JP3531997B2 - 形質転換体を用いたアミド化合物の製造法 - Google Patents
形質転換体を用いたアミド化合物の製造法Info
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- nitrile hydratase
- seq
- subunit
- nitrile
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はニトリルヒドラターゼ、
該酵素のα及びβサブユニットをコードする遺伝子、該
遺伝子を含有する組換えプラスミド及び該組換えプラス
ミドにより形質転換された形質転換体に関し、別の観点
から本願発明は上記形質転換体を用いてニトリルヒドラ
ターゼを製造する方法及び上記形質転換体を培養して得
られる培養液・分離菌体・菌体処理物を用いてニトリル
化合物から対応するアミド化合物を製造する方法に関す
る。
該酵素のα及びβサブユニットをコードする遺伝子、該
遺伝子を含有する組換えプラスミド及び該組換えプラス
ミドにより形質転換された形質転換体に関し、別の観点
から本願発明は上記形質転換体を用いてニトリルヒドラ
ターゼを製造する方法及び上記形質転換体を培養して得
られる培養液・分離菌体・菌体処理物を用いてニトリル
化合物から対応するアミド化合物を製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ニトリル化合物のニトリル基を水和して
アミド基に変換し対応するアミド化合物を製造する技術
においては、該水和反応の触媒として酸又はアルカリの
存在下加熱処理する方法や銅触媒を用いて加熱処理する
方法が知られていた。
アミド基に変換し対応するアミド化合物を製造する技術
においては、該水和反応の触媒として酸又はアルカリの
存在下加熱処理する方法や銅触媒を用いて加熱処理する
方法が知られていた。
【０００３】一方、近年該水和反応を触媒する機能を有
する酵素であるニトリルヒドラターゼを微生物を用いて
アミドを製造する方法が知られるようになった(特開昭5
9-2693号，同61-162193号，同62-91189号，同64-86889
号，特公昭56-17918号，同59-37951号，同62-21519号各
公報等)。この微生物を用いる製造方法は常温で水和反
応を行うことができ、ニトリルからアミドへの変換率も
高いため、他の化学的な方法に比較して優れている。し
かし微生物を水和反応の触媒とする場合、微生物本来の
ニトリル水和活性が十分とは言えないため、アミドの製
造コストに占める微生物触媒のコストが無視できないも
のとなり、工業的に利用可能なレベルにまで該コストを
引き下げることが重要となる。そのためには微生物菌体
重量当りのニトリル水和活性を向上させるためにはニト
リルヒドラターゼの菌体重量当りの発現量を向上させれ
ばよい。近年、ニトリルヒドラターゼの発現量を向上さ
せるためにニトリルヒドラターゼを遺伝子工学を用いて
菌体内に大量に発現させ、該菌体を利用してニトリル化
合物から対応するアミド化合物へ転換する方法が検討さ
れている。例えば、特公平３−５４５５８号公報にはロ
ドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物由来の２
つのヘテロなサブユニットよりなるニトリルヒドラター
ゼが酵素レベルで記載され、特開平２−１１９７７８号
公報にはロドコッカス属に属する微生物由来の２つのヘ
テロなサブユニットよりなるニトリルヒドラターゼ遺伝
子が記載され、特開平３−２５１１８４号公報にはシュ
ードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物由来の２
つのヘテロなサブユニットよりなるニトリルヒドラター
ゼ遺伝子が開示され、また欧州特許公開４５５６４６号
公報にはロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rh
odochrous）由来の２種のヘテロなサブユニットよりな
るニトリルヒドラターゼ遺伝子が開示されている。しか
し、これら公報に記載のニトリルヒドラターゼ遺伝子を
挿入断片として有する発現プラスミドによって形質転換
された大腸菌内に於けるニトリルヒドラターゼの活性発
現量は何れの場合も低く、形質転換体の菌体重量当りの
ニトリル水和活性は遺伝子の由来する元の微生物の活性
を下回っている(Ikehata,O., Nishiyama,M., Horinouch
i,S. and Beppu,T. ``Primary structure of nitrile
hydratase deduced from the nucleotide sequence of
a Rhodococcus speices N-774 and its expression in
Escherichia coli'' Eur. J. Biochem. 181(1989):563
-570、Nishiyama,M., Horinouchi,S., Kobayashi,M., N
agasawa,T., Yamada,H. and Beppu,T. ``Cloning and
Characterization of Genes Responsible for Metaboli
sm of Nitrile Compounds from Pseudomonas chlororap
his B23'' Journal of bacteriology 173(1991):2465-
2472、Kobayashi,M., Nishiyama,M., Nagasawa,T., Hor
inouchi,S., Beppu,T. and Yamada,H. ``Cloning nucl
eotide sequence andexpression in Escherichia coli
of two cobalt-containing nitrile hydratase genes f
rom Rhodococcus rhodochrous J1'' Biochimica et Bi
ophysica Acta. 1129(1991):23-33)。この様に大腸菌内
でのニトリルヒドラターゼの活性の発現自体は可能であ
るが、工業的なアミドの製造に利用し得るほど高いニト
リル水和活性を有する形質転換体を得るということは決
して容易でない。
する酵素であるニトリルヒドラターゼを微生物を用いて
アミドを製造する方法が知られるようになった(特開昭5
9-2693号，同61-162193号，同62-91189号，同64-86889
号，特公昭56-17918号，同59-37951号，同62-21519号各
公報等)。この微生物を用いる製造方法は常温で水和反
応を行うことができ、ニトリルからアミドへの変換率も
高いため、他の化学的な方法に比較して優れている。し
かし微生物を水和反応の触媒とする場合、微生物本来の
ニトリル水和活性が十分とは言えないため、アミドの製
造コストに占める微生物触媒のコストが無視できないも
のとなり、工業的に利用可能なレベルにまで該コストを
引き下げることが重要となる。そのためには微生物菌体
重量当りのニトリル水和活性を向上させるためにはニト
リルヒドラターゼの菌体重量当りの発現量を向上させれ
ばよい。近年、ニトリルヒドラターゼの発現量を向上さ
せるためにニトリルヒドラターゼを遺伝子工学を用いて
菌体内に大量に発現させ、該菌体を利用してニトリル化
合物から対応するアミド化合物へ転換する方法が検討さ
