JP5492876B2 - ３−メルカプトプロピオン酸またはその塩を製造する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、３−メルカプトプロピオン酸またはその塩を製造する方法に関する。
３−メルカプトプロピオン酸は、農薬、医薬をはじめとする有機合成品の原料、塩化ビニルの安定剤、または、エポキシ樹脂若しくはアクリル酸エステルポリマーの架橋剤、または、プラスチックレンズモノマー等の原料として有用な化合物である。
３−メルカプトプロピオニトリルの加水分解による３−メルカプトプロピオン酸の製造方法は公知であり、酸又は塩基を加えて、化学的に加水分解をする方法が行われている（例えば、特許文献１、２）。また、特許文献６、７には、アクリロニトリルから化学的に３−メルカプトプロピオン酸を合成する方法が記載されている。
また、微生物を用いた温和な条件でニトリル化合物やアミド化合物を加水分解する方法も多数報告されている（例えば、非特許文献１乃至３、特許文献３、特許文献４）。特許文献５には、微生物を用いて３−メルカプトプロピオニトリルを加水分解する方法が記載されている。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．９５，１１６１−１１７４（２００３）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．９１，３８１−３９３（２００１）
Ａｒｃｈｉｅｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８４）１３８，３１５−３２０
化学的方法では、加水分解条件を最適化することで高い反応収率を与える一方、チオジプロピオン酸等の副生成物を生成してしまう。このような化合物は、蒸留操作等を用いた副生成物の分離工程が必要となる。したがって、上記の化学的方法は、工業的には必ずしも優れた方法とはいえない。
酵素反応は、温和な条件で反応できるため、工業的に優れた方法である。しかしながら、３−メルカプトプロピオン酸の酵素的製造方法については、具体的に明らかにされていない。特許文献５には、得られる３−メルカプトプロピオン酸の純度において明らかにされておらず、工業的に有用であるかどうか不明である。加えて、特許文献５には、反応に関与する酵素が具体的に明らかにされていないため、３−メルカプトプロピオン酸の製造工程の改良が困難である。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、３−メルカプトプロピオン酸を酵素反応により工業的に製造する方法を提供することにある。
即ち、本発明は、以下のとおりのものである。
［１］ニトリルヒドラターゼを用いて、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩から一般式（１）で示されるアミドまたはその塩を製造し、アミダーゼを用いて、前記アミドまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法であって、
反応液中の一般式（１）で示される前記アミドまたはその塩、および、一般式（３）で示される前記ニトリルまたはその塩の少なくとも一方の濃度が、１１重量％以上１７重量％以下であり、
前記ニトリルヒドラターゼが、シュードノカルディア属の細菌に由来する酵素であり、
前記アミダーゼが、アミダーゼシグニチャーファミリーに属する酵素である、一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法。
［１］ニトリルヒドラターゼを用いて、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩から一般式（１）で示されるアミドまたはその塩を製造し、アミダーゼを用いて、前記アミドまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法であって、
反応液中の一般式（１）で示される前記アミドまたはその塩、および、一般式（３）で示される前記ニトリルまたはその塩の少なくとも一方の濃度が、１１重量％以上１７重量％以下であり、
前記ニトリルヒドラターゼが、シュードノカルディア属の細菌に由来する酵素であり、
前記アミダーゼが、アミダーゼシグニチャーファミリーに属する酵素である、一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法。
［２］ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼの存在下、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する［１］に記載の方法。
［３］一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩がアクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて得られるものであることを特徴とする［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記硫黄原子を含む化合物が水硫化ナトリウムである、［３］に記載の方法。
［５］［１］乃至［４］いずれか１項に記載の方法を用いて一般式（２）記載のカルボン酸を製造する工程と、
得られた前記カルボン酸とペンタエリスリトールとをエステル化反応させる工程と、
を含むペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）の製造方法。
［６］［５］に記載の方法を用いてペンタエリスリトールテトラキスメルカプトプロピオネートを製造する工程と、
得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を単重合又は共重合した後、硬化する工程と、
を含む光学材料の製造方法。
［３］一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩がアクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて得られるものであることを特徴とする［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記硫黄原子を含む化合物が水硫化ナトリウムである、［３］に記載の方法。
［５］［１］乃至［４］いずれか１項に記載の方法を用いて一般式（２）記載のカルボン酸を製造する工程と、
得られた前記カルボン酸とペンタエリスリトールとをエステル化反応させる工程と、
を含むペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）の製造方法。
［６］［５］に記載の方法を用いてペンタエリスリトールテトラキスメルカプトプロピオネートを製造する工程と、
得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を単重合又は共重合した後、硬化する工程と、
を含む光学材料の製造方法。
この発明によれば、アミダーゼを用いて、一般式（１）で示されるアミドまたはその塩から３−メルカプトプロピオン酸またはその塩を製造する。これにより、化学合成法よりも副生成物を低減できるため、精製工程を簡略化することができる。したがって、効率よく３−メルカプトプロピオン酸またはその塩を製造することができる。
本発明によれば、３−メルカプトプロピオン酸またはその塩を工業的に効率よく製造することができる。
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
本発明における３−メルカプトプロピオニトリル誘導体とは、上記一般式（３）で示される３−メルカプトプロピオニトリル誘導体であり、一般式（３）中、Ｚは、Ｈ、Ｓ−Ｃ２Ｈ５−ＣＮ、Ｓ−Ｃ２Ｈ５−ＣＯＮＨ２、カチオンのいずれかを表す化合物である。
本発明における３−メルカプトプロピオンアミド誘導体とは、上記一般式（１）で示される３−メルカプトプロピオンアミド誘導体であり、一般式（１）中、Ｘは、Ｈ、Ｓ−Ｃ２Ｈ５−ＣＯＮＨ２、Ｓ−Ｃ２Ｈ５−ＣＯＯＨ、カチオンのいずれかを表す化合物である。
本発明における３−メルカプトプロピオン酸誘導体とは、一般式（２）で示される３−メルカプトプロピオン酸誘導体であり、一般式（２）中、Ｙは、Ｈ、Ｓ−Ｃ２Ｈ５−ＣＯＯＨのいずれかを表す化合物である。
（第１の実施形態）
本実施形態は、アミダーゼを用いて、一般式（１）で示される３−メルカプトプロピオンアミド誘導体（ただし、一般式（１）中、Ｘは、Ｈ、１価、２価または３価のカチオンである。）から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法である。本実施形態において、ｎは、１〜３であり、ｎ＝１のとき、一般式（１）中、ＸはＨ、１価のカチオンであり、一般式（１）中ｎ＝２のとき、Ｘは、２価のカチオンであり、ｎ＝３のとき、Ｘは、３価のカチオンである。具体的には、１価のカチオンとして、例えば、アルカリ金属イオン、または、アンモニウムイオンを用いることができ、アルカリ金属イオンとしては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋が挙げられる。２価のカチオンとしては、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、または、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｒａ２＋のアルカリ土類金属イオンが挙げられる。３価のカチオンとしては、Ａｌ３＋が挙げられる。また、一般式（２）中、Ｙは、Ｈであるが、一般式（１）のＸに対応する対イオンを備えたカルボキシラートやチオラートを形成していてもよい。
本実施形態は、アミダーゼを用いて、一般式（１）で示される３−メルカプトプロピオンアミド誘導体（ただし、一般式（１）中、Ｘは、Ｈ、１価、２価または３価のカチオンである。）から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法である。本実施形態において、ｎは、１〜３であり、ｎ＝１のとき、一般式（１）中、ＸはＨ、１価のカチオンであり、一般式（１）中ｎ＝２のとき、Ｘは、２価のカチオンであり、ｎ＝３のとき、Ｘは、３価のカチオンである。具体的には、１価のカチオンとして、例えば、アルカリ金属イオン、または、アンモニウムイオンを用いることができ、アルカリ金属イオンとしては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋が挙げられる。２価のカチオンとしては、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、または、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｒａ２＋のアルカリ土類金属イオンが挙げられる。３価のカチオンとしては、Ａｌ３＋が挙げられる。また、一般式（２）中、Ｙは、Ｈであるが、一般式（１）のＸに対応する対イオンを備えたカルボキシラートやチオラートを形成していてもよい。
本実施形態の反応式の一例を下記反応式（４）で表す。反応式（４）では、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩を用いて、３−メルカプトプロピオン酸を製造する方法の例を示す。反応式（４）中、Ｘ、Ｙは、１価のカチオンを用いることが好ましい。
アミダーゼとは、アミド化合物のアミド基に作用し、アミド基を加水分解してカルボキシル基とする酵素をいう。アミダーゼは、アミダーゼの活性中心がリジン、セリン、セリンであるアミダーゼシグニチャー（ａｍｉｄａｓｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ、ＡＳ）ファミリーと呼ばれる一群（例えば、脂肪酸アミドのアミダーゼ、ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、Ｖｏｌ．２７５、Ｎｏ．２５、Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｊｕｎｅ ２３、ｐｐ．１９１７７-１９１８４、２０００、以下「参考文献１」という。）システインであるもの（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのアミダーゼ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９５，ｐｐ２７５）が知られている。活性中心がリジン、セリン、セリンであるＡＳファミリーと呼ばれる一群とは、前記参考文献１のＦｉｇ．１に示されている、各種アミダーゼのアミノ酸配列として保存性の高いアミノ酸配列中のリジン、セリン、セリンが活性に必須であり、上記のアミノ酸を他のアミノ酸に変換することで活性が完全に消失するアミダーゼの一群である。
本実施形態において、アミダーゼは、微生物（細菌、酵母など）、植物、かび、動物、昆虫等どのような起源のアミダーゼであっても構わない。アミダーゼを生産することが知られている微生物としては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテリディウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、アシドフィリウム（Ａｃｉｄｐｈｉｌｉｕｍ）属、ポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属等に属する微生物が挙げられる。
より効率的に加水分解できるアミダーゼとしては、アミダーゼの活性中心がリジン、セリン、セリンであるＡＳファミリーと呼ばれる一群のアミダーゼである。アミダーゼの活性中心がリジン、セリン、セリンであるＡＳファミリーと呼ばれる一群であるアミダーゼを生産する細菌として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｔｕｍ ＪＦ−５を挙げることができる。本発明者らの知見によれば、３−メルカプトプロピオンアミドは酵素活性を阻害することがあるが、ＡＳファミリーに属するアミダーゼは、３−メルカプトプロピオンアミドによる阻害を受けにくいため、好適に使用することができる。中でも、高度好熱菌及び超高度好熱菌に属さない生物由来のＡＳファミリーに属するアミダーゼは、大腸菌等の常温で生育する宿主において使用する場合では、アミダーゼを発現させるのが容易である量ため、より好ましい。特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５に由来するアミダーゼを用いることが好ましい。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８由来のアミダーゼのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を配列表の配列番号１、２に示す。
また、本実施形態では、アミダーゼの活性中心がリジン、セリン、セリンであるＡＳファミリーと呼ばれる一群のアミダーゼにおいて、そのアミノ酸配列の一部が置換、挿入、欠失していても酵素活性を保持している限りアミダーゼとして使用することができる。具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８由来のアミダーゼのアミノ酸配列の一部が置換されたアミダーゼも利用することができる。
例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、５１番目のＩｌｅがＴｈｒ、１４６番目のＬｅｕがＶａｌ、１４９番目のＡｌａがＧｌｙ、１８１番目のＡｌａがＳｅｒ、１８６番目のＬｅｕがＩｌｅ、１９０番目のＧｌｙがＴｈｒ、２６２番目のＶａｌがＡｌａ、２８０番目のＩｌｅがＶａｌ、２９５番目のＧｌｙがＡｌａ、３１７番目のＶａｌがＩｌｅ、３５６番目のＡｌａがＧｌｙ、３７９番目のＭｅｔがＬｅｕ、３８４番目がＰｈｅがＴｙｒ、４００番目のＩｌｅがＬｅｕ、４４２番目のＳｅｒがＡｌａ、４４７番目のＭｅｔがＴｈｒ、４４８番目のＬｅｕがＩｌｅ、４６９番目のＶａｌがＬｅｕ、４８０番目のＧｌｙがＡｌａ、及び、４９８番目のＡｌａがＳｅｒとなるアミノ酸置換より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸の置換を含み、かつ、アミダーゼ活性を有するアミダーゼ変異体を利用することができる。
なお、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、
本実施形態のアミダーゼとして、アミダーゼを産生するように形質転換された形質転換体を用いることもできる。この形質転換体は、遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋなどに登録されているアミダーゼをコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングすることでアミダーゼをコードするＤＮＡ及びこのＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを得ることができる。クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主細菌とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示することができる。また、プラスミドとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを宿主細菌とする場合には、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＵＣ１８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）等を例示することができる。なお、宿主と異なる菌由来の酵素を遺伝子組換え等により導入し発現させる場合、コドンユーセージ（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を宿主に合うように改変して使用した方がより好ましい。
プロモーターとしては、宿主細胞中でアミダーゼを発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＨプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｎｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。さらにバチルス属細菌中で発現させるためにＮｐプロモーター（特公平８−２４５８６号公報）なども用いることができる。
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中でアミダーゼを発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
転写・翻訳を効率的に行うため、該タンパク質活性を有する蛋白質のＮ末端またはその一部を欠失した蛋白質と発現ベクターのコードする蛋白質のＮ末端部分を融合させた蛋白質を発現させてもよい。
形質転換体を培養するための培地は、当該形質転換体が増殖し得る培地であれば特に制限はない。培地としては、通常、炭素源、窒素源、その他の養分などを含む液体培地が使用される。
培地の炭素源としては、例えば、グルコース、シュクロース、デンプンなどの糖類、ソルビトール、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸などの有機酸類及びその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、並びにこれらの混合物などが挙げられる。
培地の窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、尿素、アミノ酸などの有機又は無機含窒素化合物、並びにこれらの混合物などが挙げられる。
また培地には、塩化マグネシウム、塩化第二鉄などの無機塩類、微量金属塩、ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加しても良い。また、必要に応じて、形質転換体の増殖を促進する因子、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質などを添加してもよい。
形質転換体の培養は、生育に適した条件下、例えば、培地のｐＨ２〜１２、好ましくはｐＨ４〜１０、温度５〜５０℃、好ましくは２０〜５０℃で行うことができる。形質転換体の培養は、形質転換体の種類にもよるが、嫌気性又は好気性条件下の何れで行うことができるが、好気性条件下で行うことがより好ましい。培養時間は、例えば、１〜２４０時間程度、好ましくは５〜１２０時間程度、さらに好ましくは１２〜７２時間程度である。
培養した形質転換体は、そのまま反応に用いてもよいし、種々の処理を施してから反応に利用してもよい。この処理としては、例えば、形質転換体の破砕処理、凍結乾燥処理、抽出処理等がある。抽出処理は、超音波法、凍結融解法、リゾチーム法などの慣用の方法を利用することができる。このような処理を行うことで、形質転換体からアミダーゼを取り出すことができる。得られたアミダーゼは、未精製のまま用いてもよいし、精製してから用いてもよい。
例えば、培養液から遠心分離などにより分離した形質転換体を、水などで洗浄した後、ｐＨ値が酵素の安定領域にある緩衝液に懸濁し、低温（３〜１８℃、好ましくは、３〜１０℃）下にフレンチプレスまたは超音波等で処理して形質転換体を破砕する。そして、遠心分離などにより形質転換体の破片を分離除去し、得られた形質転換体の抽出液を常法により硫安分割し、透析してアミダーゼの粗抽出液を得る。このアミダーゼの粗抽出液を、例えばセファデックスＧ−２００などを用いたカラムクロマトグラフィーに付す方法等により高純度のアミダーゼを得ることができる。
また、界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒によって、細胞膜の透過性を変化させた形質転換体などを用いることもできる。
また、ポリアクリルアミドゲル法などの慣用の方法により形質転換体やアミダーゼを固定化して用いてもよい。
３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩から３−メルカプトプロピオン酸を生成する反応条件としては、温度は０℃から５０℃が好ましく、より好ましくは０℃から４０℃である。さらに好ましくは、５℃から３５℃である。反応ｐＨは３．０から１０．０、好ましくは６．０から８．０である。ｐＨを調整する際に使用する酸は塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸や酢酸などの有機酸を使用することができる。反応溶媒は、水、メタノール、エタノール、などのアルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチルなどの脂肪酸エステル類、トルエン、キシレンなどの芳香族化合物を用いることができるが、水を用いると特に好ましい。反応液中の３−メルカプトプロピオンアミドの濃度は、好ましくは、１重量％以上とすることができるが、１１重量％以上とすると工業的により有利であり、１３重量％以上がさらに好ましい。また、反応液中の３−メルカプトプロピオンアミドの濃度は、５０重量％以下とすることができるが、１７重量％以下とするとより好ましい。この段落でいう反応液とは、反応基質である３−メルカプトプロピオンアミドが反応溶媒に溶解しているもの、反応溶媒中で分散しているもの、及び、反応溶媒と相分離しているものをいずれも含むものである。また、ここでいう濃度とは、３−メルカプトプロピオンアミドが反応溶媒にすべて溶解するとした場合の濃度を意味し、現実に３−メルカプトプロピオンアミドは反応溶媒に完全に溶解していても良いし、溶解していない状態であってもよい。反応時間は、通常１０時間から８０時間程度である。反応に際して反応液は窒素等の不活性ガスなどで置換し、気相に関しても不活性ガスで置換することが望ましい。
得られる３−メルカプトプロピオン酸は、溶媒抽出により分離することができる。好ましい溶媒は、生成物のカルボキシル基を溶解し、水と混合しない適当な極性有機溶媒である。このような溶媒の例には、酢酸ブチル、酢酸エチル、メチルイソブチルケトン、塩化メチレン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトン等を挙げることができる。更に蒸留等による一般的な方法を用いて単離することができる。本実施の形態においては、得られる３−メルカプトプロピオン酸の純度が高いため、煩雑な精製工程を経なくても３−メルカプトプロピオン酸を単離することができる。たとえば、反応液に酸を加えることで、３−メルカプトプロピオン酸と水とが分離するため、３−メルカプトプロピオン酸相を回収するだけで３−メルカプトプロピオン酸を得ることもできる。また、３−メルカプトプロピオン酸相の液量が少ない時は、上述のように極性有機溶媒を用いた溶媒抽出により分離してもよい。このとき、酸としては塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸を好適に使用することができる。また、３−メルカプトプロピオン酸を大気圧下または減圧下に蒸留を行って精製をすることもできる。
つづいて、本実施形態の作用効果について説明する。この発明によれば、アミダーゼを用いて、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩から３−メルカプトプロピオン酸を製造する。これにより、副生成物を低減することができ、精製工程を簡略化することができる。したがって、工業的に効率よく３−メルカプトプロピオン酸を製造することができる。
副生成物として化学式（５）の化合物が知られている。化学式（５）はチオジプロピオン酸である。化学法によれば、これらの副生成物を低減することができなかった。そのため、３−メルカプトプロピオン酸の精製工程を煩雑にしていた。一方、本実施形態のように、アミダーゼを用いて３−メルカプトプロピオン酸を生成することで、これらの副生成物の収率を１０ｍｏｌ％以下とすることができる。また、アミダーゼの種類を適宜選択することにより、５ｍｏｌ％以下とすることができ、より好ましくは１ｍｏｌ％以下とすることができる。したがって、蒸留操作等の煩雑な精製工程を経なくても３−メルカプトプロピオン酸を純度よく得ることができる。なお、上記副生成物の収率は、下記数式（７）により求められる。
副生成物の収率（％）＝［（チオジプロピオン酸の物質量（ｍｏｌ）／仕込んだ３−メルカプトプロピオンアミドの物質量（ｍｏｌ）］×１００ （７）
（第２の実施形態）
本実施形態は、ニトリルヒドラターゼを用いて、一般式（３）で示される３−メルカプトプロピオニトリル誘導体（ただし、一般式（３）中、Ｚは、Ｈ、１価、２価または３価のカチオンである。）から一般式（１）で示される３−メルカプトプロピオンアミド誘導体を製造し、３−メルカプトプロピオン酸を製造する方法である。本実施形態において、ｎは、１〜３であり、ｎ＝１のとき、一般式（３）中、Ｚは水素、１価のカチオンであり、一般式（３）中ｎ＝２のとき、Ｚは、２価のカチオンであり、ｎ＝３のとき、Ｚは、３価のカチオンである。具体的には、１価のカチオンとして、例えば、アルカリ金属イオン、または、アンモニウムイオンを用いることができ、アルカリ金属イオンとしては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋が挙げられる。２価のカチオンとしては、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、または、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｒａ２＋のアルカリ土類金属イオンが挙げられる。３価のカチオンとしては、Ａｌ３＋が挙げられる。また、一般式（１）中、Ｘは、一般式（３）のＺに対応する水素またはカチオンである。一般式（２）中、Ｙは、水素であるが、一般式（３）のＺに対応する対イオンを備えたカルボキシラートやチオラートを形成していてもよい。
本実施形態は、ニトリルヒドラターゼを用いて、一般式（３）で示される３−メルカプトプロピオニトリル誘導体（ただし、一般式（３）中、Ｚは、Ｈ、１価、２価または３価のカチオンである。）から一般式（１）で示される３−メルカプトプロピオンアミド誘導体を製造し、３−メルカプトプロピオン酸を製造する方法である。本実施形態において、ｎは、１〜３であり、ｎ＝１のとき、一般式（３）中、Ｚは水素、１価のカチオンであり、一般式（３）中ｎ＝２のとき、Ｚは、２価のカチオンであり、ｎ＝３のとき、Ｚは、３価のカチオンである。具体的には、１価のカチオンとして、例えば、アルカリ金属イオン、または、アンモニウムイオンを用いることができ、アルカリ金属イオンとしては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋が挙げられる。２価のカチオンとしては、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、または、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｒａ２＋のアルカリ土類金属イオンが挙げられる。３価のカチオンとしては、Ａｌ３＋が挙げられる。また、一般式（１）中、Ｘは、一般式（３）のＺに対応する水素またはカチオンである。一般式（２）中、Ｙは、水素であるが、一般式（３）のＺに対応する対イオンを備えたカルボキシラートやチオラートを形成していてもよい。
本実施形態の反応式の一例を下記反応式（８）で表す。反応式（８）では、３−メルカプトプロピオン酸ニトリルまたはその塩を用いて、３−メルカプトプロピオン酸を製造する方法の例を示す。反応式（８）中Ｘは、１価のカチオンとするとより好ましい。
ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を加水分解してアミド基とする酵素をいう。本実施形態で用いるニトリルヒドラターゼは、３−メルカプトプロピオニトリルを効率的に加水分解できればよく、微生物、植物、かび、動物、昆虫等どのような起源のニトリルヒドラターゼであっても構わない。
ニトリルヒドラターゼを生産することが知られている微生物としては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテリディウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属等に属する微生物が挙げられる。
より効率的に加水分解できるニトリルヒドラターゼとしては、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５に由来するニトリルヒドラターゼを用いることが好ましい。Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を配列表の配列番号３、５に、βサブユニットのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を配列表の配列番号４、６に示す。
また、上記ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の一部が置換、挿入、欠失したものもニトリルヒドラターゼとしての酵素活性を保持している限り使用することができる。例えば、配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットからなるニトリルヒドラターゼにおいて、ニトリルヒドラターゼ活性を有する、ニトリルヒドラターゼ変異体を用いることができる。
具体的には、
（ａａ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｂ）αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ
（ａｃ）βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｄ）βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｅ）βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｆ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、及び、αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｇ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｈ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ
（ａｉ）βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐ、及び、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｊ）βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｋ）βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｌ）βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅ、及び、βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｍ）βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｎ）βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｏ）βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒ、及び、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｐ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、及び、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｑ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、及び、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｒ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＡｌａ、及び、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒ、及び、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｓ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、及び、αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐ、及び、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｔ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｕ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｖ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ、及び、βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅ、及び、βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｗ）αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｘ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＧｌｙ、及び、αサブユニットの１８８番目のＴｈｒをＧｌｙ
