CN116004593B - 半理性设计酶定向进化方法及其在腈水解酶分子改造中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半理性设计酶定向进化方法及其在腈水解酶分子改造中的应用，本发明应用ALF‑扫描对腈水解酶的活性口袋进行了几何重塑，以改变底物偏好性并提高催化效率。通过利用该方法结合定点饱和突变，成功获得了4个具有强芳香腈底物偏好性和高催化活性的突变体，分别为W170G，V198L，M197F和F202M。为了探究这4个突变的协同关系，又围绕这4个突变体构建了6个双组合突变体以及4个三组合突变体。通过组合突变，获得了协同增强突变体V198L/W170G，该突变体对芳香腈具有显著的底物偏好性，并且具有更好的催化效率。与野生型相比，其对4种芳香腈底物的比酶活分别提高了11.10、12.10、26.25和2.55倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种半理性设计酶定向进化方法及其在腈水解酶分子改造中的应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
腈水解酶作为碳-氮水解酶超家族的一员，能够水解腈类化合物生成相应的羧酸和氨。在很多情况下，腈水解酶能够催化两种类型以上的腈类底物，从而表现出底物混杂性。根据文献报道，Syechocystis sp.PCC6803来源的腈水解酶能够催化脂肪腈以及芳香腈两种类型底物(Zhang,L.et al.J.Struct.Biol.2014,188(2),93-101.)。此外，Pseudomonas putida CGMCC3830来源的腈水解酶能够催化脂肪腈，芳香腈，芳香乙腈三种类型的底物。事实上，很多酶都存在着这种能够催化多种类型的非同源底物表现出底物混杂性(Zhu,X.Y.et al.J.Mol.Catal.B-enzym.2013,97,175-183.)。这种底物混杂性意味着多种生物催化性能。事实上，我们可以定制这种底物混杂酶使其对某种类型的底物具有更高的催化效率，从而提升其在生物催化领域的应用潜力。
腈水解酶能够催化腈类底物生产出相应的羧酸。其中，芳香腈类能够被腈水解酶催化从而生成高附加值的芳香有机酸类。尽管有很多研究已经报道出腈水解酶在芳香有机酸生物转化应用中的研究案例，但腈水解酶对于芳香腈类的活性依然有待提高。因此，对混杂性腈水解酶进行芳香腈类底物偏好性改造以提升其对芳香腈底物的催化效率是一种有效策略。
酶活性口袋在酶催化底物过程起到关键作用，包括酶与底物的诱导契合，底物、产物的进入与释放等。介于活性口袋发挥的重要作用，靶向与活性口袋旨在提升酶底物偏好性、催化效率、底物特异性等蛋白质工程相关研究是一种很好的选择。很多研究应用活性口袋重塑策略提升酶底物选择性、改变酶底物谱。例如，Ishikawa等人通过甘氨酸突变成功增大了非核糖体肽合酶中芳基酸腺苷酸化结构域的底物结合口袋，拓宽了其底物范围(Ishikawa,F.et al.ANGEW.CHEM.INT.EDIT.2019,58(21),6906-6910.)。周佳海团队解析了环氧化物水解酶的底物通道。他们将145位残基的蛋氨酸残基128为的Phe突变为Ala，空间位阻变得更小，使环氧化物水解酶能够催化更大的底物分子(Kong,X.D.etal.PNAS.2014,111(44),15717-15722.)。此外，有研究还报道了重塑胺脱氢酶的活性口袋，实现了大体积脂肪胺的不对称合成。在上述所有案例研究中，研究人员通过较小的侧链氨基酸突变(Ala或Gly)扩大了活性口袋尺寸，以改变酶的底物选择性以及扩大底物谱(Chen,F.F.et al.ACS CATAL.2018,8(3),2622-2628.)。为了在活性口袋中定位关键残基，他们利用小侧链氨基酸Ala对活性口袋残基进行突变扫描(丙氨酸扫描策略)。然而，由于Ala是小侧链氨基酸的代表。因此，丙氨酸扫描仅仅只能考察小侧链残基突变后对活性口袋的影响，对于系统性考察活性口袋的几何状态，是远远不够的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明中发明了一种新型的活性口袋重塑策略，ALF-扫描，其能够对酶的活性口袋的几何状态进行系统的、较为全面的探究。并且，ALF-扫描靶向活性口袋，通过三种代表性氨基酸(丙氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸)对活性口袋残基进行扫描突变，避免了传统定向进化中，建库、初筛、复筛的繁琐实验。此外，本发明中还应用ALF-扫描至腈水解酶底物偏好性改造中，获得高芳香腈底物偏好性、高芳香腈催化效率的腈水解酶突变体。
本发明的第一个目的是提供一种半理性设计酶定向进化方法，包括如下步骤：
将待设计的酶进行建模，建模后将底物分子与酶进行分子对接，将底物距离内的残基定义为活性口袋残基；并，
分别利用丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸对活性口袋残基进行扫描突变获得突变体，并测定突变体对模型底物的酶活性，筛选突变位点；并，