れている。例えば、特公平３−５４５５８号公報にはロ
ドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物由来の２
つのヘテロなサブユニットよりなるニトリルヒドラター
ゼが酵素レベルで記載され、特開平２−１１９７７８号
公報にはロドコッカス属に属する微生物由来の２つのヘ
テロなサブユニットよりなるニトリルヒドラターゼ遺伝
子が記載され、特開平３−２５１１８４号公報にはシュ
ードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物由来の２
つのヘテロなサブユニットよりなるニトリルヒドラター
ゼ遺伝子が開示され、また欧州特許公開４５５６４６号
公報にはロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rh
odochrous）由来の２種のヘテロなサブユニットよりな
るニトリルヒドラターゼ遺伝子が開示されている。しか
し、これら公報に記載のニトリルヒドラターゼ遺伝子を
挿入断片として有する発現プラスミドによって形質転換
された大腸菌内に於けるニトリルヒドラターゼの活性発
現量は何れの場合も低く、形質転換体の菌体重量当りの
ニトリル水和活性は遺伝子の由来する元の微生物の活性
を下回っている(Ikehata,O., Nishiyama,M., Horinouch
i,S. and Beppu,T. ``Primary structure of nitrile
hydratase deduced from the nucleotide sequence of
a Rhodococcus speices N-774 and its expression in
Escherichia coli'' Eur. J. Biochem. 181(1989):563
-570、Nishiyama,M., Horinouchi,S., Kobayashi,M., N
agasawa,T., Yamada,H. and Beppu,T. ``Cloning and
Characterization of Genes Responsible for Metaboli
sm of Nitrile Compounds from Pseudomonas chlororap
his B23'' Journal of bacteriology 173(1991):2465-
2472、Kobayashi,M., Nishiyama,M., Nagasawa,T., Hor
inouchi,S., Beppu,T. and Yamada,H. ``Cloning nucl
eotide sequence andexpression in Escherichia coli
of two cobalt-containing nitrile hydratase genes f
rom Rhodococcus rhodochrous J1'' Biochimica et Bi
ophysica Acta. 1129(1991):23-33)。この様に大腸菌内
でのニトリルヒドラターゼの活性の発現自体は可能であ
るが、工業的なアミドの製造に利用し得るほど高いニト
リル水和活性を有する形質転換体を得るということは決
して容易でない。
【０００４】また、ニトリルヒドラターゼのうち、α-
ヒドロキシイソブチロニトリルを基質とし得るものはあ
まり知られておらず、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を挿
入断片として有する発現プラスミドによって形質転換さ
れた大腸菌を用いてα-ヒドロキシイソブチロニトリル
からα-ヒドロキシイソブチルアミドを製造する方法は
これまで全く知られていない。
ヒドロキシイソブチロニトリルを基質とし得るものはあ
まり知られておらず、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を挿
入断片として有する発現プラスミドによって形質転換さ
れた大腸菌を用いてα-ヒドロキシイソブチロニトリル
からα-ヒドロキシイソブチルアミドを製造する方法は
これまで全く知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上の通り、ニトリル
から対応するアミドを工業的に製造するに際しては、該
製造に使用し得る程度に菌体重量当たりのニトリルヒド
ラターゼ活性が高い微生物を得ることが必要であった
が、その様なものは知られていなかった。
から対応するアミドを工業的に製造するに際しては、該
製造に使用し得る程度に菌体重量当たりのニトリルヒド
ラターゼ活性が高い微生物を得ることが必要であった
が、その様なものは知られていなかった。
【０００６】本発明の目的は、高いニトリル水和活性を
持つニトリルヒドラターゼ、特にα-ヒドロキシイソブ
チロニトリルをも基質とし得るニトリルヒドラターゼを
提供することにあり、また本発明の他の目的は、高いニ
トリル水和活性を持つニトリルヒドラターゼをコードす
る遺伝子、該遺伝子を含有する組換えプラスミド、該組
換えプラスミドにより形質転換された形質転換体を提供
することにある。そしてまた、本発明の他の目的は、高
いニトリル水和活性を発現する形質転換体を用いてニト
リルから対応するアミドを製造することにある。
持つニトリルヒドラターゼ、特にα-ヒドロキシイソブ
チロニトリルをも基質とし得るニトリルヒドラターゼを
提供することにあり、また本発明の他の目的は、高いニ
トリル水和活性を持つニトリルヒドラターゼをコードす
る遺伝子、該遺伝子を含有する組換えプラスミド、該組
換えプラスミドにより形質転換された形質転換体を提供
することにある。そしてまた、本発明の他の目的は、高
いニトリル水和活性を発現する形質転換体を用いてニト
リルから対応するアミドを製造することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる状況
のもと鋭意検討を重ねた結果、アクロモバクター・キセ
ロシス（Achromobacter xerosis IFO 12668）中に極め
て高いニトリル水和活性を有するニトリルヒドラターゼ
（以降AxNHと称することがある）を見出し、該酵素をコ
ードする遺伝子をＤＮＡ組換え技術によりクローニング
し、得られた遺伝子を発現ベクターに組み込んで得られ
る発現プラスミドを用いて大腸菌の形質転換を作製し、
得られた形質転換体によりAxNH蛋白質を大量に生産させ
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
のもと鋭意検討を重ねた結果、アクロモバクター・キセ
ロシス（Achromobacter xerosis IFO 12668）中に極め
て高いニトリル水和活性を有するニトリルヒドラターゼ
（以降AxNHと称することがある）を見出し、該酵素をコ
ードする遺伝子をＤＮＡ組換え技術によりクローニング
し、得られた遺伝子を発現ベクターに組み込んで得られ
る発現プラスミドを用いて大腸菌の形質転換を作製し、
得られた形質転換体によりAxNH蛋白質を大量に生産させ
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明は配列表の配列番号：１記載
のアミノ酸配列或いは該アミノ酸配列の一部を削除、置
換、修飾又は挿入して得られたαサブユニット、及び配
列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列或いは該アミノ
