KR100385298B1 - 단백질 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 성장휴지기에 활성을 갖고 배양 조건에 따라 발현의 유도 조절이 가능한 프로모터와 단백질을 암호화하는 DNA 단편이 포함된 발현시스템에 의해 형질전환된 균주를 이용하여 소정의 배양 조건에서 용이하게 단백질 발현의 유도를 조절함으로써 단백질을 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 단백질 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 성장휴지기에 활성을 갖고 배양 조건에 따라 발현의 유도 조절이 가능한 프로모터와 단백질을 암호화하는 DNA 단편이 포함된 발현시스템에 의해 형질전환된 균주를 이용하여 소정의 배양 조건에서 용이하게 단백질 발현의 유도를 조절함으로써 단백질을 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
미생물을 이용한 단백질의 발현조절은 대부분 핵산의 전사과정에서 이루어지므로, 미생물 내에서 단백질을 효과적으로 발현시키기 위해서는 강력한 프로모터를 적절하게 선택하여야 한다[Makrides, 1996년,Microbiological Reviews, 60권 512 ∼ 538]. 이러한 강력한 프로모터가 갖추어야 할 요소로는 첫째, 매우 강력한 전사활성을 보여 전사 리보핵산을 과량으로 합성할 수 있고, 둘째, 발현조절을 잘 할 수 있어야 하므로, 단백질 발현을 유도하기 전에는 프로모터가 매우 낮은 수준의 전사활성을 갖거나 없어야 하며, 셋째, 대장균과 같은 숙주세포에 형질전환이 잘 되어야 하고, 넷째, 발현유도가 간단할 뿐만 아니라 경제적으로 저렴한 것이 바람직하다.
일반적으로 대장균을 이용한 단백질의 생합성을 위한 재조합 벡터의 제조에 사용되어 온 프로모터로는lac프로모터[Roberts et al., 1979년,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76권, 760 ∼ 764],tac프로모터[Aman et al., 1983년,Gene, 25권, 167 ∼ 178],trc프로모터[Brosius et al., 1985년,J. Biol. Chem., 260권, 3539 ∼ 3541], PL 또는 PR 프로모터[Elvin et al., 1990년,Gene, 87권, 123 ∼126], T7 프로모터[Studier et al., 1986년,J. Mol. Biol., 189권, 113 ∼ 130] 등이 있다. 이들 프로모터는 특정 유도체가 존재할 경우 모두 강력한 전사활성을 보여 총단백질의 10 ∼ 30% 이상의 단백질을 세포 내에 축적하는 장점이 있는 반면에, 상기의 프로모터들은 모두 세포가 성장상태에서 그 활성이 높게 유지되는 단점이 있다. 또한, 매우 효과적으로 전사를 조절할 수 있는lac프로모터 또는 람다 파아지로부터 유래한 프로모터를 사용하여 재조합 발현시스템은 실험실 수준의 대장균 배양에서는 매우 효과적이고 간편하지만, 매우 큰 부피의 배양일 경우에는 매우 불리한 단점을 갖고 있다. 그리고,lac프로모터를 사용한 발현시스템에서는 유도체로 이소프로필티오갈락토사이드(isopropyl-thiogalactoside, IPTG)를 사용하는데, 이는 매우 고가의 화합물이므로 큰 부피의 배양액일 경우는 비경제적인 단점이 있다.
이외에도, 람다 파아지로부터 유래한 프로모터를 사용한 발현시스템의 경우, 발현을 유도하기 위하여 온도를 상승시켜야 하는데, 이때 온도의 상승으로 단백질이 비활성 상태인 함유체(inclusion body)를 형성하거나 큰 부피의 배양일 경우 배양기내의 온도가 불균일한 등의 단점도 있다.
