JP3085131B2 - エステラーゼ分泌機構に関与する遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、セラチア属微生物のエ
ステラーゼの分泌機構に関与するポリペプチドをコード
する遺伝子（ＤＮＡ）、これを含む組換えプラスミド、
この組換えプラスミドで形質転換された新規微生物及び
上記組換えプラスミドとエステラーゼ遺伝子を含む組換
えプラスミドを同時に保持する新規微生物、並びに該新
規微生物を用いるエステラーゼの製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、エステラーゼ等の酵素を利用して
加水分解反応を行う試みが盛んになされており、豚膵
臓、豚肝臓などの動物由来のリパーゼや、アルスロバク
ター・ギロビホルムス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇ
ｒｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）、ゲオトリカム・カンジダム
（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、キャンデ
ィダ・シリンドラシア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄ
ｒａｃｅａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）など
の微生物由来リパーゼが知られている。また、組換えＤ
ＮＡ技術を用いてセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来のエステラーゼ
を製造する方法も知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、動物由
来のエステラーゼは高価であり、微生物のエステラーゼ
は活性、安定性または基質特異性等の点で満足しうるも
のではなかったり、あるいは当該微生物のエステラーゼ
生産能も充分でないなどの問題点がある。また、遺伝子
組換え微生物を用いた場合でも、エステラーゼ遺伝子を
増幅する手段のみでは、当該微生物のエステラーゼ生産
能を工業的生産に適用可能な水準にまで増大させること
は必ずしも容易でない。更に、エステラーゼ生産能自体
は上昇しても、菌体外へのエステラーゼ分泌能が不充分
な場合もあり、酵素の回収操作が煩雑になるなど、種々
の問題点があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、セラチア属の微生物から当該微生物エステラー
ゼの分泌機構に関与するポリペプチドをコードする遺伝
子（ＤＮＡ）を取得することに成功するとともに、この
ＤＮＡを挿入した組換えプラスミドでエステラーゼ産生
微生物を形質転換すれば、エステラーゼ分泌能が顕著に
増大するとの知見を得た。本発明は、この知見に基づき
完成されたものである。

【０００５】即ち、本発明は、セラチア属微生物由来の
エステラーゼの分泌機構に関与するポリペプチドをコー
ドする遺伝子に関する。

【０００６】また、本発明は、上記遺伝子をベクタープ
ラスミドに挿入した組換えプラスミド、及び該組換えプ
ラスミドを含む形質転換体に関する。

【０００７】更にまた、本発明は、上記形質転換体を培
地で培養し、菌体外に蓄積したエステラーゼを採取する
ことを特徴とするエステラーゼの製法に関する。

【０００８】本発明のエステラーゼ分泌機構に関与する
ポリペプチドをコードする遺伝子（以下、本発明のエス
テラーゼ分泌遺伝子と略称する）は、４４６６塩基対の
配列からなり、当該配列中に３つのオープン・リーディ
ング・フレーム（ＯＲＦ）を有する２本鎖ＤＮＡであっ
て、具体的には配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡが
あげられる。

【０００９】かかるエステラーゼ分泌遺伝子の供与微生
物としては、セラチア属に属し、エステラーゼ生産能を
有する微生物であればいかなるものでも良く、例えばセ
ラチア・マルセッセンスＳｒ４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
８７）、セラチア・リケファシエンス ＡＴＣＣ 2759
2、セラチア・マルセッセンス ＡＴＣＣ 13880、セラ
チア・マルセッセンス ＡＴＣＣ 14764、セラチア・マ
ルセッセンス ＡＴＣＣ19180、セラチア・マルセッセ
ンス ＡＴＣＣ 21074、セラチア・マルセッセンス Ａ
ＴＣＣ 27117、セラチア・マルセッセンス ＡＴＣＣ 2
1212などが挙げられる。

【００１０】また、エステラーゼ分泌遺伝子を組み込む
ベクタープラスミドとしては、形質転換細胞中で複製可
能なプラスミドであれば特に限定されないが、例えばコ
ピー数が１〜数千であり、アンピシリン、カナマイシ
ン、クロラムフェニコールなどの薬剤に耐性なマーカー
を有し、かつlac 、tac 、trp など適当なプロモーター
を有するものが好ましい。更に、par 及び parＢなどの
プラスミド安定化遺伝子を含んでいるものであってもよ
い。

【００１１】かかるプラスミドとしては、例えばｐＬＧ
３３９〔ジーン（Gene）、18巻、332 (1982)〕、ｐＢＲ
３２２〔ジーン、２巻、９５（１９７７）〕、ｐＵＣ１
８〔ジーン、３３巻、１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１
９〔ジーン、３３巻、１０３（１９８５）〕、ｐＨＳＧ
２９８〔ジーン、６１巻、６３（１９８７）〕ｐＨＳＧ
２９９〔ジーン、６１巻、６３（１９８７）〕などが挙
げられる。

【００１２】上記ベクタープラスミドは、市販のものを
好適に使用し得る他、これらを保持する微生物菌体から
クリアード・ライセイト法〔遺伝子操作実験法、１２５
頁（高木康敬著、講談社、１９８０年）〕、アルカリ・
リシス法〔モレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning)、マニアティス(Maniatis)ら、３６８頁、（コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory)、米国（１９８２））〕等の常
法により調製することもできる。

【００１３】組換えプラスミドを組込む宿主微生物とし
ては、プラスミドで形質転換可能で、プラスミドがその
宿主内で複製し、プラスミドに挿入された遺伝子が機能
しうる蛋白として発現しうるものであれば、いかなる微
生物であってもよい。

【００１４】かかる宿主微生物としては、例えばセラチ
ア属微生物やエシェリシア属微生物があげられ、具体的
には、セラチア・マルセッセンスＳｒ４１及びそれから
誘導される種々の変異株、例えば、セラチア・マルセッ
センスＭ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０６８）、同ＴＴ３
９２株〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journa
l of Bacteriology)、１６１巻、１（１９８５）〕やエ
シェリシア・コリＫ１２ ＤＨ５株〔モレキュラー・ク
ローニング、第２編、マニアティスら、Ａ１０頁、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー米国（１９
８９年）〕などがあげられる。

【００１５】また、上記のほか、既にセラチア属微生物
のエステラーゼ遺伝子を挿入した組み換えプラスミドを
保持している微生物、例えばセラチア・マルセッセンス
ＴＡ５０２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０６７）を宿主微生
物として使用することもできる。

【００１６】エステラーゼ分泌遺伝子を含む染色体ＤＮ
Ａは、例えば、微生物菌体をリゾチームで処理し、更に
ラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸
ナトリウム等の界面活性剤で処理した後、フェノール、
クロロホルム、エーテル等の有機溶媒で抽出することに
よって除蛋白し、エタノールで沈澱せしめるなどの常法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Jo
urnal of Molecular Biology）、３巻、２０８（１９６
１）、バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ
（Biochimica et Biophysica Acta)、７２巻、６１９
（１９６３）〕により容易に調製することができる。

【００１７】エステラーゼ分泌遺伝子を含む染色体ＤＮ
ＡとベクタープラスミドＤＮＡからなる組換えプラスミ
ドの調製は、適当な制限エンドヌクレアーゼ（例えばＥ
ｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓ
ａｃＩ等）を用いて染色体のＤＮＡ鎖とプラスミドのＤ
ＮＡ鎖を切断した後、ＤＮＡリガーゼ（例えばＴ４ＤＮ
Ａリガーゼや大腸菌ＤＮＡリガーゼ等）で処理するか、
或いはその切断末端によってはターミナルトランスフェ
ラーゼやＤＮＡポリメラーゼ等で処理した後、ＤＮＡリ
ガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する等、この技術分
野における常法〔メソッド・イン・エンザイモロジー
（Method in Enzymology）、６８巻、４１（１９７
９）；遺伝子操作実験法、１３５頁（高木康敬著，講談
社、１９８０年）〕により実施することができる。

