JPH03277289A - ハイブリッドプロモーター・オペレーター - Google Patents

ハイブリッドプロモーター・オペレーター

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JPH03277289A
JPH03277289A JP7329590A JP7329590A JPH03277289A JP H03277289 A JPH03277289 A JP H03277289A JP 7329590 A JP7329590 A JP 7329590A JP 7329590 A JP7329590 A JP 7329590A JP H03277289 A JPH03277289 A JP H03277289A
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JP7329590A
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Miki Kubo
幹 久保
Reiko Sakaguchi
坂口　玲子
Toshio Miyake
三宅　俊男
Masayuki Yamada
正幸 山田
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Tosoh Corp
Original Assignee
Tosoh Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、遺伝子工学の手法を使用して、例えばヒトの
蛋白質等を大量に製造する場合等に使用するいわゆるハ
イブリッドプロモーター・オペレーターに関するもので
ある。
（従来の技術とその課題） 宿主菌体（細胞）系の確立、遺伝子工学の手法自体の発
展に伴ない、医薬品等の産業上重要な物質を大量に、し
かも安価に製造することが可能となっている。
遺伝子工学は、前記したようなある種の製造方法として
利用されることは勿論、他方では生物の代謝メカニズム
を解明するうえでの重要な技術の一つである。
従来、遺伝子工学においては宿主として大腸菌が頻繁に
使用されている。これは、種々の変異を導入した菌株や
、遺伝子の発現および遺伝子発現の制御系が確立しつつ
ある、等の理由によるものである。
ところで、例えばヒトに由来する遺伝子等の細菌にとっ
ては異種の遺伝子を大腸菌内で発現させた場合には、製
造された物質は本来とは異なった形で得られることがあ
る。例えばヒトプロウロキナーゼ遺伝子やヒト成長ホル
モン等の遺伝子を大腸菌内で発現させた場合には、これ
ら蛋白質は本来可溶性であるにもかかわらず、不溶性顆
粒として取得されるのである。
以上の理由により、大腸菌を宿主として異種蛋白質を製
造する場合には、ときとして物理的手法、化学的手法又
は生物学的手法を用いて菌体を破砕し、不溶性画分を回
収し、更に活性化操作とよばれる操作を実施する必要が
生じることかある。
一方、例えば枯草菌、酵母、カビ等の微生物を宿主とし
て使用する技術についても研究が進められ、一部のもの
は実用化の段階に突入しつつある。例えば枯草菌は、元
来旺盛な分泌能力を有することから、活性型の目的物質
を、直接培地に分泌させる、といった試みがなされてい
るが、なおも目的物質の発現量を増加させなければなら
ない等の課題がある。
この点については、大腸菌は三重の膜構造を有するため
、製造物を当該まくを透過・分泌させるといった技術は
確立していない。
カビや酵母等については、真核生物に由来する蛋白質等
を活性型で発現させる試みがなされているが、ＤＮＡの
発現に必須のプロモーター系等の発現系や宿主の菌種が
確立されていない等の課題がある。
以上説明してきたように、遺伝子工学の進歩により多種
の微生物を宿主とした有用物質（蛋白質等）の大量製造
が可能とはなっているが、そこには解決されるべき課題
が残されている。
より具体的に言えば、従来の技術では宿主の種類等によ
って使用可能なプロモーター系が限定されるのである。
二のことは即ち、目的物質の製造を種々の宿主を使用し
て実施する場合には、それら宿主で作用する種々のプロ
モーター配列を準備し、その度ごとにプラスミド等の構
築を行わなければならないことを意味している。
（課題を解決するための手段） 従来技術の課題に鑑みて、目的物質を少なくとも二種以
上の宿主で効率的に実施可能な発現系、即ちプロモータ
ー配列が提供されるならば、それを用いることで一方で
は遺伝子工学による目的物質の製造に、また他方では菌
体種間の代謝の差異を研究するための手段等として有用
である、との判断に基づいて本発明者らは鋭意研究を行
った結果、本発明を完成するに至ったものである。即ち
本発明は、少なくとも次の各領域からなるハイブリッド
プロモーター・オペレーター ■「ＡＡＡＡＡＡＡ」からなる塩基配列を有する、後記
−３５領域の上流（５′）側に位置する領域 ■ｒＴＴ、ＧＣＴＴＪからなる塩基配列を存する＝３５
領域 ■ｒＴＡＴＡＡＴＧＪからなる塩基配列を有する一１０
領域 ■前記−１０領域の下流（３′）側に位置するラクトー
スオペロンのオペレーター部分を有する領域、 である。また本発明は、少なくとも次の各領域からなる
ハイブリッドプロモーター・オペレーター■「ＡＡＡＡ
」からなる塩基配列を有する、後記３５領域の上流（５
゛）側に位置する領域■ｒＴＴＴＴｃｃＪからなる塩基
配列を有する３５領域 ■ｒＴＡＴＡＡＴＧＪからなる塩基配列を存する一１０
領域 ■前記−１０領域の下流（３゛）側に位置するラクトー
スオペロンのオペレーター部分を有する領域、 である。更には本発明は、少なくとも次の各領域からな
るハイブリッドプロモーター・オペレータ■ｒＡＡＡＡ
ＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＪからなる塩基配列を有する、
後記−３５領域の上流（５−）側に位置する領域 ■ｒＴＴＧＡｃＡＪからなる塩基配列を有する一３５領
域 ［３］「ＴＡＴＡＡＴＧ」からなる塩基配列を有する一
１０領域 ■前記〜１０領域の下流（３′）側に位置するラクトー
スオペロンのオペレーター部分を有する領域、 である。以下、本発明の詳細な説明する。なお本発明の
プロモーターは、発現系が確立されている大腸菌と製造
物の菌体外分泌性が高いバチルス属細菌について着目し
た結果なされた物である。従って当該プロモーターは、
少なくとも大腸菌及びバチルス属細菌において作用する
ものである（ここで作用とは、当該プロモーターの下流
に読取りフレームを一致させて結合させたＤＮＡと相補
的なｍ−ＲＮＡを出現させることに他ならない）。
本発明の第１のハイブリッドプロモーター・・オペレー
ターは、その−３５領域の上流（５′）側に「ＡＡＡＡ
ＡＡＡ」からなる塩基配列を有する領域を、−３５領域
としてｒＴＴＧＣＴＴＪからなる塩基配列を有する領域
を、−１０領域としてｒＴＡＴＡＡＴＧＪからなる塩基
配列を有する領域を、−１０領域の下流（３′）側にラ
クトースオペロンのオペレーター部分を有するものであ
る。以上の領域は、本発明で規定された塩基配列のみか
らなる必要はなく、その配列の両側に他の塩基が付加さ
れていても良い。ここで、それぞれの領域の距離は、天
然の種々のプロモーターに観察される程度が好ましいが
、例えば−３５領域とその上流の領域は０〜１５塩基程
塩基−３５領域と一１０領域は１５〜２５塩基程度、−
１０領域とオペレーター部分はθ〜１５塩基程度であれ
ば良い。
以上の領域は、人工的に合成することにより簡単に調製
可能な断片であり、その調製方法に特別な制限はない。
しかし、本発明の一１０領域は、大腸菌におけるコンセ
ンサス配列であり、天然のラクトースオペロンにも見出
だされるものである。
従って、ラクトースプロモーターの一１０領域を利用し
ても良い。この場合には、−１０領域の下流に位置させ
るべきラクトースオペロンのプロモータ一部分を一１０
領域と既に結合したものとして取得することが可能であ
る。
本発明における一３５領域は、大腸菌ファージＴ５のプ
ロモーター中に天然に見出だせる領域である。従って、
当該プロモーターから調製しても良い。大腸菌Ｔ５プロ
モーターについては、例えばＵ、Ｐｅ５ｃｈｋｅ、Ｊ、
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、第１８６巻５４７〜５５５頁（１９
８５年）に記載されている。更に、本発明の一３５領域
の上流に位置させるべき「ＡＡＡＡＡＡＡＪからなる塩
基配列を有する領域は、バチルス・ステアロサーモフィ
ルスの耐熱性中性プロテアーゼｎｐｒＭ（特願昭６２−
２５３７４９号）のプロモーター中に天然に見出だすこ
とかできる。従ってこの配列は、当該プロモーターから
調製することもできる。
本発明のハイブリッドプロモーター・オペレーターは、
以上説明したように各領域を別々に調製し後にこれらを
結合して調製することもできるが、例えばｎｐｒＭのプ
ロモーターについて部位特異的変異導入法等の方法によ
り変異を導入して調製することもできる。なお、ｎｐｒ
Ｍのプロモーターは、バチルス・ステアロサーモフィル
スＭＫ−２３２株（微工研菌寄第９６４５号）から調製
することが可能である。
ところで、本発明で一１０領域の下流側に位置させるべ
き領域は、ラクトースオペロンの一１Ｏ領域の下流側に
位置する部分である。ｌａｃオペロンについては、例え
ばＩ　ｔａｋｕｒａ、Ｋ。
５ｃｉｅｎｃｅ、１９８巻、１０５６頁、１９７７年に
記載されている。本発明においては、他に例えばＡ、Ｓ
ｉｍｏｎｓら（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１゜Ｓｃ　ｉ、Ｕ
ＳＡ、８１巻、１６２４頁、１９８４年）により報告さ
れたｌａｃオペロンに由来するオペレーター部分であっ
ても良い。なお、本発明でオペレーター部分として使用
する塩基配列は、ラクトースオペレーターの全体である
必要はなく、そのリプレッサーとの結合により、上流に
位置するプロモータ一部分の発現を制御し得る配列を有
するものであれば良い。
以上のような本発明のハイブリッドプロモーター・オペ
レーターにおけるプロモータ一部分として例えば次式１
で示されるものが例示できる。
式　　１ ％式％ ここで、式１における本発明の各領域を下線を施して示
す。また、本発明のハイブリッドプロモーター・オペレ
ーターにおけるオペレーター部分として例えば次式２で
示されるものが例示できる。
式　　２ ％式％ 特に式２で示されるオペレーター部分は天然のうクトー
スオペレーターの塩基配列の全部を含むものではなく、
その機能的部分（下線部）を含むものである。
以上説明してきた本発明の第１のノ＼イブリ・ソドブロ
モーター・オペレーターとして、例えば式３に示される
ものが例示できる。
式　　３ ％式％ （なお、式中の下線部は本発明の各領域を示すものであ
る） 本発明の第１のハイブリッドプロモーター・オペレータ
ーにおいては、その−３５領域の上流に位置する「ＡＡ
ＡＡＡＡＡ」からなる塩基配列を含む領域が更に「ＡＡ
ＡＡＴＧＴＧ」からなる塩基配列をその上流側に含んで
いても良い。この付加的な領域もｎｐｒＭプロモーター
に由来するものである。この、「ＡＡＡＡＴＧＴＧ」な
る領域は、「ＡＡＡＡＡＡＡ」からなる塩基配列を含む
領域の上流に位置していれば制限はなく、例え距離をお
いて当該領域の上流に位置していても良い。このような
、「ＡＡＡＡＴＧＴＧ」からなる塩基配列が付加された