（ａｙ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＡｌａ、及び、αサブユニットの４８番目のＡｓｎをＧｌｎ
（ａｚ）αサブユニットの４８番目のＡｓｎをＧｌｕ、及び、βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙ
（ｂａ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＣｙｓ
（ｂｂ）βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＧｌｙ
（ｂｃ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＳｅｒ、及び、βサブユニットの３３番目のＡｌａをＶａｌ
（ｂｄ）βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＡｌａ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＶａｌ
（ｂｅ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＶａｌ、及び、βサブユニットの２１８番目のＣｙｓをＭｅｔ
（ｂｆ）βサブユニットの３３番目のＡｌａをＭｅｔ、及び、βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＴｈｒ
（ｂｇ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＬｅｕ
（ｂｈ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＩｌｅ、及び、βサブユニットの６１番目のＡｌａをＶａｌ
（ｂｉ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＴｈｒ、及び、βサブユニットの２１８番目のＣｙｓをＳｅｒ
（ｂｊ）βサブユニットの１１２番目のＬｙｓをＶａｌ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＭｅｔ
（ｂｋ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＴｒｐ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＨｉｓ
（ｂｌ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＬｅｕ、及び、βサブユニットの１１２番目のＬｙｓをＩｌｅ
（ｂｍ）βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＳｅｒ
（ｂｎ）βサブユニットの１７１番目のＬｙｓをＡｌａ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＴｈｒ
（ｂｏ）βサブユニットの１５０番目のＡｌａをＳｅｒ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＣｙｓ
（ｂｐ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＧｌｙ、及び、βサブユニットの１５０番目のＡｌａをＡｓｎ
（ｂｑ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＳｅｒ、及び、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＭｅｔ
（ｂｒ）βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１６８番目のＴｈｒをＧｌｕ
上記のアミノ酸置換より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸の置換を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するニトリルヒドラターゼ変異体を利用することができる。
具体的には、
（ａａ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｂ）αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ
（ａｃ）βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｄ）βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｅ）βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｆ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、及び、αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｇ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｈ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ
（ａｉ）βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐ、及び、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｊ）βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｋ）βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｌ）βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅ、及び、βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｍ）βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｎ）βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｏ）βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒ、及び、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｐ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、及び、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｑ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、及び、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｒ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＡｌａ、及び、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒ、及び、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｓ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、及び、αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐ、及び、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｔ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｕ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、及び、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、及び、βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｖ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ、及び、βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅ、及び、βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｗ）αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｘ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＧｌｙ、及び、αサブユニットの１８８番目のＴｈｒをＧｌｙ
（ａｙ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＡｌａ、及び、αサブユニットの４８番目のＡｓｎをＧｌｎ
（ａｚ）αサブユニットの４８番目のＡｓｎをＧｌｕ、及び、βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙ
（ｂａ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＣｙｓ
（ｂｂ）βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＧｌｙ
（ｂｃ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＳｅｒ、及び、βサブユニットの３３番目のＡｌａをＶａｌ
（ｂｄ）βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＡｌａ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＶａｌ
（ｂｅ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＶａｌ、及び、βサブユニットの２１８番目のＣｙｓをＭｅｔ
（ｂｆ）βサブユニットの３３番目のＡｌａをＭｅｔ、及び、βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＴｈｒ
（ｂｇ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＬｅｕ
（ｂｈ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＩｌｅ、及び、βサブユニットの６１番目のＡｌａをＶａｌ
（ｂｉ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＴｈｒ、及び、βサブユニットの２１８番目のＣｙｓをＳｅｒ
（ｂｊ）βサブユニットの１１２番目のＬｙｓをＶａｌ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＭｅｔ
（ｂｋ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＴｒｐ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＨｉｓ
（ｂｌ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＬｅｕ、及び、βサブユニットの１１２番目のＬｙｓをＩｌｅ
（ｂｍ）βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＳｅｒ
（ｂｎ）βサブユニットの１７１番目のＬｙｓをＡｌａ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＴｈｒ
（ｂｏ）βサブユニットの１５０番目のＡｌａをＳｅｒ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＣｙｓ
（ｂｐ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＧｌｙ、及び、βサブユニットの１５０番目のＡｌａをＡｓｎ
（ｂｑ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＳｅｒ、及び、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＭｅｔ
（ｂｒ）βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１６８番目のＴｈｒをＧｌｕ
上記のアミノ酸置換より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸の置換を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するニトリルヒドラターゼ変異体を利用することができる。
本実施形態のニトリルヒドラターゼには、ニトリルヒドラターゼを産生するように形質転換された形質転換体を用いることもできる。この形質転換体は、遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋなどに登録されているニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングすることで作製することができる。このニトリルヒドラターゼを産生する形質転換体は、第１の実施形態で説明したアミダーゼを産生する形質転換体と同様の方法で作製することができる。
本実施形態において、３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩を３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩に変換する反応（以下、第一の反応と記す）と３−メルカプトプロピオンアミドを３−メルカプトプロピオン酸に変換する反応（以下、第二の反応と記す）は別々に行う方法や同時に行う方法あるいは第一の反応終了後３−メルカプトプロピオンアミドを単離・精製して第二の反応を行う方法などが可能である。
この方法において、第一の反応と第二の反応は別々に行ってもよいし、３−メルカプトプロピオニトリルにニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼを同時に添加して、ワンポットで３−メルカプトプロピオン酸を製造してもよい。ここでいう「ワンポット」とは、いくつかの反応を同一反応容器で行うことを意味し、具体的には反応式（８）で示す第一の反応及び第二の反応である。
３−メルカプトプロピオニトリルは酵素によっては触媒毒になることもある。例えば、特許文献５には、β−置換プロピルニトリルは一般に生物毒性の強い化合物であること、酵素法では、β−置換プロピオニトリル０．５〜１０ｗｔ％を用いること、基質の毒性のため基質濃度をコントロールすることが好ましいことが記載されている。そのため、３−メルカプトプロピオニトリルに対する安定性の高い酵素を用いることは、反応収率が向上することや酵素使用量を削減できることから工業的に製造するためには有利である。３−メルカプトプロピオニトリルに対して安定性の高いニトリルヒドラターゼ、および、アミダーゼを使用することで第一の反応と第二の反応とを同時に行うことができる。３−メルカプトプロピオニトリルに対して安定性の高いニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼとして、シュードノカルディア属の細菌に由来するニトリルヒドラターゼ、および、ＡＳファミリーと呼ばれる一群のアミダーゼを挙げることができる。
また、３−メルカプトプロピオニトリルの触媒毒を回避する目的で第一の反応を完結させ、次いで第二の反応を実施することも可能である。３−メルカプトプロピオニトリルに対して安定性の高いニトリルヒドラターゼとしてシュードノカルディア属の細菌に由来するニトリルヒドラターゼを挙げることができる。アミダーゼの添加は、第一の反応が完全に完結してから行うことや第一の反応で３−メルカプトプロピオニトリルが第二の反応を阻害しない程度まで低減してから行うこともできる。
第二の反応に用いるアミダーゼとしては、アミダーゼの活性中心がリジン、セリン、セリンであるＡＳファミリーと呼ばれる一群のアミダーゼを用いることができる。より具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｔｕｍ ＪＦ−５のアミダーゼを挙げることができる。より好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５由来のアミダーゼである。３−メルカプトプロピオニトリルの生成反応において生じる副生成物は、アミダーゼの活性を低減させることがある。しかしながら、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８由来のアミダーゼは、反応式（８）で示す反応系内において活性の低下を受けにくい。したがって、３−メルカプトプロピオニトリルの精製工程を簡略または省略しながら反応式（８）で示す反応を行うことができる。なお、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８由来のアミダーゼのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を配列表の配列番号１、２にそれぞれ示す。
第一の反応条件としては、温度は０℃から５０℃が好ましく、より好ましくは０℃から４０℃である。反応ｐＨは３．０から１０．０、好ましくは６．０から８．０である。ｐＨを調整する際に使用する酸は塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸や酢酸などの有機酸を使用することができる。反応溶媒は、水、メタノール、エタノール、などのアルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチルなどの脂肪酸エステル類、トルエン、キシレンなどの芳香族化合物を用いることができるが、水を用いると特に好ましい。反応液中の３−メルカプトプロピオニトリルの濃度は、好ましくは、１重量％以上とすることができるが、１１重量％以上とすると工業的により有利であり、１３重量％以上がさらに好ましい。また、反応液中の３−メルカプトプロピオニトリルの濃度は、５０重量％以下とすることができるが、１７重量％以下とするとより好ましい。この段落でいう反応液とは、反応基質である３−メルカプトプロピオニトリルが反応溶媒に溶解しているもの、反応溶媒中で分散しているもの、及び、反応溶媒と相分離しているものをいずれも含むものである。また、ここでいう濃度とは、３−メルカプトプロピオニトリルが反応溶媒にすべて溶解するとした場合の濃度を意味し、現実に３−メルカプトプロピオニトリルは反応溶媒に完全に溶解していても良いし、溶解していない状態であってもよい。反応時間は、通常１時間から８０時間程度である。
ワンポットで第一の反応と第二の反応を同時に行うときの反応条件としては、温度は０℃から５０℃が好ましく、より好ましくは０℃から４０℃である。さらに好ましくは、１５℃から３０℃である。反応ｐＨは３．０から１０．０、好ましくは６．０から８．０である。ｐＨを調整する際に使用する酸は塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸や酢酸などの有機酸を使用することができる。反応溶媒は、水、メタノール、エタノール、などのアルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチルなどの脂肪酸エステル類、トルエン、キシレンなどの芳香族化合物を用いることができるが、水を用いると特に好ましい。反応液中の３−メルカプトプロピオニトリルの濃度は、好ましくは、１重量％以上とすることができるが、１１重量％以上とすると工業的により有利であり、１３重量％以上がさらに好ましい。また、反応液中の３−メルカプトプロピオニトリルの濃度は、５０重量％以下とすることができるが、１７重量％以下とするとより好ましい。この段落でいう反応液とは、反応基質である３−メルカプトプロピオニトリルおよび反応中間体の３−メルカプトプロピオンアミドが反応溶媒に溶解しているもの、反応溶媒中で分散しているもの、反応溶媒と相分離しているものをいずれも含むものである。また、ここでいう濃度とは、３−メルカプトプロピオニトリルが反応溶媒にすべて溶解するとした場合の濃度を意味し、現実に３−メルカプトプロピオニトリルは反応溶媒に完全に溶解していても良いし、溶解していない状態であってもよい。反応時間は、通常１時間から８０時間程度である。
本実施形態で用いるアミダーゼは、第１の実施形態で説明したアミダーゼと同様のものを用いることができる。また、３−メルカプトプロピオンアミドの反応条件及び３−メルカプトプロピオン酸の単離方法は、第１の実施形態で説明した条件または方法と同様な条件または方法を用いることができる。
本実施形態の方法では、第１の実施形態で説明した作用効果に加え、以下の作用効果を有する。すなわち、３−メルカプトプロピオニトリルから２段階の酵素反応を経て３−メルカプトプロピオン酸を製造することができる。したがって、温和な条件で３−メルカプトプロピオン酸を製造することができ、環境負荷をさらに低減することが可能になる。
また、本実施形態でも、得られる３−メルカプトプロピオン酸は、溶媒抽出により分離することができる。好ましい溶媒は、生成物のカルボキシル基を溶解し、水と混合しない適当な極性有機溶媒である。このような溶媒の例には、酢酸メチル、酢酸ブチル、メチルイソブチルケトン、塩化メチレン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトン等が好ましい。更に蒸留等による一般的な方法を用いて単離することができる。本実施の形態においては、得られる３−メルカプトプロピオン酸の純度が高いため、蒸留操作等の煩雑な精製工程を経なくても３−メルカプトプロピオン酸を単離することができる。たとえば、反応液に酸を加えることで、３−メルカプトプロピオン酸と水が分離するため、３−メルカプトプロピオン酸相を回収するだけで３−メルカプトプロピオン酸を得ることができる。このとき、酸としては塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸を好適に使用することができる。
（第３の実施形態）
本実施形態は、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩、および、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩を製造し、得られた３−メルカプトプロピオニトリルおよび３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩を用いて、アミダーゼおよびニトリラーゼを共存させて３−メルカプトプロピオン酸を製造する。この反応式は、下記反応式（９）で表される。
本実施形態は、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩、および、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩を製造し、得られた３−メルカプトプロピオニトリルおよび３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩を用いて、アミダーゼおよびニトリラーゼを共存させて３−メルカプトプロピオン酸を製造する。この反応式は、下記反応式（９）で表される。
本実施形態において、３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩は、第２の実施形態で用いられた一般式（３）で表される３−メルカプトプロピオニトリル誘導体と同じものとすることができる。また、３−メルカプトプロピオンアミドの塩には、第２の実施形態で用いられた一般式（１）で表される３−メルカプトプロピオンアミド誘導体と同じものとすることができる。３−メルカプトプロピオン酸は、３−メルカプトプロピオニトリルの塩に対応する対イオンを備えたカルボキシラートやチオラートとして得ることができる。
硫黄原子を含む化合物は、硫化物、水硫化物、チオ硫酸、炭素数１〜１２の脂肪族チオカルボン酸（例えば、チオ酢酸）、チオキサントゲン及びこれらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、マグネシウム塩またはアンモニウム塩並びにチオ尿素から選択することができる。アルカリ金属塩としては、特にナトリウム塩またはカリウム塩とすると好ましい。アルカリ土類金属塩としては、特にカルシウム塩、または、バリウム塩とすると好ましい。硫黄原子を含む化合物として、水硫化ナトリウムを用いると特に好ましい。アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて３−メルカプトプロピオニトリルのアルカリ金属塩を製造する方法としては、公知のものを用いることができる。
３−メルカプトプロピオニトリルの塩としては、１価のカチオンがより好ましい。このようにして製造した３−メルカプトプロピオニトリルは酵素反応に供する前に生成反応液に存在する硫化水素を低減させることが好ましい。硫化水素を除く方法としては、中和した後減圧する方法や窒素などによるバブリングする方法あるいはこれらの方法を組み合わせることにより低減させることができる。硫化水素の濃度としては５０ｐｐｍ以下が好ましく、より好ましくは２０ｐｐｍ以下である。更に好ましくは1５ｐｐｍ以下が好ましい。なお、硫化水素の濃度は、公知のヘッドスペースガスクロマトグラフィーにより測定することができる。
ニトリラーゼとは、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を加水分解してカルボキシル基とする酵素をいう。本実施形態で用いるニトリラーゼは、３−メルカプトプロピオニトリルを効率的に加水分解できれば微生物、植物、かび、動物、昆虫等どのような起源のニトリラーゼであっても構わない。
ニトリラーゼを生産することが知られている微生物としては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテリディウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属等に属する微生物が挙げられる。
ニトリラーゼは試薬としても販売されており、このような物の中から３−メルカプトプロピオニトリルを効率的に加水分解できるニトリラーゼを利用することもできる。例えば、ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社から販売されている、起源の異なる１２種類のニトリラーゼ（カタログ番号ＮＩＴ−１２０００）を利用してもかまわない。
本実施形態のニトリラーゼには、ニトリラーゼを産生するように形質転換された形質転換体を用いることもできる。この形質転換体は、遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋなどに登録されているニトリラーゼをコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングすることで作製することができる。このニトリラーゼを産生する形質転換体は、第１の実施形態で説明したアミダーゼを産生する形質転換体と同様の方法で作製することができる。
３−メルカプトプロピオニトリルの反応条件は、第２の実施形態で説明した条件と同様な条件を用いることができる。３−メルカプトプロピオンアミドの反応条件は、第１の実施形態で説明した条件を用いることができる。
アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とから得られた３−メルカプトプロピオニトリル及び３−メルカプトプロピオンアミドは、単離して、それぞれ別の反応容器で反応させてもよい。
また、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とから得られた３−メルカプトプロピオニトリル及び３−メルカプトプロピオンアミドは、単離せずに混合状態のまま、ニトリラーゼ及びアミダーゼを添加して反応させてもよい。
また、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とから得られた３−メルカプトプロピオニトリル及び３−メルカプトプロピオンアミドを単離せずに混合状態のまま、ニトリラーゼ及びアミダーゼを添加して反応させる場合、ニトリラーゼ及びアミダーゼとともに、第２の実施形態で用いたニトリルヒドラターゼを添加してもよい。この場合の反応条件は、温度は０℃から５０℃が好ましく、より好ましくは０℃から４０℃である。反応ｐＨは３．０から１０．０、好ましくは６．０から８．０である。ｐＨを調整する際に使用する酸は塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸や酢酸などの有機酸を使用することができる。反応溶媒は、水、メタノール、エタノール、などのアルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチルなどの脂肪酸エステル類、トルエン、キシレンなどの芳香族化合物を用いることができるが、水を用いると特に好ましい。３−メルカプトプロピオニトリルの濃度は、好ましくは、１重量％以上とすることができるが、１１重量％以上とすると工業的により有利であり、１３重量％以上がさらに好ましい。また、３−メルカプトプロピオニトリルの濃度は、５０重量％以下とすることができるが、１７重量％以下とするとより好ましい。ここでいう濃度とは、３−メルカプトプロピオニトリルが反応溶媒にすべて溶解するとした場合の濃度を意味し、現実に３−メルカプトプロピオニトリルは反応溶媒に完全に溶解していても良いし、溶解していない状態であってもよい。反応時間は、通常１時間から８０時間程度である。
アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とから得られた３−メルカプトプロピオニトリル及び３−メルカプトプロピオンアミドを製造する際、一部３，３'−ジチオジプロピオノニトリル及び３，３'−ジチオジプロピオンアミドが生成する。これらジスルフィド化合物は、ニトリラーゼおよびアミダーゼにより加水分解を受け３，３'−ジチオジプロピオン酸が生成する。生成した３，３'−ジチオジプロピオン酸は、酸性条件下亜鉛、鉄などの金属粉を添加するような、通常知られている還元方法で３−メルカプトプロピオン酸に変換することが可能である。
３−メルカプトプロピオン酸の単離方法は、第１の実施形態で説明した方法と同様な方法を用いることができる。
本実施形態の方法では、第１の実施形態で説明した作用効果に加え、以下の作用効果を有する。すなわち、アクリロニトリルおよび硫黄原子を含む化合物の反応では、３−メルカプトプロピオニトリルが主生成物（約８０％）として得られる一方、副生成物として３−メルカプトプロピオンアミド（約１５％）及び３−メルカプトプロピオン酸が得られる。そこで、本実施形態では、アクリロニトリルおよび硫黄原子を含む化合物の反応生成物に対し、ニトリラーゼ及びアミダーゼを作用させる。こうすることで、アクリロニトリルから収率よく３−メルカプトプロピオン酸を得ることができる。
また、本実施形態のように、アミダーゼとともにニトリラーゼを用いた場合においても、チオジプロピオン酸からなる副生成物の収率を、１０ｍｏｌ％以下とすることができる。また、アミダーゼの種類を適宜選択することにより、５ｍｏｌ％以下とすることができ、より好ましくは１ｍｏｌ％以下とすることができる。したがって、蒸留操作等の煩雑な精製工程を経なくても３−メルカプトプロピオン酸を純度よく得ることができる。なお、本実施形態における上記副生成物の収率は、下記数式（１０）により求められる。
副生成物の収率（％）＝［チオジプロピオン酸の物質量（ｍｏｌ）／アクリロニトリルの物質量（ｍｏｌ）］×１００ （１０）
なお、本実施形態において、アミダーゼ及びニトリラーゼに加え、さらにニトリルヒドラターゼを用いてもよい。この場合、アミダーゼの添加量は、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物との反応で生じる３−メルカプトプロピオンアミドに反応させる量とニトリルヒドラターゼの作用により生じる３−メルカプトプロピオンアミドに反応させる量とを勘案して調整することが好ましい。ニトリルヒドラターゼは、３−メルカプトプロピオニトリルの生成反応で生じる副生成物に対する耐性を有する。そのため、ニトリラーゼと比較してより少ない酵素量で効率よく反応を進行させることができる。
（第４の実施形態）
本実施形態では、第３の実施形態で説明したように、アクリロニトリルと硫黄原子とを含む化合物とを反応させて第２の実施形態で示した３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩、および、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩を製造する。得られた３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩をニトリルヒドラターゼによりニトリル基を加水分解反応して、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩とし、アミダーゼにより３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩から３−メルカプトプロピオン酸を得る。本実施形態の反応を反応式（１１）に示す。
本実施形態では、第３の実施形態で説明したように、アクリロニトリルと硫黄原子とを含む化合物とを反応させて第２の実施形態で示した３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩、および、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩を製造する。得られた３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩をニトリルヒドラターゼによりニトリル基を加水分解反応して、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩とし、アミダーゼにより３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩から３−メルカプトプロピオン酸を得る。本実施形態の反応を反応式（１１）に示す。
本実施形態においても、３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩、及び、３−メルカプトプロピオンアミドの塩として、第３の実施形態と同様なものを用いることができる。また、３−メルカプトプロピオン酸は、３−メルカプトプロピオニトリルの塩に対応するカルボン酸塩やチオラートとして得ることもできる。
反応式（１１）で示す反応はワンポットで行ってもよい。ここでいう「ワンポット」とは、いくつかの反応を同一反応容器で行うことを意味し、具体的にはアクリロニトリルおよび硫黄原子を含む化合物から主生成物として３−メルカプトプロピオニトリルを生成し副生成物として３−メルカプトプロピオンアミドを生成する反応と、３−メルカプトプロピオニトリルのアミド化反応と、３−メルカプトプロピオンアミドの加水分解反応とを連続して行うことである。この場合において、硫黄原子を含む化合物としては、第３の実施形態で説明したものを用いることができる。
