JP2777958B2 - ＭｂｏＩ制限・修飾系酵素遺伝子及び製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学試薬として
有用な制限酵素及び修飾酵素に関し、更に詳細にはＭｂ
ｏＩ制限酵素及び修飾酵素及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＭｂｏＩ制限及び修飾酵素は、１９７６
年にモラキセラ ボヴィス（ Moraxella bovis )ＡＴＣ
Ｃ１０９００より単離され、その生化学的研究がなされ
てきた。ＭｂｏＩ制限・修飾系酵素は、ＤＮＡを切断す
る活性を有するＭｂｏＩ制限酵素とＭｂｏＩ制限酵素に
よる切断よりＤＮＡを保護するＭｂｏＩ修飾酵素により
構成される。ＭｂｏＩ制限酵素は、典型的II型制限酵素
であり、ＤＮＡ塩基配列中二回転対称構造の４塩基から
なる配列（５′−ＧＡＴＣ−３′）を認識し、その認識
配列のＧの５′側を、５′突出となるように切断する酵
素である。一方、ＭｂｏＩ修飾酵素は、ＭｂｏＩ制限酵
素の上記認識配列のＡをメチル化することにより、Ｍｂ
ｏＩ制限酵素による切断よりＤＮＡを保護する機能を有
する酵素である。 従来から知られているＭｂｏＩ制限
酵素の製造方法としては、ゲリナス（ Gelinas )の方法
がある。ゲリナスは、前出の Moraxella bovis ＡＴＣ
Ｃ１０９００（以下、Ｍｂｏ菌と略記する）より回収す
る方法を確立している。当該方法はジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー（ Journal ofMolecular B
iology ) 第１１４巻、第１６９頁（１９７７）に記載
されている。ＭｂｏＩ修飾酵素の製造方法については、
いまだ詳細な確立した方法の報告はない。しかしなが
ら、Ｍｂｏ菌より得られるＭｂｏＩ制限酵素及びＭｂｏ
Ｉ修飾酵素の含量は少なく、両酵素を大量に得ることは
困難であった。また、Ｍｂｏ菌は、ＭｂｏＩ制限酵素及
び修飾酵素のほか、ＭｂｏII制限酵素及び修飾酵素も同
時に生産するため、ＭｂｏＩ制限酵素及び修飾酵素のみ
を製造するための操作は煩雑であった。一方、ＭｂｏII
制限・修飾系酵素の遺伝子の単離及び当該遺伝子を種々
のベクターに結合してクローニングする方法については
ボクラゲ（ Bocklage) 等によってヌクレイック アシ
ッズ リサーチ（ Nucleic Acids Research )第１９
巻、第１００７頁（１９９１）に記載されているが、Ｍ
ｂｏＩ制限・修飾系酵素の遺伝子についてはいまだに明
らかにされていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｍｂ
ｏＩ制限・修飾系酵素遺伝子を提供し、ＭｂｏＩ制限酵
素及び修飾酵素の工業的製造に適したＭｂｏＩ制限・修
飾系酵素の遺伝子を含むプラスミドを導入した新規微生
物、特に大腸菌を創製し、該微生物を用いたＭｂｏＩ制
限酵素及び修飾酵素の製造方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、配列表の配列番号３で表される塩
基配列中に含有されるＭｂｏＩ制限・修飾系酵素の遺伝
子に関する。また本発明の第２の発明は、ＭｂｏＩ制限
酵素及び／又は修飾酵素の製造方法に関する発明であっ
て、上記第１の発明のＭｂｏＩ制限・修飾系酵素の遺伝
子が組込まれたプラスミドを保有する微生物を培養し、
培養物よりＭｂｏＩ制限酵素及び／又は修飾酵素を採取
することを特徴とする。

【０００５】ＭｂｏＩ制限及び修飾系酵素の遺伝子には
ＤＮＡを切断する活性を有するＭｂｏＩ制限酵素をコー
ドする遺伝子と、ＭｂｏＩ制限酵素による切断よりＤＮ
Ａを保護するＭｂｏＩ修飾酵素をコードする遺伝子を含
んでいる。

【０００６】なお、本明細書において、制限・修飾系酵
素の遺伝子とは、制限及び修飾の両酵素遺伝子をもつ遺
伝子とその各個別の遺伝子との両者を統合した意味の用
語である。換言すれば、制限及び／又は修飾酵素遺伝子
を意味する。これらの遺伝子は、単独あるいは複合体の
形で利用できる。

【０００７】また、上記の両遺伝子を組込んだプラスミ
ドを用いる場合、そのプラスミドは両遺伝子を同一のプ
ラスミドに組込んだものでも、あるいは両遺伝子を各個
別に複数のプラスミドに組込んだもののいずれであって
もよい。

【０００８】本発明者らは、Ｍｂｏ菌よりＭｂｏＩ制限
修飾系酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をクローニングする
ことに成功し、更にこれらのＤＮＡ断片全体あるいは一
部が同一又は個別のプラスミドに組込まれたプラスミド
を導入した微生物、特に大腸菌を培養することにより菌
体中に著量のＭｂｏＩ制限酵素及び／又はＭｂｏＩ修飾
酵素が蓄積し、これらの培養物より大量のＭｂｏＩ制限
酵素及び／又はＭｂｏＩ修飾酵素が単離できることを見
出し本発明を完成した。

