ES2152217T5 - Produccion de xilanasa. - Google Patents
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Abstract
UNA CELULA QUE TIENE UNA CIERTA FUNCION EN UN PROCESO Y QUE CONTIENE UN ADN RECOMBINANTE QUE CODIFICA AL MENOS UNA ENZIMA, EN DONDE DICHA CELULA SE CONVIERTE EN POLIFUNCIONAL PARA DICHO PROCESO CUANDO SE PRODUCE LA EXPRESION DEL ADN RECOMBINANTE QUE CODIFICA AL MENOS DICHA ENZIMA. EL USO DE TAL CELULA POLIFUNCIONAL Y/O ENZIMA OBTENIBLE A PARTIR DE DICHA CELULA EN, POR EJEMPLO, PROCESOS DE ELABORACION DE ALIMENTOS TALES COMO LA PREPARACION DE PRODUCTOS DE PANADERIA. UN MATERIAL DE ADN RECOMBINANTE QUE CONTIENE ADN CON UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA AL MENOS UNA FORMA DE MADURACION DE UNA XILANASA DE ORIGEN FUNGICO.
Description
Producción de xilanasa.
Esta invención se encuentra dentro del campo de
la tecnología del DNA recombinante. La invención se dirige en
particular a un material de DNA recombinante que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica xilanasa de Aspergillus
Níger variedad awamori que tiene actividad mejoradora del
pan, seleccionándose dicha secuencia nucleotídica del grupo que
comprende la secuencia nucleotídica de la figura Nº 1 y secuencias
nucleotidicas equivalentes tales que
- la secuencia nucleotídica equivalente
corresponde a una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia
de aminoácidos de la figura Nº 1 o la forma madura.
Una célula transformada que comprende tal
material de DNA recombinante también está dentro del alcance de la
invención. También tal célula transformada adecuada para usar en un
procedimiento en el que se usa una materia prima que comprende
celulosa y/o hemicelulosa de una manera funcional conocida de por sí
para la célula huésped no transformada, haciéndose dicha célula
polifuncional para dicho procedimiento durante la expresión del DNA
recombinante que codifica xilanasa y posteriormente secretándose al
menos la forma madura de xilanasa que tiene actividad mejoradora
del pan, permitiendo de ese modo la degradación del xilano.
También forma una realización de la invención un
procedimiento para producir xilanasa que comprende una secuencia de
aminoácidos de acuerdo con la figura 1, que comprende cultivar una
célula de acuerdo con la invención en un medio nutritivo adecuado y
opcionalmente aislar la enzima resultante. Composiciones mejoradoras
del pan que comprenden la célula de acuerdo con la invención
también se reivindican como parte de la invención. Los nuevos
productos también conducen a procedimientos mejorados para preparar
un producto panificable, horneando una composición de harina que
comprende usar la composición mejoradora del pan según la invención
y a procedimientos mejorados para procesar un material que contiene
celulosa para preparar cerveza,papel, almidón, gluten, etc., o para
descomponer un residuo que contiene celulosa y/o hemicelulosa, y la
invención se dirige a una célula que tiene una cierta función en un
procedimiento, que contiene dicho DNA recombinante que codifica al
menos una enzima. La invención se dirige especialmente a una célula
que tiene una función en el campo del procesamiento de alimentos y
también a células con una función en procedimientos en los que se
usa una materia prima que contiene celulosa, tales como
procedimientos para preparar cerveza, papel, almidón, gluten, etc.,
y procedimientos para descomponer un residuo que contiene celulosa
tal como un residuo agrícola, un residuo de fábricas de papel,
etc.
En particular, la invención se dirige a células
que tienen una función en el procedimiento de fermentación, más
especialmente a células con una función en el procedimiento de
preparación de productos panificables.
La célula de acuerdo con la invención se
caracteriza por que la célula se hace polifuncional para el
procedimiento en el que tiene una función, al expresarse el DNA
recombinante de la invención. En el caso de un procedimiento de
fermentación, por ejemplo, tal como la preparación de pan, se usa
levadura como una célula con una función particular en dicho
procedimiento. Una célula de levadura de acuerdo con la invención no
sólo tiene su función normal, es decir una función que también
puede llevar a cabo una levadura que carece del DNA recombinante,
sino que también tiene otra función en dicho procedimiento de
preparación de pan. Un ejemplo de tal función adicional es la
expresión y la secreción de al menos la forma madura de la
xilanasa.
La presente invención se dirige en particular a
una célula con una función en la preparación de productos
panificables. Son adecuadas células que contienen enzimas que
codifican DNA recombinante seleccionadas del grupo de enzimas con
actividad amilolítica y/o hemicelulolítica y/o celulolítica.
La invención también se dirige a un
procedimiento para la producción de una xilanasa mediante una célula
polifuncional como la descrita anteriormente, que comprende
cultivar tal célula polifuncional en un medio nutritivo adecuado y
opcionalmente aislar la forma de enzima resultante. En tal
procedimiento, dicha enzima se selecciona preferiblemente del grupo
de enzimas con actividad amilolítica y/o hemicelulolítica y/o
celulolítica. Un medio adecuado para llevar a cabo el procedimiento
de acuerdo con la invención puede consistir en el medio en el que se
lleva a cabo el procedimiento para el que la célula es
polifuncional. En el procedimiento de preparación de un producto
panificable, por ejemplo, dicho medio puede ser la masa que ha de
cocerse. Naturalmente, también pueden usarse otros medios
habituales para cultivar células. La elección de los medios
dependerá de si la enzima debe usarse in situ o tiene que
aislarse. En algunos casos, será suficiente aislar el medio que
contiene dicha enzima y en otros casos la enzima tendrá que aislarse
del medio.
La invención se dirige además al uso de tal
célula polifuncional, por ejemplo en los procedimientos descritos
anteriormente, tales como procesamiento de alimentos y
procedimientos que usan una materia prima que contiene celulosa,
preferiblemente en un procedimiento para la preparación de un
producto panificable.
Harina, levadura, agua y sal son los
ingredientes básicos del pan y otros productos panificables. Durante
siglos se han añadido materiales que tienen un efecto positivo
sobre la capacidad de manejo de la masa o la calidad del producto
horneado en la fabricación de pan y productos panificables
similares, con el propósito de comodidad, también denominado
fabricación de pan. Dichos aditivos, denominados "mejoradores del
pan", contienen enzimas de malta o de origen microbiano que
juegan una parte importante en las diferentes fases de la
fabricación de pan, a saber, la preparación de la pasta de pan, la
fermentación, la cocción y el almacenamiento del producto de
pan.
Una de las características relevantes del pan
que se incluye añadiendo enzimas específicas es el llamado volumen
del pan. Para obtener un alto volumen del pan en la práctica se
añaden composiciones que contienen enzimas celulolíticas,
hemicelulolíticas y/o amilolíticas. Las composiciones disponibles
comercialmente de origen microbiano, que se originan principalmente
a partir de un hongo de uno de los géneros Aspergillus y
Trichoderma, son mezclas complejas sustancialmente
impurificadas, de diferentes tipos de actividades, por lo que no se
sabe exactamente qué enzimas están presentes en la composición y
cuáles tienen una actividad mejoradora del pan. Esta falta de
conocimiento impide mejorar más el pan y especialmente impide el
control de las diferentes propiedades de procesamiento de la masa y
del pan, tales como el volumen del pan.
Una investigación adicional en el procedimiento
de preparación de productos panificables da como resultado el
descubrimiento de que, además de \alpha-amilasa,
también es de importancia para el volumen del pan al menos una
enzima xilanasa. Una xilanasa es una enzima que cataliza la
degradación de xilanos que se produce en la parte de pentosano de
las "colas" de almidón. El término "colas" se dirige a una
fracción de, por ejemplo, almidón de trigo que consiste en
hemicelulosa insoluble en agua (pentosanos y arabinoxilanos) y
almidón dañado. Esta fracción se forma como la capa intermedia o
superior del pelet de almidón durante la centrifugación de una
suspensión de masa obtenida lavando masa para eliminar la fracción
de gluten.
Ya se han descrito diferentes xilanasas en la
bibliografía, incluyendo xilanasas de la especie bacteriana
Bacillus pumilus (Panbangred y otros, Mol. Gen. Genet.
1.92, 335-341, 1983, y Fukisaki y otros, FEBS
Lett. 171, 197-201, 1984), Bacillus subtilis
(Paice y otros, Arch. Microbiol. 144,
201-206, 1986) y Bacillus circulans (Yang y
otros, Nucl. Acids. Res. 16, 7187, 1988), de la levadura
Aureobasidium (Lea-thers, Biotech. Lett. 10,
775-780, 1988) y del hongo Aspergillus niger
(Fournier y otros, Biotechnology and Bioengineering 27,
539-546, 1985).
Se sabe de la solicitud de patente europea
EP-A-0338452 que las propiedades de
la masa y la calidad del pan pueden mejorarse añadiendo diferentes
composiciones de enzimas a la masa, incluyendo una composición de
enzimas que tiene actividad degradadora de hemicelulosa o de
xilanasa, cuyo origen no se especifica más. Tal composición de
enzimas hemicelulolíticas es una mezcla de enzimas relativamente no
definida que puede contener diferentes enzimas hemicelulolíticas
que tienen diversos efectos sobre la masa y las propiedades del pan.
La presencia de xilanasas que tienen actividad mejoradora del pan
en una extensión menor o mayor es el resultado coincidente de la
manera en la que se ha obtenido la composición de enzimas que se
pretende como un mejorador del pan. Una optimización más controlada
de los mejoradores del pan, sin embargo, no era posible debido a la
falta del conocimiento requerido y de construcciones de DNA
recombinante adecuadas que codifiquen una xilanasa que tiene
actividad mejorada del pan que pueda usarse para una alta producción
de tal xilanasa.
Para los propósitos de esta invención, se
considera generalmente que "actividad mejoradora del pan"
significa un efecto favorable sobre cualquier propiedad del
producto panificable (incluyendo pan) preparado o de la masa a
partir de la cual se elabora el producto panificable o de pan, y
particularmente se considera que significa un efecto favorable sobre
el volumen del pan.
La investigación en la que se basa la invención
se ha extendido a la identificación y la donación de un gen
(xylA) que codifica una enzima, xilanasa que tiene actividad
mejoradora del pan, que se origina a partir de un hongo de la
especie Aspergillus niger var. awamori, así como a la
transformación de diferentes especies de células huésped de tal
manera que el gen se expresa o puede expresarse en dichas células
huésped. La invención comprende material de DNA recombinante según
se define en las reivindicaciones.
El término "forma de maduración" se refiere
a las diferentes formas en las que la enzima puede presentarse
después de la expresión del gen asociado, principalmente a la
prepro-forma tanto presente en la naturaleza como
no presente en la naturaleza y a la forma madura definitiva de la
enzima que resulta después de la segmentación de un péptido
"líder".
La invención se refiere a material de DNA
recombinante que comprende DNA con una secuencia nucleotídica que
codifica xilanasa con una secuencia de aminoácidos como la mostrada
en la figura 1, y más en particular material de DNA recombinante
que comprende DNA con una secuencia nucleotídica que codifica una
forma de maduración de xilanasa, como se muestra en la figura 1. La
invención también se dirige a material de DNA recombinante que
comprende DNA con una secuencia nucleotídica que codifica una forma
de maduración de xilanasa como se define anteriormente con una
secuencia nucleotídica que es equivalente a la secuencia
nucleotídica de la figura 1 con deleciones, inserciones o
alteraciones en comparación con la secuencia nucleotídica de la
figura 1, de modo que la secuencia nucleotídica con deleciones,
inserciones o alteraciones corresponde a la secuencia de aminoácidos
que se muestra en la figura 1 o a la xilanasa madura que se muestra
en la figura 1.
Además, el DNA recombinante puede contener
muchos otros tipos de información, tales como secuencias reguladoras
(especialmente un promotor de la transcripción) y una parte de
vector provista habitualmente de uno o más genes marcadores. Estos
otros tipos de información a menudo estarán conectados con el
huésped seleccionado. Así, por ejemplo, el vector, los genes
marcadores y las secuencias reguladoras se seleccionarán dependiendo
del huésped seleccionado.
El DNA recombinante también puede contener otros
genes que han de expresarse en el huésped seleccionado. Tal gen
puede codificar ventajosamente al menos otra enzima, en donde dicha
otra enzima tiene actividad amilolítica y/o hemicelulolítica y/o
celulolítica.
Otro aspecto de la invención es una célula que
contiene material genético derivado de material de DNA recombinante
de acuerdo con la invención según se define anteriormente, y más en
particular tal célula capaz de la expresión de al menos la forma de
maduración de xilanasa codificada en dicho material de DNA
recombinante. Existe una preferencia para tal célula que también es
una célula polifuncional de acuerdo con la invención, y más
especialmente para tal célula polifuncional capaz de expresar el
material de DNA recombinante que codifica una forma de maduración
de xilanasa como se define anteriormente bajo condiciones presentes
en la materia prima durante la preparación de un producto
panificable.