具体的には、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とから得られた３−メルカプトプロピオニトリル及び３−メルカプトプロピオンアミドは、単離して、それぞれ別の反応容器で反応させてもよい。
また、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とから得られた３−メルカプトプロピオニトリル及び３−メルカプトプロピオンアミドは、単離せずに混合状態のまま、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼを添加して反応させてもよい。
３−メルカプトプロピオニトリルは、酵素反応に供する前に生成反応液に存在する硫化水素を低減させることが好ましい。硫化水素を除く方法としては、中和した後減圧する方法や窒素などによるバブリングする方法、あるいはこれらの方法を組み合わせることで硫化水素濃度を低減することができる。硫化水素の濃度としては５０ｐｐｍ以下が好ましく、より好ましくは２０ｐｐｍ以下である。更に好ましくは1５ｐｐｍ以下である。なお、硫化水素の濃度は、公知のヘッドスペースガスクロマトグラフィーにより測定することができる。
ニトリルヒドラターゼとしては第２の実施形態で用いたものと同じものを用いることができる。
また、アミダーゼとしては第１の実施形態で用いたものと同じものを用いることができるが、好ましくは、アミダーゼとしてはアミダーゼの活性中心がリジン、セリン、セリンであるＡＳファミリーと呼ばれる一群のアミダーゼを用いることができる。より具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｔｕｍ ＪＦ−５のアミダーゼを挙げることが出来る。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５由来のアミダーゼを用いるとより好ましい。
（第５の実施形態）
本実施形態では、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて上記一般式（３）で示す３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩を製造し、得られた３−メルカプトプロピオニトリルまたその塩を用いて、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼを共存させて上記一般式（２）で示す３−メルカプトプロピオン酸を製造する。この反応式の一例は、下記反応式（１２）で表される。なお、反応式（１２）において、チオール基は、チオラートであってもよいし、カルボキシル基は、カルボキシラートであってもよい。対カチオンとしては、１価のカチオンとして、例えば、アルカリ金属イオン、または、アンモニウムイオンを用いることができ、アルカリ金属イオンとしては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋が挙げられる。２価のカチオンとしては、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、または、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｒａ２＋のアルカリ土類金属イオンが挙げられる。３価のカチオンとしては、Ａｌ３＋が挙げられる。
本実施形態では、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて上記一般式（３）で示す３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩を製造し、得られた３−メルカプトプロピオニトリルまたその塩を用いて、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼを共存させて上記一般式（２）で示す３−メルカプトプロピオン酸を製造する。この反応式の一例は、下記反応式（１２）で表される。なお、反応式（１２）において、チオール基は、チオラートであってもよいし、カルボキシル基は、カルボキシラートであってもよい。対カチオンとしては、１価のカチオンとして、例えば、アルカリ金属イオン、または、アンモニウムイオンを用いることができ、アルカリ金属イオンとしては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋が挙げられる。２価のカチオンとしては、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、または、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｒａ２＋のアルカリ土類金属イオンが挙げられる。３価のカチオンとしては、Ａｌ３＋が挙げられる。
具体的には、本実施形態において、３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩は、第２の実施形態で用いられた一般式（３）で表される３−メルカプトプロピオニトリル誘導体と同じものとすることができる。３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩は、ニトリルヒドラターゼにより、第２の実施形態で説明した一般式（１）で表される３−メルカプトプロピオンアミド誘導体とすることができる。
第３の実施形態で説明したように、アクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させることで、３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩、および、３−メルカプトプロピオンアミドまたはその塩を製造することができる。チオールは、分子間で酸化カップリング反応して、ジスルフィド結合を形成する。そのため、２分子の３−メルカプトプロピオニトリルがジスルフィド結合を形成することで、３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（化合物（ａ））となり、２分子の３−メルカプトプロピオンアミドがジスルフィド結合を形成することで、３，３'−ジチオジプロピオンアミド（化合物（ｄ））となり、１分子の３−メルカプトプロピオニトリルと１分子の３−メルカプトプロピオンアミドとがジスルフィド結合を形成することで、３−（２−シアノエチル）ジスルファニルプロパンアミド（化合物（ｂ））となる。
化合物（ａ）は、ニトリルヒドラターゼにより、ニトリル基がアミド基に加水分解され、化合物（ｂ）および化合物（ｄ）に変換する。また、３−メルカプトプロピオニトリルは、第２の実施形態で説明したように、ニトリルヒドラターゼによって、３−メルカプトプロピルアミドとなり上述のように、分子間で酸化カップリング反応し、化合物（ｄ）となる。
また、化合物（ｂ）および化合物（ｄ）は、アミダーゼによりアミド基が加水分解を受けてシアノプロピオジスルファニルプロピオカルボン酸（化合物（ｃ））、アミノカルボニルプロピオスルファニルプロピオカルボン酸（ｅ））、及び、３，３'−ジチオジプロピオン酸（化合物（ｆ））を形成する。
また、３−メルカプトプロピオニトリルと３−メルカプトプロピオン酸とがジスルフィド結合を形成して化合物（ｃ）となることもありうるし、３−メルカプトプロピオンアミドと３−メルカプトプロピオン酸とがジスルフィド結合を形成して化合物（ｅ）となることもありうる。
そして、化合物（ｃ）は、ニトリルヒドラターゼにより、化合物（ｅ）となり、化合物（ｅ）は、アミダーゼにより、化合物（ｆ）となる。したがって、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ共存下で３−メルカプトプロピオニトリルを完全に反応させることで、目的の３−メルカプトプロピオン酸の他に化合物（ｆ）が得られることになる。そこで、製造した３，３'−ジチオジプロピオン酸を公知の方法で還元することで３−メルカプトプロピオン酸に変換することができる。こうすることで、本実施形態では、上記反応式（１２）で示す各工程の中間における精製を省略し、効率よく３−メルカプトプロピオン酸を製造することができる。
３，３'−ジチオジプロピオノニトリルおよび３，３'−ジチオジプロピオンアミドは第３の実施形態で説明したアクリロニトリルおよび硫黄原子を含む化合物の反応物を公知の方法により酸化して製造することができる。
本実施形態で用いるニトリルヒドラターゼとは、第３の実施形態で説明したものを用いることができる。本実施形態で用いるアミダーゼとは、第３の実施形態で説明したものを用いることができる。
３，３'−ジチオジプロピオノニトリルの反応条件は、第２の実施形態で説明した条件と同様な条件を用いることができる。３，３'−ジチオジプロピオンアミドの反応条件は、第１の実施形態で説明した条件を用いることができる。
また、３，３'−ジチオジプロピオノニトリル及び３，３'−ジチオジプロピオンアミドは、単離せずに混合状態のまま、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼを添加して反応させてもよい。
３，３'−ジチオジプロピオノニトリル及び３，３'−ジチオジプロピオンアミドは酵素反応に供する前に生成反応液に存在する硫化水素濃度を低減させることが好ましい。硫化水素を除く方法としては、中和した後減圧する方法や窒素などによるバブリングする方法、あるいはこれらの方法を組み合わせることで硫化水素濃度を低減することができる。硫化水素の濃度としては５０ｐｐｍ以下が好ましく、より好ましくは２０ｐｐｍ以下である。更に好ましくは1５ｐｐｍ以下である。なお、硫化水素の濃度は、公知のヘッドスペースガスクロマトグラフィーにより測定することができる。
反応条件は、温度は０℃から５０℃が好ましく、より好ましくは０℃から４０℃である。反応ｐＨは３．０から１０．０、好ましくは６．０から８．０である。ｐＨを調整する際に使用する酸は塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸や酢酸などの有機酸を使用することができる。反応溶媒は、水、メタノール、エタノール、などのアルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチルなどの脂肪酸エステル類、トルエン、キシレンなどの芳香族化合物を用いることができるが、水を用いると特に好ましい。反応液中の３，３'−ジチオジプロピオノニトリル及び３，３'−ジチオジプロピオンアミドの濃度は、好ましくは、１重量％以上とすることができるが、１１重量％以上とすると工業的により有利であり、１３重量％以上がさらに好ましい。この段落でいう反応液とは、反応基質としての３，３'−ジチオジプロピオノニトリルや３，３'−ジチオジプロピオンアミドが反応溶媒に溶解しているもの、反応溶媒中で分散しているもの、反応溶媒と相分離しているものをいずれも含むものである。また、ここでいう濃度とは、３，３'−ジチオジプロピオノニトリル及び３，３'−ジチオジプロピオンアミドが反応溶媒にすべて溶解するとした場合の濃度を意味し、現実に３，３'−ジチオジプロピオノニトリル及び３，３'−ジチオジプロピオンアミドは反応溶媒に対して完全に溶解していても良いし、溶解していない状態であってもよい。反応時間は、通常１時間から８０時間程度である。
生成した３，３'−ジチオジプロピオン酸は、酸性条件下亜鉛、鉄などの金属粉を添加するような、通常知られている還元方法で３−メルカプトプロピオン酸に変換することが可能である。
３−メルカプトプロピオン酸の単離方法は、第１の実施形態で説明した方法と同様な方法を用いることができる。
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
たとえば、実施形態の方法で得られた３−メルカプトプロピオン酸とペンタエリスリトールとをエステル化反応させてペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を製造することもできる。このエステル化反応には公知の方法を用いることができる。また、こうして得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を単重合又は共重合した後硬化して、プラスチックレンズなどの光学材料としてもよい。なお、本発明において、３−メルカプトプロピオン酸とβ−メルカプトプロピオン酸とは同一化合物であり、ジチオジプロピオン酸とβ，β−ジチオジプロピオン酸、３，３'−ジチオジプロピオン酸とは同一化合物である。
以下、参考形態の例を付記する。
１．アミダーゼを用いて、一般式（１）で示されるアミドまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法。
（一般式（１）中、Ｘは、Ｈ、Ｓ−Ｃ ２ Ｈ ４ −ＣＯＮＨ ２ 、Ｓ−Ｃ ２ Ｈ ４ −ＣＯＯＨ、カチオンのいずれかを表す。ＸがＨまたはＳ−Ｃ ２ Ｈ ４ −ＣＯＮＨ ２ またはＳ−Ｃ ２ Ｈ ４ −ＣＯＯＨのときｎは１であり、ＸがカチオンのときｎはＸの価数と同一の整数を表す。）
（一般式（２）中、Ｙは、Ｈ、Ｓ−Ｃ ２ Ｈ ４ −ＣＯＯＨのいずれかを表す。）
２．ニトリルヒドラターゼを用いて、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩から一般式（１）で示されるアミドまたはその塩を製造し、該アミドまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する１．に記載の方法。
（一般式（３）中、Ｚは、Ｈ、Ｓ−Ｃ ２ Ｈ ４ −ＣＮ、Ｓ−Ｃ ２ Ｈ ４ −ＣＯＮＨ ２ 、カチオンのいずれかを表す。ＺがＨまたはＳ−Ｃ ２ Ｈ ４ −ＣＯＮＨ ２ のときｎは１であり、ＺがカチオンのときｎはＺの価数と同一の整数を表す。）
３．ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼの存在下、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する２．に記載の方法。
４．前記ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属の細菌に由来する、２．または３．に記載の方法。
５．反応液中の一般式（１）で示されるアミドまたはその塩、および、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩の少なくとも一方の濃度が、１１重量％以上である、４．に記載の方法。
６．一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩がアクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて得られるものであることを特徴とする２．乃至５．いずれか１つに記載の方法。
７．前記硫黄原子を含む化合物が水硫化ナトリウムである、６．に記載の方法。
８．前記アミダーゼがアミダーゼシグニチャーファミリーに属することを特徴とする１．乃至７．いずれか１つに記載の方法。
９．１．乃至８．いずれか１つに記載の方法を用いて一般式（２）記載のカルボン酸を製造する工程と、
得られた前記カルボン酸とペンタエリスリトールとをエステル化反応させる工程と、
を含むペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）の製造方法。
１０．９．に記載の方法を用いてペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を製造する工程と、
得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を単重合又は共重合した後、硬化する工程と、
を含む光学材料の製造方法。
１１．ニトリラーゼを用いて、３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩から３−メルカプトプロピオン酸を製造する方法。
たとえば、実施形態の方法で得られた３−メルカプトプロピオン酸とペンタエリスリトールとをエステル化反応させてペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を製造することもできる。このエステル化反応には公知の方法を用いることができる。また、こうして得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を単重合又は共重合した後硬化して、プラスチックレンズなどの光学材料としてもよい。なお、本発明において、３−メルカプトプロピオン酸とβ−メルカプトプロピオン酸とは同一化合物であり、ジチオジプロピオン酸とβ，β−ジチオジプロピオン酸、３，３'−ジチオジプロピオン酸とは同一化合物である。
以下、参考形態の例を付記する。
１．アミダーゼを用いて、一般式（１）で示されるアミドまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法。
２．ニトリルヒドラターゼを用いて、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩から一般式（１）で示されるアミドまたはその塩を製造し、該アミドまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する１．に記載の方法。
３．ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼの存在下、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する２．に記載の方法。
４．前記ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属の細菌に由来する、２．または３．に記載の方法。
５．反応液中の一般式（１）で示されるアミドまたはその塩、および、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩の少なくとも一方の濃度が、１１重量％以上である、４．に記載の方法。
６．一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩がアクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて得られるものであることを特徴とする２．乃至５．いずれか１つに記載の方法。
７．前記硫黄原子を含む化合物が水硫化ナトリウムである、６．に記載の方法。
８．前記アミダーゼがアミダーゼシグニチャーファミリーに属することを特徴とする１．乃至７．いずれか１つに記載の方法。
９．１．乃至８．いずれか１つに記載の方法を用いて一般式（２）記載のカルボン酸を製造する工程と、
得られた前記カルボン酸とペンタエリスリトールとをエステル化反応させる工程と、
を含むペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）の製造方法。
１０．９．に記載の方法を用いてペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を製造する工程と、
得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を単重合又は共重合した後、硬化する工程と、
を含む光学材料の製造方法。
１１．ニトリラーゼを用いて、３−メルカプトプロピオニトリルまたはその塩から３−メルカプトプロピオン酸を製造する方法。
＜１．アミダーゼ生産菌の構築＞
（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８のアミダーゼ生産菌
特開平８−２６６２７７号公報に記載のプラスミドｐＢＡＮ−７の塩基配列を解析し、該プラスミドが有する塩基配列を元に、配列表の配列番号７および８のプライマーを設計した。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） ＮＢＲＣ１２６６８の染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行い、アミダーゼ遺伝子を増幅させた。増幅した遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を、ライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＮＢＲＣ１２６６８のアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｐｕ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（２）Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５のアミダーゼ生産菌
特開平９−２７５９７８号公報に記載のプラスミドｐＰＴ−Ｂ１の塩基配列を解析し、該プラスミドが有する塩基配列を元に配列表の配列番号９および１０のプライマーを設計した。Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５の染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行い、アミダーゼ遺伝子を増幅させた。増幅した遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様にライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５のアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｔｈ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３のアミダーゼ生産菌
ＮＣＩＢＭ（米国立生物工学情報センター）に登録されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３のアミダーゼ遺伝子情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／２１６８５０？ｏｒｄｉｎａｌｐｏｓ＝１＆ｉｔｏｏｌ＝ＥｎｔｒｅｚＳｙｓｔｅｍ２．ＰＥｎｔｒｅｚ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＲｅｓｕｌｔｓＰａｎｅｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＲＶＤｏｃＳｕｍ）にもとづいてＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合成はＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４ Ｊｕｌ １；３２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１７６−８０．の方法に従って行った。合成したＤＮＡを鋳型として配列表の配列番号１１および１２のプライマーでアミダーゼ遺伝子にＳＤ配列を付加したＤＮＡを増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様にライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３のアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｃｈ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（４）Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６のアミダーゼ生産菌
ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）からＰｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＳ６６６の染色体ＤＮＡであるＡＴＣＣ−ＢＡＡ−５００Ｄ−５を購入した。ＮＣＩＢＭ（米国立生物工学情報センター）に登録されているＰｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６のアミダーゼ遺伝子情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／９１７８５９１３、ＧｅｎｅＩＤ：４０１０９９４）にもとづいて配列表の配列番号１３および１４をプライマーとし、ＡＴＣＣ−ＢＡＡ−５００Ｄ−５を鋳型としてアミダーゼ遺伝子を増幅した。増幅したアミダーゼ遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）をライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｓｐ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（６）Ａｃｉｄｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｐｔｕｍ ＪＦ−５のアミダーゼ生産菌
ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門）からＮＢＲＣ−１４２４２を購入した。ＮＢＲＣ−１４２４２をＮＢＲＣの培地番号２３４で培養しＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて染色体ＤＮＡを得た。ＮＣＩＢＭ（米国立生物工学情報センター）に登録されているアミダーゼ遺伝子情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／１４８２５９０２１、ＧＩ：１４８２５９２６３）にもとづいて配列表の配列番号１５および１６をプライマーとし、ＮＢＲＣ−１４２４２を培養して得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてアミダーゼ遺伝子を増幅した。増幅したアミダーゼ遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様にライゲーションハイ（東洋紡）を用いて制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ａｃｒ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８のアミダーゼ生産菌
特開平８−２６６２７７号公報に記載のプラスミドｐＢＡＮ−７の塩基配列を解析し、該プラスミドが有する塩基配列を元に、配列表の配列番号７および８のプライマーを設計した。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） ＮＢＲＣ１２６６８の染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行い、アミダーゼ遺伝子を増幅させた。増幅した遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を、ライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＮＢＲＣ１２６６８のアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｐｕ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（２）Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５のアミダーゼ生産菌
特開平９−２７５９７８号公報に記載のプラスミドｐＰＴ−Ｂ１の塩基配列を解析し、該プラスミドが有する塩基配列を元に配列表の配列番号９および１０のプライマーを設計した。Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５の染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行い、アミダーゼ遺伝子を増幅させた。増幅した遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様にライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５のアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｔｈ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３のアミダーゼ生産菌
ＮＣＩＢＭ（米国立生物工学情報センター）に登録されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３のアミダーゼ遺伝子情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／２１６８５０？ｏｒｄｉｎａｌｐｏｓ＝１＆ｉｔｏｏｌ＝ＥｎｔｒｅｚＳｙｓｔｅｍ２．ＰＥｎｔｒｅｚ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＲｅｓｕｌｔｓＰａｎｅｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＲＶＤｏｃＳｕｍ）にもとづいてＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合成はＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４ Ｊｕｌ １；３２（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１７６−８０．の方法に従って行った。合成したＤＮＡを鋳型として配列表の配列番号１１および１２のプライマーでアミダーゼ遺伝子にＳＤ配列を付加したＤＮＡを増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様にライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３のアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｃｈ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（４）Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６のアミダーゼ生産菌
ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）からＰｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＳ６６６の染色体ＤＮＡであるＡＴＣＣ−ＢＡＡ−５００Ｄ−５を購入した。ＮＣＩＢＭ（米国立生物工学情報センター）に登録されているＰｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６のアミダーゼ遺伝子情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／９１７８５９１３、ＧｅｎｅＩＤ：４０１０９９４）にもとづいて配列表の配列番号１３および１４をプライマーとし、ＡＴＣＣ−ＢＡＡ−５００Ｄ−５を鋳型としてアミダーゼ遺伝子を増幅した。増幅したアミダーゼ遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）をライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｓｐ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
（６）Ａｃｉｄｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｐｔｕｍ ＪＦ−５のアミダーゼ生産菌
ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門）からＮＢＲＣ−１４２４２を購入した。ＮＢＲＣ−１４２４２をＮＢＲＣの培地番号２３４で培養しＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて染色体ＤＮＡを得た。ＮＣＩＢＭ（米国立生物工学情報センター）に登録されているアミダーゼ遺伝子情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／１４８２５９０２１、ＧＩ：１４８２５９２６３）にもとづいて配列表の配列番号１５および１６をプライマーとし、ＮＢＲＣ−１４２４２を培養して得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてアミダーゼ遺伝子を増幅した。増幅したアミダーゼ遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様にライゲーションハイ（東洋紡）を用いて制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してアミダーゼ生産菌を作製した。本菌を「Ａｃｒ−アミダーゼ生産菌」と表記する。
＜２．アミダーゼ生産菌の培養＞
５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに１００ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃かつ２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、作製したアミダーゼ生産菌をそれぞれ一白菌耳植菌し、３０℃かつ１３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁し菌体懸濁液をそれぞれ得た。菌体懸濁液は、冷凍庫にて凍結し、解凍して使用した。
５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに１００ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃かつ２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、作製したアミダーゼ生産菌をそれぞれ一白菌耳植菌し、３０℃かつ１３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁し菌体懸濁液をそれぞれ得た。菌体懸濁液は、冷凍庫にて凍結し、解凍して使用した。
＜３−１．Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５・ニトリルヒドラターゼ生産菌の構築と培養＞
５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに４０μｇ／ｍｌの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・二水和物を含む１００ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃かつ２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、寄託微生物（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５、茨城県つくば市東１-１-１ 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成８年２月７日より寄託されている）を一白菌耳植菌し、３７℃かつ１３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁し菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液は、冷凍庫にて凍結し、解凍して使用した。本菌を「Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌」と表記する。
