JP2002517252A - 大腸菌中で異種タンパク質を産生させる工業的方法及び該方法に有用な菌株 - Google Patents
大腸菌中で異種タンパク質を産生させる工業的方法及び該方法に有用な菌株Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は大腸菌中で異種タンパク質を産生させる工業的方法に関する。方法は、適正な異種タンパク質発現系によって修飾された大腸菌の菌株を適切な培養培地に播種して培養する段階から成り、大腸菌の菌株が大腸菌Ｗ株であることを特徴とする。
Description
【０００１】 本発明は、大腸菌中で異種タンパク質を産生させる新規な工業的方法に関する
。極めて高い付加価値を有する幾つかの異種タンパク質の場合にはそれらの最終
目的（例えば医薬の分野）から見ればそれらの製造原価は取るに足りない要因で
あるかもしれないが、より低い付加価値の異種タンパク質を大腸菌中で産生させ
る工業的方法の開発では、培地の種類、エネルギー効率、試薬の効率、処理条件
などを含めたコストをできるだけ削減しながら、高密度バイオマス及び高含量異
種タンパク質などの所望の製造目的を達成しなければならない。数１０ｍ３に達
し得る反応容量で行われる工業的産生の場合、培地及び処理条件をできるだけ簡
単にするのが望ましい。本発明の目的は、産生されるタンパク質の価値に関わり
なく、異種タンパク質の十分に経済的な工業的産生に不可欠な上記のような条件
を満たし得る大腸菌の適切な菌株を選択することである。
。極めて高い付加価値を有する幾つかの異種タンパク質の場合にはそれらの最終
目的（例えば医薬の分野）から見ればそれらの製造原価は取るに足りない要因で
あるかもしれないが、より低い付加価値の異種タンパク質を大腸菌中で産生させ
る工業的方法の開発では、培地の種類、エネルギー効率、試薬の効率、処理条件
などを含めたコストをできるだけ削減しながら、高密度バイオマス及び高含量異
種タンパク質などの所望の製造目的を達成しなければならない。数１０ｍ３に達
し得る反応容量で行われる工業的産生の場合、培地及び処理条件をできるだけ簡
単にするのが望ましい。本発明の目的は、産生されるタンパク質の価値に関わり
なく、異種タンパク質の十分に経済的な工業的産生に不可欠な上記のような条件
を満たし得る大腸菌の適切な菌株を選択することである。
【０００２】 分子生物学の研究に最も頻用されている大腸菌の菌株は、Ｋ１２株から誘導さ
れた菌株である（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｐｐ１６９３−１７１１）。ＢＬ２１のような大腸菌Ｂ
株から誘導された菌株もその有利な生理的特性を利用してタンパク質の産生に使
用されている。組換えタンパク質の産生に最も頻用されている菌株の一覧表がＷ
ｉｎｇｆｉｅｌｄ，１９９７によって提示されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｅ
ｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．５．０．１−５．０．３）
。
れた菌株である（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｐｐ１６９３−１７１１）。ＢＬ２１のような大腸菌Ｂ
株から誘導された菌株もその有利な生理的特性を利用してタンパク質の産生に使
用されている。組換えタンパク質の産生に最も頻用されている菌株の一覧表がＷ
ｉｎｇｆｉｅｌｄ，１９９７によって提示されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｅ
ｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．５．０．１−５．０．３）
。
【０００３】 細菌宿主中でタンパク質を発現させる多数の系が文献に記載されている（Ｍａ
ｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８
；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１
９９６，７）。発現系は、プロモーター及びそのレギュレーター、リボソーム固
定部位及びその下流で有益な遺伝子が挿入され得る制限部位、転写ターミネータ
ーとして機能し得る構造、超発現した有益なタンパク質の品質を同時発現によっ
て改善すべく任意に存在する遺伝子、並びに、これらの組合せを宿主に導入し得
る１つまたは複数のベクターとから構成されている。
ｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８
；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１
９９６，７）。発現系は、プロモーター及びそのレギュレーター、リボソーム固
定部位及びその下流で有益な遺伝子が挿入され得る制限部位、転写ターミネータ
ーとして機能し得る構造、超発現した有益なタンパク質の品質を同時発現によっ
て改善すべく任意に存在する遺伝子、並びに、これらの組合せを宿主に導入し得
る１つまたは複数のベクターとから構成されている。
【０００４】 タンパク質の産生に使用可能なプロモーターは少なくとも３つの特徴を有して
いなければならない（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，前出）： −プロモーターが強いプロモーターであり、宿主細胞の全タンパク質の１０−５
０％を占める有益なタンパク質を蓄積できる； −プロモーターがバイオマスの産生段階とタンパク質の産生段階とをできるだけ
分離するように調節され得る； −プロモーターが簡単で廉価な処理条件で誘導（弱い転写活性レベルから最大の
転写活性レベルに移行）され得る。
いなければならない（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，前出）： −プロモーターが強いプロモーターであり、宿主細胞の全タンパク質の１０−５
０％を占める有益なタンパク質を蓄積できる； −プロモーターがバイオマスの産生段階とタンパク質の産生段階とをできるだけ
分離するように調節され得る； −プロモーターが簡単で廉価な処理条件で誘導（弱い転写活性レベルから最大の
転写活性レベルに移行）され得る。
【０００５】 大腸菌中の発現に使用される多数のプロモーターが文献に記載されている（Ｍ
ａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，前出；Ｗｅｉｃｋｅｒｔら，１９９６，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：４９４−４
９９）。大腸菌中のタンパク質産生に使用される同種プロモーターとしては、ｌ
ａｃ，ｔｒｐ，ｌｐｐ，ｐｈｏＡ，ｒｅｃＡ，ａｒａＢＡＤ，ｐｒｏＵ，ｃｓｔ
−ｌ，ｔｅｔＡ，ｃａｄＡ，ｎａｒ，ｔａｃ，ｔｒｃ，ｌｐｐ−ｌａｃ，Ｐｓｙ
ｎ，ｃｓｐＡのようなプロモーターがある。大腸菌中のタンパク質産生に使用さ
れる異種プロモーターとしては、ＰＬ，ＰＬ−９Ｇ−５０，ＰＲ−ＰＬ，Ｔ７，
λＰＬ−ＰＴ７，Ｔ３−ｌａｃ，Ｔ５−ｌａｃ，Ｔ４遺伝子３２，ｎｐｒＭ−ｌ
ａｃ，ＶＨｂ，プロテインＡのようなプロモーターがある。これらのプロモータ
ーには幾つかの欠点が伴う。例えばある種のプロモーターでは、誘導分子として
ＩＰＴＧが使用されるが、ＩＰＴＧの価格は培地の価格の１４％以上を占める。
別のある種のプロモーターでは、温度による調節が使用されるが、１００ｍ３の
工業規模の発酵槽では温度による調節は極めて難しい。
ａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，前出；Ｗｅｉｃｋｅｒｔら，１９９６，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：４９４−４
９９）。大腸菌中のタンパク質産生に使用される同種プロモーターとしては、ｌ
ａｃ，ｔｒｐ，ｌｐｐ，ｐｈｏＡ，ｒｅｃＡ，ａｒａＢＡＤ，ｐｒｏＵ，ｃｓｔ
−ｌ，ｔｅｔＡ，ｃａｄＡ，ｎａｒ，ｔａｃ，ｔｒｃ，ｌｐｐ−ｌａｃ，Ｐｓｙ
ｎ，ｃｓｐＡのようなプロモーターがある。大腸菌中のタンパク質産生に使用さ
れる異種プロモーターとしては、ＰＬ，ＰＬ−９Ｇ−５０，ＰＲ−ＰＬ，Ｔ７，
λＰＬ−ＰＴ７，Ｔ３−ｌａｃ，Ｔ５−ｌａｃ，Ｔ４遺伝子３２，ｎｐｒＭ−ｌ
ａｃ，ＶＨｂ，プロテインＡのようなプロモーターがある。これらのプロモータ
ーには幾つかの欠点が伴う。例えばある種のプロモーターでは、誘導分子として
ＩＰＴＧが使用されるが、ＩＰＴＧの価格は培地の価格の１４％以上を占める。
別のある種のプロモーターでは、温度による調節が使用されるが、１００ｍ３の
工業規模の発酵槽では温度による調節は極めて難しい。
【０００６】 大腸菌中でタンパク質を発現させるために最も頻用されているベクターはプラ
スミドｐＢＲ３２２（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，前出；Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９
９６，前出）に由来のベクターである。これらのベクターは、プラスミドＲＮＡ
Ｉ及びＲＮＡＩＩ（Ｐｏｌｉｓｋｙ，１９８８，Ｃｅｌｌ ５５：９２９−９３
２）によってコードされている２つのＲＮＡの相互作用によって決定される所定
のコピー数で細胞中に存在している。ＲＮＡＩとＲＮＡＩＩとの相互作用は、Ｒ
ＮＡＩＩがプラスミドの複製開始に必要な形態に成熟することを阻害する。この
相互作用はＲＯＰタンパク質によって変調される。ＲＯＰタンパク質の遺伝子は
ｐＢＲ３２２に存在しているが、ｐＵＣ型のプラスミド（Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ａ
ｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９９１，Ｃｅｌｌ ６５：１２３３−１２４２）のような
幾つかの誘導体には存在しない。大腸菌中の発現プラスミドのコピー数の調節に
関しては、複数の戦略が文献に記載されている（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，前出
；Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，前出）。
スミドｐＢＲ３２２（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，前出；Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９
９６，前出）に由来のベクターである。これらのベクターは、プラスミドＲＮＡ
Ｉ及びＲＮＡＩＩ（Ｐｏｌｉｓｋｙ，１９８８，Ｃｅｌｌ ５５：９２９−９３
２）によってコードされている２つのＲＮＡの相互作用によって決定される所定
のコピー数で細胞中に存在している。ＲＮＡＩとＲＮＡＩＩとの相互作用は、Ｒ
ＮＡＩＩがプラスミドの複製開始に必要な形態に成熟することを阻害する。この
相互作用はＲＯＰタンパク質によって変調される。ＲＯＰタンパク質の遺伝子は
ｐＢＲ３２２に存在しているが、ｐＵＣ型のプラスミド（Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ａ
ｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９９１，Ｃｅｌｌ ６５：１２３３−１２４２）のような
幾つかの誘導体には存在しない。大腸菌中の発現プラスミドのコピー数の調節に
関しては、複数の戦略が文献に記載されている（Ｓｗａｒｔｚ，１９９６，前出
；Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，前出）。
【０００７】 発現プラスミドのコピー数が多いとき、所望のタンパク質のメッセンジャーＲ
ＮＡは高いレベルを達成し得るが、宿主菌株の代謝には有利な条件でないことに
特に留意されたい（Ｂａｉｌｅｙ，１９９３，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：２９−５２）。
ＮＡは高いレベルを達成し得るが、宿主菌株の代謝には有利な条件でないことに
特に留意されたい（Ｂａｉｌｅｙ，１９９３，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：２９−５２）。
【０００８】 工業用発酵では発酵槽中で抗生物質を使用しないのが望ましいと考えられるよ
うになったので、発現プラスミドの安定性は重要な基準である。発現プラスミド
を安定させる幾つかの戦略が開発されたが、その１つに、天然プラスミドＣｏｌ
Ｅ１のｃｅｒ遺伝子座のクローニングがある。このようなｃｅｒ遺伝子座は特性
決定されており（Ｌｅｕｎｇら，１９８５，ＤＮＡ ４：３５１−３５５）、コ
ピーの多いプラスミドに対する上記のようなｃｅｒ遺伝子座の挿入はこれらのプ
ラスミドの安定性に有利な効果を有すると記載されている（Ｓｕｍｍｅｒｓ ａ
ｎｄ Ｓｈｅｒｒａｔｔ，１９８４，Ｃｅｌｌ ３６：１０９７−１１０３）。
うになったので、発現プラスミドの安定性は重要な基準である。発現プラスミド
を安定させる幾つかの戦略が開発されたが、その１つに、天然プラスミドＣｏｌ
Ｅ１のｃｅｒ遺伝子座のクローニングがある。このようなｃｅｒ遺伝子座は特性
決定されており（Ｌｅｕｎｇら，１９８５，ＤＮＡ ４：３５１−３５５）、コ
ピーの多いプラスミドに対する上記のようなｃｅｒ遺伝子座の挿入はこれらのプ
ラスミドの安定性に有利な効果を有すると記載されている（Ｓｕｍｍｅｒｓ ａ
ｎｄ Ｓｈｅｒｒａｔｔ，１９８４，Ｃｅｌｌ ３６：１０９７−１１０３）。
【０００９】 上記のような菌株及び発現系が高い生産効率で異種タンパク質を産生させるこ
とができるとしても、それらの使用は、産生されたタンパク質の価値に比較して
産生系（細菌株、培養培地、培養条件、出発物質）の原価が取るに足りない要因
であるような極めて高い付加価値をもつ異種タンパク質の産生に限定されている
。このような極めて高い付加価値をもつタンパク質の例としては特に、医薬使用
目的の異種タンパク質、例えば、ヒト成長ホルモン、ヒトインターフェロンα共
通型、ヒトインターロイキン１β、α１及び２、ヒト白血球インターフェロン、
ヒト上皮小体ホルモン、ヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、ヒトのプロアポ
リポタンパク質Ａ−１（Ｌｅｅ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．１４：９８−１０５；Ｌａｔｔａら，１９８７，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ５：１３０９−１３１３）がある。
とができるとしても、それらの使用は、産生されたタンパク質の価値に比較して
産生系（細菌株、培養培地、培養条件、出発物質）の原価が取るに足りない要因
であるような極めて高い付加価値をもつ異種タンパク質の産生に限定されている
。このような極めて高い付加価値をもつタンパク質の例としては特に、医薬使用
目的の異種タンパク質、例えば、ヒト成長ホルモン、ヒトインターフェロンα共
通型、ヒトインターロイキン１β、α１及び２、ヒト白血球インターフェロン、
ヒト上皮小体ホルモン、ヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、ヒトのプロアポ
リポタンパク質Ａ−１（Ｌｅｅ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．１４：９８−１０５；Ｌａｔｔａら，１９８７，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ５：１３０９−１３１３）がある。
【００１０】 しかしながら、化学的中間体を量産するために使用される系（Ｌｅｅ，１９９
７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１７−１８）、または、工業用酵素
の製造、特に化合物の合成に必要な触媒の製造に使用される系については、系の
技術的価値を評価するときに考慮すべき最も重要な要因が系の原価である。
７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１７−１８）、または、工業用酵素
の製造、特に化合物の合成に必要な触媒の製造に使用される系については、系の
技術的価値を評価するときに考慮すべき最も重要な要因が系の原価である。
【００１１】 細菌中で異種タンパク質を産生させる場合、高密度細胞培養という戦略を使用
することによって培養系の生産効率を有意に向上させ得る（Ｓ．Ｍａｋｒｉｄｅ
ｓ，１９９６，前出；Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，１９９７，前出）。これらの戦略の
１つにフェッド−バッチ法がある（Ｊｕｎｇら，１９８８，Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．
Ｐａｓｔｅｒｕ／Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．１３９：１２９−１４６；Ｋｌｅｍａｎら
，１９９６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３５０２
−３５０７；Ｌｅｅ，１９９６，前出；Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，１９
７６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１８：８３９−８４６）。この戦
略とＰｔｒｐプロモーターの使用とを組合せると、１リットルあたり５５ｇの乾
燥重量及び１リットルあたり２．２ｇの異種タンパク質という高い産生率が達成
された（Ｊｕｎｇら，１９８８，前出）。常用の方法では１リットルあたり３５
−５０ｇの乾燥重量という産生率が報告されている（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，１９
９７，前出）。
することによって培養系の生産効率を有意に向上させ得る（Ｓ．Ｍａｋｒｉｄｅ
ｓ，１９９６，前出；Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，１９９７，前出）。これらの戦略の
１つにフェッド−バッチ法がある（Ｊｕｎｇら，１９８８，Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．
Ｐａｓｔｅｒｕ／Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．１３９：１２９−１４６；Ｋｌｅｍａｎら
，１９９６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３５０２