【０００９】以下本発明を具体的に説明する。本発明に
係わる新規微生物、例えば大腸菌は次に例示する工程に
より得ることができる。 １）ＤＮＡ供与体であるＭｂｏ菌から染色体ＤＮＡを抽
出し、染色体ＤＮＡの制限酵素部分分解産物を、あらか
じめ制限酵素で開裂しておいたＭｂｏＩ制限酵素の認識
配列をもつベクターに結合させる。 ２）１）で作製したプラスミドライブラリーで dam mut
ant の大腸菌を形質転換し、プラスミド抽出法により d
amメチル化されていないプラスミドライブラリーを得
る。 ３）２）で作製したプラスミドライブラリーをＭｂｏＩ
制限酵素で切断し、切断されないプラスミドすなわちＭ
ｂｏＩ修飾酵素が発現しているプラスミドを選択する。 ４）Ｍｂｏ菌より前述のゲリナスの方法によりＭｂｏＩ
制限酵素を精製する。このタンパクのアミノ酸配列を例
えばＮ末端側より一部決定し、それに対応するＤＮＡを
合成する。 ５）ＤＮＡ供与体であるＭｂｏ菌から染色体ＤＮＡを抽
出し、染色体ＤＮＡの制限酵素完全分解産物を４）で合
成したＤＮＡをプローブとしサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行い、プローブＤＮＡと同一配列を含むＤＮＡ断
片を選択する。 ６）５）で選択したＤＮＡ断片を制限酵素で開裂したプ
ラスミドと結合させる。こうして作製した、少なくとも
制限酵素遺伝子の一部を含むプラスミドと３）で選択し
た修飾酵素遺伝子を含むプラスミドとを大腸菌に形質転
換により導入する。 ７）６）で作製した形質転換体のＭｂｏＩ制限酵素及び
修飾酵素活性を解析し、制限酵素及び修飾酵素を生産す
る新規微生物を得る。

【００１０】Ｍｂｏ菌の染色体ＤＮＡは、培養液より菌
体を回収し、それより抽出する。抽出、精製、制限酵素
による切断などは、公知の方法を用いることができる。
当該方法の詳細はトーマス（ Thomas ) ほか著、プロセ
デュアス イン ヌクレイック アシッズ リサーチ
（ Procedures in Nucleic Acids Research ) 、第５３
５頁、ハーパー アンド ロー（ Harper and Row ) 出
版（１９６６年）及びサムブルック（ Sambrook ) ほか
著、モレキュラー クローニング（ Molecular Cloning
)、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
（ Cold Spring Harbor Laboratory )出版（１９８９
年）に記載されている。

【００１１】一方、プラスミドベクターの開裂も同様の
方法で行うことができる。プラスミドとしては公知のも
のが使用できるが、例えばｐＢＲ３２２等が挙げられ
る。なおｐＢＲ３２２はＭｂｏＩ制限酵素の認識配列を
含んでおり、ＭｂｏＩ修飾酵素の遺伝子のスクリーニン
グを容易に行うことができる。

【００１２】染色体ＤＮＡとベクターを結合させる方法
は公知の方法によるものである。プラスミドを大腸菌宿
主に導入する当該方法の詳細にはジャーナル オブ モ
レキュラー バイオロジー、第１６６巻、第５５７頁
（１９８３年）に記載されているハナハン（ Hanahan )
の方法がある。

【００１３】大腸菌宿主からプラスミドを調製する方法
はアルカリ法で行う。調製したプラスミドのうちＭｂｏ
Ｉ修飾酵素の遺伝子をコードしていて、且つ発現してい
るものは、ＭｂｏＩ制限酵素による切断に対して保護さ
れているので選択できる。その結果、約４ｋｂのＭｂｏ
菌由来のＤＮＡ断片を含むプラスミドが選択された。

【００１４】ＭｂｏＩ制限酵素タンパクのアミノ酸配列
の決定は、精製したタンパクをＰＶＤＦ（ポリビニリデ
ン ジフルオライド）膜に移し、自動アミノ酸シーケン
サーにより行う。当該方法は、ザ ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（ The Journal of Biol
ogical Chemistry )、第２６２巻、第１００３５頁（１
９８７年）に記載のポール マツダイラ（ Paul Matsud
aira )の方法である。配列表の配列番号１にＭｂｏＩ制
限酵素のＮ末端アミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列
より、プローブＤＮＡ、例えば配列表の配列番号２に示
すＤＮＡを合成すればよい。

【００１５】サザンハイブリダイゼーションは公知の方
法による。得られたＤＮＡ断片は、プローブＤＮＡと相
補的な配列をもつ。すなわち、少なくともＭｂｏＩ制限
酵素地図の一部を含む。

【００１６】このＤＮＡ断片を更に詳しく解析し、目的
とする制限酵素の遺伝子全体を組込んでいるか否かを確
認しなくてはならない。この確認の方法は以下のように
行う。すなわち、得られたＭｂｏＩ制限酵素遺伝子を含
むと考えられるＤＮＡ断片を制限酵素で開裂したプラス
ミドに結合させる。こうして作製したＭｂｏＩ制限酵素
遺伝子を含むと考えられるプラスミドと、既に得られて
いるＭｂｏＩ修飾酵素遺伝子を含むプラスミドとを形質
転換によって大腸菌に導入し新規微生物を創製する。得
られた新規微生物についてＭｂｏＩ制限酵素活性を解析
する。

【００１７】ＭｂｏＩ制限酵素活性を調べる手段として
は、次のようなイン ビトロ（ invitro ) の方法によ
り調べることができる。試験するクローンを培養し、そ
の培養物を粉砕し、超遠心分離を行い残渣を除去した上
清を用い、緩衝液〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．
０）−７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ −１５０ｍＭ ＫＣｌ−７ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール−０．０１％ＢＳＡ〕
中、ｄａｍメチル化されていないＤＮＡを基質として、
３７℃で制限酵素反応を行いアガロースゲル電気泳動に
より解析することができる。当該方法を用いて、上記新
規微生物についてＭｂｏＩ制限酵素活性を解析したとこ
ろ活性が認められた。このことからＭｂｏＩ制限・修飾
系遺伝子を単離できたことが確認された。

【００１８】Ｍｂｏ菌由来のＭｂｏＩ修飾酵素遺伝子を
コードしているＤＮＡ断片を連結して作製したプラスミ
ドをｐＭＭｂｏＩ、Ｍｂｏ菌由来のＭｂｏＩ制限酵素遺
伝子をコードしているＤＮＡ断片を連結して作製したプ
ラスミドをｐＲＭｂｏＩと命名した。これら両プラスミ
ド及び公知のプラスミドｐＮＴ２０３〔ジーン(Gene)、
第２９巻、第１９９〜２０９頁（１９８４）に記載〕を
大腸菌、例えば大腸菌ＭＣ１０６１株に導入して形質転
換法によって得られる新規微生物は Escherichia coli
ＭＣ１０６１／ｐＭｂｏＩと命名、表示され、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２７１７号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７１７）として寄託されている。

