JPS59162886A - 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 - Google Patents

新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物

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JPS59162886A
JPS59162886A JP58038089A JP3808983A JPS59162886A JP S59162886 A JPS59162886 A JP S59162886A JP 58038089 A JP58038089 A JP 58038089A JP 3808983 A JP3808983 A JP 3808983A JP S59162886 A JPS59162886 A JP S59162886A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規プラスミド及び、その調製方法並びに該
プラスミドを含有する新規微生物に関し、代紺産物であ
るペニシリナーゼの菌体外選択生産に関与する特定の遺
伝情報を担うデオキシリ？核酸（ＤＮＡ）を組み込んだ
新規プラスミドと該プラスミドによって形質転換した新
規微生物を提供することを目的とするものである。
シラスミドは、微生物の細胞内に見出される染色体外遺
伝子で、そのＤＮＡの円形分子であり、近年、微生物の
遺伝−子細み換えの手段として利用され、発酵工業の分
野の研究におけるその重要性は益々増大して来ている。
近年、アミノ酸やペグチドの例にみられるように、微生
物の生育に必要とする特定の要求性や代謝産物の生産能
に関与する遺伝情報を担５ＤＮＡを組み込んだプラスミ
ドについての研究がなされ、また若干のプラスミドが宿
主微生物に導入され、その形質転換株が得られている。
本発明者は、バチルス（Ｂａｃｌ　ｌ　１ｕｓ）　　属
ＫＭする微生物の代翻産物であるペニシリナーゼの菌体
外選択生産に関与する遺伝情報を担５　Ｄ’Ｎ＾を組み
込んだ新規プラスミドを調製することに成功し、更に前
記グラスミドをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｌｃ
ｈｌａ　ｃｏｌｔ）　　８８７０７株に導入して新規且
つ有用な形質転換株、工゛シエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌ・）Ｈ日／　０　／　（ｐ’Ｅ
ＡＰ２）を得ることに成功して本発明を完成するに至っ
た。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において用いられる宿主微生物は、エシェリヒア
属のグラスミドとして知られるコリシンＥ、因子等の、
培養された細胞内で増殖し得る形式をとるプラスミド（
ベクターＤＮＡ）に、外来の遺伝子ＤＮＡとしてバチル
ス属に属する微生物、例えばバチルス・扁／７θ菌（微
工研菌寄第３２２／号）から調製され嬉染色体ＤＮＡ断
片を組み込んだプラスミドを含有する、エシェリヒア・
コリによって代表されるエシェリヒア属に属する微生物
である。
前記ベクターＤＮＡＫ＃Ｉみ込まれる、バチルス・Ａｌ
２Ｏ菌から調製された染色体ＤＮＡ断片は、前記バチル
ス属菌の代謝産物であるぜニシリナーゼの菌体外選択生
産に関与する遺伝情報を担うＤＮＡであり、前記ベクタ
ーＤＮＡとしては、天然に存在するものを抽出したもの
〜他、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落
しているものでもよく、例えばＣｏ　ｌ　Ｅ　、の系統
、ｐＭＢ９　の系統、ｐｓｃｌｏｌ　　の系統、Ｒ６に
の系統、ラムダ−ファージの系統等が挙げられる。
また、前記ベクターＤＮＡに前記染色体ＤＮＡ断片を組
み込む方法は、既知のいずれの方法も適用し得る。例え
ば、適当な制限酵素（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅ−ａｓｅ）　
　を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで
同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混゛合し
、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。この
ようにして得られた前記染色体ＤＮＡ断片とベクターＤ
