JPH0817702B2 - 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 - Google Patents
新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物Info
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- JPH0817702B2 JPH0817702B2 JP59278681A JP27868184A JPH0817702B2 JP H0817702 B2 JPH0817702 B2 JP H0817702B2 JP 59278681 A JP59278681 A JP 59278681A JP 27868184 A JP27868184 A JP 27868184A JP H0817702 B2 JPH0817702 B2 JP H0817702B2
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
- C12Y305/02006—Beta-lactamase (3.5.2.6)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、新規プラスミド及びその調製方法並びに該
プラスミドを含有する新規微生物に関する。
プラスミドを含有する新規微生物に関する。
プラスミドは、微生物の細胞内に見出される、環状DN
Aから成る染色体外遺伝子であり、近年、微生物の遺伝
子組み換えの手段として利用され、発酵工業の分野の研
究においてその重要性は益々増大して来ている。
Aから成る染色体外遺伝子であり、近年、微生物の遺伝
子組み換えの手段として利用され、発酵工業の分野の研
究においてその重要性は益々増大して来ている。
近年、アミノ酸やペプチドの例にみられるように、微
生物の生育に必要とする特定の要求性や代謝産物の生産
能に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだプラスミ
ドについての研究がなされ、また若干のプラスミドが宿
主微生物に導入され、その形質転換株が得られている。
生物の生育に必要とする特定の要求性や代謝産物の生産
能に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだプラスミ
ドについての研究がなされ、また若干のプラスミドが宿
主微生物に導入され、その形質転換株が得られている。
本発明者は、先にバチルス（Bacillus）属に属する微
生物の染色体DNAから調製された、ペニシリナーゼの菌
体外生産（分泌）に関与する遺伝情報を担うDNAを組み
込んだ新規プラスミドを調製することに成功し、更に前
記プラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）HB 101株に導入して新規且つ有用な形質転換株、エ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）HB101（pEAP2）
を得ることに成功した（特開昭59-162886号公報参
照）。
生物の染色体DNAから調製された、ペニシリナーゼの菌
体外生産（分泌）に関与する遺伝情報を担うDNAを組み
込んだ新規プラスミドを調製することに成功し、更に前
記プラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）HB 101株に導入して新規且つ有用な形質転換株、エ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）HB101（pEAP2）
を得ることに成功した（特開昭59-162886号公報参
照）。
又、更に本発明者らは、バチルス属に属する微生物の
染色体DNAから調製された、キシラナーゼの菌体外生産
（分泌）に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだ新
規プラスミドを調製することに成功し、更に該プラスミ
ドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）HB101株
に導入して新規且つ有用な形質転換株、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）HB101（pCX311）を得ること
に成功した（特願昭58-232508号明細書参照）。
染色体DNAから調製された、キシラナーゼの菌体外生産
（分泌）に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだ新
規プラスミドを調製することに成功し、更に該プラスミ
ドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）HB101株
に導入して新規且つ有用な形質転換株、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）HB101（pCX311）を得ること
に成功した（特願昭58-232508号明細書参照）。
このように有用生理活性物質の菌体外生産能、すなわ
ち、有用生理活性物質を生産し、これを菌体外に分泌
し、蓄積する能力に関与する遺伝情報を担うDNA断片を
組み込んだプラスミドを宿主に導入して形質転換し、こ
の形質転換し、この形質転換体を培養して有用生理活性
物質を菌体外に分泌させ、これを分離、採集する方法
は、菌体を破砕する必要がなく、有用生理活性物質の精
製が容易であり、しかも菌体内に蓄積されないので、そ
の生産量が飽和するようなこともない、という点が極め
て有用である。
ち、有用生理活性物質を生産し、これを菌体外に分泌
し、蓄積する能力に関与する遺伝情報を担うDNA断片を
組み込んだプラスミドを宿主に導入して形質転換し、こ
の形質転換し、この形質転換体を培養して有用生理活性
物質を菌体外に分泌させ、これを分離、採集する方法
は、菌体を破砕する必要がなく、有用生理活性物質の精
製が容易であり、しかも菌体内に蓄積されないので、そ
の生産量が飽和するようなこともない、という点が極め
て有用である。
しかしながら、通常、有用生理活性物質は主として菌
体内に蓄積されるものであり、所望の有用生理活性物質
を菌体外に分泌する微生物は限られたものしか知られて
いない。したがって、所望の有用生理活性物質を生産
し、菌体外に分泌するような微生物を任意に創製するこ
とができれば、その産業上の利用性は極めて大きい。
体内に蓄積されるものであり、所望の有用生理活性物質
を菌体外に分泌する微生物は限られたものしか知られて
いない。したがって、所望の有用生理活性物質を生産
し、菌体外に分泌するような微生物を任意に創製するこ
とができれば、その産業上の利用性は極めて大きい。
したがって本発明の目的は、宿主に、有用生理活性物
質を生産し、これを菌体外に分泌する能力を与えるよう
な新規なプラスミドを提供することである。さらに本発
明の目的は、そのような新規ブラスミドを調製する方
法、ならびに新規プラスミドによって形質転換され、有
用生理活性物質を生産し、菌体外に分泌、蓄積する能力
を有する新規微生物を提供することである。
質を生産し、これを菌体外に分泌する能力を与えるよう
な新規なプラスミドを提供することである。さらに本発
明の目的は、そのような新規ブラスミドを調製する方
法、ならびに新規プラスミドによって形質転換され、有
用生理活性物質を生産し、菌体外に分泌、蓄積する能力
を有する新規微生物を提供することである。