酸配列の一部を削除、置換、修飾又は挿入して得られた
βサブユニットよりなるニトリルヒドラターゼ、該酵素
のα、βサブユニットをコードする遺伝子、該遺伝子を
含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドにより形質
転換された形質転換体、該形質転換体を用いたニトリル
ヒドラターゼの生産法、及び該形質転換体を用いたアミ
ドの製造方法を提供するものである。
のアミノ酸配列或いは該アミノ酸配列の一部を削除、置
換、修飾又は挿入して得られたαサブユニット、及び配
列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列或いは該アミノ
酸配列の一部を削除、置換、修飾又は挿入して得られた
βサブユニットよりなるニトリルヒドラターゼ、該酵素
のα、βサブユニットをコードする遺伝子、該遺伝子を
含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドにより形質
転換された形質転換体、該形質転換体を用いたニトリル
ヒドラターゼの生産法、及び該形質転換体を用いたアミ
ドの製造方法を提供するものである。
【０００９】本発明のニトリルヒドラターゼは、α、β
の二つのサブユニットからなる蛋白質であり、アクロモ
バクター・キセロシス（Achromobacter xerosis IFO 12
668）由来のニトリルヒドラターゼが第１に例示され
る。上記菌株は財団法人 発酵研究所（大阪府大阪市十
三本町２丁目１７番８５号）に番号IFO 12668として保
管され、何人にも請求により自由に分譲される。該酵素
はαサブユニットが193個、βサブユニットが220個のア
ミノ酸残基よりなるものである。そして本発明において
は該サブユニットのアミノ酸配列の一部を削除、置換、
修飾又は挿入して得られたものもニトリル水和活性を有
する限り本発明のニトリルヒドラターゼに含まれる。本
発明のニトリルヒドラターゼは、α、βサブユニットが
それぞれ１つずつ結合しているものと考えられる。本発
明のニトリルヒドラターゼを得るためには、アクロモバ
クター・キセロシスを培養し、通常の方法で菌体より分
離してもよいが、好ましくは以下に述べる方法により得
られた形質転換体より分離することができる。
の二つのサブユニットからなる蛋白質であり、アクロモ
バクター・キセロシス（Achromobacter xerosis IFO 12
668）由来のニトリルヒドラターゼが第１に例示され
る。上記菌株は財団法人 発酵研究所（大阪府大阪市十
三本町２丁目１７番８５号）に番号IFO 12668として保
管され、何人にも請求により自由に分譲される。該酵素
はαサブユニットが193個、βサブユニットが220個のア
ミノ酸残基よりなるものである。そして本発明において
は該サブユニットのアミノ酸配列の一部を削除、置換、
修飾又は挿入して得られたものもニトリル水和活性を有
する限り本発明のニトリルヒドラターゼに含まれる。本
発明のニトリルヒドラターゼは、α、βサブユニットが
それぞれ１つずつ結合しているものと考えられる。本発
明のニトリルヒドラターゼを得るためには、アクロモバ
クター・キセロシスを培養し、通常の方法で菌体より分
離してもよいが、好ましくは以下に述べる方法により得
られた形質転換体より分離することができる。
【００１０】本発明のニトリルヒドラターゼのα、βサ
ブユニットをコードする遺伝子としては、アクロモバク
ター・キセロシス（Achromobacter xerosis IFO 1266
8）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子が第１に例示さ
れる。そしてそのような遺伝子としては配列表の配列番
号：３或いは：４に示される塩基配列を有するものが挙
げられ、それらは各々全長582ｂｐ及び663ｂｐの長さで
ある。また、該遺伝子の塩基配列の一部を削除、置換、
修飾又は挿入して得られたものもコードされる蛋白質が
ニトリル水和活性を有する限り本発明の遺伝子に含まれ
る。ニトリルヒドラターゼのα、βサブユニットをコー
ドする遺伝子を得るには、例えば以下のような方法が利
用できる。則ち、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微
生物から染色体ＤＮＡを調製し、得られた染色体ＤＮＡ
をT.Maniatisらの方法(Molecular Cloning 2nd Editio
n;Cold Spring Harbor Laboratory Press;1989)等に記
載の方法に従って大腸菌に導入してプラスミドライブラ
リーを作製する。得られた大腸菌を培養して、培養菌体
（或いは培養液）のニトリル水和活性を測定することに
よって大腸菌の陽性クローンを選択し、選別された陽性
クローンから常法に従いＤＮＡを抽出することにより目
的とする遺伝子をコードするＤＮＡを得る。プラスミド
ライブラリーを作製する際の染色体ＤＮＡの起源として
は、本発明の遺伝子をコードするものであればよく、そ
のようなものとしてアクロモバクター・キセロシス（Ac
hromobacter xerosis IFO 12668）が例示できる。以上
のようにして得られたニトリルヒドラターゼのα、βサ
ブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定するた
めには、以下のような方法を用いればよい。則ち、目的
の遺伝子を含む陽性コロニーからT.Maniatisらの方法
（MolecularCloning 2nd Edition; Cold Spring Harbor
Laboratory Press;1989）によりＤＮＡを調製し、適当
な制限酵素で切断後、pUC18(ファルマシア社製)等のベ
クタープラスミドにクローニングし、Sangerらのdideox
y法(Proceedings of National Academy Science USA;7
4,5463,1977)によって塩基配列を決定する。
ブユニットをコードする遺伝子としては、アクロモバク
ター・キセロシス（Achromobacter xerosis IFO 1266
8）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子が第１に例示さ
れる。そしてそのような遺伝子としては配列表の配列番
号：３或いは：４に示される塩基配列を有するものが挙
げられ、それらは各々全長582ｂｐ及び663ｂｐの長さで
ある。また、該遺伝子の塩基配列の一部を削除、置換、
修飾又は挿入して得られたものもコードされる蛋白質が
ニトリル水和活性を有する限り本発明の遺伝子に含まれ
る。ニトリルヒドラターゼのα、βサブユニットをコー
ドする遺伝子を得るには、例えば以下のような方法が利
用できる。則ち、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微
生物から染色体ＤＮＡを調製し、得られた染色体ＤＮＡ
をT.Maniatisらの方法(Molecular Cloning 2nd Editio
n;Cold Spring Harbor Laboratory Press;1989)等に記
載の方法に従って大腸菌に導入してプラスミドライブラ
リーを作製する。得られた大腸菌を培養して、培養菌体
（或いは培養液）のニトリル水和活性を測定することに
よって大腸菌の陽性クローンを選択し、選別された陽性
クローンから常法に従いＤＮＡを抽出することにより目
的とする遺伝子をコードするＤＮＡを得る。プラスミド