【００１８】エステラーゼ分泌遺伝子を挿入した組換え
プラスミドを含む形質転換体の選択は、上記で得られる
組換えプラスミドを用いて、制限エンドヌクレアーゼ欠
損性で、かつエステラーゼ産生能を有する微生物菌体、
例えばエステラーゼ遺伝子を挿入した組換えプラスミド
（特開平５−３４４８９１記載のｐＬＩＰＥ１１１等）
を含むエシェリシア・コリＫ１２ ＤＨ５株を形質転換
し、次いで得られる形質転換処理細胞を、該細胞が生育
可能で、かつ乳化したトリグリセリドを含む寒天培地、
例えばポリオキシエチレンセチルアルコールエーテル
（Ｂｒｉｊ５８）で乳化したトリブチリンを含み、所定
濃度の抗生物質を有する栄養寒天培地、に塗布した後、
３０〜３７℃で１〜２日間培養し、得られるコロニーの
中から大きなクリアゾーンを形成する形質転換体を釣菌
分離することにより実施することができる。

【００１９】具体的には、例えば、低温下で細胞を塩化
カルシウム溶液で処理して宿主細胞の膜透過性を増大さ
せ、組換えプラスミドを宿主細胞中に取り込ませる方法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、５
３巻、１５９（１９７０）〕やエレクトロポレーション
法等の常法により、上記で調製した組換えプラスミドを
宿主微生物に導入する。

【００２０】また、エステラーゼ分泌機構関連ＤＮＡと
エステラーゼ遺伝子とを単一のベクタープラスミドに導
入した組換えプラスミドでエシェリシア・コリＫ１２
ＤＨ５株等の細胞を形質転換し、この形質転換処理細胞
を前記と同様に処理することにより、目的とする形質転
換体を選択することもできる。

【００２１】上記形質転換体から、アルカリ・リシス法
によりプラスミドＤＮＡを抽出することにより、セラチ
ア・マルセッセンスのエステラーゼ遺伝子がベクタープ
ラスミドに挿入された組換えプラスミドを得ることがで
きる。

【００２２】上記で得られる目的の組換えプラスミド
は、宿主微生物での形質転換が容易となるように、宿主
微生物と同種でかつ制限エンドヌクレアーゼ欠損株、例
えば宿主がセラチア・マルセッセンスＳｒ４１であれ
ば、セラチア・マルセッセンスのＴＴ３９２株に取り込
ませて組換えプラスミドを修飾した後、一旦組換えプラ
スミドを単離し、これを宿主微生物に導入し、ついでこ
れから目的微生物を分離することにより、形質転換体を
得ることができる。

【００２３】微生物への導入は、例えば高木と木住の方
法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６１巻、
１（１９８５）〕により容易に実施でき、プラスミドの
単離は例えばアルカリ・リシス法により実施することが
できる。また、目的の形質転換体は、薬剤耐性のコロニ
ーを釣菌分離することにより得ることが出来る。宿主微
生物は、前記したものを好適に使用できるが、エステラ
ーゼ生産能がより高い菌株を宿主微生物として使用すれ
ば、さらに好ましい結果を得ることが出来る。

【００２４】かくして得られる本発明の微生物として
は、例えばセラチア・マルセッセンスＳｒ４１に、ｐＭ
Ｗ１１９に約２．６ｋｂのエステラーゼ遺伝子を含むＳ
ａｌＩ−ＢｓｔＰＩＤＮＡ断片と約６．５ｋｂのエステ
ラーゼ分泌遺伝子を含むＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶＤＮＡ
断片導入した組換えプラスミドを含有せしめたセラチア
・マルセッセンスＴＡ５０３０、セラチア・マルセッセ
ンスＳｒ４１に、ｐＭＷ１１９に約２．６ｋｂのエステ
ラーゼ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＢｓｔＰＩＤＮＡ断片と
約９．０ｋｂのエステラーゼ分泌遺伝子を含むＢａｍＨ
Ｉ−ＳａｃＩＤＮＡ断片を導入した組換えプラスミドを
含有せしめたセラチア・マルセッセンスＴＢＳ９０等が
挙げられる。これらの微生物は、いずれの菌株もセラチ
ア・マルセッセンスＳｒ４１の形態的特徴を有するもの
である。

【００２５】更に、本発明を微生物を使用してエステラ
ーゼを製造する場合には、上記のようにして得られた微
生物を培地で培養し、菌体内外に産生せしめたエステラ
ーゼを分離、採取することにより実施することができ
る。

【００２６】本発明において使用されるエステラーゼ生
産用培地としては、本発明の微生物が生育・増殖し得る
ものであれば、どのような培地であっても使用すること
ができる。例えば、炭素源としてはブドウ糖、庶糖、糖
蜜の如き糖類、フマル酸やクエン酸の如き有機酸または
グリセロールの如きアルコール類、アラニン、グルタミ
ン、アスパラギン等のアミノ酸を、窒素源としては、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウムの如き無機アンモニ
ウム塩または尿素、或いはペプトン、コーン・スティー
プ・リカー、酵母エキス、カゼイン加水分解物等を好適
に用いることができる。

【００２７】炭素源は、通常、培地に対し、１−１５重
量（Ｗ／Ｖ）％、窒素源は０．１−２．０重量（Ｗ／
Ｖ）％の範囲で用いるのが好ましい。また、培地には必
要に応じて、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩等の無機塩、鉄、マンガン、銅、亜鉛等の
金属イオンを適当量添加してもよく、合成培地を用いる
場合には、必要に応じて、例えば、ビタミン類或いはア
ミノ酸類を添加してもよい。更に、植物油、界面活性剤
等のエステラーゼ生産誘導物質、消泡剤や、微生物の組
換えプラスミドの安定保持に好ましい抗生物質等を添加
することもできる。これらの培地は、ｐＨ５−８に調製
して用いるのが好ましい。

【００２８】培養は、常法によって実施することがで
き、例えば培地に微生物を接種後、振とう培養、通気培
養、静置培養、連続培養等のいずれの方法によっても行
うことができる。培養条件は、培地の種類、培養法によ
り若干異なるが、本発明の微生物が増殖する条件を適宜
選択すれば良い。通常は培養開始のｐＨを５〜８に調製
し、例えば２０〜４０℃で培養することが望ましい。培
養日数は通常１〜２日が適当である。

【００２９】培養菌体内外に産生されたエステラーゼ、
例えば培地中に含まれるエステラーゼは、無機塩類によ
る塩析、有機溶媒による分画沈澱、イオン交換樹脂、及
び各種カラムクロマトグラフィーによる吸脱着法、ゲル
ろ過法、蛋白沈澱剤を利用する方法などの公知方法によ
り、又はこれらを適宜組み合わせることによって分離、
採取することができる。また菌体内に蓄積されたエステ
ラーゼは、摩擦型破砕装置ダイノミル（Dyno Mill)など
物理的な手法、あるいは、リゾチーム処理など化学的な
手法により菌体を破砕し、その細胞抽出液から上記と同
様な方法で分離、採取することができる。