本発明の目的は、ペニシリナーゼの菌体外生産に関与
する遺伝情報を組み込んだプラスミドに、所望の有用生
理活性物質の生産に関与する遺伝情報を担うDNA断片を
組み込んでなるプラスミドにより達成される。
する遺伝情報を組み込んだプラスミドに、所望の有用生
理活性物質の生産に関与する遺伝情報を担うDNA断片を
組み込んでなるプラスミドにより達成される。
本願明細書において、「有用生理活性物質」とは、ペ
ニシリナーゼ、キシラナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵
素、インシュリン、ヒト成長ホルモン、インターフェロ
ンなどの高分子生理活性物質を意味するものである。
ニシリナーゼ、キシラナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵
素、インシュリン、ヒト成長ホルモン、インターフェロ
ンなどの高分子生理活性物質を意味するものである。
本発明によれば、宿主にペニシリーゼ及びキシラナー
ゼの菌体外生産能を与えるプラスミドが提供される。こ
のプラスミドは、ベクタープラスミドにバチルス（Baci
llus）属に属する微生物の染色体DNAから調製されたペ
ニシリナーゼの菌体外生産に関与する遺伝情報を担うDN
A断片と、アエロモナス（Aeromonas）属に属する微生物
の染色体DNAから調製されたキシラナーゼの生産に関与
する遺伝情報を担うDNA断片を組み込んだものである。
ゼの菌体外生産能を与えるプラスミドが提供される。こ
のプラスミドは、ベクタープラスミドにバチルス（Baci
llus）属に属する微生物の染色体DNAから調製されたペ
ニシリナーゼの菌体外生産に関与する遺伝情報を担うDN
A断片と、アエロモナス（Aeromonas）属に属する微生物
の染色体DNAから調製されたキシラナーゼの生産に関与
する遺伝情報を担うDNA断片を組み込んだものである。
このようなプラスミドは、ペニシリナーゼの菌体外生
産に関与する遺伝情報を担うDNA断片（以下、「ペニシ
リナーゼDNA断片」という）を組み込んだプラスミドを
ベクターDNAとし、該ベクターDNAを、前記遺伝情報を妨
害しない制限酵素を用いて開裂し、この開裂部位に、キ
シラナーゼの生産に関与する遺伝情報を担うDNA断片
（以下、「キシラナーゼDNA断片」という）を組み込む
ことにより調製される。
産に関与する遺伝情報を担うDNA断片（以下、「ペニシ
リナーゼDNA断片」という）を組み込んだプラスミドを
ベクターDNAとし、該ベクターDNAを、前記遺伝情報を妨
害しない制限酵素を用いて開裂し、この開裂部位に、キ
シラナーゼの生産に関与する遺伝情報を担うDNA断片
（以下、「キシラナーゼDNA断片」という）を組み込む
ことにより調製される。
〈ベクターDNA〉 本発明に使用されるベクターDNAは、例えば、Col.E1
の系統、pMB9の系統、pSC101の系統、R6Kの系統、ラム
ダーファージの系統のプラスミドを制限酵素を用いて開
裂し、その開裂部位にペニシリナーゼDNA断片を組み込
んだプラスミドであり、その代表的な例としてpEAP2プ
ラスミドを挙げることができる。pEAP2プラスミドは、p
MB9プラスミドにバチルス属に属する微生物の染色体DNA
から調製されたペニシリナーゼDNA断片を組み込んでな
るプラスミドであり、たとえば次のように調製される。
の系統、pMB9の系統、pSC101の系統、R6Kの系統、ラム
ダーファージの系統のプラスミドを制限酵素を用いて開
裂し、その開裂部位にペニシリナーゼDNA断片を組み込
んだプラスミドであり、その代表的な例としてpEAP2プ
ラスミドを挙げることができる。pEAP2プラスミドは、p
MB9プラスミドにバチルス属に属する微生物の染色体DNA
から調製されたペニシリナーゼDNA断片を組み込んでな
るプラスミドであり、たとえば次のように調製される。
すなわち、ペニシリナーゼを菌体外に生成、蓄積する
能力を有する好アルカリ性のバチルス・No.170菌（微工
研菌寄第3221号）を培地〔（g/l）：グリセロール2.0、
酵母エキス5.0、ポリペプトン5.0、K2HPO4 1.0、MgSO4
・7H2O 0.2をNaHCO31.0でpH9.0に調整したもの〕中、3
0℃で19時間振盪培養を行い、対数増殖後期の菌体を集
菌後、フェノール法により染色体DNAを抽出、精製す
る。
能力を有する好アルカリ性のバチルス・No.170菌（微工
研菌寄第3221号）を培地〔（g/l）：グリセロール2.0、
酵母エキス5.0、ポリペプトン5.0、K2HPO4 1.0、MgSO4
・7H2O 0.2をNaHCO31.0でpH9.0に調整したもの〕中、3
0℃で19時間振盪培養を行い、対数増殖後期の菌体を集
菌後、フェノール法により染色体DNAを抽出、精製す
る。
この染色体DNAをとり、制限酵素HindIIIを加え、37℃
で５分、10分、20分、30分、60分反応させて部分的に切
断する。一方、ベクターとして用いるテトラサイクリン
抵抗性（Tcr）のpMB9プラスミドDNA（Bethesda Researc
h Laboratories社（米国）製）をHindIIIで完全に切断
して65℃、５分の熱処理後、前者と混合し、T4ファージ
由来のDNAリガーゼによってDNA鎖を連結し、65℃、５分
の熱処理後、反応液にエタノールを加えて染色体DNAを
組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取する。
で５分、10分、20分、30分、60分反応させて部分的に切
断する。一方、ベクターとして用いるテトラサイクリン
抵抗性（Tcr）のpMB9プラスミドDNA（Bethesda Researc
h Laboratories社（米国）製）をHindIIIで完全に切断
して65℃、５分の熱処理後、前者と混合し、T4ファージ
由来のDNAリガーゼによってDNA鎖を連結し、65℃、５分
の熱処理後、反応液にエタノールを加えて染色体DNAを
組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取する。
次に、得られたプラスミドを宿主に導入してこれを形
質転換し、この形質転換体を増殖させてプラスミドpEAP
2を複製する。このような宿主としてエシェリヒア属に
属する微生物を有利に使用することができ、その一例と
して、エシェリヒア・コリＫ−12株とエシェリヒア・コ
リＢ株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリHB10
1株〔Molecular Cloning A Laboratory Manual p.504
（1982）参照〕（遺伝形質：F-,hsd S 20（ｒ ,
m ）,rec A 13,ara-14,pro A 2,lac Y 1,gal K 2.
rps L 20（Sm′）,xyl−5,mtl−1,sup E 44λ−）を
挙げることができる。
質転換し、この形質転換体を増殖させてプラスミドpEAP
2を複製する。このような宿主としてエシェリヒア属に
属する微生物を有利に使用することができ、その一例と
して、エシェリヒア・コリＫ−12株とエシェリヒア・コ
リＢ株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリHB10
1株〔Molecular Cloning A Laboratory Manual p.504
（1982）参照〕（遺伝形質：F-,hsd S 20（ｒ ,
m ）,rec A 13,ara-14,pro A 2,lac Y 1,gal K 2.