−３５０７；Ｌｅｅ，１９９６，前出；Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，１９
７６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１８：８３９−８４６）。この戦
略とＰｔｒｐプロモーターの使用とを組合せると、１リットルあたり５５ｇの乾
燥重量及び１リットルあたり２．２ｇの異種タンパク質という高い産生率が達成
された（Ｊｕｎｇら，１９８８，前出）。常用の方法では１リットルあたり３５
−５０ｇの乾燥重量という産生率が報告されている（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，１９
９７，前出）。
【００１２】 しかしながら、上記の菌株及び系で得られる培養密度は、方法の最終目的（特
に生物触媒の製造）に比べて方法の価格（原価）が無視できるほど廉価であるこ
とが望まれる異種タンパク質の工業的産生に十分な培養密度ではない。
に生物触媒の製造）に比べて方法の価格（原価）が無視できるほど廉価であるこ
とが望まれる異種タンパク質の工業的産生に十分な培養密度ではない。
【００１３】 本発明は、異種タンパク質の工業的産生に特に適切な大腸菌の菌株の選択に関
する。本発明方法に有用な菌株は、大腸菌Ｗ株であり、より特定的にはＡＴＣＣ
に登録番号９６３７で寄託されたＷ株である。
する。本発明方法に有用な菌株は、大腸菌Ｗ株であり、より特定的にはＡＴＣＣ
に登録番号９６３７で寄託されたＷ株である。
【００１４】 このＷ株（ＡＴＣＣ ９６３７）は公知であり、多くの刊行物に記載されてい
る（Ｄａｖｉｅｓ ＆ Ｍｉｎｇｉｏｌｉ，１９５０，Ｊ．Ｂａｃｔ．，６０：
１７−２８；Ｄｏｙ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，１９６５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４：３７７−３８９；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｄｏｙ，
１９６６，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１８：１５７−１７
２；Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｈｏｌｄｅｎ，１９６９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２４４：２７３７−２７４２；Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｈｏｌｄｅｎ，１９６９，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：２７４３−２７４９；Ｗｈｉｔｅ，１９７６，
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９６：５１−６２；Ｓｈａｗ ＆ Ｄｕｎｃ
ｏｍｂｅ，１９６３，Ａｎａｎｌｙｓｔ ８８：６９４−７０１；Ｂｒ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｐｅｉａ，１９９３，２：Ａ１６４−Ａ１６９；Ｈｕａｎｇら，ＵＳ
３，０８８，８８０；Ｈａｍｓｈｅｒら，ＵＳ３，９０５，８６８；Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉら，ＵＳ３，９４５，８８８；Ｈｕａｎｇら，ＵＳ３，２３９，４２７
；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ，１９５１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１４：４５９−４６０
；Ｐｒｉｅｔｏら，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７８：１１−１２０；Ｌｅｅ
，１９９６，前出；Ｌｅｅ ＆ Ｃｈａｎｇ，１９９５，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．４１：２０７−２１５；Ｌｅｅら，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４４：１３３７−１３４７；Ｌｅｅ ＆ Ｃｈａｎｇ，１
９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１５：９７１−９７４
；Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，１９７６，前出；Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓ
ｈｉｌｏａｃｈ，１９７４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１６：９３
３−９４１；Ｇｌｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｅｒ，１９８１，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２３：１０１５−１０２１；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａ
ｎｇ，１９９５，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅ／Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ．５２：２７−５８）。従って、Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）は、３
−ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＡ）を産生させるために、ＰＨＡの生合成に関与す
る酵素をコードするＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのオペロンを
含むプラスミドを導入した後で使用されてきた（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，
１９９３，前出；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９９５，前出；Ｌｅｅら，１
９９４）。
る（Ｄａｖｉｅｓ ＆ Ｍｉｎｇｉｏｌｉ，１９５０，Ｊ．Ｂａｃｔ．，６０：
１７−２８；Ｄｏｙ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，１９６５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４：３７７−３８９；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｄｏｙ，
１９６６，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１８：１５７−１７
２；Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｈｏｌｄｅｎ，１９６９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２４４：２７３７−２７４２；Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｈｏｌｄｅｎ，１９６９，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：２７４３−２７４９；Ｗｈｉｔｅ，１９７６，
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９６：５１−６２；Ｓｈａｗ ＆ Ｄｕｎｃ
ｏｍｂｅ，１９６３，Ａｎａｎｌｙｓｔ ８８：６９４−７０１；Ｂｒ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｐｅｉａ，１９９３，２：Ａ１６４−Ａ１６９；Ｈｕａｎｇら，ＵＳ
３，０８８，８８０；Ｈａｍｓｈｅｒら，ＵＳ３，９０５，８６８；Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉら，ＵＳ３，９４５，８８８；Ｈｕａｎｇら，ＵＳ３，２３９，４２７
；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ，１９５１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１４：４５９−４６０
；Ｐｒｉｅｔｏら，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７８：１１−１２０；Ｌｅｅ
，１９９６，前出；Ｌｅｅ ＆ Ｃｈａｎｇ，１９９５，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．４１：２０７−２１５；Ｌｅｅら，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４４：１３３７−１３４７；Ｌｅｅ ＆ Ｃｈａｎｇ，１
９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１５：９７１−９７４
；Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，１９７６，前出；Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓ
ｈｉｌｏａｃｈ，１９７４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１６：９３
３−９４１；Ｇｌｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｅｒ，１９８１，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２３：１０１５−１０２１；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａ
ｎｇ，１９９５，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅ／Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ．５２：２７−５８）。従って、Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）は、３
−ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＡ）を産生させるために、ＰＨＡの生合成に関与す
る酵素をコードするＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのオペロンを
含むプラスミドを導入した後で使用されてきた（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，
１９９３，前出；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９９５，前出；Ｌｅｅら，１
９９４）。
【００１５】 Ｗ株はまた、高密度細胞培養に使用されてきた（Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉ
ｔｅ，１９７６，前出；Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｈｉｌｏａｃｈ，１９７４，前
出；Ｇｌｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｅｒ，１９８１，前出；Ｌｅｅ ａｎｄ
Ｃｈａｎｇ，１９９３，前出；Ｌｅｅら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：５９−６２）。この場合には、サッカロース
を炭素源として使用することによって１リットルあたり１２５ｇの乾燥重量のバ
イオマスが得られた（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９９３，前出）。
ｔｅ，１９７６，前出；Ｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｈｉｌｏａｃｈ，１９７４，前
出；Ｇｌｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｅｒ，１９８１，前出；Ｌｅｅ ａｎｄ
Ｃｈａｎｇ，１９９３，前出；Ｌｅｅら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：５９−６２）。この場合には、サッカロース
を炭素源として使用することによって１リットルあたり１２５ｇの乾燥重量のバ
イオマスが得られた（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９９３，前出）。
【００１６】 しかしながら、この菌株が組換えタンパク質を産生するために使用されたと記
載されたことはない。更に、Ｌｅｅ及びＣｈａｎｇの試験（１９９３，前出）に
よれば、ＰＨＡの生合成に関与する酵素をコードするＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのオペロンを含むプラスミドと、対応する組換えＷ株の高密
度細胞培養戦略とを組合せることによって得られた産生率は、Ｋ１２株に由来の
菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで得られた産生率を下回る値であった（Ｌｅｅ ａｎｄ
Ｃｈａｎｇ，１９９５，前出；Ｌｅｅ，１９９６，前出）。
載されたことはない。更に、Ｌｅｅ及びＣｈａｎｇの試験（１９９３，前出）に
よれば、ＰＨＡの生合成に関与する酵素をコードするＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのオペロンを含むプラスミドと、対応する組換えＷ株の高密
度細胞培養戦略とを組合せることによって得られた産生率は、Ｋ１２株に由来の
菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで得られた産生率を下回る値であった（Ｌｅｅ ａｎｄ
Ｃｈａｎｇ，１９９５，前出；Ｌｅｅ，１９９６，前出）。
【００１７】 従って本発明は、適正な異種タンパク質発現系によって修飾された大腸菌を適
切な培養培地に播種し培養する段階から成り、大腸菌の菌株が大腸菌Ｗ株である
ことを特徴とする、大腸菌中で異種タンパク質を産生させる工業的方法に関する
。より好ましくはＷ株は、ＡＴＣＣに登録番号９６３７で寄託されたＷ株である
。
切な培養培地に播種し培養する段階から成り、大腸菌の菌株が大腸菌Ｗ株である
ことを特徴とする、大腸菌中で異種タンパク質を産生させる工業的方法に関する
。より好ましくはＷ株は、ＡＴＣＣに登録番号９６３７で寄託されたＷ株である
。
【００１８】 本発明の好ましい実施態様によれば、Ｗ株はＡＴＣＣに登録番号９６３７で寄
託された菌株からクローン選択及び遺伝子操作によって得られた誘導体である。
託された菌株からクローン選択及び遺伝子操作によって得られた誘導体である。
【００１９】 本文中の工業的方法という用語は、細菌の培養容量が研究室で常用の培養容量
よりも多い量であるような任意の方法を意味する。工業的方法という場合、培養
容量が一般には２リットルを上回る量であり、好ましくは１０リットル以上、よ
り好ましくは２０リットル以上、よりいっそう好ましくは５０リットル以上であ
る。本発明方法は、数１０ｍ３から１００ｍ３以上までの培養容量に特に好適で
ある。
よりも多い量であるような任意の方法を意味する。工業的方法という場合、培養
容量が一般には２リットルを上回る量であり、好ましくは１０リットル以上、よ
り好ましくは２０リットル以上、よりいっそう好ましくは５０リットル以上であ
る。本発明方法は、数１０ｍ３から１００ｍ３以上までの培養容量に特に好適で
ある。
【００２０】 適切な培養培地は、高密度のバイオマスを発生させ且つ異種タンパク質を高含
量で産生させるために好適な培養培地である。高密度細胞培養のために種々のタ
イプの培地（限定培地、複合培地、半限定培地）を使用し得る。当業界で公知の
培地、特に半限定培地が培地組成の十分な再現性と培養の十分な再現性との双方
を有し得るとしても（Ｌｅｅ，１９９６，前出）、前述のような経済的制約も考
慮に入れて最適化実験を行うことによって適切な培地を開発する必要がある（Ｌ
ｅｅ，１９９６，前出）。
量で産生させるために好適な培養培地である。高密度細胞培養のために種々のタ
イプの培地（限定培地、複合培地、半限定培地）を使用し得る。当業界で公知の
培地、特に半限定培地が培地組成の十分な再現性と培養の十分な再現性との双方
を有し得るとしても（Ｌｅｅ，１９９６，前出）、前述のような経済的制約も考
慮に入れて最適化実験を行うことによって適切な培地を開発する必要がある（Ｌ
ｅｅ，１９９６，前出）。
【００２１】 本発明の好ましい実施態様によれば、培養培地は主炭素源としてサッカロース
を含有する。本文中の主炭素源という用語は、サッカロースが培養培地の炭素源
の総重量の少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ま
しくは少なくとも８５重量％を占めることを意味する。本発明のより好ましい実
施態様によれば、培養培地が炭素源として実質的にサッカロースだけを含有する
。勿論、本発明の場合には、培養培地が本発明の総合的効率を向上させるような
適当な添加剤を含有し得る。これらの添加剤は副次的機能として細菌培養中の炭
素源となることはできる。しかしながら、本発明方法に使用される大腸菌Ｗ株が
これらの添加剤を唯一の炭素源として増殖することができないならば、これらの
添加剤は本文中に定義した炭素源であると考えることはできない。
を含有する。本文中の主炭素源という用語は、サッカロースが培養培地の炭素源
の総重量の少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ま
しくは少なくとも８５重量％を占めることを意味する。本発明のより好ましい実
施態様によれば、培養培地が炭素源として実質的にサッカロースだけを含有する
。勿論、本発明の場合には、培養培地が本発明の総合的効率を向上させるような
適当な添加剤を含有し得る。これらの添加剤は副次的機能として細菌培養中の炭
素源となることはできる。しかしながら、本発明方法に使用される大腸菌Ｗ株が
これらの添加剤を唯一の炭素源として増殖することができないならば、これらの