이와 같은 상기의 문제점을 극복하기 위하여, 특정 조건의 성장휴지기에서 전사활성이 있는phoA 프로모터[Miyake et al., 1985년,J. Biochem., 97권, 1429 ∼ 1436],cst-1 프로모터[Turner et al., 1992년,Biotechnol. Bioengin., 40권, 271 ∼ 279],nar프로모터[Lee et al., 1996년,Biotechnol. Lett., 18권, 129 ∼ 134],trp프로모터[Yansura et al., 1990년,Methods. Enzymol., 185권, 54 ∼60] 등의 프로모터를 사용한 발현시스템이 보고되어 있다. 그러나, 이들 프로모터 또한 여전히 단백질 발현의 조절이 복잡하고 비효율적인 문제점이 있어 이에 대한 개선의 필요성이 지대한 실정이었다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 단백질의 발현에 대한 조절이 효율적이고 간편한 발현시스템과 이를 사용한 단백질의 생합성 방법에 관한 연구 결과, 상기한 바와 같이 성장휴지기에서 단백질의 발현을 유도할 때의 잇점을 이용하기 위하여 성장휴지기에 활성을 갖고, 배지의 성분으로 초산이나 숙신산과 같은 유기산화합물에 의해 전사가 유도되는 프로모터에 주목하여, 이러한 프로모터를 포함하는 신규 재조합 벡터를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 성장휴지기에 활성을 갖고 배양조건에 따라 용이하게 발현 조절이 가능한 특징을 갖는 발현시스템을 이용하여 단백질 발현의 유도를 효율적이고도 용이하게 조절하는 새로운 단백질의 생산방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라, 공시된 대장균의 염색체인 고하라(Kohara) 람다 라이브러리 638로부터acs유전자와 그 프로모터 부분을 암호화하고 있는 부분을 공시 플라스미드인 pGEM-7fz(+/-)에 서브클로닝하여 pSS112를 제조하는 과정을 도식한 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따라, pSS112로 형질전환된 대장균 JM109를 배양하고 acs 유전자로부터 유도되는 ACS 단백질의 생산정도를 SDS - PAGE 젤상에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에 따라, pSS112로부터 acs 프로모터 부분과 acs 유전자 처음부분을 암호하고 있는 부위(1384 bp)를 공시 플라스미드인 pBluescript II KS(+/-)에 서브클로닝하여 pSK122(4.4 kb)를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에 따라, pSK122로부터 프로모터 확인벡터인 공시 플라스미드 pRS415에 서브클로닝하여 pSS121(약 11 kb)를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 4에 따라, pSS121로 형질전환된 대장균 JM109을 엘비(LB) 배지에서 배양하고,acs프로모터에 의해 유도되는 베타글루코시다아제 단백질(화살표로 표시)의 생산정도를 SDS - PAGE 젤상에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 4에 따라, pSS121로 형질전환된 대장균 JM109를 포도당이 첨가된 엘비 배지에서 배양하였을 경우,acs프로모터에 의해 유도되는 베타글로코시다아제 단백질(화살표로 표시)의 생산정도를 SDS - PAGE 젤상에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4에 따라, pSS121로 형질전환된 대장균 JM109를 M9 포도당 배지(1 ∼ 4번 시료)와 M9 숙신산 배지(5 ∼ 8번 시료)에서 배양하고,acs로부터 유도되는 베타글로코시다아제 단백질(화살표로 표시)의 생산정도를 SDS - PAGE 젤상에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 5에 따라,acs프로모터만을 서브클로닝하여 범용 단백질 발현벡터 pJHC30을 제조하는 과정과 이에 키틴나아제 유전자와 리파제유전자를 서브클로닝하여 pJHC31과 pJHC35를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 5에 따라, pJHC31에 의해 발현되는 키틴나아제의 발현정도를(화살표로 표시) SDS - PAGE 젤상에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 5에 따라, pJHC35에 의해 발현되는 리파제의 발현정도를(화살표로 표시) SDS - PAGE 젤상에서 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 유전자 재조합 방법에 의한 단백질 생산 방법에 있어서,
(a) 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자와 성장휴지기에서 전사유도 활성을갖으며 유기산화합물에 의해 전사가 유도되는 프로모터을 포함하는 유전자 발현벡터를 제작하는 단계,
(b) 제작된 유전자 발현벡터가 안정하게 유지되도록 그람음성 숙주균에 형질전환시키는 단계,
(c) 형질전환된 균주를 배지 내에서 배양하여 단백질의 발현을 유도하는 단계,
(d) 최종적으로 상기 형질전환된 숙주균의 배양액으로부터 목적단백질을 회수하는 단계로 구성되는 단백질 생산방법을 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명자들은 단백질 발현기술의 핵심으로 프로모터 선택이 매우 중요하다는 점으로부터, 알란 울프(Alan Wolfe) 등에 의해 특성이 보고된 바 있는 대장균acs유전자의 프로모터에 주목하여[Kumari 등, 1995년,J. Bacteriol., 177권, 2878 ∼ 2886],acs프로모터를 연구한 결과, 상기의 프로모터는 배지 중의 포도당에 의해 발현이 억제되고, 초산에 의해 발현이 유도되며, 이러한 발현유도는 성장휴지기 발현조절 됨을 보고한 바 있다[신수안 등, 1997년,FEMS Microbiology Letters, 146권, 103 ∼ 108].