【００１９】ｐＭＭｂｏＩ及びｐＲＭｂｏＩに挿入され
ているＤＮＡ断片の塩基配列を例えばヤニッシュ−ペロ
ン（ Yanisch-Perron ) らの方法に従ってディレーショ
ンミュータントを作成した後ダイデオキシ法によって決
定することができる。

【００２０】その結果、ｐＭＭｂｏＩ及びｐＲＭｂｏＩ
に挿入されているＤＮＡ断片は一部重複していた。つま
り、ｐＭＭｂｏＩ及びｐＲＭｂｏＩに挿入されているＤ
ＮＡ断片は連続していた。その塩基配列を配列表の配列
番号３に示す。すなわち、配列表の配列番号３に示され
る塩基配列のうち塩基番号１〜２２２２の部分がｐＲＭ
ｂｏＩに、塩基番号１６６６〜２６５９の部分がｐＭＭ
ｂｏＩに挿入されていた。

【００２１】また、例えばＤＮＡＳＩＳ^TM（宝酒造社）
を用いてオープン リーディングフレーム（ＯＲＦ）の
検索を行うことができる。その結果、配列表の配列番号
３に示される塩基配列中、塩基番号１〜８５０、８５５
〜１６９４、１６９９〜２５１７の３か所にＯＲＦが存
在しており、それぞれをｍｂｏＡ、ｍｂｏＢ、ｍｂｏＣ
と命名した。

【００２２】そして、ｐＭＭｂｏＩにはｍｂｏＣのみが
存在しているのでｍｂｏＣはＭｂｏＩ修飾酵素をコード
する遺伝子であると決定した。また、ｍｂｏＢ遺伝子か
ら推定されるアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示さ
れるＭｂｏＩ制限酵素タンパクのＮ末端アミノ酸配列と
一致することから、ｍｂｏＢはＭｂｏＩ制限酵素をコー
ドする遺伝子であると決定した。

【００２３】また、ｐＲＭｂｏＩからｍｂｏＣをコード
している領域を除いた後、大腸菌に導入し、インビボで
のＭｂｏＩ修飾酵素の活性を測定した。その結果修飾活
性が認められたため、ｍｂｏＡ遺伝子はＭｂｏＩ修飾酵
素をコードしていると決定した。

【００２４】ｐＲＭｂｏＩに挿入されているＭｂｏ菌由
来のＤＮＡ断片に含まれているｍｂｏＡ遺伝子は開始コ
ドンを含まないことから５′側が欠けていると考えられ
た。そこで更に上流領域を、配列表の配列番号２で示さ
れる前述のオリゴヌクレオチドをプローブとしたプラー
クハイブリダイゼーションを行って単離した。

【００２５】こうして得られたプローブと相同配列をも
つクローンは約５．１ｋｂのＭｂｏ菌由来のＤＮＡを含
んでいた。このＤＮＡ断片の塩基配列を一部決定したと
ころ、ｐＲＭｂｏＩに挿入されているＭｂｏＩ制限酵素
遺伝子を含む約２．１ｋｂの領域を完全に含んでいた。
また、ＭｂｏＡ遺伝子の上流領域の塩基配列が明らかに
なった。該塩基配列を配列表の配列番号４に示される塩
基配列の塩基番号１〜１６８に示す。

【００２６】このようにして得られた新規微生物の培養
に当っては、通常のエシェリヒア属の微生物の生育に適
した条件を採りうる。

【００２７】上記組換体 Escherichia coli ＭＣ１０６
１／ｐＭｂｏＩを培養し、培養物からＭｂｏＩ制限酵素
及び修飾酵素を回収するに当っては、例えば培養物より
菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を
抽出し、次いで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマ
トグラフィー法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラ
フィー法等を組合せ精製すればよく、この方法により、
ＭｂｏＩ制限酵素及び／又は修飾酵素を大量に得ること
ができる。

【００２８】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これらの実施例に限定されるものではない。

【００２９】実施例１ （１）Ｍｂｏ菌染色体ＤＮＡの調製 Ｍｂｏ菌を、Ｌ＋ＢＨＩ培地（トリプトン１０ｇ／リッ
トル、酵母エキス５ｇ／リットル、塩化ナトリウム５ｇ
／リットル、ブレイン ハート インフュージョン５ｇ
／リットル）１００ｍｌ中３７℃で１晩培養した後、遠
心分離により集菌した。当該菌体を１０ｍｌの２５ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−５０ｍＭ グルコース
−１０ｍＭ ＥＤＴＡ液に懸濁しリゾチームを同液に２
ｍｇ／ｍｌになる様に溶かしたものを１．０ｍｌ加えか
くはんし、３７℃で１５分静置した。次に当該溶液に２
８ｍｌの１００ｍＭ ＮａＣｌ−１００ｍＭ トリスＨ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）溶液を加えかくはんし、更に４ｍｌ
の１０％ＳＤＳ溶液を加えかくはんし、３７℃で１時間
静置した。当該溶液に１０％ＳＤＳ−８％サルコシル
（ Sarcosyl ) 溶液を１ｍｌ加えかくはんし、６０℃で
１５分静置した。当該溶液を静置後、等容量のフェノー
ル：クロロホルム（１：１）混液を加え、１０分間穏や
かにかくはんした後、遠心分離（５０００ｇ、１０分）
により、水層とクロロホルム層を分離した。分離後水層
を取り、これに等量のイソプロピルアルコールを加えか
くはんし、０℃で１０分間静置した後、遠心分離（１３
５００ｇ、１０分）により沈殿を回収した。これを７０
％エタノールで洗浄し、１０ｍｌのＴＥ溶液〔１０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ〕に
溶解させ、４℃で保存した。