Tanto una célula polifuncional que contiene DNA
recombinante que codifica al menos una enzima de acuerdo con la
invención, como una célula que contiene material de DNA recombinante
de acuerdo con la invención (así como la combinación de las mismas)
puede ser una célula que es por sí misma el resultado directo de
manipulación génica o ser una célula que se origina de cualquier
manera a partir de una célula que ha sido transformada mediante tal
manipulación génica. La invención se extiende adicionalmente tanto a
células vivas como a células que ya no están vivas.
En principio, la invención no conoce
limitaciones especiales con respecto a la naturaleza de las células,
por lo que se prefieren las células capaces de la expresión de una
forma de maduración de xilanasa de origen fúngico. Sin embargo, las
células se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en
células bacterianas, células fúngicas, células de levadura y células
de plantas.
Ejemplos preferidos de células huésped
eminentemente adecuadas son:
(a) células fúngicas de uno de los géneros
Aspergillus y Trichoderma, en particular células
fúngicas de una de las especies Aspergillus niger var.
niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus
nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reisei, y
Trichoderma viride;
(b) células de levadura de uno de los géneros
Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula y Pichia, en
particular células de levadura de una de las especies
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis,
Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Hansenula
polymorpha y Pichia pastoris;
(c) células de planta de un género de planta
seleccionado del grupo que consiste en trigo, cebada, avena, maíz,
guisante, patata y tabaco, tales como células de planta de una de
las especies Solarium tuberosum y Nicotiana tabacum;
y
(d) células bacterianas de uno de los géneros
bacterianos Bacillus, Lactobacillus y Streptococcus,
tales como bacterias de la especie Bacillus subtilis.
Las células de acuerdo con la invención según se
definen anteriormente (polifuncionales y/o que contienen
simplemente DNA recombinante que codifica una forma de maduración de
la xilanasa según se describe anteriormente) pueden ser importantes
como agentes para multiplicar el DNA recombinante o como agentes
para producir al menos una enzima codificada en dicho DNA
recombinante, tal como la forma de maduración de xilanasa.
En el caso de la producción de enzimas es
posible usar la célula para producir enzima y aislar la enzima del
medio de cultivo o usar el medio que contiene la enzima después de
la eliminación de las células como tal, o, en el caso de las
células polifuncionales, usar las propias células para producir la
enzima in situ en el procedimiento para el que son
polifuncionales.
Un uso directo de las propias células es
posible, por ejemplo, si la cepa huésped puede admitirse sin
objeción, en la producción de materiales alimenticios, como es el
caso para diversas especies fúngicas, de levadura, de planta y
bacterianas. En relación con la fabricación de pan, las células de
levadura que se manipulan genéticamente de acuerdo con la presente
invención pueden usarse, por ejemplo, directamente.
Dependiendo en parte del huésped seleccionado,
el gen que codifica xilanasa se usará, con o sin intrones que se
presentan en dicho gen, con sus propias señales de terminación de la
transcripción u originándose a partir de otro gen, y con su propia
secuencia líder o con una secuencia de señal que se origina a partir
de otro gen. Para la transformación de levadura, tal como
Saccharomyces cerevisiae (levadura para pan), es preferible
que los intrones se eliminen y que la propia secuencia líder se
reemplace por una secuencia de señal adecuada para levadura, tal
como la secuencia de señal del gen de la invertasa, asegurando un
procesamiento y una secreción correctos de la proteína madura.
La eliminación de intrones es necesaria al
transformar bacterias, tales como Bacillus subtilis. En este
caso, por ejemplo, la secuencia de señal de
\alpha-amilasa puede usarse como secuencia de
señal.
Métodos de transformación adecuados y vectores
de expresión adecuados provistos de, por ejemplo, un promotor de la
transcripción adecuado, señales de terminación de la transcripción
adecuadas y genes marcadores adecuados para seleccionar células
transformadas ya son conocidos para muchos organismos, incluyendo
diferentes especies bacterianas, de levadura, fúngicas y de planta.
Puede hacerse referencia para la levadura, por ejemplo, a Tajima y
otros, Yeast 1, 67-77, 1985, que muestra la
expresión de un gen extraño bajo el control del promotor de
GAL7 inducible por galactosa en levadura, y para Bacillus
subtilis, por ejemplo, a EP-A-0
157 441, que describe un plásmido pMS48 que contiene el promotor de
SPO2 como un vector de expresión. Para otras posibilidades en éstos
y otros organismos se hace referencia a la bibliografía general.
Otro aspecto más de la invención consiste en un
procedimiento para producir una forma de maduración de una xilanasa
de origen de Aspergillus, que comprende cultivar una célula
polifuncional de la invención capaz de expresar una forma de
maduración de xilanasa y/o una célula capaz de expresar el material
de DNA recombinante de acuerdo con la invención en un medio
nutritivo adecuado, y opcionalmente aislar la forma de maduración
de xilanasa resultante. El término "aislar la forma de maduración
de xilanasa resultante" también comprende una purificación
parcial en la que se recupera una composición de enzima que
comprende la xilanasa relevante.
Aspectos adicionales de la presente invención
son una composición mejoradora del pan que comprende una célula
transformada según la invención, que puede ser una célula
polifuncional según la invención. Dicha célula polifuncional
contiene material DNA recombinante que codifica una forma de
maduración de la xilanasa, en particular la xilanasa madura, y
adicionalmente contiene un gen que codifica al menos otra enzima
seleccionada del grupo de enzimas con actividad amilolítica y/o
hemicelulolítica y/o celulolítica además de una forma de maduración
de la xilanasa, en particular la xilanasa madura.
La invención se elucidará ahora por medio de una
descripción extensiva de la identificación, la donación y la
expresión de una xilanasa adecuada como un mejorador del pan. En el
trabajo experimental descrito en los ejemplos, la cepa fúngica
Aspergillus niger var. awamori CBS 115.52 (ATCC
11.358) se usa como una fuente para la xilanasa. De acuerdo con las
investigaciones llevadas a cabo por los inventores, dicha cepa,
después de la inducción con salvado de trigo, es capaz de producir
una xilanasa que tiene propiedades mejoradoras del pan, mientras
que el medio de cultivo exhibe una actividad de
\alpha-amilasa, una baja actividad de glucanasa y
una baja actividad de proteasa bajo estas condiciones de inducción.
La cantidad de xilanasa producida por la cepa de tipo salvaje, sin
embargo, es demasiado baja para usar en un procedimiento comercial.
Por esta razón la invención también proporciona manipulaciones
génicas que permiten una producción biotecnológica de la xilanasa a
escala comercial.
El trabajo experimental efectuado comprende el
aislamiento del gen que codifica una enzima xilanasa (el gen
xylA) a partir de una biblioteca génica de DNA cromosómico de
Aspergillus niger variedad awamori en un vector
\lambda. Para dicho aislamiento se elaboró una sonda con una
composición derivada de la secuencia de aminoácidos
N-terminal de la proteína madura purificada según se
determina por los inventores. Por medio de esta sonda se aisló un
número de clones \lambda que posiblemente contenían el gen. Se
subclonó un fragmento de DNA de estos clones \lambda positivos.
Posteriormente, se determinó la secuencia de DNA de parte del
fragmento de DNA cromosómico donado. Por medio de estos resultados
y los del análisis de mRNA, se han determinado la longitud del gen
xylA, la longitud del mRNA y la presencia y la posición de un
intrón. Podría derivarse de los datos que el gen xylA
codifica una proteína de 211 aminoácidos (una
pre(pro)-forma) en la que la proteína madura
de 184 aminoácidos está precedida por un péptido "líder" de 27
residuos.
Se han construido tres vectores de expresión que
contienen el gen de xilanasa que incluye el terminador xylA.
En uno de estos vectores el gen xylA está precedido por sus
propias señales de expresión. En el segundo vector las señales de
expresión de xylA (hasta el codón ATG) se han reemplazado por
las señales de expresión constitutivas del gen de gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa (gpdA) de
Aspergillus nidulans (véase Punt, y otros, Gene, 69,
49-57, 1988), mientras que en el tercer vector el
gen xylA está precedido por las señales de expresión
inducibles del gen de glucoamilasa (glaA) de Aspergillus
niger var. niger. Todos los vectores de expresión
contienen el gen de acetamidasa (amdS) de Aspergillus
nidulans como marcador de selección según se describe por K.
Wernars, "DNA mediated transformation of the filamentous fungus
Aspergillus nidulans", tesis, Landbouw Hogeschool
Wageningen 1986. Por medio de este marcador de selección pueden
obtenerse transformantes en los que el vector, y por consiguiente
también el gen xylA, está integrado en el genoma en un gran
número de copias.
Se obtuvieron transformantes de múltiples copias
mediante la transformación de las cepas de Aspergillus A.
niger var. awamori y A. niger var. niger
N402 con los vectores de expresión mencionados anteriormente. En
experimentos en matraces con remoción se midió la producción de
xilanasa después de cultivar los transformantes resultantes en
diferentes medios. Los resultados (niveles de producción máximos) se
listan en la Tabla A dada posteriormente, en la que la actividad de
xilanasa se expresa en 10^{3} unidades (U) por ml. Una unidad se
define como la cantidad de enzima que, por 1 minuto, libera una
cantidad de grupos reductores de xilano equivalente a 1 mg de
xilosa.
| s.c.: | cepa de tipo salvaje de una sola copia | |
| m.c.: | transformantes de múltiples copias | |
| n.d.: | no determinado |
Después de la inducción con xilano los
transformantes de múltiples copias de A. niger var.
awamori y A. niger var. niger N402
"xylA" con promotor de xylA producen mucha más
xilanasa que las cepas de A. niger var. awamori y
A. niger var. niger de tipo salvaje. A partir de esto
y de los datos obtenidos en el análisis molecular del gen, puede
derivarse que el gen donado codifica una xilanasa funcional. Por
otra parte, es evidente a partir de lo mencionado anteriormente que
los transformantes de múltiples copias son capaces de la
sobreproducción de la enzima activa. En pruebas de cocción esa
composición de enzima también tiene las propiedades deseadas.
Los transformantes de múltiples copias de las
cepas huésped con el promotor de gpdA o glaA
heterólogo también son capaces de una producción incrementada de
xilanasa activa. En medio rico los transformantes de
"gpdA" producen una cantidad claramente mayor de
xilanasa que la cepa de A. niger var awamori de tipo
salvaje. Sin embargo, los niveles de producción observados en las
pruebas efectuadas son sustancialmente inferiores que el nivel
obtenido en las pruebas con transformantes de múltiples copias de
"xylA". Después de la inducción con almidón, los
niveles de producción de transformantes de múltiples copias de
"glaA" son comparables con los de transformantes de
múltiples copias de "xylA" en medio de xilano.
En medio con salvado de maíz los mejores
transformantes de múltiples copias de "xylA" de A.
niger var, awamori producen mucha más xilanasa que en el
caso del medio de xilano. En este medio los mejores transformantes
de "xylA" de A. niger var. niger N402 alcanzan
un nivel de producción de xilanasa muy alto. Los transformantes de
múltiples copias de "gpdA" más productivos tanto de
A. niger var. awamori como de A. niger var.
niger N402 en salvado producen tanta xilanasa como en medio
rico. En medio con salvado de trigo la producción por transformantes
de "glaA" de A. niger var. awamori es
inferior que en el almidón. En este medio, sin embargo, los
transformantes de "glaA" de A. niger var.
niger N402 producen más que en almidón.
La producción alcanzada por transformantes de
Aspergillus niger var. niger N402 es superior que la
de transformantes de Aspergillus niger var, awamori.
El nivel de producción de los transformantes de A. niger
var. awamori, sin embargo, puede incrementarse adicionalmente
usando cepas mutantes de A. niger var. awamori
adecuadas, tales como A. niger var. awamori Nº 40, que
producen claramente más xilanasa que la cepa de tipo salvaje. El
A. niger var. awamori Nº 40 mutante se ha obtenido
mediante mutagénesis de esporas de A. niger var.
awamori y selección para la producción de xilanasa. En medio
de salvado el transformante de A. niger var. awamori
Nº 40 de "xylA" producía 190.000 U de xilanasa, que es
un incremento considerable sobre el transformante de A. niger
var, awamori más productivo.
Otros experimentos se refieren al aislamiento y
el uso de la xilanasa así producida como un mejorador del pan
(véase el ejemplo II) y experimentos de expresión en una cepa de
levadura y una bacteria (ejemplos III y IV, respectivamente).
Mientras tanto, el ejemplo V muestra el uso de una levadura
polifuncional de acuerdo con la invención en la preparación de pan,
por lo que dicha levadura produce xilanasa durante la fermentación
de la masa de pan sin hinchar.
