JPH0625296A

JPH0625296A - ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法

Info

Publication number: JPH0625296A
Application number: JP5089969A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Yamada; 和徳山田; Masanori Ochiai; 正則落合; Noritaka Yomoto; 能尚四本; Hironori Morimoto; 裕紀森本; Yutaka Teranishi; 豊寺西
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1992-04-28
Filing date: 1993-04-16
Publication date: 1994-02-01

Abstract

(57)【要約】【構成】ヘテロな３種のサブユニットから構成され、
ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規な水溶性酵素タ
ンパク質をリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌から
分離精製した。該タンパク質をコードする遺伝子の塩基
配列を決定し、該塩基配列を有する発現ベクターにより
形質転換された形質転換体を用いて該タンパク質を発現
させ、該形質転換体を培養して得られる培養液、分離菌
体等をニトリル類に作用させて対応するアミド類を製造
する。【効果】上記形質転換体を培養して得られる培養液、
分離菌体等を用いることによりニトリル類をその対応す
るアミド類に効率良く変換させることが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はニトリルヒドラターゼ活
性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺
伝子並びに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリ
ル類からアミド類の製造方法に関する。詳しくは、ニト
リル類からその対応するアミド類を生成させる活性を有
する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子
と、少なくとも該タンパク質発現に必要なプロモーター
配列、当該タンパク質がコードされたＤＮＡ配列及びタ
ーミネーター配列を有する発現ベクターにより形質転換
された形質転換体、さらにその形質転換体を培養するこ
とにより当該タンパク質を発現させる方法、ならびに該
形質転換体を培養して得られる培養液、分離菌体、菌体
処理物、タンパク質またはこれらの固定化物をニトリル
類に作用させて対応するアミド類を製造する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする問題点】ニ
トリル類のニトリル基を水和してアミド基に転化させ、
対応するアミド類を製造する技術において、反応の触媒
として酸またはアルカリを用いて加熱処理する方法、銅
触媒を用いて加熱処理する方法が知られていたが、近
年、この水和反応を促進する触媒機能を有する水溶性酵
素タンパク質、ニトリルヒドラターゼを菌体内に保持す
る微生物触媒を用いる方法が用いられるようになった
（特開昭５９−２６９３号、同６１−１６２１９３号、
同６２−９１１８９号、同６４−８６８８９号、特公昭
５６−１７９１８号、同５９−３７９５１号、同６２−
２１５１９号各公報等）。この微生物触媒を用いる方法
は、常温で水和反応を行うことができるとともに転化率
も高い点から他の方法に比べて優れた方法といえる。

【０００３】しかしながら微生物触媒を用いる場合に
は、微生物触媒を調製する段階において、その微生物の
安全性評価、最適培養法の検討など、用いる微生物触媒
の生物学的性質に応じて数多くの検討を行う必要があ
り、生物触媒としての活性をコストの上で工業的に利用
できるレベルにまであげることは必ずしも容易ではな
い。一方、かかる微生物触媒法の改良策として、微生物
触媒自身、即ち酵素ニトリルヒドラターゼを遺伝子工学
を利用して製造し、ニトリル類から対応するアミド類へ
転換する方法が検討されている。例えば、特公平３−５
４５５８号公報にはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ）属の菌由来で、ヘテロな２つのサブユニットから
なるニトリルヒドラターゼが酵素レベルで記載され、特
開平２−１１９７７８号公報にはロドコッカス属の菌由
来で、ヘテロな２つのサブユニットからなるニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子が記載され、また特開平３−２５１１
８４号公報にはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属の菌由来で、ヘテロな２つのサブユニットからな
るニトリルヒドラターゼ遺伝子が開示され、また欧州特
許公開４５５６４６号公報にはロドコッカス・ロドクロ
ウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）由来で、ヘテロな
２つのサブユニットからなるニトリルヒドラターゼ遺伝
子が開示されている。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】発明者らは、より高い
触媒活性を持つ微生物触媒を調製する目的で、極めて高
いニトリル類の水和活性を有する、つまりニトリルヒド
ラターゼ活性を有するタンパク質を組換えＤＮＡ技術に
より形質転換体中に大量に生産させるべく鋭意検討を重
ね、かかる目的に有用な新規なタンパク質（以下、ニト
リルヒドラターゼタンパク質、ニトリルヒドラターゼＡ
Ｍ２４タンパク質、ＡＭ２４タンパク質と称することも
ある）を初めて単離・精製し、これをコードする遺伝子
も初めて分離取得し、さらにこの遺伝子を発現ベクター
に組み込み形質転換体を得て、その形質転換体によりニ
トリルヒドラターゼタンパク質を大量に生産させること
に成功し、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち本発明の要旨は、下記の理化学的
性質を有することを特徴とする新規なタンパク質および
それをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形
質転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法に存
する。３種のサブユニットから構成されるゲル濾過法によ
る分子量が約１１０，０００の水溶性酵素タンパク質で
あって、各サブユニットのＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量が以下の通りである。サブユニットα 分子量２６，０００±５００サブユニットβ 分子量１５，０００±５００サブユニットγ 分子量１６，５００±５００ニトリルヒドラターゼ活性を有する。

【０００６】以下本発明をさらに詳細に説明するに、本
発明の新規なタンパク質ニトリルヒドラターゼＡＭ２４
タンパク質は、例えば後述の実施例に記述するように、
土壌から分離してきたRhizobium sp. ＭＣＩ２６４３
（特願平４−２４０６７９号、微工研条寄ＦＥＲＭ
ＢＰ−３９５３）を破砕し、それを遠心分離した後の上
清をＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（東ソー社
製）等による疎水クロマトグラフィーにより更に分画し
た後、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグ
ラフィー等により更に分画する。最後にＴＳＫｇｅｌ
Ｇ３，０００ＳＷ等の分子ふるいクロマトグラフィー
に供することにより精製標品が得られる。精製された本
発明のタンパク質はα、β、γの三つのサブユニットか
らなる水溶性タンパク質で各サブユニットのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動による分子量がそれぞれ２
６，０００±５００ダルトン、１５，０００±５００ダ
ルトン、１６，５００±５００ダルトンであり、ニトリ
ル類を水和反応によりアミド類に転換する活性、即ちニ
トリルヒドラターゼ活性を有する。

【０００７】また、本発明のＡＭ２４タンパク質は、配
列表の配列番号１〜３に示すようなアミノ酸配列を有す
るサブユニットα、サブユニットβ、サブユニットγの
三つのサブユニットからなるタンパク質であり、ニトリ
ル類の水和活性を損なわない範囲で一部のアミノ酸を除
去、置換、修飾または追加するなどの改変を行ったもの
も、本発明のＡＭ２４タンパク質に含まれる。

