JP2003533166A

JP2003533166A - オイゲノールおよびフェルラ酸の異化作用の特異的不活性化遺伝子による置換フェノール生産のための生産株の構築

Info

Publication number: JP2003533166A
Application number: JP2000579727A
Authority: JP
Inventors: ラベンホルスト，ユルゲン; シユタインビユヘル，アレクサンダー; プリーフエルト，ホルスト; オーフエルハーゲ，イエルク
Original assignee: ハーマン・ウント・ライマー・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1998-10-31
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2003-11-11
Also published as: KR20020022045A; SK5742001A3; HUP0104772A3; CN1325444A; DE19850242A1; HUP0104772A2; WO2000026355A3; AU1041300A; HK1041902A1; WO2000026355A2; IL142272A0; EP1124947A2; CA2348962A1; BR9914930A; PL348647A1; AU761093B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、オイゲノールおよび／またはフェルラ酸の異化作用の酵素が、中間体コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニリンおよび／またはバニリン酸が蓄積するような方式で不活性化されることを特徴とする、形質転換および／または変異された単細胞もしくは多細胞生物体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、置換メトキシフェノール、特にバニリンを生産するための、生産株
の構築および方法に関する。

【０００２】ドイツ特許出願公開第４２２７０７６号（置換メトキシフェノールの生産
方法、およびこの目的のために適当である微生物）は、新規なシュードモナス種
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）を用いる置換メトキシフェノールの生産を
記述している。これに関して、出発材料はオイゲノールであり、そして生産物は
フェルラ酸、バニリン酸、コニフェリルアルコールおよびコニフェリルアルデヒ
ドである。

【０００３】また、Ｒｏｓａｚｚａｅｔａｌ．（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ：ａｎａｂｕｎｄａ
ｎｔａｒｏｍａｔｉｃｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔ；Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．１５：４５７−４７１）によって記されている、フェルラ酸を
用いて可能となる生物変換の広範な総説が１９９５年に現れた。

【０００４】シュードモナス種由来の、コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド
、フェルラ酸、バニリンおよびバニリン酸合成のための遺伝子および酵素は、欧
州特許出願公開第０８４５５３２号に記述されている。

【０００５】トランス−フェルラ酸をトランス−フェルロイル−ＳＣｏＡエステルへ、続い
てバニリンへ変換する酵素、そしてまた、そのエステルを切断する遺伝子が、ｔ
ｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｒｗｉｃ
ｈ，ＧＢによってＷＯ９７／３５９９９において記述されている。また、１９９
８年に、その特許の内容が、科学出版物の形態で公表された（Ｇａｓｓｏｎｅ
ｔａｌ．１９９８．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ
ｔｏｖａｎｉｌｌｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１６３−４１
７０；ＮａｒｂａｄａｎｄＧａｓｓｏｎ１９９８．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ｏｆｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄｖｉａｖａｎｉｌｌｉｎｕｓｉｎｇ
ａｎｏｖｅｌＣｏＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙｉｎａｎ
ｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４４：１３９７−１
４０５）。

【０００６】ドイツ特許出願公開第１９５３２３１７号は、発酵的に高収率でフェルラ
酸からバニリンを得るためのアミコラトプシス種（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｓｐ．）の使用を記述している。

【０００７】既知の方法は、それらが非常に低収率のバニリンしか達成できないか、または
比較的高価な出発化合物を使用させるかいずれかの不利益を蒙る。最後に述べら
れた方法（ドイツ特許出願公開第１９５３２３１７号）は、高収率を達成す
るけれども、オイゲノールをバニリンに生物変換するためのシュードモナス種Ｈ
Ｒ１９９およびアミコラトプシス種ＨＲ１６７の使用は、２段階で実施される発
酵を必要として、結果的に、実質的に高い費用と時間の浪費をもたらす。

【０００８】したがって、本発明の目的は、比較的安価な原料オイゲノールを１段階工程で
バニリンに変換できる生物体を構築することである。

【０００９】この目的は、株が、オイゲノールおよび／またはフェルラ酸の異化作用の酵素
が、中間体コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バ
ニリンおよび／またはバニリン酸が蓄積するように不活性化されることを特徴と
する、単細胞もしくは多細胞生物体の生産株を構築するという手段によって達成
される。

【００１０】生産株は、単細胞もしくは多細胞であってもよい。したがって、本発明は、微
生物、植物もしくは動物に関してもよい。さらにまた、使用は、生産株から得ら
れる抽出物を用いてなされてもよい。本発明によれば、好ましくは、単細胞生物
体を用いることである。これら後者の生物体は、微生物または動物もしくは植物
細胞であってもよい。本発明によれば、真菌類および細菌類を用いることが、特
に好適である。最高に好適なのは、細菌類の種である。特に、オイゲノールおよ
び／またはフェルラ酸の異化作用が改変された後に、使用されてもよいそれらの
細菌類は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナスおよびエ
シェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の種である。

【００１１】もっとも単純な場合には、既知の、慣用の微生物学的方法が、本発明にしたが
って使用されてもよい生物体を単離するために使用できる。

【００１２】かくして、オイゲノールおよび／またはフェルラ酸の異化作用に関与するタン
パク質の酵素活性は、酵素阻害剤を用いることによって変えることができる。さ
らにまた、オイゲノールおよび／またはフェルラ酸の異化作用に関与するタンパ
ク質の酵素活性は、これらのタンパク質をコードしている遺伝子を変異すること
によって変えることができる。そのような変異は、古典的方法によって、例えば
ＵＶ照射もしくは変異誘導化学薬品を使用することによってランダム様式で生成
することができる。

【００１３】組み換えＤＮＡ法、例えば欠失、挿入および／またはヌクレオチド置換は、新
規な生物体を単離するために同じく適当である。かくして、生物体の遺伝子は、
例えば、他のＤＮＡ要素（Ω要素）を用いて不活性化することができる。同様に
、適当なベクターが、改変および／または不活性化される遺伝子構造体によりイ
ンタクト遺伝子を置換するために使用することができる。これに関して、不活性
化されるべき遺伝子、および不活性化のために使用されるＤＮＡ要素は、古典的
なクローニング技術の手段またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手段によっ
て得ることができる。

【００１４】例えば、本発明の一つの可能な実施態様では、オイゲノール異化およびフェル
ラ酸の異化作用は、適当な遺伝子中にΩ要素を挿入するか、または欠失を導入す
ることによって変えることができる。これに関して、上記組み換えＤＮＡ法は、
関連酵素の産生が遮断されるように、デヒドロゲナーゼ、シンテターゼ、ヒドラ
ターゼ−アルドラーゼ、チオラーゼもしくはデメチラーゼをコードしている遺伝
子の機能を不活性化するために使用できる。好ましくは、これらの遺伝子は、コ
ニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ、コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ、フェルロイル−ＣｏＡシンテターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ−ア
ルドラーゼ、β−ケトチオラーゼ、バニリンデヒドロゲナーゼまたはバニリン酸
デメチラーゼをコードしている遺伝子である。非常に特に好適には、欧州特許出
願公開第０８４５５３２号において特定されるアミノ酸配列をコードしている遺
伝子および／またはそれらの対立遺伝子変異体をコードしているヌクレオチド配
列である。

【００１５】したがってまた、本発明は、形質転換された生物体および変異体を作成するた
めの遺伝子構造体に関する。

【００１６】好適には、デヒドロゲナーゼ、シンテターゼ、ヒドラターゼ−アルドラーゼ、
チオラーゼもしくはデメチラーゼをコードしているヌクレオチド配列が、生物体
および変異体を単離するために不活性化される遺伝子構造体を使用することであ
る。特に好適には、コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ、コニフェリルア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、フェルロイル−ＣｏＡシンテターゼ、エノイル−Ｃ
ｏＡヒドラターゼ−アルドラーゼ、β−ケトチオラーゼ、バニリンデヒドロゲナ
ーゼもしくはバニリン酸デメチラーゼをコードしているヌクレオチド配列が不活
性化される遺伝子構造体である。非常に特に好適には、図２ａ〜２ｒに描かれる
ヌクレオチド配列および／またはそれらの対立遺伝子変異体をコードしているヌ
クレオチド配列をもつ、図１ａ〜１ｒに与えられる構造を表す遺伝子構造体であ
る。これに関して、特に好適には、ヌクレオチド配列１〜１８である。

【００１７】また、本発明は、これらの遺伝子構造体の部分配列ならびに機能的等価物を包
含する。機能的等価物は、個々の核酸塩基が、機能が変えられることなく置換（
ゆらぎ置換）されたＤＮＡの誘導体を意味すると理解されるべきである。また、
アミノ酸は、これが機能の変化をもたらすことなくタンパク質レベルにおいて置
換されてもよい。

【００１８】１種以上のＤＮＡ配列が、遺伝子構造体の上流および／または下流に挿入され
てもよい。遺伝子構造体をクローニングすることによって、生物体の形質転換お
よび／またはトランスフェクションのため、そして／または生物体への接合的伝
達のために適当であるプラスミドもしくはベクターを得ることが可能である。

【００１９】さらにまた、本発明は、本発明にしたがって形質転換される生物体および変異
体を作成するためのプラスミドおよび／またはベクターに関する。これらの生物
体および変異体は、結果的に、既に記述された遺伝子構造体を宿す。したがって
、また本発明は、該プラスミドおよび／またはベクターを宿している生物体に関
する。

【００２０】プラスミドおよび／またはベクターの性質は、それらが何のために使用されよ
うとしているかに依存する。例えば、シュードモナス類におけるオイゲノールお
よび／またはフェルラ酸の異化作用のインタクト遺伝子を、オメガ要素により不
活性化された遺伝子により置換できるためには、一方では、シュードモナス類に
伝達できる（接合的伝達性プラスミド）が、他方では、これらの生物体において
複製することができず、結果的にシュードモナス類において不安定である（いわ
ゆる自殺プラスミド）ベクターを必要とする。そのようなプラスミド系によって
シュードモナス類に伝達されるＤＮＡセグメントは、それらが相同組み換えによ
って細菌細胞のゲノム中に組み込まれた場合のみ、保持することができる。