La figura 1 muestra la secuencia de DNA de una
parte de un fragmento de Aspergillus niger var.
awamori PstI-PsI de 2,1 kb presente en el
plásmido pAW 14B, fragmento que contiene un gen que codifica una
xilanasa, indicado como el gen xylA. El comienzo de la
traducción y el codón de parada están doblemente subrayados. El
intrón de 49 pb está subrayado. Está indicado el comienzo de la
proteína madura. La secuencia de aminoácidos de la proteína (tanto
de la pre(pro)-forma como de la proteína
madura) también se menciona en la figura 1, usando el código de una
letra.
La figura 2 muestra el mapa de restricción de la
región de DNA genómico de A. niger var. awamori, que
comprende el gen xylA donado en los fagos
\lambda-1 y \lambda-14. Las
abreviaturas usadas indican: .S: SalI; E: EcoRI; H:
HindIII; P: PstI; B: BamHI; S Nº: sito SalI que se
origina a partir del polienlazador de
\lambda-EMBL3; D: Sau3A. La barra gruesa
indica un fragmento PstI*-BamHI de 1,2 kb que se hibrida con
Xy106.
La figura 3 muestra el plásmido pAW14B obtenido
mediante una inserción de un fragmento SalI de A. niger var.
awamori de 5,3 kb en pUC19.
La figura 4 muestra el plásmido pAW14S que
contiene el gen Xy1A con su propio promotor de y amdS como un
marcador de selección.
La figura 5 muestra el plásmido
pAW14B-2 que contiene una fusión de traducción del
gen XylA con el promotor de gpdA de A.
nidulans.
La figura 6 muestra el plásmido pAW
14S-2 que contiene una fusión de traducción del gen
XylA con el promotor de gpdA de Aspergillus
nidulans y amdS como un marcador de selección.
La figura 7 muestra el plásmido
pAW14S-3 que contiene una fusión de traducción del
gen XylA con el promotor de glaA de Aspergillus
niger y amdS, como un marcador de selección.
La figura 8 muestra las secuencias nucleotídicas
del fragmento de DNA BAK1 y de los oligonucleótidos sintéticos a
partir de los cuales se construye este fragmento.
La figura 9 es una representación esquemática de
la construcción del plásmido pBAK1.
La figura 10 muestra las secuencias
nucleotídicas del fragmento de DNA BAK2 y de los oligonucleótidos
sintéticos a partir de los cuales se construye este fragmento.
La figura 11 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pBAK21.
La figura 12 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2901.
La figura 13 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2904.
La figura 14 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2921.
La figura 15 muestra las secuencias
nucleotídicas del fragmento de DNA BAK4 y de los oligonucleótidos
sintéticos a partir de los cuales se construye este fragmento.
La figura 16 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2950.
La figura 17 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2951.
La figura 18 muestra la secuencia nucleotídica
del promotor de PGK de S. cerevisiae amplificado in
vitro. En la secuencia de doble hebra los cebadores se muestran
en negrita, el codón de iniciación ATG está sobre un fondo
sombreado, y se indican los sitios de restricción EcoRI,
BglII, BspMI y HindIII.
La figura 19 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2918.
La figura 20 muestra las secuencias
nucleotídicas del fragmento de DNA BAK5 y de los oligonucleótidos
sintéticos a partir de los cuales se construye este fragmento.
La figura 21 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2920.
La figura 22 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2922.
La figura 23 es una representación esquemática
de la construcción del plásmido pUR2923.
Para aislar el gen de xylA a partir de
DNA cromosómico de Aspergillus niger var. awamori, se
sintetizaron diferentes sondas que consistían en mezclas de
oligonucleótidos (Tabla B). Las composiciones de estas mezclas se
derivaban de la secuencia de aminoácidos N-terminal
de proteína xilanasa purificada.
Secuencia de aminoácidos
N-terminal de la proteína xilanasa:
X=A,G,C o T
Xy101: una mezcla de 256 oligonucleótidos que
tienen una longitud de 23 desoxinucleótidos de los que la secuencia
es complementaria a la parte de la hebra de codificación que
codifica los aminoácidos 5-12.
Xy104: un oligonucleótido que tiene una longitud
de 47 desoxinucleótidos de los que la secuencia es complementaria a
la parte de la cadena de codificación que codifica los aminoácidos
2-17.
Xy105: una mezcla de 144 oligonucleótidos que
tienen una longitud de 23 desoxinucleótidos de los que la secuencia
es complementaria a la parte de la hebra de codificación que
codifica los aminoácidos 10-17.
Xy106: una mezcla de 256 oligonucleótidos que
tienen una longitud de 47 desoxinucleótidos cuya secuencia es
complementaria a la parte de la hebra de codificación que codifica
los aminoácidos 2-17.
En Xy105 y Xy106 no todas las bases que pueden
presentarse posiblemente se introducen en la tercera posición de
los codones para obtener no más de 256 oligonucleótidos en la
mezcla.
Por medio de análisis de transferencia Southern,
se estableció que en digestos de DNA cromosómico - bajo condiciones
restrictivas - sólo una banda se hibrida con las sondas usadas. En
el digesto de EcoRI, SalI y BamHI de DNA de
Aspergillus niger var. awamori, una banda de,
respectivamente, 4,4, 5,3 y 9,5 kb, se hibrida tanto con Xy101, con
Xy104 como con Xy106. Con Xy105 no se encontró una señal clara a
41ºC. Sobre la base de este resultado, una biblioteca génica
\lambda de DNA de Aspergillus niger var. awamori se
hibridó a 65ºC con la mezcla de oligonucleótidos Xy106 como una
sonda. De las 65000 placas probadas (correspondientes a 32 veces el
genoma), tres placas (\lambda-1,
\lambda-14 y \lambda-63) se
hibridaban con esta sonda. Después de la hibridación de los
digestos de DNA de \lambda-1 y
\lambda-14 con Xy106, se encontró una banda de
hibridación de >10 kb en el digesto de EcoRI de
\lambda-1. El tamaño de la banda de hibridación en
el \lambda-14 y el digesto cromosómico de EcoRI
era 4,4 kb. En el digesto de SalI de \lambda-1 se
hibrida una banda de 4,6 kb; en el digesto de SalI de
\lambda-14 ésta es, como en DNA cromosómico, una
banda de 5,3 kb. Además, un fragmento
PstI-BamHI de 1,2 kb (figura 2) se hibrida
con Xy106. Sobre la base de modelos de restricción con diferentes
enzimas e hibridación cruzada de digestos de
\lambda-1 y \lambda-14 con el
fragmento SalI de 5,3 kb de \lambda-14, se
confirmó que estos \lambda's contenían fragmentos de solapamiento
del genoma de Aspergillus niger var. awamori. Además,
la hibridación homóloga de RNA inducido total con, respectivamente,
\lambda-1, \lambda-14 y el
fragmento SalI de 5,3 kb de \lambda-14confirmaba
la presencia de secuencias de XylA sobre estos ks. La
hibridación se encontró con un mRNA inducido por xilano de alrededor
de 1 kb. El tamaño del mismo corresponde al de la molécula de mRNA
que se hibrida con Xy106.
Los fragmentos de SalI que se hibridan
con Xy106 de, respectivamente, \lambda-1 (4,6 kb)
y \lambda-14 (5,3 kb) se donaron en dos
orientaciones en el sitio SalI de pUC19, lo que daba como
resultado el plásmido pAW1 (A y B) y el plásmido pAW14,
respectivamente (A y B, véase la figura 3). El fragmento
PstI-BamHI de 1,2 kb que se hibrida con
Xy106 y el fragmento BamHI-PstI de 1,0 kb
adyacente de, respectivamente, pAW14A y pAW1A se subclonaron en
M13mp18 y M13mp19 segmentados con BamHI y PstI, dando
como resultado los vectores m18/m19 AW de la Tabla C.
La dirección de la transcripción del gen
xylA se estableció por medio de hibridación por transferencia
puntual de ss-DNA de, respectivamente,
m18AW14A-1 y m19AW14A-1 con Xy106.
Se encontró que el ss-DNA de
m19AW14A-1 (5' *PstI-BamHI 3') se hibrida
con esta sonda. Debido a que la secuencia de Xy106 es igual a la de
la hebra que no codifica, m19AW14A4 contiene la hebra de
codificación. Sobre la base de esto se determinó la dirección de la
transcripción mostrada en la figura 2. Esta dirección se confirma
mediante los resultados de un experimento de extensión de
cebador.
La secuencia de DNA de una parte de la región
promotora se determinó mediante análisis de la secuencia de pAW14
con Xy106 como un cebador (parte 5' del gen). En esta región se
seleccionó un cebador XyIII con la secuencia 5'-GCA
TAT GAT TAA GCT CG-3', con lo que se determinó la
secuencia de DNA de la hebra complementaria de
m18AW14A-1 y m18AW1A-1. Los
resultados mostraban que estos vectores contenían una secuencia de
DNA que era sustancialmente igual a la de Xy106, mientras que la
secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de pares de bases
era idéntica a la secuencia de aminoácidos
N-terminal de la proteína xilanasa madura. Así, se
probó la clonación de al menos el extremo 5' del gen xylA.
La presencia del gen xylA entero en los vectores pAW14 y pAW1
parecía plausible sobre la base de la posición del extremo 5' del
gen en los fragmentos de SalI (figura 2) y el tamaño del mRNA de
xylA (alrededor de 1 kb).
La secuencia de bases del gen xylA se
estableció en dos direcciones en los subclones tanto m13AW14 como
m13AW1 por medio del procedimiento didesoxi de Sanger (Sanger y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467,
1977). La secuencia alrededor del sitio BamHI situado aguas
abajo del sitio PstI* (figura 2) se estableció mediante análisis de
la secuencia de DNA de pAW14 y pAW1de doble hebra. Las compresiones
se aclaran usando dITP en lugar de dGTP. En los clones dependientes
\lambda-1 y \lambda-14, se
establece una secuencia de xylA idéntica. La secuencia
completa (codificación) del gen de
pre(pro)-xilanasa se muestra en la figura 1.
La proteína xilanasa madura se prepara mediante un péptido líder de
27 aminoácidos. Entre los residuos alcalinos en las posiciones 16 y
17 está probablemente presente un sitio de segmentación para la
peptidasa de señal. A partir de la longitud del péptido líder puede
derivarse que está presente en la proteína un segundo sitio de
procesamiento. La segmentación de la banda entre Arg (27) y Ser (28)
posiblemente tiene lugar mediante una proteína similar a KEX2.
En el gen xylA se predijo un intrón de 49
ó 76 pb (231-279 o 231-306, véase la
figura 1) sobre la base de la presencia de secuencias
correspondientes a sitios "donantes" y "aceptores" de
intrones en Aspergilli. La prueba definitiva de la ausencia
de un intrón de 76 pb se obtuvo mediante el aislamiento de un
péptido de xilanasa con la secuencia
Tyr-Ser-Ala-Ser-Gly...
Este péptido sólo puede estar localizado en la proteína a partir de
la posición 302 (véase la figura 1).
\newpage
La posición del codón de parada del gen
xylA (posición 683 en la figura 1) se derivó de los datos de
la secuencia de DNA. Este codón de parada se confirmó, ya que la
secuencia de aminoácidos de un péptido es idéntica a la secuencia
de aminoácidos C-terminal derivada de los datos de
la secuencia de DNA (posición 641-682 en la figura
1).
Sobre la base de los datos anteriores el gen que
codifica una xilanasa de Aspergillus niger var.
awamori se clona en un fragmento de SalI de 5,3 kb.
Se establecieron la secuencia de DNA del gen, la posición del intrón
y la longitud del mRNA. La secuencia de aminoácidos
N-terminal establecida de la proteína madura se
confirmó completamente mediante la secuencia de DNA. Sobre la base
de los datos anteriores puede concluirse que el gen xylA
codifica una proteína de 211 aminoácidos y que los primeros 27
aminoácidos se eliminan post-traslacionalmente. La
secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de DNA del gen
xylA demuestra un alto grado de homología con la secuencia
de aminoácidos de xilanasas de Bacillus pumilus (201
aminoácidos) y Bacillus cirulans (213 aminoácidos incluyendo
la señal).
Se construyeron tres vectores de expresión que
contenían el gen xylA genómico a partir del comienzo de la
traducción que incluye el terminador xylA. Estos vectores se
derivaron de pAW14B (figura 3).
El vector pAW14S (figura 4) comprende un
fragmento de DNA cromosómico de 5,3 kb de Aspergillus niger
var. awamori sobre el que está situado el gen xylA
con sus propias señales de expresión. Además, un fragmento de 5,3
kb de Aspergillus nidulans sobre el que está situado el gen
de acetamidasa (amdS) está presente sobre este plásmido. En
pAW14S, los genes amdS y xylA tienen la misma
dirección de transcripción.