본 발명자들은 숙주세포의 성장휴지기에서의 단백질 발현을 유도할 때의 장점을 활용하기 위하여, 상기의acs프로모터와 같은 성장 휴지기에 활성을 갖는 프로모터를 발현 시스템에 도입하는 것을 착안하였다. 상기와 같은 성장 휴지기에 활성을 갖는 프로모터를 사용하면, 이를 포함한 발현시스템을 이용하여 단백질을 발현시키는 경우 세포성장 단계와 단백질 발현단계를 분리할 수 있다. 이렇게 두 단계를 분리하면, 단계마다 서로 알맞은 배양최적화전략을 세울 수 있고, 단백질 발현 없이 고농도로 숙주세포를 배양하여 단백질의 발현을 유도할 수 있으므로, 종래보다 더욱 효율적인 단백질의 생산이 가능해진다.
한편, 성장휴지기동안 단백질의 발현을 가능하게 하기 위해서는 적절한 에너지의 공급방법과 장시간 단백질 합성을 유도할 수 있는 방법을 찾아야 하는데, 최근 로웨와 서머스에 의한 성장휴지상태의 세포를 이용한 단백질 고발현계는 이러한 점을 극복할 수 있는 길을 열어 놓았다[Rowe 와 Summers, 1999년,Appl. Environ. Microbiol.65권 2710 ∼ 2715].
본 발명에 의해 발현시스템으로 제공되는 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터는 다음과 같은 과정으로 제조된다.
먼저, 성장휴지기에서 활성을 갖거나, 또는 초산이나 숙신산과 같은 유기산화합물에 의해 전사가 유도되는 프로모터를 확보한다. 이러한 본 발명의 프로모터는 대장균acs유전자의 DNA 단편 또는 그 일부분과 동일하거나 비슷한 생물학적 기능을 보이는 유전자 DNA 단편이 포함되는 것을 특징으로 한다. 또한, 대장균뿐만 아니라 여타의 다른 박테리아 및 곰팡이, 효모, 방선균 등으로부터 유래된acs프로모터도 같은 기능을 하고 있으면 비슷한 원리로 쉽게 적용이 가능하다.
그리고, 통상적인 방법으로 유용한 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 확보한다. 본 발명에서 사용한 DNA 단편으로는 아세틸코에이 합성효소를 암호화하는 유전자(acs), 베타갈락토시다제를 암호화하는 유전자(lacZ), 키틴나아제를 암호화하는 유전자(chiA), 또는 리파제를 암호화하는 유전자(tliA)를 포함하는 DNA 단편을 사용하였으며, 이외에도 통상적으로 발현을 시키고자 하는 단백질의 유전자를 포함하는 DNA 단편을 확보하여 본 발명에 따라 적용시킬 수 있다.
상기와 같이 프로모터 및 외래단백질을 암호화하는 DNA 단편을 확보한 다음, 일반적인 재조합 DNA 제조방법에 의하여, 상기한 프로모터에 의해 상기한 외래단백질이 독점적으로 또는 거의 독점적으로 발현될 수 있도록, 상기 프로모터와 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 서로 연결한 신규 재조합 벡터를 제조한다. 상기와 같이 제조된 발현시스템인 재조합 벡터를 발현시키기 위하여, 안정하게 유지될 수 있는 숙주세포에 형질전환한다. 이때, 숙주세포로는 대장균과 같은 엔테로박테리아시애(Enterobacteriaceae)족에 속하는 박테리아를 사용하며, 상기의 형질전환된 박테리아를 통상적인 방법으로 배양한다.
본 발명은 상기 발현시스템인 신규 재조합 벡터와 더불어, 상기와 같이 제조된 발현시스템의 발현을 배양조건에 따라 용이하게 조절함으로써, 단백질을 효과적으로 생산하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 발현시스템의 단백질 발현을 유도하기 위한 방법으로, 종래에 사용되어 왔던 고가의 IPTG나 온도상승법 대신, 사용되는 배지에 따라서 외래단백질 발현을 용이하게 조절하는 것을 특징으로 한다. 이때, 사용되는 배지로는 복합 배지, 초산이나 숙신산이 유일탄소원인 최소 배지, 또는 포도당이나 글리세롤이 유일탄소원인 최소 배지 중에서 선택하여 사용한다.
상기의 배지를 사용하여 외래단백질의 발현을 효과적으로 유도하는 새로운발현유도방법의 구현예로는
(가) 효모엑기스와 펩톤 및 아미노산, 비타민 등을 다량 포함하는 복합 배지에서, 세포성장휴지기에 별도의 유도체 없이 상시발현을 유도하는 방법,
(나) 초산이나 숙신산과 같은 유기산 화합물을 유일 탄소원으로 포함하는 최소 배지에서, 세포성장기 및 세포성장휴지기에 별도의 유도체 없이 상시발현을 유도하는 방법,
(다) 포도당, 글리세롤 등과 같은 당을 유일 탄소원으로 포함하는 최소 배지에서, 초산이나 숙신산과 같은 유기산 화합물을 발현 유도체로 사용하여 원하는 시기에 배양액에 첨가하여 발현을 유도하는 방법, 및
(라) 포도당, 글리세롤 등과 같은 당을 유일 탄소원으로 포함하는 최소 배지에서, 별도의 유도체 없이 세포성장 휴지기에 스스로 발현을 유도하는 방법을 포함한다.
