CN117003836A - 乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白及其调控方法 - Google Patents

乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白及其调控方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白及其调控方法。乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过EMSA实验证实CodY蛋白与支链醛代谢相关基因启动子区域的结合；通过DNase I足迹分析实验获得CodY结合位点的准确序列；通过CodY敲除与异亮氨酸饥饿胁迫实验发现CodY通过感知细胞内异亮氨酸浓度发挥多效调控作用，敲除CodY可以获得支链醛高产突变株，3‑甲基丁醛和2‑甲基丁醛产量相比野生型分别提高了38.3％和58.8％。

Description

乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白及其调控 方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白及其调控方法。
背景技术
近年来奶酪在我国销售量呈稳步增长的趋势，2017年至2021年，我国奶酪零售渠道销售额从52亿元增长到131亿元。奶酪风味是决定消费者接受度的一个关键因素，尤其是奶酪中的“坚果味”受到了消费者的偏爱。研究发现坚果风味的主要来源是支链醛，包括2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和2-甲基丙醛，是许多乳制品中坚果风味的主要来源。乳酸乳球菌是产生支链醛的主要菌株之一。乳酸乳球菌在乳制品环境中通过蛋白水解酶系统将酪蛋白降解为支链氨基酸。支链氨基酸在乳酸乳球菌中通过相似的途径产生支链醛。如亮氨酸经支链氨基酸氨基转移酶催化转化为中心代谢物α-酮异己酸，然后通过不同的代谢途径生成3-甲基丁醛。α-酮酸脱羧酶催化α-酮异己酸非氧化脱羧，直接合成3-甲基丁醛的途径是3-甲基丁醛生物合成的主要途径。间接途径中α-酮异己酸经α-酮酸脱氢酶氧化脱羧生成异戊酰辅酶a，再经磷酸转移酶、乙酸激酶、乙醛脱氢酶等催化逐步生成3-甲基丁醛。
由于支链醛对奶酪风味的重要性，已引起了研究者的广泛关注，并提出了促进3-甲基丁醛生物合成的方案。在以往的研究中，已经提出了包括添加附属发酵剂、添加前体物或辅因子、基因工程手段、改变物理化学条件等多种调控支链醛产量的方法。虽然这些方法可以促进支链醛的合成，但是现有技术中并没有CodY是否对乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)代谢氨基酸起全局调控作用以及如何调控CodY来提高乳酸乳球菌生物合成支链醛的方案。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)生物合成支链醛的全局转录调控蛋白及其调控方法。
具体而言，本发明研究发现CodY作为全局调控因子对乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)代谢氨基酸起全局调控作用，基于此，本发明提供了一种通过敲除全局调控因子(即CodY)提高奶酪中乳酸乳球菌支链醛生物合成产量的方法，同时提供该基因敲除载体以及CodY基因敲除乳酸乳球菌菌株的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供的技术方案之一是：
提供一种乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示；或为由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质与蛋白纯化标签组成的融合蛋白。
本发明所述的蛋白质是一种全局转录调控蛋白，名称为CodY，来源于L.lactis408；其中，L.lactis 408具体为一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，其生物学名称为：Lactococcus lactis，于2021年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，邮编：430072，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021742，在专利CN113832075A中有公开。其具有高产坚果风味化合物的能力，其可以通过本领域常规的方法获得，如将编码所述蛋白质的基因导入合适的宿主细胞得到能够正常表达所述蛋白质的转化体，然后培养所述的转化体，从培养物中分离所述蛋白质即可。所述的蛋白质还可以通过人工全序列合成而得。