对筛选得到的突变位点进行定点饱和突变和/或组合突变，获得突变体，将突变体构建至宿主中进行表达，筛选得到改造后的突变体。
进一步地，所述待设计的酶为腈水解酶。
本发明的第二个目的是提供一种腈水解酶突变体，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水解酶亲本的170、197、198、202位残基中的一种或多种进行突变。
进一步地，所述腈水解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第170位色氨酸突变为甘氨酸；或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第198位缬氨酸突变为亮氨酸；或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第197位甲硫氨酸突变为苯丙氨酸；或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第202位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸。
进一步地，所述腈水解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第198位缬氨酸突变为亮氨酸，并将第170位色氨酸突变为甘氨酸。
本发明的第三个目的是提供一种编码所述腈水解酶突变体的基因。
本发明的第四个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。
本发明的第五个目的是提供一种表达所述腈水解酶突变体的工程菌。
本发明的第六个目的是提供所述腈水解酶突变体在催化腈类底物中的应用。
进一步地，所述腈类底物为芳香腈类底物或脂肪腈类底物。
本发明的有益效果是：
本发明首次开发了一种针对酶活性口袋的半理性设计定向进化策略，并且应用这种半理性策略对腈水解酶进行底物偏好性改造，结合定点饱和突变以及组合突变技术，成功获得了具有芳香腈底物偏好性以及催化效率提升的酶突变体V198L/W170G。与野生型相比，V198L/W170G对4种芳香腈底物的比酶活分别提高了11.10、12.10、26.25和2.55倍，其在生物催化生产芳香族有机酸的工业应用中具有广阔的开发前景。
附图说明：
图1为芳香/脂肪腈底物与腈水解酶活性口袋结合复合体结构分析；
图2为腈水解酶活性口袋ALF-扫描突变；
图3为170(A)、197(B)、198(C)、202(D)位残基定点饱和突变；
图4为腈水解酶组合突变以及突变体底物偏好性表征，(A)3-氰基吡啶酶活力；(B)丁二腈酶活力；
图5腈水解酶蛋白纯化SDS-PAGE表征。泳道M：蛋白质Marker，泳道1-4分别为野生型Nit6803、W170G、V198L和V198L/W170G；
图6为最终突变体V198L/W170G和野生型腈水解酶对8种腈类底物的比酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
腈水解酶在大肠杆菌宿主中的重组表达
以大肠杆菌表达质粒pET-3b作为表达载体，将具有连接腈水解酶基因的重组质粒pET-3b-Nit通过热激法转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，在37℃下，在含有100μg/mL氨苄抗性的LB琼脂板上培养12h。将阳性菌落接种至10mL含有氨苄抗性(100μg/mL)的LB培养基中进行种子液培养10–12h。后以1％的接种量转接至30mL培养基中进行发酵培养进行重组腈水解酶的表达。
腈水解酶酶活力测定方法：
通过在PBS(100mM，pH 7.2)中混合底物溶液(50mM终浓度)和腈水解酶反应来实施标准酶活性测定。在30℃的金属浴中预孵育5min后，取1mL混悬液在30℃、1500rpm下反应10分钟。并通过在12000g下离心1min来终止反应。通过测量反应混合物中产生的氨来确定酶活性。该测定基于苯酚-次氯酸盐显色法。一个酶活性单位(1U)定义为在上述标准条件下每分钟产生1μmol氨的酶量。所有测定进行三次重复试验。腈水解酶催化反应的产物和底物通过HPLC使用Xterra MS C18柱在254nm波长下检测。流动相为乙腈和0.01％甲酸(梯度洗脱)，流速为1mL/min，温度为30℃。
腈水解酶突变体重组质粒构建与转化：
以构建成功的腈水解酶重组表达质粒pET-3b-Nit为模板，使用提前设计的氨基酸突变引物(表1)，进行全质粒一步反向PCR对腈水解酶DNA编码序列引入相应突变；PCR结束后，通过核酸凝胶电泳验证分离并纯化目的片段。将纯化回收的产物用DpnI酶进行消化处理，去除模板质粒，消化反应结束后，置于冰上冷却，取10μL消化产物转化至克隆宿主大肠杆菌JM109中。待长出转化子后挑菌进行测序验证。验证成功后，提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行突变体腈水解酶的重组表达。