【０００８】上記のＡＭ２４タンパク質をコードする遺
伝子としては、例えば、配列番号４または５に示すよう
な塩基配列を有するものが挙げられる。本発明のＡＭ２
４タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ断片は、例え
ば、次のような方法によって得られる。本発明のタンパ
ク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡライブラリー
としては、土壌から分離してきたRhizobium sp. ＭＣＩ
２６４３（特願平４−２４０６７９号、微工研条寄Ｆ
ＥＲＭＢＰ−３９５３）から調製してきた染色体ＤＮ
Ａを用いて公知の常法により作成したファージミドライ
ブラリーが利用できる。このＤＮＡライブラリーからフ
ァージミドを斉藤らの方法（プロシーディングスオブ
ナショナルアカデミーサイエンスユーエスエ
ー［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ］、８３、８６６４〜８６６８、１９８６年）により
感染させ培養する。培養後に形成されたコロニーを部分
ＤＮＡ断片あるいは決定した本発明のタンパク質の部分
アミノ酸配列に対応する塩基配列を持つＤＮＡ断片をプ
ローブとしてコロニーハイブリダイゼーション法（「モ
レキュラークローニング」、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー、３２０〜３２８、１９８２
年）によって選択し、目的とするＤＮＡを得ることがで
きる。

【０００９】このコロニーハイブリダイゼーション法に
使用するプローブには、ポリメラーゼチェイン反応（以
下、「ＰＣＲ」と略す）法（サイエンス［Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ］、２３９、４８７〜４９１、１９８８年）によって
得られるＡＭ２４タンパク質をコードする遺伝子の部分
ＤＮＡ断片が用いられる。例えば配列表の配列番号６
（配列番号１に記載のアミノ酸配列の１〜７番目に対
応）の＋鎖ＤＮＡプライマーと、配列表の配列番号７
（配列番号３に記載のアミノ酸配列の３〜９番目に対
応）の−鎖ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行い、得
られた配列表の配列番号４に示した９６６ｂｐのＤＮＡ
断片を作成してプローブとして用いる。またＡＭ２４タ
ンパク質のアミノ酸配列より推定されるＤＮＡ配列に基
づき合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い
てもよい。

【００１０】さらに上記のスクリーニング陽性のコロニ
ーからＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラー
クローニング」、コールドスプリングハーバー
ラボラトリー、８５、１９８２年）によりＤＮＡを調製
し、適当な制限酵素、例えばＢａｍＨＩ等で切断後，ｐ
ＵＣ１８等のプラスミドにクローニングし、Ｓａｎｇｅ
ｒらのジデオキシ法（プロシーディングスオブナシ
ョナルアカデミーサイエンスユーエスエー［Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］、７
４、５４６３、１９７７年）によって目的ＤＮＡ断片の
塩基配列が決定できる。

【００１１】このようにして決定されるＤＮＡ断片の塩
基配列（例えば、配列表の配列番号４および５）は、配
列表の配列番号１に示す精製したＡＭ２４タンパク質α
サブユニットの部分アミノ酸配列（１〜７番目）と配列
表の配列番号３に示す精製したＡＭ２４タンパク質γサ
ブユニットの部分アミノ酸配列（３〜９番目）に対応す
る塩基配列を含むαサブユニット（１９８アミノ酸残
基）、βサブユニット（１０４アミノ酸残基）、γサブ
ユニット（１１５または１１６アミノ酸残基）の三つの
タンパク質をコードしている、それぞれ全長５９４ヌク
レオチド、３１２ヌクレオチド、３４５または３４８ヌ
クレオチド長からなるものである。また本発明によるＤ
ＮＡ断片は配列表の配列番号１〜３に示すアミノ酸配列
をコードするものに限らず、ニトリルからアミドへの水
和活性を持つ限りはそのアミノ酸配列を改変したものも
含まれる。

【００１２】上記のようにして得られるＤＮＡ断片は、
その５’末端を修飾して公知の発現ベクターにそれ自体
公知の方法でプロモーターの下流に挿入され、次いで上
記のＤＮＡが挿入された発現ベクターは、大腸菌、酵
母、動物細胞宿主等、公知の細胞中にそれ自体公知の方
法により導入される。本発明のＡＭ２４タンパク質の産
生方法につき詳細に説明すると、発現ベクターとしては
上記のようにして得られたＡＭ２４タンパク質をコード
するＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有して
いるものが使用される。たとえば大腸菌、枯草菌等の微
生物を宿主とするときには、発現ベクターはプロモータ
ー、リボゾーム結合（ＳＤ）配列、ＡＭ２４タンパク質
遺伝子、転写終結配列、及びプロモーターを制御する遺
伝子より成ることが好ましい。

【００１３】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
Ｐ_L 、Ｐ_R 、Ｔ₅ ファージの初期遺伝子のプロモーター
であるＰ₂₅、Ｐ₂₆プロモーター等が挙げられる。また、
これらは例えばｐａｃプロモーター（アグリカルチュラ
ルアンドバイオロジカルケミストリー［Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．］５２、９８３−９８８、１
９８８年）のように独自に改変、設計された配列でも良
い。

【００１４】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。

【００１５】更にこれらの発現に必要な因子の発現プラ
スミド上での配列順序は、５’上流から、プロモータ
ー、ＳＤ配列、ＡＭ２４タンパク質遺伝子、転写終結因
子の順に並ぶ事が望ましい。また発現ベクター上のＳＤ
配列とＡＭ２４タンパク質遺伝子とのユニットを複数個
同方向に挿入することにより、ベクター上の転写単位の
コピー数を増加させる方法（特開平１−９５７９８号公
報）を用いることもできる。

【００１６】発現ベクターとして使用できるものとして
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）や市販
のｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）等がある。ま
た、融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシ
リーズ（ファルマシア社製）等も同様にして使用でき
る。宿主の形質転換法としては、常法に従い行うことが
できる。

【００１７】形質転換体の培養は、モレキュラークロ
ーニング（コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、１９８２年）に記載の方法を参考にして行うことが
できる。培養温度としては、２８℃〜４２℃が適当であ
る。また、形質転換に用いる宿主としては、例えば後述
の実施例のように大腸菌が挙げられるが、とくに大腸菌
に限定されるものではなく、他の微生物、動物細胞、昆
虫細胞などの宿主生物を用いることができる。

【００１８】上記形質転換体を培養して得られるＡＭ２
４タンパク質は、公知の方法で宿主から単離・精製され
る。本発明においては、ニトリル類のアミド類への変換
には、上記で得られたＡＭ２４タンパク質の他に形質転
換体の培養液、分離菌体、菌体処理物、固定化菌体、粗
酵素液、酵素処理物、固定化酵素等が用いられる。