５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに４０μｇ／ｍｌの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・二水和物を含む１００ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃かつ２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、寄託微生物（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５、茨城県つくば市東１-１-１ 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成８年２月７日より寄託されている）を一白菌耳植菌し、３７℃かつ１３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁し菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液は、冷凍庫にて凍結し、解凍して使用した。本菌を「Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌」と表記する。
＜３−２．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８・ニトリルヒドラターゼ生産菌の構築と培養＞
前記の１．アミダーゼ生産菌の構築（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８のアミダーゼ生産菌で用いた染色体ＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１７（ＧＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣ）および配列表の配列番号１８（ＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＧＣＣＧ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を増幅した。増幅したニトリルヒドラターゼ遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を、ライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＮＢＲＣ１２６６８のニトリルヒドラターゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｐｕ−ニトリルヒドラターゼ生産菌」と表記する。
５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに４０μｇ／ｍｌの硫酸第二鉄・七水和物を含む１００ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃かつ２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、Ｐｐｕ−ニトリルヒドラターゼ生産菌を一白菌耳植菌し、３７℃かつ１３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁し菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液は、冷凍庫にて凍結し、解凍して使用した。
前記の１．アミダーゼ生産菌の構築（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１２６６８のアミダーゼ生産菌で用いた染色体ＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１７（ＧＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣ）および配列表の配列番号１８（ＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＧＣＣＧ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を増幅した。増幅したニトリルヒドラターゼ遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。同様に制限酵素で消化したｐＵＣ１８（宝酒造製）を、ライゲーションハイ（東洋紡製）を用いて連結し、コンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に導入してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＮＢＲＣ１２６６８のニトリルヒドラターゼ生産菌を作製した。本菌を「Ｐｐｕ−ニトリルヒドラターゼ生産菌」と表記する。
５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに４０μｇ／ｍｌの硫酸第二鉄・七水和物を含む１００ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃かつ２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、Ｐｐｕ−ニトリルヒドラターゼ生産菌を一白菌耳植菌し、３７℃かつ１３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁し菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液は、冷凍庫にて凍結し、解凍して使用した。
＜４．メルカプトプロピオニトリルの合成＞
実施例１〜４、７−２７、３２、および、比較例で用いた３−メルカプトプロピオニトリルは、以下のように合成した。７０％水硫化ナトリウム４８．１ｇ（０．６ｍｏｌ）に水４３．５ｇを加え溶解した後、４０℃に保ちながらアクリロニトリル２６．５ｇ（０．５ｍｏｌ）を３０〜６０分間で滴下した。ついで、４０℃に保ったまま、さらに１０時間攪拌した。ついで、得られた反応マスに４７％硫酸水を７０ｇ程度加え、反応液ｐＨ２．０以下を確認した後に、クロロホルム５０ｇで２回抽出した。有機層を合せ、減圧下濃縮し、残液を４５〜４８℃／３Ｔｏｒｒで減圧蒸留し、純度９９．８％の３−メルカプトプロピオニトリル４０．３ｇを得た。
実施例１〜４、７−２７、３２、および、比較例で用いた３−メルカプトプロピオニトリルは、以下のように合成した。７０％水硫化ナトリウム４８．１ｇ（０．６ｍｏｌ）に水４３．５ｇを加え溶解した後、４０℃に保ちながらアクリロニトリル２６．５ｇ（０．５ｍｏｌ）を３０〜６０分間で滴下した。ついで、４０℃に保ったまま、さらに１０時間攪拌した。ついで、得られた反応マスに４７％硫酸水を７０ｇ程度加え、反応液ｐＨ２．０以下を確認した後に、クロロホルム５０ｇで２回抽出した。有機層を合せ、減圧下濃縮し、残液を４５〜４８℃／３Ｔｏｒｒで減圧蒸留し、純度９９．８％の３−メルカプトプロピオニトリル４０．３ｇを得た。
＜５．分析法（１）＞
実施例１〜２９、比較例については、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオンアミド、チオジプロピオン酸及びジチオジプロピオン酸を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。３−メルカプトプロピオン酸の収率は数式（１３）により算出した。
カラム；Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−６．０（５μｍ）（関東化学株式会社製）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／分
検出；ＵＶ２２５ｎｍ、
溶離液；０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４水：アセトニトリル（ＡＮ）＝１６００：４００（Ｖ／Ｖ）（リン酸ｐＨ３．０）
実施例１〜２９、比較例については、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオンアミド、チオジプロピオン酸及びジチオジプロピオン酸を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。３−メルカプトプロピオン酸の収率は数式（１３）により算出した。
カラム；Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−６．０（５μｍ）（関東化学株式会社製）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／分
検出；ＵＶ２２５ｎｍ、
溶離液；０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４水：アセトニトリル（ＡＮ）＝１６００：４００（Ｖ／Ｖ）（リン酸ｐＨ３．０）
３−メルカプトプロピオン酸の収率（％）＝（３−メルカプトプロピオン酸の物質量（ｍｏｌ）／仕込んだ３−メルカプトプロピオンアミドの物質量（ｍｏｌ））×１００（１３）
＜６．３，３'−ジチオジプロピオノニトリルの合成＞
実施例３６〜３８で用いた３，３'−ジチオジプロピオノニトリルは、以下のように合成した。３−メルカプトプロピオニトリル（１８．３９ｇ、０．２１ｍｏｌ）に水（２３．００ｇ）を加えて５℃に冷却した。反応液の温度を５〜２５℃に保ちながら、０．５ｍｏｌ／Ｌヨウ素溶液（２２５．４ｍｌ、０．１１ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後、２５℃で２時間熟成した。反応混合物の固体を濾別後、水（１８００ｍｌ）で洗浄して、粗体３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（湿体）を得た。これを室温で一晩乾燥させた。続いて、粗体３，３'−ジチオジプロピオノニトリルをｎ−ヘキサン（３００ｍｌ）およびｎ−ヘキサン／トルエン（体積比：２／１）混合液（３００ｍｌ）でそれぞれ１回ずつ１時間スラッジした後、濾過、ヘキサン洗浄（５００ｍｌ）して３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（湿体）を得た。次にこれをトルエン（６５０ｍｌ）に溶解させて、カラム濾過（シリカゲルＣ−３００、１００ｍｌ）して３，３'−ジチオジプロピオノニトリルのトルエン溶液を得た。エバポレーターによりトルエンを減圧除去し、濃縮物をヘキサン（５００ｍｌ）に滴下して再沈殿させた。結晶を濾別、ヘキサン洗浄（２５０ｍｌ）して３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（ｗｅｔ品，１０．２ｇ）を得た。これを再び、トルエン（６５０ｍｌ）に溶解させて、カラム濾過（シリカゲルＣ−３００、１００ｍｌ）した。エバポレーターによりトルエンを減圧除去し、濃縮物をヘキサン（５００ｍｌ）に滴下して再沈殿させた。結晶を濾別、ヘキサン洗浄（２５０ｍｌ）し、デシケーター内で室温にて減圧乾燥させて、３，３'−ジチオジプロピオノニトリルを得た（９．０ｇ）。
実施例３６〜３８で用いた３，３'−ジチオジプロピオノニトリルは、以下のように合成した。３−メルカプトプロピオニトリル（１８．３９ｇ、０．２１ｍｏｌ）に水（２３．００ｇ）を加えて５℃に冷却した。反応液の温度を５〜２５℃に保ちながら、０．５ｍｏｌ／Ｌヨウ素溶液（２２５．４ｍｌ、０．１１ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後、２５℃で２時間熟成した。反応混合物の固体を濾別後、水（１８００ｍｌ）で洗浄して、粗体３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（湿体）を得た。これを室温で一晩乾燥させた。続いて、粗体３，３'−ジチオジプロピオノニトリルをｎ−ヘキサン（３００ｍｌ）およびｎ−ヘキサン／トルエン（体積比：２／１）混合液（３００ｍｌ）でそれぞれ１回ずつ１時間スラッジした後、濾過、ヘキサン洗浄（５００ｍｌ）して３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（湿体）を得た。次にこれをトルエン（６５０ｍｌ）に溶解させて、カラム濾過（シリカゲルＣ−３００、１００ｍｌ）して３，３'−ジチオジプロピオノニトリルのトルエン溶液を得た。エバポレーターによりトルエンを減圧除去し、濃縮物をヘキサン（５００ｍｌ）に滴下して再沈殿させた。結晶を濾別、ヘキサン洗浄（２５０ｍｌ）して３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（ｗｅｔ品，１０．２ｇ）を得た。これを再び、トルエン（６５０ｍｌ）に溶解させて、カラム濾過（シリカゲルＣ−３００、１００ｍｌ）した。エバポレーターによりトルエンを減圧除去し、濃縮物をヘキサン（５００ｍｌ）に滴下して再沈殿させた。結晶を濾別、ヘキサン洗浄（２５０ｍｌ）し、デシケーター内で室温にて減圧乾燥させて、３，３'−ジチオジプロピオノニトリルを得た（９．０ｇ）。
＜７．分析法（２）＞
実施例３０〜４０では、３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド、３−メルカプトプロピオン酸、３，３'−ジチオジプロピオノニトリル、３，３'−ジチオジプロピオンアミド、及び、３,３'−ジチオジプロピオン酸をＨＰＬＣにより定量した。試料を水/アセトニトリル（８/２）混合液に溶解させ、ベンジルアルコールを内部標準物質として高速液体クロマトグラフィーによって、測定した。
Ｉ．装置 ＤＧＵ−１４Ａ、ＬＣ−１０Ａ、ＳＰＤ−１０Ａ、ＣＴＯ−１０Ａ、ＳＣＬ−１０Ａ
送液ユニット： 島津製作所ＳＣＬ−１０Ａ
検出器： 島津製作所ＳＰＤ−１０Ａ
カラムオ−ブン： 島津製作所ＣＴＯ−１０ＡｘＬ
オ−トインジェクタ−：島津製作所ＳＩＬ−１０Ａ
デ−タ処理装置： 島津製作所クロマトパックＣ−Ｒ５Ａ
ＩＩ．測定条件
カラム： Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−６．０（５μｍ）３０ｃｍ
検出器： ＵＶ ２２５ｎｍ
溶離液： ０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４水：アセトニトリル＝１６００：４００（Ｖ／Ｖ）（リン酸ｐＨ３．０））
溶離液流量： １．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラムオーブン温度： ４０℃
試料注入量： ２μＬ
検出限界： ０．５重量％（３−メルカプトプロピオンアミド、３−メルカプトプロピオン酸）
ＩＩＩ．分析操作
試料約７０ｍｇ及び内標準物質ベンジルアルコール約１００ｍｇを２０ｍＬサンプル瓶に正確に量りとり、水：アセトニトリル＝８：２混合液１０ｍＬを加え混合溶解して試料溶液とした。この試料溶液２μＬを上記の測定条件で導入し、得られたクロマトグラムより成分ピ−ク面積を求め、試料の純度（％）を算出した。
実施例３０〜４０では、３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド、３−メルカプトプロピオン酸、３，３'−ジチオジプロピオノニトリル、３，３'−ジチオジプロピオンアミド、及び、３,３'−ジチオジプロピオン酸をＨＰＬＣにより定量した。試料を水/アセトニトリル（８/２）混合液に溶解させ、ベンジルアルコールを内部標準物質として高速液体クロマトグラフィーによって、測定した。
Ｉ．装置 ＤＧＵ−１４Ａ、ＬＣ−１０Ａ、ＳＰＤ−１０Ａ、ＣＴＯ−１０Ａ、ＳＣＬ−１０Ａ
送液ユニット： 島津製作所ＳＣＬ−１０Ａ
検出器： 島津製作所ＳＰＤ−１０Ａ
カラムオ−ブン： 島津製作所ＣＴＯ−１０ＡｘＬ
オ−トインジェクタ−：島津製作所ＳＩＬ−１０Ａ
デ−タ処理装置： 島津製作所クロマトパックＣ−Ｒ５Ａ
ＩＩ．測定条件
カラム： Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−６．０（５μｍ）３０ｃｍ
検出器： ＵＶ ２２５ｎｍ
溶離液： ０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４水：アセトニトリル＝１６００：４００（Ｖ／Ｖ）（リン酸ｐＨ３．０））
溶離液流量： １．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラムオーブン温度： ４０℃
試料注入量： ２μＬ
検出限界： ０．５重量％（３−メルカプトプロピオンアミド、３−メルカプトプロピオン酸）
ＩＩＩ．分析操作
試料約７０ｍｇ及び内標準物質ベンジルアルコール約１００ｍｇを２０ｍＬサンプル瓶に正確に量りとり、水：アセトニトリル＝８：２混合液１０ｍＬを加え混合溶解して試料溶液とした。この試料溶液２μＬを上記の測定条件で導入し、得られたクロマトグラムより成分ピ−ク面積を求め、試料の純度（％）を算出した。
（実施例１）
３−メルカプトプロピオニトリル１ｇを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬに溶解し４℃に保った。Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の菌体懸濁液１ｇを加えて２４ｈｒ攪拌した。得られた混合液をＨＰＬＣで分析した結果、３−メルカプトプロピオニトリルの９９％が３−メルカプトプロピオンアミドに変換していた。次いで、反応式（４）の反応を行った。作製したアミダーゼ生産菌の菌体懸濁液を１ｇずつ、それぞれ添加して３５℃で反応させた。所定時間経過後の３−メルカプトプロピオン酸の収率を表１に示した。何れの反応においてもチオジプロピオン酸及びジチオジプロピオン酸の収率は５％以下であった。
３−メルカプトプロピオニトリル１ｇを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬに溶解し４℃に保った。Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の菌体懸濁液１ｇを加えて２４ｈｒ攪拌した。得られた混合液をＨＰＬＣで分析した結果、３−メルカプトプロピオニトリルの９９％が３−メルカプトプロピオンアミドに変換していた。次いで、反応式（４）の反応を行った。作製したアミダーゼ生産菌の菌体懸濁液を１ｇずつ、それぞれ添加して３５℃で反応させた。所定時間経過後の３−メルカプトプロピオン酸の収率を表１に示した。何れの反応においてもチオジプロピオン酸及びジチオジプロピオン酸の収率は５％以下であった。
（実施例２）
反応式（８）の反応を行った。１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｇに３−メルカプトプロピオニトリル１．５ｇを加え蒸留水を加えて９ｇとした。次いでＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇ、Ｐｔｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液１ｇを加えて２５℃で２０時間攪拌した。３−メルカプトプロピオン酸の収率は９９％であり、ジチオジプロピオン酸の収率は０．５％であった。
反応式（８）の反応を行った。１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｇに３−メルカプトプロピオニトリル１．５ｇを加え蒸留水を加えて９ｇとした。次いでＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇ、Ｐｔｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液１ｇを加えて２５℃で２０時間攪拌した。３−メルカプトプロピオン酸の収率は９９％であり、ジチオジプロピオン酸の収率は０．５％であった。
（実施例３）
反応式（８）の反応を行った。３−メルカプトプロピオニトリル４．４ｇに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｇを加えた。３−メルカプトプロピオニトリルの終濃度が１３重量％、１５重量％、１７重量％となるように蒸留水を加え、作製したＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇおよびＰｐｕ−アミダーゼ生産菌の懸濁液１ｇを加えて２０℃で２０時間攪拌した。３−メルカプトプロピオン酸の収率の結果を表２に示した。
反応式（８）の反応を行った。３−メルカプトプロピオニトリル４．４ｇに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｇを加えた。３−メルカプトプロピオニトリルの終濃度が１３重量％、１５重量％、１７重量％となるように蒸留水を加え、作製したＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇおよびＰｐｕ−アミダーゼ生産菌の懸濁液１ｇを加えて２０℃で２０時間攪拌した。３−メルカプトプロピオン酸の収率の結果を表２に示した。
（実施例４）
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｇに３−メルカプトプロピオニトリル０．１ｇを加え蒸留水９ｇを加えた。次いで試薬ニトリラーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社、カタログ番号ＮＩＴ−１２０００、ＮＩＴ−１，２，３，４，５，７，８，９，１０，１１）を各々０．１ｇ添加し２５℃にて２０時間攪拌した。反応液を分析し、３−メルカプトプロピオン酸の収率の結果を表３に示した。何れの反応においてもチオジプロピオン酸及びジチオジプロピオン酸の収率は５％以下であった。
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｇに３−メルカプトプロピオニトリル０．１ｇを加え蒸留水９ｇを加えた。次いで試薬ニトリラーゼ（ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社、カタログ番号ＮＩＴ−１２０００、ＮＩＴ−１，２，３，４，５，７，８，９，１０，１１）を各々０．１ｇ添加し２５℃にて２０時間攪拌した。反応液を分析し、３−メルカプトプロピオン酸の収率の結果を表３に示した。何れの反応においてもチオジプロピオン酸及びジチオジプロピオン酸の収率は５％以下であった。
（比較例）
反応式（１１）の反応について、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼを用いずに、３−メルカプトプロピオニトリルのアミド化反応および３−メルカプトプロピオンアミドの加水分解反応を化学的に行った。水硫化ナトリウム１８７．１ｇに蒸留水１７４．２ｇを加え３５℃に加温した。１０６．１ｇのアクリロニトリルを加え、１０時間かけて３−メルカプトプロピオニトリルを合成した。反応液４７２．６ｇに４６．６４重量％の水酸化ナトリウム溶液を２５７．３ｇ添加し、６０℃で１０時間加水分解反応を行った。次いで室温に冷却し、硫酸を加えてｐＨ１．８とし、クロロホルムにより抽出した。抽出液の組成を表４に示した。なお、生成量は、アクリロニトリルの物質量（ｍｏｌ）に対する各生成物の物質量（ｍｏｌ）の百分率を示す。
反応式（１１）の反応について、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼを用いずに、３−メルカプトプロピオニトリルのアミド化反応および３−メルカプトプロピオンアミドの加水分解反応を化学的に行った。水硫化ナトリウム１８７．１ｇに蒸留水１７４．２ｇを加え３５℃に加温した。１０６．１ｇのアクリロニトリルを加え、１０時間かけて３−メルカプトプロピオニトリルを合成した。反応液４７２．６ｇに４６．６４重量％の水酸化ナトリウム溶液を２５７．３ｇ添加し、６０℃で１０時間加水分解反応を行った。次いで室温に冷却し、硫酸を加えてｐＨ１．８とし、クロロホルムにより抽出した。抽出液の組成を表４に示した。なお、生成量は、アクリロニトリルの物質量（ｍｏｌ）に対する各生成物の物質量（ｍｏｌ）の百分率を示す。
（実施例５）
反応式（１１）の反応を行った。７０ｗ／ｗ％水硫化ナトリウム（和光純薬製）４８．１ｇ（０．６ｍｏｌ）に水４３．５ｇを加え溶解した後、４０℃に保ちながらアクリロニトリル２６．５ｇ（０．５ｍｏｌ）を３０〜６０分間で滴下した。ついで、４０℃に保ったまま、さらに１０時間攪拌を続けた。ついで、得られた反応マスに４７ｗ／ｖ％硫酸水を加えながら反応液ｐＨ６．５〜７．５に調整し、３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド及び３−メルカプトプロピオン酸の混合物を得た。得られた混合物の組成を表５に示した。なお、表５では、仕込んだアクリロニトリルに対する各成分のモル％を示している。この混合物に蒸留水を加え、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整した。３−メルカプトプロピオニトリルの濃度が１３重量％となるように蒸留水を加えＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇを加え４℃で２４時間攪拌した。次いで反応液を３５℃に加温してＰｐｕ−アミダーゼ生産菌の懸濁液１ｇを加え２４時間攪拌した。その結果、表５で示す３-メルカプトプロピオニトリルと３−メルカプトプロピオンアミドの合計に対する３-メルカプトプロピオン酸の収率は９８％であった。
反応式（１１）の反応を行った。７０ｗ／ｗ％水硫化ナトリウム（和光純薬製）４８．１ｇ（０．６ｍｏｌ）に水４３．５ｇを加え溶解した後、４０℃に保ちながらアクリロニトリル２６．５ｇ（０．５ｍｏｌ）を３０〜６０分間で滴下した。ついで、４０℃に保ったまま、さらに１０時間攪拌を続けた。ついで、得られた反応マスに４７ｗ／ｖ％硫酸水を加えながら反応液ｐＨ６．５〜７．５に調整し、３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド及び３−メルカプトプロピオン酸の混合物を得た。得られた混合物の組成を表５に示した。なお、表５では、仕込んだアクリロニトリルに対する各成分のモル％を示している。この混合物に蒸留水を加え、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整した。３−メルカプトプロピオニトリルの濃度が１３重量％となるように蒸留水を加えＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇを加え４℃で２４時間攪拌した。次いで反応液を３５℃に加温してＰｐｕ−アミダーゼ生産菌の懸濁液１ｇを加え２４時間攪拌した。その結果、表５で示す３-メルカプトプロピオニトリルと３−メルカプトプロピオンアミドの合計に対する３-メルカプトプロピオン酸の収率は９８％であった。
（実施例６）
実施例５において、Ｐｐｕ−アミダーゼ生産菌の懸濁液に換えてＰｃｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液を用いて同様な操作を行った。その結果、３-メルカプトプロピオン酸が収率１０％で得られた。
実施例５において、Ｐｐｕ−アミダーゼ生産菌の懸濁液に換えてＰｃｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液を用いて同様な操作を行った。その結果、３-メルカプトプロピオン酸が収率１０％で得られた。
（実施例７）高濃度３−メルカプトプロピオンアミドによる製造
反応式（８）の反応を行った。３−メルカプトプロピオニトリル４．４ｇに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｇを加えた。３−メルカプトプロピオニトリルの終濃度が１５重量％となるように蒸留水を加え、作製したＰｔｈニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇを加え３０℃にて２０時間反応した。３−メルカプトプロピオニトリルは９９％以上が３−メルカプトプロピオンアミドに変換された。次いで、アミダーゼ生産菌の懸濁液１ｇを加えて２０時間攪拌した。３−メルカプトプロピオン酸の収率の結果を表６に示した。使用した菌体懸濁液の電気泳動図を図１に示す。図１中矢印で示すバンドの濃さは、反応に用いた酵素の発現量を表す。Ａは、Ｐｓｐ−アミダーゼであり。Ｂは、Ａｃｒ−アミダーゼであり、Ｃは、Ｐｐｕ−アミダーゼであり、Ｄは、Ｐｃｈ−アミダーゼである。
反応式（８）の反応を行った。３−メルカプトプロピオニトリル４．４ｇに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｇを加えた。３−メルカプトプロピオニトリルの終濃度が１５重量％となるように蒸留水を加え、作製したＰｔｈニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇを加え３０℃にて２０時間反応した。３−メルカプトプロピオニトリルは９９％以上が３−メルカプトプロピオンアミドに変換された。次いで、アミダーゼ生産菌の懸濁液１ｇを加えて２０時間攪拌した。３−メルカプトプロピオン酸の収率の結果を表６に示した。使用した菌体懸濁液の電気泳動図を図１に示す。図１中矢印で示すバンドの濃さは、反応に用いた酵素の発現量を表す。Ａは、Ｐｓｐ−アミダーゼであり。Ｂは、Ａｃｒ−アミダーゼであり、Ｃは、Ｐｐｕ−アミダーゼであり、Ｄは、Ｐｃｈ−アミダーゼである。
（実施例８）変異型アミダーゼによる反応（１）
配列表の配列番号２をコードする遺伝子を含むｐＵＣ１８を鋳型として、配列表の配列番号１９および２０のプライマーを用い、クイックチェンジ法で配列表の配列番号１のアミノ酸配列において５１番目のＩｌｅがＴｈｒに変換された変異体をコードする遺伝子を作成した。クイックチェンジ法はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコルに従った。前記操作により作成したプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行った。実施例１で用いたアミダーゼ生産菌の培養と同様に変異型アミダーゼ生産菌を得た。変異型アミダーゼを用いて実施例７の反応を行った。得られた３−メルカプトプロピオン酸の収率は９９％であり、ジチオジプロピオン酸の収率は０．５％であった。
配列表の配列番号２をコードする遺伝子を含むｐＵＣ１８を鋳型として、配列表の配列番号１９および２０のプライマーを用い、クイックチェンジ法で配列表の配列番号１のアミノ酸配列において５１番目のＩｌｅがＴｈｒに変換された変異体をコードする遺伝子を作成した。クイックチェンジ法はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコルに従った。前記操作により作成したプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行った。実施例１で用いたアミダーゼ生産菌の培養と同様に変異型アミダーゼ生産菌を得た。変異型アミダーゼを用いて実施例７の反応を行った。得られた３−メルカプトプロピオン酸の収率は９９％であり、ジチオジプロピオン酸の収率は０．５％であった。
（実施例９〜２７）変異型アミダーゼによる反応（２）
配列表の配列番号２をコードする遺伝子を含むｐＵＣ１８を鋳型として、表７に示す配列番号のプライマーを用い、クイックチェンジ法で配列表の配列番号１のアミノ酸配列において表７に示すようにアミノ酸変換された変異体をコードする遺伝子を作成した。その他は実施例８と同様に行った。いずれの変異型アミダーゼにおいても、３−メルカプトプロピオン酸の収率は９９％であり、ジチオジプロピオン酸の収率は０．５％であった。
配列表の配列番号２をコードする遺伝子を含むｐＵＣ１８を鋳型として、表７に示す配列番号のプライマーを用い、クイックチェンジ法で配列表の配列番号１のアミノ酸配列において表７に示すようにアミノ酸変換された変異体をコードする遺伝子を作成した。その他は実施例８と同様に行った。いずれの変異型アミダーゼにおいても、３−メルカプトプロピオン酸の収率は９９％であり、ジチオジプロピオン酸の収率は０．５％であった。
（実施例２８）
実施例５で得た３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド及び３−メルカプトプロピオン酸の混合物に蒸留水を加え、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整した。３−メルカプトプロピオニトリルの濃度が１．０重量％となるように蒸留水を加えた反応液５ｇにＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液またはＰｐｕ-ニトリルヒドラタ−ゼ生産菌の懸濁液０．１ｇを加え３０℃で２時間攪拌した。何れの反応でも３−メルカプトプロピオニトリルは９９％以上が３−メルカプトプロピオンアミドに加水分解された。
実施例５で得た３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド及び３−メルカプトプロピオン酸の混合物に蒸留水を加え、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整した。３−メルカプトプロピオニトリルの濃度が１．０重量％となるように蒸留水を加えた反応液５ｇにＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液またはＰｐｕ-ニトリルヒドラタ−ゼ生産菌の懸濁液０．１ｇを加え３０℃で２時間攪拌した。何れの反応でも３−メルカプトプロピオニトリルは９９％以上が３−メルカプトプロピオンアミドに加水分解された。
（実施例２９）
４６．４２ｗ／ｖ％水硫化ナトリウム溶液（１４４．９２ｇ、１．２ｍｏｌ）に、水（３６．１２ｇ）を加えて４０℃に保ちながらこれにアクリロニトリル（５３．０６ｇ、１．０ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後、４０℃で１０時間熟成した。続いて反応混合物の温度を２５〜３０℃に保ちながら、４７ｗ／ｖ％硫酸（１２５．３ｇ、０．３ｍｏｌ）を２時間かけて滴下した後（ｐＨ１４→ｐＨ６．５〜７）、２５〜３０℃で１時間熟成した。該反応混合液中の硫化水素濃度は、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによる方法で分析した。熟成後の反応混合液中の硫化水素濃度は８０００ｐｐｍであった。該反応混合液中の硫化水素濃度が１５ｐｐｍとなるまで減圧下で反応混合物内の硫化水素を除去した（２５〜３０℃、６．７ｋＰａ（５０ｔｏｒｒ）、３時間）。硫酸滴下時、熟成時、減圧脱気時に反応系外へ放出された硫化水素ガスは、苛性トラップにて捕集した。次に、２層分離した反応混合物からデカンテーションにより上層部の粗体３−メルカプトプロピオニトリル（７５．６ｇ）と下層部分水層（２７０．０ｇ）を取得した。この取得した粗体３−メルカプトプロピオニトリルと水層を重量比率（７５．６：２７０）で使用した。得られた３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド及び３−メルカプトプロピオン酸の混合物に蒸留水を加え、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整した。反応液５ｇにＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇまたは２ｇを加え、３−メルカプトプロピオニトリルの濃度が１３重量％となるように調整し、１０℃から３０℃で２４時間攪拌した。同様にＰｐｕ-ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液を加え反応した。結果を表８に示す。
