DE69016630T2

DE69016630T2 - DNS mit der genetischen Information der Phospholipase D und seine Verwendung.

Info

Publication number: DE69016630T2
Application number: DE1990616630
Authority: DE
Inventors: Teruhiko Beppu; Sueharu Horinouchi; Shigeyuki Imamura; Junzo Mizoguchi; Masayasu Takahara; Issei Yoshioka
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1989-12-15
Filing date: 1990-12-11
Publication date: 1995-09-07
Anticipated expiration: 2010-12-12
Also published as: EP0435725B1; JPH03187382A; EP0435725A1; DE69016630D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Phospholipase D-Gen und ein Verfahren zur Herstellung einer Phospholipase D unter Verwendung dieses Gens.
Phospholipase D (Phosphatidylcholin-Phosphatidohydrolase: im folgenden PLD bezeichnet) ist ein Enzym, das z.B. auf Lecithin (Phosphatidylcholin) als Phospholipid wirkt und die Esterbindung der Phosphorsäure und des Cholinteils spaltet und so Phosphatidsäure und Cholin freisetzt. Bekanntermaßen kommt es in den Blättern von Kohl, Spinat. Zwiebeln. Kartoffeln, Salat usw., den Wurzeln von Karotten, Zuckerrüben. Rüben usw. , dem Pflanzengewebe von Gerstenkeimen, Baumwol Isamen, Bohnensprossen von grünen Erbsen usw. (vgl. KOSO HANDBOOK. Seiten 451 - 452. 1982, Asakura shobo) oder in Mikroorganismen der Gattung Streptomyces (vgl. Japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 52-39918 und 60-4716 (US 4,135,980)) oder der Gattung Nocardiopsis (vgl. Japanische Patentveröffentlichung Nr. 63-62195) vor, und die Reinigung der Phospholipase D. die aus dem Kulturmedium von Streptomyces chromofuscus extrahiert worden ist, ist in J. Biochem., 85, 79 - 95 (1979) beschrieben.
Bekanntermaßen ist Phospholipase D ein Enzym, das als Mittel zur Bestimmung von Blutphospholipiden und zur Herstellung von Derivaten durch Hydrolyse eines Phospholipids oder Basenaustauschreaktion unter Ausnützung der Reaktion von Phospholipase (vgl. die Japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 63- 36790 und 61-236793) verwendet wird.
Obwohl, wie vorstehend beschrieben, verschiedene Phospholipase D produzierende Mikroorganismen beschrieben worden sind. unterscheidet sich die Phospholipase D, die von diesen Phospholipase D produzierenden Mikroorganismen hergestellt wird, von der anderer Mikroorganismen hinsichtlich der Spezifität gegenüber einem Substrat, und die Aminosäuresequenzen der Phospholipase D sind zweifelhaft, nicht zu sprechen von der Vorhersage der Aminosäuresequenzen von Phospholipase D, die von einzelnen Phospholipase D produzierenden Mikroorganismen hergestellt worden ist. Wegen der geringen Produktionseffizienz an Phospholipase D, die insbesondere durch Extrahieren aus einem Kulturmedium von S. chromofuscus und deren Reinigung erhalten worden ist, bestand ein Bedürfnis, ein Verfahren zur effizienten Herstellung einer Phospholipase D in hoher Reinheit und hoher Qualität zu finden.
Ebenso wurden bis jetzt weder die Primärstruktur des Polypeptids, aus dem Phospholipase D besteht, noch die Basensequenz der DNA beschrieben, die für die Aminosäuresequenz des Enzyms codiert.
Daher bestand eine Nachfrage. die Primärstruktur des Polypeptids, aus dem Phospholipase D aufgebaut ist, die Basensequenz der DNA, die für die Aminosäuresequenz des Enzyms codiert, zu bestimmen, und das Enzym mittels Gentechnologie herzustellen.
Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz des Polypeptids, aus dem Phospholipase D besteht;
Fig. 2 zeigt die DNA, die für die Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert. aus dem Phospholipase D besteht;
Fig. 3 zeigt die Gesamtbasensequenz der DNA eines Potrions, das von Actinomycetes des Plasmids pcPLD1 stammt;
Fig. 4 zeigt die Karte des Restriktionsenzyms des Escherichia coli-Plasmids pcPLD1;
Fig. 5 zeigt die Karte des Restriktionsenzyms des Actinomyceten-Plasmids pcPLD1;
Fig. 6 zeigt die Restriktionsenzymstelle des Phospholipase D- Gens, wobei
die Signalsequenz bedeutet; und
Fig. 7 zeigt den Aufbau eines Plasmids, wobei
das Phospholipase D-Gen bedeutet.
Die vorliegenden Erfinder haben umfassende Untersuchungen der vorstehend genannten Probleme durchgeführt. Im Ergebnis haben sie das Gen aus einem Mikroorganismus, der zu Streptomyces chromofuscus gehört, isoliert und gereinigt, das für die Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, aus dem Phospholipase D aufgebaut ist, sie haben die Primärstruktur des Polypeptids bestimmt, aus dem das Enzym aufgebaut ist, und die Basensequenz der DNA bestimmt, die für die Aminosäuresequenz des Enzyms codiert.
Weiter haben sie ein ausgezeichnetes Verfahren zur industriellen Herstellung der Phospholipase D entwickelt, gemäß dem das Phospholipase D-Gen in einen Zufallsvektor eingeführt wird, um einen Transformanten aus einem Wirtsmikroorganismus mit einem Wirt-Vektorsystem zu erhalten, der Transformant kultiviert wird, um die Information des Phospholipase D-Gens zu exprimieren und die Phospholipase D in der Kultur identifiziert wird. So wurde die vorliegende Erfindung getätigt. Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen erläutert.
In der erf indungsgemäßen DNA, die für die Aminosäuresequenz codiert, die durch Fig. 1 dargestellt ist, können der N-Terminus und der C-Terminus der durch Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz einen Aminosäurebestandteil oder einen Polypeptidbestandteil enthalten. und es können ein oder mehrere Aminosäurebestandteile in der Position oberhalb von Ala der N-Terminus vorhanden sein. Der Aminosäurebestandteil kann ein Initiationscodon oder ein Signalpeptid sein. Ein oder mehrere Aminosäurebestandteile können in Position unterhalb von Val des C-Terminus vorhanden sein.
Weiter kann die Aminosäuresequenz, aus der Phospholipase D besteht, ein Teil der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz sein, die dieselbe Wirkung wie die Expression der Enzymaktivität durch ein Polypeptid hat, das die durch Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz hat.