【００１９】また、本発明で対象とするニトリルとして
は、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、アク
リロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリ
ル、イソブチロニトリルなどの炭素数２〜４のニトリル
が挙げられ、アクリロニトリルが代表的である。

【００２０】

【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例によって限定されるものではない。実施例１ＡＭ２４タンパク質の精製及び部分アミノ酸
配列決定土壌分離菌Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３（特願平４−
２４０６７９号、微工研条寄ＦＥＲＭＢＰ−３９５
３）を培地（グルコース２０ｇ／ｌ、ウレア７．５ｇ
／ｌ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ₂・
６Ｈ₂Ｏ１０ｍｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ポリペプ
トン５ｇ／ｌ）で２８℃、４０時間培養した後、遠心
分離（６，０００×ｇ、２０分間）により集菌した。

【００２１】菌体を生理食塩水で洗浄し、集菌した菌体
を再び緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、０．
１ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁した。この懸濁液
を氷水で冷やしながら超音波破砕（１００Ｗ、１０分
間）し、２５，０００×ｇで２０分間遠心分離した後の
上清を回収した。この上清に飽和硫安を終濃度が２５％
（ｗ／ｖ）になるようにゆっくりと加え、生じた沈澱を
２５，０００×ｇ、２０分の遠心分離で除去した。この
上清に終濃度が６５％（ｗ／ｖ）になるように飽和硫安
を加え、生じた沈澱を２５，０００×ｇ、２０分間の遠
心分離により回収した。この沈澱を４℃で上記の緩衝液
に溶解させた後、終濃度が２５％（ｗ／ｖ）になるよう
に飽和硫安をくわえ、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
カラム（１．２×２０ｃｍ）にて分画した。すなわち、
２５％硫安を含む緩衝液でカラムを十分洗浄した後、硫
安の濃度２５％から０％（ｗ／ｖ）の濃度勾配溶出を行
い、ニトリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。

【００２２】この活性画分を１０ｍＭＢｉｓ−ｔｒｉ
ｓｐｒｏｐａｎｅ（ｐＨ６．５）にたいして透析した
のち、同液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
カラム（０．７×２０ｃｍ）に共した。カラムを同液で
洗浄した後、０から０．７ＭのＮａＣｌの濃度勾配溶出
を行い、活性画分を得た。この画分をミリポア社製、ウ
ルトラフリー（１０，０００カットオフ）を用いて濃縮
した後、緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、
０．１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化したＴＳＫ
ｇｅｌＧ３０００ＳＷカラムに共した。カラム洗浄
後、０から０．７ＭのＮａＣｌの濃度勾配溶出を行っ
た。このうち１３．５ｍｌに溶出したメインピークがニ
トリルヒドラターゼ活性を示し、非還元状態での電気泳
動で単一のバンドとなった。

【００２３】更にこの画分を０．１％ＴＦＡ（トリフ
ルオロ酢酸）を含む２０％アセトニトリルで平衡化した
ＹＭＣｐａｃｋＣ４カラム（ＡＰ−８０２Ｓ−５
３００ＡＣ４、０．４６×１５ｃｍ）に添加し、ア
セトニトリル濃度２０％から６０％までの濃度勾配溶出
を行い、３種類のサブユニット画分を分取した。これら
の画分をそれぞれ減圧乾燥した後、５０％ＴＦＡ６０
μｌに溶解し、ポリブレン処理したグラスフィルターに
吸着させ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製４
７７型シークエンサーでエドマン分解し、Ｎ末端側から
のアミノ酸配列を決定した。また精製したサブユニット
のうちβサブユニットを５Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、リジルエンド
ペプチダーゼ（和光純薬製）により酵素：基質＝１：２
００で３７℃、１８時間作用させて高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）によりペプチド断片を得、そのう
ちの一つのペプチド断片のアミノ酸配列を同様に決定し
た。この結果、αサブユニットＮ末端のアミノ酸配列
は配列表の配列番号８、βサブユニットＮ末端のアミ
ノ酸配列は配列表の配列番号９、βサブユニットリジ
ルエンドペプチダーゼ断片のアミノ酸配列は配列表の配
列番号１０、γサブユニットＮ末端のアミノ酸配列は
配列表の配列番号１１の通りであることが明かになっ
た。

【００２４】またこれらの精製したＡＭ２４タンパク質
を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
解析したところ、それぞれのサブユニットの分子量はα
サブユニットが２６，０００±５００ダルトン、βサブ
ユニットが１５，０００±５００ダルトン、γサブユニ
ットが１６，５００±５００ダルトンであることが明か
となった。さらに、本発明のＡＭ２４タンパク質のαサ
ブユニット、βサブユニット、γサブユニットのアミノ
酸配列は、それぞれ配列表の配列番号１〜３に示した通
りであった。

【００２５】実施例２ＡＭ２４タンパク質のニトリル
ヒドラターゼ活性の評価（１）分離菌体及び酵素溶液（ＡＭ２４タンパク質溶液）中の
活性評価は、以下のように行った。すなわち菌体懸濁液
あるいは酵素溶液１容量に対して７％（ｖ／ｖ）アクリ
ロニトリル１容量と０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）３容量を加え、２５℃で１０分間反応させた。反応
後１容量の１ＮＨＣｌを加えて反応を停止させた後、
純水で１００倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣのＯＤＳ
カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ１００−５Ｃ１８）に添
加して１０％アセトニトリルを含む０．１Ｍリン酸２
水素ナトリウム溶液で展開した。生成アクリルアミドは
逐次分光光度測定（λ＝１９５ｎｍ）により検出した。

【００２６】実施例３ＡＭ２４タンパク質のニトリル
ヒドラターゼ活性の評価（２）ＡＭ２４タンパク質溶液（２８０ｎｍにおける吸光度が
０．１）１容量と０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）４容量を混合し、これに０．２％（ｖ／ｖ）のニト
リル化合物水溶液９０容量を加えて２５℃で５分間反応
させた。反応後５容量の１ＮＨＣｌを加えて反応を止
め、ＨＰＬＣのＯＤＳカラムに添加して生成したアミド
化合物の量を測定した。基質であるニトリル化合物は、
アクリロニトリル、プロピオンニトリル、ｎ−ブチロニ
トリル、イソブチロニトリル、アセトニトリル、クロロ
アセトニトリル、マロンアミドニトリル、メタクリロニ
トリル、３−シアノピリジン、ベンゾニトリル、クロト
ノニトリルを使用した。

【００２７】アクリロニトリルを反応の基質として用い
た時の活性を１００とした場合の各基質の相対活性を表
−１に示した。これより本発明のＡＭ２４タンパク質は
様々なニトリル類から対応するアミド類を製造すること
ができることがわかる。