４６．４２ｗ／ｖ％水硫化ナトリウム溶液（１４４．９２ｇ、１．２ｍｏｌ）に、水（３６．１２ｇ）を加えて４０℃に保ちながらこれにアクリロニトリル（５３．０６ｇ、１．０ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後、４０℃で１０時間熟成した。続いて反応混合物の温度を２５〜３０℃に保ちながら、４７ｗ／ｖ％硫酸（１２５．３ｇ、０．３ｍｏｌ）を２時間かけて滴下した後（ｐＨ１４→ｐＨ６．５〜７）、２５〜３０℃で１時間熟成した。該反応混合液中の硫化水素濃度は、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによる方法で分析した。熟成後の反応混合液中の硫化水素濃度は８０００ｐｐｍであった。該反応混合液中の硫化水素濃度が１５ｐｐｍとなるまで減圧下で反応混合物内の硫化水素を除去した（２５〜３０℃、６．７ｋＰａ（５０ｔｏｒｒ）、３時間）。硫酸滴下時、熟成時、減圧脱気時に反応系外へ放出された硫化水素ガスは、苛性トラップにて捕集した。次に、２層分離した反応混合物からデカンテーションにより上層部の粗体３−メルカプトプロピオニトリル（７５．６ｇ）と下層部分水層（２７０．０ｇ）を取得した。この取得した粗体３−メルカプトプロピオニトリルと水層を重量比率（７５．６：２７０）で使用した。得られた３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド及び３−メルカプトプロピオン酸の混合物に蒸留水を加え、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整した。反応液５ｇにＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇまたは２ｇを加え、３−メルカプトプロピオニトリルの濃度が１３重量％となるように調整し、１０℃から３０℃で２４時間攪拌した。同様にＰｐｕ-ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液を加え反応した。結果を表８に示す。
（実施例３０）変異型ニトリルヒドラターゼによる反応
［実施例３０−（１）］リボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）の取得
鋳型として特開平９−２７５９７８号公報の実施例３記載のプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１、配列表の配列番号：５９、及び、６０に記載のプライマーを用いたＰＣＲ反応により、約０．７Ｋｂｐの遺伝子断片を得た。上記ＰＣＲ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製した。同様に、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断、アガロースゲル電気泳動を行い、アガロースゲルから約３．９ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。この様にして得られた約０．７ｋｂｐと約３．９ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させ、上記のリボゾーム結合配列が改変されたニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、ｐＰＴ−ＤＢ１に、表９で示される改変されたリボゾーム結合配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１）］リボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）の取得
鋳型として特開平９−２７５９７８号公報の実施例３記載のプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１、配列表の配列番号：５９、及び、６０に記載のプライマーを用いたＰＣＲ反応により、約０．７Ｋｂｐの遺伝子断片を得た。上記ＰＣＲ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製した。同様に、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断、アガロースゲル電気泳動を行い、アガロースゲルから約３．９ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。この様にして得られた約０．７ｋｂｐと約３．９ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させ、上記のリボゾーム結合配列が改変されたニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、ｐＰＴ−ＤＢ１に、表９で示される改変されたリボゾーム結合配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２）を得た。
［実施例３０−（３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３）を取得するために、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（以後、変異導入キットと呼ぶ）を用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３）を取得するために、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（以後、変異導入キットと呼ぶ）を用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：６２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成は変異導入キットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。
ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：６３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：６４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成は変異導入キットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。
ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去した後、１０ｍＭ トリスー塩酸・１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下ＴＥ溶液と略す）を加えて各々５０μＬの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μＬずつ含む全量４７．５μＬのアニーリング溶液（組成は変異導入キットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。
アニーリング処理液にＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑを０．５μＬ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。
アニーリング処理液にＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑを０．５μＬ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。
これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：６２に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：６４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μＬとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μＬを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
続いて、アガロースゲルから約２ＫｂのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥ溶液に溶解した。精製した約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥ溶液に溶解した。
同様に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ＫｂのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥ溶液に溶解した。
この様にして得られた約２Ｋｂと約２．７ＫｂのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換した。該形質転換体から抽出したプラスミドを鋳型とし、上記の操作を、配列番号：６１記載のプライマーに換えて、配列番号：６５記載のプライマーを用いて実施し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３）を得た。
［実施例３０−（４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号６６、及び、６７に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号６６、及び、６７に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４）を得た。
［実施例３０−（５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５）を取得するために、前記の実施例３０−（２）記載の形質転換体（２）より回収したプラスミド（２）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２）記載のプラスミド（２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５）を取得するために、前記の実施例３０−（２）記載の形質転換体（２）より回収したプラスミド（２）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２）記載のプラスミド（２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１１で示すように変異させた形質転換体（６）を取得するために、前記の実施例３０−（３）記載の形質転換体（３）より回収したプラスミド（３）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３）記載のプラスミド（３）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１１で示すように変異させた形質転換体（６）を取得するために、前記の実施例３０−（３）記載の形質転換体（３）より回収したプラスミド（３）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３）記載のプラスミド（３）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７）を取得するために、前記の実施例３０−（４）記載の形質転換体（４）より回収したプラスミド（４）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４）記載のプラスミド（４）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７）を取得するために、前記の実施例３０−（４）記載の形質転換体（４）より回収したプラスミド（４）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４）記載のプラスミド（４）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８）を得た。
［実施例３０−（９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７３に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７３に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９）を得た。
［実施例３０−（１０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：６９、及び、７０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：６９、及び、７０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０）を得た。
［実施例３０−（１１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１）を取得するために、前記の実施例３０−（８）記載の形質転換体（８）より回収したプラスミド（８）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８）記載のプラスミド（８）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１）を取得するために、前記の実施例３０−（８）記載の形質転換体（８）より回収したプラスミド（８）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８）記載のプラスミド（８）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１２）を取得するために、前記の実施例３０−（９）記載の形質転換体（９）より回収したプラスミド（９）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９）記載のプラスミド（９）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１２）を取得するために、前記の実施例３０−（９）記載の形質転換体（９）より回収したプラスミド（９）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９）記載のプラスミド（９）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１３）を取得するために、前記の実施例３０−（１０）記載の形質転換体（１０）より回収したプラスミド（１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０）記載のプラスミド（１０）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１３）を取得するために、前記の実施例３０−（１０）記載の形質転換体（１０）より回収したプラスミド（１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０）記載のプラスミド（１０）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１４）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７１に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１４）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１４）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７１に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１４）を得た。
［実施例３０−（１５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１５）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：７２、及び、７３に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１５）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１５）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：７２、及び、７３に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１５）を得た。
［実施例３０−（１６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１６）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号７４、及び、７５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１６）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１６）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号７４、及び、７５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１６）を得た。
［実施例３０−（１７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１７）を取得するために、前記の実施例３０−（１４）記載の形質転換体（１４）より回収したプラスミド（１４）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１４）記載のプラスミド（１４）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１７）を取得するために、前記の実施例３０−（１４）記載の形質転換体（１４）より回収したプラスミド（１４）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１４）記載のプラスミド（１４）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体をを発現する形質転換体（１８）を取得するために、前記の実施例３０−（１５）記載の形質転換体（１５）より回収したプラスミド（１５）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１５）記載のプラスミド（１５）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体をを発現する形質転換体（１８）を取得するために、前記の実施例３０−（１５）記載の形質転換体（１５）より回収したプラスミド（１５）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１５）記載のプラスミド（１５）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１９）を取得するために、前記の実施例３０−（１６）記載の形質転換体（１６）より回収したプラスミド（１６）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１６）記載のプラスミド（１６）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１９）を取得するために、前記の実施例３０−（１６）記載の形質転換体（１６）より回収したプラスミド（１６）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１６）記載のプラスミド（１６）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（２０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２０）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７５に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２０）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２０）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７５に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２０）を得た。
［実施例３０−（２１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２１）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：７７、及び、７８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２１）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２１）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：７７、及び、７８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２１）を得た。
［実施例３０−（２２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体をを発現する形質転換体（２２）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：７９、及び、８０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２２）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体をを発現する形質転換体（２２）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：７９、及び、８０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２２）を得た。
［実施例３０−（２３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２３）を取得するために、前記の実施例３０−（２０）記載の形質転換体（２０）より回収したプラスミド（２０）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２０）記載のプラスミド（２０）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２３）を取得するために、前記の実施例３０−（２０）記載の形質転換体（２０）より回収したプラスミド（２０）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２０）記載のプラスミド（２０）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（２４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２４）を取得するために、前記の実施例３０−（２１）記載の形質転換体（２１）より回収したプラスミド（２１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２１）記載のプラスミド（２１）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２４）を取得するために、前記の実施例３０−（２１）記載の形質転換体（２１）より回収したプラスミド（２１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２１）記載のプラスミド（２１）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（２５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２５）を取得するために、前記の実施例３０−（２２）記載の形質転換体（２２）より回収したプラスミド（２２）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２２）記載のプラスミド（２２）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２５）を取得するために、前記の実施例３０−（２２）記載の形質転換体（２２）より回収したプラスミド（２２）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２２）記載のプラスミド（２２）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（２６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２６）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７２に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２６）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２６）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７２に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２６）を得た。
［実施例３０−（２７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２７）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７７に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２７）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２７）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７７に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２７）を得た。
［実施例３０−（２８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２８）を取得するために、前記の実施例３０−（２６）記載の形質転換体（２６）より回収したプラスミド（２６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２６）記載のプラスミド（２６）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２８）を取得するために、前記の実施例３０−（２６）記載の形質転換体（２６）より回収したプラスミド（２６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２６）記載のプラスミド（２６）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（２９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２９）を取得するために、前記の実施例３０−（２７）記載の形質転換体（２７）より回収したプラスミド（２７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２７）記載のプラスミド（２７）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２９）を取得するために、前記の実施例３０−（２７）記載の形質転換体（２７）より回収したプラスミド（２７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２７）記載のプラスミド（２７）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（３０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３０）を取得するために、前記の実施例３０−（１６）記載の形質転換体（１６）より回収したプラスミド（１６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１６）記載のプラスミド（１６）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表１９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３０）を取得するために、前記の実施例３０−（１６）記載の形質転換体（１６）より回収したプラスミド（１６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１６）記載のプラスミド（１６）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（３１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３１）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３１）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３１）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３１）を得た。
［実施例３０−（３２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３２）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８３、及び、８４に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３２）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３２）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８３、及び、８４に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３２）を得た。
［実施例３０−（３３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３３）を取得するために、前記の実施例３０−（３１）記載の形質転換体（３１）より回収したプラスミド（３１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３１）記載のプラスミド（３１）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３３）を取得するために、前記の実施例３０−（３１）記載の形質転換体（３１）より回収したプラスミド（３１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３１）記載のプラスミド（３１）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（３４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３４）を取得するために、前記の実施例３０−（３２）記載の形質転換体（３２）より回収したプラスミド（３２）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３２）記載のプラスミド（３２）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３４）を取得するために、前記の実施例３０−（３２）記載の形質転換体（３２）より回収したプラスミド（３２）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３２）記載のプラスミド（３２）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（３５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３５）を取得するために、前記の実施例３０−（１０）記載の形質転換体（１０）より回収したプラスミド（１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０）記載のプラスミド（１０）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３５）を取得するために、前記の実施例３０−（１０）記載の形質転換体（１０）より回収したプラスミド（１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０）記載のプラスミド（１０）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（３６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３６）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例５８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３６）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３６）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例５８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３６）を得た。
［実施例３０−（３７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３７）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６５に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３７）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３７）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６５に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３７）を得た。
［実施例３０−（３８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３８）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７４に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３８）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３８）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７４に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３８）を得た。