El plásmido pAW14S-2 (figura 6)
difiere de pAW14S en que el fragmento de Aspergillus niger
var. awamori situado aguas arriba del codón ATG del gen
xylA se reemplaza por las señales de expresión constitutivas
(hasta el triplete ATG) del gen de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (gpdA) de Aspergillus nidulans. En el
plásmido, el gen amdS y el xylA tienen la misma
orientación. La conexión correcta entre el promotor de gpdA y
el codón ATG del gen xylA se obtuvo por medio de un
fragmento de DNA sintético. Durante la construcción, también se
obtuvo el plásmido pAW14B-2 en el que está ausente
el marcador de selección amdS (figura 5).
El vector pAW14S-3 (figura 7)
comprende las señales de expresión inducibles del gen de
glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger var.
niger hasta el codón ATG seguido por secuencias de
Aspergillus niger var. awamori, partiendo del
triplete ATG del gen xylA. Además, este plásmido también
comprende el gen amdS de Aspergillus nidulans como un
marcador de selección. El gen amdS y el gen xylA
tienen la misma orientación.
Por medio del marcador de selección amdS,
pueden obtenerse transformantes con los tres plásmidos mencionados
anteriormente, en los que el vector, y por consiguiente también el
gen xylA (opcionalmente híbrido), se ha integrado en el
genoma en un gran número de copias, para incrementar la producción
de la proteína xilanasa.
La frecuencia de transformación de
Aspergillus niger var. awamori variaba de 0,03 a 0,23
(AQ) transformantes por \mug de DNA de vector. En total, esto
daba como resultado 5 transformantes AW14S (promotor de
xylA), cuarenta AW14S-2 (promotor de
gpdA) y ocho AW14S-3 (promotor de glaA).
En la investigación continuada diferentes transformantes resultaron
tener un comportamiento de crecimiento desviado. Uno de ellos, AW14S
Nº 1, daba colonias que esporulaban apropiadamente (AW14S Nº 1A) y
que esporulaban pobremente (AW14S Nº 1B).
La transformación de Aspergillus niger
var. niger N402 procedía más eficazmente que la de
Aspergillus niger var. awamori. Con pAW14S,
pAW14S-2 y pAW14S-3, se encontraron
respectivamente 0,3, 0,3 y 1 transformantes (AB) por mg de DNA. Se
cultivaron en estrías veinte transformantes pAB14S (promotor de
xylA), treinta pAB14S-2 (promotor de
gpdA) y dieciséis pAB14S-3 (promotor de
glaA).
La co-transformación de pyrG
AB4.1 de Aspergillus niger var. niger con pAW 14S y el
gen pyrG de Aspergillus niger var. niger en pAB4.1
daba como resultado 0,2 transformantes por Mg de DNA de pAW14S
cuando se seleccionaban ambos marcadores. Durante la primera
selección para amdS se encontraron 2 transformantes por Mg de
DNA, mientras que la frecuencia en la primera selección para
pyrG era alrededor de 20 \mug de DNA de pAW14S. Parecía que
alrededor de 30% de los co-transformantes
(AB4.1-14S) poseía ambos marcadores. Seis de ellos
se analizaron adicionalmente.
Después de cultivar transformantes AW14S con
xilano como un inductor, el nivel de producción de xilanasa obtenido
en el medio después de 10 días era significativamente superior que
con la cepa de Aspergillus niger var. awamori de tipo
salvaje. Durante el almacenamiento de los medios a 4ºC, la enzima es
completamente estable. Los niveles de producción en medio de xilano
se listan en la siguiente Tabla D.
Se determinó la actividad de xilanasa en medio
de xilano de la cepa huésped Aspergillus niger var.
niger pyrG AB4.1 y de siete
co-transformantes AB14S-1 Pyr+
después de 48 y 72 horas de cultivo, respectivamente (véase la Tabla
E). Aspergillus niger var. niger AB4.1 produce poca
xilanasa (alrededor de 5000 U). Para cuatro de siete
co-transformantes se encontró una actividad
de xilanasa alta de alrededor de 30000 U. Los otros
co-transformantes producían algo menos de
xilanasa.
Puede derivarse de la actividad de xilanasa
altamente incrementada en el medio de transformantes de
"xylA" de múltiples copias de Aspergillus niger
var. awamori y Aspergillus niger var, niger N
402 que el gen clonado codifica xilanasa de Aspergillus
niger var, awamori y que los transformantes son capaces
de sobreproducción de xilanasa activa. La presencia del producto
deseado se observó mediante análisis químico proteínico del medio
de AW14S Nº1A. Una proteína dominante estaba presente en el medio.
El punto isoeléctrico (pl) y la secuencia de aminoácidos
N-terminal de este componente principal eran igual a
los de xilanasa purificada de Aspergillus niger var.
awamori de tipo salvaje. El valor de pl encontrado
correspondía al valor calculado para la proteína madura de 184
aminoácidos para la que se ha derivado la composición de la
secuencia de DNA. En pruebas de cocción, la xilanasa producida
también resultaba poseer las propiedades deseadas.
Seis transformantes AW14S-2 se
cultivaron en medio rico (Tabla F). Después de dos a tres días se
encontró una actividad de xilanasa que variaba de 15000 a 20000 U
en el medio de tres transformantes, mientras que los otros tres
producían menos de la mitad de dicha actividad. La cepa de tipo
salvaje no produce xilanasa en medio rico. Además, se probaron diez
transformantes AB14S-2. Tres de ellos producían
alrededor de 11000 U de xilanasa después de 40 horas, nivel que se
mantuvo durante al menos hasta 72 horas. Los otros cinco producían
menos enzimas xilanasa, mientras que la actividad en el medio de Nº
2113 estaba en de 9000 a 0 U en 24 horas.
Se encontró que el máximo de producción de los
transformantes AW14S-2 y AB14S-2 más
productivos es en general reproducible. Sin embargo, el máximo no
se alcanza cuando el micelio crece en glóbulos grandes, mientras que
se encontró un máximo superior (19000 en lugar de 11000 U) en un
cultivo de AB14S-2 Nº 5 duplicado. Los niveles de
producción se listan en la Tabla F.
Los resultados muestran que es posible producir
xilanasa activa por medio de una fusión de traducción del promotor
de gpdA y el gen xylA. Sin embargo, la producción por
medio de transformantes tanto AW14S-2 como
AB14S-2 regulados por el promotor de gpdA en
medio rico es inferior que la producción de xilanasa de
transformantes de "xylA" en medio con xilano.
| \begin{minipage}{80mm} \Delta máximos, encontrados cuando se repite el cultivo; un cultivo de AB14S-2 N^{o} 5 por duplicado daba un máximo superior. En medio rico, A. niger var. awamori y el transformante AW14S N^{o} 4 no producen xilanasa.\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron algunos transformantes AW
14S-3 y la cepa de tipo salvaje de Aspergillus
niger var. awamori en medio de almidón (Tabla G). Se
encontró una actividad de xilanasa de 67000 U/ml en el medio de un
transformante después de 90 horas de cultivo, mientras que otros
dos transformantes producían hasta 36000 U/ml. El máximo de
producción de seis transformantes AB14S-3 analizados
se encuentra un día antes que el de transformantes AW
14S-3. Se encontró una actividad de 51000 U/ml en el
medio de un transformante, otros dos producían aproximadamente
43000 U/ml, después de 63 horas de cultivo. Los resultados muestran
que la fusión de traducción entre el promotor de glaA y el
gen xylA se efectúa de manera correcta. Los transformantes
tanto AW14S-3 como AB14S-3 producen
sustancialmente tanta enzima xilanasa en medio de almidón, regulado
por el promotor de glaA, como transformantes de
"xylA" en medio con xilano.
Es evidente a partir de los resultados (Tablas H
e I) que el nivel de producción observado para AW 14S Nº 4 cuando
se cultiva en medio con salvado de trigo es superior que en medio de
xilano. Se obtuvo un alto nivel de producción con transformantes
AB4.1-14S (Nº 1 y Nº 44) y AB14S (Nº 5 y Nº 14). Se
determinó que la actividad de xilanasa obtenida con dichos
transformantes era tan alta como 140000 U/ml. Esto significa un
incremento considerable con respecto a la producción en medio de
xilano (30000 U/ml). Parece además que el nivel de producción de
estos transformantes de Aspergillus niger var. niger
también se mantiene al prolongar el período de cultivo, como se
encontró previamente con transformantes de "xylA" de
Aspergillus niger var. awamori en medio de xilano.
AW14S-2 Nº 22 y Nº 39 producían
hasta 28000 U/ml de xilanasa. Los transformantes
AB14S-2 Nº 5 y Nº 17producían relativamente poca
xilanasa (actividad hasta 15000 U/ml) con salvado de trigo, como
también se encontró en medio rico. Los niveles de producción se
listan en las Tablas H e I.
Los transformantes AW14S-3
probados (Nº1 y Nº 7) producían hasta 25000 y 45000U/ml de
xilanasa, respectivamente, en medio con salvado de trigo, lo que
para ambos es alrededor de 70-65% de los valores
encontrados en almidón (Tabla I). Con transformantes
AB14S-3 (Nº 4 y Nº 14), sin embargo, se determinó
una producción superior con salvado de trigo que en almidón. Los
niveles de producción determinados son 1,5 veces superiores que en
almidón. Se obtuvo una producción de 72000 U/ml con
AB14S-3. Se encontró un valor de 66000 U/ml con
AB14S-3 Nº 14 (Tabla I).
Los resultados que se resumen en la Tabla A
muestran que los transformantes de múltiples copias de
Aspergillus niger var. awamori (AW14S) y
Aspergillus niger var. niger (AB14S) son capaces de
sobreproducción de xilanasa activa después de la inducción de su
propio promotor de xylA con, respectivamente, xilano y
salvado de trigo como un inductor. La expresión de xilanasa
mediante transformantes de múltiples copias de Aspergillus
niger var. awamori y Aspergillus niger var.
niger N402 con el gen xylA bajo el control del
promotor de gpdA (respectivamente, AW14S-2 y
AB14S-2) y el promotor de glaA
(respectivamente AW14S-3 y AB14S-3)
indica que puede producirse xilanasa en una amplia gama de
sustratos. La variabilidad en las productividades entre los
diferentes transformantes puede ser el resultado de diferencias en
el número de copias y/o de diferencias en el sitio de integración
en el genoma. Por supuesto, las condiciones de prueba también pueden
tener un efecto significativo sobre la producción de xilanasa. Para
la optimización de la producción, sin embargo, se dará preferencia a
cepas que muestran una productividad relativamente alta.
En los experimentos se usaron las cepas y los
plásmidos siguientes:
- Aspergillus niger var. awamori
cepa CBS 115,52, ATCC11358;
- Aspergillus niger var. niger
cepa N402, un mutante cspAl (conidióforos cortos) de Aspergillus
niger var. niger ATCC9029, CBS 120,49;
- Aspergillus niger var. niger
AB4.1, un mutante pyrG de Aspergillus niger var. niger
N402, descrito por Van Hartingsveldt y otros, Mol. Gen. Genet. 206,
71-75, 1987;
- Escherichia coli cepa JM109 (para el
aislamiento del plásmido, véase Yanisch-Perron y
otros, Gene 33, 103-119, 1985);
- Escherichia coli cepa NM539 (para la
construcción y la amplificación de la biblioteca de genes
lambda);
- plásmido pGW325, que contiene el gen
amdS de Aspergillus nidulans, véase K. Wernars,
"DNA-mediated transformation of the filamentous
fungus Aspergillus nidulans", Tesis, Agricultural University of
Wageningen, 1.986;
- plásmido pAB4.1, que contiene el gen
pyrG de Aspergillus niger var. niger N402,
véase Van Hartingsveldt y otros, Mol. Gen. Genet. 206,
71-75,1987;
- plásmido pAN52-1, descrito por
Punt y otros, Gene 56, 117-124, 1987; y el plásmido
pAN52-6, descrito por P.J. Punt, J. Biotechn., en la
prensa;
- vector \lambda-EMBL3 (para
la construcción de una biblioteca génica de un Aspergillus
niger var. awamori), obtenible de Promega Biotec.
Una cepa de Escherichia coli JM109 que
contiene el plásmido pAW14B se depositó en the Centraalbureau voor
Schimmel-cultures (CBS) de Baarn, Países Bajos, bajo
el número CBS 237.90, el 31 de Mayo de 1990.
Se elaboraron protoplastos de Aspergillus
niger var. awamori a partir de micelio por medio de
Novozym 234 (NOVO). El rendimiento de protoplastos era
1-5 x 10^{7}/g de micelio y la viabilidad era
3-8%. Para la transformación, se incubaron
3-8 x 10 protoplastos viables con 5, 10 6 20 mg de
DNA de plásmido que había sufrido dos veces purificación con CsCI.