添加剤は本文中に定義した炭素源であると考えることはできない。
【００２２】 本発明方法に有利な培養培地中のサッカロースの量は培養初期（播種前）に０
．１−３００ｇ／リットル、好ましくは０．５−２００ｇ／リットルの範囲であ
る。勿論、サッカロースは本発明の培地の主炭素源を構成するので、方法の進行
に伴ってサッカロースの量が減少していく。一般に、反応終了時の培養培地中の
サッカロースの量は０−１０ｇ／リットルの範囲である。
．１−３００ｇ／リットル、好ましくは０．５−２００ｇ／リットルの範囲であ
る。勿論、サッカロースは本発明の培地の主炭素源を構成するので、方法の進行
に伴ってサッカロースの量が減少していく。一般に、反応終了時の培養培地中の
サッカロースの量は０−１０ｇ／リットルの範囲である。
【００２３】 本発明の有利な実施態様によれば、適切な培養培地は更に、補助的有機窒素源
を含有している。この補助的有機窒素源は当業者に公知の任意の有機窒素源から
構成され得る。補助的有機窒素源は好ましくはタンパク質抽出物から成る。これ
らのタンパク質抽出物はより好ましくは、（物質１００ｇあたりのアミノ酸のｇ
数で表して）アラニン１０−４、アスパラギン酸１１−４、グリシン２２−２．
５及びリシン７−４という組成を有している。食肉またはジャガイモのペプトン
またはタンパク質はこのような組成分布の条件を満たすので本発明方法に特に好
ましい。より特定的にはジャガイモのタンパク質の誘導体が本発明方法に特に好
ましい。
を含有している。この補助的有機窒素源は当業者に公知の任意の有機窒素源から
構成され得る。補助的有機窒素源は好ましくはタンパク質抽出物から成る。これ
らのタンパク質抽出物はより好ましくは、（物質１００ｇあたりのアミノ酸のｇ
数で表して）アラニン１０−４、アスパラギン酸１１−４、グリシン２２−２．
５及びリシン７−４という組成を有している。食肉またはジャガイモのペプトン
またはタンパク質はこのような組成分布の条件を満たすので本発明方法に特に好
ましい。より特定的にはジャガイモのタンパク質の誘導体が本発明方法に特に好
ましい。
【００２４】 本発明によれば、適正な異種タンパク質発現系という表現は、大腸菌Ｗ株中で
異種タンパク質を発現するために適正な調節要素を含む任意の発現系を意味する
。これらの調節要素は特に、プロモーター、リボソーム固体部位、転写ターミネ
ーターなどである。
異種タンパク質を発現するために適正な調節要素を含む任意の発現系を意味する
。これらの調節要素は特に、プロモーター、リボソーム固体部位、転写ターミネ
ーターなどである。
【００２５】 発現系がＰｔｒｐプロモーターを含むのが有利である。Ｐｔｒｐについては複
数の使用例が記載されている（欧州出願ＥＰ０１９８７４５；ＣＩＰ出願 Ｎｏ
．０８／１９４，５８８；国際出願ＷＯ９７／０４０８３；Ｌａｔｔａら，１９
８７，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１３０９−１３１４；Ｄｅｎｅｆｌ
ｅら，１９８７，Ｇｅｎｅ ５６：６１−７０）。特に、Ｌａｔｔａら（１９９
０，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．９：１２９−１３７）は、プロモーターの上
流の調節配列の影響、タンデム（縦列）重複したプロモーター配列の影響、及び
、ＴｒｐＲリプレッサーの同時発現の影響について詳細に研究した。彼らの標準
構築物ｐＸＬ５３４は、本発明の実施例で使用したｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願Ｎ
ｏ．０８／１９４，５５８）を構築するための出発材料として使用された。好ま
しくはＰｔｒｐプロモーターは、配列１（識別子：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）で表
される核酸配列を含む。
数の使用例が記載されている（欧州出願ＥＰ０１９８７４５；ＣＩＰ出願 Ｎｏ
．０８／１９４，５８８；国際出願ＷＯ９７／０４０８３；Ｌａｔｔａら，１９
８７，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１３０９−１３１４；Ｄｅｎｅｆｌ
ｅら，１９８７，Ｇｅｎｅ ５６：６１−７０）。特に、Ｌａｔｔａら（１９９
０，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．９：１２９−１３７）は、プロモーターの上
流の調節配列の影響、タンデム（縦列）重複したプロモーター配列の影響、及び
、ＴｒｐＲリプレッサーの同時発現の影響について詳細に研究した。彼らの標準
構築物ｐＸＬ５３４は、本発明の実施例で使用したｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願Ｎ
ｏ．０８／１９４，５５８）を構築するための出発材料として使用された。好ま
しくはＰｔｒｐプロモーターは、配列１（識別子：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）で表
される核酸配列を含む。
【００２６】 本発明の実施態様によれば、異種タンパク質の発現レベルを向上させるために
、大腸菌の分子シャペロンＧｒｏＥＳＬを同時発現させる（Ｍａｋｒｉｄｅｓに
よる研究，１９９６，前出）。実際、ＧｒｏＥＳＬタンパク質の細胞内濃度が増
加すると、組換えタンパク質の再生が増進され、従って活性タンパク質の割合が
増加する（Ｗｅｉｃｋｅｒら，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．７：４９４−４９９）。その同時発現が本発明の発現に有利に作用して
異種タンパク質の品質を向上させるような遺伝子が本発明の発現系に含まれても
よい。
、大腸菌の分子シャペロンＧｒｏＥＳＬを同時発現させる（Ｍａｋｒｉｄｅｓに
よる研究，１９９６，前出）。実際、ＧｒｏＥＳＬタンパク質の細胞内濃度が増
加すると、組換えタンパク質の再生が増進され、従って活性タンパク質の割合が
増加する（Ｗｅｉｃｋｅｒら，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．７：４９４−４９９）。その同時発現が本発明の発現に有利に作用して
異種タンパク質の品質を向上させるような遺伝子が本発明の発現系に含まれても
よい。
【００２７】 本発明において異種タンパク質なる用語は、大腸菌Ｗ株中に天然には存在しな
いが本発明の適正な発現系中には存在する本発明方法によって産生された任意の
タンパク質を意味する。その例としては、細菌に由来しないタンパク質、例えば
、動物、特にヒト由来のタンパク質または植物に由来するタンパク質、あるいは
、大腸菌Ｗ株によって天然には産生されない細菌由来のタンパク質、あるいはま
た、大腸菌Ｗ株以外の細菌によって天然に産生される細菌由来のタンパク質、あ
るいはまた、本発明の発現系の調節要素とは異なる調節要素によってその発現が
コントロールされる大腸菌Ｗ株によって天然に産生されるタンパク質、最後に、
上記のタンパク質の一次構造の幾つかの要素を修飾した後で上記のタンパク質か
ら誘導されたタンパク質、などがある。
いが本発明の適正な発現系中には存在する本発明方法によって産生された任意の
タンパク質を意味する。その例としては、細菌に由来しないタンパク質、例えば
、動物、特にヒト由来のタンパク質または植物に由来するタンパク質、あるいは
、大腸菌Ｗ株によって天然には産生されない細菌由来のタンパク質、あるいはま
た、大腸菌Ｗ株以外の細菌によって天然に産生される細菌由来のタンパク質、あ
るいはまた、本発明の発現系の調節要素とは異なる調節要素によってその発現が
コントロールされる大腸菌Ｗ株によって天然に産生されるタンパク質、最後に、
上記のタンパク質の一次構造の幾つかの要素を修飾した後で上記のタンパク質か
ら誘導されたタンパク質、などがある。
【００２８】 勿論、本発明方法は任意の有益なタンパク質に使用できる。有益なタンパク質
は、全面的もしくは部分的な抽出もしくは精製を行う前または該タンパク質を産
生し得るバイオマスと混合して使用する前に大量に蓄積できるような量で産生さ
れることが必要である。有益なタンパク質としては例えば、化学反応の生体触媒
として有用な酵素がある。これらの酵素は、単離及び精製のような予備処理を行
うことなく使用できる。有益なタンパク質としてはまた、化合物のバイオトラン
スホーメーションのために増殖中の宿主細菌中で使用される酵素がある。
は、全面的もしくは部分的な抽出もしくは精製を行う前または該タンパク質を産
生し得るバイオマスと混合して使用する前に大量に蓄積できるような量で産生さ
れることが必要である。有益なタンパク質としては例えば、化学反応の生体触媒
として有用な酵素がある。これらの酵素は、単離及び精製のような予備処理を行
うことなく使用できる。有益なタンパク質としてはまた、化合物のバイオトラン
スホーメーションのために増殖中の宿主細菌中で使用される酵素がある。
【００２９】 好ましい異種タンパク質は、化学反応の触媒として使用するという最終目的で
工業的な量で産生される酵素である。本発明の特定の実施態様によれば、酵素は
ニトリラーゼ、好ましくは国際出願ＷＯ９８／１８９４１に記載されたＡｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ８７５０）のニトリラーゼもしく
はＣＩＰ出願Ｎｏ．０８／１９４，５８８に記載されたＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔ
ｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｓｐ．のニトリラーゼ、または、国際出願ＷＯ９７／
０４０８３、欧州特許ＥＰ４３３１１７，ＥＰ４８８９１６に記載されたアミダ
ーゼのようなアミダーゼ、または、国際出願ＷＯ９６／３８５６７に記載された
ヒドロキシフェニルピルビン酸デオキシゲナーゼである。
工業的な量で産生される酵素である。本発明の特定の実施態様によれば、酵素は
ニトリラーゼ、好ましくは国際出願ＷＯ９８／１８９４１に記載されたＡｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ８７５０）のニトリラーゼもしく
はＣＩＰ出願Ｎｏ．０８／１９４，５８８に記載されたＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔ
ｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｓｐ．のニトリラーゼ、または、国際出願ＷＯ９７／
０４０８３、欧州特許ＥＰ４３３１１７，ＥＰ４８８９１６に記載されたアミダ
ーゼのようなアミダーゼ、または、国際出願ＷＯ９６／３８５６７に記載された
ヒドロキシフェニルピルビン酸デオキシゲナーゼである。
【００３０】 本発明はまた、プロモーターが上記に定義のＰｔｒｐプロモーターから成る異
種タンパク質の発現系を含むことを特徴とする上記に定義のような大腸菌Ｗ株に
関する。
種タンパク質の発現系を含むことを特徴とする上記に定義のような大腸菌Ｗ株に
関する。
【００３１】 本発明を実施例に基づいて以下に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例
の記載に限定されない。
の記載に限定されない。
【００３２】 添付の図１−図３は、種々の実施例で使用したプラスミドの制限地図を示す。
【００３３】 図１はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１の制限地図を示す。括弧内の部位は
クローニングのときに除去された部位を表す。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモ
ーター；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ターミネーター；
ｆｉｎ ＲＯＰ：ＲＯＰタンパク質をコードする遺伝子の終点（Ｃｈａｍｂｅｒ
ｓら，１９８８，Ｇｅｎｅ６８：１３９−１４９）；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡ
Ｉ／ＩＩ：複製に関与するＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）；Ｔｃ：テトラ
サイクリン耐性遺伝子。
クローニングのときに除去された部位を表す。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモ
ーター；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ターミネーター；
ｆｉｎ ＲＯＰ：ＲＯＰタンパク質をコードする遺伝子の終点（Ｃｈａｍｂｅｒ
ｓら，１９８８，Ｇｅｎｅ６８：１３９−１４９）；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡ
Ｉ／ＩＩ：複製に関与するＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）；Ｔｃ：テトラ
サイクリン耐性遺伝子。
【００３４】 図２はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７の制限地図を示す。括弧内の部位
はクローニングのときに除去された部位を表す。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロ
モーター；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ターミネーター
；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡＩ＊／ＩＩ：複製に関与する突然変異ＲＮＡ；Ｃｍ
：クロラムフェニコール耐性遺伝子；ｃｅｒ：ｃｅｒ遺伝子座。
はクローニングのときに除去された部位を表す。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロ
モーター；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ターミネーター
；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡＩ＊／ＩＩ：複製に関与する突然変異ＲＮＡ；Ｃｍ
：クロラムフェニコール耐性遺伝子；ｃｅｒ：ｃｅｒ遺伝子座。
【００３５】 図３はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３の制限地図を示す。括弧内の部位
はクローニングのときに除去された部位を表す。Ｓｍ／Ｓｐ：ストレプトマイシ
ン及びスペクチノマイシンに耐性の遺伝子；ｐａｒＡＢＣＤＥ：ｐａｒ遺伝子座
（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１７４：８１１９−８１３２）；ｒｅｐ，ｍｏｂ，Ｄ２０及びｏｒｉ：プ
ラスミドの複製及び伝達に関与する領域（Ｓｃｈｏｌｔｚら，１９８９，Ｇｅｎ
ｅ ７５：２７１−２８８；Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：１０１
−１０６）。
はクローニングのときに除去された部位を表す。Ｓｍ／Ｓｐ：ストレプトマイシ
ン及びスペクチノマイシンに耐性の遺伝子；ｐａｒＡＢＣＤＥ：ｐａｒ遺伝子座
（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１７４：８１１９−８１３２）；ｒｅｐ，ｍｏｂ，Ｄ２０及びｏｒｉ：プ
ラスミドの複製及び伝達に関与する領域（Ｓｃｈｏｌｔｚら，１９８９，Ｇｅｎ
ｅ ７５：２７１−２８８；Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：１０１
−１０６）。
【００３６】 図４はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６の制限地図を示す。Ｐｔｒｐ：ト
リプトファンプロモーター；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転
写ターミネーター；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡＩ＊／ＩＩ：複製に関与する突然
変異ＲＮＡ；Ｔｃｒ：テトラサイクリン耐性遺伝子；ｃｅｒ：ｃｅｒ遺伝子座。
リプトファンプロモーター；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転
写ターミネーター；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡＩ＊／ＩＩ：複製に関与する突然
変異ＲＮＡ；Ｔｃｒ：テトラサイクリン耐性遺伝子；ｃｅｒ：ｃｅｒ遺伝子座。
【００３７】 図５はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３の制限地図を示す。Ｓｍ／Ｓｐ：
ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンに耐性の遺伝子；ｒｅｐ，ｍｏｂ及
びｏｒｉ：プラスミドの複製及び伝達に関与する領域（Ｓｃｈｏｌｔｚら，１９
８９，Ｇｅｎｅ ７５：２７１−２８８；Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １
１３：１０１−１０６）；ｄｅｌｔａは本文に記載された欠失を表す。
ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンに耐性の遺伝子；ｒｅｐ，ｍｏｂ及
びｏｒｉ：プラスミドの複製及び伝達に関与する領域（Ｓｃｈｏｌｔｚら，１９
８９，Ｇｅｎｅ ７５：２７１−２８８；Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １
１３：１０１−１０６）；ｄｅｌｔａは本文に記載された欠失を表す。
【００３８】 使用した技術は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，１９８７（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８
２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），Ｃｏｌｉｇａｎら，
１９９７（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）によって記載され
たような当業者に公知の慣用の分子生物学及び微生物学の技術である。
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８
２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），Ｃｏｌｉｇａｎら，