如本领域技术人员所知：所述蛋白质的氨基酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加一个或多个氨基酸而得所述蛋白质的同系物，只要该蛋白质的同系物依然能够保持所述蛋白质的功能即可。
在本发明的一些实施方式中，所述的蛋白纯化标签为本领域常规所述，较佳地为His6纯化标签，即本发明所述的融合蛋白较佳地为由氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质与His6纯化标签组成的融合蛋白。
本发明提供的技术方案之二是：
提供一种分离的核酸，其编码一种分离的蛋白质，所述的分离的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质与蛋白纯化标签组成的融合蛋白。
其中所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质的核酸分子，或者通过基因克隆技术获得编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示的蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示的蛋白质的核酸分子。
优选地，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的技术方案之三是：
提供一种包含上述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将上述核酸分子连接于各种大肠杆菌表达载体上构建而成。所述的大肠杆菌表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒，本发明所述载体更优选为质粒pET-28a(+)，即本发明所述的重组表达载体更优选为将上述核酸连接于质粒pET-28a(+)上构建而成。
在本发明的一个实施方式中，所述的重组表达载体含有一段His6的序列。
本发明提供的技术方案之四是：
提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规，如可以通过将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且使所携带的编码氨基酸序列组成如序列表中SEQ ID NO.1所示蛋白质的基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。将前述重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规的转化方法，较佳地为化学转化法、热激法或电转法。
本发明提供的技术方案之五是：
提供一种重组菌，其基因组中含有能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ IDNO.1所示蛋白质的外源基因。
本发明提供的技术方案之六是：
提供一种L.lactis 408的基因敲除菌株。
本发明实现L.lactis 408的基因敲除所采用的技术方案是：构建含有卡那霉素抗性基因的pLL25质粒。
上述敲除质粒是通过将L.lactis 408染色体上要敲除的靶基因全局转录调控蛋白基因CodY上游和下游、大小约为lkb的同源序列片段按次序连接至pLL25的多克隆位点上。
上述敲除质粒通过电转化进入L.lactis 408得到含敲除质粒的菌株的方法是将lμg敲除质粒与50μL乳酸乳球菌感受态细胞混合，在25μF、200Ω、2kV条件下电击，点击时间为4ms，电击后迅速将菌液转移到950μL的复苏液并冰上放置10min后转移到30℃培养箱中培养2-3h，将复苏液涂布在含10μg/mL红霉素的GM17平板，30℃培养5天左右长出，挑取单菌落进行PCR验证筛选出阳性克隆。
在30℃下培养，在目的基因同源臂两侧设计引物进行菌落PCR，筛选出目的基因(全局转录调控蛋白基因CodY)缺失的突变菌株，在不含红霉素的平板上划线2-3次，直至获得消除基因编辑质粒的突变株L.lactis 408ΔcodY。