ライブラリーを作製する際の染色体ＤＮＡの起源として
は、本発明の遺伝子をコードするものであればよく、そ
のようなものとしてアクロモバクター・キセロシス（Ac
hromobacter xerosis IFO 12668）が例示できる。以上
のようにして得られたニトリルヒドラターゼのα、βサ
ブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定するた
めには、以下のような方法を用いればよい。則ち、目的
の遺伝子を含む陽性コロニーからT.Maniatisらの方法
（MolecularCloning 2nd Edition; Cold Spring Harbor
Laboratory Press;1989）によりＤＮＡを調製し、適当
な制限酵素で切断後、pUC18(ファルマシア社製)等のベ
クタープラスミドにクローニングし、Sangerらのdideox
y法(Proceedings of National Academy Science USA;7
4,5463,1977)によって塩基配列を決定する。
【００１１】本発明の組換えプラスミドは、上記ニトリ
ルヒドラターゼのα、βサブユニットをコードする遺伝
子を含むものであり、種々の発現ベクターに該遺伝子、
該遺伝子の発現を調節する領域及び／または選択マーカ
ーが含まれるものである。発現ベクターとして使用する
ものとしては、ColE1由来のori領域を有しているプラス
ミドが好ましい。選択マーカーとしてはampicillin,tet
racycline,kanamycin等といった抗生物質に対する薬剤
耐性遺伝子をコードしたものであれば取り扱いが容易で
ある。ニトリルヒドラターゼのα、βサブユニットをコ
ードする遺伝子発現を調節する領域とはプロモーター及
びリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）が挙げられるが、組
換えプラスミドの宿主を大腸菌とする場合には、発現プ
ラスミドはプロモーターとしてlac,trp,tac,trcの何れ
かを有していることが好ましく、またリボゾーム結合部
位も大腸菌型であることが好ましい。プロモーターは本
発明の遺伝子が転写され得る位置に連結するべきであ
り、連結の順序は更にＤＮＡの５’側から３’側に向か
ってプロモーター、リボゾーム結合部位、本発明の遺伝
子の順である。
ルヒドラターゼのα、βサブユニットをコードする遺伝
子を含むものであり、種々の発現ベクターに該遺伝子、
該遺伝子の発現を調節する領域及び／または選択マーカ
ーが含まれるものである。発現ベクターとして使用する
ものとしては、ColE1由来のori領域を有しているプラス
ミドが好ましい。選択マーカーとしてはampicillin,tet
racycline,kanamycin等といった抗生物質に対する薬剤
耐性遺伝子をコードしたものであれば取り扱いが容易で
ある。ニトリルヒドラターゼのα、βサブユニットをコ
ードする遺伝子発現を調節する領域とはプロモーター及
びリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）が挙げられるが、組
換えプラスミドの宿主を大腸菌とする場合には、発現プ
ラスミドはプロモーターとしてlac,trp,tac,trcの何れ
かを有していることが好ましく、またリボゾーム結合部
位も大腸菌型であることが好ましい。プロモーターは本
発明の遺伝子が転写され得る位置に連結するべきであ
り、連結の順序は更にＤＮＡの５’側から３’側に向か
ってプロモーター、リボゾーム結合部位、本発明の遺伝
子の順である。
【００１２】上述のようにして構築された組換え発現プ
ラスミドは大腸菌，酵母，他の微生物，動物細胞等の宿
主細胞に公知の形質転換法によって導入される。得られ
た形質転換体の培養はMolecular Cloning 2nd Edition
(Cold Spring Harbor Laboratory Press;1989)に記載の
方法を参考にして行うことができる。培養温度は28〜42
℃が適当である。この様にして培養された細胞から本発
明のニトリルヒドラターゼを分離精製することができ
る。
ラスミドは大腸菌，酵母，他の微生物，動物細胞等の宿
主細胞に公知の形質転換法によって導入される。得られ
た形質転換体の培養はMolecular Cloning 2nd Edition
(Cold Spring Harbor Laboratory Press;1989)に記載の
方法を参考にして行うことができる。培養温度は28〜42
℃が適当である。この様にして培養された細胞から本発
明のニトリルヒドラターゼを分離精製することができ
る。
【００１３】本発明の形質転換体或いは上述のニトリル
ヒドラターゼを用いてニトリル化合物から対応するアミ
ドを製造するには、ニトリルヒドラターゼ、或いは形質
転換体の培養液、培養液から得られた分離細胞、該細胞
の処理物等の存在下、ニトリルを水性媒体中で反応すれ
ばよい。反応温度は特に限定されないが、ニトリルヒド
ラターゼが失活しない範囲でしかもニトリルヒドラター
ゼが充分発揮される温度である。
ヒドラターゼを用いてニトリル化合物から対応するアミ
ドを製造するには、ニトリルヒドラターゼ、或いは形質
転換体の培養液、培養液から得られた分離細胞、該細胞
の処理物等の存在下、ニトリルを水性媒体中で反応すれ
ばよい。反応温度は特に限定されないが、ニトリルヒド
ラターゼが失活しない範囲でしかもニトリルヒドラター
ゼが充分発揮される温度である。
【００１４】本発明の製造法に利用されるニトリル化合
物としては、アセトニトリル，プロピオニトリル，アク
リロニトリル，メタクリロニトリル，n-ブチロニトリ
ル，イソブチロニトリル，α-ヒドロキシイソブチロニ
トリル等といった炭素数2〜4のニトリル化合物が挙げら
れる。これら原料の反応液への添加量は、原料基質によ
る酵素の失活を考慮して決定される。
物としては、アセトニトリル，プロピオニトリル，アク
リロニトリル，メタクリロニトリル，n-ブチロニトリ
ル，イソブチロニトリル，α-ヒドロキシイソブチロニ
トリル等といった炭素数2〜4のニトリル化合物が挙げら
れる。これら原料の反応液への添加量は、原料基質によ
る酵素の失活を考慮して決定される。
【００１５】
【実施例】以下の実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明は以下の実施例によって何等限定される
ものではない。
するが、本発明は以下の実施例によって何等限定される
ものではない。
【００１６】〔実施例１〕(1) アクロモバクター・キセロシスの染色体DNAの調製
アクロモバクター・キセロシス(Achromobacter xerosis
IFO 12668)の染色体DNAを常法に従って調製した。即
ち、アクロモバクター キセロシス(Achromobacter xero
sis:IFO12668)を１ｌのＬＢ培地（バクトトリプトン １
０ｇ／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／
ｌ、ｐＨ７．２）に植菌して培養した後、遠心分離によ
り集菌した。得られた菌体を５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）１６０ｍｌ
に懸濁し、リゾチーム１６０ｍｇを加えて３７℃にて２
０分間緩やかに攪拌した後、２０％ＳＤＳ４ｍｌを加
え、６５℃にて２０分保温した。更に８ｍｇのProteina