【００２１】前記遺伝子構造体、ベクターおよびプラスミドは、種々の形質転換生物体もし
くは変異体を作成するために使用されてもよい。該遺伝子構造体は、インタクト
核酸配列を、改変および／または不活性化された遺伝子構造体によって置換する
ために使用することができる。形質転換もしくはトランスフェクションもしくは
接合によって得ることができる細胞では、インタクト遺伝子は、相同組み換えに
よって、改変および／または不活性化された遺伝子構造体により置換され、その
結果得られる細胞は、ここに、それらのゲノム中に改変および／または不活性化
された遺伝子構造体のみを保持する。この方法において、好ましくは、関連する
生物体が、コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バ
ニリンおよび／またはバニリン酸を生産できるように、遺伝子は、本発明にした
がって改変および／または不活性化することができる。

【００２２】ドイツ特許出願公開第４２２７０７６号および欧州特許出願公開第０８４
５５３２号において詳細に記述されている菌株シュードモナス種ＨＲ１９９（Ｄ
ＳＭ７０６３）の変異体は、なかんずく、図２ａ〜２ｒと組み合わせて図１ａ〜
１ｒから結果として起こる対応する遺伝子構造体を用いて、本発明にしたがうこ
の方法において構築された生産菌株の例である：１．シュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＡΩＫｍ、これはコニフェリルアルコ
ールデヒドロゲナーゼをコードしているインタクトｃａｌＡ遺伝子の代わりに、
ΩＫｍで不活性化されたｃａｌＡ遺伝子を含有する（図１ａ；図２ａ）。

【００２３】２．シュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＡΩＧｍ、これはコニフェリルアルコ
ールデヒドロゲナーゼをコードしているインタクトｃａｌＡ遺伝子の代わりに、
ΩＧｍで不活性化されたｃａｌＡ遺伝子を含有する（図１ｂ；図２ｂ）。

【００２４】３．シュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＡΔ、これはコニフェリルアルコール
デヒドロゲナーゼをコードしているインタクトｃａｌＡ遺伝子の代わりに、欠失
で不活性化されたｃａｌＡ遺伝子を含有する（図１ｃ；図２ｃ）。

【００２５】４．シュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＢΩＫｍ、これはコニフェリルアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼをコードしているインタクトｃａｌＢ遺伝子の代わりに、
ΩＫｍで不活性化されたｃａｌＢ遺伝子を含有する（図１ｄ；図２ｄ）。

【００２６】５．シュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＢΩＧｍ、これはコニフェリルアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼをコードしているインタクトｃａｌＢ遺伝子の代わりに、
ΩＧｍで不活性化されたｃａｌＢ遺伝子を含有する（図１ｅ；図２ｅ）。

【００２７】６．シュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＢΔ、これはコニフェリルアルデヒド
デヒドロゲナーゼをコードしているインタクトｃａｌＢ遺伝子の代わりに、欠失
で不活性化されたｃａｌＢ遺伝子を含有する（図１ｆ；図２ｆ）。

【００２８】７．シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΩＫｍ、これはフェルロイル−ＣｏＡ
シンテターゼをコードしているインタクトｆｃｓ遺伝子の代わりに、ΩＫｍで不
活性化されたｆｃｓ遺伝子を含有する（図１ｇ；図２ｇ）。

【００２９】８．シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΩＧｍ、これはフェルロイル−ＣｏＡ
シンテターゼをコードしているインタクトｆｃｓ遺伝子の代わりに、ΩＧｍで不
活性化されたｆｃｓ遺伝子を含有する（図１ｈ；図２ｈ）。

【００３０】９．シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΔ、これはフェルロイル−ＣｏＡシン
テターゼをコードしているインタクトｆｃｓ遺伝子の代わりに、欠失で不活性化
されたｆｃｓ遺伝子を含有する（図１ｉ；図２ｉ）。

【００３１】１０．シュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈΩＫｍ、これはエノイル−ＣｏＡヒ
ドラターゼ−アルドラーゼをコードしているインタクトｅｃｈ遺伝子の代わりに
、ΩＫｍで不活性化されたｅｃｈ遺伝子を含有する（図１ｊ；図２ｊ）。

【００３２】１１．シュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈΩＧｍ、これはエノイル−ＣｏＡヒ
ドラターゼ−アルドラーゼをコードしているインタクトｅｃｈ遺伝子の代わりに
、ΩＧｍで不活性化されたｅｃｈ遺伝子を含有する（図１ｋ；図２ｋ）。

【００３３】１２．シュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈΔ、これはエノイル−ＣｏＡヒドラ
ターゼ−アルドラーゼをコードしているインタクトｅｃｈ遺伝子の代わりに、欠
失で不活性化されたｅｃｈ遺伝子を含有する（図１ｌ；図２ｌ）。

【００３４】１３．シュードモナス種ＨＲ１９９ａａｔΩＫｍ、これはβ−ケトチオラーゼ
をコードしているインタクトａａｔ遺伝子の代わりに、ΩＫｍで不活性化されたａａｔ遺伝子を含有する（図１ｍ；図２ｍ）。

【００３５】１４．シュードモナス種ＨＲ１９９ａａｔΩＧｍ、これはβ−ケトチオラーゼ
をコードしているインタクトａａｔ遺伝子の代わりに、ΩＧｍで不活性化されたａａｔ遺伝子を含有する（図１ｎ；図２ｎ）。

【００３６】１５．シュードモナス種ＨＲ１９９ａａｔΔ、これはβ−ケトチオラーゼをコ
ードしているインタクトａａｔ遺伝子の代わりに、欠失で不活性化されたａａｔ遺伝子を含有する（図１ｏ；図２ｏ）。

【００３７】１６．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍ、これはバニリンデヒドロゲ
ナーゼをコードしているインタクトｖｄｈ遺伝子の代わりに、ΩＫｍで不活性化
されたｖｄｈ遺伝子を含有する（図１ｐ；図２ｐ）。

【００３８】１７．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＧｍ、これはバニリンデヒドロゲ
ナーゼをコードしているインタクトｖｄｈ遺伝子の代わりに、ΩＧｍで不活性化
されたｖｄｈ遺伝子を含有する（図１ｑ；図２ｑ）。

【００３９】１８．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΔ、これはバニリンデヒドロゲナー
ゼをコードしているインタクトｖｄｈ遺伝子の代わりに、欠失で不活性化されたｖｄｈ遺伝子を含有する（図１ｒ；図２ｒ）。

【００４０】１９．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈＢΩＫｍ、これはバニリンデヒドロ
ゲナーゼＩＩをコードしているインタクトｖｄｈＢ遺伝子の代わりに、ΩＫｍで
不活性化されたｖｄｈＢ遺伝子を含有する。

【００４１】２０．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈＢΩＧｍ、これはバニリンデヒドロ
ゲナーゼＩＩをコードしているインタクトｖｄｈＢ遺伝子の代わりに、ΩＧｍで
不活性化されたｖｄｈＢ遺伝子を含有する。

【００４２】２１．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈＢΔ、これはバニリンデヒドロゲナ
ーゼＩＩをコードしているインタクトｖｄｈＢ遺伝子の代わりに、欠失で不活性
化されたｖｄｈＢ遺伝子を含有する。

【００４３】２２．シュードモナス種ＨＲ１９９ａｄｈΩＫｍ、これはアルコールデヒドロ
ゲナーゼをコードしているインタクトａｄｈ遺伝子の代わりに、ΩＫｍで不活性
化されたａｄｈ遺伝子を含有する。

【００４４】２３．シュードモナス種ＨＲ１９９ａｄｈΩＧｍ、これはアルコールデヒドロ
ゲナーゼをコードしているインタクトａｄｈ遺伝子の代わりに、ΩＧｍで不活性
化されたａｄｈ遺伝子を含有する。

【００４５】２４．シュードモナス種ＨＲ１９９ａｄｈΔ、これはアルコールデヒドロゲナ
ーゼをコードしているインタクトａｄｈ遺伝子の代わりに、欠失で不活性化され
たａｄｈ遺伝子を含有する。

【００４６】２５．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＡΩＫｍ、これはバニリン酸デメチ
ラーゼのα−サブユニットをコードしているインタクトｖａｎＡ遺伝子の代わり
に、ΩＫｍで不活性化されたｖａｎＡ遺伝子を含有する。

【００４７】２６．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＡΩＧｍ、これはバニリン酸デメチ
ラーゼのα−サブユニットをコードしているインタクトｖａｎＡ遺伝子の代わり
に、ΩＧｍで不活性化されたｖａｎＡ遺伝子を含有する。

【００４８】２７．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＡΔ、これはバニリン酸デメチラー
ゼのα−サブユニットをコードしているインタクトｖａｎＡ遺伝子の代わりに、
欠失で不活性化されたｖａｎＡ遺伝子を含有する。

【００４９】２８．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＢΩＫｍ、これはバニリン酸デメチ
ラーゼのβ−サブユニットをコードしているインタクトｖａｎＢ遺伝子の代わり
に、ΩＫｍで不活性化されたｖａｎＢ遺伝子を含有する。

【００５０】２９．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＢΩＧｍ、これはバニリン酸デメチ
ラーゼのβ−サブユニットをコードしているインタクトｖａｎＢ遺伝子の代わり
に、ΩＧｍで不活性化されたｖａｎＢ遺伝子を含有する。

【００５１】３０．シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＢΔ、これはバニリン酸デメチラー
ゼのβ−サブユニットをコードしているインタクトｖａｎＢ遺伝子の代わりに、
欠失で不活性化されたｖａｎＢ遺伝子を含有する。

【００５２】さらに、本発明は、有機化合物の生物工学的生産方法に関する。特に、この方
法は、アルコール類、アルデヒド類および有機酸類を生産するために使用するこ
とができる。後者は、好ましくは、コニフェリルアルコール。コニフェリルアル
デヒド、フェルラ酸、バニリンおよびバニリン酸である。