rps L 20（Sm′）,xyl−5,mtl−1,sup E 44λ−）を
挙げることができる。
次に、プラスミドpEAP2による形質転換の例を示す。
まずエシェリヒア・コリHB101株をLB培地（純粋１当
りトリプトン（Difco）10g、酵母エキス5g、グルコース
1g、NaCl10gを含み、pH7.0に調製したもの）10mlに接種
し、37℃で振盪培養を行い、対数増殖後期まで生育させ
た後に集菌する。これを氷冷下、最終濃度で0.03MCaCl2
の溶液に順次懸濁させてコンピテントな細胞とする。こ
の細胞懸濁液に、前記プラスミドDNAの溶解液を加えて
氷冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間ヒートショッ
クを与えて前記プラスミドDNAを細胞内に取り込ませ
る。次いで、この細胞懸濁液を別途、前記LB培地に接種
し、37℃、３〜５時間振盪培養した後、集菌，洗滌して
形質転換株、エシェリヒア・コリHB101（pEAP2）（微工
研菌寄第6939号）（FERM BP−468）を得る このようにして得られるエシェリヒア・コリHB101（p
EAP2）の菌学的性質は、DNA受容菌である前記エシェリ
ヒア・コリHB101株の性質と、ペニシリン耐性を除いて
同一であるが〔Molecular Cloning A Laboratory Manua
l p.504（1982）参照、遺伝形質：F-,hsd S20（ｒ ,m
）,rec A 13,ara-14,pro A 2,lac Y 1,gal K 2,r
ps L 20（Sm′）,xyl−5,mtl−1,sup E 44λ−〕、他
の特性として、前記pEAP2プラスミドの特性、特にペニ
シリナーゼ生産能の遺伝情報を担うpEAP2プラスミドに
よってペニシリナーゼを生産し菌体外に分泌する特性を
附加して成る点がその特徴である。この形質転換体エシ
ェリヒア・コリHB101（pEAP2）を増殖させ、集菌し、プ
ラスミドpEAP2を分離する。
まずエシェリヒア・コリHB101株をLB培地（純粋１当
りトリプトン（Difco）10g、酵母エキス5g、グルコース
1g、NaCl10gを含み、pH7.0に調製したもの）10mlに接種
し、37℃で振盪培養を行い、対数増殖後期まで生育させ
た後に集菌する。これを氷冷下、最終濃度で0.03MCaCl2
の溶液に順次懸濁させてコンピテントな細胞とする。こ
の細胞懸濁液に、前記プラスミドDNAの溶解液を加えて
氷冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間ヒートショッ
クを与えて前記プラスミドDNAを細胞内に取り込ませ
る。次いで、この細胞懸濁液を別途、前記LB培地に接種
し、37℃、３〜５時間振盪培養した後、集菌，洗滌して
形質転換株、エシェリヒア・コリHB101（pEAP2）（微工
研菌寄第6939号）（FERM BP−468）を得る このようにして得られるエシェリヒア・コリHB101（p
EAP2）の菌学的性質は、DNA受容菌である前記エシェリ
ヒア・コリHB101株の性質と、ペニシリン耐性を除いて
同一であるが〔Molecular Cloning A Laboratory Manua
l p.504（1982）参照、遺伝形質：F-,hsd S20（ｒ ,m
）,rec A 13,ara-14,pro A 2,lac Y 1,gal K 2,r
ps L 20（Sm′）,xyl−5,mtl−1,sup E 44λ−〕、他
の特性として、前記pEAP2プラスミドの特性、特にペニ
シリナーゼ生産能の遺伝情報を担うpEAP2プラスミドに
よってペニシリナーゼを生産し菌体外に分泌する特性を
附加して成る点がその特徴である。この形質転換体エシ
ェリヒア・コリHB101（pEAP2）を増殖させ、集菌し、プ
ラスミドpEAP2を分離する。
このようにして得られたプラスミドpEAP2は、pMB9プ
ラスミドのHindIII制限サイトに、前記バチルスNo.170
菌の染色体DNAから調製された約2000塩基対のペニシリ
ナーゼDNA断片が組み込まれている、7.7Kbの環状DNA分
子である。
ラスミドのHindIII制限サイトに、前記バチルスNo.170
菌の染色体DNAから調製された約2000塩基対のペニシリ
ナーゼDNA断片が組み込まれている、7.7Kbの環状DNA分
子である。
このpEAP2プラスミドの調製工程及びその制限酵素切
断地図を第１図に示す。
断地図を第１図に示す。
〈キシラナーゼDNA断片の調製〉 次に、本発明に使用される、キシラナーゼの生産に関
与する遺伝情報を担うDNAを含有する微生物としては、
アエロモナス属の微生物が挙げられる。その一例とし
て、アエロモナス（Aeromonas）sp.No.212株（ATCC3108
5）を挙げることができる。〔Horikoshi K,Akiba T（19
82）Alkalophilic Microorganisms,P158Springer,Berli
n Heidelberg New York参照〕。上記アエロモナスsp.N
o.212株（ATCC31085）を培地〔0.5％硫酸アンモニウ
ム、1.5％パルス・フロック、0.02％グルコース、0.1％
酵母エキス、0.02MgSO4・7H2O及び0.2％K2HPO4を含む培
地を７％NaHCO3水溶液でpH9に調整したもの〕中、37℃
で10時間振盪培養を行い、対数増殖後期の菌体を集菌
後、フェノール抽出法により染色体DNAを抽出、精製
し、染色体DNAを得る。
与する遺伝情報を担うDNAを含有する微生物としては、
アエロモナス属の微生物が挙げられる。その一例とし
て、アエロモナス（Aeromonas）sp.No.212株（ATCC3108
5）を挙げることができる。〔Horikoshi K,Akiba T（19
82）Alkalophilic Microorganisms,P158Springer,Berli
n Heidelberg New York参照〕。上記アエロモナスsp.N
o.212株（ATCC31085）を培地〔0.5％硫酸アンモニウ
ム、1.5％パルス・フロック、0.02％グルコース、0.1％
酵母エキス、0.02MgSO4・7H2O及び0.2％K2HPO4を含む培
地を７％NaHCO3水溶液でpH9に調整したもの〕中、37℃
で10時間振盪培養を行い、対数増殖後期の菌体を集菌
後、フェノール抽出法により染色体DNAを抽出、精製
し、染色体DNAを得る。
この染色体DNAを次のようにクローニングする。まず
この染色体DNAを制限酵素HindIIIで切断する。一方、ベ
クターとして用いるテトラサイクリン耐性遺伝子（T
cr）とアンピシリン耐性遺伝子（Ampr）をもつpBR322プ
ラスミドをHindIIIで完全に切断して65℃、５分の熱処
理後、前者と混合し、T4ファージ由来のDNAリガーゼに
よってDNA鎖を連結し、反応液にエタノールを加えて、
染色体DNAを組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取す
る。一方、エシェリヒア・コリHB101株をグルコースを
含まないLB培地（純粋１当りトリプトン（Difco）10
g、酵母エキス5g、アンピシリン20γ、NaCl10gを含み、
pH7.0で調製したもの）10mlに接種し、37℃で振盪培養
を行い、対数増殖後期まで生育させた後に集菌する。こ
れを氷冷下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁さ
せてコンピテントな細胞とする。この細胞懸濁液に前記
染色体DNAを組み込んだプラスミドDNAの溶解液を加えて
氷冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間ヒートショッ
クを与えて前記プラスミドDNAを細胞内に取り込ませ
る。次いで、この細胞懸濁液を、アンピシリン100γ、
キシラン0.5％を含むプレートに散布して培養を行い、
アンピシリン耐性で且つキシラナーゼ活性を示す株を分
離する。
この染色体DNAを制限酵素HindIIIで切断する。一方、ベ
クターとして用いるテトラサイクリン耐性遺伝子（T
cr）とアンピシリン耐性遺伝子（Ampr）をもつpBR322プ
ラスミドをHindIIIで完全に切断して65℃、５分の熱処
理後、前者と混合し、T4ファージ由来のDNAリガーゼに
よってDNA鎖を連結し、反応液にエタノールを加えて、
染色体DNAを組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取す
る。一方、エシェリヒア・コリHB101株をグルコースを
含まないLB培地（純粋１当りトリプトン（Difco）10
g、酵母エキス5g、アンピシリン20γ、NaCl10gを含み、
pH7.0で調製したもの）10mlに接種し、37℃で振盪培養
を行い、対数増殖後期まで生育させた後に集菌する。こ
れを氷冷下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁さ
せてコンピテントな細胞とする。この細胞懸濁液に前記
染色体DNAを組み込んだプラスミドDNAの溶解液を加えて
氷冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間ヒートショッ
クを与えて前記プラスミドDNAを細胞内に取り込ませ
る。次いで、この細胞懸濁液を、アンピシリン100γ、
キシラン0.5％を含むプレートに散布して培養を行い、
アンピシリン耐性で且つキシラナーゼ活性を示す株を分
離する。
このようにして得られた株は、前記染色体DNAを組み
込んだプラスミドpAX1を含んでおり、キシラナーゼを生
産する能力をもっている。この株を増殖させ、集菌し、
プラスミドpAX1を分離し、さらにこのプラスミドpAX1を
HindIIIで処理して切断すると、クローン化されたキシ
ラナーゼDNA断片が得られる。
込んだプラスミドpAX1を含んでおり、キシラナーゼを生
産する能力をもっている。この株を増殖させ、集菌し、
プラスミドpAX1を分離し、さらにこのプラスミドpAX1を
HindIIIで処理して切断すると、クローン化されたキシ
ラナーゼDNA断片が得られる。
プラスミドpAX1は、pBR322プラスミドのHindIII制限
サイトに前記アエロモナスsp.No.212株の染色体DNAから
調製された、キシラナーゼの生産に関与する遺伝情報を
担う、約6000塩基対のDNA断片が組み込まれている、10.