se Kを加え、３７℃にて１時間保温した。次にＴＥ（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ
８．０）により飽和したフェノール１６０ｍｌを加え、
緩やかに攪拌した。遠心分離後の上層にクロロホルム１
６０ｍｌを加えて再抽出した。更にこれを遠心分離して
上層を回収し、エタノール３２０ｍｌを加え、ガラス棒
でDNAを巻取り、回収したDNAを７０％、８０％、９０％
のエタノールで順次脱水した。次にDNAをＴＥ４０ｍｌ
に溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌ RNase A水溶液を２００μ
ｌ加えて３７℃で１．５時間保温した。その後フェノー
ル抽出，クロロホルム抽出を施し、エタノール沈殿によ
ってDNAを回収した。その結果、最終的に２ｍｇのアク
ロモバクター・キセロシス染色体DNAが得られた。
IFO 12668)の染色体DNAを常法に従って調製した。即
ち、アクロモバクター キセロシス(Achromobacter xero
sis:IFO12668)を１ｌのＬＢ培地（バクトトリプトン １
０ｇ／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／
ｌ、ｐＨ７．２）に植菌して培養した後、遠心分離によ
り集菌した。得られた菌体を５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）１６０ｍｌ
に懸濁し、リゾチーム１６０ｍｇを加えて３７℃にて２
０分間緩やかに攪拌した後、２０％ＳＤＳ４ｍｌを加
え、６５℃にて２０分保温した。更に８ｍｇのProteina
se Kを加え、３７℃にて１時間保温した。次にＴＥ（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ
８．０）により飽和したフェノール１６０ｍｌを加え、
緩やかに攪拌した。遠心分離後の上層にクロロホルム１
６０ｍｌを加えて再抽出した。更にこれを遠心分離して
上層を回収し、エタノール３２０ｍｌを加え、ガラス棒
でDNAを巻取り、回収したDNAを７０％、８０％、９０％
のエタノールで順次脱水した。次にDNAをＴＥ４０ｍｌ
に溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌ RNase A水溶液を２００μ
ｌ加えて３７℃で１．５時間保温した。その後フェノー
ル抽出，クロロホルム抽出を施し、エタノール沈殿によ
ってDNAを回収した。その結果、最終的に２ｍｇのアク
ロモバクター・キセロシス染色体DNAが得られた。
【００１７】(2) AxNH蛋白質遺伝子をその挿入断片に含
むクローンのスクリーニング 前述の染色体DNA標品の１００μｇを制限酵素XhoI(宝酒
造社製)によって消化し、ショ糖密度勾配遠心分離を行
って５ｋｂ以上のDNA断片を分離・回収した。回収され
たDNA断片約１００ｎｇとプラスミドベクターpBluescri
pt SK+(ストラタジーン社製)のDNAを制限酵素XhoIによ
って消化したものを、更にバクテリアル・アルカリフォ
スタファーゼ(宝酒造社製)（ＢＡＰ）で５’末端を脱リ
ン酸化した後、フェノール／クロロホルム抽出，エタノ
ール沈殿することによって得たpBluescript SK+／XhoI
BAP約３０ｎｇとをDNAライゲーションキット(宝酒造社
製)を用いたライゲーション反応に供した。以上の様に
して得られたライゲーション産物によって大腸菌DH5コ
ンピテントセル(Competent High DH5:東洋紡績社製)を
形質転換し、直径１４ｃｍのアンピシリン含有（１００
μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地入りシャーレに菌液を塗布し
た。シャーレを２８℃にて一晩保温した結果、一枚当り
２０００〜３０００個のコロニーが出現した。この様に
して生じたコロニーをスクリーニングのライブラリーと
して用いた。ライブラリーのコロニーの一部を掻き採
り、２．５％のアクリロニトリルを含んだ５０ｍＭ リ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） １００μｌに懸濁
し、１０℃にて一晩保温した。遠心分離によって得られ
る上清を蒸留水にて１０倍に希釈し、HPLC(High Perfor
mance Liquid Chromatography)によるアクリルアミドの
検出を行った。アクリルアミドの検出が見られた陽性コ
ロニーをLB培地に懸濁して直径８ｃｍのアンピシリン含
有（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地入りシャーレに一
枚当たりコロニーが１００個程度出現する様に塗布し、
再度同様なスクリーニングを行うことによって陽性クロ
ーンの純化を行った。
むクローンのスクリーニング 前述の染色体DNA標品の１００μｇを制限酵素XhoI(宝酒
造社製)によって消化し、ショ糖密度勾配遠心分離を行
って５ｋｂ以上のDNA断片を分離・回収した。回収され
たDNA断片約１００ｎｇとプラスミドベクターpBluescri
pt SK+(ストラタジーン社製)のDNAを制限酵素XhoIによ
って消化したものを、更にバクテリアル・アルカリフォ
スタファーゼ(宝酒造社製)（ＢＡＰ）で５’末端を脱リ
ン酸化した後、フェノール／クロロホルム抽出，エタノ
ール沈殿することによって得たpBluescript SK+／XhoI
BAP約３０ｎｇとをDNAライゲーションキット(宝酒造社
製)を用いたライゲーション反応に供した。以上の様に
して得られたライゲーション産物によって大腸菌DH5コ
ンピテントセル(Competent High DH5:東洋紡績社製)を
形質転換し、直径１４ｃｍのアンピシリン含有（１００
μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地入りシャーレに菌液を塗布し
た。シャーレを２８℃にて一晩保温した結果、一枚当り
２０００〜３０００個のコロニーが出現した。この様に
して生じたコロニーをスクリーニングのライブラリーと
して用いた。ライブラリーのコロニーの一部を掻き採
り、２．５％のアクリロニトリルを含んだ５０ｍＭ リ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） １００μｌに懸濁
し、１０℃にて一晩保温した。遠心分離によって得られ
る上清を蒸留水にて１０倍に希釈し、HPLC(High Perfor
mance Liquid Chromatography)によるアクリルアミドの
検出を行った。アクリルアミドの検出が見られた陽性コ
ロニーをLB培地に懸濁して直径８ｃｍのアンピシリン含
有（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地入りシャーレに一
枚当たりコロニーが１００個程度出現する様に塗布し、
再度同様なスクリーニングを行うことによって陽性クロ
ーンの純化を行った。
【００１８】〔実施例２〕得られた陽性クローンの挿入DNA断片のサブクローニン
グ及び塩基配列の決定 純化した陽性クローンからプラスミドDNA pBAN-7（図
１）をアルカリ法を用いて調製し、必要なDNA領域を適
宜制限酵素で小断片化した後、プラスミドベクターpUC1
8及び19(ファルマシア社製)へのサブクローニングを行
った。得られたサブクローンからプラスミドDNAをQIApr
ep-spin(DIAGEN社製)により調製し、abi社製のシークエ
