｉｄ ２６ ，５５-６６）。ｐｉｐ遺伝子の至適発現を達成するために、これらの誘導 体を使用した。プラスミドはすべてＥ．ｃｏｌｉ及びＬ．ｌａｃｔｉｓ中で構築 した。 １． ｖａｎ ｄｅ Ｇｕｃｈｔｅ他(１９９２)，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３７，２１６-２２４及びＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒ ｅｖ．８８，７３−９２には、ｐＭＧ３６ｅ（図７Ａ及び図７Ｂ）に存在する効 率的に転写されるトランケート形ＯＲＦ３２に対する問題の遺伝子の翻訳共役を 利用することによって、遺伝子の効率的な発現が得られることが記載されている 。ＯＲＦ３２とｐｉｐ遺伝子の翻訳共役を達成するため、幾つかのベクターを構 築した。最初に、ｐｉｐ遺伝子のＣ末端部分をプラスミドｐＵＲ５３０３（図６ ）からのＳａｃＩ−ＸｂａＩフラグメントとして、ｐＭＧ３６ｅのＳａｃＩ-Ｘ ｂａＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＵＧ３７（図８）を得た。ｐＵＧ ３７をＳｔｙＩ及びＨｉｎｄIIIで消化してｐｉｐ遺伝子の下流の小領域を除去 し、クレノウ酵素処理で平滑末端として再度連結して多くの制限酵素部位を取り 除いた。得られたプラスミドをｐＵＧ３８と名付けた（図９）。ｐｉｐ遺伝子の 翻訳をトランケート形ＯＲＦ３２と共役させるため、下記のプライマー対を用い て、ｐＵＲ５３０３上でＰＣＲフラグメントを作製した。 プライマーｐｉｐ２１０（配列番号：８）は、ｐｉｐ遺伝子の開始コドンを含 めＮ末端側の２２ヌクレオチドを含んでいる。この部分はＳｓｐＩ部位を含んだ ＯＲＦ３２（２１ヌクレオチド）と共役しており、その５′末端側にＸｈｏＩ及 びＳａｃＩ部位が追加延長されている。プライマーｐｉｐ２０３はｐｉｐ遺伝子 内のＢａｍＨＩ部位の周辺に結合する（図３及び図６）。得られたＰＣＲフラグ メントをＳａｃＩで消化して５５２ｂｐフラグメントを単離し、同じ酵素で消化 しておいたベクターｐＵＧ３８に連結した。発色性基質Ｐｒｏ-βＮＡを用いて 、活性ｐｉｐ遺伝子を保有する形質転換株を同定した。得られたプラスミドｐＵ Ｇ３９（図１０）においては、先行するトランケート形ＯＲＦ３２はｐｉｐ開始 （ｓｔａｒｔ）コドンの１ｂｐ上流で終止（ｓｔｏｐ）する。 ２． 上記トランケート形ＯＲＦ３２に対するＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子の 翻訳共役はＯＲＦ３２の終止コドンがｌａｃＺの開始コドンと重複した配置のと きに最適となることが分かっている（ｖａｎ ｄｅ Ｇｕｃｈｔｅ他(１９９１)， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７，６５-７１）。ｐｉｐ遺伝子の発現につ いて同様の配置を得るため、プライマーｐｉｐ２０３（上記項目１と同一）と下 記のプライマーｐｉｐ２１１を用いて、ｐＵＲ５３０３上でＰＣＲフラグメント を作製した。 プライマーｐｉｐ２１１（配列番号：９）は、プライマーｐｉｐ２１０（配列 番号：８）と比べると、ヌクレオチド１個の変異を含んでいる。この変異はＸｈ ｏＩ部位とＳｓｐＩ部位の間にＡが１個挿入されていることからなる。得られた ＰＣＲフラグメントをＳａｃＩで消化して５５４ｂｐのフラグメントを単離し、 同じ制限酵素で切断しておいたベクターｐＵＧ３８に連結した。発色性基質Ｐｒ ｏ-βＮＡを用いて、活性ｐｉｐ遺伝子を保有する形質転換株を同定した。得ら れたプラスミドｐＵＧ４０（図１１）においては、トランケート形ＯＲＦ３２の 終止コドンはｐｉｐ遺伝子の開始コドンとＡＴＧＡという配置で重複している。 ３． ＳｓｐＩでの部分消化（図１０；７４ｂｐの欠失）、再連結及びＸｈｏＩ での消化によって、ｐＵＧ３９からトランケート形ＯＲＦを取り除くことにより 、ｐｉｐ遺伝子を、翻訳共役させずに、ｐ３２の直接の調節下においた。期待通 りの配置をもつ構築物（ｐＵＧ４１；図１２）をピックアップした。 ４． 単離された強力なｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属のプロモーターｐ２３は翻訳 開始シグナルを欠いている。したがって、ベクターｐＧＫＶ２２３Ｄ（図１３） を利用することにより、ＯＲＦ３２の翻訳開始シグナルの付いたｐｉｐ遺伝子を プロモーターｐ２３の調節下においた。