本发明提供的技术方案之七是：
提供一种提高支链醛生物合成产量的方法，步骤为：
在乳酸乳球菌中敲除全局转录调控蛋白基因CodY，提高kdcA、bacT基因的表达，获得支链醛高产突变株，所述突变株称之为L.lactis 408ΔcodY；
利用突变株生物合成支链醛。
在本发明的一个实施方式中，所述全局转录调控蛋白基因CodY序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还对L.lactis 408和L.lactis 408ΔcodY合成支链醛能力进行验证
作为本发明的一个实施方案，在L.lactis 408中敲除全局转录调控蛋白基因，得到基因敲除突变株；将基因敲除突变株在GM17固体培养基上活化，然后将活化后的菌体在GM17液体培养基中30℃过夜培养，4℃，8000×g离心10min获得稳定早期细胞。获得的菌体使用100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)洗涤两次，加入到CDM培养基中，测定其在600nm处的菌体密度，将没有细胞的混合物培养液作为对照管测定，使得最终菌体在600nm的光密度值达到20。
作为本发明的一个实施方案，所述CDM培养基含有10mmol/Lα-酮戊二酸，0.2mmol/L NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，0.1mmol/L的5-磷酸吡哆醛和18种氨基酸(10mmol/L，丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸和蛋氨酸)。
CodY是许多革兰氏阳性细菌中的一种全局调控因子，广泛存在于低G+C含量的革兰氏阳性细菌中，最初鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中二肽转运操纵子表达的负调控因子。乳酸乳球菌的全局转录调节因子CodY通过感知细胞内异亮氨酸的浓度发挥调控作用。蛋白质水解和氨基酸的进一步降解受到CodY的调控，支链氨基酸是乳酸乳球菌中支链醛生物合成的重要前体。因此CodY可能调控乳酸乳球菌支链醛生物合成。本发明研究了CodY对氨基酸代谢的调控，以及对奶酪风味的影响。
CRISPR/Cas系统最早可追溯至1987年，科学家发现在大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近存在重复序列，用于对抗病毒的入侵和外源DNA。根据Cas蛋白的不同分为三种主要类型，分别为I型、II型和III型，而CRISPR/Cas9是基于II型CRISPR系统开发而来的，主要由RNA导向的Cas9核酸内切酶、一条导向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)组成。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，引导Cas9蛋白至靶序列上，Cas9蛋白的两个功能域可以发挥内切酶的切割作用，即HNH和RuvC结构域，分别切割基因组上与crRNA的互补链和非互补链，造成DNA的双链断裂(doublestrandbreak，DSB)，从而启动细胞内的DNA损伤修复机制，导致修复后发生插入/缺失，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的，目前该技术已经成熟的运用于原核及真核生物的基因组编辑中。本发明利用CRISPR/Cas技术实现了L.lactis 408的基因敲除。
本发明通过EMSA实验证实CodY蛋白与支链醛代谢相关基因启动子区域的结合；通过DNase I足迹分析实验获得CodY结合位点的准确序列；通过CodY敲除与异亮氨酸饥饿胁迫实验发现CodY通过感知细胞内异亮氨酸浓度发挥多效调控作用，敲除CodY可以获得支链醛高产突变株，3-甲基丁醛和2-甲基丁醛产量相比野生型分别提高了38.3％和58.8％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)通过EMSA实验证明了全局转录调控蛋白CodY与支链醛合成相关基因启动子区域的结合，验证了全局转录调控蛋白CodY在生物合成支链醛时所发挥的调控作用。
2)通过在乳酸乳球菌中，利用基因敲除载体pLL25，通过敲除全局转录调控蛋白基因CodY，可以提高支链醛生物合成关键基因kdcA、bacT基因的表达，从而提高支链醛产量。