ンシングキットとオートシークエンサー373Aを用いて塩
基配列を決定した。この結果、配列表の配列番号：３及
び：４に示す塩基配列が得られた。
グ及び塩基配列の決定 純化した陽性クローンからプラスミドDNA pBAN-7（図
１）をアルカリ法を用いて調製し、必要なDNA領域を適
宜制限酵素で小断片化した後、プラスミドベクターpUC1
8及び19(ファルマシア社製)へのサブクローニングを行
った。得られたサブクローンからプラスミドDNAをQIApr
ep-spin(DIAGEN社製)により調製し、abi社製のシークエ
ンシングキットとオートシークエンサー373Aを用いて塩
基配列を決定した。この結果、配列表の配列番号：３及
び：４に示す塩基配列が得られた。
【００１９】〔実施例３〕AxNH蛋白質発現用プラスミド及び形質転換体の構築
実施例２で得たAxNH蛋白質遺伝子DNAを含むプラスミドp
BAN-7DNA100ngを制限酵素KpnI(宝酒造社製)及びSacII
(宝酒造社製)で消化した後にアガロースゲル電気泳動に
より、AxNH蛋白質遺伝子を含む約３ｋｂｐのDNA断片及
びベクター(pBluescriptSK+)を含む約２．９ｋｂｐのDN
A断片を分離した後、エタノール沈殿により該DNA断片混
合物を濃縮し５μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解した。この断
片同士をDNAライゲーションキット(宝酒造社製)を用い
たライゲーション反応に供した。この反応液を用いて大
腸菌DH5コンピテントセルの形質転換を行うことによ
り、AxNH蛋白質遺伝子を含むDNA断片が挿入された発現
用プラスミドであるpBAN-2（図２）を含有する形質転換
体MT10770を得た。MT10770は受託番号FERM P-14756とし
て茨城県つくば市東１丁目１番３号にある工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている。
BAN-7DNA100ngを制限酵素KpnI(宝酒造社製)及びSacII
(宝酒造社製)で消化した後にアガロースゲル電気泳動に
より、AxNH蛋白質遺伝子を含む約３ｋｂｐのDNA断片及
びベクター(pBluescriptSK+)を含む約２．９ｋｂｐのDN
A断片を分離した後、エタノール沈殿により該DNA断片混
合物を濃縮し５μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解した。この断
片同士をDNAライゲーションキット(宝酒造社製)を用い
たライゲーション反応に供した。この反応液を用いて大
腸菌DH5コンピテントセルの形質転換を行うことによ
り、AxNH蛋白質遺伝子を含むDNA断片が挿入された発現
用プラスミドであるpBAN-2（図２）を含有する形質転換
体MT10770を得た。MT10770は受託番号FERM P-14756とし
て茨城県つくば市東１丁目１番３号にある工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００２０】〔実施例４〕MT10770を用いたAxNH蛋白質の産生及びニトリル化合物
からアミド化合物への変換 実施例３で得られた形質転換体MT10770を１００μｇ／
ｍｌのアンピシリン及び４０μｇ／ｍｌ ＦｅＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ，１０μｇ／ｍｌ ＣｏＣｌ2 ２Ｈ2Ｏを含む１０
ｍｌのＬＢ培地に接種し、２８℃にて一晩（約１５時
間）培養した。培養終了後、遠心分離により得られた集
菌体を生理食塩水にて洗浄した後、２ｍｌの５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この
懸濁液２００μｌを３％（ｗ／ｖ）アクリロニトリルを
含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）８０
０μｌに懸濁し、１０℃にて１時間反応させた。反応終
了後、HPLCを用いて反応液の分析を行ったところ、反応
液中にはアクリルアミドのみが検出され、アクリロニト
リル及びアクリル酸の存在は認められなかった。転換効
率は１００％であった。同様にして上にて得られたMT10
770の懸濁液２００μｌを４％（ｖ／ｖ）α−ヒドロキ
シイソブチロニトリル及び２５％（ｖ／ｖ） アセトン
を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）８
００μｌに懸濁し、１０℃にて１時間反応させた。反応
終了後、HPLCを用いて反応液の分析を行ったところ、反
応液中にはα−ヒドロキシイソブチルアミドのみが検出
され、α−ヒドロキシイソブチロニトリルの存在は認め
られなかった。転換効率は１００％であった。これに対
し、上記発現プラスミドpBAN-2の代りにそのベクター部
分であるpBluescript SK+のみを含む形質転換体(DH5(pB
luescript SK+))を用いて同様な実験を行ったところ、
反応終了後の反応液中にアクリルアミド及びα−ヒドロ
キシイソブチルアミドを検出することはできなかった。
尚、培地への金属成分の添加は重要であり、添加を行わ
ない培地を用いてMT10770を培養して同様な実験を行っ
たところ、反応終了後の反応液中に於けるアクリルアミ
ド及びα−ヒドロキシイソブチルアミドの検出量は極め
て少量であった。
からアミド化合物への変換 実施例３で得られた形質転換体MT10770を１００μｇ／
ｍｌのアンピシリン及び４０μｇ／ｍｌ ＦｅＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ，１０μｇ／ｍｌ ＣｏＣｌ2 ２Ｈ2Ｏを含む１０
ｍｌのＬＢ培地に接種し、２８℃にて一晩（約１５時
間）培養した。培養終了後、遠心分離により得られた集
菌体を生理食塩水にて洗浄した後、２ｍｌの５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この
懸濁液２００μｌを３％（ｗ／ｖ）アクリロニトリルを
含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）８０
０μｌに懸濁し、１０℃にて１時間反応させた。反応終
了後、HPLCを用いて反応液の分析を行ったところ、反応
液中にはアクリルアミドのみが検出され、アクリロニト
リル及びアクリル酸の存在は認められなかった。転換効
率は１００％であった。同様にして上にて得られたMT10
770の懸濁液２００μｌを４％（ｖ／ｖ）α−ヒドロキ
シイソブチロニトリル及び２５％（ｖ／ｖ） アセトン
を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）８
００μｌに懸濁し、１０℃にて１時間反応させた。反応
終了後、HPLCを用いて反応液の分析を行ったところ、反
応液中にはα−ヒドロキシイソブチルアミドのみが検出
され、α−ヒドロキシイソブチロニトリルの存在は認め
られなかった。転換効率は１００％であった。これに対
し、上記発現プラスミドpBAN-2の代りにそのベクター部
分であるpBluescript SK+のみを含む形質転換体(DH5(pB
luescript SK+))を用いて同様な実験を行ったところ、
反応終了後の反応液中にアクリルアミド及びα−ヒドロ
キシイソブチルアミドを検出することはできなかった。
尚、培地への金属成分の添加は重要であり、添加を行わ