ＮＡの結合物を、形質転換法によって受容菌であるエシ
ェリヒア属の微生物の菌体に導入し、遺伝形質として安
定するまで増殖すると所望の染色体上の遺伝形質とべり
ターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換株が得られる０ 後述の実施例において得られる形質転換株は、ベクター
ＤＮＡとしてｐＭＢ９　　プラスミドのＤＮＡを用い、
これにバチルス・扁／７θ菌から調製された染色体ＤＮ
Ａ断片を組み込んで得られた新規ｐＥＡＰ２シラスミド
を、エシェリヒア・コリＨｅ１０／株（エシェリヒア・
コリに一／２株とエシェリヒア・コリ８株のハイブリッ
ド株）に導入して形質転換反応により得られる新規微生
物であり、エシェリヒア・コリＨＢ　／　０　／　（ｐ
ＥＡＰ２）　（Ｅｓｃｈｅ−ｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌｌ　
ＨＢ　／　０　／　（ＰＥＡＰ２））　　（微工研菌寄
第６９３９号（ＦＥ日Ｍｐ−６９３９）と呼称される。
前記エシェリヒア・コリＨＢ１０／（ｐＥＡＰ２）のｐ
ＥＡＰ２プラスミドの制限酵素切断地図は、第を図に示
すとおりである。
第７図から明らかなように１このグラスミドは、ｐＭＢ
９　　プラスミドＤＮＡの制限サイトのＨ１ｎｄｌｌｌ
サイトに前記バチルス・４７７０ｍのベニシリナーゼの
菌体外選択生産に関与する遺伝情報を担うべ二シリナー
ゼＤＮＡ断片が絹み込まれているり、７Ｋｂ　　のＤＮ
Ａ円形分子である。
次に、前記エシェリヒア・コリＨＢ１０／（ｐＥＡＰ２
）の菌学的性質は、ＤＮＡ受容菌であるエシェリヒア・
コリ＋−＋ｓ１０／株の性質と、ペニシリン耐性を際い
て、同一であるが（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｌｎｇ
　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ｐ、！
ｒＯ’ｌ（７９ｇ、２）　　診照、遺伝形質：　Ｆ−＋
　ｈｓｄ　Ｓ　＝２０（ｒＢ＋　ｍｓ）＊　ｒｅｃ　Ａ
／３＋ａｒａ−７’１ｍ　ｐｒｏＡ、２＋　１ａｃＹ／
＋　ｇａｌに、２１　ｒｐｓＬ、２０（Ｓｍ’　）　。
ｘｙｔ−５，ｍｔｌ−／＋　５ｕｐＥＩＩｌｌλ−〕、
他の特性として、前記ｐＥＡＰ２プラスミドの特性、即
ちイニシリナーゼ生産能の遺伝情報を担５　＋）ＥＡＰ
２　グラスミドによってペニシリナーゼを菌体外に選択
的に生産せしめる特性を附加して成る点がその特徴であ
る。
エシェリヒア・コ！Ｊ　ＨＢ　／　０　／　（＋）ＥＡ
Ｐ２）にヨルヘ二シリナーゼの菌体外選択生産は、後述
の実施例で示されるように、菌体内生産を含めた全酵素
生産の３０９以上に達し、且つ長時間その生産量が持続
される。これに対し、公知のエシェリヒア・コリ°Ｈａ
／θ／（ｐＢＲ３２２）によるペニシリナーゼ生産は、
全酵素生産の３０９以上が菌体内生産であり、また公知
のバチルス・Ａ／りＯ菌によるペニシリナーゼの菌体外
生産は長時間の持続性を欠くものであり、これらの点に
おいて全く対照的である。
従って、前記エシェリヒア・コリＨＢ１０／（ｐＥＡＰ
２）は、従来皆無であった酵素蛋白の菌体外選択生産能
を有する微生物を創製し、且つペニシリナーゼを極めて
有利に生産し得る微生物を提供する点において、新規性
と有用性を具備するものである。
以下に、本発明のプラスミドの調製方法と該プラスミド
を含有する前記形質転換株、エシェリヒア・コＩＪ　Ｈ
Ｂ　／　０　／　（１）ＥＡＰ２）の調製方法並びに前
記形質転換株による効果として、ベニシリナーゼの菌体
外選択生産について、実施例により説明する０ 実施例／ （１１−（＝−、；ＩＪナーゼ生産能の遺伝情報をもつ
染色体ＤＮＡの調製 （ニシリナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有する
好アルカリ性のバチルス・屋／７θ菌（微工研菌寄第３
２２／号）を培地ＣＣＶ／ｌ’）：グリセロール２．０
　、酵母エキスＳ、０、ポリにプ）　ン！ｒ、０．　に
２Ｈｐａ４／、０、ＭｔＳＯ４’　７　ＨｚＯθ、２を
ＮａＨＣＯ３１０でｐＨ９’、θに調整したもの〕中、
３０℃で７９時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の菌
体を集菌後、フェノール法によるＤＮＡ抽出法によって
染色体ＤＮＡを抽出、精製し、染色体ＤＮＡ左ダを得た
。
（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡ＃ｌ）μＶをとり、制限エンドヌクレア