4Kbの環状DNA分子である。このプラスミドpAX1の調製工
程ならびにその制限酵素切断地図を第２図に示す。
サイトに前記アエロモナスsp.No.212株の染色体DNAから
調製された、キシラナーゼの生産に関与する遺伝情報を
担う、約6000塩基対のDNA断片が組み込まれている、10.
4Kbの環状DNA分子である。このプラスミドpAX1の調製工
程ならびにその制限酵素切断地図を第２図に示す。
〈本発明のプラスミドの調製〉 本発明のプラスミドは、前記ベクターDNAに、有用生
理活性物質の生産に関与する遺伝情報を担うDNA断片、
たとえば、前記キシラナーゼDNA断片を組み込むことに
より調製される。ベクターDNAとして前記pEAP2プラスミ
ドを使用し、キシラナーゼDNA断片として、前記アエロ
モナスsp.No.212の染色体DNAを組み込んだプラスミドpA
X1をBglIIで切断して得られるDNA断片を使用したばあい
について、以下、説明する。
理活性物質の生産に関与する遺伝情報を担うDNA断片、
たとえば、前記キシラナーゼDNA断片を組み込むことに
より調製される。ベクターDNAとして前記pEAP2プラスミ
ドを使用し、キシラナーゼDNA断片として、前記アエロ
モナスsp.No.212の染色体DNAを組み込んだプラスミドpA
X1をBglIIで切断して得られるDNA断片を使用したばあい
について、以下、説明する。
キシラナーゼDNA断片を組み込んだプラスミドpAX1
に、制限酵素BglIIを加え、37℃で60分反応させて切断
する。一方、ベクターとして使用する、ペニシリナーゼ
DNA断片とを組み込んだプラスミドpEAP2を、BamHIで完
全に切断して65℃、５分の熱処理後、前者と混合し、T4
ファージ由来のDNAリガーゼによってDNA鎖を連結し、65
℃、５分の熱処理を行う。
に、制限酵素BglIIを加え、37℃で60分反応させて切断
する。一方、ベクターとして使用する、ペニシリナーゼ
DNA断片とを組み込んだプラスミドpEAP2を、BamHIで完
全に切断して65℃、５分の熱処理後、前者と混合し、T4
ファージ由来のDNAリガーゼによってDNA鎖を連結し、65
℃、５分の熱処理を行う。
更に、BamHI及びBglIIを用いて再切断して目的とする
プラスミドpXP102−３の濃縮を行った。
プラスミドpXP102−３の濃縮を行った。
一方、エシェリヒア・コリHB101株をグルコースを含
まないLB培地（純粋１当りトリプトン（Difco）10g、
酵母エキス5g、アンピシリン20γ、NaCl10gを含み、pH
7.0に調製したもの）10mlに接種し、37℃で振盪培地を
行い、対数増殖後期まで生育させた後に集菌する。これ
を氷冷下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁させ
てコンピテントな細胞とする。この細胞懸濁液に前記染
色体DNAを組み込んだプラスミドDNAの溶解液を加えて氷
冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間ヒートショック
を与えて前記プラスミドDNAを細胞内に取り込ませる。
次いで、この細胞懸濁液を、アンピシリン20γ、キシラ
ン0.5％を含むプレートに散布して培養を行い、アンピ
シリン耐性で且つキシラナーゼ活性を示す株を分離す
る。
まないLB培地（純粋１当りトリプトン（Difco）10g、
酵母エキス5g、アンピシリン20γ、NaCl10gを含み、pH
7.0に調製したもの）10mlに接種し、37℃で振盪培地を
行い、対数増殖後期まで生育させた後に集菌する。これ
を氷冷下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁させ
てコンピテントな細胞とする。この細胞懸濁液に前記染
色体DNAを組み込んだプラスミドDNAの溶解液を加えて氷
冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間ヒートショック
を与えて前記プラスミドDNAを細胞内に取り込ませる。
次いで、この細胞懸濁液を、アンピシリン20γ、キシラ
ン0.5％を含むプレートに散布して培養を行い、アンピ
シリン耐性で且つキシラナーゼ活性を示す株を分離す
る。
このようにして得られた形式転換株エシェリヒア・コ
リHB101（pXP102−３）は、前記染色体DNAを組み込んだ
プラスミドpXP102−３を含んでおり、ペニシリナーゼお
よひキシラナーゼを生産し、これを菌体外に分泌する能
力をもっている。この形質転換株は昭和59年６月１日付
で工業技術院・微生物工業技術研究所に寄託され、その
受託番号は微工研菌寄第7656号（FERM P7656）である。
この株を増殖させ、集菌し、プラスミドpXP102−３を分
離する。
リHB101（pXP102−３）は、前記染色体DNAを組み込んだ
プラスミドpXP102−３を含んでおり、ペニシリナーゼお
よひキシラナーゼを生産し、これを菌体外に分泌する能
力をもっている。この形質転換株は昭和59年６月１日付
で工業技術院・微生物工業技術研究所に寄託され、その
受託番号は微工研菌寄第7656号（FERM P7656）である。
この株を増殖させ、集菌し、プラスミドpXP102−３を分
離する。
プラスミドpXP102−３は、pEAP2のBam HI制限サイト
に、前記アエロモナスsp.No.212株の染色体DNAから調製
されたキシラナーゼDNA断片が組み込まれている、11.7K
bの環状DNA分子である。このプラスミドpXP102−３の調
製工程ならびにその制限酵素切断地図を第３図に示す。
に、前記アエロモナスsp.No.212株の染色体DNAから調製
されたキシラナーゼDNA断片が組み込まれている、11.7K
bの環状DNA分子である。このプラスミドpXP102−３の調
製工程ならびにその制限酵素切断地図を第３図に示す。
このようにして得られるエシェリヒア・コリHB101（p
XP102−３）の菌学的性質は、DNA受容菌である前記エシ
ェリヒア・コリHB101株の性質と、ペニシリン耐性を除
いて同一であるが、他の特性として、前記pXP102−３プ
ラスミドの特性、即ちペニシリナーゼとキシラナーゼを
生産し、これらを菌体外に分泌する特性を附加して成る
点がその特徴である。
XP102−３）の菌学的性質は、DNA受容菌である前記エシ
ェリヒア・コリHB101株の性質と、ペニシリン耐性を除
いて同一であるが、他の特性として、前記pXP102−３プ
ラスミドの特性、即ちペニシリナーゼとキシラナーゼを
生産し、これらを菌体外に分泌する特性を附加して成る
点がその特徴である。
したがって、エシェリヒア・コリHB101（pXP102−
３）は、親株であるエシェリヒア・コリHB101と同一の
条件で培養することができ、ペニシリナーゼおよびキシ
ラナーゼを生産し、これを菌体外に分泌する。
３）は、親株であるエシェリヒア・コリHB101と同一の
条件で培養することができ、ペニシリナーゼおよびキシ
ラナーゼを生産し、これを菌体外に分泌する。
本発明によれば、ペニシリナーゼを生産しこれを菌体
外に分泌する能力に関与する遺伝情報を担うプラスミド
をベクターとして使用し、これにキシラナーゼのような
有用生理活性物質を生産する能力を有するが、これを菌
体外に分泌する能力はない微生物の染色体DNA断片を組
み込むことにより、ペニシリナーゼとともにキシラナー
ゼのような有用生理活性物質を生産し、これらを菌体外
に分泌するような遺伝情報を担うプラスミドを調製する
ことができる。したがって、本発明によれば、インシュ
