JPH10234370A - ヘパリチナーゼのポリペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヘパリチナーゼのポリペプチドをコードする
ＤＮＡを提供する。 【解決手段】 バチラス サーキュランスＨｐＴ２９８
株由来の精製ヘパチリナーゼT-IVの部分的アミノ酸配列
を決定し、その配列に基づいて作製したオリゴヌクレオ
チドプライマーとハイブリダイズする、バチラス サー
キュランスＨｐＴ２９８株から得たゲノムＤＮＡの断片
から得られたＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、
ヘパリチナーゼT-IV完全長ＤＮＡを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘパリチナーゼの
ポリペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを組み込
んだ組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡで形質転換した形
質転換体、及び、当該形質転換体によるヘパリチナーゼ
のポリペプチドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘパリチナーゼは、Ｎ-アセチル-Ｄ-グ
ルコサミンとウロン酸との二糖単位の繰り返しを基本構
造とする、複合糖質であるヘパラン硫酸やヘパリンのグ
ルコサミニド結合を切断する酵素で、ヘパラン硫酸やヘ
パリンの生体内での機能あるいは生体成分中のこれら物
質の分析研究試薬として有用である。また、抗トロンビ
ン剤又は抗腫瘍剤として潜在的な治療上の価値がある低
分子化ヘパリンの調製時に低分子化剤として、あるいは
体外循環装置による治療の際問題になるヘパリンの副作
用を軽減するための素材（ヘパリン除去剤）としても有
用性が注目されており、診断、治療の目的に多様な用途
が期待できる。

【０００３】これらの用途に用いるヘパリチナーゼとし
ては、糖鎖に結合する硫酸基の有無、結合位置など、糖
鎖構造の違いを認識する種々の基質特異性の異なるもの
が知られている。本発明者らも、当該酵素生産微生物を
検索した結果、フラボバクテリューム属細菌の培養物か
ら三種（特開平２-５７１８３号）、及び、耐熱性細菌
のバチラス サーキュランスＨｐＴ２９８株から四種
（特開平４-２７８０８７号）の基質特異性の異なる耐
熱性酵素を見いだしている。また、堀越らによってバチ
ラス属に属するある種の微生物（バチラス属ＢＨ100
株）から耐熱性のヘパリン分解酵素が発見されている
（特開平２-１４２４７０号）。

【０００４】これらのヘパリチナーゼのうち、バチラス
サーキュランスＨｐＴ２９８株によって生産される四
種の酵素の一つのヘパリチナーゼＴ-IVは、ヘパラン硫
酸とヘパリンに作用し、分解産物として、不飽和二糖、
ウロン酸-グルコサミン-Ｎ-硫酸、ウロン酸-グルコサミ
ン-Ｎ，６-ジ硫酸、ウロン酸-２-硫酸-グルコサミン-Ｎ
-硫酸、ウロン酸-２-硫酸-グルコサミン-Ｎ，６-ジ硫酸
を生成するという独自の特異性を有しているため、ヘパ
ラン硫酸やヘパリンの生体内での機能あるいは生体成分
中のこれら物質の分析研究試薬として有用である。

【０００５】精製ヘパリチナーゼＴ-IVは、誘導剤とし
てヘパリンを添加した、ペプトン、酵母エキス、食塩を
含む培地中で酵素生産菌を培養することによって他の三
種の酵素と共に容易に生産できる。しかしながら、２０
Ｌの培養物から得られる精製ヘパリチナーゼＴ-IVは約
６単位であって、当該酵素の収率は０.７３％と低い。
そのため、低分子化ヘパリン調製時の低分子化剤とし
て、あるいは体外循環装置による治療の際問題になるヘ
パリンの副作用を軽減する素材として、工業的に使用可
能な量の酵素を得る方法が必要とされている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、バチラス サーキュランスＨｐＴ２９８株のヘパリ
チナーゼＴ-IVをコードする遺伝子の構造を明らかに
し、ヘパリチナーゼＴ-IVを遺伝子工学的手法によっ
て、純粋な形で安価かつ大量に提供する手法を確立する
ことである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題の解
決のために鋭意検討を重ねた結果、上記バチラス サー
キュランスＨｐＴ２９８株のヘパリチナーゼＴ-IVをコ
ードする遺伝子を単離して、その塩基配列を解析するに
至り、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、下記の（ａ）又は
（ｂ）のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するヘパリ
チナーゼのポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本
発明ＤＮＡともいう）を提供する。 （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列もしくは配列番号
２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜８７
６のアミノ酸配列 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、ヘパリチナーゼ活
性を実質的に害さない１以上のアミノ酸の欠失、置換も
しくは付加を有するアミノ酸配列 本発明ＤＮＡは、好ましくは、配列番号２に示すアミノ
酸配列（すなわちアミノ酸番号１〜８７６）を有するヘ
パリチナーゼのポリペプチドをコードするか、または、
配列番号２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２
７〜８７６のアミノ酸配列を有するヘパリチナーゼのポ
リペプチドをコードする。このようなＤＮＡの具体例と
しては、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１
７８〜２８０５の塩基配列を有するＤＮＡ、及び、配列
番号１に示す塩基配列における塩基番号２５６〜２８０
５の塩基配列を有するＤＮＡがある。

【０００９】また、本発明は、本発明ＤＮＡを組み込ん
だ組換えＤＮＡ（以下、本発明組換えＤＮＡともいう）
を提供する。さらに、本発明は、本発明組換えＤＮＡで
宿主細胞を形質転換することにより得られる形質転換体
（以下、本発明形質転換体ともいう）を提供する。

【００１０】さらに、また、本発明は、本発明形質転換
体を生育させ、得られた生育物からヘパリチナーゼのポ
リペプチドを採取することを特徴とするヘパリチナーゼ
のポリペプチドの製造方法（以下、本発明製造方法とも
いう）を提供する。また、本発明製造方法で得ることの
できる、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するヘパリ
チナーゼ、及び、配列番号２に示すアミノ酸配列におけ
るアミノ酸番号２７〜８７６のアミノ酸配列を有するヘ
パリチナーゼも提供する。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。 ＜１＞本発明ＤＮＡ すなわち、本発明は、下記の（ａ）又は（ｂ）のアミノ
酸配列の少なくとも一部を有するヘパリチナーゼのポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡとも
いう）を提供する。 （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列もしくは配列番号
２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜８７
６のアミノ酸配列 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、ヘパリチナーゼ活
性を実質的に害さない１以上のアミノ酸の欠失、置換も
しくは付加を有するアミノ酸配列