【００５３】先に記述した生物体が新規方法において使用される。非常に特に好適である生
物体は、細菌類、特にシュードモナス種を含む。具体的には、前記シュードモナ
ス種は、好ましくは、次の方法のために用いることができる：１．オイゲノールからコニフェリルアルコールを生産するための、シュードモ
ナス種ＨＲ１９９ｃａｌＡΩＫｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＡΩＧｍ
およびシュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＡΔ。

【００５４】２．オイゲノールもしくはコニフェリルアルコールからコニフェリルアルデヒ
ドを生産するための、シュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＢΩＫｍ、シュードモ
ナス種ＨＲ１９９ｃａｌＢΩＧｍおよびシュードモナス種ＨＲ１９９ｃａｌＢΔ
。

【００５５】３．オイゲノールもしくはコニフェリルアルコールもしくはコニフェリルアル
デヒドからフェルラ酸を生産するための、シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΩ
Ｋｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΩＧｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓ Δ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈΩＫｍ、シュードモナス種ＨＲ１
９９ｅｃｈΩＧｍおよびシュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈΔ。

【００５６】４．オイゲノールもしくはコニフェリルアルコールもしくはコニフェリルアル
デヒドもしくはフェルラ酸からバニリンを生産するための、シュードモナス種Ｈ
Ｒ１９９ｖｄｈΩＫｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＧｍ、シュードモ
ナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΔ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＧｍｖｄｈＢ ΩＫｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍｖｄｈＢΩＧｍ、シュードモ
ナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΔｖｄｈＢΩＧｍおよびシュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈ ΔｖｄｈＢΩＫｍ。

【００５７】５．オイゲノールもしくはコニフェリルアルコールもしくはコニフェリルアル
デヒドもしくはフェルラ酸もしくはバニリンからバニリン酸を生産するための、
シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＡΩＫｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＡ ΩＧｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＡΔ、シュードモナス種ＨＲ１
９９ｖａｎＢΩＫｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＢΩＧｍおよびシュー
ドモナス種ＨＲ１９９ｖａｎＢΔ。

【００５８】オイゲノールは好適な基質である。しかしながら、また、さらなる基質を添加
するか、またはオイゲノールをその他の基質により置換することさえ可能である
。

【００５９】本発明にしたがって使用される生物体のための適当な栄養培地は、合成、半合
成もしくは複合培養基である。これらの培地は、炭素含有および窒素含有化合物
、無機塩類、適当であれば微量元素、およびビタミン類を含有してもよい。

【００６０】適当である炭素含有化合物は、炭水化物、炭化水素もしくは有機標準化学薬品
である。好ましく使用できる化合物の例は、糖類、アルコール類もしくは糖アル
コール、有機酸もしくは複合混合物である。

【００６１】糖類は好ましくはグルコースである。好ましく使用できる有機酸は、クエン酸
もしくは酢酸である。複合混合物の例は、麦芽エキス、酵母エキス、カゼインも
しくはカゼイン加水分解物である。

【００６２】無機化合物は、適当な窒素含有基質である。これらの例は、硝酸塩およびアン
モニウム塩である。また、有機窒素源が使用できる。これらの起源は、酵母エキ
ス、大豆粉、カゼイン、カゼイン加水分解物およびコーンスティープリカーを含
む。

【００６３】使用されてもよい無機塩類の例は、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩および燐
酸塩である。該塩類が含有する金属は、好ましくは、ナトリウム、カリウム、マ
グネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛および鉄である。

【００６４】培養温度は、好ましくは、５〜１００℃の範囲内である。１５〜６０℃の範囲
が特に好適であり、２２〜３７℃がもっとも好適である。

【００６５】培地のｐＨは、好ましくは２〜１２である。４〜８の範囲が特に好適である。

【００６６】原則として、当業者に既知のすべてのバイオリアクターが、新規方法を実施す
るために使用することができる。好ましくは、液内培養法に適当であるすべての
装置が考えられる。これは、機械的混合機器をもっている容器でも、もっていな
い容器でも本発明にしたがって使用することができることを意味する。後者の例
は、振盪装置、およびバブルカラムリアクターもしくはループリアクターである
。前者は、好ましくは、いかなるデザインでも撹拌機を固定されたすべての既知
の装置を含む。

【００６７】新規方法は、連続的またはバッチ法で実施することができる。最大量の生産物
に達するために要する発酵時間は、使用される生物体の特定の性質に依存する。
しかしながら、原則的には、発酵時間は２〜２００時間である。

【００６８】本発明は、実施例を参照しながら以下により詳細に説明される：オイゲノール資化菌株シュードモナス種ＨＲ１９９（ＤＳＭ７０６３）の変異
株は、オメガ要素を挿入するか、または欠失を導入する方法によってオイゲノー
ル異化の遺伝子を特異的不活性化することによる標的方式において作成された。
用いられるオメガ要素は、抗生物質カナマイシン（ΩＫｍ）およびゲンタマイシ
ン（ΩＧｍ）に対する耐性をコードしているＤＮＡセグメントであった。これら
の耐性遺伝子は、標準法を用いてＴｎ５およびプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５
から単離された。コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ、コニフェリルアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、フェルロイルーＣｏＡシンテターゼ、エノイル−Ｃｏ
Ａヒドラターゼ−アルドラーゼ、β−ケトチオラーゼ、バニリンデヒドロゲナー
ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、バニリンデヒドロゲナーゼＩＩおよびバニリ
ン酸デメチラーゼをコードしている遺伝子ｃａｌＡ、ｃａｌＢ、ｆｃｓ、ｅｃｈ、ａａｔ、ｖｄｈ、ａｄｈ、ｖｄｈＢ、ｖａｎＡおよびｖａｎＢは、標準法を用
いて菌株シュードモナス種ＨＲ１９９のゲノムＤＮＡから単離され、そしてｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中にクローン化された。適当な制限エンドヌクレアー
ゼによる消化によって、ＤＮＡセグメントは、これらの遺伝子から除去される（
欠失）か、またはΩ要素により置換され（挿入）て、不活性化されているそれぞ
れの遺伝子をもたらした。この方式で変異された遺伝子は、接合的伝達性ベクタ
ー中に再クローン化され、続いて、菌株シュードモナス種ＨＲ１９９中に導入さ
れた。適当な選択が、それぞれの機能的野生型遺伝子を新しく導入された不活性
遺伝子により置換したトランスコンジュガント（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ
）を得るために使用された。この方法において得られた挿入および欠失変異株は
、ここに、それぞれの不活性遺伝子のみを保持した。この操作は、１つの欠損遺
伝子のみを保持する変異株および数個の遺伝子がこの方式で不活性化された多重
変異株の両方を得るために使用された。これらの変異株は：ａ）オイゲノールを、コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェ
ルラ酸、バニリンおよび／またはバニリン酸へ；ｂ）コニフェリルアルコールを、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニリ
ンおよび／またはバニリン酸へ；ｃ）コニフェリルアルデヒドを、フェルラ酸、バニリンおよび／またはバニリン
酸へ；ｄ）フェルラ酸を、バニリンおよび／またはバニリン酸へ；そしてｅ）バニリンをバニリン酸へ、生物変換するために使用された。

【００６９】材料および方法細菌の増殖するための条件エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の菌株が、Ｌｕｒ
ｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）もしくはＭ９無機培地（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｎｕａｌ．２
ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ）において３７℃で増殖された。シュードモナス種の菌株は、Ｎｕｔｒｉｅｎ
ｔＢｒｏｔｈ（ＮＢ，０．８％，ｗｔ／ｖｏｌ）または無機培地（ＭＭ）（Ｈ
．Ｇ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，ｅｔａｌ．１９６１．Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏ
ｌ．３８：２０９−２２２）またはＨＲ無機培地（ＨＲ−ＭＭ）（Ｊ．Ｒａｂｅ
ｎｈｏｒｓｔ，１９９６．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．４６：４７０−４７４）において３０℃で増殖された。フェルラ酸、バニリ
ン、バニリン酸およびプロトカテク酸は、ジメチルスルホキシド中に溶解され、
そしてそれぞれの培地に添加されて最終濃度０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）にされた
。オイゲノールは、直接、培地に添加されて最終濃度０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ
）にされるか、またはＭＭ寒天プレートの蓋における濾紙（円形フィルター５９
５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）に適用された。シュードモナス種のトランスコンジュガントおよび変異株が
増殖しつつある時、テトラサイクリン、カナマイシンおよびゲンタマイシンが、
最終濃度２５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび７．５μｇ／ｍｌにおいてそ
れぞれ使用された。

【００７０】培養上澄液中の代謝中間体の定性的および定量的検出培養上澄液が、いずれか直接または二重蒸留Ｈ₂Ｏによる希釈後に、高圧液体
クロマトグラフィー（ＫｎａｕｅｒＨＰＬＣ）によって分析された。クロマト
グラフィーは、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ１００Ｃ１８（７μｍ，２５０ｘ４ｍｍ
）において実施された。０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸およびアセトニトリル
が溶媒として使用された。物質を溶出するために使用された濃度勾配経過は、次
のとおりであった：００：００−０６：３０ → ２６％アセトニトリル０６：３０−０８：００ → １００％アセトニトリル０８：００−１２：００ → １００％アセトニトリル１２：００−１３：００ → ２６％アセトニトリル１３：００−１８：００ → ２６％アセトニトリルバニリンデヒドロゲナーゼＩＩの精製精製は４℃において実施された。

【００７１】粗抽出液オイゲノールにおいて増殖されたシュードモナス種ＨＲ１９９細胞は、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．０において洗浄され、次いで、同じバ
ッファーに再懸濁され、そして圧力１０００ｐｓｉにおいてＦｒｅｎｃｈプレス
（Ａｍｉｃｏｎ，ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を
２回通過させて破壊された。細胞ホモジネートは、超遠心（１ｈ，１００，００
０ｘｇ，４℃）に懸けられ、上澄液として得られる粗抽出液の可溶性画分を得た
。