Die neuartige DNA nach der vorliegenden Erfindung, die für die durch Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, muß lediglich eine DNA sein, die jedes Codon unter einer Reihe von Codons enthält. die den jeweiligen Aminosäuren in der Aminosäuresequenz einschließlich dem Aminosäurebestandteil oder Polypeptidbestandteil in der N-Terminus- oder der C-Terminus-Position entsprechen
Weiter kann die DNA, die für die Aminosäuresequenz codiert, aus der die erfindungsgemäße Phospholipase D besteht, eine DNA sein, die für einen Teil der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 codiert, der dieselbe Wirkung hat wie die Expression der Enzymaktivität durch ein Polypeptid, das die durch Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz enthält.
Als ein typisches Beispiel für die vorstehend erläuterte DNA kann eine DNA genannt werden, die vom 5'-Terminus aus gesehen die durch Fig. 2 dargestellte Basensequenz enthält. Die DNA kann ein oder mehrere Codons enthalten, die für Aminosäuren in einer Position oberhalb des 5'-Terminus codieren und es müssen nur Codons sein, die von TAA, TAG und TGA verschieden sind. Weiter kann eine DNA genannt werden, die vorzugsweise ATG, GTG, Initiationscodons, die von den zwei oder Codons, die einem Signalpeptid entsprechen, verschieden sind, enthält. Die DNA kann in der Position unterhalb von GTG als 3'- Terminus ein oder mehrere Codons enthalten, die für Aminosäuren codieren, oder ein translationsbeendigendes Codon enthalten. Wenn die DNA ein oder mehrere Codons enthält, die für Aminosäuren in der 3'-Terminus-Position codieren, enthält sie vorzugsweise ein translationsbeendigendes Codon an dem 3'- Terminus des Codons. das für die Aminosäuren codiert.
Die DNA, die für die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, oder die durch Fig. 2 dargestellte DNA codiert, kann beispielsweise durch Isolierung und Reinigung der DNA eines Mikroorganismuses als Donor für ein Phospholipase D-Gen, das in dem Mikroorganismus Phospholipase D erzeugt, Verbinden der DNA, die mittels Ultraschall, einem Restriktionsenzym etc. gespalten worden ist, und eines Expressionsvektors, der linear gespalten worden ist, mit dem stumpfen Ende oder cohäsiven Ende dieser DNA, um so einen Zyklus zu bilden, übertragen des rekombinanten DNA-Vektors, der so erhalten worden ist, in einen replizierbaren Wirts-Mikroorganismus, Kultivieren des Mikroorganismuses, der den rekombinanten DNA-Vektor beibehält, der durch Mustern (Screenen) anhand von Merkmalen des Markers des Vektors und der Aktivität von Phospholipase D erhalten worden ist, Isolierung und Reinigung des rekombinanten DNA-Vektors aus den kultivierten Mikroorganismuszellen und Ernten der DNA als das Phospholipase D-Gen aus dem rekombinanten DNA-Vektor hergestellt werden.
Als DNA-Donor-Mikroorganismen können Actinomyceten, vorzugsweise der S. chromofuscus-Stamm A-0848 (FERM P-3519, BP-361) oder dessen erneut hinterlegter S. chromofuscus-Stamm A-0848 (FERM BP-2682) verwendet werden. Die bakteriologischen Eigenschaften, Kulturvorrichtung und Reinigungsvorrichtung für den Bakterienstamm sind in der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 60 - 4716 beschrieben (Spalte 29, 3. Zeile von unten auf Seite 15 bis Spalte 34, 4. Zeile, auf Seite 17).
Die DNA, die aus dem Mikroorganismus als Gen-Donor stammt, wird gemäß dem folgenden Verfahren geerntet.
Beispielsweise wird der Donor-Mikroorganismus, der vorstehend beschrieben worden ist, in einem flüssigen Kulturmedium in einem Fermentorgefäß etwa 1 - 3 Tage kultiviert, und die erhaltene Kultur wird zentrifugiert, um den Mikroorganismus zu gewinnen, der dann lysiert wird, um ein Lysat herzustellen, das das Phospholipase D-Gen enthält. Bei dem Lyseverfahren wird der Mikroorganismus mit einem zellwandauflösenden Enzym wie Lysozym oder β-Glucanase, gegebenenfalls mit anderen Enzymen wie Protease usw. oder oberflächenaktiven Mitteln, wie Natriumlaurylsulfat usw. behandelt. Das Gefrier-/Tauverfahren oder die französische Preßbehandlung können als physikalische, die Zellwand zerstörende Verfahren (vgl. Japanische Patentoffenlegung Nr. 63 - 185371) zusammen mit dem zuvorgenannten Lyseverfahren verwendet werden.
Die Isolierung oder Reinigung der DNA aus dem Lysat, das so erhalten worden ist, kann auf gewöhnliche Weise durch geeignete Kombination von Verfahren wie der Deproteinierungsbehandlung durch Phenolextraktion, der Proteasebehandlung, der Ribonukleasebehandlung, der Alkoholausfällung oder Zentrifugation durchgeführt werden.
Obwohl die so isolierte und gereinigte Mikroorganismus-DNA beispielsweise durch Ultraschallbehandlung oder mit einem Restriktionsenzym gespalten werden kann, ist die Behandlung mit einem Restriktionsenzym, insbesondere einem Restriktionsenzym vom Typ II wie Sal I, Sac I, Kpn I, Xho I oder Mlu I, die auf spezifische Nukleotidsequenzen einwirken, für eine leichte Verknüpfung des so erhaltenen DNA-Fragments und eines Vektors bevorzugt.
Als Vektor kann ein Vektor verwendet werden, der als Vektor für genetische Rekombination aus einem Phagen konstruiert worden ist, der autonom in einem Wirtsorganismus oder einem Plasmid vermehrbar ist.
Als Phagenvektoren können λgt, λC, λgt oder λB verwendet werden, wenn als Wirtsorganismus Escherichia coli verwendet wird.
Als Plasmidvektoren können Plasmide wie pBR 322, pBR 325, pACYC 184, pUC 12, pUC 13, pUC 18, pUC 19, pUC 118, pIN I usw. für E. coli verwendet werden. Ebenso können Plamide wie pTUB, pTUB 285 usw. für Bacillus subtilis, ein Plasmid pAM 82 für Saccharomyces cerivisiae, Plasmide wie pSEV 1 (Mol. Gen. Genet. (1987), 210, 468 - 475 (FERM BP-2684)), pIJ 680 usw. für Streptomyces lividans verwendet werden. Außerdem kann ein Schaukelvektor verwendet werden, der sich autonom in zwei oder mehreren Wirtsmikroorganismen wie E. coli und S. lividans vermehren kann.