【００１２】本発明ＤＮＡがコードするヘパリチナーゼ
のポリペプチドのアミノ酸配列は、ヘパリチナーゼ活性
を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の欠失、置
換又は付加を有していてもよく、そのようなＤＮＡのい
ずれもが本発明のＤＮＡに包含される。該活性の測定方
法は公知であり(例えば、Linker,A. and Hovingh,P.,Me
th. in Enzymol.,28,902(1972))、当業者であれば、目
的とする酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的
に害さない１つ以上のアミノ酸残基の欠失、置換又は付
加をアミノ酸配列に有する本酵素を容易に選択すること
ができる。なお、本明細書における「欠失、置換又は付
加」には、挿入及び転移も包含される。

【００１３】本発明ＤＮＡは、好ましくは、配列番号２
に示すアミノ酸配列（すなわち、アミノ酸番号１〜８７
６）を有するヘパリチナーゼのポリペプチドをコードす
るか、または、配列番号２に示すアミノ酸配列における
アミノ酸番号２７〜８７６のアミノ酸配列を有するヘパ
リチナーゼのポリペプチドをコードする。このようなＤ
ＮＡの具体例としては、それぞれ、配列番号１に示す塩
基配列における塩基番号１７８〜２８０５の塩基配列を
有するＤＮＡ、及び、配列番号１に示す塩基配列におけ
る塩基番号２５６〜２８０５の塩基配列を有するＤＮＡ
がある。

【００１４】本発明ＤＮＡは、実施例に詳述した方法を
用いて単離することができる。即ち、概略的に示せば、
以下の手順により単離することができる。バチラス サ
ーキュランスＨｐＴ２９８株の菌体より直接全ＤＮＡを
常法により抽出し、これを適切なベクターに導入する。
次に、かかる導入ベクターを当該ベクターの種類に対応
した宿主に導入して、バチラス サーキュランスＨｐＴ
２９８株の全ＤＮＡについて遺伝子ライブラリーを調製
する。次いで、当該遺伝子ライブラリーから、ヘパリチ
ナーゼタンパク質の部分アミノ酸配列より、その塩基配
列を推定して調製した合成ヌクレオチドプローブ（配列
番号５及び６）を用いて本発明ＤＮＡを含むクローンを
選択する。そして、得られたクローンから目的ＤＮＡを
単離する。

【００１５】さらには、本発明によって明らかにされた
塩基配列に基づいて作製した当該塩基配列に相補的なオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法（Saiki,
R.etal.,Am.J.Hum.Genet.,37,172(1985)）に従って、遺
伝子を増幅させることにより上記クローニングをするこ
ともできる。

【００１６】また、上記のように、本発明ＤＮＡを再度
バチラス サーキュランスＨｐＴ２９８株から調製する
ことも可能であるが、本発明によりその塩基配列が明ら
かにされたので、これを直接ＤＮＡ合成装置で化学合成
することも可能である。

【００１７】アミノ酸配列へのヘパリチナーゼ活性を実
質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の欠失、置換又
は付加は、例えば、そのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａに、そのような欠失、置換又は付加を起こすような、
ヌクレオチドの欠失、置換又は付加を導入することによ
って得ることができる。ヌクレオチドの欠失、置換又は
付加は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両
側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列
の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに導入
することができる。また、部位特異的変異法（Kramer,
W. and Frits,H.J.,Meth. in Enzymol., 154, 350(198
7);Kunkel,T.A. et al., Meth. in Enzymol.,154,367(1
987)）などの方法によっても、ＤＮＡにヌクレオチドの
欠失、置換又は付加を導入することができる。

【００１８】なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基
配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されること
は、当業者であれば容易に理解されるところである。本
明細書において「アミノ酸配列の少なくとも一部を有す
る」とは、好ましくは、ヘパリチナーゼ活性を有する、
抗原性を有するなどの何らかの活性ないし機能を有する
部分、あるいは、その部分に対応する塩基配列がそのヘ
パリチナーゼに特異的であって、プライマーやプローブ
として使用できる部分を有することを意味する。

【００１９】本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的
なＤＮＡまたはＲＮＡも包含される。さらに本発明のＤ
ＮＡは、ヘパリチナーゼのポリペプチドをコードするコ
ード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖及びこ
れと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖から
なる二本鎖であってもよい。

【００２０】＜２＞本発明組換えＤＮＡ 本発明組換えＤＮＡは、本発明ＤＮＡが組み込まれたこ
とを特徴とし、一般には、組み込み用ベクターに本発明
ＤＮＡを組み込んだものである。

【００２１】本発明組換えＤＮＡの基本となる組み込み
用ベクターは、本発明ＤＮＡの導入を企画する宿主の種
類に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主と
して大腸菌を用いる場合には、pBR322やpUC18等のColE1
系のもの、pACYC177やpACYC188等のp15A系のもの、ミニ
Ｆ等のＦ因子系のもの、pSC101等のＲ因子系のものなど
の各種ベクターを、また、上記ベクターの他に、EMBL3,
4やλgt10,11等のファージベクターや、pKY2662、pCOS1
-10、HormerIII等のコスミド等をも組み込み用ベクター
として用いることができる。また、酵母を宿主として用
いる場合には、2μｍＤＮＡ由来のYEp系やarsを用いたY
Rp系、arsもしくは、2μｍ系にセントロメア配列を付加
したYCp系、染色体への組み込み型であるYIp系のベクタ
ー等を組み込み用ベクターとして用いることができる。
さらに、枯草菌を宿主として用いる場合には、UB110やp
HY300PLK等の大腸菌とのシャトルベクターを組み込み用
ベクターとして用いることができる。これらの組み込み
用ベクターへの本発明ＤＮＡの組み込みは公知の方法に
従って行うことができる。

【００２２】本発明組換えＤＮＡの構築に際して、例え
ば、大腸菌では、ヘパリチナーゼの構造遺伝子の上流に
プロモーター配列、ＳＤ配列等が位置するように設計す
るのが通常である。真核生物用のベクターを組み込み用
ベクターとして採用する場合には、上記と同様に、プロ
モーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部
位等が含まれるように設計するのが通常である。