【００３０】なお、本発明のエステラーゼ分泌遺伝子
は、この明細書において具体的に開示された塩基配列を
有するＤＮＡのみに限定されるものではなく、ＤＮＡの
挿入、欠失、置換など、自明の変更に基づいて得られる
配列を有するＤＮＡをも包含するものである。

【００３１】すなわち、エステラーゼをコードする遺伝
子のＤＮＡ配列をもとにデザインした合成変異ＤＮＡプ
ライマーを用いた試験管内人工変異や、蟻酸、ヒドラジ
ン亜硫酸などの化学変異剤を用いて、直接に試験管内で
遺伝子に変異を導入して改変を加えたもの、エステラー
ゼ生産菌株に変異処理、例えばＮＴＧ処理やＵＶ処理を
行って変異を誘発させた菌株から得られた変異型エステ
ラーゼ分泌遺伝子も本発明の遺伝子に含まれるものであ
る。

【００３２】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。

【００３３】なお、実施例におけるエステラーゼ活性の
測定は主に簡便法〔大日本製薬製リパーゼキットＳ（基
質：三酪酸ジメルカプロール）を用いる方法〕により行
った（なお、オリーブ油を基質とし、ｐＨ８．０、３７
℃で２０分間酵素反応させ、１分間に１μｍｏｌの脂肪
酸を遊離する酵素量を１単位とする活性測定法も、必要
に応じて採用することができる）。

【００３４】また、以下の実施例で使用した培地の組成
は、以下に示す通りである（組成における％は、特にこ
とわらない限り、Ｗ／Ｖ％を表わす）。

【００３５】ＬＢ培地：バクトトリプトン（ディフコ社
製）１．０％、バクトイーストエキストラクト（ディフ
コ社製）０．５％、塩化ナトリウム０．５％。

【００３６】ＬＢＧ平板培地：バクトトリプトン（ディ
フコ社製）１．０％、バクトイーストエキストラクト
（ディフコ社製）０．５％、塩化ナトリウム０．５％、
ゲランガム（和光純薬製）１．０％。

【００３７】トリブチリン含有ＬＢＧ平板培地：トリブ
チリン０．５ｖ／ｖ％、ポリオキシエチレンセチルアル
コールエーテル０．５％、アンピシリン０．００５％を
含むＬＢＧ平板培地。

【００３８】エステラーゼ生産培地：デキストリン１．
０％、ミースト２．０％、硫酸アンモニウム０．２％、
リン酸１カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物
０．０５％、塩化カルシウム２水和物０．０１％、硫酸
第１鉄７水和物０．００１％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．５
％、カラリン０．１％。

【００３９】

【実施例】

実施例１ （１）エステラーゼ分泌遺伝子を含む染色体ＤＮＡの取
得 セラチア・マルセッセンスＳｒ４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４８７）を、ＬＢ培地２００ｍｌ中、３０℃で一夜好気
的に振とう培養し、遠心分離により集菌した。

【００４０】この菌体を２００ｍｌの０．９％塩化ナト
リウム水溶液で１回懸濁後、遠心集菌することによって
菌体を洗浄した。ついで、この菌体をリゾチウム２００
ｍｇを含む５０ｍＭトリス塩酸−５０ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸二ナトリウム（ｐＨ７．５）水溶液２００ｍ
ｌに懸濁し、室温で１時間放置した。

【００４１】この溶液に、０．５％濃度になるようにラ
ウリル硫酸ナトリウムを加え、更にプロテナーゼＫを加
えて５０℃で３時間緩やかに振とうさせ菌体を溶解させ
た。

【００４２】この溶解物に、１０ｍＭトリス塩酸−１ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ｐＨ８．０）
水溶液（以下ＴＥ）で飽和したフェノールを等量加え、
２回抽出を行った。ＴＥで飽和したフェノールとクロロ
ホルムの等量混合液で２回抽出した後、エタノール沈澱
させ、沈澱物をＴＥに溶解することにより、エステラー
ゼ分泌遺伝子を含む染色体ＤＮＡを２．５ｍｇ含有する
ＴＥ溶液を調製した。

【００４３】（２）組換えプラスミドＤＮＡの調製 上記（１）で調製した染色体ＤＮＡ２０μｇを制限酵素
ＳａｃＩを用いて完全分解した。これをＴＥ飽和フェノ
ールとクロロホルムの等量混合液で２回抽出し、０．５
倍量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、その２倍量の
エタノールを加えて沈澱させ、ＤＮＡを回収した。

【００４４】次に、同じ制限酵素で完全分解したプラス
ミドベクターｐＭＷＥ１２１〔セラチア・マルセッセン
スＳｒ４１由来のエステラーゼ遺伝子を含む約２．６ｋ
ｂのゲノムＤＮＡ断片（ＳａｌＩ−ＢｓｔＰＩ断片）を
ｐＭＷ１１９に挿入して得られたプラスミドベクター〕
のＤＮＡ０．５μｇを０．４単位のアルカリホスファタ
ーゼ（宝酒造製）で５６℃，１時間処理することによっ
て脱リン酸化した後、ＴＥ飽和フェノールとクロロホル
ムの等量混合液で２回抽出し、更に０．５倍量の７．５
Ｍ酢酸アンモニウムを加え、その２倍量のエタノールを
加えて沈澱させ、プラスミドベクターＤＮＡを回収し
た。この脱リン酸化プラスミドベクターと上記の回収染
色体ＤＮＡ３μｇとを混合し、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）を用いて、４℃で１６時間反応させて
ＤＮＡ鎖の連結反応を行うことによって、組換えプラス
ミドＤＮＡを作製した。

【００４５】（３）組換えプラスミドによる形質転換と
大腸菌を宿主とするコロニーバンクの作製 大腸菌ＤＨ５株の細胞を、ハナハンの方法〔ジューナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１６６巻、５５
７頁、（１９８３）〕に従って処理し、上記（２）で作
製したプラスミドＤＮＡを含有する反応液を加えること
によって、形質転換処理を行う。ついでこの細胞を、ア
ンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＧ平板培地に
塗布し、３７℃で一夜培養した。かくしてセラチア・マ
ルセッセンスＳｒ４１株の染色体ＤＮＡの断片が挿入さ
れた組換えプラスミドを含む形質転換体約５００００株
を得た。

【００４６】（４）エステラーゼ分泌遺伝子を含む形質
転換株の分離と同定 トリブチリン含有ＬＢＧ平板培地にエステラーゼ生産菌
株を植菌すると培地中に生産されたエステラーゼによっ
てトリブチリンが分解されて脂肪酸が出来、脂質の乳化
状態が変化してコロニー周辺に円形のクリアゾーンが形
成される。この現象を利用して形質転換体をスクリーニ
ングした。

【００４７】上記（３）で得られた形質転換体約５００
００株をトリブチリン含有ＬＢＧ平板培地に植菌して３
７℃で一夜培養した結果、ＳａｃＩによるＤＮＡバンク
の中からクリアゾーンを形成する菌株が１株得られた。

【００４８】一方、セラチア・マルセッセンスＳｒ４１
株をトリブチリン含有ＬＢＧ平板培地で一晩培養すると
クリアゾーンの形成が認められたが、大腸菌ＤＨ５株お
よびプラスミドｐＭＷＥ１２１を有する同株は、このト
リブチリン含有ＬＢＧ平板培地で３７℃一晩培養して
も、クリアゾーンの形成は認められなかったことから、
このクリアゾーンの形成は、エステラーゼ分泌遺伝子を
含む組換えプラスミドの導入により、エステラーゼの菌
体外分泌能が増大したことに起因するものと考えられ
る。

