JP2001505041A - 組換えジオールデヒドラターゼを発現する組換え菌によるグリセロールからの１，３−プロパンジオールの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 １,２−プロパンジオールを分解するジオールデヒドラターゼ酵素を有することが知られている細菌由来の遺伝子を、細菌性宿主にクローニングし、前記宿主をグリセロールの存在下で増殖させる、グリセロールの１,３−プロパンジオールへの生物変換方法が提供される。宿主細胞内での外来遺伝子の発現は、グリセロールの１,３−プロパンジオールへの酵素的変換を促進するものであり、１,３−プロパンジオールは培養物から単離する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えジオールデヒドラターゼを発現する組換え菌によるグリセロールからの1, 3−プロパンジオールの製造発明の属する技術分野 本発明は、ジオールデヒドラターゼをコードする外来遺伝子を内包する組換え 菌による、グリセロールの１,３−プロパンジオールへの生物変換方法に関する 。発明の背景 １,３−プロパンジオールは、ポリエステル繊維の生産およびポリウレタンや 環状化合物の製造に有用であり得るモノマーである。 １,３−プロパンジオールに至る多様な化学的経路が知られている。たとえば 、１,３−プロパンジオールは、ホスフィン、水、一酸化炭素、水素および酸の 存在下で、エチレンオキシドおよび触媒から調製してもよいし、アクロレインを 触媒液相水和した後、還元することにより調製してもよいし、また、一酸化炭素 および水素の存在下で、周期律表VIII族触媒上で反応させた、グリセロールのよ うな炭化水素から調製してもよい。１,３−プロパンジオールは一般にこれらの 方法により生成可能だが、費用がかかるし、また環境汚染物質を含む廃液を生じ てしまう。 更新可能な供給源から生成する原料を利用する、１,３−プロパンジオールに 至る生物学的経路が知られている。たとえば、グリセロールを１,３−プロパン ジオールに変換することのできる菌株が、クレブシエラ、シトロバクター、クロ ストリジウム、およびラクトバシラスなどの属に見られる。これらの細菌におい ては、グリセロールは酸化または還元系に入る。グリセロールの酸化は、結果的 にグリセロールデヒドロゲナーゼによりグリセロールをジヒドロキシアセトン（ ＤＨＡ）へ変換し、そのＤＨＡはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）依存キナーゼに よりリン酸化されて、細胞内の解凍系に入るジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨ ＡＰ）を生じる。グリセロールの還元は、グリセロールデヒドラターゼが触媒し てまず異 性化と脱水が起こり、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを生じ、これが１, ３−プロパンジオール：ＮＡＤ⁺酸化還元酵素により更に還元されて、最終的な 細胞代謝産物である１,３−プロパンジオールを生じる。Ｋ．ニウモニエ（K.pne umoniae）においては、還元系に含まれる二つの酵素のみならず酸化系に含まれ るうちの少なくとも最初の二つの酵素の発現は、相互に作用して調節されている 。この４酵素系は機能的に連結しており、グリセロールからの１,３−プロパン ジオールの生成は、ＤＨＡからＤＨＡＰに至る経路により供給される還元剤の存 在に依存する。 グリセロールの１,３−プロパンジオールへの変換の原因となる遺伝子は単離 されており、それらはすべてｄｈａレギュロンに包含されている。組換え菌の、 タンパク発現能と生育速度が高いという潜在的な長所を利用するために、大腸菌 (Ｅ．コリ)内で、異種遺伝子としてのｄｈａレギュロンを発現させる試みがいく つかなされている。たとえば、シトロバクター由来のｄｈａレギュロン［Daniel ら、FEMS Microbiol.Lett.,100,281(1992)］およびクレブシエラ由来のｄｈａレ ギュロン［Tongら、Appl.Environ.Microbiol.,57,3541(1991)］を大腸菌内で発 現し、グリセロールを１,３−プロパンジオールに変換することが示されている 。