本発明の第１のハイブリッドプロモーター・オペレータ
ーとしては、次式４で示されるものが例示できる。
式　　４ ％式％ 続いて本発明の第２のハイブリッドプロモーター・オペ
レーターについて説明する。本発明の第２のハイブリッ
ドプロモーター・オペレーターは、その−３５領域の上
流（５′）側にｒＡＡＡＡ」からなる塩基配列を有する
領域を、−３５領域としてｒＴＴＴＴｃｃＪからなる塩
基配列を有する領域を、−１０領域としてｒＴＡＴＡＡ
ＴＧＪからなる塩基配列を有する領域を、−１０領域の
下流（３−）側にラクトースオペロンのオペレーター部
分を有するものである。以上の領域は、本発明で規定さ
れた塩基配列のみからなる必要はなく、その配列の両側
に他の塩基が付加されていても良い。それぞれの領域の
距離等については先に説明した通りである。これらそれ
ぞれの領域間の距離は前述した第１のハイブリッドプロ
モーター・オペレーターと同様である。
以上の領域は、人工的に合成することにより簡単に調製
可能な断片であり、その調製方法に特別な制限はない。
しかし−１０領域は、大腸菌におけるコンセンサス配列
であり、天然のラクトースオペロンにも見出だされるも
のである。従って、ラクトースプロモーターの一１０領
域を利用しても良い。この場合には、−１０領域の下流
に位置させるべきラクトースオペロンのプロモータ一部
分を一１Ｏ領域と既に結合したものとして取得すること
が可能である。−３５領域は、前述の耐熱性中性プロテ
アーゼ、ｎｐｒＭのプロモーター中に天然に見出だせる
領域である。従って、当該プロモーターから調製しても
良い。更に、−３５領域の上流に位置させるべき「ＡＡ
ＡＡ」からなる塩基配列を有する領域は、バチルス・ス
テアロサーモフィルスの耐熱性中性プロテアーゼｎｐｒ
Ｍ（特願昭６２−２５３７４９号）のプロモーター中に
天然に見出だすことができる。従ってこの配列も、当該
プロモーターから調製することもできる。また、−１０
領域の下流側に位置させるべきラクトースオペロンのオ
ペレーター部分については、前述の通りである。
第２のハイブリッドプロモーター−オペレーターは、第
１のものと同様に各領域を別々に調製し後にこれらを結
合して調製することもできるが例えばｎｐｒＭのプロモ
ーターについて部位特異的変異導入法等の方法により変
異を導入して調製することもできる。
以上のような本発明の第２のハイブリッドプロモーター
・オペレーターにおけるプロモーター部分として例えば
次式５で示されるものが例示できる。
式　　５ ％式％ 二こで、式５におけるプロモーター領域を下線を施して
示す。また、本発明の第２のハイブリッドプロモーター
・オペレーターにおけるオペレーター部分として例えば
次式６で示されるものが例示できる。
式　　６ ％式％ 特に式６で示されるオペレーター部分は天然のラクトー
スオペレーターの塩基配列の全部を含むものではなく、
その機能的部分（下線部）を含むものである。
以上説明してきた本発明の第２のハイブリッドプロモー
ター・オペレーターとして、例えば式７に示されるもの
が例示できる。
式　　７ ％式％ （なお、式中の下線部は本発明の各領域を示すものであ
る） 本発明の第２のハイブリッドプロモーター・オペレータ
ーにおいては、その−３５領域の上流に位置する「ＡＡ
ＡＡ」からなる塩基配列を含む領域が更に「ＡＡＡＡＴ
ＧＴＧＡＡＡ」からなる塩基配列をその上流側に含んで
いても良い。この付加的な領域もｎｐｒＭプロモーター
に由来するものである。この、ｒＡＡＡＡＴＧＴＣ；Ａ
ＡＡＪなる領域は、「ＡＡＡＡ」からなる塩基配列を含
む領域の上流に位置していれば制限はなく、例え距離を
おいて当該領域の上流に位置していても良い。このよう
な、「ＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡ」からなる塩基配列が付
加された本発明の第２のハイブリッドプロモーター・オ
ペレーターとしては、次式（で示されるものが例示でき
る。
式　　８ ５−−ＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡ３−−ＴＴＴＴ
ＡＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡ
Ａ ＡＡＡＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＡＴＧ ＡＡＡＡＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＣ ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ ＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧ ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡ−３− ＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴ−５− 最後に本発明の第３のハイブリッドブロモター・オペレ
ーターについて説明する。本発明の第３のハイブリッド
プロモーター・オペレーターは、その−３５領域の上流
（５′）側にｒＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＪから
なる塩基配列を有する領域を、−３５領域としてｒＴＴ
ＧＡｃＡＪからなる塩基配列を有する領域を、−１０領
域としてｒＴＡＴＡＡＴＧｊからなる塩基配列を有する
領域を、−１０領域の下流（３−）側にラクトースオペ
ロンのオペレーター部分を存するものである。以上の領