【００４９】また、クリアゾーンを形成する形質転換体
を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む６０ｍｌのＬ
Ｂ培地で３７℃一晩好気的に振とう培養した後、培地中
のリパーゼ活性を簡便法により測定したところ３４８０
０単位のエステラーゼ活性が認められた。更に、前記培
養上清についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、セラチア・マルセッセンス由来のエステラーゼ
に対するウサギ抗エステラーゼ抗体を用いウエスタンブ
ロット解析を行った結果、セラチア・マルセッセンスＳ
ｒ４１株の培養上清から得た精製エステラーゼ標品と同
じ位置に、ベクターとして用いたプラスミドのみを保持
する大腸菌ＤＨ５には存在しない新たなバンドが存在す
ることがわかった。

【００５０】実施例２ プラスミドの解析 実施例１（４）で得た形質転換体の細胞からプラスミド
ＤＮＡを常法〔モレキュラー・クローニング、マニアテ
ィスら、３６８頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー 米国（１９８２）〕に従って調製し、各
種制限酵素で切断後、アガロース電気泳動を行った。そ
の結果、このプラスミド（以下ｐＫＨＥ２００と称す
る）には、セラチア・マルセッセンス由来のエステラー
ゼ遺伝子を含む約２．６ｋｂのＳａｌＩ−ＢｓｔＰＩＤ
ＮＡ断片の他に、約２０．０ｋｂのＳａｃＩＤＮＡ断片
が含まれていることがわかった。

【００５１】このｐＫＥＨ２００に含まれる約２０．０
ｋｂのＳａｃＩＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を図１に
示す。

【００５２】次にプラスミドｐＫＨＥ２００の約２０．
０ｋｂＳａｃＩＤＮＡ断片を各種制限酵素で切断し、各
ＤＮＡ断片をｐＭＷＥ１２１にサブクローニングし、得
られた組換えプラスミドで大腸菌ＤＨ５を形質転換さ
せ、その形質転換体を前記と同様にしてトリブチリン含
有ＬＢＧ平板培地で培養して、クリアゾーンの形成の有
無を調べた。

【００５３】各ＤＮＡ断片についての制限酵素切断地図
は図１に示す通りであるが、約９．０ｋｂのＢａｍＨＩ
−ＳａｃＩＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐＫＨＥ９
０）と約６．５ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶＤＮＡ断
片を含むプラスミド（ｐＫＨＥ６５）を有する大腸菌Ｄ
Ｈ５にクリアゾーンの形成と菌体外エステラーゼ活性
（簡便法による測定）が認められた。しかし、約７．５
ｋｂのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を含むプラスミ
ド（ｐＫＨＥ７５）、約３．５ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｂａ
ｍＨＩＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐＫＨＥ３５）を
有する大腸菌ＤＨ５にはクリアゾーンの形成及び菌体外
エステラーゼ活性（前記簡便法による測定）は認められ
なかった。

【００５４】このことから、セラチア・マルセッセンス
Ｓｒ４１由来のエステラーゼ分泌遺伝子が約６．５ｋｂ
のＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶＤＮＡ断片中に存在すること
がわかる。

【００５５】なお、プラスミドｐＫＨＥ６５を含む形質
転換大腸菌ＤＨ５株は、工業技術院生命工学工業技術研
究所に平成７年３月１６日付（原寄託日）でＦＥＲＭ
ＢＰ−５３８５〔微生物名称：エシェリシア・コリＴＡ
５０２９（Escherichia coliTA5029 ）〕として寄託済
である。

【００５６】実施例３ クローンＤＮＡの解析 塩基配列の決定 ｐＫＨＥ６５をキロベース・デレーション・キット（宝
酒造製）を用い、種々デレーション・プラスミドを作製
した。これを用い、サンガーらのジデオキシ・チェイン
・ターミネーション法〔プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ
・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ (Proc., N
atl., Acad., Sci., USA) 、74巻、5463頁（1977）〕に
より、プライマーのアニール、ＤＮＡポリメラーゼＩの
クレノウ・フラグメントによる相補鎖合成〔（α−
³²Ｐ）ｄＣＴＰ（１４．８×１０⁶ Ｂｑ／ｐｍｏｌ，７
４×１０⁴ Ｂｑ）で標識〕、尿素変性８％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーから塩
基配列を決定した。

【００５７】その結果、セラチア・マルセッセンスＳｒ
４１のエステラーゼ分泌遺伝子は、配列番号１に示すよ
うに、ＧＴＧの開始コドンから始まり、ＧＡＧで終わる
４４６６塩基対からなる配列中にエステラーゼ分泌機構
に関与する３種のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
（ＯＲＦ）を含むＤＮＡであることがわかった（これら
３つのＯＲＦは一対のオペロンを構成しているものと考
えられる）。

【００５８】また、塩基配列から決定した各ＯＲＦにコ
ードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号
２、３及び４に示す通りである。

【００５９】実施例５ エステラーゼ高生産菌株の作製 制限エンドヌクレアーゼ欠損性のセラチア・マルセッセ
ンスＴＴ３９２株にｐＫＨＥ６５を導入することによ
り、形質転換株を得た。次に、この形質転換株の細胞か
らセラチア・マルセッセンスによって修飾されたｐＫＨ
Ｅ６５プラスミドＤＮＡを、アルカリ・リシス法により
抽出した。次に、このプラスミドＤＮＡを用いてセラチ
ア・マルセッセンスＳｒ４１の細胞をエレクトロポレー
ション法によって形質転換することにより、形質転換体
であるセラチア・マルセッセンスＴＡ５０３０を得た。
得られた形質転換体を５００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むエステラーゼ生産培地に１白金耳植菌し、３０℃
で２０時間往復振とう培養（振幅７ｃｍ、１２０回転／
分）する。遠心分離によりエステラーゼ活性約３．５×
１０⁵ 単位／ｍｌ（簡便法による測定）の培養上清が得
られた。本菌株の生産性は、宿主微生物であるセラチア
・マルセッセンスＳｒ４１株のエステラーゼ生産性の約
１０倍であり、また、ベクタープラスミドとして用いた
組換えプラスミドｐＭＷＥ１２１を保持するセラチア・
マルセッセンスＳｒ４１株のエステラーゼ生産性の約２
倍であった。

【００６０】

【発明の効果】本発明のエステラーゼ分泌遺伝子を挿入
した組換えプラスミドを含有する形質転換体は、エステ
ラーゼの菌体外への分泌能が顕著に優れているという特
長を有する。

【００６１】このため、例えば、エステラーゼ遺伝子を
含む組換えプラスミドを保持したエステラーゼ生産菌
を、更に本発明の分泌遺伝子を含む組換えプラスミドで
形質転換すれば、エステラーゼの生産性と菌体外への分
泌能がともに高い微生物を取得できる。この形質転換体
を培養することにより、工業的有利にエステラーゼを生
産することができる。