１９９７（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）によって記載され
たような当業者に公知の慣用の分子生物学及び微生物学の技術である。
【００３９】 実施例１：発現プラスミドｐＢＣＡＴ２９及びｐＢＣＡＴ４１の構築 ＰｔｒｐプロモーターとλファージのｃＩＩ遺伝子のリボソーム固定部位（Ｒ
ＢＳｃＩＩ）とＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０
のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＢ）とを含む１．２７ｋｂのフラグメントをプラ
スミドｐＲＰＡ６ＢＣＡＴ６（フランス出願ＦＲ９６／１３０７７）から制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩによって抽出し、同じ制限酵素で開裂したベクターｐ
ＸＬ６４２（ＣＩＰ出願Ｎｏ．０８／１９４，５８８に記載）にクローニングし
た。得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１５を制限酵素ＳｔｕＩ及びＢｓｍ
Ｉによって開裂し、４．３ｋｂのフラグメントをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４（フラン
ス出願９６／１３０７７）から精製した１３６ｂｐのＳｔｕＩ−ＢｓｍＩフラグ
メントに結合させてプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を作製した。ｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ１９の部分的配列決定によって、ニトリラーゼの残基Ａｓｐ２７９のコ
ドンが残基Ａｓｎ２７９のコドンによって置換されていることを確認した。融合
物Ｐｔｒｐ：：ＲＢＳｃＩＩ：：ｎｉｔＢを含むｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９の１．
２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを次に、同じ酵素で開裂したベクタ
ーｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８にクローニングし、６．２ｋｂのプラスミドｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ２９を作製した。ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８は、ｐＸＬ６４２
（ＣＩＰ出願Ｎｏ．０８／１９４，５８８）の３．９ｋｂのＳｓｐＩ−ＳｃａＩ
のフラグメントをｐＨＰ４５ΩＴｃ（Ｆｅｌｌａｙら，１９８７，Ｇｅｎｅ ５
２：１４７−１５４）の２．１ｋｂのＳｍａＩフラグメントに結合させて、アン
ピシリン耐性マーカーをテトラサイクリンマーカーで置換することによって得ら
れた。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９の複製起点に近いＮｄｅＩ部位をＮｄ
ｅＩの部分消化及び大腸菌ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）の作用で破
壊することによって、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１が得られた。このプラ
スミドの制限地図を図１に示す。発現カセットの配列を配列２（識別子：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ２）で表す。
ＢＳｃＩＩ）とＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０
のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＢ）とを含む１．２７ｋｂのフラグメントをプラ
スミドｐＲＰＡ６ＢＣＡＴ６（フランス出願ＦＲ９６／１３０７７）から制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩによって抽出し、同じ制限酵素で開裂したベクターｐ
ＸＬ６４２（ＣＩＰ出願Ｎｏ．０８／１９４，５８８に記載）にクローニングし
た。得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１５を制限酵素ＳｔｕＩ及びＢｓｍ
Ｉによって開裂し、４．３ｋｂのフラグメントをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４（フラン
ス出願９６／１３０７７）から精製した１３６ｂｐのＳｔｕＩ−ＢｓｍＩフラグ
メントに結合させてプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を作製した。ｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ１９の部分的配列決定によって、ニトリラーゼの残基Ａｓｐ２７９のコ
ドンが残基Ａｓｎ２７９のコドンによって置換されていることを確認した。融合
物Ｐｔｒｐ：：ＲＢＳｃＩＩ：：ｎｉｔＢを含むｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９の１．
２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを次に、同じ酵素で開裂したベクタ
ーｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８にクローニングし、６．２ｋｂのプラスミドｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ２９を作製した。ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８は、ｐＸＬ６４２
（ＣＩＰ出願Ｎｏ．０８／１９４，５８８）の３．９ｋｂのＳｓｐＩ−ＳｃａＩ
のフラグメントをｐＨＰ４５ΩＴｃ（Ｆｅｌｌａｙら，１９８７，Ｇｅｎｅ ５
２：１４７−１５４）の２．１ｋｂのＳｍａＩフラグメントに結合させて、アン
ピシリン耐性マーカーをテトラサイクリンマーカーで置換することによって得ら
れた。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９の複製起点に近いＮｄｅＩ部位をＮｄ
ｅＩの部分消化及び大腸菌ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）の作用で破
壊することによって、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１が得られた。このプラ
スミドの制限地図を図１に示す。発現カセットの配列を配列２（識別子：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ２）で表す。
【００４０】 実施例２：“バッチ”式で行った大腸菌Ｋ１２株、ＢＬ２１株、Ｗ株中のＡ．
ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０のニトリラーゼの発現 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９及びｐＸＬ２０３５（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉ
ｌｌら，１９９５，Ｇｅｎｅ １６１：１５−２０）を、慣用の電気穿孔を使用
して大腸菌ＤＨ５α株（ＣＬＯＮＥＣＨ，標品Ｃ１０２１−１）、ＢＬ２１株（
Ｎｏｖａｇｅｎ，標品６９３８６−１）及びＷ株（ＡＴＣＣ９６３７）に導入し
た。フランス出願ＦＲ９６／１３０７７の実施例５に記載された手順と同様の手
順を使用し予備培養時間を８時間に短縮し発現時間を１６時間に固定して発現培
養物を調製した。発現後、６６０ｎｍで読み取った培養物の光学密度（ＯＤ６６
０）に基づいてバイオマスを算定した。バイオマスの算定には、式： 培養物１リットルあたりのバイオマスの乾燥重量ｇ＝ＯＤ６６０×０．３５ を使用した。培養物のニトリラーゼ活性はフランス出願ＦＲ９６／１３０７７の
記載に従って測定した。各菌株毎に２つのクローンを分析し、各クローン毎に実
験を繰返した。表１は各菌株毎に４つの実験で得られたデータの平均を示す。
ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０のニトリラーゼの発現 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９及びｐＸＬ２０３５（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉ
ｌｌら，１９９５，Ｇｅｎｅ １６１：１５−２０）を、慣用の電気穿孔を使用
して大腸菌ＤＨ５α株（ＣＬＯＮＥＣＨ，標品Ｃ１０２１−１）、ＢＬ２１株（
Ｎｏｖａｇｅｎ，標品６９３８６−１）及びＷ株（ＡＴＣＣ９６３７）に導入し
た。フランス出願ＦＲ９６／１３０７７の実施例５に記載された手順と同様の手
順を使用し予備培養時間を８時間に短縮し発現時間を１６時間に固定して発現培
養物を調製した。発現後、６６０ｎｍで読み取った培養物の光学密度（ＯＤ６６
０）に基づいてバイオマスを算定した。バイオマスの算定には、式： 培養物１リットルあたりのバイオマスの乾燥重量ｇ＝ＯＤ６６０×０．３５ を使用した。培養物のニトリラーゼ活性はフランス出願ＦＲ９６／１３０７７の
記載に従って測定した。各菌株毎に２つのクローンを分析し、各クローン毎に実
験を繰返した。表１は各菌株毎に４つの実験で得られたデータの平均を示す。
【００４１】 表１：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９及びｐＸＬ２０３５を組み込んだ菌
株のバイオマス及び活性
株のバイオマス及び活性
【００４２】
【表１】 略号：ｇ／ｌ：培養物１リットルあたりの乾燥重量ｇ；Ｕ：１時間あたり乾燥重
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ
【００４３】 これらのデータは、ニトリラーゼＮｉｔＢを発現する性能が最も高い宿主が大
腸菌Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）であることを示す。
腸菌Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）であることを示す。
【００４４】 実施例３：ｐＢＣＡＴ４３の構築 国際出願ＷＯ９７／０４０８３に記載されたＣｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏ
ｖｏｒａｎｓ Ｎ１２のポリアミドヒドロラーゼの遺伝子（ｐａｍＩＩ）をベク
ターｐＢＣＡＴ４１にクローニングした。ＰＣＲプライマーの遺伝子の５′位に
ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ制限部位、３′位にＸｂａＩ制限部位を導入することに
よって、このポリアミドヒドロラーゼ遺伝子を１．２６ｋｂのＤＮＡフラグメン
トの形態にＰＣＲ増幅した。次にこのフラグメントをＥｃｏＲＩ酵素及びＭｕｎ
ｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼを順次に用いて処理した。フェノール−クロロホルム
−イソアミルアルコールでタンパク質を抽出した後、次の処理としてＸｂａＩ消
化を行った。同様にして、ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１をＮｄｅＩ酵素で開
裂し、次いでＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼで処理した。フェノール−クロロ
ホルム−イソアミルアルコールでタンパク質を抽出した後、次の処理としてＸｂ
ａＩ消化を行った。これらの２つのサンプルを結合させると、プラスミドｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ４３が得られた。このプラスミドは、Ｐｔｒｐプロモーターと、配
列：ＡＡＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣによってｐａｍＩＩ遺伝子の翻訳開始コドンから
隔てられたＲＢＳｃＩＩ固定部位とを含む。
ｖｏｒａｎｓ Ｎ１２のポリアミドヒドロラーゼの遺伝子（ｐａｍＩＩ）をベク
ターｐＢＣＡＴ４１にクローニングした。ＰＣＲプライマーの遺伝子の５′位に
ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ制限部位、３′位にＸｂａＩ制限部位を導入することに
よって、このポリアミドヒドロラーゼ遺伝子を１．２６ｋｂのＤＮＡフラグメン
トの形態にＰＣＲ増幅した。次にこのフラグメントをＥｃｏＲＩ酵素及びＭｕｎ
ｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼを順次に用いて処理した。フェノール−クロロホルム
−イソアミルアルコールでタンパク質を抽出した後、次の処理としてＸｂａＩ消
化を行った。同様にして、ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１をＮｄｅＩ酵素で開
裂し、次いでＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼで処理した。フェノール−クロロ
ホルム−イソアミルアルコールでタンパク質を抽出した後、次の処理としてＸｂ
ａＩ消化を行った。これらの２つのサンプルを結合させると、プラスミドｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ４３が得られた。このプラスミドは、Ｐｔｒｐプロモーターと、配
列：ＡＡＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣによってｐａｍＩＩ遺伝子の翻訳開始コドンから
隔てられたＲＢＳｃＩＩ固定部位とを含む。
【００４５】 実施例４：“バッチ”式で行った大腸菌ＤＨ５α株、ＢＬ２１株及びＷ株中の
ポリアミダーゼＰａｍＩＩの発現 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４３を慣用の電気穿孔によって大腸菌ＤＨ５α
株、Ｌ２１株及びＷ株に導入した。上記の実施例２に記載の手順を使用し発現時
間を１４時間から２４時間に延長することによって発現培養物を調製した。発現
後、前出の実施例２に記載の公式でバイオマスを算定した。培養物のポリアミド
ヒドロラーゼ活性の測定は国際出願ＷＯ９７／０４０８３に記載の手順を以下の
ごとく修正した方法で行った： −１％のトルエンを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡから成
るバッファ，ｐＨ８に乾燥細胞の濃度が約５ｇ／リットルとなるように細胞残渣
を再懸濁させることによって、トルエンで細胞を透過性にした。激しく撹拌した
後、懸濁液を４℃で１時間インキュベートし、次いで遠心し、最後に透過性にな
った細胞残渣を１００ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ７に回収した； −０．１Ｍのリン酸カリウムバッファ，ｐＨ７を含む反応培地中に２．５ｇ／リ
ットルで導入し撹拌下に３０℃でインキュベートしたオリゴマーＡＢ（１分子の
ヘキサメチレンジアミンに縮合した１分子のアジピン酸）に対する加水分解活性
を測定した； −１００μｌのサンプルを定期的に採取し、同量の０．２ＮのＮａＯＨを添加し
た； −サンプルを５０ｍＭのＨ３ＰＯ４溶液で１０倍に希釈した後でＨＰＬＣによっ
て分析した。
ポリアミダーゼＰａｍＩＩの発現 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４３を慣用の電気穿孔によって大腸菌ＤＨ５α
株、Ｌ２１株及びＷ株に導入した。上記の実施例２に記載の手順を使用し発現時
間を１４時間から２４時間に延長することによって発現培養物を調製した。発現
後、前出の実施例２に記載の公式でバイオマスを算定した。培養物のポリアミド
ヒドロラーゼ活性の測定は国際出願ＷＯ９７／０４０８３に記載の手順を以下の
ごとく修正した方法で行った： −１％のトルエンを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡから成
るバッファ，ｐＨ８に乾燥細胞の濃度が約５ｇ／リットルとなるように細胞残渣
を再懸濁させることによって、トルエンで細胞を透過性にした。激しく撹拌した
後、懸濁液を４℃で１時間インキュベートし、次いで遠心し、最後に透過性にな
った細胞残渣を１００ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ７に回収した； −０．１Ｍのリン酸カリウムバッファ，ｐＨ７を含む反応培地中に２．５ｇ／リ
ットルで導入し撹拌下に３０℃でインキュベートしたオリゴマーＡＢ（１分子の
ヘキサメチレンジアミンに縮合した１分子のアジピン酸）に対する加水分解活性
を測定した； −１００μｌのサンプルを定期的に採取し、同量の０．２ＮのＮａＯＨを添加し
た； −サンプルを５０ｍＭのＨ３ＰＯ４溶液で１０倍に希釈した後でＨＰＬＣによっ
て分析した。
【００４６】 各菌株毎に１−２４個のクローンを分析し、各クローン毎に独立の実験を１−
７回繰り返した。表２は各菌株毎に得られたデータの平均を示す。
７回繰り返した。表２は各菌株毎に得られたデータの平均を示す。
【００４７】 表２：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４３を組み込んだ菌株のバイオマス及び
活性
活性
【００４８】
【表２】 略号：ＮＢ：数；Ｕ：１時間あたり乾燥重量１ｇあたりの加水分解ＡＢのｇ；Ｐ
：１時間あたり培地１リットルあたりの加水分解ＡＢのｇ。
：１時間あたり培地１リットルあたりの加水分解ＡＢのｇ。
【００４９】 これらのデータは、ポリアミダーゼＰａｍＩＩを発現する性能が最も高い宿主
が大腸菌Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）であることを示す。
が大腸菌Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）であることを示す。
【００５０】 実施例５：プラスミドｐＢＣＡＴ４１−５３１の構築及びキャラクタリゼーシ
ョン Ｍｉｌｌｅｒ１９９２（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ａ ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒ
ｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．“Ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｍａｎｕａｌ ａｎｄ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎ
ｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕｎｉｔ ４，ｐｐ８１−２１２
）及びＨｕｍｐｈｒｅｙｓら，１９７６（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１４５
：１０１−１０８）に記載されているようなヒドロキシルアミンによる突然変異
誘発によってプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を処理した。塩化セシウム勾配
で精製した５μｇのプラスミドＤＮＡを、０．５ｍＭのＥＤＴＡと０．４ＭのＮ
Ｈ２ＯＨとを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ，ｐＨ６中で８０℃で２
０分間インキュベートした。０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む同量の５０ｍＭのリン
酸ナトリウムバッファ，ｐＨ６を添加した後、１ｍＭのＥＤＴＡと１００ｍＭの
ＮａＣｌとを含む十分な過剰量の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ，ｐＨ７．
５に反応混合物を透析した。次に、プラスミドＤＮＡを沈殿によって回収し、約
２０ｎｇのＤＮＡを、プラスミドｐＸＬ２０３５を組み込んだＤＨ５α株に電気
穿孔によって導入した。得られた形質転換体のうちで、菌株ＤＨ５α（ｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ４１，ｐＸＬ２０３５）の培養物産生率の３倍の培養物産生率を示し
た１つのクローンを選択した。このクローンに組み込まれていたプラスミドｐＲ
ＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１を抽出し、プラスミドｐＸＬ２０３５を組み込んで
いる新しいＤＨ５α宿主に再度導入した。次に、実施例２に記載の条件で３つの
クローンを分析し、３つのクローンＤＨ５α（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１，ｐＸＬ
２０３５）に比較した。結果を表３に示す。
ョン Ｍｉｌｌｅｒ１９９２（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ａ ｓｈｏｒｔ ｃｏｕｒ
ｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．“Ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｍａｎｕａｌ ａｎｄ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎ
ｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕｎｉｔ ４，ｐｐ８１−２１２
）及びＨｕｍｐｈｒｅｙｓら，１９７６（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１４５
：１０１−１０８）に記載されているようなヒドロキシルアミンによる突然変異
誘発によってプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を処理した。塩化セシウム勾配
で精製した５μｇのプラスミドＤＮＡを、０．５ｍＭのＥＤＴＡと０．４ＭのＮ
Ｈ２ＯＨとを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ，ｐＨ６中で８０℃で２
０分間インキュベートした。０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む同量の５０ｍＭのリン
酸ナトリウムバッファ，ｐＨ６を添加した後、１ｍＭのＥＤＴＡと１００ｍＭの
ＮａＣｌとを含む十分な過剰量の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ，ｐＨ７．
５に反応混合物を透析した。次に、プラスミドＤＮＡを沈殿によって回収し、約
２０ｎｇのＤＮＡを、プラスミドｐＸＬ２０３５を組み込んだＤＨ５α株に電気
穿孔によって導入した。得られた形質転換体のうちで、菌株ＤＨ５α（ｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ４１，ｐＸＬ２０３５）の培養物産生率の３倍の培養物産生率を示し
た１つのクローンを選択した。このクローンに組み込まれていたプラスミドｐＲ
ＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１を抽出し、プラスミドｐＸＬ２０３５を組み込んで
いる新しいＤＨ５α宿主に再度導入した。次に、実施例２に記載の条件で３つの
クローンを分析し、３つのクローンＤＨ５α（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１，ｐＸＬ
２０３５）に比較した。結果を表３に示す。
【００５１】 表３：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１
及びｐＸＬ２０３５を組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
及びｐＸＬ２０３５を組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
【００５２】
【表３】 略号：ｇ／ｌ；培養物１リットルあたりの乾燥重量ｇ；Ｕ：１時間あたり乾燥重
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ。
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ。
【００５３】 これらの結果は、培養物の産生率の向上がプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１
−５３１の存在に相関関係を有していることを示す。
−５３１の存在に相関関係を有していることを示す。
【００５４】 融合物Ｐｔｒｐ：：ｎｉｔＢを含む１．２７ｋｇのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラ
グメントをプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１から抽出し、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ
４１−５３１にクローニングして後者に含まれていたフラグメントに置換した。
得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ８６を菌株ＤＨ５α（ｐＸＬ２０３５）
に導入し、３つの形質転換体を上記の条件と同様の条件で試験した。結果を表４
にまとめる。
グメントをプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１から抽出し、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ
４１−５３１にクローニングして後者に含まれていたフラグメントに置換した。
得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ８６を菌株ＤＨ５α（ｐＸＬ２０３５）
に導入し、３つの形質転換体を上記の条件と同様の条件で試験した。結果を表４
にまとめる。
【００５５】 表４：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１
、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ８６及びｐＸＬ２０３５を組み込んだ菌株のバイオマス及
び活性
、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ８６及びｐＸＬ２０３５を組み込んだ菌株のバイオマス及
び活性
【００５６】
【表４】 略号：ｇ／ｌ；培養物１リットルあたりの乾燥重量ｇ；Ｕ：１時間あたり乾燥重
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ。
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ。
【００５７】 結果は、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１を組み込んた培養物の産生率の向上
が菌株の比活性の増加に起因しないこと、及び、この向上がＰｔｒｐプロモータ
ーとｎｉｔＢ遺伝子とを含むフラグメントの突然変異にも起因しないことを示す
。
が菌株の比活性の増加に起因しないこと、及び、この向上がＰｔｒｐプロモータ
ーとｎｉｔＢ遺伝子とを含むフラグメントの突然変異にも起因しないことを示す
。
【００５８】 実施例６：プラスミドｐＢＣＡＴ４１−５３１に存在する突然変異であってニ
トリラーゼを発現する菌株培養物の産生率を増加させる原因となる突然変異のキ
ャラクタリゼーション 実施例５の菌株によって産生されたタンパク質の量をＳＤＳの存在下のポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分析すると、該実施例に記載の菌株中で試験
した全部の構築物が同等のニトリラーゼポリペプチド合成率を示すことが判明し
た。これに反して、均等量のバイオマスに基づいてプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡ
Ｔ４１及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１のＤＮＡ調製物を比較すると、プラ
スミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１のコピー数が親プラスミドｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ４１のコピー数よりも少ないことが判明した。Ｔｔｈ１１１１部位を起点
としてプラスミドの複製起点を包含するｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１の９９
４ｂｐの領域を配列決定すると、ｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｊ０１７４
９，名称：ＳＹＮＰＢＲ３２２）の対応する領域の配列に比べて２つの相異が存
在することが判明した。配列Ｊ０１７４９で用いられている番号順（０は非反復
ＥｃｏＲＩ部位の中央）で示すと、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１中では塩基
２３１９の後にＡが挿入され、３０３９位のＣがＴで置換されていた。１つめの
相異は、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９のＮｄｅＩ部位の１つを破壊する機能を果たし
たクレノウポリメラーゼの作用エラーに起因しており、ｐＢＲ３２２（Ｃｈａｍ
ｂｅｒｓら，１９８８，Ｇｅｎｅ ６８：１３９−１４９）の複製に役立つこと
が記載されていない領域に相異が存在する。２つめの相異は、ＤＮＡに対するヒ
ドロキシルアミンの特徴的な作用（Ｄｒａｋｅ ａｎｄ Ｂａｌｔｚ，１９７６
，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：１１−３７）である転移に起因し
ており、ｐＢＲ３２２（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）の複製に関与するＲＮＡ
Ｉに転写された領域の２番目のヌクレオチドの処に相異が存在する。この後者の
突然変異の結果として、ＤＨ５α中のｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１のコピー
数が少なくなり、また、菌株ＤＨ５α（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３，ｐＸＬ
２０３５）の培養物によるニトリラーゼの産生率が高くなる。
トリラーゼを発現する菌株培養物の産生率を増加させる原因となる突然変異のキ
ャラクタリゼーション 実施例５の菌株によって産生されたタンパク質の量をＳＤＳの存在下のポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分析すると、該実施例に記載の菌株中で試験
した全部の構築物が同等のニトリラーゼポリペプチド合成率を示すことが判明し
た。これに反して、均等量のバイオマスに基づいてプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡ
Ｔ４１及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１のＤＮＡ調製物を比較すると、プラ
スミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１のコピー数が親プラスミドｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ４１のコピー数よりも少ないことが判明した。Ｔｔｈ１１１１部位を起点
としてプラスミドの複製起点を包含するｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１の９９
４ｂｐの領域を配列決定すると、ｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｊ０１７４
９，名称：ＳＹＮＰＢＲ３２２）の対応する領域の配列に比べて２つの相異が存
在することが判明した。配列Ｊ０１７４９で用いられている番号順（０は非反復
ＥｃｏＲＩ部位の中央）で示すと、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１中では塩基
２３１９の後にＡが挿入され、３０３９位のＣがＴで置換されていた。１つめの
相異は、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９のＮｄｅＩ部位の１つを破壊する機能を果たし
たクレノウポリメラーゼの作用エラーに起因しており、ｐＢＲ３２２（Ｃｈａｍ
ｂｅｒｓら，１９８８，Ｇｅｎｅ ６８：１３９−１４９）の複製に役立つこと
が記載されていない領域に相異が存在する。２つめの相異は、ＤＮＡに対するヒ
ドロキシルアミンの特徴的な作用（Ｄｒａｋｅ ａｎｄ Ｂａｌｔｚ，１９７６
，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：１１−３７）である転移に起因し
ており、ｐＢＲ３２２（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）の複製に関与するＲＮＡ
Ｉに転写された領域の２番目のヌクレオチドの処に相異が存在する。この後者の
突然変異の結果として、ＤＨ５α中のｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１のコピー
数が少なくなり、また、菌株ＤＨ５α（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３，ｐＸＬ
２０３５）の培養物によるニトリラーゼの産生率が高くなる。
【００５９】 実施例７：“フェッド−バッチ”（半連続培養）式で行った大腸菌ＢＬ２１株
及び大腸菌Ｗ株中のＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０のニトリラーゼの
発現 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１とｐＸＬ２０３５とを電気穿孔に
よってＢＬ２１株（前出の標品）及びＷ株（ＡＴＣＣ９６３７）に導入し、それ
ぞれ菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５９４〔ＢＬ２１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５
３１，ｐＸＬ２０３５）〕及び菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ７１４〔Ｗ（ｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ４１−５３１，ｐＸＬ２０３５）〕を作製した。組換え体であるＥ．
ｃｏｌｉ ＢＩＯＣＡＴ５９４及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＩＯＣＡＴ７１４を、以下
の組成を有する２リットルの培地を収容した３．５リットル容の発酵槽で培養し
た。
及び大腸菌Ｗ株中のＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０のニトリラーゼの
発現 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１とｐＸＬ２０３５とを電気穿孔に
よってＢＬ２１株（前出の標品）及びＷ株（ＡＴＣＣ９６３７）に導入し、それ
ぞれ菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５９４〔ＢＬ２１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５
３１，ｐＸＬ２０３５）〕及び菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ７１４〔Ｗ（ｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ４１−５３１，ｐＸＬ２０３５）〕を作製した。組換え体であるＥ．
ｃｏｌｉ ＢＩＯＣＡＴ５９４及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＩＯＣＡＴ７１４を、以下
の組成を有する２リットルの培地を収容した３．５リットル容の発酵槽で培養し
た。
【００６０】
【表５】
【００６１】 アンモニアを加えてｐＨを７．０に維持する。１容量の培地あたり１容量／分
の空気を加えて撹拌することによって酸素飽和を２０％に維持する。最初にグル
コースを最終濃度２ｇ／リットルで導入する。このグルコースが完全に消費され
た後、７００ｇ／リットルのグルコース、１９．６ｇ／リットルのＭｇＳＯ４．
７Ｈ２Ｏから成る組成をもつ母液からグルコースを連続的に導入する。添加速度