【００７２】ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌにおける陰イオン交換クロマトグラフィー粗抽出液の可溶性画分は、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．０
に対して一夜透析された。透析液は、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐ
Ｈ６．０で平衡化され、そして流速０．８ｍｌ／ｍｉｎをもつＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｃｅｌカラム（２．６ｃｍｘ３５ｃｍ，ベッドボリューム［ＢＶ］：１８６
ｍｌ）上に負荷された。カラムは、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ
６．０の２ＢＶで洗浄された。バニリンデヒドロゲナーゼＩＩ（ＶＤＨＩＩ）
は、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．０（７５０ｍｌ）中０〜４
００ｍＭＮａＣｌの直線塩濃度勾配により溶出された。１０ｍｌフラクションが
回収された。高いＶＤＨＩＩ活性をもつフラクションが合体されてＤＥＡＥプ
ールが作成された。

【００７３】バニリンデヒドロゲナーゼ活性の決定ＶＤＨ活性は、光学的酵素試験を用いて３０℃において決定された。容量１ｍ
ｌである反応混合液は、リン酸カリウム０．１ｍｍｏｌ（ｐＨ７．１）、バニリ
ン０．１２５μｍｏｌ、ＮＡＤ０．５μｍｏｌ、ピルビン酸塩（Ｎａ塩）１．
２μｍｏｌ、乳酸デヒドロゲナーゼ（１Ｕ；ブタ心臓由来）および酵素溶液を含
有した。バニリンの酸化は、λ＝３４０ｎｍ（ε_vanillin＝１１．６ｃｍ²／μ
ｍｏｌ）においてモニターされた。酵素活性は、１分当たりバニリン１μｍｏｌ
を転化する酵素量に対応する１Ｕを用いて、単位（Ｕ）で与えられた。サンプル
中のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ、Ｎ．Ｊ．Ｒ
ｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ａ．Ｌ．ＦａｒｒａｎｄＲ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ．１
９５１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）を用いて決定され
た。

【００７４】コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ活性の決定ＣＡＤＨ活性は、Ｊａｅｇｅｒら（Ｅ．Ｌ．Ｊａｅｇｅｒ，Ｅｇｇｅｌｉｎｇ
ａｎｄＨ．Ｓａｈｍ．１９８１．ＣｕｒｒｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ．６：３３３−３３６）にしたがって光学的酵素試験を用いて３０℃において
決定された。容量１ｍｌである反応混合液は、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）０
．２ｍｍｏｌ、コニフェリルアルコール０．４μｍｏｌ、ＮＡＤ２μｍｏｌ、
セミカルバジド０．１ｍｍｏｌおよび酵素溶液を含有した。ＮＡＤの還元は、λ
＝３４０ｎｍ（ε＝６．３ｃｍ²／μｍｏｌ）においてモニターされた。酵素活
性は、１分当たり基質１μｍｏｌを転化する酵素量に対応する１Ｕを用いて、単
位（Ｕ）で与えられた。サンプル中のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙらの方法（
Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ、Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒａｎ
ｄＲ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ．１９５１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２
６５−２７５）を用いて決定された。

【００７５】コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の決定ＣＡＬＤＨ活性は、光学的酵素試験を用いて３０℃において決定された。容量
１ｍｌである反応混合液は、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）０．１ｍｍｏｌ、コ
ニフェリルアルデヒド０．０８μｍｏｌ、ＮＡＤ２．７μｍｏｌおよび酵素溶
液を含有した。コニフェリルアルデヒドのフェルラ酸への酸化は、λ＝４００ｎ
ｍ（ε＝３４ｃｍ²／μｍｏｌ）においてモニターされた。酵素活性は、１分当
たり基質１μｍｏｌを転化する酵素量に対応する１Ｕを用いて、単位（Ｕ）で与
えられた。サンプル中のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｏ．Ｈ．Ｌｏ
ｗｒｙ、Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ａ．Ｌ．ＦａｒｒａｎｄＲ．Ｊ．
Ｒａｎｄａｌｌ．１９５１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５
）を用いて決定された。

【００７６】フェルロイル−ＣｏＡシンテターゼ（フェルラ酸チオキナーゼ）活性の決定ＦＣＳ活性は、Ｚｅｎｋら（Ｚｅｎｋｅｔａｌ．１９８０．Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１０１：１８２−１８７）の方法の変法である光学的酵素試験を
用いて３０℃において決定された。容量１ｍｌである反応混合液は、リン酸カリ
ウム（ｐＨ７．０）０．０９ｍｍｏｌ、ＭｇＣｌ₂２．１μｍｏｌ、フェルラ酸
０．７μｍｏｌ、ＡＴＰ２μｍｏｌ、補酵素Ａ０．４μｍｏｌおよび酵素溶液
を含有した。フェルラ酸からＣｏＡの形成は、λ＝３４５ｎｍ（ε＝１０ｃｍ²
／μｍｏｌ）においてモニターされた。酵素活性は、１分当たり基質１μｍｏｌ
を転化する酵素量に対応する１Ｕを用いて、単位（Ｕ）で与えられた。サンプル
中のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙらの方法（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ、Ｎ．Ｊ．Ｒ
ｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ａ．Ｌ．ＦａｒｒａｎｄＲ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ．１
９５１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）を用いて決定され
た。

【００７７】電気泳動法タンパク質含有抽出液は、Ｓｔｅｇｅｍａｎｎら（Ｓｔｅｇｅｍａｎｎｅｔ
ａｌ．１９７３．Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．２８ｃ：７２２−７３２）の
方法を用いて、７．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリアクリルアミドゲルにおいてネイ
ティブ条件下で、そしてＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．１９７０．
Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０−６８５）の方法を用いて１１．
５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリアクリルアミドゲルにおいて変性条件下で分画された
。ＳｅｒｖａＢｌｕｅＲが、非特異的タンパク質染色のために使用された。
コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ、コニフェリルアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼおよびバニリンデヒドロゲナーゼを特異的に染色するために、ゲルは、１
００ｍＭＫＰバッファー（ｐＨ７．０）において２０分間再緩衝化され、続い
て、０．０８％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮＡＤ、０．０４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ｐ−ニト
ロブルーテトラゾリウムクロリド、０．００３％（ｗｔ／ｖｏｌ）フェナジンメ
トサルフェート、そして１ｍＭのそれぞれの基質が、対応する発色バンドが可視
化されるまで添加された同じバッファー中で３０℃でインキュベートされた。

【００７８】ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦメンブランへのタンパク質の転移タンパク質は、ＳｅｍｉｄｒｙＦａｓｔｂｌｏｔ装置（Ｂ３２／３３，Ｂｉ
ｏｍｅｔｒａ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｍａｎｙ）を用いて、製造者の指示
にしたがってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦメンブラン（Ｗａｔ
ｅｒｓ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）へ転移さ
れた。

【００７９】Ｎ末端アミノ酸配列の決定Ｎ末端アミノ酸配列は、製造者の指示にしたがい、ＰｒｏｔｅｉｎＰｅｐｔ
ｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｔｙｐｅ４７７Ａ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＵＳＡ）およびＰＴＨアナライザーを用
いて決定された。

【００８０】ＤＮＡの単離および操作ゲノムＤＮＡは、Ｍａｒｍｕｒの方法を用いて単離された（Ｊ．Ｍａｒｍｕｒ
，１９６１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２０８−２１８）。他のプラスミドＤ
ＮＡおよび／またはＤＮＡ制限フラグメントは、標準法を用いて単離され、そし
て分析された（Ｊ．Ｅ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＴ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｎｕａｌ．２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ．，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。

【００８１】ＤＮＡの伝達コンピテントなエシェリヒア・コリ細胞が調製され、そしてＨａｎａｈａｎの
方法を用いて形質転換された（Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ、１９８３．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６６：５５７−５８０）。プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ
Ｓ１７−１菌株（ドナー）とシュードモナス種菌株（レシピエント）間の接合的
プラスミド伝達は、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら（Ｂ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｅｔａ
ｌ．１９８１．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４７：１９８−２０５）の方法にし
たがってＮＢ寒天プレート上か、または「ミニコンプリメンテーション（ｍｉｎ
ｉｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）法」によって、Ｃ源として０．５％（ｗｔ
／ｖｏｌ）グルコン酸塩およびテトラサイクリン２５μｇもしくはカナマイシン
１００μｇを含有するＭＭ寒天プレートにおいて遂行された。この場合、レシピ
エントの細胞は、接種ストリークとして１方向に適用された。次いで、５分後、
ドナー菌株の細胞が、接種ストリークとして、レシピエント接種ストリークと交
差するストリークによって適用された。３０℃で４８時間培養した後、トランス
コンジュガントは、交差部位のすぐ下流に増殖するが、一方ドナー菌株またはレ
シピエント菌株は、いずれも増殖することができない。

【００８２】ハイブリダイゼーション実験ＤＮＡ制限フラグメントは、５０ｍＭトリス−５０ｍＭホウ酸−１．２５ｍＭ
ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．５）中０．８％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲル
において電気泳動的に分画された（Ｊ．Ｅ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆ．Ｆｒｉｔｓ
ｃｈａｎｄＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｎｕａｌ．２ｎｄＥｄｉｔｉｏ
ｎ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。正電荷をもつ
ナイロンメンブラン（孔径：０．４５μｍ，ＰａｌｌＦｉｌｔｒａｔｉｏｎｓ
ｔｅｃｈｎｉｋ，Ｄｒｅｉｅｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上へのゲルからの変性Ｄ
ＮＡの転移、続く、ビオチン化もしくはジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブとの
ハイブリダイゼーション、およびこれらのＤＮＡプローブの調製は、すべて、標
準法を用いて遂行された（Ｊ．Ｅ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈａ
ｎｄＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ
：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｎｕａｌ．２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ．，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。