이와 같이, 본 발명에서는 초산 또는 숙신산과 같은 유기산 화합물이 유도체로 작용하므로, 이를 탄소원으로 사용하여 배양 초기부터 발현을 유도할 수 있고(나), 또는 택일적으로 배양 초기에는 유기산화합물을 매우 낮은 농도로 또는 첨가되지 않은 배지에서 배양하다가 원하는 시기에 초산이나 숙신산과 같은 유기산화합물을 첨가하여 외래 단백질의 발현을 유도할 수 있다(다). 이때, 초산이나 숙신산 이외에 발현 유도체로 작용할 수 있는 유기산 화합물로는 말레이트, 푸마레이트, 시트레이트 등이 있다.
한편, 포도당을 탄소원으로 사용하는 경우는 세포성장기에서는 포도당으로인하여 외래단백질의 발현이 억제되고, 성장휴지기에서 24시간 이상 배양을 유지함으로써, 성장기의 부산물인 초산이 발현 유도체로 작용하게 된다(라). 이때, 상기의 배지에 첨가되는 당으로는 포도당 이외에 배양액에 사용할 수 있는 통상의 발효 탄소용 당류, 즉 글리세롤, 과당, 맥아당 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기의 복합 배지로는 엘비 배지를 비롯하여, 통상적으로 사용될 수 있는 복합 배지, 예를 들면 YT 배지[트립톤 8 g/L, 효모추출물 5 g/L, NaCl 5 g/L], 2배 YT배지, B 브로스 또는 트립톤 브로스[트립톤 10 g/L, NaCl 8 g/L], 루리아 브로스[트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, NaCl 0.5 g/L]를 사용할 수 있고, 상기의 최소 배지로는 M9 최소 배지, M63 최소 배지[인산제일칼륨염 13.6 g/L, 황산암모늄 2 g/L, 황산철(Ⅱ)7수화물 0.5 mg/L, KOH을 이용 pH 7.0으로 조절] 등을 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의한 발현방법은 종래의 IPTG를 발현 유도체로 사용할 때와 달리, 발현유도체의 가격이 매우 저렴하여 경제적인 장점이 있다. 또한, 발현유도체의 종류가 매우 다양할 수 있고, 발현유도체에 포함된 불순물에 큰 영향을 받지 않으며, 큰 부피의 배양액에서도 즉각적인 발현유도가 가능하다. 부가적으로, 특별한 발현유도체 없이도 성장휴지기에서 발현이 유도되는 것도 가능하며, 특히 성장휴지기에 발현시키는 방법은 단백질 과발현으로 야기되는 함유체(inclusion body)의 생성을 막아 보다 많은 가용성 단백질을 발현할 수 있는 이점이 있다. 그리고, 보다 정교하게 발현을 억제 또는 조절하는 것이 가능하다.
최종적으로, 본 발명은 상기의 발현된 외래단백질을 통상적인 방법으로 활성을 유지하면서 분리, 정제하여 확보함으로써 완성한다.
이하 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하겠는바, 다음 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명이 다음 실시예에 의해 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 실시예에서 목적단백질로 사용된 아세틸코에이 합성효소(ACS), 베타갈락토시다아제(Lac Z), 키틴나아제(Chi A), 리파제(Tli A)는 단지 본 발명을 완성하기 위한 예이며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 발명의 실시예에서 사용된 재료 및 방법 등을 설명하면 다음과 같다.
대장균 숙주세포 JM109이 본 발명을 완성하기 위한 박테리아 숙주세포로 사용되었으며, 플라스미드 pGEM-7Zf(+/-)(프로메가, 미국), 플라스미드 pBluscript II-KS(+/-)(스트라타진, 미국), pTrc99A(파마시아, 스웨덴) 그리고 플라스미드 pRS415[Simons et al., 1987년,Gene, 53권, 85 ∼ 96]등은acs프로모터를 서브클로닝하는데 사용되었다.