Los protoplastos transformados se cultivaron en placas sobre placas
de selección estabilizadas osmóticamente (acetamida como una fuente
de nitrógeno) y se incubaron a 25ºC. Después de
6-10 días, eran visibles colonias. La transformación
de Aspergillus niger var. niger N402 y A. niger
var. niger AB4.1, respectivamente, se llevó a cabo en
principio como se describe anteriormente. En el caso de
Aspergillus niger var. niger pyrG AB4.1, sin embargo,
se añadió uridina al medio. En la co-transformación
de A. niger var. niger AB4.1, DNA de pAW14S y pAB4.1
se mezcló en una relación en peso de 4:1; los transformantes se
seleccionaron sobre placas de acetamida con uridina (selección de
amdS), sin uridina (selección de amdS y pyrG) y
sobre placas de medio mínimo con nitrato (selección de
pyrG), respectivamente. Después de 4-5 días,
se hacían visibles colonias. Los (co-transformantes
se cultivaron en estrías dos veces sobre placas de acetamida. Para
obtener grandes cantidades de esporas, las esporas de la segunda
estría se cultivaron en estrías sobre placas con medio rico y se
incubaron durante 5-6 días a
25-28ºC. Las esporas resultantes se almacenaron como
una suspensión (10^{8}-10^{9} esporas/ml) o se
adsorbieron en gel de sílice de modo que las esporas pudieran
almacenarse durante un tiempo prolongado.
Se aisló DNA cromosómico del micelio de
Aspergillus niger var. awamori. El DNA de alto peso
molecular se segmentó parcialmente con Sau3AI, seguido por
aislamiento de fragmentos de 13-17 kb después de la
electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,4%. De estos
fragmentos, 0,4 mg se ligaron con 1,2 mg de DNA de
\lambda-EMBL3 que se segmentó con BamHI y
EcoRI. La mezcla de ligación fue provista de coberturas para
fagos por medio de un sistema de envasado in vitro
(Amersham). Mediante la transducción a E. coli NM539 se
obtuvo una biblioteca génica de alrededor de 154000 placas. Estas
representaban alrededor de 75 veces el genoma de A. niger
var. awamori. Se transfirieron 65000 placas a filtros de
nitrocelulosa (por duplicado).
Análisis por transferencia Southern: Se llevó a
cabo hibridación de digestos de DNA de A. niger var.
awamori cromosómico con mezclas de oligonucleótidos marcados
Xy104 y Xy106 (47 meros) en 6 x SSC, respectivamente, a 68ºC, 62ºC
y 56ºC; para Xy101 y Xy105 (23 meros) se usó una temperatura de
hibridación de 41ºC. La temperatura de hibridación seleccionada era
al menos 5ºC menor que la temperatura de fusión calculada. Las
transferencias se lavaron a la temperatura de hibridación con 5 x y
3 x SSC, respectivamente. La hibridación se llevó a cabo a 68ºC en
6 x SSC, mientras que las últimas etapas de lavado se llevaron a
cabo a la misma temperatura con 2 x y 0,4 x SSC,
respectivamente.
Análisis por transferencia Northern: Se aisló
RNA no inducido total de A. niger var. awamori de
micelio de cultivos en medio rico (después de 3 días de cultivo a
25ºC). RNA inducido originado a partir de cultivos en los que se
usaba xilano al 1% o salvado de trigo al 4% se usó como un inductor.
El micelio se recogió de los últimos cultivos mencionados después
de diferentes períodos de cultivo. Después de 3 y 6 días,
respectivamente, se aisló micelio de medio con salvado de trigo. El
micelio de medio de xilano se recogió después de 6 y 11 días de
cultivo, respectivamente. Las condiciones de hibridación eran
iguales a las del análisis de transferencia Southern.
Medios: El medio de xilano contiene xilano al
1%, extracto de levadura al 0,67% con aminoácidos (Difco) y
cas-aminoácidos al 0,1%. El medio con salvado de
trigo consiste en 4 g de salvado de trigo en 50 ml de agua
corriente, a lo que se añadían 50 ml de una solución salina (pH 5,0)
hasta una concentración final de (NH_{4})_{2}SO_{4} al
0,5%, KH_{2}PO_{4} al 0,15%, MgSO_{4} al 0,025% y KCl al
0,025%. El medio rico para pruebas de expresión es medio mínimo
(MgSO_{4} al 0,05%, NaNO_{3} al 0,06%, KCI al 0,05%,
KH_{2}PO_{4} al 0,15% y elementos traza) con glucosa al 1%,
tripticasa (BBL) al 0,2%, extracto de levadura al 0,5%,
cas-aminoácidos al 0,1% y vitamina. El medio de
almidón contiene almidón al 5% y glucosa al 0,1% en medio mínimo.
Los medios se esterilizaron durante 30 minutos a 120ºC. Se inoculó
medio (100 ml en un matraz de 500 ml) con 2 x 10^{5} esporas/ml,
seguido por cultivo en un incubador de aire(300 rpm) a 25ºC
durante
diferentes períodos. Los cultivos con salvado de trigo como un inductor (Tabla 1) se inocularon con 4 x 10^{5} esporas/ml.
diferentes períodos. Los cultivos con salvado de trigo como un inductor (Tabla 1) se inocularon con 4 x 10^{5} esporas/ml.
La actividad de xilanasa se estableció
determinando la formación de azúcares reductores. Procedimiento: una
muestra de medio (diluida) se añadió a 125 \mul de xilano al 2%
(Sigma) en acetato Na 0,5 M, pH 5,0, a 40ºC,seguido por incubación
de la mezcla de reacción durante 30 minutos a 40ºC. La reacción se
detuvo inmediatamente con 0,5 ml de reactivo de ácido
2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico
(DNS), seguido por complementar del volumen con agua hasta 1 ml. La
mezcla de reacción se calentó durante 5 minutos a 100ºC y se enfrió
hasta temperatura ambiente. La DO se determinó a 534 mm frente a un
blanco. La determinación de la actividad de xilanasa de una muestra
se llevó a cabo al menos dos veces. Se usó acetato Na 0,5 M, pH5,0,
para diluir los medios.
En el análisis de los muchos transformantes, las
cepas huésped y alrededor de 6 transformantes de una serie se
cultivaron en medio rico o selectivo, seguido por la determinación
del nivel de producción de xilanasa. Dos transformantes de cada
serie, con la producción de xilanasa más alta, se analizaron de
nuevo en el mismo medio. Además, el nivel de producción de estos
transformantes se determinó en medio con salvado de trigo.
pAW14S (con el promotor de xylA de
Aspergillus. niger var. niger): El vector de expresión
pAW14S (figura 4) se construyó mediante la inserción de un
fragmento Eco R1 de 5,0 kb del plásmido pGW325, sobre el que se
sitúa el gen amdS de Aspergillus nidulans, en el
sitio EcoRI del polienlazador de pAW14B (figura 3). En
pAW14S, los genes amdS y xylA tienen la misma
dirección de transcripción.
pAW14S-2 (con el promotor de
gpdA de A. nidulans): El fragmento
StuI-NcoI de 1,8 kb lineal de
pAN52-1, sobre el que se sitúa el promotor de
gpdA de A. nidulans (hasta el triplete ATO) se sitúa,
se liga con el fragmento NcoI*-SmaI de 7,2 kb de pAW14B,
obtenido mediante digestión parcial con NcoI y digestión completa
con SmaI. La transformación de E. coli JM109 daba
como resultado el aislamiento del plásmido pAW14B-1
(0,9 kb). El fragmento NruI*-NcoI* de 7,2 kb de
pAW14B-1, obtenido mediante digestión parcial con
NcoI y digestión completa con NruI,se ligo con un fragmento
sintético (79 pb, nucleótidos Nº 1-78 de la hebra de
codificación y nucleótidos Nº 4-78 de la hebra del
molde), que consistía en secuencias de xylA desde el triplete
ATG, dando como resultado pAW14B-2 (figura 5). El
fragmento EcoRI de 5,0 kb de pGW325 (gen amdS. de
Aspergillus nidulans) se introdujo en el sitio EcoRI
único de pAW14B-2, dando como resultado
pAW14S-2 (figura 6). El gen amdS y el
xylA tienen la misma orientación en este plásmido. La
conexión del promotor de gpdA al codón ATG del gen
xylA así como la secuencia del fragmento sintético se
verificó por medio de análisis de la secuencia de DNA.
pAW14S-3 (con el promotor de
glaA de A. niger var. niger N402):
pAN52-6 se segmentó parcialmente con XmnI (3
sitios). El fragmento lineal de 7,5 kb, sobre el que se sitúa el
promotor de glaA de A. niger var. niger N402,
se aisló. Después de segmentar este fragmento con BssHII, un
fragmento BssHII-XmnI de 7,35 kb se ligó con un fragmento de
DNA sintético (alrededor de 150 pb) que contiene el extremo 3' del
promotor de glaA hasta el triplete ATG, seguido por el gen
xylA desde el triplete ATG hasta el sitio NruI situado en el
gen con un extremo BssHII más allá de esto. El plásmido
pAN53-6.URL que se obtenía así se disoció con NcoI y
con NruI, después de rellenar en el sitio NcoI. La secuencia de DNA
del fragmento sintético en pAN52-6.URL se verificó.
El promotor de glaA se colocó antes del gen xylA
mediante la ligación del fragmento "NcoI relleno" -NruI de 2,5
kb de pAN52-6.URL con el fragmento NruI de
alrededor de 10 kb de pAW14S. La inserción de este fragmento en la
orientación correcta daba como resultado pAW14S-3
(figura 7).
La actividad mejoradora del pan de la xilanasa,
obtenida después del aislamiento de caldo de fermentación, se probó
midiendo el incremento de volumen de panecillos belgas cocidos
después de la adición de cantidades crecientes de enzima y masa. La
xilanasa se aisló como sigue.
Se cultivó transformante
AW14S-1A de Aspergillus niger var.
awamori durante 7 días sobre medio con salvado de trigo al
4% en un fermentador que tenía un volumen de trabajo de 8 litros. La
producción de xilanasa era alrededor de 85.000 U/ml. Las células
fúngicas se retiraron mediante una filtración sobre una tela. Se
añadió a continuación sulfato amónico a 6 litros de filtrado, con
agitación, hasta 50% en peso. El precipitado se centrifugó en un
rotor Sorvall GSA a 10000 g durante 20 minutos. El pelet se
suspendió en 500 ml de agua destilada y a continuación se
centrifugó de nuevo a 10000 g. El sobrenadante se concentró a
continuación mediante ultrafiltración por medio de una membrana de
ultrafiltración Amicon PM10 hasta un volumen de 60 ml. Para eliminar
el sulfato amónico la ultrafiltración se repitió dos veces después
de la dilución con agua destilada hasta 300 y 600 ml,
respectivamente. El material obtenido finalmente, que estaba
presente en un volumen de 50 ml, se liofilizó a continuación. El
rendimiento era 4,8 g con una actividad específica de 60000 U/mg
(56% global). Para usar en pruebas de cocción la xilanasa se mezcló
con almidón hasta una concentración de 240 U/mg.
\newpage
Se añadieron 600 ml de agua, 20 g de sal, 20 g
de azúcar (sacarosa), 50 g de levadura (Koningsgist de Gist
Brocados) y 0, 50, 100 ó 200 mg/kg de xilanasa (240 U/mg) a 1000 g
de harina de trigo Banket Extra (de Wessanen). Las especies de masa
se amasaron en un amasador Erberhardt durante 10 minutos a una
temperatura de la masa de 24ºC. Después de 20 minutos de
fermentación a 28ºC, la masa se batió, se dividió en pequeñas
porciones de masa de alrededor de 50 g y se fermentó una vez más en
una cabina de elevación durante 60 minutos a de 35ºC a 38ºC. Las
porciones de masa se cocieron a continuación a 230ºC durante 20
minutos. Los volúmenes específicos (en ml/g) se determinaron
dividiendo el volumen (en ml), determinado por medio del método de
desplazamiento de la semilla, por el peso (en g).
Para una media de 10 panecillos se encontraron
los siguientes resultados:
Pueden establecerse las mismas tendencias si,
además, se añaden otros ingredientes mejoradores del pan tales como
vitamina C, grasa, emulsionantes y \alpha-amilasa.
Otras propiedades, tales como el procesa-miento de
la masa y la estructura de la miga, también son afectadas
positivamente añadiendo la enzima xilanasa.
Como un ejemplo de la producción heteróloga de
xilanasa de Aspergillus niger var. awamori por
microorganismos, se construyeron vectores de expresión para la
expresión de xilanasa en Saccharomyces cerevisiae regulada
por el promotor de GAL7, inducible (Nogi y Fukasawa, 1983).