【００８３】ＤＮＡ配列決定ヌクレオチド配列は、各場合、製造者の指示にしたがって、「ＬＩ−ＣＯＲ」
ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒＭｏｄｅｌ４０００Ｌ」（ＬＩ−ＣＯＲＩｎ
ｃ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＤｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ
，ＵＳＡ）を用い、そして「７−デアザ−ｄＧＴＰを用いるサーモシークェナー
ゼ蛍光標識プライマーサイクルシークェンシングキット」（Ａｍｅｒｓｈａｍ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
ｐｌｃ．，ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ
，Ｅｎｇｌａｎｄ）用いてＳａｎｇｅｒら（Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．１９７
７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３−５４６
７）のジデオキシ鎖終結法にしたがって「非放射能的に」決定された。

【００８４】合成オリゴヌクレオチドは、Ｓｔｒａｕｓｓら（Ｅ．Ｃ．Ｓｔｒａｕｓｓｅ
ｔａｌ．１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５４：３５３−３６０）の
「プライマー−ホッピング戦略」にしたがって配列決定を実施するために使用さ
れた。

【００８５】化学薬品、生化学薬品および酵素制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、λＤＮＡおよび光学的酵素試験のための酵素
および基質は、Ｃ．Ｆ．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ＆Ｓｏｅｈｎｅ（Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。［γ−³²Ｐ］ＡＴＰは、Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｂ
ｕｃｈｌｅｒ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。オ
リゴヌクレオチドは、ＭＷＧ−ＢｉｏｔｅｃｈＧｍｂＨ（Ｅｂｅｒｂｅｒｇ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。タイプＮＡアガロースは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
−ＬＫＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から得られた。すべての他の化学薬
品は、Ｈａａｒｍａｎｎ＆Ｒｅｉｍｅｒ（Ｈｏｌｚｍｉｎｄｅｎ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）、Ｅ．ＭｅｒｃｋＡＧ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｆ
ｌｕｋａＣｈｅｍｉｅ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｅｒｖａ
Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もし
くはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｅ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）か
ら得られた。

【００８６】実施例例１カナマイシン（ΩＫｍ）もしくはゲンタマイシン（ΩＧｍ）に対する耐性を媒介するオメガ要素の構築 ΩＫｍ要素を構築するために、トランスポゾンＴｎ５（Ｅ．Ａ．Ａｕｅｒｗａ
ｌｄ，Ｇ．ＬｕｄｗｉｇａｎｄＨ．Ｓｃｈｓｌｌｅｒ．１９８１．Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４５：１０７−
１１３；Ｅ．Ｂｅｃｋ，Ｇ．Ｌｕｄｗｉｇ，Ｅ．Ａ．Ａｕｅｒｓｗａｌｄ，Ｂ．
ＲｅｉｓｓａｎｄＨ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ．１９８２．Ｇｅｎｅｓ１９：３
２７−３３６；Ｐ．Ｍａｚｏｄｉｅｒ，Ｐ．Ｃｏｓｓａｒｔ，Ｅ．Ｇｉｒａｕｄ
ａｎｄＦ．Ｇａｓｓｅｒ．１９８５．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ
．１３：１９５−２０５）の２０９９ｂｐＢｇｌＩフラグメントが、調製規模に
おいて単離された。フラグメントは、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼでそれを処理する
ことによって約９９０ｂｐに短縮された。ここに、カナマイシン耐性遺伝子（ア
ミノグリコシド−３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼをコードしている）のみ
を含有したこのフラグメントが、次に、ＳｍａＩ切断ｐＳＫｓｙｍＤＮＡ（対称
的に構築された多重クローニング部位［ＳａｌＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ
，ＳｍａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｌＩ］を含有するｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ^-誘導体）に連結された。ＳｍａＩフラグメント、ＥｃｏＲＩ
フラグメント、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントもしくはＳａｌＩフラグメントとし
て得られるプラスミドからのΩＫｍ要素を再単離することが可能であった。

【００８７】 ΩＧｍ要素を構築するために、プラスミドｐＢＲ１ＭＣＳ−５（Ｍ．Ｅ．Ｋｏ
ｖａｃｈ，Ｐ．Ｈ．Ｅｌｚｅｒ，Ｄ．Ｓ．Ｈｉｌｌ，Ｇ．Ｔ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ，Ｍ．Ａ．Ｆａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｍ．ＲｏｏｐａｎｄＫ．Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓ
ｏｎ．１９９５．Ｇｅｎｅｓ１６６：１７５−１７６）の９８３ｂｐＥａｅＩ
フラグメントが、調製規模において単離され、次いで、マングビーン（ｍｕｎｇ
ｂｅａｎ）ヌクレアーゼにより処理（一本鎖ＤＮＡ分子末端の漸次消化）され
た。ここに、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ゲンタマイシン−３−アセチルトラン
スフェラーゼをコードしている）のみを含有したこのフラグメントが、次に、Ｓ
ｍａＩ切断ｐＳＫｓｙｍＤＮＡ（上記参照）に連結された。ＳｍａＩフラグメン
ト、ＥｃｏＲＩフラグメント、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントもしくはＳａｌＩフ
ラグメントとして得られるプラスミドからのΩＧｍ要素を再単離することが可能
であった。

【００８８】例２ Ω要素を挿入するか、または欠失の手段によって不活性化されるべきシュードモナス種ＨＲ１９９（ＤＳＭ７０６３）からの遺伝子のクローニングｆｃｓ，ｅｃｈ，ｖｄｈおよびａａｔ遺伝子は、Ｅ．コリＳ１７−１菌株ＤＳ
Ｍ１０４３９およびＤＳＭ１０４４０から出発し、そしてプラスミドｐＥ２０７
およびｐＥ５−１を用いて、別々にクローン化された（欧州特許出願公開第０８
４５５３２号、参照）。定められたフラグメントが、これらのプラスミドから調
製規模で単離され、そして下記のように処理された：ｆｃｓ遺伝子のクローニングでは、プラスミドｐＥ２０７からの２３５０ｂｐ
ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントおよびプラスミドｐＥ５−１からの３７００
ｂｐＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントが、２つのフラグメントが、ＥｃｏＲＩ
末端で一緒に結合されるように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中に同時にクロ
ーン化された。６０５０ｂｐＳａｌＩフラグメントが、得られるハイブリッドプ
ラスミドから調製規模で単離され、そしてＢａｌ３１ヌクレアーゼで処理されて
約２４８０ｂｐに短縮された。ＰｓｔＩリンカーが、続いて、そのフラグメント
の末端に連結され、そしてＰｓｔＩによる消化後に、フラグメントが、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中にクローン化された（ｐＳＫｆｃｓ）。Ｅ．コリＸＬ１
ｂｌｕｅの形質転換後、ｆｃｓ遺伝子を発現し、そしてＦＣＳ活性０．２Ｕ／タ
ンパク質ｍｇを表すクローンが得られた。

【００８９】ｅｃｈ遺伝子のクローニングでは、プラスミドｐＥ２０７からの３８００ｂｐ
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントが、調製規模で単離され、そしてＢａ
ｌ３１ヌクレアーゼでそれを処理することによって約１４７０ｂｐに短縮された
。次いで、ＥｃｏＲＩリンカーが、そのフラグメントの末端に連結され、そして
ＥｃｏＲＩによる消化後に、フラグメントが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中
にクローン化された（ｐＳＫｅｃｈ）。

【００９０】ｖｄｈ遺伝子のクローニングでは、プラスミドｐＥ２０７からの２３５０ｂｐ
ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントが、調製規模で単離された。ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＳＫ^-中にクローン化後、フラグメントは、エキソヌクレアーゼＩＩＩ
／マングビーンヌクレアーゼ系を用いて、約１５３０ｂｐまで一端において端を
切り取られた。次いで、ＥｃｏＲＩリンカーが、そのフラグメントの末端に連結
され、そしてＥｃｏＲＩによる消化後に、フラグメントが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ^-中にクローン化された（ｐＳＫｖｄｈ）。Ｅ．コリＸＬ１ｂｌｕｅの
形質転換後、ＶＤＨ遺伝子を発現し、そしてＶＤＨ活性０．０１Ｕ／タンパク質
ｍｇを表すクローンが得られた。

【００９１】ａａｔ遺伝子のクローニングでは、プラスミドｐＥ５−１からの３７００ｂｐ
ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントが、調製規模で単離され、そしてＢａｌ３１
ヌクレアーゼでそれを処理することによって約１５９０ｂｐに短縮された。次い
で、ＥｃｏＲＩリンカーが、そのフラグメントの末端に連結され、そしてＥｃｏ
ＲＩによる消化後に、フラグメントが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中にクロ
ーン化された（ｐＳＫａａｔ）。

【００９２】例３ Ω要素を挿入するか、またはこれらの遺伝子の構成領域を欠失することによる上記遺伝子の不活性化ｆｃｓ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＫｆｃｓが、ＢｓｓＨＩＩにより消化
されて、ｆｃｓ遺伝子から切り取られる１２９０ｂｐフラグメントが得られた。
再連結後、ｆｃｓ遺伝子の欠失誘導体（ｆｃｓΔ）（図１ｉおよび２ｉ、参照）
は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中のクローン化形態において得られた（ｐＳ
ＫｆｃｓΔ）。さらに、フラグメントが切り取られた後、オメガ要素ΩＫｍおよ
びΩＧｍがその代わりに連結された。これは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中
のクローン化形態において得られるｆｃｓ遺伝子のΩで不活性化された誘導体（ｆｃｓ ΩＫｍ，図１ｇおよび２ｇ、参照）および（ｆｃｓΩＧｍ，図１ｈおよび
２ｈ、参照）をもたらした（ｐＳＫｆｃｓΩＫｍおよびｐＳＫｆｃｓΩＧｍ）。
ハイブリッドプラスミドが、欠失またはΩ要素挿入によって不活性化されたｆｃｓ遺伝子を保持している、得られるＥ．コリ・クローンの粗抽出液中には、いか
なるＦＣＳ活性も検出することができなかった。