【００２８】

【表１】

【００２９】実施例４ＰＣＲ法によるＡＭ２４タンパ
ク質の部分ＤＮＡ断片の調製基質となる土壌分離菌Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３
（特願平４−２４０６７９号、微工研条寄ＦＥＲＭ
ＢＰ−３９５３）の染色体ＤＮＡは常法に従って作製さ
れる。すなわち培養菌体よりフェノール−クロロホルム
法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリン
グハーバーラボラトリー、１９８２年）に従い、若干の
改良を加えて以下のごとく調製した。

【００３０】Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３株を前記実
施例１における培地１００ｍｌに植菌して培養した後集
菌し、この菌体をＴＥＳ［１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＣ
ｌ］で洗浄後、ＴＥ［１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ］５ｍｌに懸濁し、リゾ
チーム１０ｍｇを加えて３７℃で３０分間インキュベー
トした後、凍結−再融解を繰り返して細胞を破壊する。
次に１／２量の１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを穏やかに振と
うしながら加え、更にプロテイナーゼＫ（シグマ社製）
を終濃度０．１ｍｇ／ｍｌになるよう加えて６０℃で５
時間インキュベートする。次に等量のＴＥ飽和フェノー
ル・クロロホルムを加え、一晩室温で緩やかに振とうす
る（以下、この操作をフェノール処理と呼ぶ）。遠心
後、上層をとり等量のクロロホルムを加えて再抽出す
る。遠心後の上層に等量のエタノールを加えたのちガラ
ス棒でＤＮＡを巻きとり、７０％、８５％、９９．５％
のエタノールで順次脱水する。次にＤＮＡを３ｍｌのＴ
Ｅバッファーに溶解させたのち１００℃、１０分間の加
熱処理したＲＮａｓｅＡ水溶液を終濃度１０μｇ／ｍｌ
になるよう加えて３７℃で１時間保温する。その後フェ
ノール処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収する。
この結果、７００μｇの染色体ＤＮＡが得られた。

【００３１】ＰＣＲはパーキン・エルマー・シータス・
ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍ
ｅｒ・Ｃｅｔｕｓ・ＤＮＡ・ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌ
ｅｒ）を使用して、使用説明書に基づき、ジーンアンプ
キット（ＧｅｎｅＡｍｐＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ、宝酒造製）を使っ
て行った。すなわち基質ＤＮＡ１μｌ（０．５μｇ相当
量）、１０培濃度の反応緩衝液［５００ｍＭＫＣｌ、
１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍ
ＭＭｇＣｌ2 、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］１０μ
ｌ、１．２５ｍＭ４ｄＮＴＰ１６μｌ、５０μＭプ
ライマー＃１として配列表の配列番号６（配列番号１の
アミノ酸配列の１〜７番目に対応）の＋鎖ＤＮＡプライ
マー５’ＡＴＧＧＡＡ／ＧＣＣＩＴＡＣ／ＴＡＣＩＡＡ
Ａ／ＧＣＣ３’（２０ヌクレオチド、Ｉはイノシン）及
びプライマー＃２として配列表の配列番号７（配列番号
３のアミノ酸配列の３〜９番目に対応）−鎖ＤＮＡプラ
イマー５’ＡＴＡ／ＧＴＣＣ／ＴＴＣＩＧＧＡ／ＧＴＴ
ＩＡＣＩＣＣ３’（２０ヌクレオチド）各５μｌ、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えて１００μｌの
系とする。反応は９４℃、１０分間の前処理後、９４℃
１分間（変性ステップ）、４６℃１．５分間（アニーリ
ングステップ）、７２℃２分間（伸長ステップ）のイン
キュベーションを３５サイクル行った。最後に７２℃で
７分間のインキュベーションを行い反応を終了した。得
られた反応液をフェノル：クロロホルム＝１：１で抽出
し、エタノール沈澱を行った。この沈澱を１６μｌ滅菌
脱イオン水に溶解した後、５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行い、９６６ｂｐのバンドを常法に従って切
り出しＤＮＡフラグメントを回収し、エタノール沈澱を
行った。ＤＮＡ沈澱を１６μｌ滅菌脱イオン水に溶解
し、１０培濃度のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液［０．
３３Ｍトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、０．６６Ｍ酢酸カ
リウム、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、５ｍＭＤＴＴ］
２μｌ，１．２５ｍＭ４ｄＮＴＰ１μｌ、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ１μｌ（６ユニット）を加え２０μｌの
系とし、３７℃で３０分間反応させ、２本鎖の平滑末端
ＤＮＡを得た。

【００３２】このＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８ベクターの
ＳｍａＩ部位に挿入してデュポン社の蛍光法ＤＮＡシー
ケンサーを用いてその塩基配列を決定した。決定したＰ
ＣＲフラグメントの塩基配列は配列表の配列番号４に示
すとおりであり、９６６ｂｐＤＮＡフラグメントがコー
ドするアミノ酸配列のうち５’側から４０アミノ酸が配
列表の配列番号１の１〜４０番目のアミノ酸に、また
３’側から８アミノ酸が配列表の配列番号３の１〜８番
目のアミノ酸に相当し、精製ＡＭ２４タンパク質から決
定したアミノ酸配列に一致した。

【００３３】実施例５ＡＭ２４タンパク質をコードす
る完全長ＤＮＡ断片を含むクローンのスクリーニング上記実施例４で作製した９６６ｂｐのＰＣＲ断片をモレ
キュラークローニング（コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー、１９８２年）に記載の方法に従い ³²Ｐ標識
することによりスクリーニング用プローブとした。

【００３４】上記実施例４で調製した染色体ＤＮＡ標品
１０μｌ（５μｇ相当量）に１０倍濃度制限酵素緩衝液
［５００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ
塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
ＤＴＴ］３μｌ、滅菌脱イオン水１６μｌ、制限酵素Ｂ
ｇｌＩＩ１μｌ（１５ユニット）を加え３７℃で２時
間反応させた後、アガロースゲル電気泳動（６５Ｖ、４
時間）を行い、前記のプローブを用いてモレキュラーク
ローニング（コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、１９８２年）に記載の方法に従いサザンハイブリダ
イゼーションを行った結果、約５．２Ｋｂの位置にプロ
ーブと強くハイブリダイズするＤＮＡ断片が存在するこ
とが明らかになった。

【００３５】そこで前出の染色体ＤＮＡ標品４０μｌ
（２０μｇ相当量）に１０倍濃度制限酵素緩衝液［５０
０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化マ
グネシウム、１ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭＤＴ
Ｔ］８μｌ、滅菌脱イオン水２９μｌ、制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩ３μｌ（４５ユニット）を加え３７℃で２時間反
応させた後、アガロースゲル電気泳動（６５Ｖ、５時
間）を行い、モレキュラークローニング（コールドスプ
リングハーバーラボラトリー、１９８２年）に記載の方
法に従い５．２Ｋｂ付近のＤＮＡ断片を分離・回収し
た。