【００６２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４４６６ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体ＤＮＡ 起源 生物名：セラチア・マルセッセンス（Serratia marcesc
ens) 株名：Ｓｒ４１ 配列 ＧＴＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＴＴ ＡＴＣ ＣＣＧ ＣＧＣ ＡＡＣ 24 ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＣＧ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＣＧＴ ＡＣＡ 48 ＣＧＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＣＣ ＧＴＴ 72 ＧＧＴ ＡＴＡ ＴＴＴ ＡＣＴ ＧＣＧ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＡＣ 96 ＣＴＧ ＴＴＡ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＴＴ 120 ＴＡＴ ＡＴＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ 144 ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＴＣＧ ＣＧＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＴＣ 168 ＡＣＧ ＣＴＧ ＴＴＡ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＣＧ ＣＴＧ ＡＴＣ 192 ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＡＴＧ 216 ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＧＡＡ ＴＡＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＡＧＣ 240 ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＧＣ 264 ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＣＧＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＣＧ 288 ＣＧＡ ＧＴＣ ＴＡＴ ＡＣＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＴＡＣ ＧＡＡ 312 ＧＣＧ ＡＡＴ ＣＴＧ ＡＡＡ ＡＡＣ ＧＧＴ ＴＣＧ ＴＣＴ 336 ＧＡＣ ＧＣＣ ＧＧＴ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＡＴ 360 ＴＴＧ ＡＣＣ ＡＡＴ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＴＣ ＣＴＣ 384 ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＣＣ ＴＴＣ 408 ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＣＧ ＣＣＧ ＴＧＧ ＴＴＴ ＣＣＧ ＡＴＣ 432 ＴＡＴ ＣＴＧ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＴＡ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＴ 456 ＡＡＣ ＣＣＴ ＴＧＧ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＧＣＣ 480 ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＧＴ ＧＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＴＣ 504 ＧＣＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＧＴＡ ＡＴＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＴＧ 528 ＧＴＴ ＴＣＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＡＡ 552 ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＴＣＧ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＣＡ 576 ＧＧＴ ＡＡＴ ＴＴＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＡＴ ＣＴＧ 600 ＣＧＡ ＡＡＴ ＧＣＣ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＣＴ 624 ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＣＴ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＡＡ 648 ＣＧＣ ＣＧＧ ＴＧＧ ＴＴＣ ＧＧＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＡＧ 672 ＣＧＧ ＴＴＣ ＴＴＧ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＡＡ ＣＧＣ ＡＴＣ 696 ＧＣＣ ＡＧＣ ＧＡＡ ＣＧＣ ＧＣＡ ＴＣＧ ＣＧＧ ＧＴＣ 720 ＡＣＧ ＴＣＡ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＴＴＣ ＧＴＧ ＣＧＴ 744 ＡＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＴＧ 768 ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＴＧ ＧＣＧ ＡＴＴ 792 ＧＡＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ＡＴＣ ＡＣＧ ＣＣＣ ＧＧＣ ＡＴＧ 816 ＡＴＧ ＡＴＣ ＧＣＣ ＧＧＴ ＴＣＴ ＡＴＡ ＴＴＧ ＡＴＧ 840 ＧＧＧ ＣＧＡ ＡＣＧ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＣＧ ＡＴＣ ＧＡＧ 864 ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＴＴ ＡＡＣ ＧＴＴ ＴＧＧ ＡＡＡ ＡＧＣ 888 ＴＡＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＴＣＴ ＴＡＴ 912 ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＡ 936 ＡＣＧ ＣＡＴ ＣＣＧ ＣＡＧ ＣＧＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＧＣ 960 ＡＴＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＧＴ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＧＴ 984 ＧＴＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＴＧ ＡＣＣ 1008 ＧＣＣ ＡＣＧ ＣＣＴ ＣＣＧ ＧＧＡ ＴＣＧ ＡＡＡ ＧＧＧ 1032 ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＡＴ ＡＡＣ ＧＴＡ ＡＧＴ 1056 ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＴＴ ＣＡＡ ＣＣＣ ＧＧＣ ＧＡＴ ＧＴＧ 1080 ＣＴＧ ＧＧＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＧＧＴ ＣＣＧ ＡＧＴ ＧＣＧ 1104 ＴＣＧ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＣ 1128 ＴＴＡ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＴＧ 1152 ＡＧＣ ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＴＡ ＧＴＧ ＣＧＧ ＴＴＧ ＧＡＴ 1176 ＡＡＴ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＡＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＡＣ 1200 ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＡＡ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＴＣ 1224 ＧＧＣ ＴＡＴ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＡＧ 1248 ＴＴＧ ＴＴＣ ＧＣＣ ＧＧＣ ＡＣＴ ＡＴＣ ＧＣＣ ＧＡＧ 1272 ＡＡＣ ＡＴＣ ＧＣＴ ＣＧＣ ＴＴＴ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＴＣ 1296 ＧＡＴ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＣＴ 1320 ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＡＴ ＧＡＡ 1344 ＣＴＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＣＧＴ ＴＴＣ ＣＣＴ ＡＡＣ ＧＧＴ 1368 ＴＡＣ ＧＡＴ ＴＣＧ ＧＴＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＡＣ ＧＧＴ 1392 ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＴＧ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＧＧ ＣＡＧ 1416 ＡＡＧ ＣＡＡ ＣＧＴ ＡＴＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ 1440 ＧＣＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＧＧＣ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＣＧ ＴＴＧ 1464 ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＡＴ ＧＡＧ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＣＣ 1488 ＡＡＣ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＧＣ ＧＡＧ ＡＡＡ 1512 ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＴＣ 1536 ＣＴＴ ＡＡＡ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＴ ＡＡＧ ＡＣＧ ＧＴＧ 1560 ＧＴＣ ＣＴＧ ＡＴＣ ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＧＣ ＡＣＣ ＡＡＴ 1584 ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＣＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＴＧ 1608 ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＧＴＴ ＡＡＣ ＧＧＧ ＡＡＣ ＧＴＣ 1632 ＡＡＴ ＧＣＡ ＴＴＣ ＧＧＣ ＣＣＡ ＡＣＧ ＣＡＧ ＣＡＧ 1656 ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＣＧ ＡＡＴ ＧＣＧ 1680 ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＣＴ ＣＣＧ ＣＡＧ 1704 ＧＣＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＧＣＧ ＧＴＧ ＡＡＣ ＴＣＣ ＧＡＧ 1728 ＣＣＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＡＡ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＡＡ 1752 ＡＣＴ ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＣＣＧＴＧＡＡＣＴ 17
77 ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧ ＣＧＣＴＴＴＴＧＣＧ ＴＣＧＣＣＧＡＣＡＧ 1807 ＴＣＡＡＡＧＧＡＧＴ ＴＧＧＴ ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＣＧ ＣＡＴ 1833 ＡＴＴ ＧＧＣ ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＡ ＧＡＣ ＴＣＧ ＴＡＴ 1857 ＡＣＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＴＣ ＣＣＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＧＡＡ 1881 ＣＧＧ ＣＧＧ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＴ ＡＴＧ ＧＧＧ ＴＧＧ 1905 ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＣ ＧＧＧ ＡＴＣ ＧＧＴ ＣＴＧ ＴＴＣ 1929 ＧＧＧ ＴＴＴ ＴＴＡ ＧＣＣ ＴＧＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＴＴＴ 1953 ＧＣＧ ＣＣＧ ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＡＡ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＣＧ 1977 ＴＣＧ ＣＣＧ ＧＧＡ ＴＣＧ ＧＴＡ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＣＣ 2001 ＧＧＣ ＡＡＣ ＣＧＣ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ 2025 ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＡＡＴ 2049 ＡＴＴ ＧＣＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＧＡＣ ＡＡＡ 2073 ＧＴＧ ＡＡＡ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＴＧ 2097 ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＣＴ ＣＡＡ 2121 ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＧＡＴ ＴＣＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＧＡＴ 2145 ＣＡＧ ＴＡＣ ＴＡＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＣＴＧ ＧＣＧ ＡＣＡ 2169 ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＧＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＡＡ ＣＧＣ 2193 ＧＡＴ ＧＧＧ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＴＡ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＣ 2217 ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＴＴ ＴＴＧ ＧＡＣ ＧＣＧ ＧＴＧ ＡＡＡ 2241 ＧＡＴ ＡＡＡ ＣＣＴ ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＴＣ 2265 ＡＴＴ ＧＣＡ ＴＴＧ ＣＡＡ ＡＣＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣ 2289 ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＧＣ ＣＧＣ ＣＡＡ ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＡＡ 2313 ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＡＴ ＡＡＧ ＣＡＧ 2337 ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＡＣ ＧＧＡ ＡＴＣ ＣＧＴ ＴＴＣ ＣＡＡ 2361 ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＧＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＣＧ ＣＧＣ 2385 ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＣＣ 2409 ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＧＴ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＡＧＣ 2433 ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＡＣ ＧＧＴ 2457 ＴＡＣ ＣＴＡ ＣＣＧ ＣＧＴ ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＧ 2481 ＧＡＡ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＡＧ ＴＴＴ ＧＣＣ ＧＡＧ 2505 ＧＴＡ ＡＡＴ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＴＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＣＧ 2529 ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＧ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＡＡ 2553 ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ 2577 ＣＧＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＧＴ ＴＴＣ ＧＣＣ ＧＡＣ 2601 ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＧＣ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＧＡ ＡＣＧ ＣＡＧ 2625 ＣＴＧ ＧＣＧ ＣＡＡ ＡＣＴ ＣＡＡ ＡＴＧ ＧＡＣ ＧＣＣ 2649 ＡＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＡＡ 2673 ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＡＴ ＴＴＣ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＡＣ 2697 ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＣＡ ＣＣＧ ＧＴＧ ＧＡＣ 2721 ＧＧＣ ＡＣＣ ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＧＡ ＴＴＧ ＡＡＴ ＡＴＣ 2745 ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＡＧ ＧＧＧ ＧＧＣ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＧＡ 2769 ＧＣＧ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＡＣ ＧＴＴ 2793 ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＣＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＧＴＧ 2817 ＧＴＧ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＧＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＣ 2841 ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＡＣ ＡＡＣ ＧＧＧ 2865 ＴＴＧ ＣＣＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＡＴＧ ＴＴＴ ＡＣＣ 2889 ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＡＡ ＡＣＣ ＣＣＧ 2913 ＡＡＡ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＧＡ ＡＣＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＴＴＧ 2937 ＧＴＴ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＡＣ 2961 ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＣＴ ＴＡＣ ＴＡＣ 2985 ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＣＧ ＧＴＣ ＴＣＧ ＣＣＧ 3009 ＧＡＧ ＧＧＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＴＧ ＣＴＣ ＡＧＴ ＧＧＣ 3033 ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＣＧ ＧＧＧ ＡＴＧ ＣＣＧ 3057 ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＧＧ 3081 ＴＣＧ ＣＧＣ ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＴＧ 3105 ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＣＴ ＡＴＴ ＴＴＧ ＧＡＴ ＣＧＣ ＧＣＴ 3129 ＣＡＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＴＡ ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＡＡ 3153 ＴＴ ＴＴＧ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＣＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＡＧ 3176 ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＧＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＣＣ 3200 ＣＴＴ ＴＴＧ ＴＴＴ ＧＣＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＣＧ ＣＣＧ 3224 ＧＴＴ ＴＡＴ ＴＣＧ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＴＴ ＴＴＡ ＧＡＣ 3248 ＧＣＡ ＴＡＴ ＴＣＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＴＴＡ ＧＡＡ ＡＡＧ 3272 ＧＡＣ ＣＣＧ ＡＣＣ ＴＴＴ ＣＧＧ ＧＣＧ ＧＣＴ ＡＴＡ 3296 ＡＡＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＧ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＡＡ 3320 ＡＡＣ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＧＧ ＧＣＡ ＧＧＧ 3344 ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＧ ＡＡＧ ＧＴＡ ＴＣＧ ＣＴＧ ＡＡＣ 3368 ＴＡＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＣＧ ＣＧＣ ＡＡＣ ＴＧＧ 3392 ＣＡＡ ＡＣＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＴＡＣ ＣＣＧ ＣＡＡ ＡＧＣ 3416 ＧＡＣ ＴＴＴ ＴＴＣ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＴＴ ＴＣＧ ＧＡＧ 3440 ＧＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＡＡ ＴＡＴ ＣＧＣ 3464 ＡＧＣ ＴＡＴ ＴＣＣ ＡＧＴ ＴＣＧ ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＴＧ 3488 ＡＣＧ ＣＡＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＡ 3512 ＧＣＴ ＴＡＣ ＧＣＣ ＡＧＧ ＴＡＣ ＡＡＡ ＧＣＣ ＧＧＣ 3536 ＧＴＧ ＧＣＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＴＣＧ ＧＡＣ 3560 ＧＡＧ ＡＣＧ ＴＡＴ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＴＧ 3584 ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＡＴＴ ＡＡＣ 3608 ＧＣＣ ＴＡＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＣ 3632 ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＴＣ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＣＣ ＧＡＡ 3656 ＧＣＴ ＣＡＡ ＡＡＧ ＧＣＧ ＧＣＴ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＡ 3680 ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＡＴ ＣＧＣ ＣＴＧ 3704 ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＴＴ 3728 ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＴＡ ＴＣＣ ＧＡＡ ＡＣＴ ＣＡＧ ＧＣＧ 3752 ＣＧＣ ＴＡＴ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＡＧ 3776 ＧＴＧ ＡＴＡ ＧＡＡ ＧＣＧ ＣＧＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＴＧ 3800 ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＣＡ ＣＡＧ ＣＧＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＧＡＡ 3824 ＧＴＡ ＡＴＴ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＡＡＣ 3848 ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＴＧ 3872 ＣＧＧ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＣＧ 3896 ＣＣＧ ＴＴＡ ＡＴＣ ＣＣＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＴＴＣ ＧＡＡ 3920 ＧＡＧ ＴＧＧ ＣＡＡ ＡＡＧ ＡＴＣ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＡＧ 3944 ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＴＡ ＴＴＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＣＧ 3968 ＣＧＴ ＣＡＴ ＧＧＣ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＡＧ 3992 ＴＡＴ ＧＡＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＧＧ ＧＣＴ 4016 ＧＧＣ ＴＴＴ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＧ 4040 ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＣＧ ＣＡＴ ＴＣＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＧＡＣ 4064 ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＡＣ 4088 ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＧＴ ＡＣＴ ＧＡＣ ＡＧＣ ＡＴＴ 4112 ＧＧＣ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＣＴ ＡＴＴ 4136 ＴＡＴ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＣＧ ＧＣＡ 4160 ＴＣＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＧＣＧ ＧＣＧ ＣＧＴ 4184 ＴＡＣ ＧＧＧ ＣＡＡ ＧＣＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＴＧ 4208 ＧＡＴ ＧＣＧ ＣＡＡ ＡＣＧ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＣＴＣ 4232 ＡＡＣ ＧＡＴ ＣＴＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＣＡＧ ＴＡＣ ＡＡＴ 4256 ＴＴＧ ＴＧＴ ＡＴＴ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＣＴ ＡＡＡ 4280 ＧＴＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＧＣＧ ＧＴＴ 4304 ＣＡＡ ＴＣＧ ＧＣＧ ＡＣＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＣＧ 4328 ＧＣＧ ＡＣＣ ＣＧＧ ＣＡＡ ＡＧＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＴ 4352 ＧＧＧ ＣＡＡ ＣＧＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＴＧ 4376 ＣＴＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＡＴ 4400 ＡＧＣ ＧＣＡ ＣＡＧ ＧＣＧ ＡＴＴ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＣＴ 4424 ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＣＴ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＴＣＣ 4448 ＴＧＧ ＧＡＴ ＣＡＣ ＣＣＴ ＡＴＴ ＧＡＧ 4466 。