Diese Vektoren werden vorzugsweise mit demselben Restriktionsenzym gespalten wie dem, das für die Spaltung der Mikroorganismus-DNA als Donor für das Phospholipase D-Gen verwendet wird, um Vektorfragmente zu erhalten.
Als Verfahren zur Verknüpfung des Mikroorganismus-DNA-Fragments und des Vektor-Fragments kann jedes beliebige Verfahren verwendet werden. bei dem eine bekannte DNA-Ligase verwendet wird. Beispielsweise können das cohäsive Ende des Mikroorganismus-DNA-Fragments und das cohäsive Ende des Vektor-Fragments verbunden werden, und anschließend kann eine rekombinante DNA aus dem Mikroorganismus-DNA-Fragment und dem Vektor-Fragment mittels einer geeigneten DNA-Ligase hergestellt werden. Falls erforderlich, können die verbundenen Fragmente in einen Wirtsorganismus übertragen werden, um so mit Hilfe der DNA-Ligase, die in dem Mikroorganismus vorhanden ist, eine rekombinante DNA herzustellen.
Es kann ein beliebiger Wirtsorganismus verwendet werden, in dem die rekombinante DNA stabil und autonom vermehrt wird und ein exogenes DNA-Merkmal exprimiert werden kann. Wenn der Wirts-Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der zu E. coli gehört, können E. coli DH1, E. coli HB 101, E. coli W 3110, E. coli C 600 usw. verwendet werden. Wenn der Wirts-Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der zu S. lividans gehört, können S. lividans TK-24 (FERM BP-2685), S. lividans TK-21, S. griseofuscus, S. coelicolor, S. ambofaciens usw. verwendet werden.
Als Verfahren zur Einführung der rekombinanten DNA in den Wirtsorganismus kann ein Verfahren zur Einführung einer rekombinanten DNA in Gegenwart von Calciumionen verwendet werden, wenn der Wirts-Mikroorganismus zur Gattung Escherichia gehört. Gehört der Wirts-Mikroorganismus zur Gattung Bacillus, können das kompetente Zellverfahren, das Einführungsverfahren durch Elektrofusion einer rekombinanten Ribosom-DNA in eine Protoplasten-Wirtszelle und das Mikroinjektionsverfahren verwendet werden.
Der Nachweis der Einführung einer rekombinanten Ziel-DNA in einen Wirts-Mikroorganismus kann mittels radioaktiver Markierung der DNA-Probe einer vorab synthetisierten Phospholipase D mit ³²P usw., Koloniehybridisierung der markierten DNA-Probe mit einer vorab entwickelten Genbank und Auswählen eines positiven Stammes als Zieltransformant erfolgen.
Für die zuvorgenannte Genmanipulation werden im allgemeinen Mengen von etwa 1 - 10 ug eines Restriktionsenzyms, etwa 300 ug einer Ligase und etwa 1 - 10 ug anderer Enzyme bezogen auf 0,1 - 10 ug einer DNA aus dem Donor-Mikroorganismus und einer Plasmid-DNA verwendet.
Der so erhaltene Transformant eines Mikroorganismuses wie eines Mikroorganismuses, der zu E. coli gehört, hat die Fähigkeit, zuverlässig eine große Menge an Phospholipase D bei Kultivierung des Mikroorganismuses in einem Nährmedium herzustellen.
Als eine Ausführungsform des Transformanten kann E. coli DH 1 pcPLD1 (FERM BP-2683) genannt werden, der erhalten wird, indem die in Fig. 2 dargestellte DNA in ein Plasmid pUC 118 (TAKARA SHUZO K.K.) eingeführt wird, in E. coli DH 1 (ATCC 33849) [T. Maniatis et al., Molecular Cloning: Cold Spring Harbor (1982), 504 - 506] als Wirts-Organismus transformiert wird und ein Mikroorganismus ausgewählt wird, der Phospholipase D produziert.
Die so ausgewählte rekombinante DNA kann leicht aus dem rekombinanten Mikroorganismus entfernt werden, der die rekombinante DNA enthält, und wiederum in einen anderen Wirts-Organismus eingeführt werden.
Weiter kann die DNA, die für die Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, aus dem Phospholipase D aufgebaut ist, aus der rekombinanten DNA mit einem Enzym wie einem Restriktinosenzym herausgeschnitten werden und mit dem Terminus eines anderen offenen Ringvektors verbunden werden, der durch Spaltung auf dieselbe Weise wie zuvor erhalten wird, um so eine rekombinante DNA mit neuen Eigenschaften herzustellen die dann leicht in einen anderen Wirts-Organismus eingeführt wird.
Als Ausführungsform der rekombinanten DNA kann S. lividans TK- 24 pSEV1-PLD (FERM BP-2686) erwähnt werden, die erhalten wird, indem die in Fig. 2 dargestellte DNA in einem Plasmid pSEV1 (FERM BP-2684), eingeführt wird, in S. lividans TK-24 (FERM BP-2685) als ein Wirts-Organismus transformiert wird und ein Mikroorganismus ausgewählt wird, der Phospholipase D produziert.
Die erfindungsgemäße Phospholipase D kann einer bekannten Genmanipulation unterzogen werden, um die Mutation eines Peptids zu bewirken. Solch mutierte DNA hat ein künstliches mutiertes Gen, das aus der erfindungsgemäßen Phospholipase D durch Gentechnologie erzeugt wird. Das künstliche mutierte Gen kann mittels verschiedener Gentechnologien erhalten werden, wie dem ortspezifischen Basentransformationsverfahren und der Substitution eines spezifischen DNA-Fragments eines Zielgens durch ein künstliches mutiertes DNA-Fragment. Die mutierte Phospholipase D-DNA mit besonders hervorragenden Eigenschaften unter den so erhaltenen künstlichen mutierten Genen kann schließlich in einen Vektor eingefügt werden, um eine rekombinante DNA herzustellen, die anschließend in einen Wirts-Organismus eingeführt wird, um einen Phospholipase D- Mutanten zu erzeugen.
Als Ausführungsformen von Vektoren, die die DNA enthalten, die für Phospholipase D codiert, können das Plasmid pcPLD1 aus E. coli DH1 pcPLD 1 und das Plasmid pSEV-PLD aus S. lividans TK-24 genannt werden, (Figuren 4 und 5 zeigen deren Restriktionsenzymkarten). Zudem ist die Restriktionsenzym-Spaltkarte des PLD-Gens, das aus dem Plasmid pcPLD 1 erhalten wird, in Fig. 6 gezeigt (wobei