域は、本発明で規定された塩基配列のみからなる必要は
なく、その配列の両側に他の塩基か付加されていても良
い。これらそれぞれの領域間の距離は前述した第１のハ
イブリッドプロモーター・オペレーターと同様である。
以上の領域は、人工的に合成することにより簡単に調製
可能な断片であり、その調製方法に特別な制限はない。
しかし−１０領域は、大腸菌におけるコンセンサス配列
であり、天然のラクトースオペロンにも見出だされるも
のである。従って、ラクトースプロモーターの一１０項
域を利用しても良い。この場合には、−１０領域の下流
に位置させるべきラクトースオペロンのプロモータ一部
分を一１０領域と既に結合したものとして取得すること
が可能である。−３５領域も、大腸菌におけるコンセン
サス領域である。従って、例えばトリプトファンプロモ
ーター等の公知のプロモーターから調製しても良い。−
３５領域の上流に位置させるべきｒＡＡＡＡＴＧＴＧＡ
ＡＡＡＡＡＡＪからなる塩基配列を有する領域は、前述
のバチルス・ステアロサーモフィルスの耐熱性中性プロ
テアーゼｎｐｒＭのプロモーター中に天然に見出だすこ
とかできる。従ってこの配列も、当該プロモーターから
調製することもできる。また、−１０領域の下流側に位
置させるべきラクトースオペロンのオペレーター部分に
ついては、前述の通りである。
第３のハイブリッドプロモーター・オペレーターは、第
１のものと同様に各領域を別々に調製し後にこれらを結
合してＲｆｆすることもできるが、例えばｎｐｒＭのプ
ロモーターについて部位特異的変異導入法等の方法によ
り変異を導入して調製することもできる。
以上のような本発明の第３のハイブリッドブ１ニアモー
ターーオペレーターにおけるプロモーター部分として例
えば次式９で示されるものが例示できる。
式　　９ ％式％ ここで、式９におけるプロモーター領域を下線を施して
示す。また、本発明の第３のハイブリッドプロモーター
・オペレーターにおけるオペレータ部分として例えば次
式１ｏで示されるものが例示できる。
式　　１０ ％式％ ＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡ−３− ＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴ−５ 特に式１０で示されるオペレーター部分は天然のラクト
ースオペレーターの塩基配列の全部を含むものではなく
、その機能的部分（下線部）を含むものである。
以上説明してきた本発明の第３のハイブリッドプロモー
ター・オペレーターとして、例えば式１１に示されるも
のが例示できる。
式　　１１ ％式％ （本発明でいう領域について、 下線を施して示す） 実施例１ プラスミドｐＫＫｌを図１のようにして構築した。まず
、下記に示す４種類のＤＮＡ配列を常法に従いＤＮＡ合
成機（アプライド・バイオシステムズ社製モデル３８０
Ｂ　　ＤＮＡシンセサイザー）を使用して化学的に合成
し、精製した。
■ （５′側） ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＴ
ＴＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＴ （３−側） （５′側） ＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡ
ＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧ （３−側） ■ （５′側） ＴＴＣＴＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡ
ＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡ （３−側） ■ （５′側） ＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡ
ＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＡ （３′側） 合成りＮＡを各々１．　８ｕｇずつ１０ｍＭトリス−塩
酸、ｐＨ７，５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、１ｍＭＡＴＰを含む反応液１０μｍ中
に溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株
）より購入）１単位を加え、３７℃で１時間反応させ５
′末端をリン酸化した。反応後、フェノール／クロロホ
ルム抽出を行い、更にエタノール沈澱を行ってＤＮＡを
回収し、これを１０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス
−塩酸、ｐＨ８，０，０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に溶解
した。次に、リン酸化した■及び■ＤＮＡを各々１，８
μｇずつ１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８，０，０，１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣ１溶液　２０μｍに
混合し、６５℃で５分間加熱し、室温までゆっくり冷却
してアニーリングした。これを以後ＤＮＡ溶液Ａとする
。
一方、プラスミドｐＫＫ２３２　８（クロラムフェニコ
ール耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ）をコードするが、プロモーターを欠失し
たプロモーター検索ベクタファルマシア社、ｃａｔ、Ｎ