リン、ヒト生長ホルモン、インターフェロン、酵素など
の有用生理活性物質を生産し、これを菌体外に分泌する
能力に関与するプラスミドを任意に調製することがで
き、これをたとえばエシェリヒア・コリなどの宿主に導
入することにより、上記有用生理活性物質の菌体外生産
能を有する有用な微生物を創製することができる。
外に分泌する能力に関与する遺伝情報を担うプラスミド
をベクターとして使用し、これにキシラナーゼのような
有用生理活性物質を生産する能力を有するが、これを菌
体外に分泌する能力はない微生物の染色体DNA断片を組
み込むことにより、ペニシリナーゼとともにキシラナー
ゼのような有用生理活性物質を生産し、これらを菌体外
に分泌するような遺伝情報を担うプラスミドを調製する
ことができる。したがって、本発明によれば、インシュ
リン、ヒト生長ホルモン、インターフェロン、酵素など
の有用生理活性物質を生産し、これを菌体外に分泌する
能力に関与するプラスミドを任意に調製することがで
き、これをたとえばエシェリヒア・コリなどの宿主に導
入することにより、上記有用生理活性物質の菌体外生産
能を有する有用な微生物を創製することができる。
以下、本発明のプラスミドの調製方法、および該プラ
スミドを導入した宿主を培養して、ペニシリナーゼとと
もにキシラナーゼを菌体外に分泌させる方法を例示す
る。
スミドを導入した宿主を培養して、ペニシリナーゼとと
もにキシラナーゼを菌体外に分泌させる方法を例示す
る。
実施例１ pEAP2プラスミドの調製 ペニシリナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有す
る好アルカリ製のバチルス・No.170菌（微工研菌寄第32
21号）（FERM BP-467）を培地〔（g/l）：グリセロール
2.0、酵母エキス5.0、ポリペプトン5.0、K2HPO4 1.0、
MgSO4・7H2O 0.2をNaHCO310でpH9.0に調製したもの〕
中、30℃で19時間振盪培養を行い、対数増殖後期の菌体
を集菌後、フェノール法によって染色体DNAを抽出、精
製し、染色体DNA5mgを得た。
る好アルカリ製のバチルス・No.170菌（微工研菌寄第32
21号）（FERM BP-467）を培地〔（g/l）：グリセロール
2.0、酵母エキス5.0、ポリペプトン5.0、K2HPO4 1.0、
MgSO4・7H2O 0.2をNaHCO310でpH9.0に調製したもの〕
中、30℃で19時間振盪培養を行い、対数増殖後期の菌体
を集菌後、フェノール法によって染色体DNAを抽出、精
製し、染色体DNA5mgを得た。
この染色体DNA10μｇをとり、制限酵素HindIIIを加
え、37℃で５分、10分、20分、30分、60分反応させて部
分的に切断した。一方、ベクターとして用いるテトラサ
イクリン抵抗性（Tcr）のpMB9プラスミドDNA（Bethesda
Research Laboratories社（米国）製）をHindIIIで完
全に切断した65℃、５分の熱処理後、前者と混合し、T4
ファージ由来のDNAリガーゼによって10℃、24時間DNA鎖
の連結反応を行い、65℃、５分の熱処理後、反応液に２
倍容のエタノールを加えて染色体DNAを組み込んだプラ
スミドDNAを沈澱、採取した。
え、37℃で５分、10分、20分、30分、60分反応させて部
分的に切断した。一方、ベクターとして用いるテトラサ
イクリン抵抗性（Tcr）のpMB9プラスミドDNA（Bethesda
Research Laboratories社（米国）製）をHindIIIで完
全に切断した65℃、５分の熱処理後、前者と混合し、T4
ファージ由来のDNAリガーゼによって10℃、24時間DNA鎖
の連結反応を行い、65℃、５分の熱処理後、反応液に２
倍容のエタノールを加えて染色体DNAを組み込んだプラ
スミドDNAを沈澱、採取した。
一方、エシェリヒア・コリＫ−12株とエシェリヒア・
コリＢ株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリHB
101株をLB培地（純水１当りトリプトン（Difco）10
g、酵母エキス5g、グルコース1g、NaCl10gをpH7.0に調
製したもの）10mlに接種し、37℃で振盪培養を行い、対
数増殖後期まで生育させた後に集菌した。これを氷冷
下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞懸濁液に前記プラスミ
ドDNAの溶解液を加えて氷冷下で60分反応させ、42℃、
１〜２分間ヒートショックを与えて前記プラスミドDNA
を細胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を前
記LB培地に接種し、37℃、３〜５時間振盪培養した後、
集菌、洗滌して形質転換株、エシェリヒア・コリHB101
（pEAP2）（微工研菌寄第6939号）（FERM BP-468）を得
た。
コリＢ株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリHB
101株をLB培地（純水１当りトリプトン（Difco）10
g、酵母エキス5g、グルコース1g、NaCl10gをpH7.0に調
製したもの）10mlに接種し、37℃で振盪培養を行い、対
数増殖後期まで生育させた後に集菌した。これを氷冷
下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞懸濁液に前記プラスミ
ドDNAの溶解液を加えて氷冷下で60分反応させ、42℃、
１〜２分間ヒートショックを与えて前記プラスミドDNA
を細胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を前
記LB培地に接種し、37℃、３〜５時間振盪培養した後、
集菌、洗滌して形質転換株、エシェリヒア・コリHB101
（pEAP2）（微工研菌寄第6939号）（FERM BP-468）を得
た。
この菌体を次のように処理して、精製プラスミドpEAP
2を得た。
2を得た。
実施例２ キシラナーゼDNA断片の調製 キシラナーゼを生成する能力を有するアエロモナスs
p.No.212株（ATCC31085）を培地〔0.5％硫酸アンモニウ
ム、1.5％パルプ・フロック、0.02％グルコース、0.1％
酵母エキス、0.02MgSO4・7H2O及び0.2％K2HPO4を含む培
地を７％NaHCO3水溶液でpH9に調整したもの〕中、37℃
で10時間振盪培地を行い、対数増殖後期の菌体を集菌
後、フェノール法によるDNA抽出法によって染色体DNAを
抽出、精製し、染色体DNA3mgを得た。この染色体DNA10
μｇをとり、制限酵素HindIIIを加え、37℃で５分、10
分、20分、30分、60分反応させて部分的に切断した。一
方、ベクターとして用いるテトラサイクリン抵抗性（Te
tr）およびアンピシリン抵抗性（Ampr）のpBR322プラス
ミドDNAをHindIIIで完全に切断して65℃、５分の熱処理
後、前者と混合し、T4ファージ由来のDNAリガーゼによ
って10℃、24時間DNA鎖の連結反応を行い、65℃、５分
の熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて染色
体DNAを組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取した。
p.No.212株（ATCC31085）を培地〔0.5％硫酸アンモニウ