重组酶的分离纯化方法：
将在优化后的最适条件下培养的菌体低温离心收集，悬浮于缓冲液A(50mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH 7.4)中，采用超声破碎或高压匀浆等方式进行菌体破碎，过滤或超高速离心去除细胞碎片，制备得到无细胞抽提液，采用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，采用缓冲液A进行柱子平衡，用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，实时监测洗脱过程，检测波长为280nm，分别收集各阶段洗脱峰，通过SDS-PAGE分析纯化后的真菌腈水解酶的分子量大小和纯度。本发明中对野生型Nit6803、突变体W170G、突变体V198L和突变体V198L/W170G进行蛋白质纯化(图5)。获取纯化蛋白后以进行比酶活测定等研究。
实施例1：基于ALF-扫描的活性口袋几何重塑
将底物小分子与腈水解酶进行分子对接，选取对接结合能最低的最合理复合体结构进行分析。将底物距离内的残基定义为活性口袋残基。本研究中确定了由14个氨基酸组成的活性口袋(图1)。本研究中以改变活性口袋几何状态作为目标，利用丙氨酸(Ala)，亮氨酸(Leu)，苯丙氨酸(Phe)，三个氨基酸分别作为小侧链，中等侧链，大侧链氨基酸代表，采用引物表1中的引物对活性口袋的氨基酸进行扫描突变，即ALF-扫描。首先，我们用小侧链氨基酸丙氨酸对Nit6803活性口袋中的14个残基进行了突变扫描。为了探索突变体对芳香腈/脂肪腈底物偏好性的改变，我们测定了所有突变体对芳香腈模型底物3-氰基吡啶和脂肪腈模型底物丁二腈的酶活性。在丙氨酸-扫描突变后，两种突变体W170A和F202A在所有测试突变体中表现出显着的潜力(图2A)。突变体W170A几乎失去了对脂肪腈底丁二腈的所有酶活性，但保留了约75％的对芳香腈底物3-氰基吡啶的酶活性。同样，突变体F202A失去了约85％的丁二腈活性，但与野生型相比，其对3-氰基吡啶的活性增加了25％。这表明突变体W170A和F202A显著提升了对芳香腈的底物偏好性。同上述丙氨酸扫描，我们对腈水解酶的活性口袋进行了中等侧链的Leu扫描突变和大侧链的Phe扫描突变。结果，发现了四个对芳香腈底物偏好性显著改善的突变体，即V198L(相对酶活性：3-氰基吡啶，351％；丁二腈，59％)，F202L(3-氰基吡啶，119％；丁二腈，13％)，M197F(3-氰基吡啶，161％；丁二腈，77％)和V198F(3-氰基吡啶，147％；丁二腈，43％)(图2B，C)。总体而言，我们发明的ALF-扫描突变策略应用于腈水解酶活性口袋的几何重塑研究，以改变底物偏好性。本研究共发掘出6个突变体，分别反映在腈水解酶活性口袋的第170位、第197位、第198位和第202位。
表1定点突变引物
实施例2：定点饱和突变结合组合突变获得协同增强突变体
根据上述实施例1中所述的研究结果，对确定的4个残基位点进行定点饱和突变，采用引物表1中定点饱和突变引物对该4个残基位点进行定点饱和突变进行氨基酸侧链优化，最终进一步确定了突变体W170G，F202M，V198L以及M197F(图3)。为研究突变体直接的协同效应，本发明中又对这四个突变体继续构建了6个双突变体以及4个三突变体，并且对组合突变体进行了两种模式底物(芳香腈：3-氰基吡啶，脂肪腈：丁二腈)酶活性表征(图4)。图5为野生型Nit6803、突变体W170G、突变体V198L和突变体V198L/W170G蛋白质纯化结果。
根据酶活性表征结果确定了最终突变体V198L/W170G，该突变体对芳香腈具有显著的底物偏好性，并且具有更好的催化效率。与野生型相比，其对4种芳香腈底物的比酶活分别提高了11.10、12.10、26.25和2.55倍(图6)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (5)
1.一种腈水解酶突变体，其特征在于，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水解酶亲本的170、198、202位残基中的一种或多种进行突变，所述突变选自以下任一种：
将第198位缬氨酸突变为亮氨酸；
将第202位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸；
将第198位缬氨酸突变为亮氨酸，并将第170位色氨酸突变为甘氨酸。
2.一种编码权利要求1所述腈水解酶突变体的基因。
3.一种携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.一种表达权利要求1所述腈水解酶突变体的工程菌。
5.权利要求1所述腈水解酶突变体在催化芳香腈类底物中的应用。
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