3)通过在L.lactis 408中敲除全局转录调控蛋白基因CodY，使3-甲基丁醛和2-甲基丁醛发酵产量分别提高了38.3％和58.8％，在氨基酸培养基中发酵24h后浓度分别达到176.00μM和47.83μM。
附图说明
图1为利用RSAT软件生成L.lactis 408中CodY结合位点的一致序列基序；
图2中编号“1”的泳道为PCR产物；编号“2”的泳道为pET-28经限制性内切XhoI和NdeI酶切后的电泳图；M为DL 10000DNA Marker；
图3为重组蛋白表达鉴定及纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中，M为蛋白Marker；编号“1”的泳道为大肠杆菌BL21-codY诱导前细胞的破碎上清；编号“2”的泳道为大肠杆菌BL21-codY诱导后的细胞破碎上清；3为目的蛋白经纯化后的电泳结果；
图4为表达载体pET-28-codY的构建示意图；
图5、图6为验证三个启动子区域CodY-DNA结合的EMSA实验结果图；
图7为对关键基因启动子区域标记的探针和重组蛋白CodY的DNase I足迹分析结果图；
图8为用于基因敲除的pLL25-P23-codY质粒图谱结构示意图；
图9为L.lactis 408与敲除全局转录调控蛋白基因CodY突变株L.lactis408ΔcodY的PCR产物电泳图和测序结果比对图，L.lactis 408和L.lactis 408ΔcodY的菌落PCR产物长度分别为3.0kb和2.2kb，测序文件显示了该突变株的测序结果。
图10为L.lactis 408与敲除全局转录调控蛋白基因CodY突变株L.lactis408ΔcodY支链醛合成产量示意图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：CodY结合位点的预测
通过BPROM(http://www.softberry.com)启动子预测确定bcaT、kdcA和pdhABCD的-10和-35序列。使用调控序列分析工具(RSAT,http://rsat.ulb.ac.be/rsat/)分析CodY的TFBSs的共识基序。基于L.lactis IL1403中CodY结合位点的分析，利用RegPrecise(http://regprecise.lbl.gov/RegPrecise/)数据库扫描L.lactis 408基因组的所有上游区域，确定了这些基序。构建PFM和序列标识收集TFBSs，并在乳酸乳球菌支链醛生物合成相关基因上游区域寻找可能的TFBSs。根据每个位置核苷酸的权重计算预测位点的得分，并表示与共识序列的相似性。一般情况下，>5可以认为是CodY的结合位点。
结果分析：研究表明，CodY可以通过直接与CodY结合位点结合来调控靶基因的转录。目前，在许多菌株中都发现了CodY调控基因及其结合位点。在回归精确数据库的基础上，找到了CodY的保守共识基序，并使用RSAT对PFM/序列标识进行了转换(图1A)。
利用生成的PFM对L.lactis 408基因组进行搜索，在严格条件下发现了131个CodY结合位点(p<0.00001)。值得注意的是，在PbcaT、PkdcA和PpdhABCD区域中分别发现了两个假定的结合位点。这6个候选位点的得分均大于5分，表明这些位点可能是CodY的潜在结合位点(图1B)。
实施例2：CodY表达菌株E.coli BL21-His6-CodY的构建
以L.lactis 408的基因组DNA为模板，使用引物CodY-F/R，PCR扩增得到CodY基因片段(789bp)，回收PCR产物。将表达质粒pET-28进行双酶切(XhoI和NdeI)，酶切体系参照限制性内切酶说明书，回收纯化酶切产物。将纯化后的酶切产物进行连接，连接体系：5μL酶切产物(载体)(27.156ng/μL)、1μL扩增产物(180.271ng/μL)、2μL ExnaseⅡ重组酶、4μL 5×Buffer、8μLddH2O，反应条件：37℃、30min。采用热激转化法将连接反应液转化到加大肠杆菌BL21感受态细胞中，加入lb培养基，经37℃、200rpm、60min摇床振荡培养后，室温4000rpm离心5min，再涂布到含50μg/mL卡那抗性的LB培养基上，37℃培养24h。筛选阳性克隆并进行测序鉴定，得到正确的目标重组表达载体，将其命名为pET-28-codY，该重组表达载体包含一种核酸，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，该核酸编码一种分离的蛋白质，所述的分离的蛋白质为包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质与蛋白纯化标签His6的融合蛋白，相应的重组菌命名为BL21-His6-CodY。