［実施例３０−（３９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３９）を取得するために、前記の実施例３０−（３６）記載の形質転換体（３６）より回収したプラスミド（３６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３６）記載のプラスミド（３６）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３９）を取得するために、前記の実施例３０−（３６）記載の形質転換体（３６）より回収したプラスミド（３６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３６）記載のプラスミド（３６）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（４０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４０）を取得するために、前記の実施例３０−（３７）記載の形質転換体（３７）より回収したプラスミド（３７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３７）記載のプラスミド（３７）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４０）を取得するために、前記の実施例３０−（３７）記載の形質転換体（３７）より回収したプラスミド（３７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３７）記載のプラスミド（３７）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（４１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４１）を取得するために、前記の実施例３０−（３８）記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３８）記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４１）を取得するために、前記の実施例３０−（３８）記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３８）記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（４２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４２）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６２に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４２）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４２）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６２に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４２）を得た。
［実施例３０−（４３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４３）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８７、及び、８８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４３）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４３）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８７、及び、８８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４３）を得た。
［実施例３０−（４４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４４）を取得するために、前記の実施例３０−（４２）記載の形質転換体（４２）より回収したプラスミド（４２）を鋳型とし、配列表の配列番号：８９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４２）記載のプラスミド（４２）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４４）を取得するために、前記の実施例３０−（４２）記載の形質転換体（４２）より回収したプラスミド（４２）を鋳型とし、配列表の配列番号：８９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４２）記載のプラスミド（４２）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（４５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４５）を取得するために、前記の実施例３０−（３１）記載の形質転換体（３１）より回収したプラスミド（３１）を鋳型とし、配列表の配列番号:１２０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３１）記載のプラスミド（３１）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４５）を取得するために、前記の実施例３０−（３１）記載の形質転換体（３１）より回収したプラスミド（３１）を鋳型とし、配列表の配列番号:１２０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３１）記載のプラスミド（３１）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（４６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４６）を取得するために、前記の実施例３０−（４３）記載の形質転換体（４３）より回収したプラスミド（４３）を鋳型とし、配列表の配列番号：８９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４３）記載のプラスミド（４３）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４６）を取得するために、前記の実施例３０−（４３）記載の形質転換体（４３）より回収したプラスミド（４３）を鋳型とし、配列表の配列番号：８９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４３）記載のプラスミド（４３）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（４７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４７）を取得するために、前記の実施例３０−（３６）記載の形質転換体（３６）より回収したプラスミド（３６）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３６）記載のプラスミド（３６）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４７）を取得するために、前記の実施例３０−（３６）記載の形質転換体（３６）より回収したプラスミド（３６）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３６）記載のプラスミド（３６）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（４８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４８）を取得するために、前記の実施例３０−（８）記載の形質転換体（８）より回収したプラスミド（８）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８）記載のプラスミド（８）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４８）を取得するために、前記の実施例３０−（８）記載の形質転換体（８）より回収したプラスミド（８）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８）記載のプラスミド（８）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（４９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４９）を取得するために、前記の実施例３０−（１５）記載の形質転換体（１５）より回収したプラスミド（１５）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１５）記載のプラスミド（１５）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４９）を取得するために、前記の実施例３０−（１５）記載の形質転換体（１５）より回収したプラスミド（１５）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１５）記載のプラスミド（１５）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（５０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５０）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６３に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５０）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５０）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６３に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５０）を得た。
［実施例３０−（５１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体をコードする形質転換体（５１）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９１、及び、９２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５１）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体をコードする形質転換体（５１）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９１、及び、９２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５１）を得た。
［実施例３０−（５２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５２）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９３、及び、９４に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５２）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５２）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９３、及び、９４に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５２）を得た。
［実施例３０−（５３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５３）を取得するために、前記の実施例３０−（５０）記載の形質転換体（５０）より回収したプラスミド（５０）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、及び、７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５０）記載のプラスミド（５０）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５３）を取得するために、前記の実施例３０−（５０）記載の形質転換体（５０）より回収したプラスミド（５０）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、及び、７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５０）記載のプラスミド（５０）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（５４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５４）を取得するために、前記の実施例３０−（５１）記載の形質転換体（５１）より回収したプラスミド（５１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、及び、７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５１）記載のプラスミド（５１）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５４）を取得するために、前記の実施例３０−（５１）記載の形質転換体（５１）より回収したプラスミド（５１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、及び、７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５１）記載のプラスミド（５１）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（５５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５５）を取得するために、前記の実施例３０−（５２）記載の形質転換体（５２）より回収したプラスミド（５２）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、及び、７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５２）記載のプラスミド（５２）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５５）を取得するために、前記の実施例３０−（５２）記載の形質転換体（５２）より回収したプラスミド（５２）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、及び、７１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５２）記載のプラスミド（５２）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（５６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５６）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５６）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５６）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５６）を得た。
［実施例３０−（５７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５７）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９６、及び、９７に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５７）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表２９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５７）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９６、及び、９７に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５７）を得た。
［実施例３０−（５８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５８）を取得するために、前記の実施例３０−（５６）記載の形質転換体（５６）より回収したプラスミド（５６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６、及び、９５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５６）記載のプラスミド（５６）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５８）を取得するために、前記の実施例３０−（５６）記載の形質転換体（５６）より回収したプラスミド（５６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６、及び、９５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５６）記載のプラスミド（５６）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（５９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５９）を取得するために、前記の実施例３０−（２７）記載の形質転換体（２７）より回収したプラスミド（２７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６、及び、９５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２７）記載のプラスミド（２７）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５９）を取得するために、前記の実施例３０−（２７）記載の形質転換体（２７）より回収したプラスミド（２７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６、及び、９５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２７）記載のプラスミド（２７）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇにする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（６０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６０）を取得するために、前記の実施例３０−（５７）記載の形質転換体（５７）より回収したプラスミド（５７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６、及び、９５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５７）記載のプラスミド（５７）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６０）を取得するために、前記の実施例３０−（５７）記載の形質転換体（５７）より回収したプラスミド（５７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８６、及び、９５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５７）記載のプラスミド（５７）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（６１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６１）を取得するために、前記の実施例３０−（５０）記載の形質転換体（５０）より回収したプラスミド（５０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５０）記載のプラスミド（５０）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６１）を取得するために、前記の実施例３０−（５０）記載の形質転換体（５０）より回収したプラスミド（５０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５０）記載のプラスミド（５０）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（６２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６２）を取得するために、前記の実施例３０−（２６）記載の形質転換体（２６）より回収したプラスミド（２６）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２６）記載のプラスミド（２６）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６２）を取得するために、前記の実施例３０−（２６）記載の形質転換体（２６）より回収したプラスミド（２６）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２６）記載のプラスミド（２６）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（６３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６３）を取得するために、前記の実施例３０−（２１）記載の形質転換体（２１）より回収したプラスミド（２１）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２１）記載のプラスミド（２１）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６３）を取得するために、前記の実施例３０−（２１）記載の形質転換体（２１）より回収したプラスミド（２１）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２１）記載のプラスミド（２１）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（６４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６４）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６７に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６４）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６４）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６７に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６４）を得た。
［実施例３０−（６５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６５）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７６に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６５）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６５）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例７６に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６５）を得た。
［実施例３０−（６６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６６）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９９、及び、１００に記載のプライマーを用い、実施例３０−（２）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６６）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６６）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９９、及び、１００に記載のプライマーを用い、実施例３０−（２）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６６）を得た。
［実施例３０−（６７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６７）を取得するために、前記の実施例３０−（６４）記載の形質転換体（６４）より回収したプラスミド（６４）を鋳型とし、配列表の配列番号：９８、及び、１２０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６４）記載のプラスミド（６４）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６７）を取得するために、前記の実施例３０−（６４）記載の形質転換体（６４）より回収したプラスミド（６４）を鋳型とし、配列表の配列番号：９８、及び、１２０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６４）記載のプラスミド（６４）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（６８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６８）を取得するために、前記の実施例３０−（６５）記載の形質転換体（６５）より回収したプラスミド（６５）を鋳型とし、配列表の配列番号：８９、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６５）記載のプラスミド（６５）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６８）を取得するために、前記の実施例３０−（６５）記載の形質転換体（６５）より回収したプラスミド（６５）を鋳型とし、配列表の配列番号：８９、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６５）記載のプラスミド（６５）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（６９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６９）を取得するために、前記の実施例３０−（６６）記載の形質転換体（６６）より回収したプラスミド（６６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８９、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６６）記載のプラスミド（６６）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６９）を取得するために、前記の実施例３０−（６６）記載の形質転換体（６６）より回収したプラスミド（６６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８９、及び、９８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６６）記載のプラスミド（６６）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（７０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７０）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７０）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７０）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７０）を得た。
［実施例３０−（７１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７１）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例８０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７１）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７１）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例８０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７１）を得た。
［実施例３０−（７２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７２）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０１、及び、１０２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７２）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７２）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０１、及び、１０２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７２）を得た。
［実施例３０−（７３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７３）を取得するために、前記の実施例３０−（７０）記載の形質転換体（７０）より回収したプラスミド（７０）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、及び、９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７０）記載のプラスミド（７０）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７３）を取得するために、前記の実施例３０−（７０）記載の形質転換体（７０）より回収したプラスミド（７０）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、及び、９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７０）記載のプラスミド（７０）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（７４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７４）を取得するために、前記の実施例３０−（７１）記載の形質転換体（７１）より回収したプラスミド（７１）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、及び、９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７１）記載のプラスミド（７１）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７４）を取得するために、前記の実施例３０−（７１）記載の形質転換体（７１）より回収したプラスミド（７１）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、及び、９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７１）記載のプラスミド（７１）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（７５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７５）を取得するために、前記の実施例３０−（７２）記載の形質転換体（７２）より回収したプラスミド（７２）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、及び、９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７２）記載のプラスミド（７２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７５）を取得するために、前記の実施例３０−（７２）記載の形質転換体（７２）より回収したプラスミド（７２）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、及び、９０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７２）記載のプラスミド（７２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（７６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７６）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０３、及び、１０４に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７６）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７６）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０３、及び、１０４に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７６）を得た。