El promotor de GAL7 afecta ala producción de enzima bajo
condiciones inductoras: crecimiento sobre medio con galactosa como
la única fuente de carbono (Hopper y Rove, 1978). Ya se ha descrito
el uso de este promotor para la producción inducida de proteínas
heterólogas (Tajima y otros, 1985). El gen fúngico que codifica
xilanasa se hizo en primer lugar adecuado para la expresión en
Saccharomyces cerevisiae eliminando el intrón (secuencia que
no codifica) por medio de un fragmento de DNA sintético. Se ha
usado la misma técnica para proporcionar una conexión correcta del
gen de xilanasa con el promotor de GAL7 de Saccharomyces
cerevisiae. Opcionalmente, también se introdujo una secuencia de
señal de Saccharomyces cerevisiae, la secuencia de señal de
invertasa, para lograr la secreción de la enzima xilanasa fúngica
por la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se han usado
vectores que se replican autónomamente así como vectores
integradores (de múltiples copias) en la producción de la xilanasa
de Aspergillus niger var. awamori por la levadura
Saccharomyces cerevisiae. Todos los procedimientos de
donación se llevaron a cabo en E. coli cepa JM109
(Yanisch-Perron y otros, 1985) y todos los métodos y
las técnicas de acuerdo con Maniatis y otros (1982).
La primera construcción intermedia se dirigió a
la eliminación correcta del intrón del gen de xilanasa, es decir,
sin cambiar o perturbar la secuencia de codificación. Los
oligonucleótidos de DNA sintéticos mostrados en a figura 8 (BAK 02,
03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 23 y 24) se reasociaron y se ligaron
entre sí dando como resultado un fragmento BAKI. El fragmento BAKI
mide 205 pb y comprende el fragmento de xilanasa
SacI-KpnI (pb 185-pb 427) del que
se ha eliminado el intrón. Los oligonucleótidos de DNA sintéticos se
han diseñado de tal manera que, al eliminar el intrón, se ha
formado una conexión correcta con los fragmentos de modo que el
marco de lectura abierto (que codifica xilanasa) no se perturba.
Para simplificar la construcción continuada, el sitio SacI se
cambió por un sitio XhoI, En el lado 5' el fragmento estaba provisto
de un sitio EcoRI. La mezcla de ligación se digirió con las enzimas
de restricción KpnI y EcoRI y el fragmento de 205 pb
correcto se aisló por medio de electroforesis en gel de agarosa
para la separación del fragmento y elución en gel para el
aislamiento del fragmento del gel de agarosa. El fragmento de BAKI
KpnI-EcoRI se clonó en el sitio KpnI
y el EcoRI del vector pTZ19R (obtenido de Pharmacia) dando
como resultado pBAK1 (véase la figura 9). El fragmento insertado en
el plásmido pBAK1 construido se verificó por medio de análisis de la
secuencia.
Las construcciones continuadas se dirigieron a
la realización de una conexión correcta del gen de xilanasa de
Aspergillus niger var. awamori con el promotor de GAL7
de Saccharomyces cerevisiae. Para este propósito, los
oligonucleótidos de DNA sintéticos mostrados en la figura 10 (BAK13,
14, 15, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27 y 28) se reasociaron y se
ligaron dando como resultado el fragmento BAK2. El fragmento BAK2
mide 202 pb y comprende la transición sintética desde el sitio SacI
del promotor de GAL7 a través de la secuencia de señal de la
invertasa con el gen de xilanasa maduro hasta el sitio SacI (pb
185). Para simplificar la construcción continuada, el sitio SacI se
cambió por un sitio XhoI, de una manera idéntica a la usada
en la construcción de pBAK1. Se proporcionó un sitio EcoRI
adicional en el sitio 5' del fragmento. La mezcla de ligación se
digirió con EcoRI y XhoI y el fragmento de BAK2 de 202 pb
correcto se aisló. El plásmido pBAK1 se digirió con EcoRI y
XhoI y los fragmentos de BAK2 con los mismos extremos se
donaron en los fragmentos de vector, dando como resultado el
plásmido pBAK21 (véase la figura 11). El fragmento de BAK2 insertado
se verificó por medio del análisis de la secuencia. En el plásmido
pBAK21, la conexión de los fragmentos BAKI y BAK2 con el sitio XhoI
se efectuó de tal manera que el marco de lectura abierto que
codifica la xilanasa se restauraba correctamente. El plásmido
pBAK21 contiene por lo tanto la transición del promotor de
GAL7 de Saccharomyces cerevisiae desde el sitio SacI,
la secuencia de señal de invertasa de Saccharomyces
cerevisiae (incluyendo un codón de parada ATG) y la xilanasa de
Aspegillus niger var. awamori (que codifica xilanasa
madura) a partir de la cual se ha eliminado correctamente el intrón
fúngico (secuencia que no codifica) hasta el sitio KpnI (la
parte 5' del gen de xilanasa).
El plásmido pAW14B se digirió con KpnI y
BamHI y el fragmento KpnI-BamHI de 327 pb, que
contiene la parte 3' del gen de xilanasa, se aisló. El plásmido
pBAK21 también se digirió con KpnI y BamHI y el
fragmento de vector se aisló. El fragmento de 327 pb aislado y el
fragmento de vector se ligaron entre sí dando como resultado el
plásmido pUR2901 (véase la figura 12). El plásmido pUR2901 se
verificó por medio de análisis por enzimas de restricción. El
plásmido pUR2901 contiene el sitio de fusión del promotor de
GAL7 de S. cerevisiae en el sitio SacI, la
secuencia de señal de la invertasa de S. cerevisiae (incluyendo un
codón de parada ATG) y el gen de xilanasa de Aspergillus
niger var. awamori completo (que codifica la xilanasa
madura) del que se ha eliminado correctamente el intrón fúngico
(secuencia que no codifica).
La construcción del vector de expresión pUR2904
comenzó a partir del plásmido pUR2740. El plásmido pUR2740 es un
derivado de pUR2730 (Overbeeke 1987) usado para la producción de
\alpha-galactosidasa en S. cerevisiae. El
plásmido pUR2740 no es esencialmente diferente de pUR2730, se han
eliminado algunas secuencias superfluas en la parte no funcional
del vector. El plásmido pUR2740 es un vector lanzadera de E.
coli/S. cerevisiae. Se hizo uso del origen de replicación de 2
\mum, y el gen LEU2d de S. cerevisiae servía como un
gen de selección para la replicación en S. cerevisiae. El
plásmido pUR2740 se digirió con SacI y HindIII, y el
fragmento de vector se aisló. Como resultado de esta digestión, se
eliminó el gen de a-galactosidasa. El plásmido
pUR2901 también se digirió con SacI y HindIII, y se
aisló el fragmento de 730 pb que comprende el sitio de fusión del
promotor de GAL7 de S. cerevisiae en el sitio SacI, la
secuencia de señal de la invertasa de S. cerevisiae
(incluyendo un codón de parada ATG) y el gen de xilanasa de A.
niger var. awamori completo (que codifica la xilanasa
madura). El fragmento de vector pUR2740 y el fragmento de 730 pb de
pUR2901 se ligaron entre sí, dando como resultado pUR,2904 (véase
la figura 13). El plásmido pUR2904 se verificó por medio de análisis
de enzimas de restricción. El plásmido pUR2904 es el vector de
expresión para la producción de la xilanasa de Aspergillus
niger var. awamori por la levadura Saccharomyces
cerevisiae. El plásmido pUR2904 es un vector lanzadera de E.
coli/S. cerevisiae. Contiene la secuencia de DNA que codifica
xilanasa con la secuencia de señal de la invertasa fusionada a
ella; la secuencia de señal de la invertasa proporcionará la
secreción de la xilanasa. La secuencia de DNA enpUR2904 codifica
exactamente la misma xilanasa que la cepa de A. niger de
tipo salvaje. Durante la secreción la proteína de fusión resultante,
en principio, sufrirá el procesamiento por la peptidasa de señal de
Saccharomyces cerevisiae en enzima xilanasa madura secretada.
La expresión de la xilanasa se regula mediante el promotor de
GAL7 inducible por galactosa de Saccharomyces
cerevisiae.
Se transformaron células de levadura de la cepa
de Saccharomyces SU10 (\alpha, leu2, ura3, his3,
cir-; depositada en the Centraalbureau voor Schimmelcultures,
P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Países Bajos, bajo el número CBS
323.87) con plásmido pUR2904 a través del método de los
esferoplastos (Beggs, 1978). Las células de levadura transformadas
con leu+ resultantes se analizaron con respecto a la
presencia de xilanasa. Las células de levadura se hicieron crecer
dos veces durante la noche sobre medio MM (Base Nitrogenada de
Levadura al 0,67% sin aminoácidos, glucosa al 2%) complementado con
uracilo e histidina. Posteriormente, las células de levadura se
transfirieron a un volumen diez veces más grande de medio YPG
(Extracto de Levadura al 1%, peptona Bacto al 2%, galactosa al 5%)
y se hicieron crecer hasta que las células de levadura habían
alcanzado la fase estacionaria. Las células de levadura se
cultivaron bajo agitación a 30ºC. Las células de levadura se
separaron del medio mediante centrifugación. El medio se analizó
con respecto a la presencia de la xilanasa con el ensayo enzimático
que se describe en el Ejemplo 1. El nivel de expresión de xilanasa
era aproximadamente 10000 unidades en 1 ml de medio. Por medio de
enfoque isoeléctrico (véase el Ejemplo 1) se demostró que la
xilanasa producida por Saccharomyces cerevisiae es idéntica
a la xilanasa producida por Aspergillus niger var.
awamori de tipo salvaje. La funcionalidad de la xilanasa,
producida y secretada por Saccharomyces cerevisiae, se
observó en pruebas de cocción llevadas a cabo como se describe en
el Ejemplo UI. Los resultados descritos anteriormente muestran que
la levadura Saccharomyces cerevisiae es capaz de producir y
secretar eficazmente xilanasa de Aspergillus niger var.
awamori.
La expresión del gen de xilanasa de
Aspergillus niger var. awamori en Saccharomyes
cerevisiae también se estudió mediante un sistema de vectores
integradores. Para este propósito, se usó el sistema de integración
de alto número de copias (Lopes, 1989).
La construcción del vector de expresión pUR2921
comenzó a partir del plásmido pUR2778. El plásmido pUR2778 es un
plásmido multi-integrador que se integra en el lugar
de DNA ribosómico de S. cerevisiae. Se usó para la
integración estable de múltiples copias del casete de expresión de
a-galactosidasa en S. cerevisiae. También
contiene secuencias de vector para la replicación y la selección en
E. coli, y el gen LEU2d de S. cerevisiae como un gen
de selección para levadura. El plásmido pUR2778 es un derivado de
pMIRY2 (Lopes, 1989), del que se ha eliminado el fragmento
SmaI-BgIII que contiene el DNA de
Spirodella oligorhiza, y el fragmento
BamHII-HindIII que contiene una parte de las
secuencias de rDNA se ha reemplazado por el fragmento
BgIII-HindIII de pUR2730 (Overbeeke, 1987)
que contiene el casete de expresión de
\alpha-galactosidasa. El plásmido pUR2778 se
digirió con SacI y HindIII, y el fragmento del vector
se aisló de gel de agarosa. Como resultado de esta digestión se
eliminó la secuencia de codificación de
\alpha-galactosidasa que incluye la secuencia de
señal de la invertasa. Este fragmento de vector se ligó con el
fragmento SacI-HindIII de 730 pb de pUR2901,
que también se usó para la construcción de pUR2904, dando como
resultado el plásmido pUR2921 (véase la figura 14). El fragmento
SacI-HindIII de 730 pb de pUR2901 comprende
el sitio de fusión del promotor de GAL7 de S.
cerevisiae en el sitio SacI, la secuencia de señal de la
invertasa de S. cerevisiae (incluyendo el codón de parada
ATG) y el gen de xilanasa de A. niger var. awamori
completo (que codifica la xilanasa madura) del que se ha eliminado
correctamente el intrón fúngico (secuencia que no codifica). El
plásmido pUR2921 se verificó por medio de análisis de enzimas de
restricción. El plásmido pUR2921 es un vector de expresión para la
producción de la xilanasa de Aspergillus niger var.
awamori por la levadura Saccharomyces cerevisiae. El
plásmido pUR2921 contiene secuencias de lugar de DNA ribosómico del
DNA cromosómico de S. cerevisiae. Como no contiene ningún
origen de replicación de levadura, el vector se integrará en el
lugar de DNA ribosómico durante la transformación en S.
cerevisiae. Cuando el plásmido pUR2921 se transforma en una cepa
leu2 de S. cerevisiae, bajo condiciones selectivas, se
integrarán múltiples copias del vector, debido a la baja expresión
del gen marcador LEU2 del plásmido pUR2921. Como resultado
de este procedimiento, el casete de expresión de xilanasa estará
presente en múltiples copias en el cromosoma de levadura. Como el
casete de expresión de xilanasa es exactamente el mismo que en el
plásmido pUR2904, esta cepa de S. cerevisiae secretará la
enzima xilanasa madura del mismo modo que la cepa de S.
cerevisiae con el plásmido pUR2904.