ーゼＨｉｎｄ　ｍ　　を加え、３７℃で３分、７０分、
２０分、３０分、乙Ｏ分反応させて部分的に切断した。
一方、ベクターとして用いるテトラサイクリン抵抗性（
Ｔｅｔ　’　）　　のｐＭＢ９シラスミドＤ　Ｎ　Ａ　
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｑｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒ　Ｉｅｓ　　社（米国）製）をＨｌｎｄ　ＩＩＩ　
　で完全に切断してる左’Ｃ１ｊ分の熱処理後、前者と
混合し、Ｔ４　　ファージ由来のＤＮＡリガーゼによっ
て７０℃、２り時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行ない、乙Ｓ
℃、３分の熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加
えて染色体ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを沈澱
、採取した。
【３）　　ペニシリナーゼの菌体外選択生産遺伝子を担
うプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリに一／−株とエシェリヒア・コリ８
株のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリＨＢ１０
／株［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｌｎｇＡ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｐ、３ＱＩＪｔ（７９
ｇ２）　　参照〕（遺伝形質：Ｆ″″、　ｈｓｄ　Ｓ　
２θ（ｒＢ　＊　ｍＢ　）　’、　ｒｅｃ　Ａｌ１　＊
　ａｒａ−７４１，ｐｒｏ　Ａ　ａ２　ｒ　ｌａｃ　Ｙ
　／　＋　Ｐａｌにコ。
ｒｐｓ　Ｌ　Ｊ７（Ｓｍ’）　＋　ｘｙｔ−５＋　ｍｔ
ｌ−／　＋　ｓｕｐ　Ｅ　４ｔ’ｌλ″″）をＬＢ培地
（純水／ｌ当りトリプトン（ＤＩｆｃＯ）／θｙ、酵ｍ
エキス左ｖ１グルコース／２、Ｎａｃ′１０ｆをｐＨ７
，ＯＫｆｉＭ製したもの）１０ｔｎｔに接種し、３７℃
で振盪培養を行ない、対数増殖後期まで生育させた後に
集菌した。これを水冷下、最終濃度で０．θ３　Ｍ　Ｃ
ａＣｌ２の溶液に順次懸濁させてコンピテントな細胞と
した。この細胞懸濁液に（２）で得たプラスミドＤＮＡ
の溶解液を加えて水冷下で６θ分反応させ、ｌＩ２℃、
７〜２分間ヒートショックを与えて前記シラスミドＤＮ
Ａを細胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液を
別途、前記ＬＢ培地に接秤し、３７℃、３〜ｓ時間振盪
培養して形質転換反応を行なった後、集菌、洗滌して形
質転換株、エシェリヒア　、　ニアすＨａ　／　０　／
　（ＰＥＡＰ２）　（機工Ｈ菌寄第６９３９号）を得た
。
実施例コ 実施例／の（３）で得られた形償転換株、エシェリヒア
・コリＨｓ　／　０　／　（ｐＥＡＰ２）　（微工研菌
寄第乙９３９号）　（ＦＥＲＭ　ｐ−６９３９）を、Ｌ
Ｂ培地（／ｌ当りトリプトン１０２、酵母エキス３ｆ。
グルコース／２、グリセロール２２、ＮａＣ６／θｔ）
１００−を含む、５−００−容のフラスコで３７℃にて
振盪培養した。細胞の生育（菌体量の測定）は、波長１
−　Ａ　Ｏｎｍ　　における吸光度（ＯＤ）を測定し、
菌体外及び菌体内生産のベニシリナーゼ活性をサージェ
ント（Ｓａｒｇｅｎｔ）の変法［Ｓａｗａｌ　ｅｔ　ａ
ｌ；Ａｎｔｌｍｌｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒ、　／　３　、り１０（７９７ｇ）参照〕で
測定し、３０℃、７分間に／マイクロモル（μｍｏ　ｌ
　ｅ　）　　のベンジルペニシリンを水解する酵素側を
ペニシリナーゼ／単位（Ｕ）とした。
前記形質転換株の菌体量は接種後、／６時間で最大に達
し、第１図に示すとおり、菌体外ベニシリナーゼの活性
ははｙ２０時間後から増大しはじめ、２ｇ時間後に最大
に達した（　＃Ｊ　ＯＵ／ｒｎｔ）。
生産されたベニシリナーゼは非常に安定であり、第１図
（ａ）に示されるように、更にそのま〜培養をグざ時間
まで継続しても生産量は減少せず、全酵素活性のｇθ％
以上に達した。これに対して、菌体内ペニシリナーゼは
、培％初期（接種後５〜２０時間）において認められた
が、その生産は全酵素活性の１０％程度であり、最高で