ム、1.5％パルプ・フロック、0.02％グルコース、0.1％
酵母エキス、0.02MgSO4・7H2O及び0.2％K2HPO4を含む培
地を７％NaHCO3水溶液でpH9に調整したもの〕中、37℃
で10時間振盪培地を行い、対数増殖後期の菌体を集菌
後、フェノール法によるDNA抽出法によって染色体DNAを
抽出、精製し、染色体DNA3mgを得た。この染色体DNA10
μｇをとり、制限酵素HindIIIを加え、37℃で５分、10
分、20分、30分、60分反応させて部分的に切断した。一
方、ベクターとして用いるテトラサイクリン抵抗性（Te
tr）およびアンピシリン抵抗性（Ampr）のpBR322プラス
ミドDNAをHindIIIで完全に切断して65℃、５分の熱処理
後、前者と混合し、T4ファージ由来のDNAリガーゼによ
って10℃、24時間DNA鎖の連結反応を行い、65℃、５分
の熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて染色
体DNAを組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取した。
一方、エシェリヒア・コリHB101株をグルコースを含
まないLB培地（純粋１当りトリプトン（Difco）10g、
酵母エキス5g、アンピシリン20γ、NaCl10gをpH7.0に調
製したもの）10mlに接種し、37℃で振盪培養を行い、多
数増殖後期まで生育させた後に集菌した。これを氷冷
下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞懸濁液に前記プラスミ
ドDNAの溶解液を加えて氷冷下で60分反応させ、42℃、
１〜２分間ヒートショックを与えて前記プラスミドDNA
を細胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を、
アンピシリン100γ、キシラン0.5％を含むプレートに散
布し、アンピシリン耐性且つキシラナーゼ活性を有する
株を分離したところ、3000株のうち４株がキシラナーゼ
活性を示した。この４株をLB培地で培養し、実施例１と
同様にプラスミドを分離精製し、その構造を調べたとこ
ろ、同じDNA断片が、同じ方向に挿入されていることが
わかった。
まないLB培地（純粋１当りトリプトン（Difco）10g、
酵母エキス5g、アンピシリン20γ、NaCl10gをpH7.0に調
製したもの）10mlに接種し、37℃で振盪培養を行い、多
数増殖後期まで生育させた後に集菌した。これを氷冷
下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞懸濁液に前記プラスミ
ドDNAの溶解液を加えて氷冷下で60分反応させ、42℃、
１〜２分間ヒートショックを与えて前記プラスミドDNA
を細胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を、
アンピシリン100γ、キシラン0.5％を含むプレートに散
布し、アンピシリン耐性且つキシラナーゼ活性を有する
株を分離したところ、3000株のうち４株がキシラナーゼ
活性を示した。この４株をLB培地で培養し、実施例１と
同様にプラスミドを分離精製し、その構造を調べたとこ
ろ、同じDNA断片が、同じ方向に挿入されていることが
わかった。
次いで、サザン（Southern）の方法〔J.Mol.Biol.98,
503（1975）〕により、上記DNA断片を調べたところ、こ
のDNA断片はアエロモナスsp.No.212株由来のものである
ことが確認された。
503（1975）〕により、上記DNA断片を調べたところ、こ
のDNA断片はアエロモナスsp.No.212株由来のものである
ことが確認された。
実施例３ pXP102−３プラスミドの調製 キシラナーゼDNA断片を組み込んだプラスミドpAX1
５μｇに、制限酵素BglII 15Uを加え、37℃て60分反応
させて切断した。一方、ベクターとして使用する、ペニ
シリナーゼDNA断片を組み込んだプラスミドpEAP2 ５μ
ｇに、制限酵素Bam HI 15Uを加え、37℃で60分処理し
て、これを完全に切断し、65℃、５分の熱処理後、前者
と混合した。T4ファージ由来のDNAリガーゼによってDNA
鎖を連結し、65℃、５分の熱処理を行った。
５μｇに、制限酵素BglII 15Uを加え、37℃て60分反応
させて切断した。一方、ベクターとして使用する、ペニ
シリナーゼDNA断片を組み込んだプラスミドpEAP2 ５μ
ｇに、制限酵素Bam HI 15Uを加え、37℃で60分処理し
て、これを完全に切断し、65℃、５分の熱処理後、前者
と混合した。T4ファージ由来のDNAリガーゼによってDNA
鎖を連結し、65℃、５分の熱処理を行った。
更に、BamHI（15U）及びBglII（15U）を加え、37℃、
60分反応させてpEAP2及びpAX1の選択的切断を行い、目
的とするpXP102−３プラスミドの濃縮を行った。
60分反応させてpEAP2及びpAX1の選択的切断を行い、目
的とするpXP102−３プラスミドの濃縮を行った。
一方、エシェリヒア・コリHB101株を前記グルコース
を含まないLB培地に接種し、37℃で振盪培養を行い、対
数増殖後期まで生育させた後に集菌した。これを氷冷
下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞懸濁液に前記プラスミ
ドDNAの溶解液を加えて氷冷下で60分反応させ、42℃、
１〜２分間ヒートショックを与えて前記プラスミドDNA
を細胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を前
記グルコースを含まないLB培地に接種し、アンピシリン
耐性（20γ）且つキシラナーゼ活性を有する株を分離
し、形質転換株、エシェリヒア・コリHB101（pXP102）
（微工研菌寄第7656号）を得た。
を含まないLB培地に接種し、37℃で振盪培養を行い、対
数増殖後期まで生育させた後に集菌した。これを氷冷
下、最終濃度で0.03MCaCl2の溶液に順次懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞懸濁液に前記プラスミ
ドDNAの溶解液を加えて氷冷下で60分反応させ、42℃、
１〜２分間ヒートショックを与えて前記プラスミドDNA
を細胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を前
記グルコースを含まないLB培地に接種し、アンピシリン
耐性（20γ）且つキシラナーゼ活性を有する株を分離
し、形質転換株、エシェリヒア・コリHB101（pXP102）
（微工研菌寄第7656号）を得た。
この菌体を、実施例１と同様に処理して、精製プラス
ミドpXP102−３を得た。
ミドpXP102−３を得た。
実施例４ 実施例２および３で得られた形質転換株、エシェリヒ
ア・コリHB101（pAX1）（FERMP−7655）とエシェリヒア
・コリHB101（pXP102-3）（FERM P−7656）を前記グル
コースを含まないLB培地（純水１当りトリプトン（Di
fco）10g、酵母エキス5g、アンピシリン20γ、NaCl10g
をpH7.0に調製したもの）で37℃にて振盪培養した。細
胞の生育（菌体量の測定）は、波長660nmにおける吸光
度（OD）測定により行った。ペニシリナーゼ活性はサー
ジエント（Sargent）の変法〔Sawai et al;Antimicrob.