ｏ、２７−４９２５−０１）のＤＮＡ　２　ｕ　ｇを１
０ｍＭトリスー塩酸、ｐＨ７，５，１００ｍＭＮａＣ１
，１ｍＭジチオスレイトールを含む反応液中で制限酵素
旦ｉｎｄｍ、５ａｉｌ各々２ユニツトにより３７℃で２
時間消化した。反応後、フェノール／クロロホルムで抽
出しエタノール沈殿を行って回収したＤＮＡは１０μｍ
のＴＥ緩衝液に溶解した。これを以後ＤＮＡ溶液Ｂとす
る。
ＤＮＡ溶液Ａ１０μｍとＤＮＡ溶液Ｂを緩衝液（６６ｍ
Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７，６，５ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　２
．５　ｍＭジチオスレイトール、０．６ｍＭＡＴＰ）５
０μｌ中で混合し、５０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ
を加えて１６℃で１２時間反応させた。この反応液１０
μｍを用いて常法に従い大腸菌ＪＭＩ　Ｏ９を形質転換
した後、クロラムフェニコールを３０μｇ　／　ｍ　ｌ
の濃度を含ムＬＢ培地に接種し、３７°Ｃて一部振当培
養した。得られた培養菌体から、アルカリ溶液法によっ
てプラスミドを回収した。
実施例２ （１）新規発現調節ＤＮＡ配列によるプロウロキナーゼ
遺伝子の発現 １）ｐＵＫΔｔａｃの作成 プラスミドｐＵＫＯ２ｐｍ４　（ヒト変異型プロウロキ
ナーゼの発現プラスミドであり、該プラスミドで形質転
換された大腸菌ＫＹ１４３６株は受託番号０５Ｍ４２５
７号として寄託機関であるドイツＤＳＭに寄託されてい
る。詳細についてはは特開平１−１８７０８７号を参照
のこと）１μｇを緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ
７，６゜５ｍＭＭｇＣ１２，５０ｍＭＮａＣ１）５０μ
ｍに溶解し、１ユニツトのＤｒａＩ、及びＡａｔＩＩを
加えて３７℃で２時間反応させた。この反応液をクロロ
ホルム処理、エタノール沈殿してＤＮＡを回収した。
一方、７４塩基、７３塩基から成る一本鎖ＤＮＡを合成
し、常法に従ってアニーリングさせ、下記の二本鎖ＤＮ
Ａを調製した。
（５′側） ＧＴＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ ＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＧ（３゛側） ＡＣＴＴＴＣＧＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＡ
ＡＡＧＣＧＧＴＧＣＡＡＣＣＧＣＣＴＴＴＣＡＡＡＣＣ
ＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＧＴＴＴＧＧＡＣＴ
ＧＴＴＧＴＡＣＴＴＧＡＴＡ（３−側） ＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＧＴ ＣＴＴＣＴＣＣＡＣ （５″側） アニーリングは、２種類の合成りＮＡ　１μｇずつを反
応液（６６ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７゜６．５ｍＭＭｇ
ＣＩ２，１００ｍＭＮａＣ１）１０μｍ中にて６５℃で
５分間加温した後、室温までゆっくり冷却することによ
って行った。
このようにして調製した２本鎖合成りＮＡと、前述のベ
クターＤＮＡ断片とを緩衝液（６６ｍＭトリス−塩酸、
ｐＨ７，６，５ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭジチオスレイト
ール、０．６ｍＭＡＴＰ）２０μｌ中で混合し、Ｔ４リ
ガーゼ５０ユニットを加えて１６℃で１２時間反応させ
た。この反応液５μｍを用いて常法により大腸菌ＪＭ１
０９を形質転換し、得られた形質転換株よりアルカリ溶
菌法によりプラスミドを単離し、制限酵素の消化パター
ンからｐＵＫΔｔａｃが得られたことを確認した（図２
）。
（２）　　ｐＵＫＯ２Ｂｇ−ｐｍ４の作成実施例１で作
成したプラスミドｐＫＫ１　５０ｕｇを緩衝液（１０ｍ
Ｍ）リス−塩酸、ｐＨ７゜６．５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．
１００ｍＭ　　ＮａＣ１）２０μｌ中に溶解し、５ａｉ
ｌ及びＨｉｎｄｎｌをそれぞれ５ユニツトずつ加えて３
７℃で２時間消化し、生じた約６．２ｋｂのＤＮＡ断片
をアガロース電気泳動によって単離した。
以上の操作により得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し
、緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，６、５ｍＭ
　　　ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ　　　ＮａＣ１）２０μ
Ｉ中でＴ４ＤＮＡリガーゼ５０ユニットを加えて１６℃
で１２時間反応させた。この反応液５μｍを用い常法に
より大腸菌ＪＭＩ　Ｏ９を形質転換した。得られた形質
転換株からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを単
離しプラスミドｐＵＫＯ２ＢＢ−ｐｍ４が得られたこと
を確認した（図２）。
（３）大腸菌によるヒト変異型プロウロキナーゼの発現
及び活性の測定 プラスミドｐＵＫＯ２−ｐｍ４及びｐＵＫ０２ＢＢ−ｐ
ｍ４を用いて大腸菌ＫＹ１４３Ｂ株を常法により形質転
換し、得られた形質転換株をＭ９ｍＥ培地（Ｍ９最小培
地に０．１％イーストエキス、０．２％グリセロール、