ein Signalpeptid bezeichnet). Die Basensequenz der DNA, die für die Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, aus dem die Phospholipase D aufgebaut ist, die nach dem vorstehend erwähnten Verfahren erhalten worden ist, wurde mittels dem Didesoxy-Verfahren decodiert, das in Science, 214, 1205 - 1210 (1981) beschrieben ist. Die gesamte Aminosäurensequenz des Polypeptids, aus dem die Phospholipase D aufgebaut ist, wurde anhand der Basensequenz ermittelt. Es wurde auch für das Phospholipase D-Polypeptid, das gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren kultiviert und gereinigt worden war, bestätigt, daß die N-Terminus-Aminosäuresequenz, die mittels einem Flüssigphasenproteinsequenzer bestimmt worden war (Beckman System 890 ME; hergestellt von Beckman), mit einem Teil der ermittelten Aminosäuresequenz übereinstimmte. Der Aufbau des Plasmids pcPLD1 und des Plasmids pSEV-PLD ist in Fig. 7 veranschaulicht (wobei
das Phospholipase D- Gen bezeichnet).
Die Produktion der Phospholipase D durch einen Transformanten kann erfolgen, indem der Transformant in einem Nährkulturmedium kultiviert wird, so daß die Phospholipase D in der Mikroorganimuszelle oder in dem Kulturmedium produziert wird, durch Ernten der Zelle z.B. mittels Filtration oder Zentrifugation der Kultur. die nach dem Kultivieren erhalten worden war, Zerstören der Zelle mittels eines mechanischen Verfahrens oder eines enzymatischen Verfahrens mit Lysozym usw., gegebenenfalls Zugabe von EDTA und/oder einem geeigneten oberflächenaktiven Mittel, um die Phospholipase D in Lösung zu bringen und Abtrennen und Sammeln als wässrige Lösung. Die so erhaltene wässrige Lösung der Phospholipase D kann, wahlweise nach Aufkonzentrierung, eine Ammoniumsulfatfraktionierung, Gelfiltration, Absorptionschromatographie wie Affinitätschromatographie usw., oder Ionenaustauschchromatographie unterzogen werden, um Phospholipase D in hoher Reinheit zu erhalten.
Die Kultivierungsweise eines Mikroorganismustransformanten kann unter Berücksichtigung der physiologischen Nähreigenschaften ausgewählt werden. Obwohl der Mikroorganismus in einer Flüssigkeit kultiviert wird, ist es für die industrielle Produktion des Mikroorganismuses vorteilhaft, die Kultur in ein Fermentergefäß einzubringen. Als Nahrungsquelle des Kulturmediums kann für die Kultur des Mikroorganismuses ein üblicherweise verwendetes Kulturmedium verwendet werden.
Als Kohlenstoffquelle ist eine Kohlenstoffverbindung ausreichend, die als Nährmittel verwendet werden kann, beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose, Molassen usw. Für die Stickstoffquelle ist eine Stickstoffverbindung ausreichend, die als Nährmittel verwendet werden kann, z.B. Pepton, Nährboujllon , Hefeextrakt, Caseinhydrolysat usw. Erforderlichenfalls können auch Phosphate, Carbonate, Sulfate, Magnesium-, Calcium-, Kalium-, Eisen-, Mangan-, Zink- usw. -Salze, spezifische Aminosäuren, spezifische Vitamine usw. verwendet werden.
Die Kulturtemperatur kann innerhalb des Temperaturbereiches, in dem der Mikroorganismus wächst und die Phospholipase D produziert, in geeigneter Weise variiert werden. Vorzugsweise liegt sie in dem Bereich von 20 - 42ºC für E. coli und 28 - 30ºC für S. lividans. Obwohl die Kulturzeitdauer abhängig von den Bedingungen variiert, ist es ausreichend, daß die Kultivierung nach einer geeigneten Zeit, wenn die Phospholipase D ihren Maximumgehalt erreicht hat, beendet wird. üblicherweise liegt die Kultivierungszeit in dem Bereich von 12 - 48 Stunden für E. coli und 48 - 72 Stunden für S. lividans. Der pH des Kulturmediums kann in geeigneter Weise innerhalb des Bereiches variiert werden, in dem der Mikroorganismus wachsen und Phospholipase D produzieren kann. Vorzugsweise liegt er in dem Bereich von 6,0 - 8,0 für E. coli und 7,0 - 7,5 für S. lividans.
Die in der Kultur enthaltene Phospholipase D kann direkt geerntet und in Form eines Kulturmediums, das die Mikroorganismuszellen enthält, verwendet werden. Im allgemeinen wird die Phospholipase D, wenn sie in einem Kulturmedium enthalten ist, verwendet, nachdem die Phospholipase D enthaltende Lösung von den Mikroorganismuszellen durch Filtration, Zentrifugation usw. abgetrennt worden ist. Ist die Phospholipase D in den Mikroorganismuszellen enthalten, wird die erhaltene Kultur filtriert, zentrifugiert usw., um die Mikroorganismuszellen zu ernten, die anschließend mittels einem mechanischen Verfahren oder einem enzymatischen Verfahren mit Lysozym usw. zerstört werden. Anschließend wird ein Chelatbildner wie EDTA usw. und/oder ein oberflächenaktives Mittel zu der zerstörten Zellenmischung gegeben und die Phospholipase D wird in Lösung gebracht, anschließend abgetrennt und in Form einer wässrigen Lösung gesammelt.
Es genügt daß die so erhaltene Phospholipase D enthaltende Lösung beispielsweise einer Konzentrierung unter reduziertem Druck, Membrankonzentrierung. einer Aussalzbehandlung mit Ammoniumsulfat. Natriumsulfat usw. oder einem fraktionierten Ausfällverfahren mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie Methanol. Ethanol. Aceton usw. unterzogen wird, um einen Niederschlag zu erhalten.
Anschließend kann der Niederschlag in Wasser aufgelöst werden und einer Dialyse mit einer semipermeablen Membran unterzogen werden. um Verunreinigungen mit einem geringeren Molekulargewicht zu entfernen. Das Produkt wird weiter mittels Gelfiltration unter Verwendung eines Adsorbents oder eines Gelfiltermittels, mittels Absorptionschromatographie, wie Affinitätschromatographie usw., Ionenaustauschchromatographie usw. weiter gereinigt. Die gemäß diesen Reinigungsverfahren erhaltene Phospholipase D enthaltende Lösung kann einer Konzentrierung unter reduziertem Druck, Gefriertrockung usw. unterzogen werden, um eine gereinigte Phospholipase D zu erhalten.
Als Phospholipase D. die gemäß den zuvorgenannten Herstellungsverfahren erhalten worden ist, kann z.B. eine Phospholipase D genannt werden, die die folgenden physikalischen Eigenschaften hat:

(1) Wirkung

Phospholipase D spaltet die Esterbindung zwischen der Phosphorsäure und einer Stickstoff enthaltenden Base eines Phospholipids in eine Phosphorverbindung und eine entsprechende Stickstoff enthaltende Verbindung. Die Wirkung der Phospholipase D auf Lecithin ist wie folgt dargestellt: Lecithin (Phosphatidylcholin) Phosphatidsäure Cholin
Weiter hydrolysiert Phospholipase D Lecithin. so daß ein nucleinsäureartiger Nucleosid-Phospholipidkomplex mit krebshemmender Wirkung mittels Basenaustauschreaktion zwischen den Substraten des nucleinsäureartigen Nucleosids und eines Phospholipids wie Lecithin in einer reversiblen Reaktion erzeugt werden kann.

(2) Bestimmung der Aktivität

0,2 M Tris-Chlorwasserstoffsäurepuffer (pH 8,0) 0,1 ml
10 mM Lecithinemulsion 0,1 ml
0,1 M Calciumchlorid 0,05 ml
1 % Triton X100 0,1 ml
Wasser 0,1 ml
Zu der Reaktionsmischung mit der vorstehend genannten Zusammensetzung wurde 0,05 ml der Enzymlösung gegeben. Nach Unsetzung bei 37ºC für 10 min wurde die Mischung 5 min zum Kochen gebracht, um die Umsetzung zu stoppen. Die Reaktionslösung wurde auf 37ºC gekühlt. Anschließend wurden zu der Lösung 0.1 ml 4-Aminoantipyrin (3 mg/ml) 0,1 ml Phenol (2 mg/ml), 0,1 ml Peroxidase (2 U/ml), 0,1 ml Cholinoxidase (30 U/ml) und 0,1 ml Wasser gegeben, bevor 2 ml 1 % Triton X100 zu der Reaktionsmischung zur Messung der dekadischen Extinktion bei 500 nm gegeben wurde, erfolgte die Umsetzung bei 37ºC für 20 min. Gemäß Definition hat eine Einheit (Unit (U)) Phospholipase D eine Enzymaktivität zur Erzeugung von 1 uM/min Cholin. Die Enzymaktivität berechnet sich aus der folgenden Gleichung:
U/ml = Δ A&sub5;&sub0;&sub0; x 0.55
wobei ΔA&sub5;&sub0;&sub0; die dekadische Extinktion bei 500 nm ist.

(3) Substratspezifität

Dasselbe Verfahren, das zuvor für die Reaktionslösung zur Messung der dekadischen Extinktion beschrieben worden war. wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß Emulsionen (10 mM, 0,1 ml) von Lecithin, Lysolecithin bzw. Sphingomyelin als Substrate verwendet wurden. Die Menge an Cholin wurde bestimmt und die relativen Enzymaktivitäten wurden berechnet, wobei die Enzymaktivität gegenüber Lysolecithin zu 100 gesetzt wurde. Substrat Relative Aktivität Lecithin Sphingomyelin Lysolecithin

(4) pH-Stabilität

pH 5: Acetatpuffer
pH 6 - 7: Dimethylglutarat-Natriumhydroxidpuffer
pH 8 - 9: Tris-Chlorwasserstoff- Säurepuffer
pH 10: Glycin-Natriumhydroxidpuffer
Nachdem die Enzymlösung in den Pufferlösungen (10 mM) bei 37ºC 60 Minuten inkubiert worden war, wurde die Aktivität der Phospholipase D mit dem zuvorgenannten Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität gemessen.
Das Enzym ist bei pH 7 - 9 vergleichsweise stabil.

(5) Optimaler pH

pH 6 - 7, 5: Dimethylglutarat-Natriumhydroxidpuffer
pH 7 - 9: Tris-Chlorwasserstoffsäurepuffer
pH 9 - 10: Glycin-Natriumhydroxidpuffer
Die Aktivität der Phospholipase D wird gemäß dem zuvorgenannten Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität gemessen. Der optimale pH liegt in dem Bereich von etwa 7,5 - 8.

(6) Thermische Stabilität

Nachdem die Phospholipase D jeweils bei einer Temperatur von 40, 50, 60, 70 und 80ºC 10 min bei den folgenden Bedingungen inkubiert worden war: 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäurepuffer (pH 8,0) und Konzentration der Enzymlösung 1 mg/ml, wurde die Aktivität der Phospholipase D gemäß den zuvorgenannten Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität gemessen. Das Enzym ist bei einer Temperatur bis zu 70ºC stabil.

(7) Relative Molekülmasse und isoelektrischer Punkt

Die Phospholipase D hat eine relative Molekülmasse von etwa 50.000 gemessen mittels Sephadex G-150 Gelfiltration und etwa 57.000 gemessen mittels SDS-Polyacrylamiddiskelektrophorese.
Die Phospholipase D hat einen isoelektrischen Punkte (IP) von pH 5.0.
Die so erhaltene Phospholipase D ist einer Phospholipase D, die aus dem Stamm Streptomyces hachiioensis A 1143 (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 48-99386) in Hinblick auf den optimalen pH, pH-Stabilität und thermische Stabilität überlegen. Da der Stamm S. hachiioensis A 1143 zusätzlich zur Phospholipase D Phospholipase C produziert (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 49-55893), weist er den Nachteil einer Nebenreaktion aufgrund der Verunreinigung durch Phospholipase C in dem Endprodukt auf, falls nicht im wesentlichen vollständig gereinigt wird. Andererseits wird erfindungsgemäß eine Phospholipase D in hoher Reinheit mittels einfacher Reinigungsverfahren erhalten, und daher kann die Phospholipase D als besonders nützliches Enzym angesehen werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung im einzelnen unter Bezugnahme auf die Beispiele erläutert wird, ist festzustellen, daß die Erfindung nicht auf diese beschränkt ist.

Beispiel 1

Extraktion der DNA aus Actinomyceten

Zu 500 ml trophischer Sojabohnennährlösung (30 g/l, hergestellt von DIFCO) wurde ein Phospholipase D produzierender Actinomyceten-Stamm S. chromofuscus A 0848 (FERM BP 2682) gegeben und die Kultivierung wurde unter Schütteln bei 30ºC drei Tage durchgeführt. Die Kulturlösung wurde bei 14.000 Upm (25.000 G) 10 min lang in einer gekühlten Hochgeschwindigkeitszentrifuge (HITACHI SCR-20BA-Modell) zentrifugiert, um die Actinomycetenzellen zu sammeln. Die Actinomycetenzellen wurden in 20 ml TES (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 15 % Sucrose) suspendiert und Lysozym (hergestellt von SIGMA Co.) wurde in einer solchen Menge zugegeben, daß die Endkonzentration 1 mg/ml betrug. Die Behandlung wurde bei 37ºC 10 min durchgeführt, um die Zellwände zu zerstören. Anschließend wurde 0,5 ml 10 % SDS zugegeben und es wurden 21 ml einer Mischung aus Phenol und Chloroform (1 : 1) zusätzlich zugegeben, bevor bei 14.000 Upm (25.000 G) 15 min zentrifugiert wurde. Die abgetrennte wässrige Schicht wurde in ein anderes Gefäß gegeben und es wurden 42 ml Ethanol zugesetzt. Abgesetztes Chromosom wurde gesammelt, indem es um einen Glasstab gewickelt wurde.
Das Chromosom wurde in 20 ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) gelöst und vor dem Rühren wurden 20 ml einer Mischung aus Phenol und Chloroform (1 : 1) zugegeben. Anschließend wurde bei 14.000 Upm (25.000 G) 15 min zentrifugiert. Die abgetrennte wässrige Schicht wurde in ein anderes Gefäß gegeben und es wurden 2 ml 3 M Natriumacetatpuffer (pH 5,5) und 50 ml Ethanol vor dem Rühren zugesetzt. Die Mischung wurde bei -70ºC 20 min gekühlt und mit 3.000 Upm (2.000 G) 15 min zentrifugiert. Die abgesetzten Chromosome wurden mit 75 % Ethanol gewaschen und getrocknet, wobei 550 ug eines Produkts aus Chromosomen-DNA erhalten wurde.