ない培地を用いてMT10770を培養して同様な実験を行っ
たところ、反応終了後の反応液中に於けるアクリルアミ
ド及びα−ヒドロキシイソブチルアミドの検出量は極め
て少量であった。
【００２１】〔比較例１〕MT10770とアクロモバクター・キセロシスとのニトリル
水和活性の比較 実施例４で得られたMT10770の集菌体及び実施例１で得
られたアクロモバクター・キセロシス集菌体を各々用
い、アクリロニトリルの水和活性を比較する実験を行っ
た。２．７％（ｗ／ｖ） アクリロニトリルを含む５０
ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに
菌体２ｍｇを懸濁し、１０℃にて１時間反応させた。反
応終了後、HPLCを用いて反応液中に含まれるアクリルア
ミド量の定量を行った。その結果を図３に示した。この
結果よりMT10770はその元株であるアクロモバクター・
キセロシス IFO12668と比較して、菌体重量当り約２０
倍のアクリロニトリル水和活性を有していることが示さ
れた。
水和活性の比較 実施例４で得られたMT10770の集菌体及び実施例１で得
られたアクロモバクター・キセロシス集菌体を各々用
い、アクリロニトリルの水和活性を比較する実験を行っ
た。２．７％（ｗ／ｖ） アクリロニトリルを含む５０
ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに
菌体２ｍｇを懸濁し、１０℃にて１時間反応させた。反
応終了後、HPLCを用いて反応液中に含まれるアクリルア
ミド量の定量を行った。その結果を図３に示した。この
結果よりMT10770はその元株であるアクロモバクター・
キセロシス IFO12668と比較して、菌体重量当り約２０
倍のアクリロニトリル水和活性を有していることが示さ
れた。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、ニトリルヒドラターゼ活
性の高いニトリルヒドラターゼが得られる。また、本発
明により工業的にニトリルから対応するアミドを製造、
とりわけ、形質転換体を用いてイソブチロニトリルをア
ミドに変換する方法が提供される。ニトリルヒドラター
ゼ活性を有するαサブユニット，βサブユニットの二つ
のポリペプチドから成るAchromobacter xerosis IFO126
68由来のAxNH蛋白質をコードする新規なDNA断片が得ら
れた。さらに本発明で構築した発現プラスミドによって
形質転換を行った大腸菌を用いることでニトリル化合物
をその対応するアミド化合物に変換させることが可能と
なった。また、本発明の方法を用いることにより、ニト
リル化合物よりアミド化合物を効率良く製造することが
可能となる。
性の高いニトリルヒドラターゼが得られる。また、本発
明により工業的にニトリルから対応するアミドを製造、
とりわけ、形質転換体を用いてイソブチロニトリルをア
ミドに変換する方法が提供される。ニトリルヒドラター
ゼ活性を有するαサブユニット，βサブユニットの二つ
のポリペプチドから成るAchromobacter xerosis IFO126
68由来のAxNH蛋白質をコードする新規なDNA断片が得ら
れた。さらに本発明で構築した発現プラスミドによって
形質転換を行った大腸菌を用いることでニトリル化合物
をその対応するアミド化合物に変換させることが可能と
なった。また、本発明の方法を用いることにより、ニト
リル化合物よりアミド化合物を効率良く製造することが
可能となる。
【００２３】
【００２４】配列番号：1
配列の長さ：193
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Protein
起源
生物名：Achromobacter xerosis
株名：IFO12668
直接の起源
クローン名：pBAN-2
配列の特徴
特徴を決定した方法：E
他の情報：AxNH蛋白質αサブユニット
【００２５】配列番号：2
配列の長さ：220
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Protein
起源
生物名：Achromobacter xerosis
株名：IFO12668
直接の起源
クローン名：pBAN-2
配列の特徴
特徴を決定した方法：E
他の情報：AxNH蛋白質βサブユニット
【００２６】配列番号：3
配列の長さ：582
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Achromobacter xerosis IFO12668
直接の起源
クローン名：pBAN-2
配列の特徴
特徴を決定した方法：E
他の情報：AxNH蛋白質αサブユニット
配列
ATGACGGCAA CTTCAACCCC TGGTGAGCGC GCACGCGCAC TGTTTGCAGT GCTCAAGCGC 60
AAAGACCTCA TCCCCGAGGG CTACATCGAA CAGCTCACCC AGCTGATGGA ACACGGCTGG 120
AGCCCGGAAA ACGGCGCGCG CATCGTCGCC AAGGCCTGGG TCGATCCGCA GTTTCGCGAG 180
CTGCTGCTCA AGGACGGTAC GGCCGCCTGC GCCCAGTTCG GCTTCACCGG CCCACAGGGT 240
GAATACATCG TCGCCCTGAA AAACACCCCG CAGTTGAAAA ACGTGATCGT CTGCAGCCTG 300
TGCTCCTGCA CGAACTGGAC GGTGATGGGA CTGCCGCCTG AGTGGTACAA GGGCTTCGAG 360
TTCCGTGAGC GGTTGGTCCG GAAGGGCCGC ACGGTATTGC GCGAGCTGGG CACCGAGTTG 420
CCCGGTGACA TGGTGGTCAA GGTCTGGGAT ACCAGCGCTG AAAGCCGCTA CCTGGTGCTG 480
CCGCAACGGC CAGCGGGATC AGAGCATATG AACGAAGAGC AGTTGCGGCA ACTGGTCACC 540
AAGGATGTGC TGATCGGCGT CGCCCTGCCC CGCGTTGGCT GA 582
【００２７】配列番号：4
配列の長さ：663
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Achromobacter xerosis
株名：IFO12668
直接の起源
クローン名：pBAN-2
配列の特徴
特徴を決定した方法：E
他の情報：AxNH蛋白質βサブユニット
配列
ATGGATGGCT TTCACGATCT CGGCGGTTTC CAGGGCTTTG GCAAAGTGTC CCACCGCATC 60
AACAGCCTGA GCTACAAGCA GGTGTTCAAG CAGGACTGGG AACACCTGGC CTACAGCCTG 120
ATGTTCATCG GCGTCGACCA CCTGAACAAG TTCAGCGTCG ATGAAATACG TCATGCCGTC 180
GAACGCATTG ACGTGCGCCA GCACGTCGGC ACCGAATACT ACGAACGTTA TGTGATCGCC 240
ACTGCCACGC TGCTGGTCGA AACAGGCGTC ATCACCCAGG CCGAACTGGA TGAAGCACTC 300
GGCTCGCACT TCAAGCTGGC CAACCCCGCC CATGCGCAAG GGCGTGCTGC AATTACCGGG 360