［実施例３０−（７７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７７）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０５、及び、１０６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７７）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７７）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０５、及び、１０６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７７）を得た。
［実施例３０−（７８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７８）を取得するために、前記の実施例３０−（１４）記載の形質転換体（１４）より回収したプラスミド（１４）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１、及び、８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１４）記載のプラスミド（１４）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７８）を取得するために、前記の実施例３０−（１４）記載の形質転換体（１４）より回収したプラスミド（１４）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１、及び、８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１４）記載のプラスミド（１４）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（７９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７９）を取得するために、前記の実施例３０−（７６）記載の形質転換体（７６）より回収したプラスミド（７６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１、及び、８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７６）記載のプラスミド（７６）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７９）を取得するために、前記の実施例３０−（７６）記載の形質転換体（７６）より回収したプラスミド（７６）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１、及び、８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７６）記載のプラスミド（７６）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（８０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８０）を取得するために、前記の実施例３０−（７７）記載の形質転換体（７７）より回収したプラスミド（７７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１、及び、８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７７）記載のプラスミド（７７）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８０）を取得するために、前記の実施例３０−（７７）記載の形質転換体（７７）より回収したプラスミド（７７）を鋳型とし、配列表の配列番号：８１、及び、８５に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７７）記載のプラスミド（７７）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（８１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８１）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６４に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８１）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８１）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６４に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８１）を得た。
［実施例３０−（８２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８２）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６６に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８２）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８２）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６６に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８２）を得た。
［実施例３０−（８３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８３）を取得するために、前記の実施例３０−（８１）記載の形質転換体（８１）より回収したプラスミド（８１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８１）記載のプラスミド（８１）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８３）を取得するために、前記の実施例３０−（８１）記載の形質転換体（８１）より回収したプラスミド（８１）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８１）記載のプラスミド（８１）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（８４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８４）を取得するために、前記の実施例３０−（８２）記載の形質転換体（８２）より回収したプラスミド（８２）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８２）記載のプラスミド（８２）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８４）を取得するために、前記の実施例３０−（８２）記載の形質転換体（８２）より回収したプラスミド（８２）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８２）記載のプラスミド（８２）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（８５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８５）を取得するために、前記の実施例３０−（３８）記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３８）記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表３９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８５）を取得するために、前記の実施例３０−（３８）記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３８）記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（８６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８６）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６１に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８６）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８６）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６１に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８６）を得た。
［実施例３０−（８７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８７）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０７、及び、１０８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８７）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８７）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０７、及び、１０８に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８７）を得た。
［実施例３０−（８８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８８）を取得するために、前記の実施例３０−（８６）記載の形質転換体（８６）より回収したプラスミド（８６）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０９、及び、１１０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８６）記載のプラスミド（８６）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８８）を取得するために、前記の実施例３０−（８６）記載の形質転換体（８６）より回収したプラスミド（８６）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０９、及び、１１０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８６）記載のプラスミド（８６）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（８９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８９）を取得するために、前記の実施例３０−（６４）記載の形質転換体（６４）より回収したプラスミド（６４）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０９、及び、１１０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６４）記載のプラスミド（６４）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８９）を取得するために、前記の実施例３０−（６４）記載の形質転換体（６４）より回収したプラスミド（６４）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０９、及び、１１０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６４）記載のプラスミド（６４）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（９０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９０）を取得するために、前記の実施例３０−（８７）記載の形質転換体（８７）より回収したプラスミド（８７）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０９、及び、１１０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８７）記載のプラスミド（８７）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９０）を取得するために、前記の実施例３０−（８７）記載の形質転換体（８７）より回収したプラスミド（８７）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０９、及び、１１０に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８７）記載のプラスミド（８７）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（９１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９１）を取得するために、前記の実施例３０−（８６）記載の形質転換体（８６）より回収したプラスミド（８６）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１１、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８６）記載のプラスミド（８６）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９１）を取得するために、前記の実施例３０−（８６）記載の形質転換体（８６）より回収したプラスミド（８６）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１１、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８６）記載のプラスミド（８６）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（９２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９２）を取得するために、前記の実施例３０−（６５）記載の形質転換体（６５）より回収したプラスミド（６５）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１１、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６５）記載のプラスミド（６５）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９２）を取得するために、前記の実施例３０−（６５）記載の形質転換体（６５）より回収したプラスミド（６５）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１１、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（６５）記載のプラスミド（６５）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（９３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９３）を取得するために、前記の実施例３０−（２）記載の形質転換体（２）より回収したプラスミド（２）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１１、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２）記載のプラスミド（２）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９３）を取得するために、前記の実施例３０−（２）記載の形質転換体（２）より回収したプラスミド（２）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１１、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２）記載のプラスミド（２）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（９４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９４）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１３、及び、１１４に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９４）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９４）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１３、及び、１１４に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９４）を得た。
［実施例３０−（９５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９５）を取得するために、前記の実施例３０−（８１）記載の形質転換体（８１）より回収したプラスミド（８１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、９８、及び、１０９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８１）記載のプラスミド（８１）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９５）を取得するために、前記の実施例３０−（８１）記載の形質転換体（８１）より回収したプラスミド（８１）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、９８、及び、１０９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８１）記載のプラスミド（８１）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（９６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９６）を取得するために、前記の実施例３０−（５６）記載の形質転換体（５６）より回収したプラスミド（５６）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、９８、及び、１０９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５６）記載のプラスミド（５６）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９６）を取得するために、前記の実施例３０−（５６）記載の形質転換体（５６）より回収したプラスミド（５６）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、９８、及び、１０９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（５６）記載のプラスミド（５６）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（９７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９７）を取得するために、前記の実施例３０−（９４）記載の形質転換体（９４）より回収したプラスミド（９４）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、９８、及び、１０９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９４）記載のプラスミド（９４）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９７）を取得するために、前記の実施例３０−（９４）記載の形質転換体（９４）より回収したプラスミド（９４）を鋳型とし、配列表の配列番号：９５、９８、及び、１０９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９４）記載のプラスミド（９４）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（９８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９８）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例５９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９８）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４５で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９８）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例５９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９８）を得た。
［実施例３０−（９９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９９）を取得するために、前記の実施例３０−（９８）記載の形質転換体（９８）より回収したプラスミド（９８）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０、９５、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９８）記載のプラスミド（９８）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９９）を取得するために、前記の実施例３０−（９８）記載の形質転換体（９８）より回収したプラスミド（９８）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０、９５、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９８）記載のプラスミド（９８）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１００）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１００）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１００）を取得するために、前記の実施例３０−（８２）記載の形質転換体（８２）より回収したプラスミド（８２）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０、９５、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１００）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１００）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８２）記載のプラスミド（８２）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１００）を取得するために、前記の実施例３０−（８２）記載の形質転換体（８２）より回収したプラスミド（８２）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０、９５、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１００）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１００）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（８２）記載のプラスミド（８２）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１０１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０１）を取得するために、前記の実施例３０−（４）記載の形質転換体（４）より回収したプラスミド（４）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０、９５、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４）記載のプラスミド（４）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４６で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０１）を取得するために、前記の実施例３０−（４）記載の形質転換体（４）より回収したプラスミド（４）を鋳型とし、配列表の配列番号：９０、９５、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４）記載のプラスミド（４）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１０２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０２）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０２）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４７で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０２）を取得するために、特開２００４−１９４５８８号公報の実施例６０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例３０−（１）記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０２）を得た。
［実施例３０−（１０３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０３）を取得するために、前記の実施例３０−（９８）記載の形質転換体（９８）より回収したプラスミド（９８）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、８１、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９８）記載のプラスミド（９８）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０３）を取得するために、前記の実施例３０−（９８）記載の形質転換体（９８）より回収したプラスミド（９８）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、８１、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９８）記載のプラスミド（９８）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１０４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０４）を取得するために、前記の実施例３０−（３７）記載の形質転換体（３７）より回収したプラスミド（３７）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、８１、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３７）記載のプラスミド（３７）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０４）を取得するために、前記の実施例３０−（３７）記載の形質転換体（３７）より回収したプラスミド（３７）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、８１、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３７）記載のプラスミド（３７）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１０５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０５）を取得するために、前記の実施例３０−（１０２）記載の形質転換体（１０２）より回収したプラスミド（１０２）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、８１、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０２）記載のプラスミド（１０２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４８で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０５）を取得するために、前記の実施例３０−（１０２）記載の形質転換体（１０２）より回収したプラスミド（１０２）を鋳型とし、配列表の配列番号：６８、８１、及び、１１１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０２）記載のプラスミド（１０２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１０６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０６）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１５、及び、１１６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０６）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表４９で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０６）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１５、及び、１１６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０６）を得た。
［実施例３０−（１０７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０７）を取得するために、前記の実施例３０−（４２）記載の形質転換体（４２）より回収したプラスミド（４２）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、８２、及び、８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４２）記載のプラスミド（４２）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０７）を取得するために、前記の実施例３０−（４２）記載の形質転換体（４２）より回収したプラスミド（４２）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、８２、及び、８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（４２）記載のプラスミド（４２）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１０８）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０８）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０８）を取得するために、前記の実施例３０−（２０）記載の形質転換体（２０）より回収したプラスミド（２０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、８２、及び、８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２０）記載のプラスミド（２０）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０８）を取得するために、前記の実施例３０−（２０）記載の形質転換体（２０）より回収したプラスミド（２０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、８２、及び、８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（２０）記載のプラスミド（２０）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１０９）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０９）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０９）を取得するために、前記の実施例３０−（１０６）記載の形質転換体（１０６）より回収したプラスミド（１０６）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、８２、及び、８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０６）記載のプラスミド（１０６）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５０で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０９）を取得するために、前記の実施例３０−（１０６）記載の形質転換体（１０６）より回収したプラスミド（１０６）を鋳型とし、配列表の配列番号：７１、８２、及び、８６に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０６）記載のプラスミド（１０６）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１１０）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１０）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１０）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０５、及び、１１７に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１０）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５１で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１０）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１０５、及び、１１７に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１０）を得た。