【００３０】（２）ライブラリーの作製 （１）で得られたＭｂｏ菌の染色体ＤＮＡ２５μｇを制
限酵素ＡｌｕＩの１ユニットと緩衝液〔１０ｍＭ トリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ −１ｍ
Ｍ ジチオスレイトール〕中、３７℃で１〜１０分間反
応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルより３〜
７ｋｂの断片を回収した。このＤＮＡ断片をあらかじめ
ＥｃｏＲＶで開裂しておいたｐＢＲ３２２に結合した
後、このプラスミドで大腸菌ＧＭ３３（ｄａｍ^- ）を形
質転換した。こうして得られた形質転換体からアルカリ
法によってプラスミドを調製した。

【００３１】（３）修飾酵素遺伝子の単離 （２）で得られたプラスミドを制限酵素ＭｂｏＩで切断
した。このときＭｂｏＩ修飾酵素が発現しているプラス
ミドは切断されない。こうして得られた切断されている
あるいは切断されていないＤＮＡの混合物で大腸菌ＧＭ
３３を形質転換した。切断されていないプラスミドのみ
が大腸菌中に導入されるので、アンピシリンを含むプレ
ートで形質転換体を選択し、ＭｂｏＩ修飾酵素遺伝子を
含んでいる形質転換体を得た。

【００３２】（４）修飾酵素遺伝子の解析 ＭｂｏＩ修飾酵素が発現しているプラスミドは約４ｋｂ
のＭｂｏ菌由来のＤＮＡ断片を含んでいた。そこでＭｂ
ｏＩ修飾酵素遺伝子の位置を限定するために、当該ＤＮ
Ａ断片をエキソヌクレアーゼIII （宝酒造社製）及びマ
ングビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を用いて末端か
ら削って様々な大きさのＤＮＡ断片をもつプラスミドを
作製し、修飾酵素活性を測定した。その結果ＭｂｏＩ修
飾酵素遺伝子は図１の制限酵素地図で表される約１．２
ｋｂのＤＮＡ断片上に存在することがわかった。この
１．２ｋｂ ＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４
に結合させて作製したプラスミドをｐＭＭｂｏＩと命名
した。

【００３３】（５）ＭｂｏＩ制限酵素タンパクのＮ末端
アミノ酸配列の決定及びプローブＤＮＡの作製 Ｍｂｏ菌より精製されたＭｂｏＩ制限酵素タンパクをＳ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、ＰＶ
ＤＦ膜に移し、クマシー ブリリアント ブルー Ｒ−
２５０により染色し、１０％酢酸−５０％メタノールで
脱色した。ＭｂｏＩ制限酵素タンパクの部分を切り取
り、アミノ酸シークエンサーに供し自動エドマン分解に
より、前出配列表の配列番号１で表されるＮ末端アミノ
酸配列を決定した。次にこの配列に基づき、同配列番号
２で表される２３ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成し
た。

【００３４】（６）ＭｂｏＩ制限酵素遺伝子の単離 Ｍｂｏ菌染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で完全分解し、
配列表の配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプ
ローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。
その結果、２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩ断片がプ
ローブＤＮＡと同一配列をもつことが推定された。そこ
で、Ｍｂｏ菌染色体ＤＮＡ１０μｇを１００ユニットの
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｍｎＩと反応させ、０．７％
シーケムジー ティー ジー（Seakem ＧＴＧ）アガロ
ースゲルを用いて電気泳動し、２．１ｋｂのＤＮＡ断片
をＤＥペーパーに吸着させ、ゲルより抜き出した。その
後エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、ＥｃｏＲ
Ｉリンカーを結合させた。このＤＮＡ断片をλｇｔ１０
ベクターに結合した後、パッケージングして大腸菌Ｃ６
００（Ｈｆ１）株に感染させた。こうして得られたプラ
ークをニトロセルロース膜に移し、（５）で得られた合
成ＤＮＡをプローブとしてプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行い、プローブＤＮＡと同一配列をもつプラーク
を得た。このλファージＤＮＡ組換体を調製し、図２の
制限酵素地図で表される約２．１ｋｂのＭｂｏ菌由来の
ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出し、プロシー
ディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザＵＳＡ（ Proceedings of
the National Academy of Sciences of the USA ）、第
８０巻、第７１３７〜７１４１頁（１９８３）に記載さ
れているプラスミドｐＫＨ１のＥｃｏＲＩサイトに結合
してＭｂｏＩ制限酵素遺伝子を含むと考えられるプラス
ミドを作製した。当該プラスミドをｐＲＭｂｏＩと命名
した。プラスミドｐＭＭｂｏＩ，ｐＲＭｂｏＩ及びｐＮ
Ｔ２０３により大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換し、イン
ビボでＭｂｏＩ制限酵素活性を測定したところ、活性
が認められた。そこで、これらのプラスミドを保有する
大腸菌を Escherichiacoli ＭＣ１０６１／ｐＭｂｏＩ
と命名、表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託した（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７１７）。

【００３５】（７）ＭｂｏＩ制限・修飾系遺伝子の構造
解析 ｐＭＭｂｏＩ及びｐＲＭｂｏＩに挿入されているＤＮＡ
断片の塩基配列を、エキソヌクレアーゼ III、及びマン
グビーンヌクレアーゼを用いてディレーションミュータ
ントを作成した後、ダイデオキシ法で決定した。その結
果、ｐＭＭｂｏＩ及びｐＲＭｂｏＩに挿入されているＤ
ＮＡ断片は一部重複していた。つまりｐＭＭｂｏＩ及び
ｐＲＭｂｏＩに挿入されているＤＮＡ断片は連続してい
た。その連続した塩基配列を配列表の配列番号３に示
す。すなわち、配列表の配列番号３に示される塩基配列
のうち、塩基番号１〜２２２２の部分がｐＲＭｂｏＩ
に、塩基番号１６６６〜２６５９の部分がｐＭＭｂｏＩ
に挿入されていた。