【００６３】配列番号：２ 配列の長さ：５８８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Asn Gln Phe Ile Pro Arg Asn Glu Ile Ala Asp Val Ile Arg Thr 1 5 10 15 Arg Ser Lys Val Phe Trp Thr Val Gly Ile Phe Thr Ala Phe Ile Asn 20 25 30 Leu Leu Met Leu Val Pro Ser Ile Tyr Met Leu Gln Val Tyr Asp Arg 35 40 45 Val Leu Pro Ser Arg Asn Glu Ile Thr Leu Leu Met Leu Thr Leu Ile 50 55 60 Met Leu Gly Met Phe Gly Met Met Ser Leu Leu Glu Tyr Val Arg Ser 65 70 75 80 Met Val Val Ile Arg Ile Gly Ser Gln Leu Asp Met Arg Leu Asn Thr 85 90 95 Arg Val Tyr Thr Ala Ala Tyr Glu Ala Asn Leu Lys Asn Gly Ser Ser 100 105 110 Asp Ala Gly Gln Met Leu Ser Asp Leu Thr Asn Leu Arg Gln Phe Leu 115 120 125 Thr Gly Ser Ala Leu Phe Ala Phe Phe Asp Ala Pro Tyr Phe Pro Ile 130 135 140 Tyr Leu Leu Val Ile Phe Leu Phe Asn Pro Trp Leu Gly Leu Phe Ala 145 150 155 160 Leu Val Gly Ala Leu Leu Leu Ile Ala Leu Ala Val Ile Asn Glu Val 165 170 175 Val Ser Lys Lys Pro Leu Gly Glu Ala Ser Lys Leu Ser Ile Met Ser 180 185 190 Gly Asn Leu Ala Ser Thr Asn Leu Arg Asn Ala Glu Val Ile Glu Ala 195 200 205 Leu Gly Met Leu Pro Asn Leu Lys Arg Arg Trp Phe Gly Leu His Gln 210 215 220 Arg Phe Leu Asn Ser Gln Arg Ile Ala Ser Glu Arg Ala Ser Arg Val 225 230 235 240 Thr Ser Ile Thr Lys Phe Val Arg Met Ser Leu Gln Ser Leu Val Leu 245 250 255 Gly Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ile Asp Gly His Ile Thr Pro Gly Met 260 265 270 Met Ile Ala Gly Ser Ile Leu Met Gly Arg Thr Leu Ala Pro Ile Glu 275 280 285 Gln Val Ile Asn Val Trp Lys Ser Tyr Ser Ala Ala Lys Leu Ser Tyr 290 295 300 Gly Arg Leu Val Lys Leu Leu Glu Thr His Pro Gln Arg Gly Thr Gly 305 310 315 320 Met Ser Leu Pro Arg Pro Glu Gly Val Leu Ser Val Glu Gly Val Thr 325 330 335 Ala Thr Pro Pro Gly Ser Lys Gly Asp Ala Val Leu His Asn Val Ser 340 345 350 Phe Ala Ile Gln Pro Gly Asp Val Leu Gly Ile Ile Gly Pro Ser Ala 355 360 365 Ser Gly Lys Ser Thr Leu Ala Arg Leu Leu Val Gly Ile Trp Pro Val 370 375 380 Ser Glu Gly Ile Val Arg Leu Asp Asn Ala Asp Ile Tyr Gln Trp Asn 385 390 395 400 Lys Asp Glu Leu Gly Pro Tyr Ile Gly Tyr Leu Pro Gln Asp Ile Glu 405 410 415 Leu Phe Ala Gly Thr Ile Ala Glu Asn Ile Ala Arg Phe Asn Asp Ile 420 425 430 Asp Ser Glu Lys Val Ile Glu Ala Ala Lys Leu Ala Gly Val His Glu 435 440 445 Leu Ile Leu Arg Phe Pro Asn Gly Tyr Asp Ser Val Ile Gly Asn Gly 450 455 460 Gly Ala Gly Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Gly Leu Ala Arg 465 470 475 480 Ala Leu Tyr Gly Asp Pro Ala Leu Val Val Leu Asp Glu Pro Asn Ser 485 490 495 Asn Leu Asp Asp Ala Gly Glu Lys Ala Leu Asn Gln Ala Ile Met Phe 500 505 510 Leu Lys Gln Arg Asn Lys Thr Val Val Leu Ile Thr His Arg Thr Asn 515 520 525 Leu Leu Ser Met Thr Ser Lys Leu Leu Leu Leu Val Asn Gly Asn Val 530 535 540 Asn Ala Phe Gly Pro Thr Gln Gln Val Leu Gln Ala Leu Ala Asn Ala 545 550 555 560 Gln Lys Ala Gln Val Pro Pro Gln Ala Val Arg Ala Val Asn Ser Glu 565 570 575 Pro Asp Glu Gly Glu Ile Pro Lys Thr Gln Ile Asn 580 585 。