Agents Chemother.13、910（1978）参照〕で測定し、30
℃、１分間に１マイクロモル（μmole）のベンジルペニ
シリンを水解する酵素量をペニシリナーゼ１単位（Ｕ）
とした。また、キシラナーゼ活性は、酵素液0.05mlにキ
シラン液（生化学工業（株）製）0.1ml及びpH8.0の0.2M
トリスマレイト緩衝液0.1mlを加えて40℃で10分間反応
させ、DNA（3,5−dinitrosalicylic acid）1mlを加えて
100℃で４分間反応させた後に水4mlを加えて510nmの吸
光度を測定し、１分間にキシロース1mgに相当する還元
力を生ずる酵素量をキシラナーゼ１単位（Ｕ）とした。
ア・コリHB101（pAX1）（FERMP−7655）とエシェリヒア
・コリHB101（pXP102-3）（FERM P−7656）を前記グル
コースを含まないLB培地（純水１当りトリプトン（Di
fco）10g、酵母エキス5g、アンピシリン20γ、NaCl10g
をpH7.0に調製したもの）で37℃にて振盪培養した。細
胞の生育（菌体量の測定）は、波長660nmにおける吸光
度（OD）測定により行った。ペニシリナーゼ活性はサー
ジエント（Sargent）の変法〔Sawai et al;Antimicrob.
Agents Chemother.13、910（1978）参照〕で測定し、30
℃、１分間に１マイクロモル（μmole）のベンジルペニ
シリンを水解する酵素量をペニシリナーゼ１単位（Ｕ）
とした。また、キシラナーゼ活性は、酵素液0.05mlにキ
シラン液（生化学工業（株）製）0.1ml及びpH8.0の0.2M
トリスマレイト緩衝液0.1mlを加えて40℃で10分間反応
させ、DNA（3,5−dinitrosalicylic acid）1mlを加えて
100℃で４分間反応させた後に水4mlを加えて510nmの吸
光度を測定し、１分間にキシロース1mgに相当する還元
力を生ずる酵素量をキシラナーゼ１単位（Ｕ）とした。
β−ガラクトシダーゼの活性は、酵母液100μｌ及び
Ｚ緩衝液（NaHPO4・12H2O 4.3g、NaH2PO4 1.25g、KCl
0.15g、MgSO4 0.04gを蒸留水200mlに溶解したもの）90
0μｌを30℃、５分間反応させ、0.2mlのオルトニトロピ
ラノシルガラクトシド0.2ml（4mg/ml、0.1Mリン酸緩衝
液（pH7）中）を加え、更に30℃で10分間反応させる。
その後1.8mlの２％Na2CO3水溶液を加え、420nmの吸光度
を測定し、酵素液1ml、１分当りの吸光度の増加によっ
て酵素活性を測定した。
Ｚ緩衝液（NaHPO4・12H2O 4.3g、NaH2PO4 1.25g、KCl
0.15g、MgSO4 0.04gを蒸留水200mlに溶解したもの）90
0μｌを30℃、５分間反応させ、0.2mlのオルトニトロピ
ラノシルガラクトシド0.2ml（4mg/ml、0.1Mリン酸緩衝
液（pH7）中）を加え、更に30℃で10分間反応させる。
その後1.8mlの２％Na2CO3水溶液を加え、420nmの吸光度
を測定し、酵素液1ml、１分当りの吸光度の増加によっ
て酵素活性を測定した。
β−ラクタマーゼの活性測定法は、ペニシリナーゼの
ばあいと同様である。
ばあいと同様である。
エシェリヒア・コリHB101（pAX1）株によるキシラナ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−ラクタマーゼの
生産性ならびに同株の生育を第４図に示す。キシラナー
ゼは菌体内およびペリプラスミック空間に蓄積され、菌
体外にはほとんど分泌されないことがわかる。β−ガラ
クトシダーゼは、菌体内に蓄積され、ペリプラスミック
空間および菌体外にはほとんど分泌されない。β−ラク
タマーゼは、ペリプラスミック空間に蓄積されるが、培
養20時間後にはほとんど認められなくなっている。
ーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−ラクタマーゼの
生産性ならびに同株の生育を第４図に示す。キシラナー
ゼは菌体内およびペリプラスミック空間に蓄積され、菌
体外にはほとんど分泌されないことがわかる。β−ガラ
クトシダーゼは、菌体内に蓄積され、ペリプラスミック
空間および菌体外にはほとんど分泌されない。β−ラク
タマーゼは、ペリプラスミック空間に蓄積されるが、培
養20時間後にはほとんど認められなくなっている。
エシェリヒア・コリHB101（pXP102−３）株によるキ
シラナーゼの生産性を第５図に示す。培養16〜20時間後
において、キシラナーゼはそのほとんどの部分が菌体外
に分泌され、蓄積されることがわかる。キシラナーゼ
は、20時間後にペリプラスミック空間にわずかに蓄積さ
れているが、菌体内には全く蓄積されていない。
シラナーゼの生産性を第５図に示す。培養16〜20時間後
において、キシラナーゼはそのほとんどの部分が菌体外
に分泌され、蓄積されることがわかる。キシラナーゼ
は、20時間後にペリプラスミック空間にわずかに蓄積さ
れているが、菌体内には全く蓄積されていない。
このように、キシラナーゼを生産するが、菌体外には
ほとんど分泌しないHB101（pAX1）のキシラナーゼDNA断
片を、ペニシリナーゼを生産し、これを菌体外に分泌す
るHB101（pEAP2）のプラスミドpEAP2に組み込んでな
る、プラスミドpXP102−３を導入した形質転換株HB101
（pXP102−３）は、ペニシリナーゼのみならず、キシラ
ナーゼをも生産し、これを菌体外に分泌するようにな
る。
ほとんど分泌しないHB101（pAX1）のキシラナーゼDNA断
片を、ペニシリナーゼを生産し、これを菌体外に分泌す
るHB101（pEAP2）のプラスミドpEAP2に組み込んでな
る、プラスミドpXP102−３を導入した形質転換株HB101
（pXP102−３）は、ペニシリナーゼのみならず、キシラ
ナーゼをも生産し、これを菌体外に分泌するようにな
る。
第６図は、エシェリヒア・コリHB101（pXP102−３）
による、ペニシリナーゼとβ−ガラクトシダーゼの生産
性を示すグラフである。ペニシリナーゼはほとんどすべ
ての部分が菌体外に分泌され、蓄積されるのに対し、β
−ガラクトシダーゼはそのほとんどの部分が菌体内に蓄
積され、菌体外には分泌されないことがわかる。
による、ペニシリナーゼとβ−ガラクトシダーゼの生産
性を示すグラフである。ペニシリナーゼはほとんどすべ
ての部分が菌体外に分泌され、蓄積されるのに対し、β
−ガラクトシダーゼはそのほとんどの部分が菌体内に蓄
積され、菌体外には分泌されないことがわかる。
第１図は、プラスミドpEAP2の調製工程ならびにその制
限酵素切断地図を示すものである。第２図はプラスミド
pAX1の調製工程ならびにその制限酵素切断地図を示すも
のである。第３図はプラスミドpXP102−３の調製工程な
らびにその制限酵素切断地図を示すものである。第４図
は、エシェリヒア・コリHB101（pAX1）の生育および、
キシラナーゼ、β−ガラクトシダーゼならびにβ−ラク
タマーゼの生産性を示すグラフである。第５図は、エシ
ェリヒア・コリHB101（pXP102−３）の生育およびキシ
ラナーゼの生産性を示すグラフである。第６図は、第５
図に示したエシェリヒア・コリHB101（pXP102−３）の
生育およびペニシリナーゼとβ−ガラクトシダーゼの生
産性を示すグラフである。
限酵素切断地図を示すものである。第２図はプラスミド
pAX1の調製工程ならびにその制限酵素切断地図を示すも
のである。第３図はプラスミドpXP102−３の調製工程な
らびにその制限酵素切断地図を示すものである。第４図
は、エシェリヒア・コリHB101（pAX1）の生育および、
キシラナーゼ、β−ガラクトシダーゼならびにβ−ラク
タマーゼの生産性を示すグラフである。第５図は、エシ
ェリヒア・コリHB101（pXP102−３）の生育およびキシ
ラナーゼの生産性を示すグラフである。第６図は、第５
図に示したエシェリヒア・コリHB101（pXP102−３）の
生育およびペニシリナーゼとβ−ガラクトシダーゼの生
産性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/86 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (11)
- 【請求項１】宿主に、キシラナーゼの菌体外生産能を与
えるプラスミドであって、バチルス（Bacillus）属に属
する微生物の染色体DNAから調製されたペニシリナーゼ
の菌体外生産に関与する遺伝情報を担うデオキシリボ核
酸（DNA）断片と、アエロモナス（Aeromonas）属に属す
る微生物の染色体DNAから調製されたキシラナーゼの生
産に関与する遺伝情報を担うデオキシリボ核酸（DNA）
断片を組み込んでなるプラスミド。 - 【請求項２】プラスミドがpXP102−３プラスミドである
特許請求の範囲第（１）項記載のプラスミド。 - 【請求項３】バチルス属に属する微生物がバチルス（Ba