【００３６】次にＤＮＡＳＩＳ^TMを用いてＯＲＦの検索
を行った。その結果配列表の配列番号３に示される配列
中、塩基番号１〜８５０、８５５〜１６９４、１６９９
〜２５１７の３か所にＯＲＦが存在しており、それぞれ
をｍｂｏＡ、ｍｂｏＢ、ｍｂｏＣと命名した。それぞれ
のＯＲＦに対応するアミノ酸配列も配列表の配列番号３
に示す。

【００３７】（８）ｍｂｏＡ遺伝子の解析 ｐＲＭｂｏＩをＨｉｎｄ IIIで切断し、ｍｂｏＣ遺伝子
を除いた後、ライゲーションしてｍｂｏＡとｍｂｏＢの
一部を含むプラスミドｐＲＭｂｏＩＤを得た。当プラス
ミドを大腸菌ＧＭ３３（ｄａｍ^- ）に形質転換によって
導入し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、
得られたプラスミドがＭｂｏＩ制限酵素で切断されるか
否かを調べた。その結果、活性が認められたため、ｍｂ
ｏＡ遺伝子はＭｂｏＩ修飾酵素をコードしていることが
わかった。

【００３８】（９）ｍｂｏＡ遺伝子の上流領域のクロー
ニング Ｍｂｏ菌のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢｇｌIIとＸｍｎＩ
で完全分解した後、末端を平滑化しＥｃｏＲＩリンカー
を結合した後にλｇｔ１０ベクターに挿入した。得られ
たライブラリーを形質転換により大腸菌に導入し、配列
表の配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプロー
ブとして、プラークハイブリダイゼーションを行った。
こうして得られたプローブと相同配列をもつクローンは
約５．１ｋｂのＭｂｏ菌由来のＤＮＡを含んでいた。こ
のＤＮＡ断片の塩基配列を一部決定したところ、ｐＲＭ
ｂｏＩに挿入されているＭｂｏＩ制限酵素遺伝子を含む
約２．１ｋｂの領域を完全に含んでいた。また、ｍｂｏ
Ａ遺伝子の上流領域の塩基配列が明らかになった。該塩
基配列を配列表の配列番号４に示される塩基配列の塩基
番号１〜１６８に示す。

【００３９】実施例２ （１）ＭｂｏＩ制限酵素の組換体による生産 実施例１−（６）で得られた Escherichia coli ＭＣ１
０６１／ｐＭｂｏＩ（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７１７）をア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＬ培地
に接種し、３０℃で６時間培養した後、４２℃で１５分
培養し、更に３７℃で６時間培養した。集菌後、１．２
ｍｌの１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール−０．１５
％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処理で菌を破砕
し、超遠心分離（１００００ｇ、３０分）により、上清
を回収した。上清の活性を測定したところ、ＭｂｏＩ制
限酵素が４００，０００ユニット、修飾酵素が８，００
０ユニット生産されていた。

【００４０】（２）ＭｂｏＩ制限酵素の精製 Escherichia coli ＭＣ１０６１／ｐＭｂｏＩをアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含む２リットルのＬ培地に接
種し、３０℃で６時間培養した後、４２℃で１５分培養
し、更に３７℃で６時間培養した。集菌後、１０ｇの湿
菌体を、２０ｍｌの１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル−０．１５％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ リ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処
理で菌を破砕し、超遠心分離（１００００ｇ、３０分）
により、上清を回収した。これに等量の緩衝液Ａ〔２０
ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）−１０ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール−５％グリセリン〕を加え同緩衝液で平衡
化したホスホセルロースカラムに添加した。０〜１Ｍ塩
化カリウム直線濃度勾配により溶出し、ＭｂｏＩ制限酵
素活性を含む画分を回収した。次にこの画分を緩衝液Ｂ
〔１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）−１０ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール−５％グリセリン〕に対し透析し、
同緩衝液で平衡化したアフィ ゲル ブルー カラム
（バイオラッド社）に添加した。０〜０．７５Ｍ塩化カ
リウム直線濃度勾配により溶出しＭｂｏＩ制限酵素活性
を含む画分約５ｍｌを回収した。この画分を再び緩衝液
Ｂに対し透析し、ヘパリンセファロースカラムに添加し
０〜１Ｍ塩化カリウム直線濃度勾配により溶出した。回
収したＭｂｏＩ制限酵素活性を含む画分をセファデック
スＧ−１００カラムに添加した。得られた活性画分の酵
素活性は約１，０００，０００ユニットであった。本精
製標本には他のエンドヌクレアーゼ、ホスファターゼ、
非特異的ＤＮａｓｅ等は夾雑していなかった。

【００４１】（３）ＭｂｏＩ修飾酵素の精製 Escherichia coli ＭＣ１０６１／ｐＭｂｏＩをアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含む２リットルのＬ培地に接
種し、３０℃で６時間培養した後、４２℃で１５分培養
し、更に３７℃で６時間培養した。集菌（１０ｇ湿菌）
後、３０ｍｌの緩衝液Ａに懸濁し、超音波処理で菌を破
砕し、超遠心分離（１００００ｇ、３０分）により、上
清を回収した。この上清に、２％になるように硫酸スト
レプトマイシン溶液を加え、かくはん後遠心により上清
を回収した。次に硫酸アンモニウム粉末を６５％飽和と
なるように加え、超遠心分離（１３５００ｇ、３０分）
により回収した。この回収沈殿物を３０ｍｌの緩衝液Ｂ
〔１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）−１０ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール−５％グリセリン〕に懸濁し、緩衝
液Ｂに対して透析した。続いて緩衝液Ｂで平衡化したヘ
パリンセファロースカラムに添加し、０．０５Ｍ〜０．
８０Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行っ
た。ＭｂｏＩ修飾酵素活性を含む画分を回収し、緩衝液
Ｂに対して透析した。これを緩衝液Ｂで平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファデックス（ Sephadex ) （Ａ−５０）カラ
ムに添加し、０．０５Ｍ〜０．６０Ｍ塩化ナトリウム直
線濃度勾配により溶出した。ＭｂｏＩ修飾酵素活性を含
む画分を回収し、緩衝液Ｂに対して透析した後、あらか
じめ緩衝液Ｂで平衡化したホスホセルロースカラムに添
加し、０．０５Ｍ〜１．０Ｍ塩化ナトリウム直線濃度勾
配により溶出した。得られた活性画分の酵素活性は約３
０，０００ユニットであった。本精製標品にはエンドヌ
クレアーゼ、ホスファターゼ、非特異的ＤＮａｓｅなど
は夾雑していなかった。