Se transformaron células de levadura de la cepa
de Sasccharomyces SU50
(YT6-2-1, a, leu2, his4, canl, cirº;
Erhart y Hollenberg, 1981) mediante el método de los esferoplastos
con el plásmido pUR2921, linealizado por HpaI. Las células
de levadura transformadas con leu+ se analizaron con respecto
a la producción de xilanasa según se describe para las células de
levadura SU10 transformadas con el plásmido pUR2904. Para estas
células de levadura el medio MM sólo se complementaba con
histidina. El nivel de expresión era aproximadamente 60.000 unidades
secretadas en 1 ml de medio.
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275: 104-109.
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Como un ejemplo de la producción heteróloga de
xilanasa de Aspergillus niger var. awamori por un
microorganismo procariótico, se construyeron vectores de expresión
para la producción de xilanasa por Bacillus subtilis. Se
muestran diversos sistemas de vectores, promotores y secuencias de
señal para la producción de proteínas heterólogas. Para este
ejemplo el promotor de SPO2 y la secuencia de señal de
\alpha-amilasa se usaron para la expresión de la
enzima xilanasa. Este sistema ha sido satisfactorio para la
expresión de la \alpha-galactosidasa de plantas en
B. subtilis (Overbeeke y otros, 1990).
Para la construcción de un vector para la
expresión de xilanasa de Aspergillus niger var.
awamori por Bacillus subtilis, se usaron como un
punto de partida plásmidos construidos para la expresión de xilanasa
en Saccharomyces cerevisiae (véase el ejemplo III), en los
que el intrón (secuencia que no codifica) del gen de xilanasa se
eliminaba correctamente. La eliminación del intrón es esencial,
debido a que un microorganismo procariótico tal como Bacillus
subtilis no es capaz, a diferencia del eucariota Aspergillus
niger var. awamori, de eliminar intrones mediante un
procedimiento llamado corte y empalme.
Los oligonucleótidos de DNA sintéticos mostrados
en la figura 15 (BAK 15, 18, 26, 27, 41 y 42) se reasociaron y se
ligaron entre sí dando como resultado un fragmento BAK4. El
fragmento BAK4 mide 107 pb y comprende la secuencia de DNA que
codifica xilanasa madura hasta el sitio SacI (pb 185 en la figura
1). Para simplificar la construcción continuada, el sitio SacI se
cambió por un sitio XhoI sin cambiar la secuencia de
aminoácidos derivada. Por otra parte, para obtener una conexión
correcta de la xilanasa madura con la secuencia de señal de
a-amilasa en la construcción continuada, se cambió
el primer codón de la xilanasa madura que codifica alanina. El
codón GCT se cambió por GCC, que también codifica alanina. Así, se
creó un sitio SacI sobre el lado 5' del fragmento BAK4. Continuo a
este sitio SacI, el fragmento BAK4 estaba provisto de un sitio
EcoRI. La mezcla de ligación se digirió con EcoRI y XhoI y el
fragmento EcoRI-XhoI de 1075 pb se aisló de
gel de agarosa. Se digirió plásmido pUR2901 (véase el ejemplo III)
con EcoRI y XhoI y el fragmento BAK4 se clonó en el fragmento de
vector con los mismos extremos de enzimas de restricción, dando como
resultado pUR2950 (véase la figura 16). El fragmento insertado BAK4
en pUR2950 se verificó por medio de análisis de la secuencia. En el
plásmido pUR2950, la conexión del fragmento BAK4 y BAKI por medio
del sitio XhoI se llevó a cabo de tal manera que se restauraba
correctamente el marco de lectura abierto que codifica la parte 5'
de la xilanasa. Por otra parte, según se describe en el ejemplo
III, el intrón del gen de xilanasa se eliminaba correctamente. De
acuerdo con esto, el plásmido pUR2950 contiene la secuencia de DNA
del primer codón de alanina de xilanasa madura, en la que se ha
formado un sitio SacI en esa posición, y el gen de xilanasa
de Aspergillus niger var. awamori que codifica la
xilanasa madura del que se ha eliminado correctamente el intrón
fúngico (secuencia que no codifica).
El plásmido pUR2601 (Overbeeke 1990) se usó como
una base para la construcción en la que el gen de xilanasa de
Aspegillus niger var. awamori maduro presente en
pUR2950 se ha fusionado a la secuencia de señal de
a-amilasa para la secreción de la enzima que ha de
producirse, mientras este gen de fusión es regulado por el promotor
de SOP2. El plásmido pUR2601 se digirió con SaclI y
HindIII y se aisló el fragmento de vector con el promotor de
SPO y la secuencia de señal de \alpha-amilasa. El
fragmento SaclI-HindIII de pUR2950 con el gen
de xilanasa madura se aisló y se ligó al fragmento de vector
pUR2601, dando como resultado el plásmido pUR2951 (figura 17). En
el plásmido pUR2951, la secuencia de señal de
a-amilasa se ha fusionado exactamente de la manera
correcta con el gen de xilanasa madura. La mezcla de ligación se
transformó en la cepa DB104 de Bacillus subtilis (Kawamuri y
Doi, 1984), usando el método de los protoplastos/el PEG (Chang y
Cohen, 1979) con kanamicina para la selección. El plásmido pUR2951
se verificó con análisis por enzimas de restricción.
Debido a que la cepa DB104 tiene alguna
actividad de proteasa residual, es necesaria la fermentación de
DB104 con pUR2951 bajo condiciones controladas para evitar la
proteolisis de la enzima secretada. El sistema descrito por
Overbeeke y otros (1990) para la producción de
a-galactosidasa de planta por B. subtilis
puede usarse como punto de partida para la producción de xilanasa
de Aspegillus niger var. awamori por Bacillus
subtilis. En esta fermentación se presta una atención especial
a los niveles de glucosa y amonio durante la fermentación.
Chang, S. y Cohen, S.N.
(1979), Mol. Gen. Genet.
182:77-81.
Kawamura, F. y Doi, R.E.
(1984), J. Bacteriol. 160:442-444.
Overbeeke, N., Termoshuizen,
G.H.M., Giuseppin, M.L.F., Underwood, D.R. y
Verrips, C.T. (1990), Appl. Environ. Microbiol.
56:1429-1434.
Como un ejemplo del uso directo de células que
producen la xilanasa de Aspergillus niger var, awamori
en materiales alimenticios, se ha construido una cepa de
Saccharomyces cerevisiae que produce la xilanasa durante la
fermentación de masa de pan sin hinchar. Para este propósito, la
cepa de S. cerevisiae debe secretar la xilanasa bajo
condiciones presentadas durante la fermentación de masa de trigo.
En la masa de trigo sin hinchar no se añade azúcar y por lo tanto
las principales fuentes de carbono para la levadura para pan que
fermenta son glucosa y maltosa. El gen de xilanasa debe ser
regulado por lo tanto por un promotor que no está afectado por la
represión de glucosa. Los promotores de los genes de la ruta
glicolítica (GAPDH, PGK, ADH1, PYK, etc.) de levadura son
extremadamente útiles para este propósito. Sólo, a modo de ejemplo,
se usó el promotor del gen de fosfoglicerato quinasa (PGK)
de Saccharomyces cerevisiae. Este promotor se usa para la
expresión por S. cerevisiae de numerosas proteínas
heterólogas, por ejemplo la producción de
interferón-alfa humano (Tuite y otros, 1982).
\newpage
El modo preferido para alcanzar la expresión de
una enzima durante la fabricación de pan es usar un vector
integrador (integración de una sola copia o de múltiples copias),
aunque también pueden usarse vectores que se replican
autónomamente.
El promotor de GAL7 del plásmido pUR2921,
usado para la expresión de la xilanasa de Aspergillus niger
var. awamori en Saccharomyces cerevisiae (véase el
ejemplo III), se reemplazó por el promotor de PGK. Cepas de
S. cerevisiae transformadas con este nuevo vector, y que
secretan la enzima xilanasa en medios de cultivo que contienen
glucosa, podrían usarse en la fabricación de pan. La adición de esta
levadura a la masa antes de la mezcladura da como resultado la
secreción de la enzima xilanasa durante la fabricación de pan, y así
exhibe el efecto positivo de esta enzima mejoradora del pan, dando
como resultado un volumen específico incrementado del pan.
Para la fusión de las secuencias promotoras de
PGK de Saccharomyces cerevisiae al gen de xilanasa de
Aspergillus niger var. awamori eran posibles varios
sistemas. Entre otros, la creación de un sitio de endonucleasa de
restricción adecuado al final del promotor por medio de mutagénesis
dirigida al sitio que podría dar una molécula de DNA que, por
ejemplo, podría fusionarse al sitio SacI entre el promotor de
GAL7 y la secuencia de señal de invertasa de pUR2904, el
plásmido usado para la expresión de la xilanasa madura por
Saccharomyces cerevisiae. Otro modo de crear sitios de
restricción adecuados al final de una molécula de DNA es por medio
de una técnica de amplificación in vitro de DNA conocida
como la Reacción en Cadena de la Polimerasa. Esta técnica de PCR se
usó para generar una molécula de DNA que contiene todas las
secuencias importantes del promotor de fosfoglicerato quinasa de
Saccharomyces cerevisiae hasta el codón de iniciación ATG,
con un sitio EcoRI y uno BgIII en su extremo 5' y una
secuencia de reconocimiento BspMI y un sitio HindIII (véase
la figura 18) con respecto al codón de iniciación ATG. Los
cebadores usados para la amplificación eran PGP01:
5'-GGA ATT CAG ATC TTG AAT TGA TGT TAC CCT CAT AAA
GCA CGT G-3' y PGP02: 5'-CCC AAG CTT
ACC TGC TGC GCA TTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG ATA ATT ACT
TCC-3'. El DNA de molde era pUR2801, un vector de
expresión de levadura con el promotor completo de PGK en
Saccharomyces cerevisiae. La mezcla de reacción (volumen
total 100 \mul) estaba compuesta como sigue: aprox. 1 ng de
pUFt28OI cortado con SalI, 100 pmol de PGP01 y 100 pmol de PGP02, 1
U de polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer), 0,2 mmol/l de cada uno de
los siguientes dNTP: dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 1,15 mmol/l
MgCl_{2}, 50 mmol/l KCl, 10 mmol/l Tris\cdotHCl pH8,3 (a 25ºC),
0,001% p/v de gelatina. Después de 2 minutos de incubación a 95ºC,
se llevaron a cabo 25 ciclos de las siguiente etapas de temperatura:
1 min a 95ºC, 1:45 min a 52ºC, 2 min a 72ºC. Después de estos
ciclos la mezcla de reacción se mantuvo a 72ºC durante 5 min antes
de enfriar a 4ºC. Todos los ciclos de temperatura se realizaron en
un termociclador de DNA Perkin Elmer. Se precipitaron 60 \mul de
la mezcla de reacción con etanol y posteriormente la banda de
aproximadamente 600 pb se aisló de gel de agarosa. El DNA aislado
se cortó después con EcoRI y HindIII y se aisló de
nuevo de gel de agarosa. Este fragmento de DNA comienza con un
extremo cohesivo seguido por un sitio BgIII y la secuencia
desde la posición 568 en relación al codón ATG hasta el codón ATG
del promotor de la fosfoglicerato quinasade Saccharomyces
cerevisiae. El codón ATG está seguido por un sitio BspMI
y un extremo cohesivo HindIII. El plásmido de clonación
pTZ19R para múltiples propósitos (obtenido en Pharmacia) se cortó
con EcoRI y HindIII y se ligó con el fragmento del
promotor PGK, dando lugar a pUR2918 (véase la figura 19). El
plásmido se comprobó mediante un análisis de secuencia.