【００２３】なお、上記の遺伝子発現を企画した部位を
既に備えた組み込み用ベクターは、既に市販されてい
る。例えば、昆虫細胞における発現を企画する場合に
は、例えばバキュロウィールスの発現系においては、大
腸菌とのシャトルベクターであるpAc373,pAcYM1もしく
はその誘導体等を組み込み用ベクターとして用いること
ができる。

【００２４】なお、ヘパリチナーゼのポリペプチドの発
現様式は必ずしも単独発現系に限定されるものでなく、
例えば、融合タンパク質発現系を企画したベクターを設
計することができる。

【００２５】＜３＞本発明形質転換体 本発明形質転換体は、宿主細胞を本発明組換えＤＮＡで
形質転換して得ることができる。宿主細胞としては大腸
菌等の原核細胞や、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等
の真核細胞が例示される。本発明組換えＤＮＡの宿主細
胞への導入、及び、これによる形質転換の方法は、通常
一般に用いられる方法を採用することができる。例え
ば、宿主細胞として大腸菌を用いる場合には、宿主細胞
の対数増殖期にある細胞を集め、CaCl₂処理して自然に
ＤＮＡを取り込みやすい状態にして、かかる処理細胞に
上記ベクターを取り込ませる方法等を採用することがで
きる。なお、かかる方法において、形質転換率を向上さ
せるために、MgCl₂やRbClをさらに共存させて、形質転
換・形質導入を行うこともできる。

【００２６】＜４＞本発明製造方法 本発明製造方法は、本発明形質転換体を生育させ、得ら
れた生育物からヘパリチナーゼのポリペプチドを採取す
ることを特徴とするヘパリチナーゼのポリペプチドの製
造方法である。生育の具体的方法としては培養が最も好
ましいが、動植物体内で生育させたり、動植物体そのも
のとして生育させることもできる。

【００２７】生育の方法として培養を用いる場合、本発
明ＤＮＡを保持する細胞を、好適な培地で培養し、本発
明ＤＮＡがコードするヘパリチナーゼのポリペプチドを
培養物中に生成蓄積させ、その培養物から該ポリペプチ
ドを採取することによって、ヘパリチナーゼのポリペプ
チドを製造することができる。

【００２８】培養に用いられる培地は、通常の細胞培養
に慣用される各種の培地のいずれをも用いることができ
る。例えば、ＬＢ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等、または、
当該培地に通常知られている各種の炭素源、窒素源、無
機塩類、ビタミン類等を添加した上記の培地、例えば、
ＬＢ培地等を用いて培養することが望ましい。また、当
該培地には培養における適切な時期に、イソプロピルβ
-Ｄ（-）-チオガラクトピラノサイド（IPTG）等のラク
トース（Lac）・プロモーターの働きを強めるための薬
剤を添加することもできる。

【００２９】培養物からの本発明ポリペプチドの採取
は、単離・精製の常法に従い実行することが可能であ
る。特に、ヘパリチナーゼのポリペプチドを宿主から抽
出する場合は、例えば、浸透圧ショック法、リゾチーム
消化法等の温和な条件を採用することが、その高次構造
保持の面からより好ましい。ヘパリチナーゼの単離・精
製は、例えば、当該ポリペプチドの物理・化学的性質を
利用した各種の処理操作に従い実施できる（例えば、
「生化学データブックII」pp1175-1259、第１版・第１
刷、1980年6月23日、株式会社東京化学同人発行を参照
のこと。）。当該方法としては、例えば、具体的には通
常のタンパク質沈殿剤による処理、遠心分離、透析、限
外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動法またはこ
れらの組み合わせ等を採用できる。なお、培養物には、
培地及び当該培地中の細胞が包含される。

【００３０】本発明製造方法によれば、例えば、配列番
号２に示すアミノ酸配列を有するヘパリチナーゼ、及
び、配列番号２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番
号２７〜８７６のアミノ酸配列を有するヘパリチナーゼ
を、それぞれ、配列番号１に示す塩基配列における塩基
番号１７８〜２８０５、及び、配列番号２に示す塩基配
列における塩基番号２５６〜２８０５の塩基配列を有す
る本発明ＤＮＡを用いることによって、得ることができ
る。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。 ＜１＞バチラス サーキュランスＨｐＴ２９８株のゲノ
ム(Genomic)ＤＮＡの調製 Saito-Miura（Saito,H and Miura,K.,Biochim.Biophys.
Acta,72,618(1963)）の方法に従って、バチラス サーキ
ュランスＨｐＴ２９８株のGenomic DNAの調製を行っ
た。バチラス サーキュランスＨｐＴ２９８株を生育培
地（0.75％ポリペプトン，0.5％酵母エキス，0.1％K₂HP
O₄，0.02％MgSO₄・7H₂O，0.1％NaCl,pH7.0）で37℃恒温
振蘯培養器中一晩培養し、菌体を得た。得られた菌体
（湿菌体重量約5ｇ）を6ｍｌのリゾチーム溶液（2mg/ml
in 0.15M NaCl-0.1M EDTA, pH8.0）に懸濁し、37℃で
約30分間保温した。溶菌を確認後、50ｍｌの100mMトリ
ス塩酸（pH9.0）-1％SDS-0.1M NaCl溶液を加え、60℃の
温浴中で、完全に溶菌させた。続いて、約60ｍｌの飽和
フェノール（使用直前に上記の緩衝液で飽和させた）を
加え、20分間攪拌した後に、遠心分離し、水層を回収し
た。この水層に冷却エタノール（-80℃）を1/10量加
え、糸状に現われるDNAをガラス棒で回収した。回収し
たDNAは70，80，90％エタノールに順次浸した後、約30
ｍｌの0.1×SSC（0.15MNaCl-0.015M クエン酸ナトリウ
ム）に溶解した。DNAが完全に解けたことを確認後、10
×SSCを加えて1×SSCの濃度に調整した。加熱処理（DNa
seを失活させるため）をしたRNaseを最終濃度50μg/ml
になるように加えた後、37℃で30分間保温した。この溶
液を上記条件で再度エタノール沈殿処理し、得られたDN
Aを5ｍｌの1×SSCに溶解した。