대장균 배양 배지로는 엘비 배지(효모엑기스 5 g/L, 박토트립톤 10 g/L, 소금 5 g/L, pH 7.2)를 복합 기본배지로 사용하였고, M9 최소 배지(인산 제2나트륨염 6 g/L, 인산제일칼륨 3 g/L, 소금 0.5 g/L, 염화암모늄염 1 g/L, 증기멸균 후 10mL의 0.01 M 염화칼슘을 첨가, pH 7.2)에 초산, 숙신산, 포도당 등을 탄소원으로 사용할 경우 0.2 %(w/v) 농도로 첨가하여 사용하였다. 필요한 경우, 플라스미드 유지를 위한 항생제의 사용은 앰피실린 100 ㎍/㎖, 테트라사이클린 15 ㎍/㎖등을 사용하였다. 배양온도는 기본적으로 37℃에서 수행하였다.
엘비 배지는 미국 라이프 텍크노로지사(Life Technologies Co.)의 집코 비알엘(GIBCO BRL) 엘비 배양 베이스(LB Broth Base, Cat. 12780 - 052)와 M9 최소 배지는 미국 시그마사의 시그마 M9 최소염(Cat. M6030)을 기본배지로 사용하였다.
DNA 클로닝에 사용된 각종 제한효소 및 기본 효소들은 한국의 포스텍(Postech)제품을 사용하였고, T4 DNA 리가제는 독일의 뵈링거맨하임 제품을 사용하였다. 아가로즈 젤로부터의 DNA 단편의 회수를 위해서는 독일 키아젠사의 키아엑스 II(QiaEx II)를 사용하였다.
특별한 조건이 없으면, 통상적인 재조합 DNA 조작과 세포 총단백질의 분석방법은 샘브룩(Sambrook) 등이 기술한 방법에 따라 수행하였다[Molecular Cloning: A laboratory manual].
또한, 세포내의 가용성 단백질과 불용성 단백질의 분리방법은 다음과 같은 방법을 따랐다. 즉, 대장균세포 배양액 1 mL을 취해 원심분리기로 세포를 분리하고 0.85 %(w/v) 생리식염수로 세척하고, 다시 세포파쇄용 완충용액[50 mM 트리스 pH 8.0, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)]에 현탁하였다. 현탁된 세포를 초음파 세포파쇄기로 파쇄후 12000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 침지액은 세포내 불용성 단백질원으로 상등액은 가용성 단백질원으로 분석하였다.
실시예 1: 아세틸코에이 합성 효소 유전자(
acs
)와
acs
프로모터가 포함된 대장균의 DNA 단편를 포함하는 pSS112의 제조
유전자acs와 프로모터가 포함된 DNA 단편은 공시된 대장균의 염색체 라이브러리인 고하라 람다 라이브러리 중 638번(Kohara et al., 1989년, Cell, 50권 495 ∼ 508)을 이용하였고,EcoRI로 자른후 약 5 kb 길이의 DNA 단편을 분리하고, 상업용 플라스미드인 pGEM-7Zf(+/-)(프로메가, 미국)를 동일한EcoRI으로 자른 후 서브클로닝하여 pSS112를 제조하였다(도 1). 그리고 이렇게 제조된 pSS112를 이용해 형질전환시킨 대장균(E. coli) JM109/pSS112를 생명공학연구소 내 유전자은행에 1999년 10월 21일, 기탁번호 KCTC 067BP로 기탁하였다.
실시예 2:
acs
프로모터에 의한 아세틸코에이 합성효소(ACS)의 생산방법
플라스미드 pSS112는 아세틸코에이 합성효소를 암호화하고 있는 유전자와 발현을 조절하는 프로모터를 포함하고 있으므로, 본 실시예에서는 pSS112를 포함한 대장균 JM109를 복합 배지인 엘비(LB) 배지 또는 카자미노에시드 0.2 %(w/v)와 포도당 0.2 %(w/v)을 포함한 반합성 M9 최소 배지에서 온도 37℃에서 배양하여 아세틸코에이 합성효소의 발현을 확인하였다(도 2). 이에 대한 SDS - PAGE 젤상에서 분석한 결과를 도 2에 나타내었으며, 도 2에서 (가)는 재조합 대장균의 총단백질에 대한 분석이고, (나)는 가용성 단백질분획에 대한 것이며, (다)는 불용성 단백질분획에 대한 분석을 나타낸 것이다. 각각에서, M은 단백질분자량 표식단백질들을 나타내고, 1은 엘비 배지에서 배양 4시간째 시료, 2는 엘비 배지에서배양 7시간째 시료, 3은 엘비 배지에서 배양 11.2시간째 시료, 4는 엘비 배지에서 배양 22시간째 시료, 5는 M9 숙신산 배지에서 배양 4시간째 시료, 6은 M9 숙신산 배지에서배양 7시간째 시료, 7은 M9 숙신산 배지에서 배양 11.2시간째 시료, 8은 M9 숙신산 배지에서 배양 22시간째 시료에 대한 분석을 나타낸 것이다.