【００９３】ｅｃｈ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＫｅｃｈが、ＮｒｕＩにより消化され
て、ｅｃｈ遺伝子から切り取られる５３ｂｐフラグメントと４３０ｂｐフラグメ
ントが得られた。再連結後、ｅｃｈ遺伝子の欠失誘導体（ｅｃｈΔ，図１ｌおよ
び２ｌ、参照）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中のクローン化形態において
得られた（ｐＳＫｅｃｈΔ）。さらに、フラグメントが切り取られた後、オメガ
要素ΩＫｍおよびΩＧｍがそれらの代わりに連結された。これは、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ^-中のクローン化形態において得られるｅｃｈ遺伝子のΩで不活
性化された誘導体（ｅｃｈΩＫｍおよびｅｃｈΩＧｍ）をもたらした（ｐＳＫｅｃｈ ΩＫｍおよびｐＳＫｅｃｈΩＧｍ）。

【００９４】ｖｄｈ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＫｖｄｈが、ＢｓｓＨＩＩにより消化
されて、ｖｄｈ遺伝子から切り取られる２１０ｂｐフラグメントが得られた。再
連結後、ｖｄｈ遺伝子の欠失誘導体（ｖｄｈΔ，図１ｏおよび２ｏ、参照）は、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中のクローン化形態において得られた（ｐＳＫｖ
ｄｈΔ）。さらに、フラグメントが切り取られた後、オメガ要素ΩＫｍおよびΩ
Ｇｍがその代わりに連結された。これは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中のク
ローン化形態において得られるｖｄｈ遺伝子のΩで不活性化された誘導体（ｖｄｈ ΩＫｍおよびｖｄｈΩＧｍ）をもたらし（ｐＳＫｖｄｈΩＫｍ，図１ｍおよび
２ｍ参照）および（ｐＳＫｖｄｈΩＧｍ，図１ｎおよび２ｎ参照）。ハイブリッ
ドプラスミドが、欠失またはΩ要素挿入によって不活性化されたｖｄｈ遺伝子を
保持している、得られるＥ．コリ・クローンの粗抽出液中には、いかなるＶＤＨ
活性も検出することができなかった。

【００９５】ａａｔ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＫａａｔが、ＢｓｓＨＩＩにより消化
されて、ａａｔ遺伝子から切り取られる５９ｂｐフラグメントが得られた。再連
結後、ａａｔ遺伝子の欠失誘導体（ａａｔΔ，図１ｒおよび２ｒ、参照）は、ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中のクローン化形態において得られた（ｐＳＫａａ
ｔΔ）。さらに、フラグメントが切り取られた後、オメガ要素ΩＫｍおよびΩＧ
ｍがその代わりに連結された。これは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-中のクロ
ーン化形態において得られるａａｔ遺伝子のΩで不活性された化誘導体（ａａｔ ΩＫｍ，図１ｐおよび２ｐ参照）および（ａａｔΩＧｍ，図１ｑおよび２ｑ参照
）をもたらした（ｐＳＫａａｔΩＫｍおよびｐＳＫａａｔΩＧｍ）。

【００９６】例４接合的伝達性「自殺プラスミド」ｐＳＵＰ２０２中へのΩ要素で不活性化された遺伝子のサブクローニングシュードモナス種ＨＲ１９９におけるインタクト遺伝子をΩ要素で不活性化さ
れた遺伝子を用いて置換できるためには、一方で、シュードモナス類に伝達する
ことができる（接合的伝達性プラスミド）が、他方では、これらの細菌において
複製することができず、結果的にシュードモナス類において不安定である（「自
殺プラスミド」）ベクターを必要とする。そのようなプラスミド系を用いてシュ
ードモナス類に伝達されるＤＮＡセグメントは、それらが相同組み換え（Ｒｅｃ
Ａ依存性組み換え）によって細菌細胞のゲノム中に組み込まれる場合のみ、保持
することができる。この場合には、「自殺プラスミド」ｐＳＵＰ２０２（Ｓｉｍ
ｏｎｅｔａｌ．１９８３．Ｉｎ：Ａ．Ｐｕｅｈｌｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆｔｈｅＢａｃｔｅｒｉａ−ｐｌａｎｔｉｎｔｅ
ｒａｃｔｉｏｎ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．９８−１０６）が使用された。

【００９７】ＰｓｔＩによる消化後、不活性遺伝子ｆｃｓΩＫｍおよびｆｃｓΩＧｍが、プ
ラスミドｐＳＫｆｃｓΩＫｍおよびｐＳＫｆｃｓΩＧｍから単離され、そしてＰ
ｓｔＩ切断されたｐＳＵＰ２０２ＤＮＡに連結された。連結混合物は、Ｅ．コリ
Ｓ１７−１中に形質転換された。選択は、それぞれカナマイシンもしくはゲンタ
マイシンをまた含有するテトラサイクリン含有ＬＢ培地において実施された。ハ
イブリッドプラスミド（ｐＳＵＰｆｃｓΩＫｍ）が不活性遺伝子ｆｃｓΩＫｍを
含有しているカナマイシン耐性形質転換株が得られた。対応するゲンタマイシン
耐性形質転換株のハイブリッドプラスミド（ｐＳＵＰｆｃｓΩＧｍ）は、不活性
遺伝子ｆｃｓΩＧｍを含有した。

【００９８】ＥｃｏＲＩによる消化後、不活性遺伝子ｅｃｈΩＫｍおよびｅｃｈΩＧｍが、
プラスミドｐＳＫｅｃｈΩＫｍおよびｐＳＫｅｃｈΩＧｍから単離され、そして
ＥｃｏＲＩ切断されたｐＳＵＰ２０２ＤＮＡに連結された。連結混合物は、Ｅ．
コリＳ１７−１中に形質転換された。選択は、それぞれカナマイシンもしくはゲ
ンタマイシンをまた含有するテトラサイクリン含有ＬＢ培地において実施された
。ハイブリッドプラスミド（ｐＳＵＰｅｃｈΩＫｍ）が不活性遺伝子ｅｃｈΩＫ
ｍを含有しているカナマイシン耐性形質転換株が得られた。対応するゲンタマイ
シン耐性形質転換株のハイブリッドプラスミド（ｐＳＵＰｅｃｈΩＧｍ）は、不
活性遺伝子ｅｃｈΩＧｍを含有した。

【００９９】ＥｃｏＲＩによる消化後、不活性遺伝子ｖｄｈΩＫｍおよびｖｄｈΩＧｍが、
プラスミドｐＳＫｖｄｈΩＫｍおよびｐＳＫｖｄｈΩＧｍから単離され、そして
ＥｃｏＲＩ切断されたｐＳＵＰ２０２ＤＮＡに連結された。連結混合物は、Ｅ．
コリＳ１７−１中に形質転換された。選択は、それぞれカナマイシンもしくはゲ
ンタマイシンをまた含有するテトラサイクリン含有ＬＢ培地において実施された
。ハイブリッドプラスミド（ｐＳＵＰｖｄｈΩＫｍ）が不活性遺伝子ｖｄｈΩＫ
ｍを含有しているカナマイシン耐性形質転換株が得られた。対応するゲンタマイ
シン耐性形質転換株のハイブリッドプラスミド（ｐＳＵＰｖｄｈΩＧｍ）は、不
活性遺伝子ｖｄｈΩＧｍを含有した。

【０１００】ＥｃｏＲＩによる消化後、不活性遺伝子ａａｔΩＫｍおよびａａｔΩＧｍが、
プラスミドｐＳＫａａｔΩＫｍおよびｐＳＫａａｔΩＧｍから単離され、そして
ＥｃｏＲＩ切断されたｐＳＵＰ２０２ＤＮＡに連結された。連結混合物は、Ｅ．
コリＳ１７−１中に形質転換された。選択は、それぞれカナマイシンもしくはゲ
ンタマイシンをまた含有するテトラサイクリン含有ＬＢ培地において実施された
。ハイブリッドプラスミド（ｐＳＵＰａａｔΩＫｍ）が不活性遺伝子ａａｔΩＫ
ｍを含有しているカナマイシン耐性形質転換株が得られた。対応するゲンタマイ
シン耐性形質転換株のハイブリッドプラスミド（ｐＳＵＰａａｔΩＧｍ）は、不
活性遺伝子ａａｔΩＧｍを含有した。

【０１０１】例５「ｓａｃＢ選択系」を保持する接合的伝達性「自殺プラスミド」ＰＨＥ５５中への欠失で不活性化された遺伝子のサブクローニングシュードモナス種ＨＲ１９９におけるインタクト遺伝子を欠失により不活性化
された遺伝子を用いて置換できるためには、ｐＳＵＰ２０２の場合において既に
記述された性質を保持するベクターを必要とする。欠失で不活性化された遺伝子
の場合には、Ω要素で不活性化された遺伝子に対して、シュードモナス種ＨＲ１
９９における遺伝子の成功裏の置換を選択する方法が存在しない（抗生物質耐性
がない）ので、その他の選択系が使用されねばならなかった。「ｓａｃＢ選択系
」では、置換する欠失で不活性化された遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子に加えて
ｓａｃＢ遺伝子を保持するプラスミド中にクローン化される。シュードモナス類
へのこのハイブリッドプラスミドの接合的伝達に続いて、プラスミドが、インタ
クト遺伝子が位置するゲノム中の部位における相同組み換え（第１の交差）によ
って組み込まれる。これは、インタクト遺伝子および欠失で不活性化された遺伝
子がｐＨＥ５５ＤＮＡによって互いに分離されているこれら両方の遺伝子を保持
する「異型遺伝子接合（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｔｉｃ）」菌株をもたらす。これ
らの菌株は、そのベクターによってコードされている耐性を表し、そしてまた活
性ｓａｃＢ遺伝子を保持する。次の努力は、インタクト遺伝子と一緒のｐＨＥ５
５ＤＮＡが、次いで、第２の相同組み換えイベント（第２の交差）によってゲノ
ムＤＮＡから分離されることである。この組み換えイベントは、ここに、不活性
遺伝子のみを保持する菌株をもたらす。さらに、ｐＨＥ５５にコードされた抗生
物質耐性およびｓａｃＢ遺伝子は両方失われる。この菌株がスクロース含有培地
にストリークされる場合、その遺伝子産物が、スクロースを細胞のペリプラズム
に蓄積されるポリマーへ転化するので、ｓａｃＢ遺伝子を発現する菌株の増殖は
阻害される。第２の組み換えイベントが起きた結果、もはやｓａｃＢ遺伝子を担
持しない細胞の増殖は、結果的に阻害される。欠失で不活性化された遺伝子の組
み込みを表現型で選択できるようにするためには、この遺伝子はインタクト遺伝
子と交換されない；代わりに、使用されるのは、置換されるべき遺伝子が既にΩ
要素の挿入によって「標識され」ている菌株である。成功裏の置換が起きる場合
、得られる菌株は、Ω要素によってコードされている抗生物質耐性を失う。