cillus）No.170菌（微工研菌寄第3221号）（FERM BP-46
7）である特許請求の範囲第（１）項記載のプラスミ
ド。 - 【請求項４】アエロモナス属に属する微生物がアエロモ
ナス（Aeromonas）sp.No.212（ATCC 31085）である特許
請求の範囲第（１）項記載のプラスミド。 - 【請求項５】宿主がエシェリヒア（Escherichia）属に
属する微生物である特許請求の範囲第（１）項記載のプ
ラスミド。 - 【請求項６】エシェリヒア属に属する微生物がエシェリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）である特許請求の範囲
第（５）項に記載のプラスミド。 - 【請求項７】バチルス（Bacillus）属に属する微生物の
染色体DNAから調製されたペニシリナーゼの菌体外生産
に関与する遺伝情報を担うDNA断片を組み込んだプラス
ミドをベクターDNAとし、該ベクターDNAを、前記遺伝情
報を妨害しない制限酵素を用いて開裂し、この開裂部位
に、アエロモナス（Aeromonas）属に属する微生物の染
色体DNAから調製されたキシラナーゼの生産に関与する
遺伝情報を担うDNA断片を組み込むことを特徴とするペ
ニシリナーゼ及びキシラナーゼの菌体外生産能を宿主に
与えるプラスミドの調製方法。 - 【請求項８】ペニシリナーゼ及びキシラナーゼの菌体外
生産能を宿主に与えるプラスミドがpXP102−３プラスミ
ドである特許請求の範囲第（７）項記載の調製方法。 - 【請求項９】ベクターDNAがpEAP2プラスミドである特許
請求の範囲第（７）項記載の調製方法。 - 【請求項１０】アエロモナス属に属する微生物がアエロ
モナス（Aeromonas）sp.No.212（ATCC 31085）である特
許請求の範囲第（７）項記載の調製方法。 - 【請求項１１】ペニシリナーゼ及びキシラナーゼの菌体
外生産能を有するエシェリヒア・コリHB101-pXP102−３
〔Escherichia coli HB 101-pXP102−３〕（微工研菌寄
第7656号）（FERM P−7656）。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59278681A JPH0817702B2 (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
| DK605985A DK605985A (da) | 1984-12-28 | 1985-12-23 | Plasmid, fremgangsmaade til fremstilling og mikroorganisme indeholdende samme samt fremgangsmaade til dyrkning af mikroorganismen |
| DE8585116611T DE3583601D1 (de) | 1984-12-28 | 1985-12-27 | Plasmid, verfahren zu dessen herstellung, dieses plasmid enthaltender mikroorganismus und verfahren zur zuechtung des mikroorganismus. |
| EP19850116611 EP0187382B1 (en) | 1984-12-28 | 1985-12-27 | Plasmid, method for construction of the same, microorganism carrying the plasmid and method for cultivation of the microorganism |
| US07/401,507 US5190874A (en) | 1984-12-28 | 1989-08-30 | Method for producing penicillinase and xylanase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59278681A JPH0817702B2 (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61158790A JPS61158790A (ja) | 1986-07-18 |
| JPH0817702B2 true JPH0817702B2 (ja) | 1996-02-28 |
Family
ID=17600685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59278681A Expired - Lifetime JPH0817702B2 (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0187382B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0817702B2 (ja) |
| DE (1) | DE3583601D1 (ja) |
| DK (1) | DK605985A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2620852B2 (ja) * | 1985-07-30 | 1997-06-18 | 理化学研究所 | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物 |
| NL9001388A (nl) | 1990-06-19 | 1992-01-16 | Unilever Nv | Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan. |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519092A (en) * | 1978-06-08 | 1980-02-09 | Harvard College | Selected protein producing method |
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
| JPS59162886A (ja) * | 1983-03-08 | 1984-09-13 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK138984A (da) * | 1983-03-08 | 1984-09-09 | Rikagaku Kenkyusho | Plasmid, fremgangsmaade til fremstilling heraf, mikroorganismer indeholdende samme samt fremgangsmaade til dyrkning af mikroorganismen |
-
1984
- 1984-12-28 JP JP59278681A patent/JPH0817702B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-12-23 DK DK605985A patent/DK605985A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-12-27 EP EP19850116611 patent/EP0187382B1/en not_active Expired
- 1985-12-27 DE DE8585116611T patent/DE3583601D1/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519092A (en) * | 1978-06-08 | 1980-02-09 | Harvard College | Selected protein producing method |
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
| JPS59162886A (ja) * | 1983-03-08 | 1984-09-13 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0187382A2 (en) | 1986-07-16 |
| JPS61158790A (ja) | 1986-07-18 |
| EP0187382B1 (en) | 1991-07-24 |
| DK605985D0 (da) | 1985-12-23 |
| DE3583601D1 (de) | 1991-08-29 |
| EP0187382A3 (en) | 1988-04-20 |
| DK605985A (da) | 1986-06-29 |
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