このベクターはベクターｐＧＫＶ２１０ 及びｐＧＫＶ２２３（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ他(１９８７)，Ａｐｐｌ．Ｅ ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３，２４５２-２４５７）から誘導され たものである。ｐＧＫＶ２２３はｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来の６８０ランダ ムインサートを含んでいるが、このインサートにはｃａｔ-８６クロラムフェニ コール耐性遺伝子の上流にプロモーターｐ２３、リボソーム結合部位（ＲＢＳ） 及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始コドンが含まれている。ｐ ＧＫＶ２２３の４０７ｂｐ ＥｃｏＲＶ-ＨａｅIIIフラグメント（ｐ２３とＲＢ Ｓを含む）をｐＧＫＶ２１０のＳｍａ 部位にサブクローニングして、ベクター ｐＧＫＶ２２３Ｄを得た。ｐＵＧ３９（図１０）のｐｉｐ遺伝子を含んだ１５４ ３ｂｐのＳｓｐＩフラグメントを単離して、これを、ＢａｍＨＩで切断してクレ ノウ酵素処理で平滑末端としておいたｐＧＫＶ２２３Ｄに連結した。ｐｉｐ遺伝 子インサートを正しい方向で含んでいるプラスミドをピックアップ して、ｐＵＧ４２（図１４）と名付けた。 上記の最終構築体ｐＵＧ３９、ｐＵＧ４０、ｐＵＧ４１及びｐＵＧ４２で、Ｌ ．ｌａｃｔｉｓ のＭＧ１３６３株及びＬＬ１０８株を電気形質転換法（Ｈｏｌ ｏ及びＮｅｓ（１９８９），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５ ，３１１９-３１２３）で形質転換し、実施例１に記載の通り無細胞抽出液 でプロリンイミノペプチダーゼ活性を測定した。ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属のプ ロモーターｐ２３の調節下にあるｐＷＶ０１のｒｅｐＡ遺伝子を、プラスミドｐ ＵＣ２３ｒｅｐ３（Ｋ．Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ他(１９９１)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉ ｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７，２５６２-２５６７）から、ｐＢＲ３２２ 系の組込みプラスミドｐＨＶ６０Ａの欠失誘導体（Ｋ．Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ他( １９８９)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５，３９４-４ ００）に移して、ｐＫＬ１５Ａ（図１５）を得た。このベクターを、キャンベル （Ｃａｍｐｂｅｌｌ）型の組換えにより、ＭＧ１３６３株の染色体に組込み、ク ロラムフェニコール耐性形質転換株を選択した。得られたＣｍ^r株をＬＬ１０８ と名付けた。既に報告されている通り（Ｋ．Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ他(１９８９)， Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５，３９４-４００）、こ のタイプの選択は、用いた染色体位置で、染色体中の上記組込みプラスミドが約 １５コピーまで増幅されるという結果を与える。その結果、このＯｒｉ＋系プラ スミドはこの菌株において高いコピー数を有する（ｐＷＶ０１系プラスミドがＭ Ｇ１３６３株中で通常有するコピー数よりも約１０倍高い）。 ｐＵＧ３９、ｐＵＧ４０及びｐＵＧ４１はＭＧ１３６３株中では高レベルのプ ラスミド不安定性を示したものの、これらのプラスミドはＬＬ１０８株中では安 定であった。各種の遺伝子改変微生物の産生するプロリンイミノペプチダーゼの 活性を調べるため、実施例４の記載の通り活性測定を行った。ｐＵＧ３９、ｐＵ Ｇ４０又はｐＵＧ４１のいずれかを保有するＬＬ１０８株におけるプロリンイミ ノペプチダーゼ活性は、表IIにみられる通り、どれも同程度であった。ｐＵＧ４ ２を保有するＬＬ１０８株では、プロリンイミノペプチダーゼ活性が格段に低か った。