２μｇ／ｍｌのチアミンを添加したもの）中、３０℃で
振とう培養した。対数増殖期において、最終濃度が０．
５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加しさらに４時間培養
を続けた。
１００、Ｄユニット相当の培養菌体を遠心により回収し
、１００ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８゜０１ｍｌに懸濁し
た。この破砕液を遠心し上演を除き沈殿を１　ｍ　ｌの
５０ｍＭ０ｍＭトリスルｐＨ８，０，４Ｍグアニジン塩
酸を含む溶液に懸濁し、６０℃で６０分間放置すること
により可溶化した。この可溶化液に３ｍｌの５０ｍＭｔ
−リス−塩酸、ｐＨ８，０，０，２ｍＭグルタチオン（
還元型）及び５ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む溶液を加え、室
温で１６時間放置して活性を復元せしめた。復元溶液５
μｍに１００ｍＭ　　トリス−塩酸、ｐＨ８、Ｏ，０，
０１％　　ト　　リ　　ト　　ン　Ｘ−１００及　び　
５　８ｇのプラスミンを含む溶液９５μｍを加え３７℃
で３０分放置してプロウロキナーゼを活性化した。
２５μｇの大豆トリブシインヒビターを加えて反応を停
止した後、０．２ｍＭＳ−２４４４（第−薬品型）　　
５０ｍＭ　　）リス−塩酸、ｐＨｇ、ｏ。
０．０１％トリトンＸ−１００を７００μｍを加えた。
３７℃、３０分間反応させた後、１００μｍの酢酸を加
えて反応を停止した。４０５ｎｍの吸光度を測定し、標
準ウロキナーゼの測定値との比例計算により試料の活性
値を算出した。その結果、表１に示したように、今回調
製したプロモーターを有するプラスミドｐＵＫＯ２１１
３８−ｐｍ４を保持する大腸菌は、ヒト変異型プロウロ
キナーゼを高発現し得ることが示された。なお、表１に
では、ウロキナーゼ活性を国際単位で示した。
表１ プラスミド　　　　　　　ウロキナーゼ活性ｐＵＫΔｔ
ａｃ　　　　　　　ＯＵ／ｇ湿潤細胞ｐＵＫＯ２−ｐｍ
４　　　　２０万Ｕ／ｇ湿潤細胞ｐＵＫ０２Ｂ８−ｐｍ
４　　３０万Ｕ／ｇ湿潤細胞実施例３ （１）　枯草菌中で働くプロモーター検索ベクターの構
築 特願昭６３−１９２３８１１１号記載のｐＴＺ２３２（
ｎｐｒＭ）（耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子をコードし
ている）を５ａｌＩ、及びＰｖｕ　Ｉを用いて実施例１
で示した方法により消化した。
次に下記に示す２種のＤＮＡ配列を常法に従い化学合成
し、精製した。
■ （５′側） ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡ
ＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＣ，ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧ
ＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＣＧＡＴ （３′側） ■ （５′側） ＧＴＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴ
ＣＡＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴ
ＴＡＡＣＴＴＧ （３′側） 上記ＤＮＡ■及び■を実施例１と同様の方法でアニーリ
ングさせ、これとＳａ　１１．及びＰｖｕｌで消化した
ｐ”ｒｚ　２３２を混合し連結して枯草菌中で働くプロ
モーター検索ベクター（ｐ”ｒｚ２３２−１を調製した
；図３）。
（２）（１）で得たｐＴＺ２３２−１を実施例１に従い
Ｓ　ａ　１１　ｓ　Ｈｉｎ　ｄ　ｍで部分消化し、実施
例１で合成したプロモーターと混合して連結した。
このプラスミド（ｐＴＺ２３２−１８）（図３）を用い
特願昭６３−１９２３８８号に記載されたＢａｃｉｌｌ
ｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓＭＴ−２を形質転換させ、Ｌ
Ｃ培地（Ｌ培地＋１％カゼイン）上でハローを形成する
株を選択した。
（３）（２）で得た形質転換株をＬ培地＋カナマイシン
（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、３７℃で２４時間培養し、
特願昭６３−１９２３８８号に記載されたのプロテアー
ゼ活性測定法に従い活性を測定した。その結果、下記表
２に示すように、枯草菌中でも十分なプロモーター活性
を有することが確認された。
表２ プラスミド　　　　　プロテアーゼ活性（Ｕ／ｍ１）ｐ
ＴＺ２３２−１　　　　　　　１５ ｐＴＺ２３２−１８　　　　４０００ なお、プロテアーゼ活性は、１分間に遊離するチロシン
１μｇをＩＵと定義する。
実施例４ 実施例１で示した４種類の合成りＮＡ配列に代えて、下
記の４種類の合成りＮＡ配列を用いた以外は実施例１と
同様の操作を行い、本発明のプロモーター配列を含むプ
ラスミドｐＫＫ２を構築した。
■ （５′側） ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＣ
ＡＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＴ （３′側） ■ （５′側） ＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＣＡＡ
ＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧ （３′側） ■ （５′側） ＴＴＣＴＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡ
ＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡ （３−側） ［相］ （５′側） ＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡ
ＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＡ （３′側） 実施例５ （１）プラスミドｐＫＫ１を、実施例４−　（１）で得
られたプラスミドｐＫＫ２に代えたこと以外は実施例２
−　（１）、（２）と同様な操作を行い、プラスミドｐ
ＵＫ０２Ｂ９−ｐｍ４を構築した。
（２）得られ（２）得られたプラスミドｐＵＫ０２Ｂ９
−ｐｍ４で実施例２−　（３）と同様にして大腸菌ＫＹ
１４３６を形質転換し、ヒト変異型プロウロキナーゼを
発現させ、その活性を測定した。
その結果、プラスミドｐＵＫ０２Ｂ９−ｐｍ４で形質転
換された大腸菌か与えるウロキナーゼ活性は３０万Ｕ／
ｇ−湿潤細胞であり、式［１１］で示されるプロモータ
ーを有するプラスミドｐ！ＪＫＯ２Ｂ９−ｐｍ４で形質
転換された大腸菌は、ヒト変異型プロウロキナーゼを高
発現し得ることが示された。
実施例６ （１）実施例１で合成したプロモーター配列に代えて実
施例４で合成したプロモーター配列を用いた以外は実施
例３−（１）、（２）と同様の操作を行い、プラスミド
ｐＴＺ２３２−１９を構築した。
（２）得られたプラスミドｐＴＺ２３２−１９を用い実
施例３−　（３）と同様な操作を行い、プロテアーゼ活
性を調べたところ、４０００Ｕ／ｍｌであった。このこ
とから、式［ｎ］で示される本発明のプロモーター配列
は枯草菌中でも十分なプロモーター活性を有することが
確認された。
実施例７ 実施例１で示した４種類の合成りＮＡ配列に代えて、下
記の４種類の合成りＮＡ配列を用いたことを除き、実施
例１と同様の操作を行い、上記式ＩＩＩ］で示される本
発明のプロモーター配列を含むプラスミドｐＫＫ３を構
築した。
（５′側） ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣ
ＣＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＴ （３−側） （５′側） ＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡ
ＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧ （３′側） （５′側） ＴＴＣＴＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡ
ＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡ （３−側） （５′側） ＡＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡ
ＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＡ （３°側） 実施例８ ＜１）プラスミドｐＫＫＩを、実施例４−　（１）で得
られたプラスミドｐＫＫ３に代えたこと以外は実施例２
−　（１）、（２）と同様の操作を行い、プラスミドｐ
ＵＫ０２ＢＩ　Ｑ−ｐｍ４を構築した。
（２）得られたプラスミドｐＵＫ０２Ｂ１０−ｐｍ４で
実施例２−　（３）と同様にして大腸菌ＫＹ１４３６を
形質転換し、ヒト変異型プロウロキナーゼを発現させ、
その活性を測定した。その結果、プラスミドｐＵＫ０２
Ｂ１０−ｐｍ４で形質転換された大腸菌が与えるウロキ
ナーゼ活性は２５万Ｕ／ｇ−湿潤細胞であり、本発明の
プロモーター・オペレーター配列を有するプラスミドｐ
ＵＫ０２Ｂ１０−ｐｍ４で形質転換された大腸菌は、ヒ
ト変異型プロウロキナーゼを高発現し得ることが示され
た。
実施例９ （１）実施例１で合成したプロモーター配列に代えて実
施例４で合成したプロモーター配列を用いた以外は実施
例３−（１）、（２）と同様な操作を行い、プラスミド
ｐＴＺ２３２−１１０を構築した。
（２）得られたプラスミドｐＴＺ２３２−１１０を用い
実施例３−（３）と同様な操作を行い、プロテアーゼ活
性を調べたところ、６０００Ｕ／ｍ１てあった。このこ
とから、本発明のプロモーター・オペレーター配列は枯
草菌中でも十分なプロモーター活性を有することが確認
された。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のプロモーター配列を有するプラスミド
ｐＫＫ１を構築するための図である。 図２は、プロウロキナーゼを発現させるためのｐＵＫΔ
ｔａｃ及びｐＵＫｏ　２Ｂ　１　ｐｒｎ４を構築するた
めの工程を説明するための図である。 図３は枯草菌中で働くプロモーター検索ベクターｐＴＺ
２３２−１及びそれを用いて作成したｐＴ　Ｚ　２３２
−１．８を構築する工程を説明するための図である。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）少なくとも次の各領域からなるハイブリッドプロ
    モーター・オペレーター。 ［１］「ＡＡＡＡＡＡＡ」からなる塩基配列を有する、
    後記−３５領域の上流（５′）側に位置する領域 ［２］「ＴＴＧＣＴＴ」からなる塩基配列を有する−３
    ５領域 ［３］「ＴＡＴＡＡＴＧ」からなる塩基配列を有する−
    １０領域 ［４］前記−１０領域の下流（３′）側に位置するラク
    トースオペロンのオペレーター部分を有する領域