は培地１リットルあたりグルコース２．２ｇ／時とする。
の空気を加えて撹拌することによって酸素飽和を２０％に維持する。最初にグル
コースを最終濃度２ｇ／リットルで導入する。このグルコースが完全に消費され
た後、７００ｇ／リットルのグルコース、１９．６ｇ／リットルのＭｇＳＯ４．
７Ｈ２Ｏから成る組成をもつ母液からグルコースを連続的に導入する。添加速度
は培地１リットルあたりグルコース２．２ｇ／時とする。
【００６２】 ２４時間の発酵後、培地を回収し、遠心し、乾燥重量を計算し、ｇ／リットル
で表す。酵素活性を国際特許ＷＯ９６／０９４０３に記載されたプロトコルに従
って測定する。酵素活性は、１時間あたり乾燥細胞１ｋｇあたりに形成された３
−ヒドロキシブタン酸アンモニウムのｋｇで表す。
で表す。酵素活性を国際特許ＷＯ９６／０９４０３に記載されたプロトコルに従
って測定する。酵素活性は、１時間あたり乾燥細胞１ｋｇあたりに形成された３
−ヒドロキシブタン酸アンモニウムのｋｇで表す。
【００６３】
【表６】
【００６４】 この実施例では、ニトリラーゼの発酵が大腸菌ＢＬ２１株中よりも大腸菌Ｗ株
中で盛んであること、及び、発酵が組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＢＩＯＣ
ＡＴ ５９４中よりも組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ ＢＩＯＣＡＴ ７１４中で盛
んであることが明らかである。
中で盛んであること、及び、発酵が組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＢＩＯＣ
ＡＴ ５９４中よりも組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ ＢＩＯＣＡＴ ７１４中で盛
んであることが明らかである。
【００６５】 実施例８：動物起原の有機窒素源の効果 菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ ＢＩＯＣＡＴ ７１４を、以下の組成の２リットルの
培地を収容した３．５リットル容の発酵槽で培養する。
培地を収容した３．５リットル容の発酵槽で培養する。
【００６６】
【表７】
【００６７】 アンモニアを加えてｐＨを７．０に維持する。１容量の培地あたり１容量／分
の空気を加えて撹拌することによって酸素飽和を２０％に維持する。最初にグル
コースを最終濃度２ｇ／リットルで導入する。グルコースが完全に消費された後
、７００ｇ／リットルのグルコース、１９．６ｇ／リットルのＭｇＳＯ４．７Ｈ ２ Ｏから成る組成をもつ母液からグルコースを連続的に導入する。添加速度は培
地１リットルあたりグルコース２．２ｇ／時とする。
の空気を加えて撹拌することによって酸素飽和を２０％に維持する。最初にグル
コースを最終濃度２ｇ／リットルで導入する。グルコースが完全に消費された後
、７００ｇ／リットルのグルコース、１９．６ｇ／リットルのＭｇＳＯ４．７Ｈ ２ Ｏから成る組成をもつ母液からグルコースを連続的に導入する。添加速度は培
地１リットルあたりグルコース２．２ｇ／時とする。
【００６８】 この培地に動物起原の有機窒素源を添加する。
【００６９】
【表８】
【００７０】 動物起原の有機窒素の使用濃度を増加すると細胞の比活性が有意に増加する。
【００７１】 実施例９：植物起原の有機窒素源の効果 実施例８と同じ培養条件を用いる。この実施例では植物起原の有機窒素を添加
する。
する。
【００７２】
【表９】
【００７３】 植物起原の有機窒素は、起原次第では同じ結果にならない。
【００７４】 意外にもジャガイモのタンパク質を添加したときに、動物起原の有機窒素と同
等の好結果が得られる。
等の好結果が得られる。
【００７５】 実施例１０：炭素源の効果 Ｅ．ｃｏｌｉ菌株 Ｗ ＢＩＯＣＡＴ ７１４を以下の組成をもつ２リットル
の培地を収容した３．５リットル容の発酵槽で培養する。
の培地を収容した３．５リットル容の発酵槽で培養する。
【００７６】
【表１０】
【００７７】 アンモニアを加えてｐＨを７．０に維持する。１容量の培地あたり１容量／分
の空気を加えて撹拌することによって酸素飽和を２０％に維持する。最初に炭素
源を最終濃度２ｇ／リットルで導入する。炭素源が完全に消費された後、７００
ｇ／リットルの炭素源、１９．６ｇ／リットルのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏから成る
組成の母液から炭素源を連続的に導入する。添加速度は培地１リットルあたりグ
ルコースまたサッカロースを２．２ｇ／時とする。
の空気を加えて撹拌することによって酸素飽和を２０％に維持する。最初に炭素
源を最終濃度２ｇ／リットルで導入する。炭素源が完全に消費された後、７００
ｇ／リットルの炭素源、１９．６ｇ／リットルのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏから成る
組成の母液から炭素源を連続的に導入する。添加速度は培地１リットルあたりグ
ルコースまたサッカロースを２．２ｇ／時とする。
【００７８】 この実施例では種々の炭素源を使用する。
【００７９】
【表１１】
【００８０】 この実施例では、サッカロース（ゼロシロップ）を炭素源として使用したとき
に細胞の比活性が有意に増加することが観察される。
に細胞の比活性が有意に増加することが観察される。
【００８１】 実施例１１：ＴｒｐＲレギュレーターの同時発現プラスミドの構築 ｔｒｐＲ遺伝子とそのプロモーターとを含む４３４ｂｐのＤＮＡフラグメント
を制限酵素ＡａｔＩＩ及びＳｔｕＩを用いてプラスミドｐＲＰＧ９（Ｇｕｎｓａ
ｌｕｓ ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７１１７−７１２１）から抽出した。このフラグメント
をプラスミドｐＳＬ３０１（Ｂｒｏｓｉｕｓ，１９８９，ＤＮＡ ８：７５９−
７７７）にクローニングし、約３．１ｋｂのＡａｔＩＩ−ＳｔｕＩフラグメント
に結合させることによってプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３０を作製した。ｔｒ
ｐＲ遺伝子とそのプロモーターとを４７５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメ
ントの形態でｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３０から抽出し、プラスミドｐＸＬ２０３５に
クローニングして２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントに置換した。
得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３４は、シャペロンＧｒｏＥＳＬとＴｒ
ｐＲレギュレーターとを発現させ得るｐＫＴ２３０の誘導体である。
を制限酵素ＡａｔＩＩ及びＳｔｕＩを用いてプラスミドｐＲＰＧ９（Ｇｕｎｓａ
ｌｕｓ ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７１１７−７１２１）から抽出した。このフラグメント
をプラスミドｐＳＬ３０１（Ｂｒｏｓｉｕｓ，１９８９，ＤＮＡ ８：７５９−
７７７）にクローニングし、約３．１ｋｂのＡａｔＩＩ−ＳｔｕＩフラグメント
に結合させることによってプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３０を作製した。ｔｒ
ｐＲ遺伝子とそのプロモーターとを４７５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメ
ントの形態でｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３０から抽出し、プラスミドｐＸＬ２０３５に
クローニングして２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントに置換した。
得られたプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３４は、シャペロンＧｒｏＥＳＬとＴｒ
ｐＲレギュレーターとを発現させ得るｐＫＴ２３０の誘導体である。
【００８２】 実施例１２：ＧｒｏＥＳＬとＴｒｐＲとの同時発現の効果 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３４を電気穿孔によって菌株ＤＨ５α（ｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ２９）、ＢＬ２１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９）及び菌株Ｗ（ｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ２９）に導入した。種々の菌株の発現培養物を実施例２に記載の手
順で調製し、結果を表５に示す。
Ａ−ＢＣＡＴ２９）、ＢＬ２１（ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９）及び菌株Ｗ（ｐＲＰ
Ａ−ＢＣＡＴ２９）に導入した。種々の菌株の発現培養物を実施例２に記載の手
順で調製し、結果を表５に示す。
【００８３】 表５：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９、ｐＸＬ２０３５及びｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ３４の組合せを組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
ＣＡＴ３４の組合せを組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
【００８４】
【表１２】 略号：Ｕ：活性，１時間あたり乾燥重量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡの
ｋｇ；Ｐ：産生率，１時間あたり培養物１リットルあたりに形成されたＨＭＴＢ
Ａのｋｇ
ｋｇ；Ｐ：産生率，１時間あたり培養物１リットルあたりに形成されたＨＭＴＢ
Ａのｋｇ
【００８５】 結果は、どの菌株を使用したかに関わりなく、ＧｒｏＥＳＬの同時発現が培養
物の産生率を増加させ同時に培養物の比活性を向上させることを示す。フランス
出願ＦＲ９６／１３０７７に記載のように電気泳動によってタンパク質を分析す
ると、得られた効果がニトリラーゼポリペプチドの溶解度の増加に相関関係を有
することが観察される。ＴｒｐＲレギュレーターの同時発現の効果は菌株毎に異
なっているが、Ｗ株中では培養物の産生率が増加する。
物の産生率を増加させ同時に培養物の比活性を向上させることを示す。フランス
出願ＦＲ９６／１３０７７に記載のように電気泳動によってタンパク質を分析す
ると、得られた効果がニトリラーゼポリペプチドの溶解度の増加に相関関係を有
することが観察される。ＴｒｐＲレギュレーターの同時発現の効果は菌株毎に異
なっているが、Ｗ株中では培養物の産生率が増加する。
【００８６】 実施例１３：ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１に存在するｃｅｒ遺伝子座の効果 プラスミドＣｏｌＥ１（Ｌｅｕｎｇら，１９８５，ＤＮＡ ４：３５１−３５
５）のｃｅｒ遺伝子座を含む３８２ｂｐのＨｐａＩＩのフラグメントを、複製型
のＭ１３ｍｐ７ファージの２つのＡｃｃＩ部位の処にクローニングした。得られ
た構築物からＥｃｏＲＩ酵素によってｃｅｒ遺伝子座を含む約４３０ｂｐのファ
ージを抽出し、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１のＥｃｏＲＩ部位の処にクローニングし
てプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６６を作製した。このプラスミドをプラスミド
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３４を組み込んだＷ株に電気穿孔によって導入した。実施例
２に記載の手順を使用し発現培養期間を２４時間に延長して種々の菌株の発現培
養物を調製し、１つの実験で各菌株の３つのクローンを試験した。平均結果を表
６に示す。
５）のｃｅｒ遺伝子座を含む３８２ｂｐのＨｐａＩＩのフラグメントを、複製型
のＭ１３ｍｐ７ファージの２つのＡｃｃＩ部位の処にクローニングした。得られ
た構築物からＥｃｏＲＩ酵素によってｃｅｒ遺伝子座を含む約４３０ｂｐのファ
ージを抽出し、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１のＥｃｏＲＩ部位の処にクローニングし
てプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６６を作製した。このプラスミドをプラスミド
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３４を組み込んだＷ株に電気穿孔によって導入した。実施例
２に記載の手順を使用し発現培養期間を２４時間に延長して種々の菌株の発現培
養物を調製し、１つの実験で各菌株の３つのクローンを試験した。平均結果を表
６に示す。
【００８７】 表６：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１，ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６６及びｐＲ
ＰＡ−ＢＣＡＴ３４を組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
ＰＡ−ＢＣＡＴ３４を組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
【００８８】
【表１３】 略号：ｇ／ｌ：培養物１リットルあたりの乾燥重量ｇ；Ｕ：１時間あたり乾燥重
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ
【００８９】 これらの結果は、ニトリラーゼの発現プラスミドにｃｅｒ遺伝子座が付加され
ると培養物の産生率が向上することを示す。
ると培養物の産生率が向上することを示す。
【００９０】 実施例１４：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７の構築 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３０の非反復ＮｄｅＩ部位を消化によって除去
し、ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）によって平滑末端を形成した後、
このプラスミドからｔｒｐＲ遺伝子を、ＡａｔＩＩ酵素で処理し次いでポリメラ
ーゼＩ（クレノウフラグメント）を作用させ次いで反応混合物を不活性化した後
でＳａｃＩＩ酵素で処理することによって調製した約３００ｂｐのフラグメント
の形態で抽出した。このフラグメントを、Ｔｔｈ１１１で開裂し次いでポリメラ
ーゼＩ（クレノウフラグメント）で処理し次に不活性化した後でＳａｃＩＩで処
理したプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６６にクローニングした。このようにして
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ８２が得られた。このプラスミドの約１．１２ｋ
ｂのフラグメントＢｓｔ１１０７１−Ｅａｍ１１０５１を置換することによって
その複製起点をプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１の複製起点で置換し
た。このクローニングによって選択された構築物であるプラスミドｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ９９は、Ｅａｍ１１０５１部位の処で１つのヌクレオチドが欠失しこの部
位が非反復ＰｓｈＡＩ部位に変換された形態を有している人工産物である。次に
該プラスミドの耐性マーカーを変更した。即ち、マトリックスｐＡＣＹＣ１８４
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃４０１−Ｍ）からクロラムフェ
ニコール耐性をコードする遺伝子をプライマーＣｍ１及びＣｍ２を使用してＰＣ
Ｒ増幅した後に調製された約１．０７ｋｂのＡａｔＩＩ−ＰｓｈＡＩフラグメン
トを、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９９のＡａｔＩＩ部位とＰｓｈＡＩ部位と
の間にクローニングした。プライマーＣｍ１及びＣｍ２は以下の配列を有してい
た： Ｃｍ１：５′−ＣＣＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＧＡＡＴＴ
ＴＣＴＧＣＣ Ｃｍ２：５′−ＴＴＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＧ。
し、ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）によって平滑末端を形成した後、
このプラスミドからｔｒｐＲ遺伝子を、ＡａｔＩＩ酵素で処理し次いでポリメラ
ーゼＩ（クレノウフラグメント）を作用させ次いで反応混合物を不活性化した後
でＳａｃＩＩ酵素で処理することによって調製した約３００ｂｐのフラグメント
の形態で抽出した。このフラグメントを、Ｔｔｈ１１１で開裂し次いでポリメラ
ーゼＩ（クレノウフラグメント）で処理し次に不活性化した後でＳａｃＩＩで処
理したプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ６６にクローニングした。このようにして
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ８２が得られた。このプラスミドの約１．１２ｋ
ｂのフラグメントＢｓｔ１１０７１−Ｅａｍ１１０５１を置換することによって
その複製起点をプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１の複製起点で置換し
た。このクローニングによって選択された構築物であるプラスミドｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ９９は、Ｅａｍ１１０５１部位の処で１つのヌクレオチドが欠失しこの部
位が非反復ＰｓｈＡＩ部位に変換された形態を有している人工産物である。次に
該プラスミドの耐性マーカーを変更した。即ち、マトリックスｐＡＣＹＣ１８４
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃４０１−Ｍ）からクロラムフェ
ニコール耐性をコードする遺伝子をプライマーＣｍ１及びＣｍ２を使用してＰＣ