【００３２】＜２＞合成DNAプローブの調製 精製ヘパリチナーゼ T-IVを臭化シアン処理することに
よって得られるペプチドをSDS-PAGEで分離し、ＰＶＤＦ
膜に転写した。得られた断片のペプチドI、II及びIII
（分子量は、それぞれ、15万、20万、10万）並びにその
ままの酵素のＮ−末端アミノ酸配列をプロテインシーク
エンサー（Applied Biosystems社製，Model 476A）によ
り分析した。その結果、ペプチドI及びIIIのＮ−末端ア
ミノ配列が決定された（配列番号３及び配列番号４）。
ペプチドIIとそのままの酵素のＮ−末端アミノ酸配列分
析はできず、何らかの形でＮ−末端がブロックされてい
る可能性が示された。ペプチドIとIIIのＮ−末端アミノ
酸配列をもとにして、配列番号５及び配列番号６に示す
塩基配列をそれぞれ有する合成DNAプローブI及びIIを設
計し（図１）、DNA合成装置（（株）日本遺伝子研究所
製）で合成した。なお、配列番号５及び６において"N"
で示される塩基はヒポキサンチン(I)である。

【００３３】＜３＞スクリーニング 上記＜１＞で得たバチラス サーキュランスＨｐＴ２９
８株のGenomic DNAを制限酵素のBamHI、EcoRI、HindII
I, PstI及びSalIを用いて完全分解し、アガロースゲル
電気泳動にて分離した後、ニトロセルロースフィルター
上にDNA断片をブロッティングした。フィルターは必要
な部分を切り出し、ゲルを除いた後に、60〜70℃で2時
間焼き付けを行った。各合成プローブとのハイブリダイ
ズ条件は42℃とし、洗浄条件は、Primary washing buff
er（6M urea,0.4% SDS,0.1×SSC）による洗浄が42℃で2
回、Secondary washing buffer（2×SSC）による洗浄が
室温で5分間を2回とした。

【００３４】その結果、プローブIとハイブリダイズす
るDNA断片を各種制限酵素処理物からそれぞれ、1バンド
ずつ得た（BamHI:4.8kb, EcoRI:5.4kb, HindIII:6.2kb,
PstI:9.9kb, SalI:1.4kb）。なお、プローブIIでは、
非特異的なバンドが検出され、解析は困難であった。

【００３５】プローブIとハイブリダイズするSalI断片
（1.4kb）をプラスミドpUC18に組み込み、これにより大
腸菌DH5αMCRを形質転換してDNAライブラリーを作製
し、プローブIを用いたコロニーハイブリダイゼーショ
ンによってSalI断片（1.4kb）を含むプラスミドpHEP1.4
を得た。SalI断片（1.4kb）の下記に述べる塩基配列の
解析から、本断片のなかにBamHIサイトが存在すること
が明かとなったので、BamHI断片（4.8kb）のなかに当該
遺伝子の全塩基配列が存在することが示唆された。

【００３６】そこで、このBamHI断片（4.8kb）をプラス
ミドpUC18に組み込み、これにより大腸菌DH5αMCRを形
質転換してDNAライブラリーを作製し、SalI断片を用い
たコロニーハイブリダイゼーションによってBamHI断片
（4.8kb）を含むプラスミドpHEP4.8を得た。

【００３７】クローン化したBamHI断片（4.8kb）に当該
遺伝子が存在することは下記に述べる塩基配列の決定に
よって確かめた。

【００３８】＜４＞塩基配列の決定 上記プラスミドpHEP1.4とプラスミドpHEP4.8は通常公知
の方法に従って分離し、プラスミドpHEP1.4にクローン
化したSalI断片（1.4kb）はその両末端からSanger法に
従って、塩基配列を解析した。また、プラスミドpHEP4.
8にクローン化したBamI断片（4.8kb）はBamI-HindIII断
片（2.5kb）、HinbIII-BamI断片（2.3kb）、SalI-HindI
II断片（1.2kb）にサブクローニングした後に、それぞ
れの断片について両末端からSanger法に従って、塩基配
列を解析した。その結果、ヘパリチナーゼT-IVをコード
する遺伝子を含む塩基配列が決定された（配列番号
１）。シークエンスキットはSequiTherm（エアブラウン
社製）を用い、塩基配列の決定はDNAシーケンサー Mode
l 4000（LI-COR社製）を使用した。

【００３９】かかる塩基配列の決定により、当該ヘパリ
チナーゼをコードする遺伝子には、潜在的ＳＤ領域（配
列番号１の塩基配列における塩基番号171〜175）が存在
することが判明した。

【００４０】さらに、配列番号２のアミノ酸配列におけ
るアミノ酸番号1〜26にシグナルペプチド配列と推定で
きる疎水性アミノ酸を多く含んだ配列が存在する。従っ
て、配列番号１の塩基配列における塩基番号178〜2805
がヘパリチナーゼ前駆体、塩基番号256〜2805がヘパリ
チナーゼ成熟体に対応すると考えられる。当該塩基配列
から推定されるアミノ酸配列は、配列番号２におけるア
ミノ酸番号１〜876（ヘパリチナーゼ前駆体）、アミノ
酸番号27〜876（ヘパリチナーゼ成熟体）のアミノ酸配
列である。

【００４１】＜５＞ヘパリチナーゼ T-IVをコードする
ＤＮＡを含むベクター及び形質転換体の調製 上記ヘパリチナーゼ遺伝子領域を含むBamHI断片（4.8k
b）をアガロースゲル電気泳動で分離し、単離・精製し
た。プラスミドpUC18のマルチクローニングサイト上のB
amHIサイトに精製BamHI断片（4.8kb）を挿入し、ベクタ
ー pHEP4.8を調製した。このpHEP4.8で大腸菌DH5αMCR
を形質転換した。次いで、この大腸菌（E. coli DH5αM
CR/pHEP4.8）をアンピシリンを含むＬＢ培地（1％ポリ
ペプトン，0.5％酵母エキス，0.5％NaCl，ｐＨ7.5）で
培養した。