［実施例３０−（１１１）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１１）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１１）を取得するために、前記の実施例３０−（１０２）記載の形質転換体（１０２）より回収したプラスミド（１０２）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６、８９、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０２）記載のプラスミド（１０２）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１１）を取得するために、前記の実施例３０−（１０２）記載の形質転換体（１０２）より回収したプラスミド（１０２）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６、８９、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１０２）記載のプラスミド（１０２）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１１２）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１２）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１２）を取得するために、前記の実施例３０−（７０）記載の形質転換体（７０）より回収したプラスミド（７０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６、８９、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７０）記載のプラスミド（７０）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１２）を取得するために、前記の実施例３０−（７０）記載の形質転換体（７０）より回収したプラスミド（７０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６、８９、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（７０）記載のプラスミド（７０）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１１３）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１３）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１３）を取得するために、前記の実施例３０−（１１０）記載の形質転換体（１１０）より回収したプラスミド（１１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６、８９、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１１０）記載のプラスミド（１１０）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５２で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１３）を取得するために、前記の実施例３０−（１１０）記載の形質転換体（１１０）より回収したプラスミド（１１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：７６、８９、及び、１１２に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１１０）記載のプラスミド（１１０）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１１４）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１４）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１４）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１８、及び、１１９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１４）を得た。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５３で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１４）を取得するために、上記実施例３０−（３）記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例３０−（１）記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１１８、及び、１１９に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１４）を得た。
［実施例３０−（１１５）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１５）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１５）を取得するために、前記の実施例３０−（３８）記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１２１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３８）記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１５）を取得するために、前記の実施例３０−（３８）記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１２１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（３８）記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１１６）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１６）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１６）を取得するために、前記の実施例３０−（９）記載の形質転換体（９）より回収したプラスミド（９）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１２１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９）記載のプラスミド（９）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１６）を取得するために、前記の実施例３０−（９）記載の形質転換体（９）より回収したプラスミド（９）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１２１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（９）記載のプラスミド（９）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［実施例３０−（１１７）］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１７）
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１７）を取得するために、前記の実施例３０−（１１４）記載の形質転換体（１１４）より回収したプラスミド（１１４）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１２１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１１４）記載のプラスミド（１１４）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼを表５４で示すように変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１７）を取得するために、前記の実施例３０−（１１４）記載の形質転換体（１１４）より回収したプラスミド（１１４）を鋳型とし、配列表の配列番号：８５、及び、１２１に記載のプライマーを用い、実施例３０−（３）に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定、実施例３０−（１１４）記載のプラスミド（１１４）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。
［評価］
形質転換体１〜１１７を実施例１で用いたＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌と同様に培養し、菌体懸濁液を調製した。Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼに変えて調製した形質転換体１〜１１７を用いた以外は実施例２９と同様にして３−メルカプトプロピオニトリルを反応させたところ、何れも９９％以上の３−メルカプトプロピオニトリルが３−メルカプトプロピオンアミドに変換された。
形質転換体１〜１１７を実施例１で用いたＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌と同様に培養し、菌体懸濁液を調製した。Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼに変えて調製した形質転換体１〜１１７を用いた以外は実施例２９と同様にして３−メルカプトプロピオニトリルを反応させたところ、何れも９９％以上の３−メルカプトプロピオニトリルが３−メルカプトプロピオンアミドに変換された。
（実施例３１）
実施例３０の反応で得られた３−メルカプトプロピオンアミドの反応液に、それぞれ、表５５に示すアミダーゼ生産菌１ｇを加えて２０時間反応した。結果を表５５に示す。
実施例３０の反応で得られた３−メルカプトプロピオンアミドの反応液に、それぞれ、表５５に示すアミダーゼ生産菌１ｇを加えて２０時間反応した。結果を表５５に示す。
（実施例３２）硫化水素含有３−メルカプトプロピオニトリルによる反応（Ｐｔｈ-アミダーゼ）
５００ｇの１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）硫化水素ガスを吹き込んだ。吹き込み後の重量が５００．２２ｇであったので、この緩衝液の硫化水素濃度を４４０ｐｐｍとした。実施例１で製造した精製３−メルカプトプロピオニトリル０．５ｍＬに硫化水素濃度が１５ｐｐｍから１８０ｐｐｍとなるように緩衝液を加え全量を４．５ｍＬとした。実施例１で用いたＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液０．２５ｍＬとＰｔｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液０．２５ｍＬを加え、２５℃で６時間保温した。結果を表５６に示す。
５００ｇの１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）硫化水素ガスを吹き込んだ。吹き込み後の重量が５００．２２ｇであったので、この緩衝液の硫化水素濃度を４４０ｐｐｍとした。実施例１で製造した精製３−メルカプトプロピオニトリル０．５ｍＬに硫化水素濃度が１５ｐｐｍから１８０ｐｐｍとなるように緩衝液を加え全量を４．５ｍＬとした。実施例１で用いたＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液０．２５ｍＬとＰｔｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液０．２５ｍＬを加え、２５℃で６時間保温した。結果を表５６に示す。
（実施例３３）硫化水素を脱気処理した３−メルカプトプロピオニトリルでの反応（Ｐｔｈ-アミダーゼ）
４６．４２ｗ／ｖ％水硫化ナトリウム溶液（１４４．９２ｇ、１．２ｍｏｌ）に、水（３６．１２ｇ）を加えて４０℃に保ちながらこれにアクリロニトリル（５３．０６ｇ、１．０ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後、４０℃で１０時間熟成した。続いて反応混合物の温度を２５〜３０℃に保ちながら、４７ｗ／ｖ％硫酸（１２５．３ｇ、０．３ｍｏｌ）を２時間かけて滴下して、ｐＨ１４からｐＨ６．５〜７に調製した後、２５〜３０℃で１時間熟成した。該反応混合液中の硫化水素濃度は、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによる方法で分析した。熟成後の反応混合液中の硫化水素濃度は８０００ｐｐｍであった。該反応混合液中の硫化水素濃度が１５ｐｐｍとなるまで減圧下で反応混合物内の硫化水素を除去した（２５〜３０℃、６．７ｋＰａ（５０ｔｏｒｒ）、３時間）。硫酸滴下時、熟成時、減圧脱気時に反応系外へ放出された硫化水素ガスは、苛性トラップにて捕集した。次に、２層分離した反応混合物からデカンテーションにより上層部の粗体３−メルカプトプロピオニトリル（７５．６ｇ）と下層部分水層（２７０．０ｇ）を取得した。この取得した粗体３−メルカプトプロピオニトリルと水層を重量比率（７５．６：２７０）で使用した。上層部の粗体３−メルカプトプロピオニトリル１ｇ、下層部分水層３．６ｇを測り取り、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整し、全重量を５．５ｇとした。Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇとＰｔｈ-アミダーゼ生産菌の懸濁液1ｇを加え、２０℃で２４時間攪拌した。反応液中の３−メルカプトプロピオニトリルの９９%以上が３−メルカプトプロピオン酸に変換された。
４６．４２ｗ／ｖ％水硫化ナトリウム溶液（１４４．９２ｇ、１．２ｍｏｌ）に、水（３６．１２ｇ）を加えて４０℃に保ちながらこれにアクリロニトリル（５３．０６ｇ、１．０ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した後、４０℃で１０時間熟成した。続いて反応混合物の温度を２５〜３０℃に保ちながら、４７ｗ／ｖ％硫酸（１２５．３ｇ、０．３ｍｏｌ）を２時間かけて滴下して、ｐＨ１４からｐＨ６．５〜７に調製した後、２５〜３０℃で１時間熟成した。該反応混合液中の硫化水素濃度は、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによる方法で分析した。熟成後の反応混合液中の硫化水素濃度は８０００ｐｐｍであった。該反応混合液中の硫化水素濃度が１５ｐｐｍとなるまで減圧下で反応混合物内の硫化水素を除去した（２５〜３０℃、６．７ｋＰａ（５０ｔｏｒｒ）、３時間）。硫酸滴下時、熟成時、減圧脱気時に反応系外へ放出された硫化水素ガスは、苛性トラップにて捕集した。次に、２層分離した反応混合物からデカンテーションにより上層部の粗体３−メルカプトプロピオニトリル（７５．６ｇ）と下層部分水層（２７０．０ｇ）を取得した。この取得した粗体３−メルカプトプロピオニトリルと水層を重量比率（７５．６：２７０）で使用した。上層部の粗体３−メルカプトプロピオニトリル１ｇ、下層部分水層３．６ｇを測り取り、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整し、全重量を５．５ｇとした。Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇとＰｔｈ-アミダーゼ生産菌の懸濁液1ｇを加え、２０℃で２４時間攪拌した。反応液中の３−メルカプトプロピオニトリルの９９%以上が３−メルカプトプロピオン酸に変換された。
（実施例３４）
実施例２９で得た３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド及び３−メルカプトプロピオン酸の混合物に蒸留水を加え、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整した。反応液５ｇにＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇとＰｔｈ-アミダーゼ生産菌の懸濁液1ｇを加え、３−メルカプトプロピオニトリルの濃度が１３重量％となるように調整し、２０℃で２４時間攪拌した。３−メルカプトプロピオニトリルの９９％以上が３−メルカプトプロピオン酸に変換された。
実施例２９で得た３−メルカプトプロピオニトリル、３−メルカプトプロピオンアミド及び３−メルカプトプロピオン酸の混合物に蒸留水を加え、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０に調整した。反応液５ｇにＰｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液１ｇとＰｔｈ-アミダーゼ生産菌の懸濁液1ｇを加え、３−メルカプトプロピオニトリルの濃度が１３重量％となるように調整し、２０℃で２４時間攪拌した。３−メルカプトプロピオニトリルの９９％以上が３−メルカプトプロピオン酸に変換された。
（実施例３５）
Ｐｔｈ−アミダーゼ生産菌をＰｐｕ−アミダーゼ生産菌に変えた以外は、実施例３４と同様に行った。９９％以上の３−メルカプトプロピオニトリルが３−メルカプトプロピオン酸に変換された。
Ｐｔｈ−アミダーゼ生産菌をＰｐｕ−アミダーゼ生産菌に変えた以外は、実施例３４と同様に行った。９９％以上の３−メルカプトプロピオニトリルが３−メルカプトプロピオン酸に変換された。
（実施例３６）３，３'−ジチオジプロピオノニトリルの酵素による３，３'−ジチオジプロピオンアミドの合成
３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（０．４３ｇ，０．００２５ｍｏｌ）に水（３．７２ｇ）加えて２０℃に温度調整した。攪拌しながら０．０２ｗ／ｖ％ＮａＯＨ水溶液（０．０２ｇ）を用いてｐＨ７．０に調整し、続いて水（０．７３ｇ）を装入した。そのｐＨ７．０の反応液を２０℃に保温、攪拌しているなかに、Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液０．１ｇを加え２４時間攪拌・反応した。該反応液をＨＰＬＣ分析したところ３，３'−ジチオジプロピオノニトリルのピークが消失し、３，３'−ジチオジプロピオンアミドのピークの生成が確認され、ＨＰＬＣによる３，３'−ジチオジプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオノニトリルが３，３'−ジチオジプロピオンアミドに変換された。
３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（０．４３ｇ，０．００２５ｍｏｌ）に水（３．７２ｇ）加えて２０℃に温度調整した。攪拌しながら０．０２ｗ／ｖ％ＮａＯＨ水溶液（０．０２ｇ）を用いてｐＨ７．０に調整し、続いて水（０．７３ｇ）を装入した。そのｐＨ７．０の反応液を２０℃に保温、攪拌しているなかに、Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液０．１ｇを加え２４時間攪拌・反応した。該反応液をＨＰＬＣ分析したところ３，３'−ジチオジプロピオノニトリルのピークが消失し、３，３'−ジチオジプロピオンアミドのピークの生成が確認され、ＨＰＬＣによる３，３'−ジチオジプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオノニトリルが３，３'−ジチオジプロピオンアミドに変換された。
（実施例３７）３，３'−ジチオジプロピオンアミドの酵素による３，３'−ジチオジプロピオン酸の合成
実施例３６で得られた３，３'−ジチオジプロピオンアミドの反応液を２０℃で攪拌しながら、Ｐｔｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液０．６ｇを添加し、２０℃、２４時間反応した。該反応液をＨＰＬＣ分析したところ、３，３'−ジチオジプロピオンアミドのピークが消失し、３，３'−ジチオジプロピオン酸のピークが確認され、ＨＰＬＣによる３，３'−ジチオジプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオンアミドが３，３'−ジチオジプロピオン酸に変換された。
実施例３６で得られた３，３'−ジチオジプロピオンアミドの反応液を２０℃で攪拌しながら、Ｐｔｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液０．６ｇを添加し、２０℃、２４時間反応した。該反応液をＨＰＬＣ分析したところ、３，３'−ジチオジプロピオンアミドのピークが消失し、３，３'−ジチオジプロピオン酸のピークが確認され、ＨＰＬＣによる３，３'−ジチオジプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオンアミドが３，３'−ジチオジプロピオン酸に変換された。
（実施例３８）３，３'−ジチオジプロピオノニトリルの酵素による３，３'−ジチオジプロピオン酸の合成
３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（０．４３ｇ，０．００２５ｍｏｌ）に水（３．７２ｇ）加えて３０℃に温度調整した。該スラリー液を３０℃で攪拌しながら、０．０２ｗ／ｖ％ＮａＯＨ水溶液（０．０２ｇ）を用いてｐＨ７．０に調整し、続いて水（０．７３ｇ）を装入した。そのｐＨ７．０の該スラリー液を３０℃に保温、攪拌しているなかに、Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液０．１４ｇを添加し、続いてＰｔｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液０．６ｇを添加し、３０℃、２４時間反応した。該反応液をＨＰＬＣ分析したところ、３，３'−ジチオジプロピオノニトリルのピークが消失し、３，３'−ジチオジプロピオン酸のピークが確認され、ＨＰＬＣによる３，３'−ジチオジプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオノニトリルが３，３'−ジチオジプロピオン酸に変換された。
３，３'−ジチオジプロピオノニトリル（０．４３ｇ，０．００２５ｍｏｌ）に水（３．７２ｇ）加えて３０℃に温度調整した。該スラリー液を３０℃で攪拌しながら、０．０２ｗ／ｖ％ＮａＯＨ水溶液（０．０２ｇ）を用いてｐＨ７．０に調整し、続いて水（０．７３ｇ）を装入した。そのｐＨ７．０の該スラリー液を３０℃に保温、攪拌しているなかに、Ｐｔｈ−ニトリルヒドラターゼ生産菌の懸濁液０．１４ｇを添加し、続いてＰｔｈ−アミダーゼ生産菌の懸濁液０．６ｇを添加し、３０℃、２４時間反応した。該反応液をＨＰＬＣ分析したところ、３，３'−ジチオジプロピオノニトリルのピークが消失し、３，３'−ジチオジプロピオン酸のピークが確認され、ＨＰＬＣによる３，３'−ジチオジプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオノニトリルが３，３'−ジチオジプロピオン酸に変換された。
（実施例３９）３，３'−ジチオジプロピオン酸の亜鉛粉末による還元
実施例３８で製造した３，３'−ジチオジプロピオン酸（０．５２６ｇ，０．００２５ｍｏｌ）に、水（２０ｇ）を加え。３２ｗ／ｖ％ＮａＯＨ水溶液を０．６７ｇ加えた。該水溶液に３５℃、攪拌条件下で亜鉛粉末（０．４１ｇ，０．００６３ｍｏｌ）を加え、４７ｗ／ｖ％硫酸水（５．５８ｇ）を４２分間で滴下装入し、その温度で１時間熟成した。該還元反応液をＨＰＬＣ分析したところ、３，３'−ジチオジプロピオン酸のピークが消失し、３−メルカプトプロピオン酸のピークが確認され、ＨＰＬＣによる３−メプカプトプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオン酸が３−メプカプトプロピオン酸に変換された。
実施例３８で製造した３，３'−ジチオジプロピオン酸（０．５２６ｇ，０．００２５ｍｏｌ）に、水（２０ｇ）を加え。３２ｗ／ｖ％ＮａＯＨ水溶液を０．６７ｇ加えた。該水溶液に３５℃、攪拌条件下で亜鉛粉末（０．４１ｇ，０．００６３ｍｏｌ）を加え、４７ｗ／ｖ％硫酸水（５．５８ｇ）を４２分間で滴下装入し、その温度で１時間熟成した。該還元反応液をＨＰＬＣ分析したところ、３，３'−ジチオジプロピオン酸のピークが消失し、３−メルカプトプロピオン酸のピークが確認され、ＨＰＬＣによる３−メプカプトプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオン酸が３−メプカプトプロピオン酸に変換された。
（実施例４０）３，３'−ジチオジプロピオン酸の鉄粉末による還元
実施例３９の亜鉛粉末を鉄粉末（０．３５ｇ，０．００６３ｍｏｌ）に変えて実施例３９とまったく同様に反応・熟成した。該還元反応液をＨＰＬＣ分析したところ、３，３'−ジチオジプロピオン酸のピークが消失し、３−メプカプトプロピオン酸のピークが確認され、ＨＰＬＣによる３−メルカプトプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオン酸が３−メプカプトプロピオン酸に変換された。
実施例３９の亜鉛粉末を鉄粉末（０．３５ｇ，０．００６３ｍｏｌ）に変えて実施例３９とまったく同様に反応・熟成した。該還元反応液をＨＰＬＣ分析したところ、３，３'−ジチオジプロピオン酸のピークが消失し、３−メプカプトプロピオン酸のピークが確認され、ＨＰＬＣによる３−メルカプトプロピオン酸のピーク面積値が１００．０％であり、９９％以上の３，３'−ジチオジプロピオン酸が３−メプカプトプロピオン酸に変換された。
（実施例４１）ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）の合成
実施例３４と同様に反応を繰り返し実施した。該反応液（２０００ｇ）を攪拌機、冷却管、窒素ガスパージ管、温度計およびｐＨ計を取り付けた３リットル４口フラスコ内に装入し攪拌しながら６０℃に過熱した。該反応液に亜鉛粉末（２２．６ｇ）を装入し、４７ｗ／ｖ％硫酸水（５０６ｇ）を用いｐＨ１．０以下に調整した。該反応液を６０℃保温・攪拌下、１時間熟成し室温まで冷却した。該反応液を攪拌しながら室温下で活性炭（ＰＭＳＸ）（８３．１ｇ）を装入し０．５時間のあいだ不要となった菌体成分を吸着させた。該活性炭処理液を濾過・水洗し濾塊に廃活性炭とともに不要となった菌体成分を除去し、濾液に３−メルカプトプロピオン酸を取得した。該濾液を４０℃酢酸−ｎ−ブチル（３５０ｇ）で３回抽出・分液を繰り返し、酢酸ブチル層を合わせた。得られた酢酸ブチル層を濃縮し、続いて蒸留することで高純度（９９．９％以上）の３−メルカプトプロピオン酸が収率９１（％／アクリロニトリル）で得られた。本方法を繰り返し実施し３−メルカプトプロピオン酸を製造した。
攪拌機、還流冷却水分離器、窒素ガスパージ管および温度計を取り付けた１Ｌの４つ口反応フラスコ内に、上記方法で製造し得られた３−メルカプトプロピオン酸（４４２．３ｇ、４．１５ｍｏｌ）、ペンタエリスリトール（１３６．２ｇ，１．００ｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（３．８２ｇ，０．０２ｍｏｌ）、トルエン（１８５．２ｇ）を加えた。加熱還流下で副生する水を連続的に系外に抜きながら１０時間反応を行い（内温１０２〜１２２℃）、その後室温まで冷却した。反応液を、塩基洗浄、続いて水洗浄を行い、加熱減圧下でトルエンおよび微量の水を除去した。その後、濾過してペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（４６３．６ｇ）を得た。得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）色相（黄色度：ＹＩ）は１．０であった。
実施例３４と同様に反応を繰り返し実施した。該反応液（２０００ｇ）を攪拌機、冷却管、窒素ガスパージ管、温度計およびｐＨ計を取り付けた３リットル４口フラスコ内に装入し攪拌しながら６０℃に過熱した。該反応液に亜鉛粉末（２２．６ｇ）を装入し、４７ｗ／ｖ％硫酸水（５０６ｇ）を用いｐＨ１．０以下に調整した。該反応液を６０℃保温・攪拌下、１時間熟成し室温まで冷却した。該反応液を攪拌しながら室温下で活性炭（ＰＭＳＸ）（８３．１ｇ）を装入し０．５時間のあいだ不要となった菌体成分を吸着させた。該活性炭処理液を濾過・水洗し濾塊に廃活性炭とともに不要となった菌体成分を除去し、濾液に３−メルカプトプロピオン酸を取得した。該濾液を４０℃酢酸−ｎ−ブチル（３５０ｇ）で３回抽出・分液を繰り返し、酢酸ブチル層を合わせた。得られた酢酸ブチル層を濃縮し、続いて蒸留することで高純度（９９．９％以上）の３−メルカプトプロピオン酸が収率９１（％／アクリロニトリル）で得られた。本方法を繰り返し実施し３−メルカプトプロピオン酸を製造した。
攪拌機、還流冷却水分離器、窒素ガスパージ管および温度計を取り付けた１Ｌの４つ口反応フラスコ内に、上記方法で製造し得られた３−メルカプトプロピオン酸（４４２．３ｇ、４．１５ｍｏｌ）、ペンタエリスリトール（１３６．２ｇ，１．００ｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物（３．８２ｇ，０．０２ｍｏｌ）、トルエン（１８５．２ｇ）を加えた。加熱還流下で副生する水を連続的に系外に抜きながら１０時間反応を行い（内温１０２〜１２２℃）、その後室温まで冷却した。反応液を、塩基洗浄、続いて水洗浄を行い、加熱減圧下でトルエンおよび微量の水を除去した。その後、濾過してペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（４６３．６ｇ）を得た。得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）色相（黄色度：ＹＩ）は１．０であった。
（実施例４２）プラスチックレンズの製造
２，５−ビス（イソシアナトメチル）−ビシクロ［２．２．１］ヘプタンと２，６−ビス（イソシアナトメチル）−ビシクロ［２．２．１］ヘプタンの混合物３５．４ｇに、ジ−ｎ−ブチルスズジクロリド０．０１４ｇ（重合性組成物総重量に対して２００ｐｐｍ）、内部離型剤（ＳＴＥＰＡＮ社、商品名、ゼレックＵＮ）０．０８４ｇ、紫外線吸収剤（共同薬品株式会社、商品名バイオソーブ５８３）０．０３５ｇを２０℃にて混合溶解し、均一溶液とした。この均一溶液に、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）１６．７ｇ、４−メルカプトメチル−１，８−ジメルカプト−３，６−ジチアオクタン１７．９ｇの混合溶液を添加し、２０℃で混合溶解させた。この混合溶液を４００Ｐａにて１時間脱泡を行った後、１μｍＰＴＦＥ製フィルターでろ過を行い、ガラスモールドとテープからなるモールド型へ注入した。このモールド型を重合オーブンへ投入、２５℃〜１２０℃まで２１時間かけて徐々に昇温して重合した。重合終了後、オーブンからモールド型を取り出し、離型して樹脂を得た。得られた樹脂をさらに１３０℃で４時間アニール処理を行った。得られた樹脂は透明性があり、屈折率（ｎｅ）１．５９７、アッベ数（νｅ）４０．６、耐熱性（Ｔｇ）１１８．１℃、色相（黄色度：ＹＩ）３．８であり、光学用透明樹脂として好適であった。触媒活性については、重合性組成物を２０℃、５時間保持した後の粘度は６１ｍＰａ・ｓであった。
２，５−ビス（イソシアナトメチル）−ビシクロ［２．２．１］ヘプタンと２，６−ビス（イソシアナトメチル）−ビシクロ［２．２．１］ヘプタンの混合物３５．４ｇに、ジ−ｎ−ブチルスズジクロリド０．０１４ｇ（重合性組成物総重量に対して２００ｐｐｍ）、内部離型剤（ＳＴＥＰＡＮ社、商品名、ゼレックＵＮ）０．０８４ｇ、紫外線吸収剤（共同薬品株式会社、商品名バイオソーブ５８３）０．０３５ｇを２０℃にて混合溶解し、均一溶液とした。この均一溶液に、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）１６．７ｇ、４−メルカプトメチル−１，８−ジメルカプト−３，６−ジチアオクタン１７．９ｇの混合溶液を添加し、２０℃で混合溶解させた。この混合溶液を４００Ｐａにて１時間脱泡を行った後、１μｍＰＴＦＥ製フィルターでろ過を行い、ガラスモールドとテープからなるモールド型へ注入した。このモールド型を重合オーブンへ投入、２５℃〜１２０℃まで２１時間かけて徐々に昇温して重合した。重合終了後、オーブンからモールド型を取り出し、離型して樹脂を得た。得られた樹脂をさらに１３０℃で４時間アニール処理を行った。得られた樹脂は透明性があり、屈折率（ｎｅ）１．５９７、アッベ数（νｅ）４０．６、耐熱性（Ｔｇ）１１８．１℃、色相（黄色度：ＹＩ）３．８であり、光学用透明樹脂として好適であった。触媒活性については、重合性組成物を２０℃、５時間保持した後の粘度は６１ｍＰａ・ｓであった。
Claims (6)
- ニトリルヒドラターゼを用いて、一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩から一般式（１）で示されるアミドまたはその塩を製造し、アミダーゼを用いて、前記アミドまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法であって、
反応液中の一般式（１）で示される前記アミドまたはその塩、および、一般式（３）で示される前記ニトリルまたはその塩の少なくとも一方の濃度が、１１重量％以上１７重量％以下であり、
前記ニトリルヒドラターゼが、シュードノカルディア属の細菌に由来する酵素であり、
前記アミダーゼが、アミダーゼシグニチャーファミリーに属する酵素である、一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する方法。
- 前記ニトリルヒドラターゼ及び前記アミダーゼの存在下、一般式（３）で示される前記ニトリルまたはその塩から一般式（２）で示されるカルボン酸またはその塩を製造する請求項１に記載の方法。
- 一般式（３）で示されるニトリルまたはその塩がアクリロニトリルと硫黄原子を含む化合物とを反応させて得られるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
- 前記硫黄原子を含む化合物が水硫化ナトリウムである、請求項３に記載の方法。
- 請求項１乃至４いずれか１項に記載の方法を用いて一般式（２）記載のカルボン酸を製造する工程と、
得られた前記カルボン酸とペンタエリスリトールとをエステル化反応させる工程と、
を含むペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）の製造方法。 - 請求項５に記載の方法を用いてペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を製造する工程と、
得られたペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）を単重合又は共重合した後、硬化する工程と、
を含む光学材料の製造方法。
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