ｇ　Ｕ／＋＋／！に過ぎず、しかもその活性は急速に減
少し、グｇ時間後では全く認められなかった。第１図（
ｂ）は、全酵素活性に対する菌体外ベニシリナーゼと菌
体内ぺ二シリナーゼの生成の割合を示すものである。比
較として、ＤＮＡ供与菌の前記バチルス・Ａｌ２Ｏ菌（
微工研菌寄第３２２／号）及びＤＮＡ受容菌の公知のエ
シェリヒア・コＩＪ　ＨＢ　／θ／　（ｐＢＲ５２２）
株（ペニシリナーゼ生産能の遺伝情報を和うｐＢＲ３２
２シラスミドを含有する菌株）’　［Ｂｏｙｅｒ　ｅｔ
ａｌ；Ｇｅｎｅ、ｖａｔ　、ｌ　、ｐ、ヲｊｔ−／／３
Ｃ／９７７’）参照〕を、それぞれ培養してベニシリナ
ーゼ活性を測定した。
前記バチルス・屋／７０菌の場合は、使用培地［（ｆ／
ｌ）：　　グルコース（又はグリセロール）−！、θ、
酵母エキスＳ。θ、ポリ被プトンＳ、０、に２ＨＰ０４
／、０％ＭｆＳＯ４−りＨ，ＯＯ，２−をＮａＨＣＯ３
／　０でｐＨ９，０に調整したもの〕１００−を含む３
００づ容のフラスコに接種し、３７℃＋：振盪培養した
。培養液の菌体外ベニ゛シリナーゼ活性をり時間毎に測
定し、接種後、７２時間で活性は最高（／９ヴ→　に達
し、以後急速に減少して７０時間では全く認められなか
った（第２図参照）。
一方、エシェリヒア・コリＨＢ　／　０　／　（ｐｓＲ
３２２）の場合は、前ｇｒ′ｌエシェリヒア・コリＨＢ
１０／（ｐＥＡＰ２）株の培養に用いたＬＢ培地の７０
０−を５θＯｍｌ谷のフラスコに入れて接種し、３７℃
で振−培養した。第３図（８）Ｋ示されるように、接種
後、２０時間で全活性のｇθ％以上が菌体内ベニシリナ
ーゼとして認められたが（最高３　！ｒ　咥）、以後急
速に減少し、菌体外ペニシリナーゼ活性は７０％以下が
認められるに過ぎなかった。第３図（ｂ）は、全酵素活
性に対する菌体外４ニシリナーゼと副体内ペニシリナー
ゼの生成の割合を示すものである。
なお、実施例／の形質転換株の培養液を１０分間、／θ
０θ０×１で超遠心してアンモニウム硫酸塩でｇθ％飽
和溶液とした。この沈澱物を水に溶解シ、−夜、０．／
　Ｍ　ＮａＣｌ　を含むθ、０　、！ｉ−Ｍ燐酸緩衝液
（ｐ）Ｉ　７．０　’）で透析した。この透析物を同一
の緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−７ｊ？（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７３）に通じて精製被ニシリナー
ゼを得た。
また、前記バチルスＡ／’７ＯＮ＋（＠工研菌寄第３λ
２／号）の培養液を同様に処理して精製被ニシリナーゼ
を得た。
両者のベニシリナーゼの同一性をみるために、酵素活性
におけるｐＨの影響、熱安定性、分子量等を測定した。
その結果、次のとおり両者の同一性が確認された。
（ａ）　　酵素の安定性は各ｐＨ値の緩衝液を用い、３
０’Ｃ１４３−分でインキュベートした後、調べた。
その結果、両酵素は、いずれもｐＨ７〜１０で安定であ
り、至適ｐＨはｐＨＡ、θ〜７．０であった。
（ｂ）　　酵素の熱安定性は、酵素を０．０ｊＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、その溶液を７０分間、所
定の温度で熱処理し、残存活性をｐＨ７，０で測定する
ことにより調べた。その結果、いずれの酵素も３０℃ま
で安定であった。
（Ｃ）　　酵素の分子量の測定は、ｒル濾過法で行なっ
た。両酵素の分子量はいずれも、２７ｏｏｏ〜２２、０
００と推定された。
【図面の簡単な説明】
第７図は、本発明方法で用いたエシェリヒア・コリＨｓ
　／　０　／　（ｐＥＡＰ２）によるベニシリナーゼの
活性を、第２図は、バチルス・扁／７θ菌によるベニシ
リナーゼの活性を、第３図は、公知のエシェリヒア・コ
リＨａ１０／ＣρＢＲ３２２）　　によるベニシリナー
ゼの活性をそれぞれ示すグラフである。 第９図は、エシェリヒア・コリＨａ／θ／（ｐＥＡＰ２
）のプラスミド（ｐＥＡＰ２）の制限酵素切断地図であ
る。 特許出願人　　　理　化　学　研　究　所第２図 冷養時間（ｈｒ） 第３図（ａ） 第３図（ｂ） 第　４ｒＸＪ −□　　：　　ｐＭＢ９乃スミドＤＮＡ手　　続　　補
　　正　　瞥 昭和　　年　　〜ａ４・−８ １、事件の表示　昭和！ｇ年特許願第　３１０ｇ２号３
、補正をする者 事件との関係　　出願人 名称（６７９）理化学研究所 ４、代理人 ５、補正命令の日付　　自　　発 ６゜ コ　第弘図を別紙のとおシ訂正する。 第４図 □　：　ρＭＢ９プラスミドＤＮＡ □　：バ千ＩＬＸ属Ｎｏ、１７０ＯＮＡＶ、ｆｆ片〔ベ
ニシリナーゼ“ＤＮＡ（Ｐｅｎ）ｌ妻斤Ｍθ手続補正書