【００４２】

【発明の効果】本発明により、バチラス サーキュラン
スＨｐＴ２９８株の生産するヘパリチナーゼ T-IVをコ
ードする遺伝子の構造が明らかにされ、これに基づき、
ヘパリチナーゼT-IVを、遺伝子工学的手法によって、純
粋な形で安価かつ大量に提供する技術が確立される。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：3260 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：バチラス サーキュランス 株名：ＨｐＴ298 (FERM P-11983) 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：178..2808 配列の特徴 特徴を表す記号：mat_petide 存在位置：256..2805 配列 GTCGACGGCA AGGCGACCTT TCGCCTCGGA TCCGAGCAGG AAATCAACTC GAACAATCCG 60 AGGTACGTTT TCGAAATCGG CATCAACTTC ACCGGCTGGC GGGGCATGTG GATTCAGTTC 120 AGGGAAGACG GCGCTTACGA CGGCTACAAG GGGGACGGGA AGGCACCCCT GGAGGTG 177 ATG GAA ATC ATT CCG CCC GCT GCG GCG CCT CAA GGC AGC TTG TTT TTC 225 Met Glu Ile Ile Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gln Gly Ser Leu Phe Phe 1 5 10 15 GAT GTG GTG GAA TTC GAG GGC ACG ATT CCC GCG ACG CGC TCG ACC GAC 273 Asp Val Val Glu Phe Glu Gly Thr Ile Pro Ala Thr Arg Ser Thr Asp 20 25 30 TAC CAG GTG CCG TAC GAC CGC AAG CGC TCC AAC GAC GGG ATG GGC GGA 321 Tyr Gln Val Pro Tyr Asp Arg Lys Arg Ser Asn Asp Gly Met Gly Gly 35 40 45 ACG TGG GAC CGG AGC TAC TAC TGG AGC CAA ATG AAG CCG GAC CTT CCG 369 Thr Trp Asp Arg Ser Tyr Tyr Trp Ser Gln Met Lys Pro Asp Leu Pro 50 55 60 CTT GCG GAC CGG ATC ACG CCG GAG CAG TCG CGG GCG TTC GAA ACG ATA 417 Leu Ala Asp Arg Ile Thr Pro Glu Gln Ser Arg Ala Phe Glu Thr Ile 65 70 75 80 GCC AAA CGG TAC GAA GGC TGG ATT TAC GGC GAG CAT CCG GAT CTG ACC 465 Ala Lys Arg Tyr Glu Gly Trp Ile Tyr Gly Glu His Pro Asp Leu Thr 85 90 95 CGG GAG CCG CTC CGC ATT CGC AAC AGC GCG CTG CAA TCG TTC ATT GCC 513 Arg Glu Pro Leu Arg Ile Arg Asn Ser Ala Leu Gln Ser Phe Ile Ala 100 105 110 AAA GGG CTG CAA AAA TAC GCG CAG CTC GGC TTG AAT AGG GAC GGC AAC 561 Lys Gly Leu Gln Lys Tyr Ala Gln Leu Gly Leu Asn Arg Asp Gly Asn 115 120 125 GGA TAC ATT ACC GGT CCT CCG CTG TTT TCC AGC CGT TCG ACG CAC GGG 609 Gly Tyr Ile Thr Gly Pro Pro Leu Phe Ser Ser Arg Ser Thr His Gly 130 135 140 CCG GAG TTC GGC GAG GAT GTG GCC AAG ACG ATC TTT CTG CCG CTC GTG 657 Pro Glu Phe Gly Glu Asp Val Ala Lys Thr Ile Phe Leu Pro Leu Val 145 150 155 160 TTC GAT TAC AAG ATC AAC GGC CGT CAG GAA AGC AAA AAC AAG GTG CTC 705 Phe Asp Tyr Lys Ile Asn Gly Arg Gln Glu Ser Lys Asn Lys Val Leu 165 170 175 GAC CTG TTC GAT TAC TTT CAC GAC CAG GGC TGG GCG GAC GGC AGC GGT 753 Asp Leu Phe Asp Tyr Phe His Asp Gln Gly Trp Ala Asp Gly Ser Gly 180 185 190 CTG GAA ACG CTC GAT CAC GAG ACG AAC CGG ACG AAC GGG TAT TTT CAC 801 Leu Glu Thr Leu Asp His Glu Thr Asn Arg Thr Asn Gly Tyr Phe His 195 200 205 GCC GTC TAC TTG ATG CGT AAA GAG CTT CAA GAA TCC GGC CGG CTT GAC 849 Ala Val Tyr Leu Met Arg Lys Glu Leu Gln Glu Ser Gly Arg Leu Asp 210 215 220 CGC GAG CTG CCG ACC GTC CGC TGG TTT ACG AAT TTC GGA AAA ACG TAC 897 Arg Glu Leu Pro Thr Val Arg Trp Phe Thr Asn Phe Gly Lys Thr Tyr 225 230 235 240 ATC GCC GAT CCC GGG GAG ACG ACG GCC GAT GAA ATC CGC ACC AAA TTC 945 Ile Ala Asp Pro Gly Glu Thr Thr Ala Asp Glu Ile Arg Thr Lys Phe 245 250 255 ATG TAT GAG CTG CTG TAC GTG CTG GCG CTC GAC GAC GGT CCC GCA AAA 993 Met Tyr Glu Leu Leu Tyr Val Leu Ala Leu Asp Asp Gly Pro Ala Lys 260 265 270 GTG CGC GAG ATG CAG AGC TTG CTG CGC TGG ATG AAT CAT GCG CTG GCC 1041 Val Arg Glu Met Gln Ser Leu Leu Arg Trp Met Asn His Ala Leu Ala 275 280 285 GTC GCT ACC GGC TTT GCC GGA ACG ATC AAG GAC GAC TTC ATG GGA TTT 1089 Val Ala Thr Gly Phe Ala Gly Thr Ile Lys Asp Asp Phe Met Gly Phe 290 295 300 CAT CAC AGG GGC GTT TAC ATG AGC GCG TAT GCG CGG CAA GCG TTT CAT 1137 His His Arg Gly Val Tyr Met Ser Ala Tyr Ala Arg Gln Ala Phe His 305 310 315 320 ATG GCT GCC TTG ATC GCT TAT TTG CTG CAC GAT ACG CCG TTT GCT CTT 1185 Met Ala Ala Leu Ile Ala Tyr Leu Leu His Asp Thr Pro Phe Ala Leu 325 330 335 TCC AAG CAA TCG ACG GAT AAC ATG CCG AAA CGC GCT GCT GAC TTT TCG 1233 Ser Lys Gln Ser Thr Asp Asn Met Pro Lys Arg Ala Ala Asp Phe Ser 340 345 350 GAC GGT GGC GAA CAA ATA CGA CGT GCC GGT GGC CTC AGC GGC CGC TTT 1281 Asp Gly Gly Glu Gln Ile Arg Arg Ala Gly Gly Leu Ser Gly Arg Phe 355 360 365 CCG GCC AAG GAC GGC GTG GCG AAC GAA ATC GTG CCG GCT TAC GCC TAT 1329 Pro Ala Lys Asp Gly Val Ala Asn Glu Ile Val Pro Ala Tyr Ala Tyr 370 375 380 ATG GCG CTG GCG AGC GAG CCC GTC GAC CGG GAG ATG GCC GGG GCG TTC 1377 Met Ala Leu Ala Ser Glu Pro Val Asp Arg Glu Met Ala Gly Ala Phe 385 390 395 400 ATG CGG CTG TGG GAC CCG AGT TCG CCC TAC TTG AAG CAG GGG CTG TTC 1425 Met Arg Leu Trp Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Leu Lys Gln Gly Leu Phe 405 410 415 CCC AAA GCC GAT AGC GGC GAC GTG TCC TAT CTG GAC ACA ATA GGC GGA 1473 Pro Lys Ala Asp Ser Gly Asp Val Ser Tyr Leu Asp Thr Ile Gly Gly 420 425 430 CTT CAG CTC GCG CTG AAG CTG GCG GAT CAA GGA TTC GCG CCG GAA AAA 1521 