したがって、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ染色体上での安定化のため に、ｐＵＧ３９に存在する発現カセットを選んだ。上記カセットの各種組込みベ クターへの移入を簡単にするため、ｐＵＧ３９のＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩフラグメ ント（１８４９ｂｐ）をｐＵＫ２１（Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ及びＪ．Ｍｅｓｓｉｎｇ (１９９１)，Ｇｅｎｅ，１００，１８９-１９４）のＥｃｏＲＩ-ＳｍａＩ部位に 移入して、プラスミドｐＵＫ３９（図１６）を得た。 実施例６ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの染色体上でのｐｉｐ遺伝子の安定化 ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の染色体上でｐｉｐ遺伝子を安定化させるため、ｌ ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属のプラスミドｐＷＶ０１由来のプラスミド組込み系（Ｌ ｅｅｎｈｏｕｔｓ他，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．(１９ ９１)５７，２５６２-２５６７；欧州特許出願第０４８７１５９号）を利用した 。この系は異種プラスミドＤＮＡ及び抗生物質耐性マーカーを含まない遺伝子改 変株を与える。２タイプの組込みベクターを使用した。最初のタイプのベクター 群は１度の交差によって染色体に完全に組込まれ、２０〜３０コピーのｐｉｐ遺 伝子保有ベクターが安定な頭-尾整列したものを生じた。次のタイプのベクター 群は、その組込みベクターのｐｉｐ含有部分での２度の交差によって組込まれた 。すべての組込みベクターは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ のＲｅｐ⁺ヘルパー 株ＬＬ１０８（実施例５参照）の中で構築した。この菌株から正しい構築体を単 離して、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ のＲｅｐ^-株ＭＧ１３６３に導入して染色体にベクタ ーを組込んだ。Ｏｒｉ⁺組込みベクター群の構築 すべてのＯｒｉ⁺組込みベクターの主な構造は、下記のフラグメント(１)及び( ２)又は(３)からなる。 (１) ｐＷＶ０１のプラス複製起点（Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ他(１９９１)，Ｐｌａ ｓｍｉｄ ２６，５５-６６）を含んだ６０１ｂｐ ＴａｑＩフラグメント； (２) ｐＵＫ２１の１２１ｂｐ ＳｐｅＩフラグメントであって、多重クローニン グ部位（Ｖｉｅｉｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ(１９９１)，Ｇｅｎｅ，１００，１８ ９-１９４）を含んでおり、そのＸｈｏＩ部位にｐＥ１９４の１ｋｂエリスロマ イシン耐性遺伝子（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈ及びＷｅｉｓｂｌｕｍ(１９８２)，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０，８０４-８１４）が存在するもの； (３) ｐＵＫ２１から得られる同一フラグメントではあるが、上記エリスロマイ シン耐性遺伝子がＢａｍＨＩ部位に存在するもの。 フラグメント(１)と(２)を連結してｐＯＲＩ２８（図１７）を得た。フラグメン ト（１）と（３）を連結してｐＯＲＩ２２（図１８）を得た。ＳＣＯ組込みベクター群 プラスミドｐＯＲＩ２２を使用して、キャンベル型の組込みベクターｐＩＮＴ １２４（図１９）及びｐＩＮＴ１２５（図２０）を構築した。プラスミドｐＩＮ Ｔ１２４は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ染色体のｐｅｐＸＰ遺伝子（Ｍａｙｏ他(１９９ １)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｒｏｂｉｏｌ．５７，３８-４４）の ７８５ｂｐ ＸｈｏII-ＰｖｕII内部フラグメントを含んでいる。