【００６４】配列番号：３ 配列の長さ：４４３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Thr His Ile Gly Glu Pro Gln Asp Ser Tyr Thr Glu Glu Ile 1 5 10 15 Pro Gln Asp Glu Arg Arg Phe Thr Arg Met Gly Trp Leu Val Val Gly 20 25 30 Ile Gly Leu Phe Gly Phe Leu Ala Trp Ala Ala Phe Ala Pro Leu Asp 35 40 45 Lys Gly Val Ala Ser Pro Gly Ser Val Thr Val Ser Gly Asn Arg Lys 50 55 60 Thr Val Gln Ala Pro Ala Ser Gly Ile Ile Lys Asn Ile Ala Val Arg 65 70 75 80 Asp Gly Asp Lys Val Lys Ala Gly Glu Val Leu Vla Gln Leu Ser Gln 85 90 95 Val Gln Ala Gln Ala Gln Val Asp Ser Leu Arg Asp Gln Tyr Tyr Thr 100 105 110 Thr Leu Ala Thr Glu Gly Arg Leu Leu Ala Glu Arg Asp Gly Leu Ser 115 120 125 Ile Val Thr Pro Ser Phe Ile Leu Asp Ala Val Lys Asp Lys Pro Arg 130 135 140 Val Ala Glu Ile Ile Ala Leu Gln Thr Gln Leu Phe Ala Ser Arg Arg 145 150 155 160 Gln Ala Leu Gln Ser Glu Ile Asp Gly Tyr Lys Gln Ser Met Asp Gly 165 170 175 Ile Arg Phe Gln Leu Lys Gly Leu Gln Asp Ser Arg Gly Asn Lys Gln 180 185 190 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Arg Glu Gln Met Asn Ser Met Lys Gln Leu 195 200 205 Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Arg Asn Arg Tyr Leu Glu Val Gln Arg 210 215 220 Gln Phe Ala Glu Val Asn Ser Ser Ile Asp Glu Thr Val Gly Arg Ile 225 230 235 240 Gly Gln Leu Gln Lys Gln Leu Leu Glu Ser Gln Gln Arg Ile Asp Gln 245 250 255 Arg Phe Ala Asp Tyr Gln Arg Glu Val Arg Thr Gln Leu Ala Gln Thr 260 265 270 Gln Met Asp Ala Ser Glu Phe Arg Asn Lys Leu Gln Met Ala Asp Phe 275 280 285 Asp Leu Gly Asn Thr Ala Ile Thr Ser Pro Val Asp Gly Thr Val Val 290 295 300 Gly Leu Asn Ile Phe Thr Gln Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Asp His 305 310 315 320 Leu Met Asp Val Val Pro Ser Gln Ala Thr Leu Val Val Asp Ser Arg 325 330 335 Leu Lys Val Asp Leu Phe Asp Lys Val Tyr Asn Gly Leu Pro Val Asp 340 345 350 Leu Met Phe Thr Ala Phe Asn Gln Asn Lys Thr Pro Lys Ile Pro Gly 355 360 365 Thr Val Thr Leu Val Ser Ala Asp Arg Leu Val Asp Lys Ala Asn Gly 370 375 380 Glu Pro Tyr Tyr Gln Met Gln Val Thr Val Ser Pro Glu Gly Met Lys 385 390 395 400 Met Leu Ser Gly Glu Asp Ile Lys Pro Gly Met Pro Val Glu Val Phe 405 410 415 Val Lys Thr Gly Ser Arg Ser Leu Leu Ser Tyr Leu Phe Lys Pro Ile 420 425 430 Leu Asp Arg Ala His Thr Ser Leu Thr Glu Glu 435 440 。