組換え菌内でのｄｈａレギュロンの発現は、野生型での１,３−プロパンジオ ールの生成よりも有利である可能性を提案するものである。ｄｈａレギュロンに 含まれる遺伝子は、酵素と、グリセロールの１,３−プロパンジオールへの効率 的な変換に必要な還元剤との双方を提供する。しかしながら、グリセロールデヒ ドロゲナーゼおよびグリセロールデヒドラターゼの双方を同時に過剰発現すると 、ＤＨＡに変換するグリセロールも出てくる。還元系酵素のみを発現しながら、 還元剤の生成のための異なる基質を提供することによって、すべてのグリセロー ルを１,３−プロパンジオールに変換するのが有利であろう。好ましい系は、グ リセロール基質をより効率的に利用しながら、ジオール生成物の高収率を維持す るものであろう。 多くの細菌が、１,２−プロパンジオールを単一炭素源として利用可能である ことは、以前から知られている。この能力は、ｐｄｕオペロンによりコードされ る、特定のビタミンＢ₁₂依存ジオールデヒドラターゼにより賦与されるものと考 えら れる。ｐｄｕオペロンは、ビタミンＢ₁₂の生合成に必要な酵素をコードするｃｏ ｂオペロンに連結しており、双方のオペロンとも、ｃ ｐｏｃＲ遺伝子によりコ ードされる同一の活性化タンパク質の調節下にある。 近年、クレブシエラ・オキシトカのジオールデヒドラターゼをコードする遺伝 子がクローニングおよび配列決定され、大腸菌内で発現された。活性ジオールデ ヒドラターゼがこれらの形質転換体内に観察されたが、これらのクローンが炭素 基質を１,３−プロパンジオールに代謝できるという証拠はない。 多様なサルモネラ属およびクレブシエラ属が、嫌気条件下で、１,２−プロパ ンジオールの、プロピオンアルデヒド、最終的には１−プロパノールおよびプロ ピオン酸への変換を触媒するジオールデヒドラターゼを生産することが知られて いる。ジオールデヒドラターゼはまた、クロストリジウム、およびプロピオニバ クテリウムで同定されているが、大腸菌ではされていない。クレブシエラ種由来 のジオールデヒドラターゼは、グリセロールを１,３−プロパンジオールに変換 できる［Forageら、Bacteriol,149,413(1981)］。 ｐｄｕジオールデヒドラターゼの主たる機能は１,２−プロパンジオールの代 謝にあるが、本発明者らは、大腸菌内でＫ．ニウモニエのジオールデヒドラター ゼを発現することにより、グリセロールの１,３−プロパンジオールへの変換が 触媒されることを発見した。このジオールデヒドラターゼ系を発現する組換え菌 は、グリセロールを所望の１,３−プロパンジオール生成物に変換し、かつ、グ リセロールデヒドラターゼ系のような連結系に依存しない。本発明者らは、クレ ブシエラ種由来のｐｄｕジオールデヒドラターゼ遺伝子による組換え菌の形質転 換により、新規で、効率的かつ省コストの、１,３−プロパンジオールに至る生 物学的経路が提供されることを発見した。発明の要旨 本発明は、クレブシエラ・ニウモニエから単離した約３５kbのＤＮＡ断片を含 有するコスミドであって、前記断片が、図５、第４列の制限部位を有する活性ジ オールデヒドラターゼ酵素をコードするコスミドを含む。 本発明は、更に、宿主微生物と、上記コスミドとを含有する形質転換微生物を 含む。 本発明は、更に、活性ジオールデヒドラターゼ酵素をコードし、配列番号１に 記載するようなＤＮＡ配列を有する遺伝子、または活性アルコールデヒドロゲナ ーゼ酵素をコードし、配列番号２に記載するようなＤＮＡ配列を有する遺伝子を 含む。 本発明は、更に、宿主微生物と、上記遺伝子のいずれかとを含有する形質転換 微生物を含む。 本発明は、更に、ジオールデヒドラターゼを発現可能な遺伝子で微生物宿主を 形質転換し、そして前記形質転換宿主を炭素基質に接触させることによる、炭素 基質の生物変換を含む。 本発明は、更に、クレブシエラ・ニウモニエから単離した約３５kbの断片を含 有するコスミドに由来し、かつ、活性ジオールデヒドラターゼ酵素、および前記 コスミドによりコードされる他のあらゆる機能細菌タンパク質をコードする遺伝 子で微生物宿主を形質転換し、そして前記形質転換宿主を炭素基質に接触させる ことによる、炭素基質の生物変換を含む。図面の簡単な説明 図１は、Ｋ．ニウモニエのｐｄｕ−ｃｏｂ領域の遺伝子構成の概略図である。 ＤＮＡ配列は、GCG-Wisconsin packageを用いて分析し、またオープンリーディ ングフレームは、ＧＡＰを用いてＳ．