Beispiel 2

Herstellung einer Actinomyceten-Genbank

Chromosomen-DNA von Actinomyceten (2 ug) wurde mit 4 U der Restriktionsendonuclease Sal I (hergestellt von TOYOBO Co.) bei 37ºC 2 Stunden in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; , 1 mM DTT (Dithiothreitol) und 10 ug/ml BSA (Rinderserumalbumin; BOEHRINGER-MANNHEIM Co.) gespalten.
Ebenso wurden 2 ug des Plasmidvektors pUC 118 (ColE 1 ori, Ampr, M 13 IG; hergestellt von TAKARA SHUZO Co.) mit 4 U Sal I bei 37ºC 16 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie zuvor genannt gespalten, bevor er mit Phenolchloroform behandelt wurde und mit Methanol ausgefällt wurde. Der linearisierte pUC 118 wurde mit alkalischer Phosphatase. die aus E. coli (hergestellt von TOYOBO Co.) stammte, bei 65ºC 1 Stunde in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM MgCl&sub2; umgesetzt, um den Phosphatteil am 5'-Terminus zu entfernen.
Die so behandelten pUC 118 (100 ng) und Actinomycetenchromosom (200 ng) wurden mit 100 U der T4 DNA-Ligase (hergestellt von TAKAR SHUZO Co.) bei 16ºC 16 Stunden in Gegenwart von 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT (Dithiothreitol) und 660 uM ATP (hergestellt von BOEHRINGER- MANNHEIM) behandelt. Das Produkt wurde in E. coli DH 1 (ATCC 33849) transformiert (F&supmin; , rec A I, end A I, gyr A96, thi-l, hsd R 17 (γk&supmin; , mk&spplus;). Sup E 44 rel A I, λ&supmin; ) [T. Maniatis et al., Molecular Cloning: Cold Spring Harbor (1982) 504 - 506], die zu einer kompetenten Zelle durch das Verfahren von K. Shigesada [SAIBO KOGAKU (1983) 2, 616 - 626] modifiziert worden war, und in einer Ampicillin (50 ug/ml) enthaltenden L- Agar-Kulturmediumplatte [15 g/l Bacto-Tripton (hergestellt von DIFCO), 5 g/l Hefeextrakt (hergestellt von DIFCO), 5 g/l NaCl und 15 g/l Bacto-Agar (hergestellt von DIFCO) über Nacht kultiviert, wobei etwa 100.000 ampicillinresistente Kolonien als Actinomycetengenbank erhalten wurden.

Beispiel 3

Herstellung einer radioaktiven Oligonucleotidprobe

Vor der Herstellung einer Oligonucleotidprobe einer Phospholipase D, die nicht genetisch analysiert worden war, wurde zunächst eine Phospholipase D, die mittels der Fermentationsmethode erhalten worden war. vollständig gereinigt. und es wurde die Aminosäuresequenz an der N-Terminusseite der Phospholipase D untersucht. Dabei wurde eine Sequenz von 20 Aminosäuren am N-Terminus analysiert und als die Aminosäuresequenz, die im folgenden als A dargestellt ist, bestimmt. Vor der Herstellung einer Oligonucleotidprobe einer Phospholipase D wurde anhand der so bestimmten 20 Aminosäuren an der N-Terminusstelle die Sequenz von 60 Basen an der 5'-Terminusstelle des Gens für verschiedene Arten von Oligonucleotiden, die im folgenden als B dargestellt sind, entwickelt. Obwohl unzählige Sequenzen für die Oligonucleotidprobe vorhanden sind, die anhand der entwickelten Sequenzen entworfen worden ist, wurden erfindungsgemäß mehrere Sequenzarten entworfen. Als Ergebnis mehrerer Trial-and-Error-Versuche wurde festgestellt, daß das Oligonucleotid, das aus 50 Basen besteht und im folgenden als C dargestellt ist, für die Erfindung das brauchbarste ist und daher wurde das Oligonucleotid für das folgende Verfahren als Probe verwendet. (A) Aminosäuresequenz: (B) Geschätzte DNA-Sequenz: (C) Oligonucleotid:
Das vorstehend als C bezeichnete Oligonucleotid wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesizers (Beckman System I plus, hergestellt von BECKMAN Co.) basierend auf dem Verfahren von R.L. Letsinger, W.B. Lursford; J. Am. Chem. Soc., 98, 3655 hergestellt.
Das so erhaltene Oligonucleotid (200 ng) wurde mit 8,5 U T4 Polynucleotidkinase (hergestellt von TOYOBO Co.) bei 37ºC 30 min in Gegenwart von einem T4 Polynucleotidkinasepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM MgCl&sub2;; 10 mM 2-Mercaptoethanol) und 740 kBq ³²P-ATP (hergestellt von AMERCIAM JAPAN Co.) umgesetzt wobei eine radioaktive Oligonucleotidprobe durch Einführung des Radioisotops ³²P in das Oligonucleotid erhalten wurde.