자체 프로모터에 의해 발현된 ACS 단백질은 특별한 화학물질 유도체 또는 온도 상승과 같은 수단 없이, 엘비 배지에서 성장시 성장대수기 초기(4시간째)에 매우 낮은 수준으로 발현되었으나, 성장휴지기에서는 총단백질의 약 40%에 달하는 수준으로 고발현되었다. 또한, 포도당을 탄소원으로 한 반합성 M9 최소 배지에서도 대수성장기에서는 낮은 수준의 ACS 발현을 보이다가 성장휴지기에서 총단백질의 약 28% 정도 세포내에 축적하였다. 따라서,acs프로모터에 의해 발현되는 단백질은 모두 성장휴지기에서 대량으로 발현됨을 알 수 있다.
실시예 3: pSS121 의 제조
또 다른 단백질의 예로 자주 사용되는 베타갈락토시다아제를 발현하기 위하여 다음과 같이 pSS121을 제조하였다(도 3, 도 4).acs프로모터를 포함하고 있는 DNA 단편은 pSS112로부터ClaI과XhoI로 잘려진 1384 bp의 단편, 특히 서열 1로 특징 지워지는 단편을 pBluescript II KS의 동일 제한효소로 잘린 자리에 삽입하여 pSK122를 제조하였다. 이때, 서열 1은 pSK122을 주형(template)으로 사용하고 스트라타진(stratagene)에서 제공하고 있는 KS 프라이머(서열 2)와 SK 프라이머(서열 3)을 프라이머로 사용하여 각각 윗가닥과 아랫가닥의 염기서열을 분석하는데 사용하였으며, 또한, 염기서열분석을 위한 반응은 미국 퍼킨엘머사의 빅다이 종결 시퀀싱 키트(BigDye Terminater Sequencing Kit)를 사용하였고 서열분석기로는 동사의 모델 377 기계를 사용하여 3번 반복하여 염기서열을 확인한 것이다. 다시 pSK122을XhoI와EcoR V로 자른 후 클레노우 채움반응(Klenow filling reaction)을 통해 DNA 단편의 말단을 모두 블런트로 만들고 아가로즈 젤상에서 1.34 kb의 단편을 분리 정제하여 pRS415를EcoRV로 자른 벡터에 서브클로닝을 하였다. 제한효소 지도법을 통해acs프로모터, 베타갈락토시다아제 유전자순으로 연결된 플라스미드를 선택하여 pSS121이라 명명하였다. 따라서, pSS121은 리포터유전자인lacZ의 발현이acs프로모터에 의해 유도될 수 있는 유전적 구조를 갖는 플라스미드 벡터가 되었다. 그런 다음, 이렇게 제조된 pSS121를 이용해 형질전환시킨 대장균(E. coli) JM109/pSS121를 생명공학연구소 내 유전자은행에 1999년 10월 21일에 기탁번호 KCTC 0675BP로 기탁하였다.
실시예 4:
acs
프로모터에 의한 베타갈락토시다아제의 고발현
플라스미드 pSS121로 형질전환된 대장균 JM109를 복합 배지인 엘비 배지에서 배양하여 실시예 2에서와 같이 성장휴지기 발현을 시도하였다.
이에 대한 결과, 즉acs프로모터에 의해 유도되는 베타글로코시다아제 단백질의 생산정도를 SDS-PAGE 젤상에서 분석한 결과를 도 5에 나타내었으며, 여기서 (가)는 재조합 대장균의 총단백질, (나)는 가용성 단백질분획, (다)는 불용성 단백질분획에 대한 분석결과를 나타내고 있다. 그리고, 각각의 M은 단백질분자량 표식단백질들을 나타내고, 1은 대장균 JM109 시료, 2는 배양 4시간째 시료, 3은 배양 6.5시간째 시료, 4는 배양 9시간째 시료, 5는 배양 11시간째 시료, 6은 배양 24시간째 시료에 대한 분석 결과이다.
도 5 에서 보듯이, 대수성장기 초기(4시간째)에 비하여 성장휴지기(9시간째 이후)에서 총세포 단백질의 50%을 차지할 정도로 대량의 효소가 발현되었다. 발현된 효소단백질을 가용성과 불용성 부분으로 분획하였을 경우 대부분의 단백질이 가용성 형태로 세포 내에 발현됨을 알 수 있다.