【００４２】

【発明の効果】以上詳細に説明した通り、本発明により
ＭｂｏＩ制限・修飾系酵素遺伝子が単離された。該遺伝
子を含有するプラスミドで形質転換した大腸菌により、
遺伝子工学において有用なＭｂｏＩ制限酵素及び／又は
修飾酵素を効率よく製造することが可能となった。

【００４３】

【配列表】

【００４４】配列番号：1 配列の長さ：34 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源：モラキセラ ボヴィス (Moraxella bovis) 配列の特徴：32番目のXaaは不明のアミノ酸 配列： Met Lys Leu Ala Phe Asp Asp Phe Leu Asn Ser Met Ser Glu Thr 1 5 10 15 Asn Thr Thr Leu Asp Tyr Phe Thr Asp Phe Asp Lys Val Lys Lys 20 25 30 Asn Xaa Ala Gln

【００４５】配列番号：2 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列の特徴：12番目のN はi （イノシン） 配列： GATTATTTTA CNGATTTTGA TAA 23

【００４６】配列番号：3 配列の長さ：2659 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：モラキセラ ボヴィス (Moraxella bovis) 株名：ATCC10900 配列： G AAT TCT TTG CTT GAT GAA ATT CAA AAA CGC TTG CCT GAT TTT GTT 46 Asn Ser Leu Leu Asp Glu Ile Gln Lys Arg Leu Pro Asp Phe Val 1 5 10 15 CAC TCA CAA GAT TTT TGT TTG GTA GAG CCT TTT GTT GGT GGT GGG 91 His Ser Gln Asp Phe Cys Leu Val Glu Pro Phe Val Gly Gly Gly 20 25 30 GCG GTG TCC TTA TGG GCA TTG TCC GAT TTG CCA CAT CTA AAA CAG 136 Ala Val Ser Leu Trp Ala Leu Ser Asp Leu Pro His Leu Lys Gln 35 40 45 CTT GTC ATC AAT GAT TGC AAT GCC GAT TTA ATC AAT GTT TAT CAA 181 Leu Val Ile Asn Asp Cys Asn Ala Asp Leu Ile Asn Val Tyr Gln 50 55 60 GTT ATT AAA AAC AAC CCC GAT GAT TTG ATA GGA TAT ATT GAA AAT 226 Val Ile Lys Asn Asn Pro Asp Asp Leu Ile Gly Tyr Ile Glu Asn 65 70 75 TTG CAA AGT CAT TAT GAT AAA TTA ACT GAT TTA GAA AGT AAA AAA 271 Leu Gln Ser His Tyr Asp Lys Leu Thr Asp Leu Glu Ser Lys Lys 80 85 90 CCT TAT TTT TAT CAC AAA CGA GAT GTT TTT AAT CAA AGA ACC AGT 316 Pro Tyr Phe Tyr His Lys Arg Asp Val Phe Asn Gln Arg Thr Ser 95 100 105 AAT GAT ATT GAG CAG GCA GGG TTA TTT ATC TTT TTA AAC AAA TCT 361 Asn Asp Ile Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Phe Leu Asn Lys Ser 110 115 120 GCT TTT AAT GGC TTA TAT CGT GTT AAT AAA AAT AAT CAA TTC AAC 406 Ala Phe Asn Gly Leu Tyr Arg Val Asn Lys Asn Asn Gln Phe Asn 125 130 135 GTT CCC ATT GGT AAT TAT AAA AAA CCA ACT TTT GTA GAT AAA GAA 451 Val Pro Ile Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Thr Phe Val Asp Lys Glu 140 145 150 AAT ATT TTA AAT ATT TCA AAA AAA CTA CAA AAC ACC AAA ATA CTA 496 Asn Ile Leu Asn Ile Ser Lys Lys Leu Gln Asn Thr Lys Ile Leu 155 160 165 TCA GGT GAT TTT GAA TTG GTT TTG GCT CAT TTG CCA AAT AAT TTT 541 Ser Gly Asp Phe Glu Leu Val Leu Ala His Leu Pro Asn Asn Phe 170 175 180 CCC TGC CTA TTT TAC CTT GAT CCG CCT TAT CGT CCG ATT AGT GAT 586 Pro Cys Leu Phe Tyr Leu Asp Pro Pro Tyr Arg Pro Ile Ser Asp 185 190 195 ACC GCA AGT TTT ACT TCT TAT TCT GAT AAT GGC TTT GAT GAT AAT 631 Thr Ala Ser Phe Thr Ser Tyr Ser Asp Asn Gly Phe Asp Asp Asn 200 205 210 GAA CAA AAA CGC TTG GCA AAT TTT TGT AAA AAA ATA GAT AAG TTG 676 Glu Gln Lys Arg Leu Ala Asn Phe Cys Lys Lys Ile Asp Lys Leu 215 220 225 GGT CAT TAT TTT TTA TTA AGC AAT TCC GAT CCA AAA AAT ACC AAT 721 Gly His Tyr Phe Leu Leu Ser Asn Ser Asp Pro Lys Asn Thr Asn 230 235 240 TCA TCT GAT GAA TTT TTT GAT GAA TTA TAT CAA GAT TTT AAA ATT 766 Ser Ser Asp Glu Phe Phe Asp Glu Leu Tyr Gln Asp Phe Lys Ile 245 250 255 GAG AGA ATA CAA GCT AAC CGC ACC ATT AGT GCC AAT AGT AAT GGT 811 Glu Arg Ile Gln Ala Asn Arg Thr Ile Ser Ala Asn Ser Asn Gly 260 265 270 CGC AAA AAG GTA AAT GAA ATT ATA GTC AGT AAC GGA GTT TAAC ATG 857 Arg Lys Lys Val Asn Glu Ile Ile Val Ser Asn Gly Val Met 275 280 1 AAA TTA GCA TTT GAT GAT TTT TTA AAT AGT ATG TCA GAA ACC AAT 902 Lys Leu Ala Phe Asp Asp Phe Leu Asn Ser Met Ser Glu Thr Asn 5 10 15 ACT ACT TTG GAT TAT TTT ACT GAT TTT GAT AAA GTA AAA AAG AAT 947 Thr Thr Leu Asp Tyr Phe Thr Asp Phe Asp Lys Val Lys Lys Asn 20 25 30 GTC GCT CAA ATT GAG ATT CAC TTA AAC CAG CTT AAT TAT TTA TTG 992 Val Ala Gln Ile Glu Ile His Leu Asn Gln Leu Asn Tyr Leu Leu 35 40 45 GGA AAA GAT GAT TTA AAA CAA GCA GTT TAT GAT TTA TAC GCC GAA 1037 Gly Lys Asp Asp Leu Lys Gln Ala Val Tyr Asp Leu Tyr Ala Glu 50 55 60 TGC CCA AAT GCG TTT TCT ATC TTA GAA ATA CTG ATT GCA GTT AGA 1082 Cys Pro Asn Ala Phe Ser Ile Leu Glu Ile Leu Ile Ala Val Arg 65 70 75 AAA AAG GAA CAA AAG AAA AGC CTA GAT GAA AAA GGT CAA GTG GTA 1127 Lys Lys Glu Gln Lys Lys Ser Leu Asp Glu Lys Gly Gln Val Val 80 85 90 ACA TTA AAT AGC TAC TTT CAA TCA GCA GAT AAA ATT ATA GAT TTT 1172 Thr Leu Asn Ser Tyr Phe Gln Ser Ala Asp Lys Ile Ile Asp Phe 95 100 105 CTT