プラスミドｐＩ ＮＴ１２５は、ｐｅｐＸＰ遺伝子の３′末端部を保有した１５０４ｂｐのＸｂａ Ｉフラグメントを含んでいる。両プラスミド共に、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐ ｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＰＰＥ１.０のプラスミドｐＳＲＱ１のスクロース遺伝子 ｓｃｒＡ及びｓｃｒＢ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤａｔａＢａｓｅアク セション番号Ｌ３２０９３のヌクレオチド１３２８５〜１７８９７）を保有した ＢｇｌII−ＳａｌＩフラグメントを含 んでいる。両方の構築体から、ＢａｍＨＩ消化と再連結によりエリスロマイシン 耐性遺伝子を切り取った。ＤＣＯ組込みベクター群 プラスミドｐＯＲＩ２８を使用して、置換型組込みベクターｐＩＮＴ２９（図 ２１）、ｐＩＮＴ５１（図２２）及びｐＩＮＴ６１（図２３）を構築した。プラ スミドｐＩＮＴ２９は、ｐｅｐＸＰ遺伝子領域の２つの染色体フラグメント、す なわち、ｐｅｐＸＰ遺伝子の３′末端部を含む１５０４ｂｐ ＸｂａＩフラグメ ントと、ｐｅｐＸＰ遺伝子の５′末端部と全ＯＲＦ１とそのターミネーター（Ｍ ａｙｏ他(１９９１)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｒｏｂｉｏｌ．５７ ，３８-４４）を含んだ１４７９ｂｐのＳｐｅＩ-ＭｌｕＩフラグメントとを含ん でいる。上記２つのフラグメントの間にはｐＯＲＩ２８の多重クローニング部位 が存在しており、したがって、ｐＩＮＴ２９が染色体に組込まれるとｐｅｐＸＰ 遺伝子が不活性化される。 ｐＩＮＴ５１及びｐＩＮＴ６１を構築するために、最初にｐＯＲＩ２８０（図 ２４）を構築した。ｐＭＧ５７（ｖ.ｄ．Ｇｕｃｈｔｅ他(１９９１)，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７，６５-７１）から、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の プロモーターｐ３２の調節下におかれたＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＺリポーター遺伝 子をＥｃｏＲＩ-ＸｍｎＩフラグメントとして単離した。クレノウ酵素を用いて このフラグメントを平滑末端とし、ｐＯＲＩ２８のＳｔｕＩ部位に連結してｐＯ ＲＩ２８０を得た。 プラスミドｐＩＮＴ６１は、ｐｅｐＸＰ遺伝子の５′末端部と全ＯＲＦＩとそ のターミネーターを保有した１４７９ｂｐのＭｌｕＩ−ＳｐｅＩフラグメント、 及びｐＭＢ３３０（Ｍａｙｏ他(１９９１)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃ ｏｒｏｂｉｏｌ．５７，３８−４４）から得られるＯＲＦ１下流の染色体ＤＮＡ からなる１.７ｋｂ ＳｐｅＩ−ＸｂａＩフラグメントを含んでいる。ｐＩＮＴ６ １における多重クローニング部位はＯＲＦのターミネーターの直ぐ下流に位置し ており、そのため、染色体への置換型組込みによって遺伝子の不活性化が起こる ことはない。 プラスミドｐＩＮＴ５１は、ＯＲＦ１の３′末端部とそのターミネーターを保 有した６５５ｂｐのＦｓｐＩ−ＳｐｅＩフラグメントを含んでいるほか、ｐＭＧ ８２０（Ｍａｅｄａ及びＧａｓｓｏｎ(１９８６)，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ．１３２，３３１-３４０；ｖ．Ｒｏｏｉｊｅｎ及びｄｅＶｏｓ(１９９０) ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１８４９９-１８５０３）のｌａｃＲ遺伝 子のＸｂａＩ-ＳｃａＩ内部フラグメントも含んでいる。これら２つのフラグメ ントの間には多重クローニング部位が存在する。染色体（ＬＢ２５０株の染色体 ）へのこれらの部位の置換型組込みは、遺伝子の不活性化を起こさない。１．ｐｉｐ遺伝子を含んだ単一交差ベクター群 Ａ． 組込みプラスミドｐＩＮＴ１２４（図１９）は、乳酸菌Ｐｅｄｉｏｃｏｃ ｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＰＰＥ１.０から単離されたスクロース代謝遺 伝子群（欧州特許出願第０４８７１５９号並びにＧｏｎｚａｌｅｚ，Ｇ.