또한,acs프로모터로 베타갈락토시다아제를 발현시키는 경우, 조절이 가능한 지의 여부를 알아보기 위하여, 먼저 엘비 배지에 포도당을 4 g/L을 첨가하였을 때의 단백질 발현을 분석하였다(도 6). 이 때,acs프로모터에 의해 유도되는 베타글로코시다아제 단백질의 생산정도를 SDS-PAGE 젤상에서 분석한 결과를 도 6에 나타내었다. 여기서 M은 단백질분자량 표식단백질들을 나타내고, 1은 배양 2시간째 시료, 2는 배양 4.5시간째 시료, 3은 배양 5.5시간째 시료, 4는 배양 7.5시간째 시료, 5는 배양 11시간째 시료, 6은 배양 24시간째 시료에 대한 분석 결과이다.
결과에서 알 수 있듯이, 포도당이 있을 경우 복합 엘비 배지에서는 완전히 발현이 억제됨을 알 수 있었다.
한편, 포도당 또는 숙신산을 유일탄소원으로 사용하여 M9 최소 배지에서 배양하였을 때의 유도되는 단백질의 생산량을 알아보기 위한 실험은 도 7에 나타내었다. 즉, pSS121로 형질전환된 대장균 JM109을 M9 포도당 배지(1 ∼ 4번 시료)와 M9 숙신산 배지(5 ∼ 8번 시료)에서 배양하고acs에 유도되는 베타글로코시다아제 단백질(화살표로 표시)의 생산정도를 SDS-PAGE 젤상에서 분석한 결과를 나타내었다. 여기서, (가)는 재조합 대장균의 총단백질에 대한 분석이고, (나)는 가용성 단백질분획, (다)는 불용성 단백질분획에 대한 것이며, 각각에서 M은 단백질분자량 표식단백질들을 나타내고, 1은 M9 포도당 배지에서 배양 4.5시간째 시료, 2는 M9 포도당 배지에서 배양 7시간째 시료, 3은 M9 포도당 배지에서 배양 12시간째 시료, 4는 M9 포도당 배지에서 배양 20시간째 시료, 5는 M9 숙신산 배지에서 배양 4.5시간째 시료, 6는 M9 숙신산 배지에서 배양 7시간째 시료, 7은 M9 숙신산 배지에서 배양 12시간째 시료, 8은 M9 숙신산 배지에서 배양 20시간째 시료에 대한 결과이다. 도 7에서 보듯이, 포도당을 유일탄소원으로 사용할 경우 그 발현이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다.
특히, 대수증식기에서는 총단배질의 2% 이하의 단백질양이 관찰되었고 성장휴지기에서만 총단백질량의 약 10% 가량의 단백질을 세포 내에 축적하였다.
한편, 숙신산을 유일탄소원으로 사용할 경우 배양초기 즉 대수증식기 및 성장휴지기에서 총단백질의 40% 이상이 축적되었고, 발현된 대부분의 단백질은 가용성 형태임을 알 수 있다.
실시예 5:
acs
프로모터에 의한 범용 외래단백질 발현벡터 pJHC30의 제조 및 외래단백질의 발현
본 발명에 의한 발현시스템이 외래단백질 발현에 적용하기 위하여 도 8과 같이acs프로모터만을 PCR기법으로 서브클로닝하여 기존의 대장균용 고발현벡터인 pTrc99A에 존재하는trc프로모터를 대체하여 pJHC30을 제조하고 그 유용성을 확인하고자 하였다.acs프로모터를 서브클로닝하기 위하여 서열 4와 서열 5를 각각 프라이머로 사용하고 pSS112를acs프로모터 유전자원으로 사용하여 PCR 증폭한 다음 프라이머에 존재하는HpaI과NcoI 제한효소로 처리하여 동일한 효소로 처리된 pTrc99A를 벡터로 사용하여 서브클로닝할 수 있었다(도 8). 그리고, 이렇게 제조된 pJHC30를 이용해 형질전환시킨 대장균(E. coli) JM109/pJHC30을 1999년 12월 15일 생명공학연구소 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0712BP로 공시 기탁하였다. pTrc99A의 사용은acs프로모터의 유용성을 보이기 위해 사용한 것이지 벡터제조를 위해 pTrc99A로 제한하고자 하는 것은 아니다.
acs프로모터에 의한 단백질의 발현을 시도하기 위하여 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescensATCC 27117) 유래의 키틴나아제 유전자 약 1.3 kb 와 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescensSIK W1)유래의 리파제의 유전자 약 1.3 kb[안정훈 등, 1998년,J. Bacteriol., 181권, 1847 ∼ 1852]를 각각 pJHC30에 서브클로닝하여 각각 pJHC31과 pJHC35를 제조하였다(도 8). 제조된 플라스미드 pJHC31과 pJHC35를 대장균 JM109에 형질전환시켜 발현을 유도하여 그 결과를 SDS - PAGE 젤 분석을 도 9와 도 10에 나타내었다. 도 9에서, M은 단백질분자량 표식단백질들을 나타내고, 1은 대장균 JM109의 총단백질시료, 2는 엘비 배지 배양 20시간째 시료, 3은 M9 숙신산 배지에서 배양 20 시간째 시료이다.