Para la fusión del promotor de PGK de pUR2918 al
gen de xilanasa de los oligonucleótidos de DNA sintéticos mostrados
en la figura 20 (BAK14, 15, 18, 19, 20, 21, 51, 52 y 53) se
reasociaron y se ligaron entre sí dando como resultado el fragmento
BAK5. Los oligonucleótidos BAK51 y BAK53 no se fosforilaron para
evitar el autoligamiento del fragmento resultante, y posteriormente
se aisló el fragmento a partir de gel de agarosa. El fragmento BAK5
tiene 169 pb y comprende la secuencia señal de la invertasa y el gen
de xilanasa madura hasta el sitio XhoI para una correcta
fusión al fragmento BAK1 (véase el ejemplo III). Difiere del
fragmento BAK2 antes mencionado (ejemplo III) en ambos extremos. En
el extremo 5' contiene un extremo cohesivo y justo antes del segundo
codón de la secuencia de señal de la invertasa para obtener una
fusión exacta con la secuencia del promotor de PGK en
pUR2918. En el extremo 3' del sitio XhoI, contiene un extremo
cohesivo HindIII adicional. El plásmido pUR2918 se corta con
BspMI y HindIII y se liga al fragmento BAKS dando como
resultado el plásmido pUR2920 (véase la figura 21). El fragmento
BAK5 insertado se verificó por medio de análisis de la secuencia. El
plásmido pUR2920 contiene el promotor de fosfoglicerato quinasa
(PGK) de Saccharomyces cerevisiae, desde el nucleótido
-568 con relación al codón de iniciación ATG, hasta el codón de
parada ATG, la secuencia de señal de invertasa de Saccharomyces
cerevisiae correctamente fusionada a este codón ATG, y el gen de
xilanasa de Aspergillus niger var. awamori hasta el
sitio SacI. Para simplificar la construcción continuada, el
sitio SacI se cambió por un sitio XhoI según se
describe en el ejemplo III.
El vector de expresión episomal basado en 2
micras pUR2904 (véase el ejemplo III) se usó para construir un
vector plasmídico para la expresión del gen de xilanasa regulado por
el promotor de PGK en S. cerevisiae. El plásmido
pUR2920 se disolvió con BgIII y XhoI y el fragmento de
735 pb que contiene el promotor de PGK, la secuencia de
señal de la invertasa y el gen de xilanasa hasta el sitio
XhoI se aisló de gel de agarosa. El plásmido pUR2904 también
se disoció con BgIII y XhoI y el fragmento de vector grande
se aisló. Como resultado de esta digestión, se eliminaron el
promotor de GAL7 y la secuencia de señal de invertasa. Este
vector pUR2904 se ligó con el fragmento
BgIII-XhoI de pUR2920, dando pUR2922 (véase
la figura 22). El plásmido pUR2922 difiere del vector de expresión
de Saccharomyces cerevisiae pUR2904 (ejemplo III) ya que
contiene el promotor de fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces
cerevisiae antes de la secuencia de señal de invertasa en lugar
del promotor de GAL7.
Para la construcción de un vector de integración
de múltiples copias con el casete de expresión de
PGK-xilanasa, el plásmido pUR2792 servía como punto de
partida. El plásmido pUR2792 es un derivado de pMIRY2 (Lopes,
1.989). Contiene un polienlazador
BgIII-HindIII en lugar de la parte
BgIII-HindIII que contiene el DNA de S.
oligorhiza, y la parte entre el sitio BaII en la
secuencia de pAT153 y el sitio HindIII en la secuencia de
rDNA se han suprimido. El plásmido pUR2792 se segmentó con BgIII y
HindIII y la banda del vector se aisló de gel de agarosa. El
fragmento BgIII-HindIII que contiene el
casete de expresión de xilanasa controlado por PGK se aisló
del plásmido pUR2922 y se ligó al vector pUR2792 que se había
disociado con BgIII-HindIII. El plásmido resultante pUR2923
(véase la figura 23) es un plásmido de integración de múltiples
copias de Saccharomyces cerevisiae que contiene el promotor
de fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae hasta
el codón de iniciación ATG, la secuencia de señal de invertasa de
Saccharomyces cerevisiae fusionada a este promotor y el gen
de xilanasa madura de Aspergillus niger var. awamori
fusionado en el marco con la secuencia de señal de invertasa. El
intrón (secuencia que no codifica) se ha eliminado correctamente del
gen de xilanasa.
Células de levadura de la cepa SU50 de
Saccharomyces cerevisiae se transformaron mediante el método
de los esferoplastos con el plásmido pUR2923, linealizado con
HpaI (véase el ejemplo III). Las células de levadura
transformadas con leu+ resultantes se analizaron con respecto a la
producción de xilanasa según se describe para las células de
levadura SU50 con el plásmido pUR2921, con una alteración, el uso de
medio YPD (Extracto de Levadura al 1%, Peptona Bacto al 2%, glucosa
al 2%) en lugar de YPG en la fase de cultivo final. El nivel de
expresión era aproximadamente 10.000 unidades secretadas en 1 ml de
medio.
Células SU50 de Saccharomyces cerevisiae
que contienen el plásmido pUR2923 integrado con múltiples copias en
el cromosoma de levadura se usaron en una prueba de cocción según se
describe posteriormente. El incremento en el volumen del pan
mediante la adición de xilanasa está provocado por una alteración
enzimática de las colas de almidón, a través de lo cual la masa es
capaz de obtener más ventajas de la actividad de gasificación de la
levadura en la masa. Se requiere por lo tanto una levadura con un
alto poder de gasificación para obtener todo el beneficio de la
adición de la enzima xilanasa. Como la cepa SU50 es una cepa de
laboratorio, no posee buenas propiedades de gasificación. Para un
experimento de cocción con la cepa de levadura SU50 que produce
xilanasa, es así necesario complementar con una cepa de levadura de
buena gasificación.
La prueba de cocción descrita posteriormente se
basaba en la prueba de micro-barras de 10 gramos
(Shogren y Finney, 1984). La formulación de la masa era 10 g de
harina de trigo (Columbus: MENEBA, Países Bajos); 0,15 g de NaCl;
5,9 ml de agua; 0,2 g de levadura prensada (Koningsgist; Gist
Brocades, Países Bajos). Los complementos a esta formulación
(levadura que produce y que no produce xilanasa, enzima xilanasa) se
disolvieron en agua justo antes de la mezcladura de la masa. La
mezcladura tuvo lugar durante 5 minutos en un mixógrafo de 10
gramos de National Manufacturing Co. Lincoln, NE. Después de la
mezcladura, la masa se fermentó durante 80 minutos a 30ºC con dos
troqueles, un troquel 40 minutos y uno a 80 minutos. Los rodillos de
laminación usados para el troquelado estaban separados 2 mm.
Después de la fermentación la masa se moldeó y se probó durante 60
minutos a 30ºC antes de cocer. La cocción tuvo lugar durante 12
minutos a 240ºC. Después de pesar, el volumen de las barras se midió
por medio de desplazamiento de semillas de colza enana.
Los complementos a la masa eran:
Saccharomyces cerevisiae SU50 con pUR2923 (levadura que
produce xilanasa), Saccharomyces cerevisiae SU50 (cepa
originaria) y enzima xilanasa purificada. Las cepas de levadura SU50
usadas se hicieron crecer en primer lugar sobre medios
selectivos: YNB sin aminoácidos (Difco) y 20 g/l de glucosa,
complementado con 60 mg/l de leucina (SU50 originaria solamente) y
20 ml/g de histidina. Estos cultivos se hicieron crecer durante 40
horas a 30ºC y a continuación se usaron 5 ml para inocular 45 ml de
YPD (véase anteriormente), y se hicieron crecer durante 16 horas a
30ºC. Las células de levadura se recogieron mediante
centrifugación, se lavaron una vez con YPD reciente y se
centrifugaron de nuevo. Diversas cantidades del pelet (húmedo) se
resuspendieron en 5,9 ml de agua justo antes de mezclar la masa.
Cuando se aplicaba, la cantidad de xilanasa purificada añadida era
5 \mul de una solución de 40 U/\mul (200 U). El efecto de los
diversos complementos sobre el volumen específico (V.E.) del pan se
muestra en la tabla siguiente:
A partir de los resultados mostrados en esta
tabla está claro que la cepa de levadura que produce la xilanasa
(SU50:pUR2923) tiene un efecto positivo sobre el volumen específico
del pan, comparable al de la adición de enzima xilanasa purificada.
La cepa originaria, cuando se añade en cantidades equivalentes, no
exhibe este efecto. Por supuesto, este efecto se logra mediante la
combinación de una levadura para pan con buenas características de
poder de gasificación, y una levadura de laboratorio manipulada. Los
mismos efectos positivos, sin embargo, pueden obtenerse cuando una
levadura para pan con buen poder de gasificación se manipula de un
modo comparable para producir la xilanasa fúngica. Por otra parte,
estas cepas de levadura pueden manipularse para producir otras
enzimas con capacidades mejoradoras del pan
(a-amilasas, hemicelulolasas, etc).
Lopes, T.S., Klootwijk, J.,
Veenstra, A.E., van der Aar, P.C., van
Heerikhuizen, H., Raué, H.A. y Planta, R.J.
(1989), Gene 79:199-206.
Shogren, M.D. y Finney, K.F.
(1984), Cereal Chem. 61:418-423.
Tuite, MY, Dobson, M.J.,
Roberts, N.A., King, R.M., Burke, D.C.,
Kingsman, S.M. y Kingsman, A.J. (1982), EMBO
Journal 1:603-608.
Claims (22)
1. Un material de DNA recombinante que comprende
una secuencia nucleotídica que codifica xilanasa de origen fúngico
que tiene actividad mejoradora del pan, seleccionándose dicha
secuencia nucleotídica del grupo que comprende la secuencia
nucleotídica de la figura Nº 1 y secuencias nucleotídicas
equivalentes tales que
- -
- la secuencia nucleotídica equivalente corresponde a una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la figura Nº 1 o la forma madura.
2. Un material de DNA recombinante de acuerdo
con la reivindicación anterior, que comprende DNA con una secuencia
nucleotídica que codifica la forma madura de xilanasa.
3. Un material de DNA recombinante de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que codifica
además al menos otra enzima, en donde dicha otra enzima tiene
actividad amilolítica y/o hemicelulolítica y/o celulolítica.
4. Una célula transformada que comprende
material de DNA recombinante de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, siendo capaz dicha célula de
expresar xilanasa codificada en el material de DNA recombinante y
siendo capaz dicha célula de secretar al menos la forma madura de
xilanasa codificada por el material de DNA recombinante.
5. Una célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 4, adecuada para usar en un procedimiento en el que
se usa una materia prima que contiene celulosa y/o hemicelulosa de
una manera funcional conocida de por sí para la célula huésped no
transformada, haciéndose dicha célula polifuncional para dicho
procedimiento al expresar el DNA recombinante que codifica xilanasa,
y posteriormente secretándose al menos la forma madura de la
xilanasa que tiene actividad mejoradora del pan, permitiendo de ese
modo la degradación de xilano.
6. Una célula de acuerdo con la reivindicación
5, en la que el procedimiento para que dicha célula no transformada
sea funcional y la célula transformada sea polifuncional se
encuentra en el campo del procesamiento y la producción de
alimentos.
7. Una célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 5 ó 6, en la que el procedimiento para que dicha
célula sea polifuncional se dirige a la fermentación y dicha célula
es una célula de levadura.
8. Una célula transformada de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 5-7, siendo dicha
célula una célula de levadura en la que el procedimiento para el que
dicha célula es polifuncional se dirige a la preparación de
productos panificables.
9. Una célula transformada de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en la que
dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una célula
bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura y una célula
de planta.
10. Una célula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 9, en la que la célula es una célula fúngica
seleccionada de los géneros Aspergillus y
Trichoderma.
11. Una célula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 10, en la que la célula es una célula fúngica
seleccionada de las especies Aspergillus niger var,
awamori, Aspergillus niger var. niger, Aspegillus
nidulans y Aspergillus oryrzae.
12. Una célula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 9, en la que la célula es una célula bacteriana
seleccionada de los géneros Bacillus, Lactobacillus y
Streptococcus.
13. Una célula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 4-9, en la que la célula se
selecciona de células de levadura de los géneros Saccharomyces,
Kluyveromyces, Hansenula y Pichia.
14. Una célula de acuerdo con la reivindicación
13, en la que la célula se selecciona de células de levadura de las
especies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis,
Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Hansenula
polymorpha y Pichia pastoris.
15. Un procedimiento para producir una xilanasa,
comprendiendo dicha xilanasa una secuencia de aminoácidos
seleccionada de la figura Nº 1, que comprende:
- cultivar una célula de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 4-14 en un medio nutritivo
adecuado, y
- opcionalmente aislar la enzima resultante.
\newpage
16. Una composición mejoradora del pan que
comprende una célula según cualquiera de las reivindicaciones
4-8, 13 y 14.
17. Un procedimiento para preparar un producto
panificable cociendo una composición de harina, que comprende usar
la composición mejoradora del pan según la reivindicación 16.
18. El método para procesar una materia prima
que contiene celulosa para preparar cerveza, papel, almidón, gluten,
o para descomponer un residuo que contiene celulosa y/o
hemicelulosa, que comprende poner en contacto dicho material con una
célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
5-14.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
la xilanasa que se usa es una forma madura.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 18-19, en el que el material que
contiene celulosa es un residuo agrícola que se pone en contacto con
la xilanasa.
21. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 18-20, en el que el material que
contiene celulosa es un residuo de fábricas de papel.
22. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 18-21, que comprende poner en
contacto dicho material con una célula de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 5-14, de modo que secreta
xilanasa in situ.
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