【００３６】こうして回収した約５．２ＫｂのＤＮＡ断
片を少なくとも１０ｐｍｏｌ用意し、ライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９−
３６クローニングベクター（ニッポンジーン社製）のマ
ルチクローニングサイト内にあるＢａｍＨＩサイトに組
み込んだ。（この時ライゲーションに用いたベクターＤ
ＮＡは、次の様に用意されたものを１μｇ使用した。即
ち、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９−３６クローニングベクターを
制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績社製）で切断し、フェノ
ール／クロロホルム処理、エタノール沈澱させた後、さ
らにアルカリフォスタファーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）で５′末端を脱リン酸化して［モレキュラーク
ローニング、コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、１９８２年］、フェノール／クロロホルム処理、エ
タノール沈澱させた。）

【００３７】このようにして作成したＤＮＡをストラタ
ジーン社のギガパックゴールドパッケージングキットを
用いてλファージ粒子中にパッケージングした。すなわ
ちライゲーションしたＤＮＡ溶液２μｌ（総量の１／３
量）をキット付属の説明書に従って反応を行った。反応
後、ニッポンジーン社のＣｈａｒｏｍｉｄ９−３６ク
ローニングベクターに添付の説明書に従いトランスフェ
クションを行い、直径１５ｃｍのシャーレ中のアンピシ
リン含有（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地（１％酵母抽
出物、０．５％バクトトリプトン、０．５％塩化ナトリ
ウム）に希釈段階を変えて菌液を塗布した。一枚あたり
１０²〜１０³個のコロニーが出現したシャーレをバンク
のスクリーニングに用いた。トランスフェクションには
東洋紡績社製の大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（Ｃ
ＯＭＰＥＴＥＮＴＨＩＧＨ）を用いた。

【００３８】バンクのスクリーニングはＮＥＮ社製のナ
イロンメンブレン、Ｃｏｌｏｎｙ／ＰｌａｑｕｅＳｃｒ
ｅｅｎを用いて添付の説明書に従っておこなった。すな
わちプレート上に生育したコロニーをプレート１枚あた
り２枚のメンブレンに移し取った後、そのメンブレンを
０．１Ｍ水酸化ナトリウム−０．５Ｍ塩化ナトリウムが
染み込んだ濾紙上に２分間静置し、続いて１．５Ｍ塩化
ナトリウム−０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）が染
み込んだ濾紙上で５分間静置した。このフィルターの処
理を更に２回繰り返した後、２×ＳＳＣ（２倍ＳＳＣ溶
液）でフィルターを洗浄し乾いた濾紙上で風乾した。次
にこのメンブレンに１２０ｍＪ／ｃｍ²のＵＶ照射を行
うことによりメンブレンに移したＤＮＡの固定を行っ
た。

【００３９】こうして処理したメンブレン４枚（５，０
００コロニー相当）を２×ＳＳＣで一度洗浄し、次に１
５ｍｌのハイブリダイゼーション液［３×ＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳ、１０×Ｄｅｎｈａｌｔ（１０倍濃度のＤｅ
ｎｈａｌｔ；１％牛血清アルブミン、１％ポリビニルピ
ロリドン、１％フィコール４００）、１０μｇ／ｍｌ鱒
精子ＤＮＡ］に６５℃で２時間浸した。この間に実施例
４で作製した９６６ｂｐのＤＮＡ断片を実施例４記載の
ＰＣＲ用プライマー＃２を用いて常法に従い³²Ｐ標識し
た。次にこの³²Ｐ標識ＤＮＡ断片を１μＣｉ／ｍｌの濃
度で含む新しいハイブリダイゼーション液１５ｍｌ中に
上述のフィルターを６５℃で２０時間浸した。その後メ
ンブレンを取り出し２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中
での洗浄を室温で２回行い、更に０．２×ＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳ溶液中で６５℃で１５分の洗浄を２回行った
後にオートラジオグラフィーを取った。この結果、２枚
１組のメンブレンのオートラジオグラフィー上のポジテ
ィブなシグナルが一致したコロニーが１個得られた。こ
のコロニーをＬＢ培地（１％酵母抽出物、０．５％バク
トトリプトン、０．５％塩化ナトリウム）で培養した後
に希釈してＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む）にシャーレ一枚当たりコロニーが１００個程
度出現するように塗布し、再度³²Ｐ標識ＤＮＡ断片を用
いたハイブリダイゼーション法を行うことによりポジテ
ィブクローンを純化した。

【００４０】実施例６ＤＮＡ断片のサブクローニング
及び塩基配列の決定純化したポジティブクローンからプラスミドＤＮＡを常
法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリン
グハーバーラボラトリー、８６〜９６頁（１９８２））
に従い調製し、必要なＤＮＡ領域を適宜制限酵素で小断
片化した後にプラスミドベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９にサブクローニングを行った。得られたサブクローン
からプラスミドＤＮＡを常法により調製し、デュポン社
製蛍光シークエンサーＧＥＮＥＳＩＳ２０００システム
を用いて、配列を決定した。シークエンスプライマーと
して次の２種の合成プライマー５′ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣ
ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）３′（配列表の配列番号１
２）、５′ｄ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）
３′（配列表の配列番号１３）を使用し、該ＤＮＡ断片
の＋鎖、一鎖の塩基配列を決定した。この結果、配列表
の配列番号５に示すような塩基配列が得られた。すなわ
ち実施例１及び４で明らかになったアミノ酸配列をコー
ドする領域、及びＤＮＡの塩基配列を含む全長５．２ｋ
ｂのＤＮＡ断片が得られた。

【００４１】実施例７ＡＭ２４タンパク質発現プラス
ミドの構築と形質転換体の取得実施例６で得たＡＭ２４タンパク質遺伝子ＤＮＡを含む
シャロミドｐＣｈＡＭ２４−１（図１）を常法により調
製した。次に該プラスミドＤＮＡ２μｇを制限酵素Ｘｂ
ａＩで消化した後にＴ４ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮ
Ａの末端を平滑末端化した。そしてポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により目的のＡＭ２４タンパク質コード領
域を含むＤＮＡ断片を分離した後フェノール／クロロホ
ルム抽出を行い、エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を
精製し１０μｌの滅菌水に溶解した。次にこのＤＮＡ断
片を含む溶液１μｌと制限酵素ＳｍａＩで切断後のＤＮ
Ａ末端を子牛腸粘膜由来アルカリフォスファターゼを用
いて脱燐酸化した発現ベクターｐＵＳＩ２（特開平１−
９５７９８号公報）ＤＮＡ１０ｎｇとを混ぜ、両者をＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造６０２１）を用いて
連結した。この反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質
転換し、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラーク
ローニング」、３６５−３８１頁（１９８２））に従い
解析することにより、発現ベクターのプロモーターの転
写方向に対して順方向にＤＮＡ断片が挿入されたＡＭ２
４タンパク質発現プラスミド、ｐＥＡＭ２４Ｘ１（図
２）を含有する形質転換体を得た。