CGAGCGCCTT TTGAAGTGGG CGACCGGGTC ATCGTACGCG ATGAATACGT GGCCGGGCAT 420
GTGCGCATGC CTGCATATGT GCGCGGCAAG CAAGGCGTAG TGCTGCACCG GACCACTGAA 480
CAGTGGCCGT TTCCGGACGC GATTGGCCAT GGCGACCAGA ACGCTGCGCA TCAACCGACC 540
TACCATGTCG AGTTCCGCGT GCGGGACCTG TGGGGCGATG CCGCAGACGA CGGCCTGGTG 600
GTGGTAGACC TGTTTGAAAG CTATCTGGAC AGGGTCGAAA GCCCGCGAGT GGTGCGCGCA 660
TGA 663
【図１】プラスミドpBAN-7の制限酵素切断点地図を示
す。
す。
【図２】プラスミドpBAN-2の制限酵素切断点地図を示
す。
す。
【図３】MT10770とAchromobacter xerosis IFO 12668の
アクリロニトリルの水和活性を比較する実験結果を示す
グラフである。
アクリロニトリルの水和活性を比較する実験結果を示す
グラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 9/88
Ｃ１２Ｒ 1:025）
(Ｃ１２Ｎ 9/88
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 13/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 特開 平３−251184（ＪＰ，Ａ)
Ｒ・Ｗ・オールド著、穴井 元昭訳,
遺伝子操作の原理，培風館，1987年 ４
月 ２日，第３版，ｐ．115
Ｔ．Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ 1992 Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅ
ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｏｓａｋａ
（ＩＦＯ），1992年 ５月30日，９ｔｈ
Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．97，166
Ｈ．Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｓ
ｔ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ 1996 Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ， Ｏｓａｋａ （ＩＦＯ）,
1996年 ３月 ８日，10ｔｈ Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ，ｐ．178
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/88
C12N 15/60
ＪＳＴＰｌｕ
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (8)
- 【請求項１】 配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配
列で表わされるαサブユニット、及び配列表の配列番
号：２記載のアミノ酸配列で表わされるβサブユニット
よりなるニトリルヒドラターゼ。 - 【請求項２】 アクロモバクター・キセロシス（Achromo
bacter xerosis IFO 12668）由来である請求項１記載の
ニトリルヒドラターゼ。 - 【請求項３】 配列表の配列番号：３に記載の塩基配列
で表わされるニトリルヒドラターゼαサブユニットをコ
ードする遺伝子。 - 【請求項４】 配列表の配列番号：４に記載の塩基配列
で表わされるニトリルヒドラターゼβサブユニットをコ
ードする遺伝子。 - 【請求項５】 配列表の配列番号：３に記載の塩基配列
で表わされるニトリルヒドラターゼαサブユニットをコ
ードする遺伝子と配列表の配列番号：４に記載の塩基配
列で表わされるニトリルヒドラターゼβサブユニットを
コードする遺伝子とを含む組換えプラスミド。 - 【請求項６】 配列表の配列番号：３に記載の塩基配列
で表わされるニトリルヒドラターゼαサブユニットをコ
ードする遺伝子と配列表の配列番号：４に記載の塩基配
列で表わされるニトリルヒドラターゼβサブユニットを
コードする遺伝子とを含む組換えプラスミドにより形質
転換された形質転換体。 - 【請求項７】 配列表の配列番号：３に記載の塩基配列
で表わされるニトリルヒドラターゼαサブユニットをコ
ードする遺伝子と配列表の配列番号：４に記載の塩基配
列で表わされるニトリルヒドラターゼβサブユニットを
コードする遺伝子とを含む組換え発現プラスミドにより
形質転換された形質転換体を培養してニトリルヒドラタ
ーゼを生産する方法。 - 【請求項８】 配列表の配列番号：３に記載の塩基配列
で表わされるニトリルヒドラターゼαサブユニットをコ
ードする遺伝子と配列表の配列番号：４に記載の塩基配
列で表わされるニトリルヒドラターゼβサブユニットを
コードする遺伝子とを含む組換え発現プラスミドにより
形質転換された形質転換体を培養して得られる培養液、
該培養液から分離された菌体及び菌体処理物の存在下、
ニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方
法。
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|---|---|---|---|
| JP07103295A JP3531997B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | 形質転換体を用いたアミド化合物の製造法 |
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1995
- 1995-03-29 JP JP07103295A patent/JP3531997B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Ｈ．Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ １９９６ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｏｓａｋａ （ＩＦＯ），１９９６年 ３月 ８日，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．１７８ |
| Ｒ・Ｗ・オールド著、穴井 元昭訳，遺伝子操作の原理，培風館，１９８７年 ４月 ２日，第３版，ｐ．１１５ |
| Ｔ．Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ １９９２ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｏｓａｋａ （ＩＦＯ），１９９２年 ５月３０日，９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．９７，１６６ |
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