Leu Gln Leu Ala Leu Lys Leu Ala Asp Gln Gly Phe Ala Pro Glu Lys 435 440 445 AGC CCG CAG TTC TGG ATG AAG CCG TCC GCC GCC TTC GCG GTC ATG CGC 1569 Ser Pro Gln Phe Trp Met Lys Pro Ser Ala Ala Phe Ala Val Met Arg 450 455 460 CGC GAC GAT TGG GCG GTG TCG GTG AAG GGC TGG AGC CAG TAC GTA TTC 1617 Arg Asp Asp Trp Ala Val Ser Val Lys Gly Trp Ser Gln Tyr Val Phe 465 470 475 480 GAC TTC GAA TCG CAG GCG CCG AAA GCG GCC GAT TCC GCG CAG AAG GCG 1665 Asp Phe Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ala Asp Ser Ala Gln Lys Ala 485 490 495 CTG GCC GGA CAA AAC GTG TTC GGC CGG TAC GCG AGC TAC GGC GCC ATG 1713 Leu Ala Gly Gln Asn Val Phe Gly Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Ala Met 500 505 510 CAG GTG ATG GCC GCC GGC GAT CCG ATC AAC AAA GCG AAT AAC GGA TAC 1761 Gln Val Met Ala Ala Gly Asp Pro Ile Asn Lys Ala Asn Asn Gly Tyr 515 520 525 GGC CTC GAT AAC GGC TGG GAC TGG AAC CGC TGG CCC GGC GCG ACG ACG 1809 Gly Leu Asp Asn Gly Trp Asp Trp Asn Arg Trp Pro Gly Ala Thr Thr 530 535 540 ATC CGG TTG CCC TGG GAG CGG CTC GGC GTA TCG AAG GAT CGC CCG CAA 1857 Ile Arg Leu Pro Trp Glu Arg Leu Gly Val Ser Lys Asp Arg Pro Gln 545 550 555 560 ACC CGT TCG TTT ACG GAC CAA ACG TTC GTG GGC GGA GTC GAA AGC GAA 1905 Thr Arg Ser Phe Thr Asp Gln Thr Phe Val Gly Gly Val Glu Ser Glu 565 570 575 GGG AAA GAC GGC ATT TTC GCG ATG AAG CTG CAC GAT ACG GTG TAC GAC 1953 Gly Lys Asp Gly Ile Phe Ala Met Lys Leu His Asp Thr Val Tyr Asp 580 585 590 AAG TCG TTT CGA GCC GAA AAG TCC GTA TTT TTT CTC GAT AAC GAG GTC 2001 Lys Ser Phe Arg Ala Glu Lys Ser Val Phe Phe Leu Asp Asn Glu Val 595 600 605 ATT GCG CTC GGC TCC GGC ATT CAT AAC GAC GAC GGC GCC CAC TCG ACG 2049 Ile Ala Leu Gly Ser Gly Ile His Asn Asp Asp Gly Ala His Ser Thr 610 615 620 GAA ACG ACG CTG TTT CAA TCG TAC ATG AAA GAT ACG GGC ATG CCG ATT 2097 Glu Thr Thr Leu Phe Gln Ser Tyr Met Lys Asp Thr Gly Met Pro Ile 625 630 635 640 CGG ACG GGT TCG GCC GGT TCC GCC GAA ACG ATC GCG GAG TTT CCT TAC 2145 Arg Thr Gly Ser Ala Gly Ser Ala Glu Thr Ile Ala Glu Phe Pro Tyr 645 650 655 CGT CGG GAC TTC AAG CCC AAA GAA AAC GTA TGG CTC ATG GAC CCG TAC 2193 Arg Arg Asp Phe Lys Pro Lys Glu Asn Val Trp Leu Met Asp Pro Tyr 660 665 670 GGC AAC GAT ATA TCG TAC CGA TGC GGA GGG TGC GCC TTG AAC GAA GCA 2241 Gly Asn Asp Ile Ser Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Ala Leu Asn Glu Ala 675 680 685 AGC AGT CGT CGC CCG ATT AGA GCG GTA AAA AAA CGA CGA CCG GCA GCT 2289 Ser Ser Arg Arg Pro Ile Arg Ala Val Lys Lys Arg Arg Pro Ala Ala 690 695 700 ACA GCA CCG CCT GGA TCG ATC ACG GCA CGA AGC CGA AGG GTG CGG GCT 2337 Thr Ala Pro Pro Gly Ser Ile Thr Ala Arg Ser Arg Arg Val Arg Ala 705 710 715 720 ACG AAT ATG CGA TGC TCG TGC AGG CTT CTC CCG AGC AGG TGC GGA AAT 2385 Thr Asn Met Arg Cys Ser Cys Arg Leu Leu Pro Ser Arg Cys Gly Asn 725 730 735 ACG CGG AGT CGC CGG GCT ATG AGG TGC TTC GAA AAG ACA GCC AGG CTC 2433 Thr Arg Ser Arg Arg Ala Met Arg Cys Phe Glu Lys Thr Ala Arg Leu 740 745 750 ATA TCG TCA GAC ATG CGA AGA AGC GCG CGC TCG GAT ACG TCA TTT TCG 2481 Ile Ser Ser Asp Met Arg Arg Ser Ala Arg Ser Asp Thr Ser Phe Ser 755 760 765 ATG CGG CGG CGG AAA TGC AGG GCG GCA TCG TCC GGA AAG CAG GCC GGC 2529 Met Arg Arg Arg Lys Cys Arg Ala Ala Ser Ser Gly Lys Gln Ala Gly 770 775 780 CGG CGA TCA TTA TGG AAA AAC AAA AGG AGA ACG GAA TCG TTC TCA GCG 2577 Arg Arg Ser Leu Trp Lys Asn Lys Arg Arg Thr Glu Ser Phe Ser Ala 785 790 795 800 TCG CCG ATC CGG ATC TGC GCC TGC CCA AGC TTC CCG ACC AAA GAA TGG 2625 Ser Pro Ile Arg Ile Cys Ala Cys Pro Ser Phe Pro Thr Lys Glu Trp 805 810 815 ACG ACG GCG TSC GCT GAC GCT GGW ACG GCG GAG ACG GTG CGG GTC GAG 2673 Thr Thr Ala Xaa Ala Asp Ala Xaa Thr Ala Glu Thr Val Arg Val Glu 820 825 830 CTG AAA GGA AGC TGG CAG CCG GGA CAG CCG CTT CCG GCC GGC ATC CGT 2721 Leu Lys Gly Ser Trp Gln Pro Gly Gln Pro Leu Pro Ala Gly Ile Arg 835 840 845 CTG ACG GGT AAC GGC CCG GAT ACG ACC GTG CTG GAG TTC GAT TGC ATA 2769 Leu Thr Gly Asn Gly Pro Asp Thr Thr Val Leu Glu Phe Asp Cys Ile 850 855 860 GGC GGA AAA TCG TTG GAA TTG CTC CTG GCA GCC CGG TAATGCGGGA 2815 Gly Gly Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Ala Ala Arg 865 870 875 CTCGCCGTGC GCTCGGGATG AAAAGGGCGG CCAATTCCCA ACTGCTGACG ATTTCGTCGA 2875 CCGGCAAGCA TAAAGAGATG GCATCGCAAG GCGGTGGATC GGGCCAAAAA GGCGATCGCC 2935 GCGGAGGCGC CCGATCGGCC AAATGAGAAG GCGTCCGGAG CCGGGAGATA AAGCGAATGA 2995 AGCCGGACGC GGACGGCACA ATGAAAAAGG AGATGACGGC AGATGGATGT TGACGATCGA 3055 AAAGAAGGAG CCGGGCATTC GGCGGGAGAA TCGGCGTCCG TATCCGTTTC TGTATCGGCG 3115 CGGGAAACGG CGCAATTCGA GGACGACGGC ACGTTCGGGA GAGCGCAATC GTTCGAAGGC 3175 GCGATAGTTC CGCCCGAATT CAGGCGCAGG GAGGCGGGTC GCTTCGGCTG TCCGACGCCC 3235 ATTACAAGCA CGGCCGCCAA TTCTT 3260