【００４２】実施例８形質転換体を用いたＡＭ２４タ
ンパク質の産生とニトリル類のアミド類への変換実施例７で得られたｐＥＡＭ２４Ｘ１を含有する形質転
換体を１０ｍｌのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
含有）培地に接種し２７℃で一晩（１２〜１６時間）培
養し、この培養液を１０ｍｌのＬＢ（アンピシリン５０
μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌＣｏＣｌ₂・５Ｈ₂Ｏ含有）
に１／１００量（０．１ｍｌ）加えて２７℃で２時間培
養した後、プロモーターの転写誘導剤であるＩＰＴＧを
終濃度１ｍＭになるよう添加し、さらに２７℃で１２時
間培養した。菌体を遠心分離により集め、これを生理食
塩水で一回洗浄したのち１．６ｍｌのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０、０．１Ｍ）に懸濁した。このうち０．３２ｍ
ｌをサンプリングし、７％アクリロニトリル水溶液８０
μｌを混和し、３０℃で１時間反応させた。反応終了
後、反応液中のアクリルアミドと未反応のアクリロニト
リルを高速液体クロマトグラフィーを用いて検出したと
ころ、反応液中にはアクリルアミドが検出され、アクリ
ロニトリルは検出されなかった。

【００４３】これに対し上記発現プラスミド、ｐＥＡＭ
２４Ｘ１を含まない大腸菌ＤＨ５α株を用いて同様な試
験を行ったところ、反応終了後の反応液中にアクリルア
ミドが検出できなかった。なお培地中のコバルトは必須
で、コバルトを含まない培地を用いてｐＥＡＭ２４Ｘ１
を含有する形質転換体を培養した場合には、同様な試験
において反応終了後の反応液中にアクリルアミドが検出
できなかった。

【００４４】実施例９形質転換体からのＡＭ２４タン
パク質の精製と部分配列決定実施例８の方法で培養した形質転換体０．９ｇを生理食
塩水で１回洗浄した後、緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ
／ＮａＯＨ、０．１ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁
した。この懸濁液を氷水で冷やしながら超音波破砕（１
００Ｗ、５分間）し、２５，０００×ｇで２０分間遠心
分離した後の上清を回収した。この上清を実施例１と同
様に硫安分画、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム
クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカ
ラムクロマトグラフィー、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００Ｓ
Ｗカラムクロマトグラフィーの順に精製を行い、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを与える精製
標品を得た。この精製標品はRhizobium sp. ＭＣＩ２６
４３株から精製したＡＭ２４タンパク質と同等の分子量
と比活性を有していた。

【００４５】更にこの精製標品を実施例１で行った方法
と同様にしてリジルエンドペプチダーゼで断片化し、そ
のうち２つのペプチドの部分アミノ酸配列を決定したと
ころ各ペプチド断片のアミノ酸配列は配列表の配列番号
５から推定されるＡＭ２４タンパク質のアミノ酸配列
（配列表の配列番号１及び配列番号３）の部分配列と完
全に一致した。

【００４６】

【発明の効果】本発明により、αサブユニット、βサブ
ユニット、γサブユニットの３つのサブユニットのアミ
ノ酸配列を有し、ニトリルヒドラターゼ活性を有するポ
リペプチドをコードする新規なＤＮＡ断片が得られ、そ
の塩基配列が明らかにされた。そして本発明で構築した
発現プラスミドを有する形質転換体を培養することによ
り得られる菌体、菌体抽出物等を用いることによりニト
リル化合物をその対応するアミド化合物に変換させるこ
とが可能となった。本発明を用いることによりニトリル
類よりアミド類を効率よく製造することができる。

【００４７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１９８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３配列 Met Glu Pro Tyr Thr Lys Pro Pro Ala Pro Glu Ala Leu Arg Val Lys 1 5 10 15 Ala Leu Glu Thr Leu Leu Leu Glu Lys Gly Val Ile Asn Pro Gly Val 20 25 30 Val Asp Ala Ile Ile Asp Val Phe Glu Asn Lys Leu Ser Pro Lys Asn 35 40 45 Gly Ala Gln Val Val Ala Lys Ala Trp Thr Asp Pro Glu Phe Lys Lys 50 55 60 Trp Leu Leu Glu Asp Gly Thr Ala Ala Ile Glu Ser Met Gly Phe Ser 65 70 75 80 Gly Phe Gln Gly Glu Tyr Met Val Val Leu Glu Asn Thr Pro Glu Val 85 90 95 His Asn Leu Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Ile 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys Thr Ala Pro Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Ala Val Leu Asp Pro Arg Ser Val Leu Ala Glu Phe Gly Phe Asn Val 130 135 140 Pro Asp Asp Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Thr Ser Asp Val Arg 145 150 155 160 Phe Met Val Leu Pro Met Arg Pro Asp Gly Thr Asp Gly Trp Ser Ile 165 170 175 Glu Gln Leu Ala Glu Leu Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Ala 180 185 190 Asp Cys Lys Gln Val Val 195

【００４８】配列番号：２配列の長さ：１０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３配列 Met Asn Ser Met His Asp Cys Gly Gly Leu Ala Gly Leu Gly Pro Leu 1 5 10 15 Asp Ile Glu Ala Asn Glu Pro Val Phe His Glu Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Met Phe Gly Ile Lys Val Asn Leu Ala Ile Glu Gly Ile Tyr Asn Ile 35 40 45 Asp Glu Thr Arg Trp Ala Met Glu Gln Ile Gln Gly Leu Arg Trp Leu 50 55 60 Glu Ser Ser Tyr Tyr Glu Gln Trp Ile Asp Gly Val Thr Arg Gln Met 65 70 75 80 Leu Glu Lys Gly Ile Phe Thr Gln Glu Glu Leu Asp Val Arg Leu Lys 85 90 95 Glu Leu Ala Glu Gln Glu Gly Thr 100

【００４９】配列番号：３配列の長さ：１１５−１１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３配列 Xaa Ala Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Pro Gly Ile Ile Ala Thr Asn 1 5 10 15 Phe Ser Pro Met Ala Glu Val Asp Thr Pro Pro Arg Phe Lys Val Gly 20 25 30 Asp Lys Val Arg Ala Val Ile Asp Ala Lys Pro Thr His Thr Arg Leu 35 40 45 Pro Arg Tyr Leu Arg Gly Arg Val Gly Thr Ile Val Lys His Tyr Gly 50 55 60 Gly Met Val Phe Ala Asp Thr Arg Ala Leu Lys Gln Gly Asp Asn Pro 65 70 75 80 Gln His Ile Tyr Ser Val Arg Phe Glu Gly Ala Asp Val Trp Gly Lys 85 90 95 Glu Thr Gly Gly Asn Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Met Tyr Glu Ser Tyr 100 105 110 Ile Glu Asn Gln 115 （上記式中Ｘａａは欠失またはＭｅｔを表す）