结果分析：
以L.lactis 408的基因组DNA为模板PCR扩增得到CodY基因片段，PCR产物电泳图如图2编号“1”泳道所示。将载体pET-28-codY进行双酶切(XhoI和NdeI)，回收纯化后酶切产物电泳图如图2编号“2”泳道所示。表达载体pET-28-codY构建示意图如图4所示。将重组质粒连接物转化至E.coli BL21，37℃平板培养24h，挑选阳性转化子接种至LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体，提取重组质粒，用对应的限制性内切酶对重组质粒进行鉴定。使用引物CodY-F/R进行PCR扩增，得到800bp左右的目的基因片段，证明表达载体pET-28-codY成功转入大肠杆菌BL21宿主菌中。阳性表达宿主命名为BL21-His6-CodY。
实施例3：CodY表达与EMSA实验
CodY表达菌株E.coli BL21-His6-CodY在含卡那霉素(50μg/mL)的LB肉汤中培养至OD600为0.6。加入最终浓度为1mM的异丙基-β-d-硫半乳糖吡喃苷，在28℃下有氧培养4小时。诱导后收集细胞，用A溶液(含磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、7.5％甘油和1mM苯基甲基磺酰氟)洗涤一次，并在A溶液中重悬。在珠状细胞干扰系统JY96-IIN中超声10分钟后裂解细胞，每个细胞超声2秒，休息2秒。在4℃下，通过12000×g离心10min去除细胞碎片。可溶性提取物用0.9％(w/v)硫酸链霉素处理以去除核酸和核糖体。使用HisTrap FF Crude(用于纯化组氨酸标记的重组蛋白)洗脱杂质蛋白和洗脱缓冲液(含20mM PBS缓冲液、500mM Nacl和不同浓度咪唑)，用不同浓度咪唑洗脱带有组氨酸标记的靶蛋白。
采用T7(FAM)和SP6引物，用Dpx DNA聚合酶(TOLO Biotech,Shanghai)分别从pGM-T-bcaT、pGM-T-kdcA和pGM-T-pdhABCD质粒上PCR扩增PbcaT、PkdcA和PpdhABCD质粒的启动子区，制备FAM荧光标记探针。fam标记探针用SV凝胶和PCR清理系统纯化，并用NanoDrop 2000C定量。
EMSA实验反应体系为20μL，含有50ng标记探针、不同蛋白浓度和结合缓冲液。根据需要将支链氨基酸(BCAAs)添加到结合缓冲液中。结合缓冲液含有50mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM KCl,2.5mM MgCl2,0.2mM DTT,2μg鲑鱼精DNA和10％甘油。在25℃反应30min后，将反应体系置于4％琼脂糖凝胶和0.5×TBE缓冲液中的Native-PAGE中。使用ImageQuant LAS 4000mini扫描凝胶观察标记探针。
结果分析：为了研究CodY是否能直接与bcaT、kdcA和pdhABCD的调控区结合，进行了电泳迁移率移位实验。在重组菌株BL21-His6-CodY中表达纯化CodY，以关键基因的T载体制备生物素标记探针。EMSA前用SDS-PAGE和Bradford protein kit检测蛋白纯度和浓度，尽量降低盐浓度，以免影响CodY与探针的结合。
根据预测的结合位点进行EMSA实验，纯化6组氨酸标记的重组蛋白CodY。如图5所示，所有通道均含有50ng标记探针，在含有单一支链氨基酸且不含CodY的通道中未观察到条带移位(图5a,b,c泳道1-4)，而含有2μg CodY蛋白且不含支链氨基酸且含有亮氨酸或缬氨酸的通道中观察到条带移位(图5a,b,c泳道7-9)。在仅含有CodY蛋白、BCAAs或异亮氨酸的通路中观察到更强的移位(图5a,b,c泳道5-6)，在仅含有BCAAs和异亮氨酸的通路中观察到同样的移位。与不含CodY相比，含有0.5、1、2μg CodY和10mM异亮氨酸的条带，随着蛋白质含量的增加，蛋白质-DNA复合物逐渐增加。在包含标记探针和未标记探针的泳道中，移位的条带完全消失(图6a,b,c泳道6)。EMSA实验表明，CodY分别能特异性结合bcaT、kdcA和pdhABCD的启动子区域。