【０１０２】ＰｓｔＩによる消化後、不活性遺伝子ｆｃｓΔが、プラスミドｐＳＫｆｃｓΔ
から単離され、そしてＰｓｔＩ切断されたｐＨＥ５５ＤＮＡに連結された。連結
混合物は、Ｅ．コリＳ１７−１中に形質転換された。選択は、テトラサイクリン
含有ＬＢ培地において実施された。ハイブリッドプラスミド（ｐＨＥｆｃｓΔ）
が不活性遺伝子ｆｃｓΔを含有しているテトラサイクリン耐性形質転換株が得ら
れた。

【０１０３】ＥｃｏＲＩによる消化後、不活性遺伝子ｅｃｈΔが、プラスミドｐＳＫｅｃｈ Δから単離され、そしてマングビーンヌクレアーゼにより処理された（平滑末端
の生成）。そのフラグメントが、ＢａｍＨＩ切断され、マングビーンヌクレアー
ゼ処理されたｐＨＥ５５ＤＮＡに連結された。連結混合物は、Ｅ．コリＳ１７−
１中に形質転換された。選択は、テトラサイクリン含有ＬＢ培地において実施さ
れた。ハイブリッドプラスミド（ｐＨＥｅｃｈΔ）が不活性遺伝子ｅｃｈΔを含
有しているテトラサイクリン耐性形質転換株が得られた。

【０１０４】ＥｃｏＲＩによる消化後、不活性遺伝子ｖｄｈΔが、プラスミドｐＳＫｖｄｈ Δから単離され、そしてマングビーンヌクレアーゼにより処理された。そのフラ
グメントが、ＢａｍＨＩ切断され、マングビーンヌクレアーゼ処理されたｐＨＥ
５５ＤＮＡに連結された。連結混合物は、Ｅ．コリＳ１７−１中に形質転換され
た。選択は、テトラサイクリン含有ＬＢ培地において実施された。ハイブリッド
プラスミド（ｐＨＥｖｄｈΔ）が不活性遺伝子ｖｄｈΔを含有しているテトラサ
イクリン耐性形質転換株が得られた。

【０１０５】ＥｃｏＲＩによる消化後、不活性遺伝子ａａｔΔが、プラスミドｐＳＫａａｔ Δから単離され、そしてマングビーンヌクレアーゼにより処理された。そのフラ
グメントが、ＢａｍＨＩ切断され、マングビーンヌクレアーゼ処理されたｐＨＥ
５５ＤＮＡに連結された。連結混合物は、Ｅ．コリＳ１７−１中に形質転換され
た。選択は、テトラサイクリン含有ＬＢ培地において実施された。ハイブリッド
プラスミド（ｐＨＥａａｔΔ）が不活性遺伝子ａａｔΔを含有しているテトラサ
イクリン耐性形質転換株が得られた。

【０１０６】例６オイゲノール異化の遺伝子が、Ω要素の挿入によって特異的に不活性化された菌株シュードモナス種ＨＲ１９９変異株の作成菌株シュードモナス種ＨＲ１９９は、以下に挙げられるｐＳＵＰ２０２のハイ
ブリッドプラスミドを宿しているＥ．コリＳ１７−１菌株が、ドナーとして使用
される接合実験において、レシピエントとして使用された。トランスコンジュガ
ントは、Ω要素に対応する抗生物質を含有するグルコース含有無機培地において
選択された。ｐＳＵＰ２０２にコードされたテトラサイクリン耐性に基づいて、
「同型遺伝子接合」（二重交差による、Ω要素挿入で不活性化された遺伝子によ
るインタクト遺伝子の置換）および「異型遺伝子接合」（一回交差による、ハイ
ブリッドプラスミドのゲノム中への挿入）トランスコンジュガント間を区別する
ことが可能であった。

【０１０７】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΩＫｍおよびシュードモナス種ＨＲ
１９９ｆｃｓΩＧｍが、シュードモナス種ＨＲ１９９と、それぞれＥ．コリＳ１
７−１（ｐＳＵＰｆｃｓΩＫｍ）およびＥ．コリＳ１７−１（ｐＳＵＰｆｃｓΩ
Ｇｍ）とを接合させた後に得られた。ΩＫｍで不活性化されたか、またはΩＧｍ
で不活性化された遺伝子（それぞれｆｃｓΩＫｍおよびｆｃｓΩＧｍ）によるイ
ンタクトｆｃｓ遺伝子の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された。

【０１０８】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈΩＫｍおよびシュードモナス種ＨＲ
１９９ｅｃｈΩＧｍが、シュードモナス種ＨＲ１９９と、それぞれＥ．コリＳ１
７−１（ｐＳＵＰｅｃｈΩＫｍ）およびＥ．コリＳ１７−１（ｐＳＵＰｅｃｈΩ
Ｇｍ）とを接合させた後に得られた。ΩＫｍで不活性化されたか、またはΩＧｍ
で不活性化された遺伝子（それぞれｅｃｈΩＫｍおよびｅｃｈΩＧｍ）によるイ
ンタクトｅｃｈ遺伝子の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された。

【０１０９】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍおよびシュードモナス種ＨＲ
１９９ｖｄｈΩＧｍが、シュードモナス種ＨＲ１９９と、それぞれＥ．コリＳ１
７−１（ｐＳＵＰｖｄｈΩＫｍ）およびＥ．コリＳ１７−１（ｐＳＵＰｖｄｈΩ
Ｇｍ）とを接合させた後に得られた。ΩＫｍで不活性化されたか、またはΩＧｍ
で不活性化された遺伝子（それぞれｖｄｈΩＫｍおよびｖｄｈΩＧｍ）によるイ
ンタクトｖｄｈ遺伝子の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された。

【０１１０】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ａａｔΩＫｍおよびシュードモナス種ＨＲ
１９９ａａｔΩＧｍが、シュードモナス種ＨＲ１９９と、それぞれＥ．コリＳ１
７−１（ｐＳＵＰａａｔΩＫｍ）およびＥ．コリＳ１７−１（ｐＳＵＰａａｔΩ
Ｇｍ）とを接合させた後に得られた。ΩＫｍで不活性化されたか、またはΩＧｍ
で不活性化された遺伝子（それぞれａａｔΩＫｍおよびａａｔΩＧｍ）によるイ
ンタクトａａｔ遺伝子の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された。

【０１１１】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΩＫｍｖｄｈΩＧｍは、シュードモ
ナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΩＫｍと、Ｅ．コリＳ１７−１（ｐＳＵＰｖｄｈΩＧｍ
）とを接合させた後に得られた。ΩＧｍで不活性化された遺伝子（ｖｄｈΩＧｍ
）によるインタクトｖｄｈ遺伝子の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された
。

【０１１２】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍａａｔΩＧｍは、シュードモ
ナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍと、Ｅ．コリＳ１７−１（ｐＳＵＰａａｔΩＧｍ
）とを接合させた後に得られた。ΩＧｍで不活性化された遺伝子（ａａｔΩＧｍ
）によるインタクトａａｔ遺伝子の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された
。変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍｅｃｈΩＧｍは、シュード
モナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍと、Ｅ．コリＳ１７−１（ｐＳＵＰｅｃｈΩＧ
ｍ）とを接合させた後に得られた。ΩＧｍで不活性化された遺伝子（ｅｃｈΩＧ
ｍ）によるインタクトｅｃｈ遺伝子の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証され
た。

【０１１３】例７オイゲノール異化の遺伝子が、構成領域を欠失することによって特異的に不活性化された菌株シュードモナス種ＨＲ１９９変異株の作成菌株シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΩＫｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈ ΩＫｍ、シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍおよびシュードモナス
種ＨＲ１９９ａａｔΩＫｍは、以下に挙げられるｐＨＥ５５のハイブリッドプラ
スミドを宿しているＥ．コリＳ１７−１菌株が、ドナーとして使用される接合実
験において、レシピエントとして使用された。「異型遺伝子接合」トランスコン
ジュガントは、テトラサイクリン（ｐＨＥ５５にコードされた耐性）に加えてま
たΩ要素に対応する抗生物質を含有するグルコース含有無機培地において選択さ
れた。スクロース含有培地にストリークされた後、第２の組み換えイベント（第
２の交差）によってベクターＤＮＡを消失したトランスコンジュガントが得られ
た。抗生物質を含有しないか、またはΩ要素に対応する抗生物質を含有する無機
培地におけるストリークによって、Ω要素挿入で不活性化された遺伝子が、欠失
で不活性化された遺伝子（抗生物質耐性なし）によって置換された変異株を同定
することが可能であった。

【０１１４】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓΔは、シュードモナス種ＨＲ１９９ｆｃｓ ΩＫｍと、Ｅ．コリＳ１７−１（ｐＨＥｆｃｓΔ）とを接合させた後に得
られた。欠失で不活性化された遺伝子（ｆｃｓΔ）によるΩＫｍで不活性化され
た遺伝子（ｆｃｓΩＫｍ）の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された。