【００５０】配列番号：４配列の長さ：９６６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３直接の起源クローン名：Ｊ１２１配列の特徴特徴を表す記号：ＰＣＤＳ（α subunit）存在位置：１．．５９７特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ＰＣＤＳ（β subunit）存在位置：６２７．．９４１特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ＰＣＤＳ（N-terminal sequence of
γ subunit）存在位置：９４１．．９６６特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG GAR CCN TAY ACN AAR CCG CCG GCA CCC GAA GCG CTG CGC GTC AAA 48 Met Glu Pro Tyr Thr Lys Pro Pro Ala Pro Glu Ala Leu Arg Val Lys 1 5 10 15 GCG CTG GAA ACA CTG CTG CTG GAA AAA GGC GTC ATA AAC CCG GGT GTT 96 Ala Leu Glu Thr Leu Leu Leu Glu Lys Gly Val Ile Asn Pro Gly Val 20 25 30 GTC GAC GCG ATT ATC GAT GTA TTC GAA AAC AAG CTT AGT CCG AAG AAC 144 Val Asp Ala Ile Ile Asp Val Phe Glu Asn Lys Leu Ser Pro Lys Asn 35 40 45 GGC GCT CAG GTT GTT GCG AAA GCC TGG ACA GAC CCT GAG TTC AAA AAA 192 Gly Ala Gln Val Val Ala Lys Ala Trp Thr Asp Pro Glu Phe Lys Lys 50 55 60 TGG CTC TTG GAA GAC GGC ACA GCA GCA ATT GAA TCG ATG GGC TTT AGT 240 Trp Leu Leu Glu Asp Gly Thr Ala Ala Ile Glu Ser Met Gly Phe Ser 65 70 75 80 GGC TTT CAG GGC GAA TAC ATG GTC GTT CTG GAG AAC ACG CCA GAG GTG 288 Gly Phe Gln Gly Glu Tyr Met Val Val Leu Glu Asn Thr Pro Glu Val 85 90 95 CAT AAC CTT GTC GTT TGC ACG CTG TGT TCG TGC TAC CCG TGG CCG ATA 336 His Asn Leu Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Ile 100 105 110 CTG GGG TTG CCG CCT AAT TGG TAT AAA ACA GCC CCT TAC CGT AGC CGT 384 Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys Thr Ala Pro Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 GCA GTT CTG GAT CCG CGT TCT GTT TTG GCA GAA TTC GGT TTC AAC GTG 432 Ala Val Leu Asp Pro Arg Ser Val Leu Ala Glu Phe Gly Phe Asn Val 130 135 140 CCA GAT GAT GTT GAA GTC CGG GTC TGG GAT TCT ACC TCC GAC GTT CGT 480 Pro Asp Asp Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Thr Ser Asp Val Arg 145 150 155 160 TTC ATG GTT CTG CCA ATG CGA CCC GAT GGC ACT GAT GGC TGG AGC ATA 528 Phe Met Val Leu Pro Met Arg Pro Asp Gly Thr Asp Gly Trp Ser Ile 165 170 175 GAA CAG CTA GCA GAA CTG GTC ACC CGA GAC TCA ATG ATC GGC ACT GCC 576 Glu Gln Leu Ala Glu Leu Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Ala 180 185 190 GAT TGC AAA CAA GTC GTC TGAGCA GCAAACGCAA CTCGCAGGAG GAAATT ATG 629 Asp Cys Lys Gln Val Val Met 195 AAC TCG ATG CAT GAC TGT GGC GGT CTG GCT GGT CTT GGC CCG CTC GAC 677 Asn Ser Met His Asp Cys Gly Gly Leu Ala Gly Leu Gly Pro Leu Asp 200 205 210 215 ATC GAA GCG AAC GAA CCT GTG TTT CAC GAG GAG TGG GAA GGC CGG ATG 725 Ile Glu Ala Asn Glu Pro Val Phe His Glu Glu Trp Glu Gly Arg Met 220 225 230 TTC GGC ATC AAG GTG AAT CTG GCG ATT GAG GGC ATC TAT AAT ATT GAC 773 Phe Gly Ile Lys Val Asn Leu Ala Ile Glu Gly Ile Tyr Asn Ile Asp 235 240 245 GAG ACC CGC TGG GCG ATG GAG CAA ATA CAA GGC CTG CGC TGG TTG GAA 821 Glu Thr Arg Trp Ala Met Glu Gln Ile Gln Gly Leu Arg Trp Leu Glu 250 255 260 TCC AGC TAT TAC GAA CAA TGG ATT GAC GGA GTT ACT CGT CAA ATG TTG 869 Ser Ser Tyr Tyr Glu Gln Trp Ile Asp Gly Val Thr Arg Gln Met Leu 265 270 275 GAA AAG GGC ATC TTC ACT CAA GAA GAG CTT GAT GTC CGC CTC AAG GAA 917 Glu Lys Gly Ile Phe Thr Gln Glu Glu Leu Asp Val Arg Leu Lys Glu 280 285 290 295 CTT GCA GAG CAG GAG GGC ACG TG ATG GCT GGN GTN AAY CCN GAR GAY AT 966 Leu Ala Glu Gln Glu Gly Thr Met Ala Gly Val Asn Pro Glu Asp 300 305 310 （上記式中ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれか、ＲはＡまた
はＧ、ＹはＣまたはＴを表す）