Beispiel 4

Mustern der Phospholipase D-Gen enthaltenden Klone

Auf die so erhaltene Genbank, d.h. die ampicillinresistenten Kolonien auf der Agarkulturmediumplatte, wurde ein Nylonmembranfilter gelegt (Biodine A, hergestellt von PALL Co.) und ein Teil der Kolonien wurde auf den Filter übertragen. Der Filter, auf den ein Teil der Kolonien übertragen worden war, wurde auf eine andere Ampicillin (50 u/ml) enthaltende L- Agarkulturmediumplatte gegeben und die Mikroorganismuszellen wurden bei 37ºC 16 Stunden kultiviert. Nach Kultivierung der Zellen wurde der Filter in eine alkalische denaturierende Lösung (0,5 N NaOH, 1,5 N NaCl) 5 min eingetaucht, zudem wurde er in einen 3 M Natriumacetatpuffer (pH 5,5) 5 min eingetaucht und getrocknet. Der Filter wurde 1 Stunde bei 80ºC erwärmt und die Plasmid-DNA in der Mikroorganismuszelle wurde auf dem Filter immobilisiert.
Der Filter wurde zudem in eine Hybridisierungslösung [NaCl (43,84 g/l), Trinatriumcitrat (22,1 g/l), 50 mM Trinatriumphosphat (pH 6,5), Natriumdodecylsulfat (1 g/l), Phycol (1 g/l, hergestellt von PHARMACIA Co.), Polyvinylpyrrolidon (1 g/l), BSA (1 g/l, hergestellt von BOEHRINGER-MANNHEIM Co.), Lachssperma-DNA (250 mg/l, hergestellt von PHARMACIA Co.), Formamid (0,4 I/l)] eingetaucht, und die Hybridisierung wurde bei 42ºC 1 Stunde durchgeführt. Anschließend wurde der Filter in eine frische Hybridisierungslösung getaucht und die zuab hergestellte radioaktive Oligonucleotidprobe wurde zugegeben. Die Hybridisierung wurde bei 42ºC 24 Stunden durchgeführt.
Nach der Hybridisierung wurde der Filter dreimal mit einer Waschlösung [NaCl (4,38 g/l), Trinatriumcitrat (2,21 g/l), Natriumdodecylsulfat (1 g/l)] gewaschen, und der Filter wurde zudem in die Waschlösung bei 50ºC getaucht, um überschüssige Probe zu entfernen. Der Filter wurde luftgetrocknet und auf einem Röntgenstrahl-Fotographiefilm aufgebracht (New RXO-H, hergestellt von FUJI PHOTO FILM Co.), eine Autoradiographie wurde bei -70ºC 24 Stunden unter Lichtabschirmung durchgeführt.
Nach Beendigung der Autoradiographie wurde der Film entwickelt und die Kolonien, die positive Signale ergaben, wurden festgestellt. Die Kolonien wurden als die Transformanten geerntet, die DNA enthielten, die für Phospholipase D codiert, und als E. coli DH1 pcPLD1 (FERM BP 2683) hinterlegt.
In diesem Zusammenhang ist festzustellen, daß die optimale Bedingung für die Hybridisierung abhängig von der Form des Oligonucleotids variiert. Erfindungsgemäß wurde daher als Ergebnis von wiederholten Trial-and-Error-Versuchen festgestellt, daß die Oligonucleotidprobe mit den 50 Basen, die zuvor als C bezeichnet wurde, unter den zuvorgenannten Hybridisierungsbedingungen optimal war, und es konnte das positive Signal eines Transformanten, der allein unter 100.000 Kolonien enthalten war, und das Gen der Phospholipase D enthielt, unterschieden werden.

Beispiel 5

Extraktion des rekombinanten Plasmids

Das rekokmbinante Plasmid pcPLD1, das die DNA enthielt, die für Phospholipase D codiert, wurde aus E. coli DH1 pcPLD1 gemäß dem Verfahren von T. Maniatis et al., Molecular Cloning; Cold Spring Harbor, (1982) 86 - 94 extrahiert. Die Restriktionsenzymkarte ist in Fig. 4 gezeigt.
Die Basensequenz der DNA in dem Teil, der von dem Actinomycetenchromosom stammte, wurde in dem Plasmid mittels Didesoxy-Verfahren [Science, 214, 1205 - 1210 (1981)] bestimmt, so daß. bestätigt wurde, daß die gesamte DNA, die für Phospholipase D codiert, enthalten ist. Gleichzeitig wurde die gesamte Basensequenz bestimmt. Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 6

Kultivierung und Herstellung der Zellextrakte

E. coli DH1 pcPLD1, das pcPLD1 enthielt, wurde in 20 ml einer Ampicillin (50 ug/ml) enthaltenden LB-Kulturmedium [1,0 % Bacto-Tripton (hergestellt von DIFCO Co.), 0,5 % Hefeextrakt (hergestellt von DIFCO Co.), 1,0 % NaCl] bei 37ºC 18 Stunden kultiviert und die Zellen wurden mittels Zentrifugation (6.000 Upm, 10 Minuten) gesammelt und in 100 ul 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert. Die Zellen wurden mit einem Ultraschallzerkleinerer zerkleinert und bei 14.000 Upm 5 min zentrifugiert und der überstand wurde als Zellextrakt gesammelt.

Beispiel 7

Bestimmung der Phospholipase D-Aktivität des Zellextrakts

Um die Expression des PLD-Gens in E. coli DH1 pcPLD1 zu bestätigen, wurde die Phospholipase D-Aktivität in dem Zellextrakt gemessen.
Ein 5 ml Anteil einer Substrat lösung (5 mM Phosphatidylcholin, 3,8 % Chloroform, 1 % Triton X-100, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM CaCl&sub2;) wurde entnommen und bei einer Temperatur von 37ºC 5 min gehalten. Der Zellextrakt (50 ul) wurde zugegeben, das Gemisch wurde gerührt und bei 37ºC 10 min umgesetzt. Anschließend wurden 2,5 ml einer Chromogenlösung [0,6 mM 4-Aminoantipyrin, Phenol (80 ug/ml), 2,4 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl (pH 8,0)] zugegeben, und die Mischung wurde unter Rühren bei 37ºC 4 Stunden umgesetzt. Die dekadische Extinktion der Reaktionslösung bei 500 nm wurde gemessen und als Nachweis für die Phospholipase D verwendet.
Zur Kontrolle wurde der Extrakt eines nichttransformierten E. coli DH 1 auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt.
Es wurde bestätigt, daß E. coli DH 1 pcPLD1 Phospholipase-Aktivität exprimiert. Tabelle 1 Zellextrakt Dekadische Extinktion bei 500 nm E. coli