  2. （２）前記［１］〜［３］の領域により構成されるプロ
    モーター領域が次式で示されるものであることを特徴と
    する請求項第１項記載のハイブリッドプロモーター・オ
    ペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は通常の遺伝学で使用するものと
    同一の意味である）
  3. （３）前記［４］の領域が次式で示される塩基配列を有
    するものであることを特徴とする請求項第１項記載のハ
    イブリッドプロモーター・オペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は前記に同じ）
  4. （４）次式で示される塩基配列を有することを特徴とす
    る請求項第１〜３項いずれかに記載のハイブリッドプロ
    モーター・オペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は前記に同じ）
  5. （５）−３５領域の上流（５′）側に位置する「ＡＡＡ
    ＡＡＡＡ」からなる塩基配列を含む領域の上流（５′）
    側に、更に「ＡＡＡＡＴＧＴＧ」からなる塩基配列が付
    加されていることを特徴とする請求項第１〜４いずれか
    の項に記載のハイブリッドプロモーター・オペレーター
    。
  6. （６）次式で示される塩基配列を有することを特徴とす
    る請求項第５項記載のハイブリッドプロモーター・オペ
    レーター。 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は前記と同じ）
  7. （７）少なくとも次の各領域からなるハイブリッドプロ
    モーター・オペレーター。 ［１］「ＡＡＡＡ」からなる塩基配列を有する、後記−
    ３５領域の上流（５′）側に位置する領域［２］「ＴＴ
    ＴＴＣＣ」からなる塩基配列を有する−３５領域 ［３］「ＴＡＴＡＡＴＧ」からなる塩基配列を有する−
    １０領域 ［４］前記−１０領域の下流（３′）側に位置するラク
    トースオペロンのオペレーター部分を有する領域
  8. （８）前記［１］〜［３］の領域により構成されるプロ
    モーター領域が次式で示されるものであることを特徴と
    する請求項第７項記載のハイブリッドプロモーター・オ
    ペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は通常の遺伝学で使用するものと
    同一の意味である）
  9. （９）前記［４］の領域が次式で示される塩基配列を有
    するものであることを特徴とする請求項第７項記載のハ
    イブリッドプロモーター・オペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は前記に同じ）
  10. （１０）次式で示される塩基配列を有することを特徴と
    する請求項第７〜９項いずれかに記載のハイブリッドプ
    ロモーター・オペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は前記に同じ）
  11. （１１）−３５領域の上流（５′）側に位置する「ＡＡ
    ＡＡ」からなる塩基配列を含む領域の上流（５′）側に
    、更に「ＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡ」からなる塩基配列が
    付加されていることを特徴とする請求項第７〜１０いず
    れかの項に記載のハイブリッドプロモーター・オペレー
    ター。
  12. （１２）次式で示される塩基配列を有することを特徴と
    する請求項第１１項記載のハイブリッドプロモーター・
    オペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は前記と同じ）
  13. （１３）少なくとも次の各領域からなるハイブリッドプ
    ロモーター・オペレーター。 ［１］「ＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡ」からなる塩
    基配列を有する、後記−３５領域の上流 （５′）側に位置する領域 ［２］「ＴＴＧＡＣＡ」からなる塩基配列を有する−３
    ５領域 ［３］「ＴＡＴＡＡＴＧ」からなる塩基配列を有する−
    １０領域 ［４］前記−１０領域の下流（３′）側に位置するラク
    トースオペロンのオペレーター部分を有する領域
  14. （１４）前記［１］〜［３］の領域により構成されるプ
    ロモーター領域が次式で示されるものであることを特徴
    とする請求項第１３項記載のハイブリッドプロモーター
    ・オペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は通常の遺伝学で使用するものと
    同一の意味である）
  15. （１５）前記４の領域が次式で示される塩基配列を有す
    るものであることを特徴とする請求項第１３項記載のハ
    イブリッドプロモーター・オペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は前記に同じ）
  16. （１６）次式で示される塩基配列を有することを特徴と
    する請求項第１３〜１５項いずれかに記載のハイブリッ
    ドプロモーター・オペレーター。 式 【遺伝子配列があります。】 （ただし、式中の記号は前記と同じ）
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