【００５１】配列番号：５配列の長さ：１２９１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３直接の起源クローン名：ｐＣｈＡＭ２４−１配列の特徴特徴を表す記号：ＰＣＤＳ（α subunit）存在位置：１．．５９７特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ＰＣＤＳ（β subunit）存在位置：６２７．．９４１特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ＰＣＤＳ（γ subunit）存在位置：９４１．．１２９１特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATGGAACCAT ATACCAAACC GCCGGCACCC GAAGCGCTGC GCGTCAAAGC GCTGGAAACA 60 CTGCTGCTGG AAAAAGGCGT CATAAACCCG GGTGTTGTCG ACGCGATTAT CGATGTATTC 120 GAAAACAAGC TTAGTCCGAA GAACGGCGCT CAGGTTGTTG CGAAAGCCTG GACAGACCCT 180 GAGTTCAAAA AATGGCTCTT GGAAGACGGC ACAGCAGCAA TTGAATCGAT GGGCTTTAGT 240 GGCTTTCAGG GCGAATACAT GGTCGTTCTG GAGAACACGC CAGAGGTGCA TAACCTTGTC 300 GTTTGCACGC TGTGTTCGTG CTACCCGTGG CCGATACTGG GGTTGCCGCC TAATTGGTAT 360 AAAACAGCCC CTTACCGTAG CCGTGCAGTT CTGGATCCGC GTTCTGTTTT GGCAGAATTC 420 GGTTTCAACG TGCCAGATGA TGTTGAAGTC CGGGTCTGGG ATTCTACCTC CGACGTTCGT 480 TTCATGGTTC TGCCAATGCG ACCCGATGGC ACTGATGGCT GGAGCATAGA ACAGCTAGCA 540 GAACTGGTCA CCCGAGACTC AATGATCGGC ACTGCCGATT GCAAACAAGT CGTCTGAGCA 600 GCAAACGCAA CTCGCAGGAG GAAATTATGA ACTCGATGCA TGACTGTGGC GGTCTGGCTG 660 GTCTTGGCCC GCTCGACATC GAAGCGAACG AACCTGTGTT TCACGAGGAG TGGGAAGGCC 720 GGATGTTCGG CATCAAGGTG AATCTGGCGA TTGAGGGCAT CTATAATATT GACGAGACCC 780 GCTGGGCGAT GGAGCAAATA CAAGGCCTGC GCTGGTTGGA ATCCAGCTAT TACGAACAAT 840 GGATTGACGG AGTTACTCGT CAAATGTTGG AAAAGGGCAT CTTCACTCAA GAAGAGCTTG 900 ATGTCCGCCT CAAGGAACTT GCAGAGCAGG AGGGCACGTG ATGGCTGGAG TTAACCCTGA 960 AGATATTCCT GGGATTATCG CTACAAATTT TTCGCCGATG GCTGAAGTCG ATACGCCGCC 1020 GAGGTTCAAA GTCGGCGACA AGGTGCGCGC TGTTATAGAC GCAAAACCAA CTCATACACG 1080 ACTGCCGCGC TATCTACGTG GGCGCGTCGG TACCATAGTG AAGCACTACG GCGGTATGGT 1140 ATTCGCCGAT ACCCGTGCTC TCAAGCAAGG CGACAATCCT CAGCATATCT ATTCAGTCCG 1200 ATTTGAGGGT GCTGATGTTT GGGGCAAGGA AACAGGCGGC AACAATACAT TCTACGCGGA 1260 CATGTATGAA AGCTACATAG AAAACCAATG A 1291

【００５２】配列番号：６配列の長さ：２０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGGARCCNTAYACNAARC 20 （上記式中ＲはＧまたはＡ、Ｎはイノシン、ＹはＣまた
はＴを表す）

【００５３】配列番号：７配列の長さ：２０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATRTCYTCNGGRTTNACNCC 20 （上記式中ＲはＧまたはＡ、Ｎはイノシン、ＹはＣまた
はＴを表す）

【００５４】配列番号：８配列の長さ：４０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３配列 Met Glu Pro Tyr Thr Lys Pro Pro Ala Cys Glu Ala Leu Arg Val Lys 1 5 10 15 Ala Leu Glu Thr Xaa Leu Leu Glu Lys Gly Val Ile Asn Val Gly Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Ala Ile Ile Asp Xaa Phe 35 40 （上記式中、Ｘａａは不明であることを示す。）

【００５５】配列番号：９配列の長さ：２８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３配列 Met Asn Ser Met His Asp Thr Gly Gly Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ile 1 5 10 15 Glu Ala Asn Glu Pro Val Phe His Glu Glu Trp Glu 20 25

【００５６】配列番号：１０配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３配列 Gly Ile Phe Thr Gln Glu Glu Leu Asp Val Arg Leu Lys 1 5 10

【００５７】配列番号：１１配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント起源生物名：Rhizobium sp. ＭＣＩ２６４３配列 Ala Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Pro Gly Ile Ile Ala Thr Asn Phe 1 5 10 15 Ser Pro Met Ala 20

【００５８】配列番号：１２配列の長さ：１７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTAAAACGACGGCCAGT 17

【００５９】配列番号：１３配列の長さ：１７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CAGGAAACAGCTATGAC 17

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＡＭ２４タンパク質をコードする遺伝
子領域を含むＤＮＡ断片を有するシャロミドクローン、
ｐＣｈＡＭ２４−１とＡＭ２４タンパク質を発現するベ
クターｐＥＡＭ２４Ｘ１の構築を表す図面である。図中
Ａｍｐ^rはアンピシリン耐性遺伝子を、ＣＯＳはＣＯＳ
領域を、ｏｒｉは複製開始領域を表す。

【図２】本発明のＡＭ２４タンパク質を発現するベクタ
ーｐＥＡＭ２４Ｘ１の構築を表す図面である。図中、Ａ
ｍｐ^r、ｏｒｉは図１と同様であり、ｌａｃＩ^qはリプレ
ッサー遺伝子を、Ｐ_tacはｔａｃプロモーターを、ｌｐ
ｐ３’はｌｐｐ遺伝子ターミネーター領域を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 13/02 8931−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者森本裕紀神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者寺西豊神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地三菱化成株式会社総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有することを特徴
とする新規なタンパク質。３種のサブユニットから構成されるゲル濾過法によ
る分子量が約１１０，０００の水溶性酵素タンパク質で
あって，サブユニットのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分子量が以下の通りである。サブユニットα 分子量２６，０００±５００サブユニットβ 分子量１５，０００±５００サブユニットγ 分子量１６，５００±５００ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
【請求項２】サブユニットαが配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする請求項
１記載のタンパク質。
【請求項３】サブユニットβが配列表の配列番号２に
記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする請求項
１記載のタンパク質。
【請求項４】サブユニットγが配列表の配列番号３に
記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする請求項
１記載のタンパク質。
【請求項５】請求項１〜４記載のタンパク質をコード
する遺伝子。
【請求項６】配列表の配列番号４または５に記載の塩
基配列で表されることを特徴とする請求項５記載の遺伝
子。
【請求項７】請求項５または請求項６記載の遺伝子に
よりコードされるポリペプチドを発現する組換え発現ベ
クター。
【請求項８】請求項７記載の組換え発現ベクターで、
宿主細胞を形質転換させて得られた形質転換体。
【請求項９】請求項８記載の形質転換体を培養して請
求項１に記載のタンパク質を産生させる方法。
【請求項１０】請求項８記載の形質転換体を培養して
得られる形質転換体の培養液、該培養液から分離された
菌体、該菌体処理物、請求項１または２記載のタンパク
質またはこれらの固定化物をニトリル類に作用させて、
該ニトリル類に対応するアミド類を製造することを特徴
とするアミド類の製造方法。