Beispiel 8

Einführung des Phospholipase D-Gens in Actinomyceten

Der Plasmidvektor pcPLD 1 (2 ug) wurde mit den Restriktionsendonucleasen Mlu I (6 U) und Xho I (10 U) (hergestellt von TOYOBO Co.), gespalten, und das 3 kb DNA-Fragment, das das Phospholipase D (PLD) -Gen enthielt, wurde mittels Elektrophorese auf 1 % niedrigschmelzendem Agarosegel (hergestellt von BETHESDA RESEARCH LABORATORIES Co.) abgetrennt. Die beiden Enden des Fragments wurden mittels Behandlung mit 2,4 U T4 DNA Polymerase (hergestellt von TOYOBO Co.) in Gegenwart von 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6,7 mM MgCl&sub2;, 16,6 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 6,7 uM EDTA, 50 uM dNTP (hergestellt von BOEHRINGER-MANNHEIM) und 167 ug/ml BSA (hergestellt von BOEHRINGER-MANNHEIM) in stumpfe Enden überführt. Der Actinomycetenplasmidvektor pSEV 1 (2 ug) [S. Horinovchi, M. Nishiyama, A. Nakamura, T. Beppu, Mol. Gen. Genet., (1987) 210: 468 - 475 (FERM BP 2684)] wurde mit 2 U Restriktionsendonuclease Sac I (hergestellt von TOYOBO Co.) gespalten. Die beiden Enden des Fragments wurden durch dieselbe Behandlung wie zuvor in stumpfe Enden überführt, und das Fragment wurde mit 6 U bakterieller alkalischer Phosphatase (hergestellt von TOYOBA Co.) behandelt, um die Phosphatteile an beiden Enden zu entfernen. Das so behandelte PLD-Gen enthaltende Fragment (200 ng) und das Plasmid pSEV1 (100 ng) wurden mit 100 U T4 NDA-Ligase (hergestellt von TAKARA SHUZO Co.) in Gegenwart von 6,6 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 660 uM ATP (hergestellt von BOEHRINGER-MANNHEIM) bei 16ºC für 16 Stunden verbunden. Das verbundene Produkt wurde in S. lividans TK-24 (FERM BP 2685) transformiert, der mittels dem Verfahren von D.A. Hopwood et al. (Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, the John Innes Foundation, John Innes Institute, 103 - 122) in eine kompetente Zelle umgewandelt worden war, auf eine trophische Sojabohnenagarmediumplatte (3 % trophische Sojabohne, 2 % Bacto-Agar (jeweils hergestellt von DIFCO Co.) und 1 Tag bei 28ºC kultiviert. Anschließend wurde die trophische Sojabohnenagarplatte mit einem Nährlösung-Agarmedium, das Thiostrepton (100 ug/mg) enthielt, [1,8 % Nährbouillon (hergestellt von TANABE PHARMACEUTICAL Co.), 11,3 % Sucrose, 0,5 % Agar (hergestellt von WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD)] bedeckt und bei 28ºC 1 Tag kultiviert, wobei eine thiostreptonresistente Kolonie erhalten wurde, der als ein Actinomyceten-Stamm angesehen wurde, der das Plasmid pSEV-PLD als PLD-Gen enthaltenden Vektor (siehe Fig. 5) enthielt. Der so erhaltende Transformant wurde als Streptomyces lividans TK-24 pSEV1-PLD (FERM BP 2686) hinter legt.

Beispiel 9

Kultivierung von Streptomyces lividans TK-24.pSEV1-PLD und Expression der Aktivität

Streptomyces lividans TK-24 pSEV1-PLD, der der so erhaltene Actinomycetentransformant war, wurde in einem 3 % trophischen Sojabohnenkulturmedium (hergestellt von DIFCO Co.) bei 28ºC 3 Tage kultiviert. Die Kultur wurde mit 14.000 Upm 2 min zentrifugiert und der überstand abgetrennt. Die Phospholipase DAktivität des Kulturüberstandes wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 7 gemessen. Ebenso wurde die Phospholipase D-Aktivität des Kulturüberstandes eines nichttransformierten Streptomyces lividans TK-24 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Es konnte bestätigt werden, daß durch Einführung des Vektors pSEV-PLD Phospholipase D-Aktivität exprimiert wurde. Tabelle 2 Kulturüberstand Phospholipase D-Aktivität (U/ml) Transformant Nicht transformiert
Erfindungsgemäß wurde ein neuartiges Phospholipase D-Gen, dessen gesamte DNA-Sequenz bestimmt worden war, aus einer Chromosomen-DNA-Bank, die von einem Phospholipase D produzierenden Stamm stammte, unter Verwendung eines Oligonucleotids abgetrennt, das auf Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz von Phospholipase D synthetisiert worden war. Unter Verwendung des Phospholipase D-Gens wurde es möglich, Phospholipase D in einem beliebigen Wirts-Vektorsystem herzustellen und zu kultivieren. Weiter wurde eine Vielzahl von Proteintechniken wie Verbesserung der Hitzebeständigkeit oder Änderung der Substratspezifität der Phospholipase D durch die Isolierung des Phospholipase D-Gens ermöglicht.

SEQUENZLISTE

SEQ ID NO: 1
SEQUENZTYP: Nucleotid mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 1530 Basenpaare
STRÄNGIGKEIT: UNBEKANNT
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Genom-DNA
ORIGINALQUELLE ORGANISMUS: Mikroorganismus
VORLIEGENDE EXPERIMENTALQUELLE: Streptomyces chromofuscus A- 0848
EIGENSCHAFTEN: Phospholipase D-Gen

Claims

1. Eine DNA, für die die DNA-Sequenz vom 5'-Terminus durch Figur 2 wiedergegeben ist.

2. Ein Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz vom 5'-Terminus gemäß Figur 2 umfaßt.

3. Ein Vektor nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Vektor um das Plasmid pcPLD1 in Escherichia coli DH1.pcPLD1 (FERM BP 2683) oder das Plasmid pSEV1-PLD in Streptomyces lividans TK24.pSEV1-PLD (FERM BP 2686) handelt.

4. Ein Transformant, gekennzeichnet durch einen Wirt, bei dem es sich um einen Mikroorganismus handelt, der zur Gattung Escherichia, zur Gattung Streptomyces, zur Gattung Saccharomyces oder zur Gattung Bacillus gehört, enthaltend eine für den Wirt exogene DNA, wobei die DNA-Sequenz vom 5'-Terminus durch die Figur 2 wiedergegeben ist.

5. Ein Transformant nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus der Gattung Escherichia ein Mikroorganismus ist, der zu Escherichia coli gehört.

6. Ein Transformant nach Anspruch 5, wobei der Transformant Escherichia coli DH1-pcPLD1 (FERM BP 2683) ist.

7. Ein Transformant nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus der Gattung Streptomyces ein Mikroorganismus ist, der zu Streptomyces lividans gehört.

8. Ein Transformant nach Anspruch 7, wobei der Transformant Streptomyces lividans TK24.pSEV1-PLD (FERM BP 2686) ist.

9. Verfahren zur Herstellung von Phospholipase D, gekennzeichnet durch einen Wirt, der ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia, der Gattung Streptomyces, der Gattung Saccharomyces oder der Gattung Bacillus ist, wobei ein Transformant, der eine DNA gemäß Figur 2 umfaßt, kultiviert wird und die genetische Information der DNA exprimiert wird und Phospholipase D von der Kultur geerntet wird.