ティフィムリウム（S.typhimurium）配列 と比較した。同一性％および類似性％を示す。 図２は、Ｓ．ティフィムリウムのｐｄｕＣ遺伝子にコードされるアミノ酸配列 と、Ｋ．ニウモニエのｐｄｕＣ遺伝子にコードされるアミノ酸配列との比較であ る。 図３は、Ｋ．ニウモニエのｐｄｕＣ遺伝子にコードされるアミノ酸配列と、シ トロバクター・フリウンジ（Citrobacter freundii）由来のグリセロールデヒド ラターゼのアミノ酸配列との比較であり、類似性％および同一性％を示す。 図４は、Ｋ．ニウモニエ由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子のオープン リーディングフレームから推定されるアミノ酸配列と、シトロバクター・フリウ ンジ由来の同じ遺伝子にコードされるアミノ酸配列との比較である。この図は、 二つの推定アミノ酸配列間の類似性％および同一性％を示す。 図５は、コスミドｐＫＰ１，ｐＫＰ２，およびｐＫＰ４の制限酵素地図（Ｅｃ ｏＲ１、ＢａｍＨ１、ＥｃｏＲＶ、およびＮｏｔ１）をそれぞれ第１列、第２列 、および第４列に示すものであり、また、０.８％アガロースゲル電気泳動にお ける分離を示す。分子量マーカーは、端のレーンに注入した。４番とした列は、 ジオールデヒドラターゼ酵素を含むコスミドを示す。発明の詳細な説明 ここに用いる以下の用語は、請求項および明細書の解釈に用いてよい。 「構築体」なる用語は、プラスミド、ウイルス、自立複製する配列、ファージ 、またはあらゆる供給源に由来する、線状または環状の、一本鎖または二本鎖の ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列を指し、複数の塩基配列を連結するかまたは再結 合して特異な構築物としたものであり、プロモーター断片と選ばれた遺伝子産物 のＤＮＡ配列を、適切な３‘末端非翻訳領域配列と共に細胞へ導入することがで きる。 「形質転換」または「トランスフェクション」なる用語は、核酸導入後、細胞 において新たな遺伝子が獲得されることを指す。 「発現」なる用語は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの、その遺伝 子産物への転写および翻訳を指す。発現に際しては、遺伝子産物の配列をコード するＤＮＡ鎖を、たいていはメッセンジャーＲＮＡである相補的ＲＮＡにまず転 写し、ついで転写したメッセンジャーＲＮＡを、上記遺伝子産物がタンパク質で ある場合はその遺伝子産物に翻訳する。 ここで用いる「プラスミド」または「ベクター」または「コスミド」なる用語 は、細胞の主要な代謝に関与しない遺伝子をたいてい担持する、染色体外の要素 を指し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形である。 「炭素基質」なる用語は、微生物によって代謝されうるあらゆる炭素源を意味 し、少なくとも一つの炭素原子を含むものである。 「デヒドラターゼ酵素」なる用語は、グリセロール分子を生成物の３−ヒドロ キシプロピオンアルデヒドに変換可能なあらゆる酵素を指すものとする。本発明 の目的においては、デヒドラターゼ酵素は、好ましい基質がそれぞれグリセロー ルおよび１,２−プロパンジオールである、グリセロールデヒドラターゼまたは ジオールデヒドラターゼのいずれかである。 「１,３−プロパンジオール」なる用語は、式ＨＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨの化合 物を指し、繊維製造用のポリマーの生産において、モノマーとして有用である。 以下の菌株は、ブダペスト条約の規定のもとにアメリカ基準菌株保存機構[Ame rican Type Culture Collection(ATCC)、米国20852メリーランド州、ロックビル 、パックローンドライブ12301所在]に寄託された：コスミドｐＫＰ１を含む大腸 菌ＤＨ５αに対応するＡＴＣＣ受託番号第６９７８９番。ＡＴＣＣ受託番号第６ ９７９０番は、コスミドｐＫＰ４を含む大腸菌ＤＨ５αを指す。 本発明は、組換え生物を用いた、グリセロールからの１,３−プロパンジオー ルの生物学的製造法を含む。この方法は、１,２−プロパンジオールに特異性を 有する異種のｐｄｕジオールデヒドラターゼ遺伝子で形質転換した形質転換大腸 菌を組み込んでいる。