【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：876 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Ile Ile Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gln Gly Ser Leu Phe Phe 1 5 10 15 Asp Val Val Glu Phe Glu Gly Thr Ile Pro Ala Thr Arg Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Gln Val Pro Tyr Asp Arg Lys Arg Ser Asn Asp Gly Met Gly Gly 35 40 45 Thr Trp Asp Arg Ser Tyr Tyr Trp Ser Gln Met Lys Pro Asp Leu Pro 50 55 60 Leu Ala Asp Arg Ile Thr Pro Glu Gln Ser Arg Ala Phe Glu Thr Ile 65 70 75 80 Ala Lys Arg Tyr Glu Gly Trp Ile Tyr Gly Glu His Pro Asp Leu Thr 85 90 95 Arg Glu Pro Leu Arg Ile Arg Asn Ser Ala Leu Gln Ser Phe Ile Ala 100 105 110 Lys Gly Leu Gln Lys Tyr Ala Gln Leu Gly Leu Asn Arg Asp Gly Asn 115 120 125 Gly Tyr Ile Thr Gly Pro Pro Leu Phe Ser Ser Arg Ser Thr His Gly 130 135 140 Pro Glu Phe Gly Glu Asp Val Ala Lys Thr Ile Phe Leu Pro Leu Val 145 150 155 160 Phe Asp Tyr Lys Ile Asn Gly Arg Gln Glu Ser Lys Asn Lys Val Leu 165 170 175 Asp Leu Phe Asp Tyr Phe His Asp Gln Gly Trp Ala Asp Gly Ser Gly 180 185 190 Leu Glu Thr Leu Asp His Glu Thr Asn Arg Thr Asn Gly Tyr Phe His 195 200 205 Ala Val Tyr Leu Met Arg Lys Glu Leu Gln Glu Ser Gly Arg Leu Asp 210 215 220 Arg Glu Leu Pro Thr Val Arg Trp Phe Thr Asn Phe Gly Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Ile Ala Asp Pro Gly Glu Thr Thr Ala Asp Glu Ile Arg Thr Lys Phe 245 250 255 Met Tyr Glu Leu Leu Tyr Val Leu Ala Leu Asp Asp Gly Pro Ala Lys 260 265 270 Val Arg Glu Met Gln Ser Leu Leu Arg Trp Met Asn His Ala Leu Ala 275 280 285 Val Ala Thr Gly Phe Ala Gly Thr Ile Lys Asp Asp Phe Met Gly Phe 290 295 300 His His Arg Gly Val Tyr Met Ser Ala Tyr Ala Arg Gln Ala Phe His 305 310 315 320 Met Ala Ala Leu Ile Ala Tyr Leu Leu His Asp Thr Pro Phe Ala Leu 325 330 335 Ser Lys Gln Ser Thr Asp Asn Met Pro Lys Arg Ala Ala Asp Phe Ser 340 345 350 Asp Gly Gly Glu Gln Ile Arg Arg Ala Gly Gly Leu Ser Gly Arg Phe 355 360 365 Pro Ala Lys Asp Gly Val Ala Asn Glu Ile Val Pro Ala Tyr Ala Tyr 370 375 380 Met Ala Leu Ala Ser Glu Pro Val Asp Arg Glu Met Ala Gly Ala Phe 385 390 395 400 Met Arg Leu Trp Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Leu Lys Gln Gly Leu Phe 405 410 415 Pro Lys Ala Asp Ser Gly Asp Val Ser Tyr Leu Asp Thr Ile Gly Gly 420 425 430 Leu Gln Leu Ala Leu Lys Leu Ala Asp Gln Gly Phe Ala Pro Glu Lys 435 440 445 Ser Pro Gln Phe Trp Met Lys Pro Ser Ala Ala Phe Ala Val Met Arg 450 455 460 Arg Asp Asp Trp Ala Val Ser Val Lys Gly Trp Ser Gln Tyr Val Phe 465 470 475 480 Asp Phe Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ala Asp Ser Ala Gln Lys Ala 485 490 495 Leu Ala Gly Gln Asn Val Phe Gly Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Ala Met 500 505 510 Gln Val Met Ala Ala Gly Asp Pro Ile Asn Lys Ala Asn Asn Gly Tyr 515 520 525 Gly Leu Asp Asn Gly Trp Asp Trp Asn Arg Trp Pro Gly Ala Thr Thr 530 535 540 Ile Arg Leu Pro Trp Glu Arg Leu Gly Val Ser Lys Asp Arg Pro Gln 545 550 555 560 Thr Arg Ser Phe Thr Asp Gln Thr Phe Val Gly Gly Val Glu Ser Glu 565 570 575 Gly Lys Asp Gly Ile Phe Ala Met Lys Leu His Asp Thr Val Tyr Asp 580 585 590 Lys Ser Phe Arg Ala Glu Lys Ser Val Phe Phe Leu Asp Asn Glu Val 595 600 605 Ile Ala Leu Gly Ser Gly Ile His Asn Asp Asp Gly Ala His Ser Thr 610 615 620 Glu Thr Thr Leu Phe Gln Ser Tyr Met Lys Asp Thr Gly Met Pro Ile 625 630 635 640 Arg Thr Gly Ser Ala Gly Ser Ala Glu Thr Ile Ala Glu Phe Pro Tyr 645 650 655 Arg Arg Asp Phe Lys Pro Lys Glu Asn Val Trp Leu Met Asp Pro Tyr 660 665 670 Gly Asn Asp Ile Ser Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Ala Leu Asn Glu Ala 675 680 685 Ser Ser Arg Arg Pro Ile Arg Ala Val Lys Lys Arg Arg Pro Ala Ala 690 695 700 Thr Ala Pro Pro Gly Ser Ile Thr Ala Arg Ser Arg Arg Val Arg Ala 705 710 715 720 Thr Asn Met Arg Cys Ser Cys Arg Leu Leu Pro Ser Arg Cys Gly Asn 725 730 735 Thr Arg Ser Arg Arg Ala Met Arg Cys Phe Glu Lys Thr Ala Arg Leu 740 745 750 Ile Ser Ser Asp Met Arg Arg Ser Ala Arg Ser Asp Thr Ser Phe Ser 755 760 765 Met Arg Arg Arg Lys Cys Arg Ala Ala Ser Ser Gly Lys Gln Ala Gly 770 775 780 Arg Arg Ser Leu Trp Lys Asn Lys Arg Arg Thr Glu Ser Phe Ser Ala 785 790 795 800 Ser Pro Ile Arg Ile Cys Ala Cys Pro Ser Phe Pro Thr Lys Glu Trp 805 810 815 Thr Thr Ala Xaa Ala Asp Ala Xaa Thr Ala Glu Thr Val Arg Val Glu 820 825 830 Leu Lys Gly Ser Trp Gln Pro Gly Gln Pro Leu Pro Ala Gly Ile Arg 835 840 845 Leu Thr Gly Asn Gly Pro Asp Thr Thr Val Leu Glu Phe Asp Cys Ile 850 855 860 Gly Gly Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Ala Ala Arg 865 870 875