实施例4：DNaseI足迹分析。
为了获得CodY结合位点的准确序列，对三个关键基因启动子区标记的探针和重组蛋白CodY进行了DNaseI足迹分析。
利用M13F(FAM)和SP6引物，从质粒pGM-T-bcaT、pGM-T-kdcA和pGM-T-pdhABCD上，用2倍TOLOHIFIDNA聚合酶预混剂PCR扩增启动子区，制备FAM荧光标记探针。FAM标记探针用SV Gel和PCR清理系统纯化，并用NanoDrop 2000C定量。
450ng探针与2μg重组CodY蛋白和10mM异亮氨酸在与前面描述的EMSA相同的缓冲液中反应，总体积为40μL。在25℃反应30min后，加入10μL含有0.015单位DNase I和100nmol新鲜制备的CaCl2的溶液，在37℃下进一步反应1min。加入140μL DNase I停止溶液(200mM未缓冲的醋酸钠，30mM EDTA和0.15％SDS)停止反应。样品先用苯酚/氯仿提取，再用乙醇沉淀。将微球溶解于30μL MiniQ水中。DNA梯的制备、电泳和数据分析与前面所述的相同，除了使用GeneScan-LIZ600尺寸标准。
结果分析：为了获得准确的CodY结合位点的准确序列，对关键基因启动子区域标记的探针和重组蛋白CodY进行了DNase I足迹分析。CodY保护的结合区未被DNaseI消化。与没有CodY的测序信号相比，CodY的加入减弱了结合区域的测序信号，在峰值图上出现了峰递减区域(图7)。如图7所示，根据测序峰图，发现一个15bp的CodY结合位点(bcaT为“TATTATAACAAAAAA”，kdcA为“TATTTAAAGAAAGAGC”)分别位于bcaT和kdcA启动子区-35box附近。在pdhABCD的启动子区获得了两个结合位点(结合位点I“AACCTTAGGAAATTT”和结合位点II“TATTATGTCAAATTC”)。结合位点I位于-35box附近，结合位点II位于-35box上游72bp。因此，CodY调控的主要结合位点在启动子的-10和-35区域，有利于转录调控的作用，可能通过调控RNA聚合酶活性激活或抑制基因表达。
实施例5：敲除全局转录调控蛋白基因CodY突变株L.lactis 408ΔcodY的构建。
步骤一：质粒pLL25-P23-codY的构建
以L.lactis 408的基因组DNA为模板，使用引物CodY-HA-1-F/R，PCR扩增得到CodY左侧1000bp基因片段，使用引物CodY-HA-2-F/R，PCR扩增得到CodY右侧1000bp基因片段。以E.coli pLL25的基因组DNA为模板，使用引物sgRNA-F/R，PCR扩增得到长度为103bp的sgRNA片段。在质粒pLL25的pLL25的ApaI/XbaI位点按序插入三个基因片段得到质粒pLL25-P23-codY，参考图8。
步骤二：全局转录调控蛋白基因CodY的敲除
将已构建完成的基因敲除的质粒pLL25-P23-codY通过电击转化法转入L.lactis408中。将转化后的细胞涂布在含10μg/mL Em抗性的GM17平板上，30℃静置培养24-36h后挑取单菌落，培养后提取基因组，采用CodY-KO-YZ-F和CodY-KO-YZ-R为引物，通过PCR筛选基因敲除突变株，并通过测序确认。在30℃无抗生素存在的条件下连续传n代使pLL25-P23-codY丢失，通过抗生素抗性分析和PCR鉴定，最终得到CodY基因敲除的突变株L.lactis 408ΔcodY。
上述步骤一、二中所用到的引物序列如表1所示。
表1本发明中所用引物
结果分析：L.lactis 408与敲除全局转录调控蛋白基因CodY突变株L.lactis 408ΔcodY的PCR产物电泳图和测序结果比对如图9所示，L.lactis 408和L.lactis 408ΔcodY的菌落PCR产物长度分别为3.0kb和2.2kb，表明全局转录调控蛋白基因CodY被成功敲除，测序文件也确认了该结果。
实施例6：RNA提取及RT-qPCR分析。
当CDM,CDM-Ile,CDM-Leu和CDM-Val培养基中的L.lactis 408和L.lactis 408ΔCodY菌株生长到16小时，根据制造商的说明通过Trizol试剂进行总RNA的分离。RNA浓度和完整性分别用分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳测定。RNA用PrimeScript RT试剂盒和gDNAEraser处理，清除基因组DNA，然后通过逆转录反应合成cDNA。