【００６５】配列番号：４ 配列の長さ：４３７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列 Leu Ile His Ser Lys Arg Gln Ala Ala Gly Leu Val Ile Gly Thr Leu 1 5 10 15 Leu Phe Ala Met Ser Ala Pro Val Tyr Ser Ile Gly Ile Leu Asp Ala 20 25 30 Tyr Ser Leu Ala Leu Glu Lys Asp Pro Thr Phe Arg Ala Ala Ile Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Ala Gly Asp Glu Asn Glu Asn Ile Gly Arg Ala Gly Leu 50 55 60 Leu Pro Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gln Asn Ser Pro Arg Asn Trp Gln 65 70 75 80 Thr Gln Lys Tyr Pro Gln Ser Asp Phe Phe Gly Asn Val Ser Glu Val 85 90 95 Thr Arg Arg Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Ser Ser Ser Ile Thr Leu Thr 100 105 110 Gln Pro Leu Phe Asp Tyr Glu Ala Tyr Ala Arg Tyr Lys Ala Gly Val 115 120 125 Ala Gln Thr Met Met Ser Asp Glu Thr Tyr Arg Gly Lys Leu Leu Asp 130 135 140 Leu Ala Val Arg Val Ile Asn Ala Tyr Val Glu Val Ala Tyr Ser Lys 145 150 155 160 Asp Gln Ile Ala Leu Ala Glu Ala Gln Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Gln 165 170 175 Leu Thr Leu Asn Asp Arg Leu Met Ser Ala Gly Glu Gly Thr Ile Thr 180 185 190 Asp Val Ser Glu Thr Gln Ala Arg Tyr Ser Leu Ala Glu Ala Gln Val 195 200 205 Ile Glu Ala Arg Asp Ala Leu Asp Ala Ala Gln Arg Gln Leu Glu Val 210 215 220 Ile Ile Gly Met Pro Leu Asn Gln Leu Asp Glu Leu Gln Val Leu Arg 225 230 235 240 Pro Gly Lys Phe Lys Val Ala Pro Leu Ile Pro Ser Lys Phe Glu Glu 245 250 255 Trp Gln Lys Ile Ala Leu Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Ala Ser Arg 260 265 270 His Gly Val Asp Ala Ala Lys Tyr Asp Val Glu Arg Lys Arg Ala Gly 275 280 285 Phe Met Pro Gln Val Gln Leu Tyr Ala Ser His Ser Glu Asn Asp Ala 290 295 300 Ser Ser Asp Asn Thr Val Asn Gln Lys Tyr Arg Thr Asp Ser Ile Gly 305 310 315 320 Val Gln Val Ser Met Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Val Ser Ala Ser 325 330 335 Thr Arg Gln Ala Ala Ala Arg Tyr Gly Gln Ala Met Tyr Glu Met Asp 340 345 350 Ala Gln Thr Gly Thr Thr Leu Asn Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Asn Leu 355 360 365 Cys Ile Ser Ser Ser Ala Lys Val Ala Ala Tyr Glu Leu Ala Val Gln 370 375 380 Ser Ala Thr Thr Gln Val Thr Ala Thr Arg Gln Ser Val leu Ala Gly 385 390 395 400 Gln Arg Val Asn Val Asp Val Leu Asn Ala Glu Gln Gln Leu Tyr Ser 405 410 415 Ala Gln Ala Ile Leu Ala Ser Ala Lys Tyr Thr Tyr Ile Lys Ser Trp 420 425 430 Asp His Pro Ile Glu 435 。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例２で得られた形質転換細胞から単離し
たプラスミドＤＮＡであるｐＰＫＨＥ２００、ｐＰＫＨ
Ｅ７５、ｐＰＫＨＥ３５、ｐＰＫＨＥ９０及びｐＰＫＨ
Ｅ６５の各制限酵素切断地図を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:43） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:43） (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，177 （1995），（22），ｐ．6381−6389 ＥＭＢＯ Ｊ．，９（1990）, （５），ｐ．1375−1382 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，175 （1993），（22），ｐ．7321−7328 Ｇｅｎｅ，121，（1992），（１）, ｐ．47−54 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 C12N 9/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ／Ｄ ＤＢＪ／ｐｉｒ／ＪＰＯａａ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）配列番号１記載の塩基配列を有す
   るＤＮＡからなるか、又は（２）配列番号１記載の塩基
   配列を有するＤＮＡから、ＤＮＡの挿入、欠失、置換に
   基づいて得られる配列を有するＤＮＡからなる、セラチ
   ア属微生物のエステラーゼ分泌機構に関与するポリペプ
   チドをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮ
   Ａからなる、セラチア属微生物のエステラーゼ分泌機構
   に関与するポリペプチドをコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号２、配列番号３及び配列番号４
   記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
   ＤＮＡからなる、セラチア属微生物のエステラーゼ分泌
   機構に関与するポリペプチドをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項１、２又は３記載の遺伝子をベク
   タープラスミドに組込んでなる組換えプラスミド。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えプラスミドを含む
   形質転換微生物。
6. 【請求項６】 セラチア属微生物のエステラーゼをコー
   ドする遺伝子と請求項１、２又は３記載の遺伝子とを単
   一のベクタープラスミドに組込んでなる組換えプラスミ
   ドを含む形質転換体。
7. 【請求項７】 セラチア属微生物のエステラーゼをコー
   ドする遺伝子をベクタープラスミドに組込んでなる組換
   えプラスミドと請求項１、２又は３記載の遺伝子をベク
   タープラスミドに組込んでなる組換えプラスミドとをと
   もに含む形質転換体。
8. 【請求項８】 宿主微生物がセラチア属微生物またはエ
   シェリシア属微生物である請求項６又は７記載の形質転
   換体。
9. 【請求項９】 請求項６又は７記載の形質転換体を培地
   で培養し、菌体内又は培地に蓄積したエステラーゼを分
   離・採取することを特徴とするエステラーゼの製法。