Ｆ.及び Ｋｕｎｋａ，Ｂ.Ｓ.(１９８６)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｒｏｂｉ ｏｌ．５１，１０５-１０９）を含んでおり、これらはＬ．ｌａｃｔｉｓ中で選 択マーカーとして機能する。さらに、このプラスミドは、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ ｓ属のｐｅｐＸＰ遺伝子（Ｍａｙｏ他(１９９１)，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｏｒｏｂｉｏｌ．５７，３８-４４）の７８０ｂｐ内部ＤＮＡフラグメン トを含んでおり、組込みのための相同性を提供する。この組込みが起こるとはｐ ｅｐＸＰ遺伝子を破壊するので、この事象は発色性基質Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-βＮＡを 利用した平板アッセイ（Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ他(１９９１)，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ．１７３，４７９４-４７９８）によって容易に検出される。 ｐＵＫ３９（図１６）からｐｉｐ遺伝子をＳｐｅＩ-ＸｂａＩフラグメントと して単離し、ｐＩＮＴ１２４のＸｂａＩ部位に連結した。それぞれ図２５及び図 ２６に示す配置をもつベクターｐＵＧ１３９及びｐＵＧ１３９Ｒを単離した。Ｂ． ｐｅｐＸＰ遺伝子の不活性化はＬ．ｌａｃｔｉｓのミルク中での増殖には 影響しないが、その発酵産物の官能的組成物に対する変異の影響については未知 数である。ｐｅｐＸＰ遺伝子の不活性化を避けるため、プラスミドｐＩＮＴ１２ ５（図２０）を使用した。このベクターはｐｅｐＸＰ遺伝子の ３′末端部を組込みのための相同領域として保有している点で、ｐＩＮＴ１２４ とは異なる。この染色体フラグメントを通して組込むと、ｐｅｐＸＰは不活性化 されない。ｐＵＫ３９のＢｇｌII-ＭｌｕＩフラグメントを、ｐＩＮＴのＢａｍ ＨＩ-ＭｌｕＩ部位と連結して、ｐＵＧ２３９（図２７）を得た。 ２．ｐｉｐ遺伝子を含んだ二重交差ベクター群 Ａ． ベクターｐＩＮＴ２９（図２１）は、ｐｅｐＸＰ遺伝子中の問題とする遺 伝子を１コピーだけ送り込むのに特異的である。ｐＵＫ３９のｐｉｐ遺伝子をＢ ｇｌII-ＭｌｕＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩ-ＭｌｕＩで消化してお いたｐＩＮＴ２９に連結した。得られたプラスミドをｐＵＧ３３９（図２８）と 名付けた。Ｂ． ベクターｐＩＮＴ６１（図２３）は、ｐｅｐＸＰ遺伝子領域中のＯＲＦ１ 下流の問題とする遺伝子を１コピーだけ送り込むのに特異的であり、この事象は ｐｅｐＸＰを不活性化しない。ｐＵＫ３９からｐｉｐ遺伝子フラグメントをＥｃ ｏＲＩ-ＢｇｌIIフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌIIで消化して おいたｐＩＮＴ６１に連結した。得られたプラスミドをｐＵＧ４３９（図２９） と名付けた。Ｃ． ベクターｐＩＮＴ５１（図２２）は、ＬＢ２５０株中のＯＲＦ１及びｌａ ｃＲの下流の問題とする遺伝子を１コピーだけ送り込むのに特異的である。ＬＢ ２５０株は、ｐＩＮＴ６１の誘導体（Ｌ．ｌａｃｔｉｓの９.１ｋｂ ｌａｃオペ ロンをＢａｍＨＩ-ＮｏｔＩ部位にクローン化したもの）であるｐＩＮＴ２５０ （図３０）を用いて構築した。ｐＵＫ３９からｐｉｐ遺伝子フラグメントをＥｃ ｏＲＩ-ＢｇｌIIフラグメントとして単離し、ｐＩＮＴ５１のＥｃｏＲＩ-Ｂｇｌ II部位に挿入して、ｐＵＧ５３９（図３１）を得た。 ベクターｐＵＧ１３９Ｒ、ｐＵＧ３３９及びｐＵＧ４３９をＬ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３（ｐＬＰ７１２）の染色体に組込んで、それぞれ、菌株ＵＧ１３９ 、ＵＧ３３９及びＵＧ４３９を得た。ｐＵＧ２３９をＭＧ１３６３の染色体に組 込み、ｐＵＧ５３９をＬＢ２５０に組込んで、それぞれ、菌株ＵＧ２３９及びＵ Ｇ５３９を得た。菌株ＵＧ１３９とＵＧ２３９はスクロース含有寒天培地上で直 接選択して単離した。