采用TB Green Premix Ex Taq II试剂盒对bcaT、kdcA和pdhD进行RT-qPCR实验。RT-qPCR分析时，将生成的cDNA与0.2μM基因特异性引物(见表1)混合，使用AppliedBiosystemsTMQuantStudioTM3在95℃下扩增30s，然后在95℃扩增5s,60℃扩增30s，循环40次。所有样品均重复测量三次。基因表达采用2-ΔCT法归一化，以甘油醛-3-磷酸脱氢基因(GAPDH)为归一化标准。
结果分析：RT-qPCR结果显示，与CDM培养基培养的L.lactis 408相比，异亮氨酸饥饿胁迫使kdcA、bcaT和pdhD的表达水平分别提高了1.38倍、0.43倍和0.26倍(表2)。而在缺少缬氨酸和亮氨酸的情况下，关键基因的表达水平没有增加。与CDM培养基培养的L.lactis408相比，CDM培养基培养的L.lactis 408ΔcodY中bcaT和kdcA的转录水平分别提高了0.84倍和7.47倍，而pdhD的表达水平下降了31％(表2)。在CDM-Leu、CDM-Ile和CDM-Val培养基中培养L.lactis408ΔcodY的关键基因表达量与在CDM培养基中相同。bcaT和kdcA基因的表达水平高于CDM培养基培养的L.lactis 408，而pdhD基因的表达水平低于CDM培养基培养的L.lactis 408。结果表明，CodY抑制bcaT和kdcA的表达，提高pdhD的表达，CodY通过感知细胞内异亮氨酸浓度发挥多效调控作用。
表2不同培养条件下L.lactis 408和L.lactis 408ΔcodY的相对转录丰度
以GAPDH为内标，采用2-ΔCt法计算基因的相对表达量。数据基于三次实验，并计算了均值和标准差。根据Duncan计算方法，不同字母的行间存在显著性差异(p<0.05)。
实施例7：气相色谱-质谱联用法测定支链醛。
为了测定L.lactis 408和L.lactis 408ΔcodY产生支链醛的能力，将其在GM17肉液中培养过夜，并在4℃下以8000×g离心10分钟。用100mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)清洗菌体两次并用相同缓冲液重新悬浮，加入CDM培养基中，直到OD600为20。在30℃培养24小时后取出，用液氮快速冷冻，并在-80℃保存。
样品在30℃水浴中融化后进行GC-MS检测，以无菌CDM培养基作为对照进行GC-MS分析，每个样品测量三次。使用50/30μm的DVB/CAR/PDMS三合一萃取头进行萃取，在玻璃小瓶的顶空中测量3-甲基丁醛和2-甲基丁醛的浓度。在55℃下平衡20min后，通过暴露于顶部空间40min将挥发性化合物浓缩到纤维上。然后通过使用热解吸系统(250℃，5min)将化合物从注射器针头解吸到注射器中，然后在-110℃下冷冻聚焦到分析柱的顶部。随后将冷阱快速加热至250℃,并使样本在DB-蜡毛细管柱(30.0m×320μm×0.25μm)上分离。将固相微萃取纤维在250℃下引入分流注射器中。GC注射参数如下：注射体积，1μL；分流，10:1；氦气流速，1.2mL/min；40℃，3min，以3℃/min升温至70℃，等温2min，然后以10℃/min升至240℃，最后等温10min。用于分析的MS参数如下：传输线的温度，250℃；离子源，电子轰击模式；电子能量，70eV；离子阱温度，230℃和全扫描模式(35-450m/z)。
结果分析：在30℃培养24h后，L.lactis 408及L.lactis 408ΔCodY均检测到3-甲基丁醛和2-甲基丁醛。与L.lactis 408相比，L.lactis 408ΔCodY的3-甲基丁醛和2-甲基丁醛产量显著提高。L.lactis 408中3-甲基丁醛和2-甲基丁醛的产量分别为127.27μM和30.12μM,L.lactis 408ΔCodY中3-甲基丁醛和2-甲基丁醛的产量分别为176.00μM和47.83μM，产量分别提高38.3％和58.8％(见图10)。
本发明中涉及的两个序列如下：
SEQ ID NO.1
VATLLEKTRKITAILQDGVTDLQQELPYNSMTERLANVIDCNACVINTKGELLGY
SLPYN
TNNDRVDQFFYDRKLPDEYVRAAVRIYDTMANVPVDRPLAIFPEESLGDFPKGV
TTLAPI
YGSGMRLGTFIMGA
SEQ ID NO.2
GTGGCTACATTACTTGAAAAAACACGTAAAATCACCGCGATTTTGCAAGATG