Ｒ増幅した後に調製された約１．０７ｋｂのＡａｔＩＩ−ＰｓｈＡＩフラグメン
トを、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９９のＡａｔＩＩ部位とＰｓｈＡＩ部位と
の間にクローニングした。プライマーＣｍ１及びＣｍ２は以下の配列を有してい
た： Ｃｍ１：５′−ＣＣＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＧＡＡＴＴ
ＴＣＴＧＣＣ Ｃｍ２：５′−ＴＴＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＧ。
【００９１】 このようにした得られたプラスミドをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２３と命名した。
次いで、ｔｒｐＲ遺伝子を約０．５２５ｋｂのＳａｃＩ−Ｂｓｔ１１０７１フラ
グメントの形態で除去し、ポリメラーゼＰｆｕで平滑末端を形成した後でプラス
ミドを再度閉環した（製造業者Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ推奨のバッファ中で０．２
ｍＭのデオキシヌクレオチドの存在下で７５℃で１５分間処理する）。このよう
にしてプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７が得られた。このプラスミドの制限
地図を図２に概略図で示す。
次いで、ｔｒｐＲ遺伝子を約０．５２５ｋｂのＳａｃＩ−Ｂｓｔ１１０７１フラ
グメントの形態で除去し、ポリメラーゼＰｆｕで平滑末端を形成した後でプラス
ミドを再度閉環した（製造業者Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ推奨のバッファ中で０．２
ｍＭのデオキシヌクレオチドの存在下で７５℃で１５分間処理する）。このよう
にしてプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７が得られた。このプラスミドの制限
地図を図２に概略図で示す。
【００９２】 実施例１５：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０
３の構築 フランス出願ＦＲ９６／１３０７７に記載のプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３
７の約３．２ｋｂのＳｆｉＩ−ＳｃａＩフラグメントをプラスミドＲＳＦ１０１
０Ｄ２０（Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：１０１−１０６）の約２
．４２ｋｂのＳｆｉＩ−ＳｃａＩフラグメントで置換することによってプラスミ
ドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３７を修飾した。このフラグメントはＲｅｐＢプライマー
ゼをコードする遺伝子の５′部分に１つの欠失を有しており、プラスミドの伝達
頻度が６ｌｏｇの減少を示す（Ｆｒｅｙら，前出）。このようにして得られたプ
ラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８は幾つかの利点を有している。即ち、グラム陰
性細菌中で複製されるという特性を完全に維持していながら、移動機能の喪失に
よって工業的生体安全基準に適合する。
３の構築 フランス出願ＦＲ９６／１３０７７に記載のプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３
７の約３．２ｋｂのＳｆｉＩ−ＳｃａＩフラグメントをプラスミドＲＳＦ１０１
０Ｄ２０（Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：１０１−１０６）の約２
．４２ｋｂのＳｆｉＩ−ＳｃａＩフラグメントで置換することによってプラスミ
ドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３７を修飾した。このフラグメントはＲｅｐＢプライマー
ゼをコードする遺伝子の５′部分に１つの欠失を有しており、プラスミドの伝達
頻度が６ｌｏｇの減少を示す（Ｆｒｅｙら，前出）。このようにして得られたプ
ラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８は幾つかの利点を有している。即ち、グラム陰
性細菌中で複製されるという特性を完全に維持していながら、移動機能の喪失に
よって工業的生体安全基準に適合する。
【００９３】 次に、ｐａｒ遺伝子座（Ｇｅｒｌｉｔｚら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７２：６１９４−６２０３）を以下の手順でｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８にク
ローニングした。先ず、ｐＧＭＡ２８（Ｇｅｒｌｉｔｚら，前出）の約２．３ｋ
ｂのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをベクターｐＵＣ１８にクローニングし
、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で抽出し、ベクターｐＭＴＬ
２２（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９８８，Ｇｅｎｅ ６８：１３９−４９）にクロ
ーニングした。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩで消化しクレノウで処理することによっ
てＨｉｎｄＩＩＩ部位を破壊した。約２．３８ｋｂのフラグメントを酵素Ｐｓｔ
Ｉ及びＢｇｌＩＩで抽出し、ベクターｐＸＬ２４２６のＰｓｔＩ部位及びＢａｍ
ＨＩ部位にクローニングし、ベクターｐＸＬ２５７２を作製した。ベクターｐＸ
Ｌ２４２６は、ｐＸＬ２３９１（フランス出願ＦＲ９６／１３０７７）の２．３
８ｋｂのＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントをＲＳＦ１０１０Ｄ２０の１．４７
ｋｂのＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントで置換することによって得られた。プ
ラスミドｐＸＬ２５７２のＮｄｅＩ部位及びＢａｍＨＩ部位に、ｐＲＲ７１（Ｗ
ｅｉｎｓｔｅｉｎら，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７４８６−
７４８９）の約０．９６０ｂｐのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをクローニ
ングして、プラスミドｐＸＬ２５７３のｐａｒ遺伝子座を完全に復元した。この
遺伝子座をｐＸＬ２５７３から２．６ｋｂのフラグメントＥｃｏＲＩ−平滑末端
（ＰｓｔＩ及びクレノウで処理後）の形態で抽出し、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩに
よって開裂したプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８にクローニングした。後者の
末端はポリメラーゼＰｆｕで処理しておいた。得られたプラスミドをｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ１０３と命名し、その制限地図を図３に概略図で示す。
ｌ．１７２：６１９４−６２０３）を以下の手順でｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８にク
ローニングした。先ず、ｐＧＭＡ２８（Ｇｅｒｌｉｔｚら，前出）の約２．３ｋ
ｂのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをベクターｐＵＣ１８にクローニングし
、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で抽出し、ベクターｐＭＴＬ
２２（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９８８，Ｇｅｎｅ ６８：１３９−４９）にクロ
ーニングした。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩで消化しクレノウで処理することによっ
てＨｉｎｄＩＩＩ部位を破壊した。約２．３８ｋｂのフラグメントを酵素Ｐｓｔ
Ｉ及びＢｇｌＩＩで抽出し、ベクターｐＸＬ２４２６のＰｓｔＩ部位及びＢａｍ
ＨＩ部位にクローニングし、ベクターｐＸＬ２５７２を作製した。ベクターｐＸ
Ｌ２４２６は、ｐＸＬ２３９１（フランス出願ＦＲ９６／１３０７７）の２．３
８ｋｂのＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントをＲＳＦ１０１０Ｄ２０の１．４７
ｋｂのＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントで置換することによって得られた。プ
ラスミドｐＸＬ２５７２のＮｄｅＩ部位及びＢａｍＨＩ部位に、ｐＲＲ７１（Ｗ
ｅｉｎｓｔｅｉｎら，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７４８６−
７４８９）の約０．９６０ｂｐのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをクローニ
ングして、プラスミドｐＸＬ２５７３のｐａｒ遺伝子座を完全に復元した。この
遺伝子座をｐＸＬ２５７３から２．６ｋｂのフラグメントＥｃｏＲＩ−平滑末端
（ＰｓｔＩ及びクレノウで処理後）の形態で抽出し、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩに
よって開裂したプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８にクローニングした。後者の
末端はポリメラーゼＰｆｕで処理しておいた。得られたプラスミドをｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ１０３と命名し、その制限地図を図３に概略図で示す。
【００９４】 実施例１６：Ｗ株中でニトリラーゼを発現させるためのプラスミドｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ９８、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７の使用 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８、ｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ１０３、ｐＸＬ２０３５及びｐＸＬ２２３１（フランス出願ＦＲ９６／
１３０７７）を電気穿孔によって大腸菌Ｗ株に導入し、実施例２に記載の条件で
下記の抗生物質を使用して発現培養物を調製した。使用した抗生物質は、ｐＸＬ
２２３１には１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、ｐＸＬ２０３５には５０μｇ
／ｍｌのカナマイシン、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３
には１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７には２
０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールであった。プラスミドの組合せの各々につ
いて、２−３個のクローンを分析し、平均結果を表７に示す。
ＢＣＡＴ９８、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７の使用 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８、ｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ１０３、ｐＸＬ２０３５及びｐＸＬ２２３１（フランス出願ＦＲ９６／
１３０７７）を電気穿孔によって大腸菌Ｗ株に導入し、実施例２に記載の条件で
下記の抗生物質を使用して発現培養物を調製した。使用した抗生物質は、ｐＸＬ
２２３１には１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、ｐＸＬ２０３５には５０μｇ
／ｍｌのカナマイシン、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３
には１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７には２
０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールであった。プラスミドの組合せの各々につ
いて、２−３個のクローンを分析し、平均結果を表７に示す。
【００９５】 表７：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２
７、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３、ｐＸＬ２０３５及び
ｐＸＬ２２３１を組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
７、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３、ｐＸＬ２０３５及び
ｐＸＬ２２３１を組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
【００９６】
【表１４】 略号：ｇ／ｌ：培養物１リットルあたりの乾燥重量ｇ；Ｕ：１時間あたり乾燥重
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ
【００９７】 ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ
１２７／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３の組合せは、欧州の生体安全基準に適合する
プラスミドを使用するときと少なくとも同等の産生率を示す。
１２７／ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３の組合せは、欧州の生体安全基準に適合する
プラスミドを使用するときと少なくとも同等の産生率を示す。
【００９８】 実施例１７：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６の構築 実施例１４に記載のプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９９の耐性マーカーを以下
の手順で変更した。ベクターを酵素ＰｓｈＡＩ及びＡａｔＩＩによって開裂し、
次いでポリメラーゼＰｆｕで処理（製造業者Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの推奨するバ
ッファ中で０．２ｍＭのデオキシヌクレオチドの存在下で７５℃で５分間処理）
し、約３．９５ｋｂのフラグメントをＱｕｉａｅｘキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を
用いてアガロースゲルから抽出した〔別のＤＮＡ回収系、特にクロマトグラフィ
ー型の回収系を使用してもよい〕。このフラグメントをプラスミドｐＢＲ３２２
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ｒｅｆ３０３−３Ｓ）から抽出し
た１．３２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｍＩフラグメントに慣用の方法で結合さ
せ、次いでポリメラーゼＰｆｕによって上記のごとく処理した。得られたプラス
ミドのうちで、ニトリラーゼの発現カセットと同じ転写方向に配向されたテトラ
サイクリン耐性遺伝子を担うインサートを含むプラスミドをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ
１１１と命名した。このプラスミドを酵素ＮｓｉＩ及びＢｓｔＺ１７１によって
開裂し、次いでポリメラーゼＰｆｕで処理し、再結合させてｔｒｐＲ遺伝子を含
む０．４７ｋｂのフラグメントを除去した。得られたプラスミドをｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ１２６と命名し、その制限地図を図４に示す。
の手順で変更した。ベクターを酵素ＰｓｈＡＩ及びＡａｔＩＩによって開裂し、
次いでポリメラーゼＰｆｕで処理（製造業者Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの推奨するバ
ッファ中で０．２ｍＭのデオキシヌクレオチドの存在下で７５℃で５分間処理）
し、約３．９５ｋｂのフラグメントをＱｕｉａｅｘキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を
用いてアガロースゲルから抽出した〔別のＤＮＡ回収系、特にクロマトグラフィ
ー型の回収系を使用してもよい〕。このフラグメントをプラスミドｐＢＲ３２２
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ｒｅｆ３０３−３Ｓ）から抽出し
た１．３２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｍＩフラグメントに慣用の方法で結合さ
せ、次いでポリメラーゼＰｆｕによって上記のごとく処理した。得られたプラス
ミドのうちで、ニトリラーゼの発現カセットと同じ転写方向に配向されたテトラ
サイクリン耐性遺伝子を担うインサートを含むプラスミドをｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ
１１１と命名した。このプラスミドを酵素ＮｓｉＩ及びＢｓｔＺ１７１によって
開裂し、次いでポリメラーゼＰｆｕで処理し、再結合させてｔｒｐＲ遺伝子を含
む０．４７ｋｂのフラグメントを除去した。得られたプラスミドをｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ１２６と命名し、その制限地図を図４に示す。
【００９９】 実施例１８：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３の構築 実施例１５に記載のプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８を酵素ＳｆｉＩ及びＳ
ｃａＩによって開裂し、ＲｅｐＢプライマーゼをコードする遺伝子の５′部分に