AAC AAT ACA GGG CTT GCT GAT GTA TTT AGA GAT AAA AAC ATC 1217 Leu Asn Asn Thr Gly Leu Ala Asp Val Phe Arg Asp Lys Asn Ile 110 115 120 AAA AAT TTA GTT GAT TAT GTG TTT GGC ATT GAA GTG GGT TTG GAT 1262 Lys Asn Leu Val Asp Tyr Val Phe Gly Ile Glu Val Gly Leu Asp 125 130 135 ACT AAT GCC CGA AAA AAT CGT GGT GGA GAC AAT ATG TCA AAA GCT 1307 Thr Asn Ala Arg Lys Asn Arg Gly Gly Asp Asn Met Ser Lys Ala 140 145 150 GTT CAA TTA TTA TTT GAC AAT GCA GAT ATT TAT TAT AAA AAA GAA 1352 Val Gln Leu Leu Phe Asp Asn Ala Asp Ile Tyr Tyr Lys Lys Glu 155 160 165 GTC AGA AAC ACC ATT TTT ACA GAC ATT GAA AGC TTG GGA GCT GAT 1397 Val Arg Asn Thr Ile Phe Thr Asp Ile Glu Ser Leu Gly Ala Asp 170 175 180 GTC AAA CAA TTT GAT TTT GTC ATC AAA ACC AAA AGA AAA ACC TAT 1442 Val Lys Gln Phe Asp Phe Val Ile Lys Thr Lys Arg Lys Thr Tyr 185 190 195 GTA ATT GAA ACC AAT TAT TAT AAT AGT GGT GGC TCA AAA TTA AAT 1487 Val Ile Glu Thr Asn Tyr Tyr Asn Ser Gly Gly Ser Lys Leu Asn 200 205 210 GAA GTT GCC AGA GCT TAT ACT GAT GTT GCC CCA AAA ATC AAT CAA 1532 Glu Val Ala Arg Ala Tyr Thr Asp Val Ala Pro Lys Ile Asn Gln 215 220 225 TAT TCG CAG TAT GAA TTT GTT TGG ATT ACC GAT GGT CAA GGC TGG 1577 Tyr Ser Gln Tyr Glu Phe Val Trp Ile Thr Asp Gly Gln Gly Trp 230 235 240 AAA ACT GCC AAG AAT AAA CTA CAA GAA GCC TAT ACT CAT ATA CCT 1622 Lys Thr Ala Lys Asn Lys Leu Gln Glu Ala Tyr Thr His Ile Pro 245 250 255 TCT GTT TAT AAT TTA TAT ACT TTG CAT GGT TTT ATT GAA CAG CTA 1667 Ser Val Tyr Asn Leu Tyr Thr Leu His Gly Phe Ile Glu Gln Leu 260 265 270 AAT AGC GAA GGT GTT ATA AAG GAT TGG TAAA ATG AGA ATA AAA CCT 1713 Asn Ser Glu Gly Val Ile Lys Asp Trp Met Arg Ile Lys Pro 275 280 1 5 TAT TTT GAA TCA GAT GAT AAA AAC TTT AAT ATC TAC CAG GGG AAT 1758 Tyr Phe Glu Ser Asp Asp Lys Asn Phe Asn Ile Tyr Gln Gly Asn 10 15 20 TGC ATT GAT TTT ATG TCG CAT TTT CAG GAT AAT TCC ATA GAT ATG 1803 Cys Ile Asp Phe Met Ser His Phe Gln Asp Asn Ser Ile Asp Met 25 30 35 ATA TTT GCC GAT CCG CCC TAT TTT TTA TCC AAT GAT GGA TTA ACT 1848 Ile Phe Ala Asp Pro Pro Tyr Phe Leu Ser Asn Asp Gly Leu Thr 40 45 50 TTT AAA AAT AGC ATT ATT CAA TCG GTT AAT AAA GGC GAA TGG GAT 1893 Phe Lys Asn Ser Ile Ile Gln Ser Val Asn Lys Gly Glu Trp Asp 55 60 65 AAA AAT GAC AAT GAA GCT AGT ATT TAT AAT TTT AAT CAT GAA TGG 1938 Lys Asn Asp Asn Glu Ala Ser Ile Tyr Asn Phe Asn His Glu Trp 70 75 80 ATA GCA CAA GCC AGA CAA TTA TTA AAA GAT AAC GGA ACC ATT TGG 1983 Ile Ala Gln Ala Arg Gln Leu Leu Lys Asp Asn Gly Thr Ile Trp 85 90 95 ATA AGT GGT ACG CAC CAT AAT ATT TTT ACC GTT GGT CAA GTA TTA 2028 Ile Ser Gly Thr His His Asn Ile Phe Thr Val Gly Gln Val Leu 100 105 110 AAA GAA AAT AAT TTT AAA ATA TTA AAT ATA ATA ACT TGG GAA AAA 2073 Lys Glu Asn Asn Phe Lys Ile Leu Asn Ile Ile Thr Trp Glu Lys 115 120 125 CCT AAT CCA CCG CCT AAT TTT TCT TGC CGT TAT TTT ACC TAT TCA 2118 Pro Asn Pro Pro Pro Asn Phe Ser Cys Arg Tyr Phe Thr Tyr Ser 130 135 140 AGT GAA TGG ATA ATT TGG GCA AGA AAA CAT TCT AAG ATA CCA CAT 2163 Ser Glu Trp Ile Ile Trp Ala Arg Lys His Ser Lys Ile Pro His 145 150 155 TAT TTT AAC TAT GAT TTG ATG AAA AAA TTA AAT GGC GAC AAA CAA 2208 Tyr Phe Asn Tyr Asp Leu Met Lys Lys Leu Asn Gly Asp Lys Gln 160 165 170 CAA AAA GAC ATA TGG CGA TTG CCT GCG GTG GGC AGT TGG GAA AAG 2253 Gln Lys Asp Ile Trp Arg Leu Pro Ala Val Gly Ser Trp Glu Lys 175 180 185 ACA CAG GGT AAA CAC CCT ACT CAA AAA CCA CTT GGG CTT TTA TCT 2298 Thr Gln Gly Lys His Pro Thr Gln Lys Pro Leu Gly Leu Leu Ser 190 195 200 CGC ATT ATC TTA TCA TCA ACC CAA AAA GAT GAT TTG ATT TTA GAT 2343 Arg Ile Ile Leu Ser Ser Thr Gln Lys Asp Asp Leu Ile Leu Asp 205 210 215 CCA TTT TCA GGC TCT GGC ACA ACA GGT ATT GCT GGT GTA TTG TTG 2388 Pro Phe Ser Gly Ser Gly Thr Thr Gly Ile Ala Gly Val Leu Leu 220 225 230 GAT AGA AAT TAT ATC GGT ATT GAG CAA GAA TTA GAG TTT TTA GAG 2433 Asp Arg Asn Tyr Ile Gly Ile Glu Gln Glu Leu Glu Phe Leu Glu 235 240 245 TTA TCA AAA AGG CGT TAT CAC GAA ATC ACA CCT GTA TTA AAA AAT 2478 Leu Ser Lys Arg Arg Tyr His Glu Ile Thr Pro Val Leu Lys Asn 250 255 260 GAA TTT AAA CAA AAA ATT CGT AAG CAG ATT AGT GCT ATT 2517 Glu Phe Lys Gln Lys Ile Arg Lys Gln Ile Ser Ala Ile 265 270 TAATTGCAAT TAAGTCCTTA ACCACCCTAA ACACCACACT ACGCCCCTGT ACAATGACAT 2577 CAATATCAGG GGCGTANAAA AATCCATTTG CCAACTCCAT AAATTTTTGT TAAAATTTGA 2637 TTTATTATTT TTGGCTCTGG TC 2659