　５８．９．１６ 昭和　　年嘗Ｖ　　日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 ■、事件の表示 昭和５８年　特許願　第３８０８９号 ３、補正をする者 事件との関係　　　出願人 名称　（６７９）理化学研究所 ５、補正命令の日付　　自　　発 （１）　　明細書第ｇ頁、第５〜乙行の１断片が組み込
壕れている・・・円形分子である。＃を次のとおシ訂正
する。 ［断片が組み込捷れているＤＮＡ円形分子、即ちｐＭ８
９ニア’ラスミドＤＮＡと約２，０θθの塩基対のＤＮ
Ａゐ）ら成る７、７Ｋｂ　のＤＮＡ円形分子である。」 （，２１同第り頁、第１Ｓ行”である。”の後に、次の
文を挿入する。 「また、その生産物質は目的とする単一の高分子物質の
みならず、複数の酵素蛋白類がそれぞれ菌体外に著量に
生産（分泌）され、併せて採取することができる。即ち
、エシェリヒア・コリＨ８１０１株の培養によシ、従来
、菌体内にのみ検出されていたアルカリホスファターゼ
及びβ−ガラクト７ダーゼ並びに約７０種の蛋白質から
成る蛋白質群が、後述の実施例に記載の如く、それぞれ
菌体外に著量に分泌されることが明らかにされた。 これは、本発明によって得られるｐＥＡＰ’Ｊｆラスミ
ドに含まれる約２．０００の塩基対のＤＮＡが、代謝産
物の菌体外選択生産（分泌）能を宿主に附与しているこ
とを意味するものである−（Ｊ　同第７頁、第７９行 ”ペニシリナーゼ＃を、「ペニシリナーゼ等」と訂正す
る。 （匈　同第１７貞、第１行と第２行の間に、次の文を挿
入する。 「実施例３゜ 前記エシェリヒア・コリＨＢ／θ／　（ｐＥＡＰ、２）
（微工研菌寄第６９３９号）（ＦＥＲＭ　　Ｐ−４９３
９）の菌体外生産物質について、プラスミド（ｐＥＡＰ
！　）を導入しないエシェリヒア−コリＨＦ３１０／株
及びｐＭＢ９グラスミドを導入したエシェリヒア・コリ
）−Ｉ８／（１；）／株の生産物質と比較して、ペニシ
リナーゼ以外の酵素蛋白類を調べた結果を第１表に示す
。 なお、培養条件は、実施例／、のＬ８培地で、３７℃に
て１０時間振盪培養し、また生産酵素蛋白の内、アルカ
リホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼの酵素活性
は、波長ｌＩ２θｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し
て表わしたものであシ、蛋白質濃度は、培地／ｒｎｔ当
シのηとして表わし、その他の条件は実施例／、と同様
である。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）宿主にペニシリナーゼの菌体外選択生産能を与え
    るプラスミドであって、その制限サイトのＨ１ｎｄｌｌ
    ｌサイトにバチルス（Ｂａｃｌ　ｌ　１ｕｓ）　　属に
    属する微生物のベニシリナーゼの菌体外選択生産に関与
    する遺伝情報を担うデオキシリテ核酸（ＤＮＡ）断片を
    組み込んだプラスミド。
  2. （２）グラスミドがｐＥＡＰ２プラスミドである特許請
    求の範囲第１項記載のプラスミド。
  3. （３）　　グラスミドのベクターがｐＭＢ　９　　プラ
    スミドのＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載のゲラ
    スミ　ド。
  4. （４）　　バチルス属に属する微生物がバチルス（Ｂａ
    ｃｌｌｌｕｓ）　　Ａ　／　７０菌（微工研菌寄第３２
    ２／号）である特許請求の範囲第１項記載のプラスミド
    。
  5. （５）宿主がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ）
    属に属する微生物である特許請求の範囲第１項記載のシ
    ラスミド。
  6. （６）　　エシェリヒア属に州する微生物がエシェリヒ
    ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃａｌｌ）　　で
    ある特許請求の範囲第１項記載のシラスミド。
  7. （７）　　ペニシリナーゼの菌体外選択生産能を与える
    染色体ＤＮＡ断片を制限酵素を用いて調製すること、前
    記染色体ＤＮＡ断片のベニンリナーゼの菌体外選択生産
    に関与する遺伝情報を妨害しない制限酵素を用いてシラ
    スミドのベクターＤＮＡを制限すること、制限された前
    記グラスミドのベクターＤＮＡの制限サイトのＨｌｎｄ
    　ＩＩＩサイトに前記染色体ＤＮＡ断片を組み換えるこ