この形質転換大腸菌は、炭素源としてのグリセロールの存 在下で増殖し、その増殖培地から１,３−プロパンジオールが単離される。 本発明の方法は、ポリエステルやその他のポリマーの製造に有用な１,３−プ ロパンジオールモノマーの、迅速で、廉価、かつ環境責任を果たしうる供給源を 提供する。 本発明は、ｐｄｕジオールデヒドラターゼの発現に適した形質転換宿主細胞を 提供する。適切な宿主細胞は、一般に、ジオールデヒドラターゼ遺伝子を通常は 内包していないものであろう。本発明の方法において好ましいのは、大腸菌、枯 草菌（バシラス・サチリス）、バシラス・リヒェニフォルミス（Bacillus liche niformis）、またはピヒア・パストリスである。形質転換宿主細胞内のジオール デヒドラターゼは、さきにTorayaら、J.Biol.Chem.,252,963(1977)が記載してい る。遺伝子の単離： ｐｄｕジオールデヒドラターゼ遺伝子はあらゆる適切な供給源から得られるが 、好ましくは、１,２−プロパンジオールを唯一の炭素源として利用可能である ことがわかっている細菌から得る。ｐｄｕ遺伝子を内包することがわかっている 適切な細菌には、限定はないが、クレブシエラ属、クロストリジア属、サルモネ ラ属、 およびシトロバクター属がある。 細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学の業界では一般的で、 よく知られている。本発明においては、所望のジオールデヒドラターゼをコード する遺伝子を単離するのに、実質的にあらゆる方法を用いてよい。たとえば、遺 伝子の配列がわかっている場合は、制限酵素切断により作製した適切な遺伝子ラ イブラリーを、その所望の遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーニングして よい。配列を単離したら、そのＤＮＡを、ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ ン（ＰＣＲ）（米国特許第4,683,202号）のような標準的なプライマー支配の増 幅法で増幅して、適切なべクターを用いて形質転換するのに適した量のＤＮＡを 得る。 あるいはまた、ゲノムＤＮＡの長い断片（３５〜４５kb）がベクターにパッケ ージングされているコスミドライブラリーを作製して、適当な宿主を形質転換す るのに用いてよい。コスミドベクターは、大量のＤＮＡを収容可能な点で特異で ある。一般に、コスミドベクターは、外来ＤＮＡのパッケージング、そしてその 後の環状化に必要なｃｏｓＤＮＡ配列の、少なくとも一つのコピーを有する。ｃ ｏｓ配列に加え、これらのベクターは、ＣｏｌＥ１のような複製起点や、アンピ シリンまたはネオマイシンに耐性の遺伝子のような薬剤耐性マーカーも含むこと がよくある。多数のコスミドベクターが当業界で知られており、例えば、ａｍｐ マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、および単一のｃｏｓ部位を含有するｐＪＢ８[I sh-Horowiczら、Nucl.Acids Res.9,2989(1981)］；ならびに、二つのｃｏｓ部位 、カナマイシン耐性遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子の双方、およびＣｏｌＥ１ 複製起点を含むｃ２ＲＢ［Batesら、Gene,26,137(1983)］がある。あらゆるコス ミドベクターが本発明に用いるのに適しているが、Stratagene社（カリフォルニ ア州ラホラ所在）から提供されるSupercos1ベクターが、最も好ましい。 典型的には、コスミドをクローニングするために、外来ＤＮＡを適当な制限酵 素を用いて単離し、コスミドベクターのｃｏｓ領域の隣に連結する。次いで、線 状化した外来ＤＮＡを含有するコスミドベクターは、λバクテリオファージのよ うなＤＮＡパッケージング媒体にインビトロでパッケージングする。パッケージ ングの間、ｃｏｓ部位は開裂し、外来ＤＮＡが細菌性ウイルス粒子の頭部にパッ ケージングされる。これらの粒子は、大腸菌のような適切な宿主細胞にトランス フェクションするのに用いる。細胞に注入すると、外来ＤＮＡはｃｏｓ粘着末端 の影響下で環状化する。この方法で、外来ＤＮＡの長い断片を組換え宿主細胞内 に導入し、発現させることができる。 