【００４７】配列番号：4 配列の長さ：256 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：モラキセラ ボヴィス (Moraxella bovis) 株名：ATCC10900 配列： AAGTTGCCGA GTTAGAAGGC AAATTAGGGA GATTGAGAAG CAGGTGGGGC AGTTGATAGT 60 TTGTAATCCC AACAACGGCA AATAGATTAT TTATAATCTA TTTGCTTAAT GCACCACTTA 120 ATGATGAAAA AAGTAA ATG AAA CCT TTT ATA AAA TGG GCG GGC GGT 166 Met Lys Pro Phe Ile Lys Trp Ala Gly Gly 1 5 10 AAG AAT TCT TTG CTT GAT GAA ATT CAA AAA CGC TTG CCT GAT TTT 211 Lys Asn Ser Leu Leu Asp Glu Ile Gln Lys Arg Leu Pro Asp Phe 15 20 25 GTT CAC TCA CAA GAT TTT TGT TTG GTA GAG CCT TTT GTT GGT GGT 256 Val His Ser Gln Asp Phe Cys Leu Val Glu Pro Phe Val Gly Gly 30 35 40

【図面の簡単な説明】

【図１】MboI修飾酵素遺伝子を含む約１．２kbのＤＮＡ
の制限酵素部位を示した図である。

【図２】MboI制限酵素遺伝子を含む約２．１kbのＤＮＡ
の制限酵素部位を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 中島 和男 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．114 Ｐ．169 −179 （1977) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/16 C12N 9/10 C12N 15/54 C12N 15/55 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号３で表される塩基配列
   中に含有されるＭｂｏＩ制限・修飾系酵素の遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＭｂｏＩ制限・修飾系
   酵素の遺伝子が組込まれたプラスミドを保有する微生物
   を培養し、培養物よりＭｂｏＩ制限酵素及び／又は修飾
   酵素を採取することを特徴とするＭｂｏＩ制限酵素及び
   ／又は修飾酵素の製造方法。