    と及び組換えられたプラスミドを抽出することから成る
    にニシリナーゼの菌体外選択生産に関与する遺伝情報を
    和５　ｏ　Ｎ　Ａ断片を組み込んだプラスミドの調製方
    法。
  8. （８）グラスミドがｐＥＡＰ２　グラスミドである特許
    請求の範囲第７項記載の調製方法。
  9. （９）　　プラスミドのベクターとして、９Ｍ８９　　
    プラス・ミドのＤＮＡを用いる特許請求の範囲第７項記
    載のグラスミドの調製方法。 ０ω　染色体ＤＮＡ断片がバチルス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ
    ）　　属に属する微生物のＤＮＡから調製された染色体
    ＤＮＡである特許請求の範囲第７項記載のプラスミドの
    調製方法。 （Ｉｌｌ　　バチルス属に属する微生物がバチルス（Ｂ
    ａａ　Ｉ　−１１ｕｓ）　・Ａ　／　７θ菌（ｆａ工研
    菌寄第、？：１２／号）である特許請求の範囲第７０項
    記載のプラスミドの調製方法。 ０２　　ペニシリナーゼの菌体外選択生産能を有するエ
    シェリヒア・コリＨｅ　／　０　／　（ｐ・Ｅ−Ａ”Ｐ
    　２　）［Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌ　Ｉ　ＨＢ
    　／　０　／　（ｐＥＡＰ２）］。
JP58038089A 1983-03-08 1983-03-08 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 Granted JPS59162886A (ja)

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DE19843486163 DE3486163T2 (de) 1983-03-08 1984-03-07 Plasmide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Mikroorganismen und Methoden zur extrazellulären Herstellung von Xylanase durch Züchten dieser Mikroorganismen.
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CA000449095A CA1226833A (en) 1983-03-08 1984-03-08 Plasmids, methods for construction of the same, microorganisms carrying the plasmids and methods for cultivation of the microorganism
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPS61158790A (ja) * 1984-12-28 1986-07-18 Rikagaku Kenkyusho 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物
JPS6229982A (ja) * 1985-07-30 1987-02-07 Rikagaku Kenkyusho 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JOURNAL OF BACTERIOLOGY *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61158790A (ja) * 1984-12-28 1986-07-18 Rikagaku Kenkyusho 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物
JPH0817702B2 (ja) * 1984-12-28 1996-02-28 理化学研究所 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物
JPS6229982A (ja) * 1985-07-30 1987-02-07 Rikagaku Kenkyusho 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物

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