【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Pro Asp Leu Pro Leu Ala Asp Arg Ile Thr Pro Glu Gln 1 5 10

【００４６】配列番号：４ 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ala Gly Asp Pro Ile Asn Pro Ala Pro Glu Gly Tyr Gly Leu 1 5 10 15

【００４７】配列番号：５ 配列の長さ：44 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGAARCCNG AYYTNCCNYT NGCNGAYMGN ATHACNCCNG ARCA 44

【００４８】配列番号：６ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTNGCNGGNG AYCCNATHAA YCC 23

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用
したプローブを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:09） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列
   の少なくとも一部を有するヘパリチナーゼのポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列もしくは配列番号
   ２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７〜８７
   ６のアミノ酸配列 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、ヘパリチナーゼ活
   性を実質的に害さない１以上のアミノ酸の欠失、置換も
   しくは付加を有するアミノ酸配列
2. 【請求項２】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   ヘパリチナーゼのポリペプチドをコードする請求項１に
   記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列における
   アミノ酸番号２７〜８７６のアミノ酸配列を有するヘパ
   リチナーゼのポリペプチドをコードする請求項１に記載
   のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号１に示す塩基配列における塩基
   番号１７８〜２８０５の塩基配列を有する請求項２に記
   載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号１に示す塩基配列における塩基
   番号２５６〜２８０５の塩基配列を有する請求項３に記
   載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１乃至請求項５の何れか１項に記
   載のＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の組換えＤＮＡで宿主細
   胞を形質転換することにより得られる形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の形質転換体を生育さ
   せ、得られた生育物からヘパリチナーゼのポリペプチド
   を採取することを特徴とするヘパリチナーゼのポリペプ
   チドの製造方法。
9. 【請求項９】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   ヘパリチナーゼ。
10. 【請求項１０】 配列番号２に示すアミノ酸配列におけ
    るアミノ酸番号２７〜８７６のアミノ酸配列を有するヘ
    パリチナーゼ。