GAGTGACCGATTTGCAACAAGAGTTGCCATATAACAGTATGACTGAACGCTT
GGCAAACGTCATTGATTGCAATGCATGTGTGATTAATACGAAGGGCGAGTTGC
TTGGTTACTCATTGCCTTATAATACAAACAATGACCGTGTTGACCAATTTTTCT
ATGATCGTAAATTGCCTGATGAATATGTTCGTGCGGCAGTACGTATCTACGATA
CAATGGCAAACGTTCCTGTTGACCGTCCATTAGCAATCTTCCCAGAAGAAAG
CCTTGGCGATTTTCCAAAAGGTGTGACAACTTTAGCACCTATTTATGGTTCTG
GAATGCGTTTGGGAACATTTATCATGTGGCGTGAAGACGGCGAATTCACTGAT
GATGATTTGGTCTTAGTTGAACTTGCAACAACAGTAATTGGTGTTCAACTCTC
AAATCTTAAACTTGAACAAATGGAAGAAAATATCCGTAAAGACACCATGGCA
ACTATGGCTGTTAACACACTTTCATATTCAGAAATGAAAGCTGTTAAAGCAAT
CATTGAAGAGCTTGATGGTGAAGAAGGGCATGTTATCGCTTCTGTCATTGCTG
ACAAGATTGGGATTACACGTTCAGTCATCGTTAACGCTTTGCGTAAACTCGAA
TCTGCTGGTGTAATTGAATCACGTTCACTTGGTATGAAAGGAACTTATCTTAA
AGTTCTTAATACTGGTTTATTTGATAAACTTGCAGGACGTAATTTCTAA
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质与蛋白纯化标签组成的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸乳球菌生物合成支链醛的全局转录调控蛋白，其特征在于，所述蛋白纯化标签为His6纯化标签。
3.一种分离的核酸，其特征在于，其编码一种分离的蛋白质，所述的分离的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质与蛋白纯化标签组成的融合蛋白。
4.一种包含如权利要求3所述核酸的重组表达载体。
5.一种包含如权利要求4所述重组表达载体的重组表达转化体。
6.一种重组菌，其特征在于，其基因组中含有能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQID NO.1所示蛋白质的外源基因。
7.一种L.lactis 408的基因敲除菌株，其特征在于，所述L.lactis 408的基因敲除菌株是指敲除掉靶基因全局转录调控蛋白基因CodY的L.lactis 408菌株，所述全局转录调控蛋白基因CodY的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种提高支链醛生物合成产量的方法，其特征在于，步骤为：
在乳酸乳球菌中敲除全局转录调控蛋白基因CodY，提高kdcA、bacT基因的表达，获得支链醛高产突变株，所述全局转录调控蛋白基因CodY的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
利用突变株生物合成支链醛。
9.根据权利要求8所述的一种提高支链醛生物合成产量的方法，其特征在于，在L.lactis 408中敲除全局转录调控蛋白基因CodY，得到基因敲除突变株；将基因敲除突变株在GM17固体培养基上活化，然后将活化后的菌体在GM17液体培养基中30℃过夜培养，离心获得菌体，获得的菌体使用磷酸钠缓冲液洗涤，加入到CDM培养基中培养，利用突变株生物合成支链醛。
10.根据权利要求9所述的一种提高支链醛生物合成产量的方法，其特征在于，所述CDM培养基含有10mmol/Lα-酮戊二酸，0.2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.1mmol/L的5-磷酸吡哆醛和含量分别为10mmol/L的丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸和蛋氨酸。
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