菌株ＵＧ３３９、ＵＧ４３９及びＵＧ５３９は、 Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ及びＶｅｎｅｍａ(１９９２)，Ｍｅｄ．Ｆａｃ．Ｌａｎｄｂ ｏｕｗｗ．Ｕｎｉｖ．Ｇｅｎｔ，５７/４ｂ，２０３１-２０４３に記載の２段階 法にしたがって選択した。 すべての菌株について、無細胞抽出液中のプロリンイミノペプチダーゼ活性を 実施例５記載の通り測定して表IIIに示した。 種々の遺伝子改変微生物由来のプロリンイミノペプチダーゼの作用活性を、種 々のＮ末端プロリン含有ペプチドを用いて求めた。０.１Ｍリン酸ナトリウム（ ｐＨ７.０）に基質（０.２〜０.４ｍＭ）を溶解し、２５〜５０Ｕ/ｌのプロリン イミノペプチダーゼ活性溶液と共に３７℃でインキュベーションした。プロリン イミノペプチダーゼによる基質ペプチドからの遊離プロリンの放出量を求めるた めに、インキュベーション中に時間間隔をおいて試料を採取し、Ａｌｐｈａ Ｐ ｌｕｓ II（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ製）アミノ酸分析装置を用いたアミノ酸 分析で分析した。内標準としてノルロイシン（１００ｎｍｏｌ/ｍｌ）を添加し た後、０.２Ｍクエン酸ナトリウムを用いて試料をｐＨ２.２に調節し、Ｕｌｔｒ ａｐａｃ ７ 陽イオン交換樹脂にかけた。アミノ酸分析は、クエン酸ナトリウム ／ホウ酸溶離系を用いてｐＨ上昇勾配をかけることで遂行した。検出は、アミノ 酸の含ニンヒドリン法を行った後で、標準アミノ酸を５７０ｎｍで検出し、プロ リンを４４０ｎｍで特異的に検出することにより行った。その結果を、遺伝子改 変を施したプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を有していない対応微生物か らの抽出液を用いた同様の実験結果と比較した。表IVに示す通り、例示としての 基質（ポリ-プロリン-グリシン-プロリン）からのプロリン放出量は、プロリン イミノペプチダーゼ含有微生物から回収した抽出液のほうが対照試料よりも格段 に高かった。 実施例７ 酵母によるプロリンイミノペプチダーゼの発現 酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはベーカリ用途に広 く使われており、ドゥから得られる製品のフレーバー発生に部分的に関与してい る。このような酵母でプロリンイミノペプチダーゼを発現させると、このような 製品に対してフレーバー発生を早め、ねかしに要する時間を短縮できるはずであ る。プロリンイミノペプチダーゼを分泌し得る酵母株を創製するため、プラスミ ドｐＵＲ５３０２を鋳型とし、下記のｐｉｐ２１２（配列番号：１０）とｐｉｐ ２１３（配列番号：１１）のプライマー対を利用したＰＣＲ法を用いることがで きるはずである。 これによって約１２６９ｂｐのフラグメントが生じるはずであり、次にこのフ ラグメントをＢｓａＩ及びＨｉｎｄIIIで消化すれば、ＥａｇＩ/ＨｉｎｄIII消 化ベクターと連結可能な５′突出一本鎖末端を有する約１２４７ｂｐのフラグメ ントが得られるはずである。こうして得られるフラグメントは、酵母発現ベクタ ーｐＵＲ２７７８（図３２，Ｖａｎ Ｇｏｒｃｏｍ他（１９９１）国際特許出願 国際公開パンフレットＷＯ９１/１９７８２）をＨｉｎｄIIIで消化しＥａｇＩで 部分消化して得られる約７３７８ｂｐフラグメントに連結することができる。こ のベクターは、酵母ゲノムへのｒＤＮＡ遺伝子座での安定な多コピー組込みが可 能である。得られるプラスミドｐＵＲ５３０５（図３３）は、酵母ＧＡＬ７プロ モーターの調節下で、酵母インベルターゼ（ＳＵＣ２）遺伝子産物由来の分泌シ グナルと同一フレーム（読み枠が一致していること）で融合したＰＩＰタンパク を含んでいる。このクローニング操作はＮ末端メチオニンのアラニン残基による 置換を生じる。主たる炭素源がマルトース又はグルコースであるようなドゥ系で のＰＩＰの発現には、ガラクトース誘導性ＧＡＬ７プロモーターの構成性プロモ ーターによる置換が必要とされる。構成性ＴＤＨ３（グリセルアルデヒド-３-リ ン酸デヒドロゲナーゼ；ＧＡＰＤＨ）プロモーターをｐｇａｐ４９１（Ｈｏｌｌ ａｎｄ,Ｍ.Ｊ.及びＨｏｌｌａｎｄ,Ｊ.Ｐ.(１９７９)，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. ，２５４，５４６６-５４７４）からのＨｐａｌ/ＨｉｎｄIIIフラグメントとし て単離し、ＨｉｎｃII/ＨｉｎｄIIIで消化したベクターｐＴＺ１９Ｕ（Ｍｅａｄ ，Ｄ.