도 10은 pJHC35에 의해 발현되는 리파제의 발현정도를 SDS-PAGE 젤상에서 분석한 결과를 나타낸 것이고, 여기서 M은 단백질분자량 표식단백질들을 나타내고, 1은 엘비 배지 배양 7시간째 시료, 2는 엘비 배지 배양 9시간째 시표, 3은 엘비 배지 배양 12시간째 시료, 4는 엘비 배지 배양 24시간째 시료, 5는 M9 숙신산 배지 배양 6.5시간째 시료, 6은 M9 숙신산 배지 배양 8.5시간째 시료, 7은 M9 숙신산 배지 배양 12.5시간째 시료, 8은 M9 숙신산 배지 배양 24시간째 시료이다.
상기한 결과와 마찬가지로 엘비 배지나 M9 최소 배지에서 숙신산이나 초산을 유일탄소원으로 사용할 때, 키틴나아제의 경우 대장균 총단백질의 약 16%에 이르는 발현양을 보였고, 대장균에서 발현이 잘되지 않는 리파제의 경우도 약 총단백질의 5% 정도를 발현하였다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 단백질 발현시스템은 이로 형질전환된 숙주세포에서 효과적인 단백질의 생산을 가능하게 한다. 또한, 본 발명에서 소개한 발현시스템의 단백질의 발현 유도방법은 보다 정교하게 발현을 조절하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 발현유도체의 종류가 매우 다양할 수 있고, 발현유도체에 포함된 불순물에 큰 영향을 받지 않으며, 큰 부피의 배양액에서도 즉각적인 발현유도가 가능한 효과가 있다. 특히, 성장휴지기에 발현시키는 방법은 단백질 과발현으로 야기되는 함유체 생성을 막아 보다 많은 가용성 단백질을 발현할 수 있는 효과가 있다.
Claims (10)
- 유전자 재조합 방법에 의한 단백질 생산 방법에 있어서,(a) 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자와 성장휴지기에서 전사유도 활성을 갖으며 유기산화합물에 의해 전사가 유도되는 프로모터을 포함하는 유전자 발현벡터를 제작하는 단계,(b) 제작된 유전자 발현벡터가 안정하게 유지되도록 그람음성 숙주균에 형질전환시키는 단계,(c) 형질전환된 균주를 배지 내에서 배양하여 단백질의 발현을 유도하는 단계,(d) 최종적으로 상기 형질전환된 숙주균의 배양액으로부터 목적단백질을 회수하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 유기산화합물은 초산, 숙신산, 말레이트, 푸마레이트 및 시트레이트 중에서 선택되어진 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 발현 유도는 유일 탄소원으로 유기산 화합물을 포함하는 최소 배지에서, 그리고 세포성장 초기 중에 단백질 합성을 유도하는 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 발현 유도는 효모 엑기스, 펩톤, 아미노산 및 비타민이 포함된 복합 배지에서, 그리고 특별한 발현유도체없이 성장휴지기 중에 단백질 합성을 유도하는 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 프로모터는 대장균acs유전자의 DNA 단편 또는 그 일부분과 동일하거나 비슷한 생물학적 기능을 보이는 유전자 DNA 단편이 포함되는 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기acs프로모터는 대장균을 포함한 박테리아, 곰팡이, 효모 또는 방선균으로부터 유래인 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 DNA 단편이 아세틸코에이 합성효소를 코딩하는 유전자(acs), 베타갈락토시다제를 코딩하는 유전자(lacZ), 키틴나아제를 코딩하는 유전자(chiA), 또는 리파제를 코딩하는 유전자(tliA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 형질전환된 균주가 대장균과 같은 엔테로박테리아시애(Enterobacteriaceae)족에 속하는 박테리아를 사용하며 이러한 형질전환된 균주를 복합 배지, 초산이나 숙신산이 유일탄소원인 최소 배지 및 포도당이나 글리세롤이 유일탄소원인 최소 배지 중에서 선택된 배지에서 배양시키는 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 형질전환된 균주를 포도당이나 글리세롤이 유일탄소원인 최소 배지에서 배양시키는 경우, 초산이나 숙신산을 발현 유도체로서 원하는 시기에 배양액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 복합 배지가 엘비 배지이고, 상기 최소 배지가 M9 최소염 배지인 것을 특징으로 하는 단백질 생산방법.
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