欠失を含む２．４２ｋｂのフラグメントを、ｒｅｐＢ遺伝子の５′部分の２６７
ｂｐのインフェーズの欠失を含むプラスミドＲＳＦ１０１０Δ１８（Ｆｒｅｙら
，１９９２，Ｇｅｎｅ １３：１０１−１０６）から抽出した２．９６ｋｂのＳ
ｆｉＩ−ＳｃａＩフラグメントによって置換した。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡ
Ｔ１４３に導入された欠失はプラスミドの伝達頻度を１０−６に低下させ（Ｆｒ
ｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：１０１−１０６）、プラスミドを生体安
全基準の規定に適合させる。前述のプラスミドｐＲＰＡ６ＢＣＡＴ９８とは違っ
て、この新しいプラスミドは非修飾のプラスミドｐＸＬ２０３５（Ｌｅｖｙ−Ｓ
ｃｈｉｌｌら，１９９５，Ｇｅｎｅ １６１：１５−２０）のコピー数に近いコ
ピー数を維持している。このプラスミドを図２に示す。
ｃａＩによって開裂し、ＲｅｐＢプライマーゼをコードする遺伝子の５′部分に
欠失を含む２．４２ｋｂのフラグメントを、ｒｅｐＢ遺伝子の５′部分の２６７
ｂｐのインフェーズの欠失を含むプラスミドＲＳＦ１０１０Δ１８（Ｆｒｅｙら
，１９９２，Ｇｅｎｅ １３：１０１−１０６）から抽出した２．９６ｋｂのＳ
ｆｉＩ−ＳｃａＩフラグメントによって置換した。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡ
Ｔ１４３に導入された欠失はプラスミドの伝達頻度を１０−６に低下させ（Ｆｒ
ｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：１０１−１０６）、プラスミドを生体安
全基準の規定に適合させる。前述のプラスミドｐＲＰＡ６ＢＣＡＴ９８とは違っ
て、この新しいプラスミドは非修飾のプラスミドｐＸＬ２０３５（Ｌｅｖｙ−Ｓ
ｃｈｉｌｌら，１９９５，Ｇｅｎｅ １６１：１５−２０）のコピー数に近いコ
ピー数を維持している。このプラスミドを図２に示す。
【０１００】 実施例１９：Ｗ株中でニトリラーゼを発現させるためのプラスミドｐＲＰＡ−
ＢＣＡＴ１２６及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３の使用 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７（前述）、
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８及びｐＸＬ２０３５を電気
穿孔によって大腸菌Ｗ株に導入し、実施例２に記載の条件で以下の抗生物質を使
用して発現培養物を調製した。使用した抗生物質は、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−
５３１及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６では１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで
あり、ｐＸＬ２０３５では５０μｇ／ｍｌのカナマイシンであり、ｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ９８及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３では１００μｇ／ｍｌのストレプトマ
イシンであり、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７では２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニ
コールであった。プラスミドの各組合せ毎に２−３個のクローンを分析し、平均
結果を表８に示す。
ＢＣＡＴ１２６及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３の使用 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７（前述）、
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８及びｐＸＬ２０３５を電気
穿孔によって大腸菌Ｗ株に導入し、実施例２に記載の条件で以下の抗生物質を使
用して発現培養物を調製した。使用した抗生物質は、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−
５３１及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６では１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで
あり、ｐＸＬ２０３５では５０μｇ／ｍｌのカナマイシンであり、ｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ９８及びｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３では１００μｇ／ｍｌのストレプトマ
イシンであり、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７では２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニ
コールであった。プラスミドの各組合せ毎に２−３個のクローンを分析し、平均
結果を表８に示す。
【０１０１】 表８：プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２
６、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ
１４３及びｐＸＬ２０３５を組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
６、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ９８、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ
１４３及びｐＸＬ２０３５を組み込んだ菌株のバイオマス及び活性
【０１０２】
【表１５】 略号：ｇ／ｌ：培養物１リットルあたりの乾燥重量ｇ；Ｕ：１時間あたり乾燥重
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ
量１ｋｇあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ；Ｐ：１時間あたり培養物１リッ
トルあたりに形成されたＨＭＴＢＡのｋｇ
【０１０３】 プラスミドｐＢＣＡＴ９８と違って、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３と
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７または
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６のいずれか１つとの組合せは、プラスミドｐＸＬ２０
３５を組み込んだ菌株で得られる培養物の産生率を維持し得る。
プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１−５３１、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７または
ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６のいずれか１つとの組合せは、プラスミドｐＸＬ２０
３５を組み込んだ菌株で得られる培養物の産生率を維持し得る。
【配列表】
【図１】 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１の制限地図を示す。括弧内の部位はクロー
ニングのときに除去された部位を表す。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター
；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ターミネーター；ｆｉｎ
ＲＯＰ：ＲＯＰタンパク質をコードする遺伝子の終点（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，
１９８８，Ｇｅｎｅ６８：１３９−１４９）；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡＩ／Ｉ
Ｉ：複製に関与するＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）；Ｔｃ：テトラサイク
リン耐性遺伝子。
ニングのときに除去された部位を表す。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター
；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ターミネーター；ｆｉｎ
ＲＯＰ：ＲＯＰタンパク質をコードする遺伝子の終点（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，
１９８８，Ｇｅｎｅ６８：１３９−１４９）；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡＩ／Ｉ
Ｉ：複製に関与するＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，前出）；Ｔｃ：テトラサイク
リン耐性遺伝子。
【図２】 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２７の制限地図を示す。括弧内の部位はクロ
ーニングのときに除去された部位を表す。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモータ
ー；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ターミネーター；ＯＲ
Ｉ：複製起点；ＲＮＡＩ＊／ＩＩ：複製に関与する突然変異ＲＮＡ；Ｃｍ：クロ
ラムフェニコール耐性遺伝子；ｃｅｒ：ｃｅｒ遺伝子座。
ーニングのときに除去された部位を表す。Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモータ
ー；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ターミネーター；ＯＲ
Ｉ：複製起点；ＲＮＡＩ＊／ＩＩ：複製に関与する突然変異ＲＮＡ；Ｃｍ：クロ
ラムフェニコール耐性遺伝子；ｃｅｒ：ｃｅｒ遺伝子座。
【図３】 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１０３の制限地図を示す。括弧内の部位はクロ
ーニングのときに除去された部位を表す。Ｓｍ／Ｓｐ：ストレプトマイシン及び
スペクチノマイシンに耐性の遺伝子；ｐａｒＡＢＣＤＥ：ｐａｒ遺伝子座（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７４：８１１９−８１３２）；ｒｅｐ，ｍｏｂ，Ｄ２０及びｏｒｉ：プラスミ
ドの複製及び伝達に関与する領域（Ｓｃｈｏｌｔｚら，１９８９，Ｇｅｎｅ ７
５：２７１−２８８；Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：１０１−１０
６）。
ーニングのときに除去された部位を表す。Ｓｍ／Ｓｐ：ストレプトマイシン及び
スペクチノマイシンに耐性の遺伝子；ｐａｒＡＢＣＤＥ：ｐａｒ遺伝子座（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７４：８１１９−８１３２）；ｒｅｐ，ｍｏｂ，Ｄ２０及びｏｒｉ：プラスミ
ドの複製及び伝達に関与する領域（Ｓｃｈｏｌｔｚら，１９８９，Ｇｅｎｅ ７
５：２７１−２８８；Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：１０１−１０
６）。
【図４】 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１２６の制限地図を示す。Ｐｔｒｐ：トリプト
ファンプロモーター；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ター
ミネーター；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡＩ＊／ＩＩ：複製に関与する突然変異Ｒ
ＮＡ；Ｔｃｒ：テトラサイクリン耐性遺伝子；ｃｅｒ：ｃｅｒ遺伝子座。
ファンプロモーター；ｎｉｔＢ：ニトリラーゼの遺伝子；ＴｒｒｎＢ：転写ター
ミネーター；ＯＲＩ：複製起点；ＲＮＡＩ＊／ＩＩ：複製に関与する突然変異Ｒ
ＮＡ；Ｔｃｒ：テトラサイクリン耐性遺伝子；ｃｅｒ：ｃｅｒ遺伝子座。
【図５】 プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１４３の制限地図を示す。Ｓｍ／Ｓｐ：ストレ
プトマイシン及びスペクチノマイシンに耐性の遺伝子；ｒｅｐ，ｍｏｂ及びｏｒ
ｉ：プラスミドの複製及び伝達に関与する領域（Ｓｃｈｏｌｔｚら，１９８９，
Ｇｅｎｅ ７５：２７１−２８８；Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：
１０１−１０６）；ｄｅｌｔａは本文に記載された欠失を表す。
プトマイシン及びスペクチノマイシンに耐性の遺伝子；ｒｅｐ，ｍｏｂ及びｏｒ
ｉ：プラスミドの複製及び伝達に関与する領域（Ｓｃｈｏｌｔｚら，１９８９，
Ｇｅｎｅ ７５：２７１−２８８；Ｆｒｅｙら，１９９２，Ｇｅｎｅ １１３：
１０１−１０６）；ｄｅｌｔａは本文に記載された欠失を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 フアーブル−ビユル，オリビエ フランス国、エフ−69003・リヨン、リ ユ・バラバン、113 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA11 CA02 DA06 EA04 FA02 GA14 GA19 4B050 CC03 DD02 EE02 EE10 4B064 AG01 CA02 CC03 CC08 CC24 CD13 CD20 4B065 AA12Y AA26X AB01 AC14 BA03 BB12 BB16 BB19 BB26 BC10 CA31
Claims (20)
- 【請求項１】 適正な異種タンパク質発現系によって修飾された大腸菌の菌
株を適切な培養培地に播種して培養する段階から成り、大腸菌の菌株がＥ．ｃｏ
ｌｉ Ｗ株であることを特徴とする、大腸菌中で異種タンパク質を産生させる工
業的方法。 - 【請求項２】 Ｗ株が、ＡＴＣＣに登録番号９６３７で寄託されたＷ株であ
ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 Ｗ株が、ＡＴＣＣに登録番号９６３７で寄託されたＷ株から
クローン選択または遺伝子操作によって得られた誘導体であることを特徴とする
請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 適切な培養培地が、高密度バイオマス及び高含量異種タンパ
ク質の産生に適した培養培地であることを特徴とする請求項１から３のいずれか
一項に記載の方法。 - 【請求項５】 培養培地がＬ−トリプトファンを含むことを特徴とする請求
項１から４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 培養培地中のＬ−トリプトファンの量が０．０５−０．５ｇ
／リットル、好ましくは０．１−０．３ｇ／リットルの範囲であることを特徴と
する請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 培養培地が主炭素源としてサッカロースを含むことを特徴と
する請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 培養培地が主炭素源として実質的にサッカロースだけを含む
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 培養初期の培養培地中のサッカロースの量が０．１−３００
ｇ／リットル、好ましくは０．５−２００ｇ／リットルであることを特徴とする
請求項７または８に記載の方法。 - 【請求項１０】 適切な培養培地が更に、補助的有機窒素源を含むことを特
徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】 補助的有機窒素源がタンパク質抽出物から成ることを特徴
とする請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 タンパク質抽出物が、産生物１００ｇあたりのアミノ酸の
ｇ数で表して、アラニン１０−４、アスパラギン酸１１−４、グリシン２２−２
．５及びリシン７−４から成る組成をもつことを特徴とする請求項９または１０
に記載の方法。 - 【請求項１３】 補助的有機窒素源が食肉またはジャガイモのペプトンまた
はタンパク質、特にジャガイモタンパク質の誘導体から成ることを特徴とする請
求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】 適正な異種タンパク質発現系がＰｔｒｐプロモーターを含
むことを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｐｔｒｐプロモーターが配列１（識別子：ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ１）で表される核酸配列を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 異種タンパク質が酵素であることを特徴とする請求項１か
ら１５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１７】 酵素が化学反応の生体触媒として有効であることを特徴と
する請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 酵素がニトリラーゼであることを特徴とする請求項１７に
記載の方法。 - 【請求項１９】 プロモーターがＰｔｒｐプロモーターから成る異種タンパ
ク質発現系を含むことを特徴とする大腸菌Ｗ株。 - 【請求項２０】 Ｐｔｒｐプロモーターが配列１（識別子：ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ１）で表される核酸配列を含むことを特徴とする請求項１９に記載の菌株。
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