Ａ.，Ｓｚｃｚｅｓｎａ-Ｓｋｏｒｕｐａ，Ｅ.及びＫｅｍｐｅｒ，Ｂ.(１９ ８６)，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１，６７-７４）に連結した 。部位特異的変異導入法でＡＴＧ開始コドンの−１８位のＣの前にヌクレオチド ＧＡＧＣＴを導入することにより、ＳａｃＩ部位を作出した。得られた プラスミドを鋳型として、下記のプライマー対を利用したＰＣＲに使用した。 及び こうして得られたＰＣＲフラグメントをＢｇｌII及びＳａｃＩで消化した。得 られるフラグメントを、ｐＵＲ５３０５のＢａｍＨＩ及びＳａｃＩでの部分消化 で得られる約８４１４ｂｐベクターフラグメントと連結すると、ｐＵＲ５３０６ （図３４）が得られる。 ＨｐａＩ消化で線状化したｐＵＲ５３０６を、公知の電気穿孔法でｌｅｕ２欠 失Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に導入して、ロイシン原栄養株について選択する と、ドゥ系にプロリンイミノペプチダーゼを分泌し得る酵母が得られるであろう 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 レーデボーエル、アドリアヌス・マリヌス オランダ国、3055・エムエル・ロッテルダ ム、ビー・ルフェーブル・ド・モンティニ ュイプレーン ８ (72)発明者 レーンホーツ、コルネリス・ヨハネス オランダ国、9751・エヌエヌ・ハーレン、 カークラーン 30、バクグロープ・ジェネ ティカ、バイオロジッシュ・セントラム、 リクサニベルスィテート・グロニンゲン （番地なし) (72)発明者 トーネン、マリア・イヴォンヌ オランダ国、3136・エイチエイチ・ヴラー ディンゲン、スペシュトラーン 359

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．金属依存性セリンペプチダーゼ型のプロリンイミノペプチダーゼ活性をも つポリペプチドにして、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎ ｉｉ ＡＴＣＣ９６１７から得られる計算上の分子量が４５ｋＤａのプロリンイ ミノペプチダーゼの少なくともプロリンイミノペプチダーゼ活性を担うアミノ酸 配列からなるポリペプチド又はプロリンイミノペプチダーゼ活性を示す当該アミ ノ酸配列の誘導体からなるポリペプチド。 ２．プロリンイミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドにして図３及び配 列番号：３に示すユニークなアミノ酸配列に基本的に一致したアミノ酸配列から なるポリペプチド、又はその誘導体にして当該誘導体のアミノ酸配列と上記ユニ ークなアミノ酸配列との間の相同性の高さが６０％を超える、好ましくは７５％ を超える、さらに好ましくは９５％を超える誘導体。 ３．請求項１又は請求項２記載のポリペプチドにおいて、当該ポリペプチドが フェニルメチルスルホニルフルオリドに対して感受性であることを特徴とするポ リペプチド。 ４．請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のポリペプチドにおいて、当該 ポリペプチドが食品グレードであることを特徴とするポリペプチド。 ５．請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のプロリンイミノペプチダーゼ 活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。 ６．プロリンイミノペプチダーゼ活性をもつポリペプチドを産生し得る遺伝子 改変微生物及び当該微生物から得られる子孫にして、当該微生物が請求項５記載 のヌクレオチド配列を含んでいることを特徴とする微生物。 ７．請求項６記載の微生物において、プロリンイミノペプチダーゼ活性をもつ ポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ-ＤＮＡ ）であって、当該ｄｓ-ＤＮＡのプラス鎖の５′末端の前にはフレームの一致し た翻訳開始コドンが位置していてその翻訳開始コドンの上流には発現レギュロン が位置しており、かつ当該ｄｓ-ＤＮＡのプラス鎖のコーディング領域の３′末 端の後には翻訳終止コドンが位置しており、場合によってその後に転写終結配列 が続いていることを特徴とする微生物。 ８．請求項６又は請求項７記載の微生物において、プロリンイミノペプチダー ゼ活性をもつポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列の前に、当該微生 物の増殖する培地中に上記プロリンイミノペプチダーゼを分泌させるのに有効な シグナルペプチドをコードする配列が存在することを特徴とする微生物。 ９．請求項６乃至請求項８のいずれか２項記載の微生物において、プロリンイ ミノペプチダーゼ活性をもつポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列の フランキング配列として、プロリンイミノペプチダーゼをコードする当該ヌクレ オチド配列の宿主ゲノム中への組込みを助長するようなヌクレオチド配列からな るＤＮＡが存在することを特徴とする微生物。 １０．請求項６乃至請求項９のいずれか２項記載の微生物において、当該微生物 が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃ ｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉ ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｃｏｒｙ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属か ら選択され、好ましくは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂｉｆｉｄｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属から選択 される食品グレードの微生物であることを特徴とする微生物。 １１．請求項１０記載の微生物において、上記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群から選択 されることを特徴とする微生物。 １２．プロリンイミノペプチダーゼの生産方法にして、請求項６乃至請求項１１ のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物を適当な増殖培地中で増殖させ、任意段 階としての上記微生物の細胞の破壊後に、発酵培地から酵素を回収することから なる方法。 １３．食品組成物の風味を改良する方法にして、当該食品組成物又はその成分を 、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のプロリンイミノペプチダーゼ活性 をもつポリペプチドの作用に付すことからなる方法。 １４．食品組成物の風味を改良する方法にして、当該食品組成物又はその成分を 、請求項６乃至請求項１１のいずれか１項記載の食品グレードの微生物の酵素活 性の作用に付すことからなる方法。 １５．請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法において、上記改良 が苦味の低減であることを特徴とする方法。 １６．食品組成物にして、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のプロリン イミノペプチダーゼ活性をもつポリペプチドの活性にさらしておいた食品組成物 。 １７．食品組成物にして、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のプロリン イミノペプチダーゼ活性をもつポリペプチドを配合した食品組成物。 １８．食品組成物にして、請求項６乃至請求項１１のいずれか１項記載の食品グ レードの微生物、好ましくは乳酸菌又は酵母を配合した食品組成物。 １９．請求項１６乃至請求項１８のいずれか１項記載の食品組成物において、当 該組成物がカゼイン又はカゼイネートを含有しており、好ましくはチーズである ことを特徴とする食品組成物。 ２０．プロリンイミノペプチダーゼ活性をもつポリペプチドを産生するＳａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の酵素活性にさらした食品組成物 、好ましくはドゥ。 ２１．請求項１６乃至請求項２０のいずれか１項記載の食品組成物において、当 該組成物が遊離プロリン残基を含んでいることを特徴とする食品組成物。