【０１１５】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈΔは、シュードモナス種ＨＲ１９９ｅｃｈ ΩＫｍと、Ｅ．コリＳ１７−１（ｐＨＥｅｃｈΔ）とを接合させた後に得
られた。欠失で不活性化された遺伝子（ｅｃｈΔ）によるΩＫｍで不活性化され
た遺伝子（ｅｃｈΩＫｍ）の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された。

【０１１６】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΔは、シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈ ΩＫｍと、Ｅ．コリＳ１７−１（ｐＨＥｖｄｈΔ）とを接合させた後に得
られた。欠失で不活性化された遺伝子（ｖｄｈΔ）によるΩＫｍで不活性化され
た遺伝子（ｖｄｈΩＫｍ）の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された。

【０１１７】変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ａａｔΔは、シュードモナス種ＨＲ１９９ａａｔ ΩＫｍと、Ｅ．コリＳ１７−１（ｐＨＥａａｔΔ）とを接合させた後に得
られた。欠失で不活性化された遺伝子（ａａｔΔ）によるΩＫｍで不活性化され
た遺伝子（ａａｔΩＫｍ）の置換は、ＤＮＡ配列決定によって立証された。

【０１１８】例８変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍを用いる、オイゲノールのバニリンへの生物変換菌株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍが、６ｍＭオイゲノールを含有
するＨＲ−ＭＭ５０ｍｌにおいて光学濃度約ＯＤ６００ｎｍ＝０．６まで増殖さ
れた。１７時間後、培養上澄液中に２．９ｍＭバニリン、１．４ｍＭフェルラ酸
および０．４ｍＭバニリン酸を検出することができた。

【０１１９】例９変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＧｍａａｔΩＫｍを用いる、オイゲノールのフェルラ酸への生物変換菌株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＧｍａａｔΩＫｍが、６ｍＭオイゲ
ノールを含有するＨＲ−ＭＭ５０ｍｌにおいて光学濃度約ＯＤ６００ｎｍ＝０．
６まで増殖された。１８時間後、培養上澄液中に１．９ｍＭバニリン、２．４ｍ
Ｍフェルラ酸および０．６ｍＭバニリン酸を検出することができた。

【０１２０】例１０変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＧｍａａｔΩＫｍを用いる、オイゲノールのコニフェリルアルコールへの生物変換菌株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＧｍａａｔΩＫｍが、６ｍＭオイゲ
ノールを含有するＨＲ−ＭＭ５０ｍｌにおいて光学濃度約ＯＤ６００ｎｍ＝０．
４まで増殖された。１５時間後、培養上澄液中に１．７ｍＭコニフェリルアルコ
ール、１．４ｍＭバニリン、１．４ｍＭフェルラ酸および０．２ｍＭバニリン酸
を検出することができた。

【０１２１】例１１変異株シュードモナス種ＨＲ１９９ｖｄｈΩＫｍを用いる、１０ｌ発酵槽におけるオイゲノールから天然バニリンの発酵生産生産発酵槽は、ｐＨ７．０に調整され、そしてグリセロール１２．５ｇ／ｌ、
酵母エキス１０ｇ／ｌおよび酢酸０．３７ｇ／ｌからなる培地において振盪培養
機（１２０ｒｐｍ）上で３２℃で増殖された２４時間前培養液１００ｍｌを接種
された。発酵槽は、次の組成の培地９．９ｌを含有した：酵母エキス１．５ｇ
／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄１．６ｇ／ｌ、ＮａＣｌ０．２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄０．２ｇ／
ｌ。ｐＨは、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．０に調整された。殺菌後、オ
イゲノール４ｇがその培地に添加された。温度は３２℃であり、通気は３Ｎｌ／
ｍｉｎであり、そして撹拌速度は６００ｒｐｍであった。ｐＨは、水酸化ナトリ
ウム溶液によりｐＨ６．５に維持された。

【０１２２】培養４時間後に、オイゲノールの連続添加が開始され、オイゲノール２５５ｇ
が、発酵が６５時間後に終了する時までに培養液に添加された。発酵終了時点で
、オイゲノール濃度は０．２ｇ／ｌであった。バニリンの濃度は２．６ｇ／ｌで
あった。また、フェルラ酸３．４ｇ／ｌが存在した。

【０１２３】この方法で得られたバニリンは、既知の物理的方法、例えばクロマトグラフィ
ー、蒸留および／または抽出によって単離することができ、そして天然香料製造
のために使用された。

【０１２４】図面に関する説明的注釈：図１ａ〜１ｒ：生物体および変異株を単離するための遺伝子構造体ｃａｌＡ＊：コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼについて不活性化された
遺伝子の部分ｃａｌＢ＊：コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼについて不活性化された
遺伝子の部分ｆｃｓ＊：フェルロイルーＣｏＡシンテターゼについて不活性化された遺伝子の
部分ｅｃｈ＊：エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ−アルドラーゼについて不活性化され
た遺伝子の部分ｖｄｈ＊：バニリンデヒドロゲナーゼについて不活性化された遺伝子の部分ａａｔ＊：β−ケトチオラーゼについて不活性化された遺伝子の部分「＊」標識された制限酵素切断部位が構築のために使用されたけれども、それ
らは、得られた構築物において、もはや機能しない。

【０１２５】図２ａ：ｃａｌＡΩＫｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｂ：ｃａｌＡΩＧｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｃ：ｃａｌＡΔ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｄ：ｃａｌＢΩＫｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｅ：ｃａｌＢΩＧｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｆ：ｃａｌＢΔ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｇ：ｆｃｓΩＫｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｈ：ｆｃｓΩＧｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｉ：ｆｃｓΔ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｊ：ｅｃｈΩＫｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｋ：ｅｃｈΩＧｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｌ：ｅｃｈΔ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｍ：ｖｄｈΩＫｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｎ：ｖｄｈΩＧｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｏ：ｖｄｈΔ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｐ：ａａｔΩＫｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｑ：ａａｔΩＧｍ遺伝子構造体のヌクレオチド配列図２ｒ：ａａｔΔ遺伝子構造体のヌクレオチド配列

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 7/22 Ｃ１２Ｐ 7/42 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:38 7/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 7/22 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:38） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者プリーフエルト，ホルストドイツ・デー−48291テルクテ・ポツトホフスカンプ５ (72)発明者オーフエルハーゲ，イエルクドイツ・デー−59132ベルクカメン・ロテルバツハシユトラーセ42 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA77 CA06 DA09 HA20 4B064 AC17 AC26 AD21 AD29 CA19 CD06 DA10 4B065 AA41X AB01 AC16 BA02 BB06 CA08 CA41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オイゲノールおよび／またはフェルラ酸の異化作用の酵素が
、中間体コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニ
リンおよび／またはバニリン酸が蓄積するように不活性化されることを特徴とす
る、形質転換および／または変異誘発された単細胞もしくは多細胞生物体。
【請求項２】オイゲノールおよび／またはフェルラ酸の異化作用が、対応
する遺伝子中にΩ要素を挿入するか、または欠失を導入することによって改変さ
れていることを特徴とする、請求項１記載の生物体。
【請求項３】酵素コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ、コニフェリ
ルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、フェルロイル−ＣｏＡシンテターゼ、エノイル
−ＣｏＡヒドラターゼ−アルドラーゼ、β−ケトチオラーゼ、バニリンデヒドロ
ゲナーゼもしくはバニリン酸デメチラーゼをコードしている１種以上の遺伝子が
改変され、そして／または不活性化されていることを特徴とする、いずれか請求
項１もしくは２記載の生物体。
【請求項４】生物体が、単細胞、好ましくは微生物または植物もしくは動
物細胞であることを特徴とする、請求項１〜３の一つに記載の生物体。
【請求項５】生物体が、細菌、好ましくはシュードモナス種であることを
特徴とする、請求項１〜４の一つに記載の生物体。
【請求項６】酵素コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ、コニフェリ
ルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、フェルロイル−ＣｏＡシンテターゼ、エノイル
−ＣｏＡヒドラターゼ−アルドラーゼ、β−ケトチオラーゼ、バニリンデヒドロ
ゲナーゼもしくはバニリン酸デメチラーゼ、または２種以上のこれらの酵素をコ
ードしているヌクレオチド配列が改変され、そしてまたは不活性化されている遺
伝子構造体。
【請求項７】図１ａ〜１ｒに示される配列をもつ遺伝子構造体。
【請求項８】図２ａ〜２ｒに示される配列をもつ遺伝子構造体。
【請求項９】請求項６〜８の一つに記載の少なくとも１個の遺伝子構造体
を含有するベクター。
【請求項１０】生物体が、請求項９記載の少なくとも１個のベクターを宿
していることを特徴とする、請求項１〜５の一つに記載の形質転換された生物体
。
【請求項１１】生物体が、それぞれのインタクト遺伝子の代わりに、ゲノ
ム中に組み込まれている請求項６〜８の一つに記載の少なくとも１個の遺伝子構
造体を含有していることを特徴とする、請求項１〜５の一つに記載の生物体。
【請求項１２】請求項１〜５または１０〜１１の一つに記載の生物体が使
用されることを特徴とする、有機化合物、特にアルコール、アルデヒドおよび有
機酸の生物工学的生産方法。
【請求項１３】改変オイゲノールおよび／またはフェルラ酸の異化作用が
、それ自体既知である微生物学的培養法の手段によって達成されることを特徴と
する、請求項１〜５の一つに記載の生物体を作成する方法。
【請求項１４】オイゲノールおよび／またはフェルラ酸の異化作用におけ
る改変、および／または対応する遺伝子の不活性化が、組み換えＤＮＡ法の手段
によって達成されることを特徴とする、請求項１〜５または１０〜１１の一つに
記載の生物体を作成する方法。
【請求項１５】コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェ
ルラ酸、バニリンおよび／またはバニリン酸を生産するための、請求項１〜５ま
たは１０〜１１の一つに記載の生物体の使用。
【請求項１６】形質転換および／または変異誘発された生物体を作成する
ための、請求項６〜８の一つに記載の遺伝子構造体または請求項９記載のベクタ
ーの使用。