コスミドベクターおよびコスミドによる形質転換法は、本発明の状況において 、グリセロールを１,３−プロパンジオールに加工可能な遺伝子を所有すること がわかっている細菌属から、ゲノムＤＮＡの長い断片をクローニングするのに用 いた。具体的には、Ｋ．ニウモニエおよびＫ．アエロゲネスのゲノムＤＮＡを、 当業界でよく知られた方法により単離し、コスミドベクターSupercos1へ挿入す るために制限酵素Ｓａｕ３Ａで切断して、GigapackII（登録商標）パツケージン グ抽出物を用いてパッケージングした。ベクターの構築の後、このコスミドＤＮ Ａで大腸菌XL1-Blue MR細胞を形質転換した。形質転換体は、細胞をグリセロー ルの存在下で増殖させ、１,３−プロパンジオール形成について培地を分析する ことにより、グリセロールを１,３−プロパンジオールへ変換する能力のあるも のをスクリーニングした。 コスミドによる形質転換から生成したｐＫＰ４およびｐＫＰ５と称するＤＮＡ 配列を、GenbankデータベースのＤＮＡ配列と比較した。Ｓ．ティフィムリウム のｐｄｕ領域とホモロジーを示す独立したクローンがいくつか同定されたが、こ のことは、これらの形質転換体が、１,２−ジオールデヒドラターゼ遺伝子を含 む、１,２−プロパンジオール利用酵素をコードするＤＮＡを担持していたこと を示唆する。これに対し、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２と称する形質転換体において は、オープンリーディングフレームがＣ．フリウンジ由来のグリセロールデヒド ラターゼ遺伝子に広範囲なホモロジーを示したが、このことは、これらの形質転 換体が、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含んでいたこ とを示唆する。細胞： 本発明は、更に、炭素基質を１,３−プロパンジオールに変換可能な形質転換 宿主細胞を含む。さきに開示したように、宿主細胞は、ジオールデヒドラターゼ をコードする単一の遺伝子、またはジオールデヒドラターゼ、および生物変換の 工 程を促進することで知られるその他の酵素をコードする一連の特定の遺伝子、ま たはコスミドの全ＤＮＡ断片によって形質転換してよい。本発明に用いるのに好 ましいのは、大腸菌ＤＨ５αである。しかしながら、その他の細胞も上記遺伝子 によって形質転換されやすいと考えられ、それらには、限定はないが、バシラス 属、クレブシエラ属、シトロバクター属、クロストリジア属、およびピヒア属が 含まれると考えられる。炭素基質： 本発明は、形質転換した宿主生物の酵素機構によって、所望の１,３−プロパ ンジオール最終生成物に変換される炭素基質を提供する。実質的に、デヒドラタ ーゼ酵素の基質として機能するあらゆる炭素基質が、アルコールを最も利用する 本発明に適している。好ましい炭素基質には、限定はないが、グリセロール、エ チレングリコール、１,２−プロパンジオール、１,２−ブタンジオール、および ２,３−ブタンジオールがあるが、グリセロールが最も好ましい。１,３−プロパンジオールの精製および単離 発酵培地からの１,３−プロパンジオールの精製方法は、当業界では知られて いる。たとえば、反応混合物を有機溶媒で抽出し、蒸留して、カラムクロマトグ ラフィーにかけることによって、細胞培地からプロパンジオールを得ることがで きる（米国特許第5,356,812号）。この方法に特に適した有機溶媒は、シクロヘ キサンである（米国特許第5,008,473号）。 １,３−プロパンジオールは、培地を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ ）分析にかけることによって直接同定してよい。本発明において好ましいのは、 ０.０１Ｎ硫酸を移動相に用いるイソクラティック方式で、分析用イオン排除カ ラムによって分析する方法である。 以下の実施例により本発明を説明するが、これらは本発明をいかようにも限定 するものではない。実施例 一般的方法 制限酵素切断、リン酸化、連結、および形質転換は、Sambrook,Jら、Molecula r Cloning:Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press 、１９ ８９年、に記載のようにして行った。GeneClean（カリフォルニア州ラホラ所在 のストラテジーン社製）を、製造者に指示されているように用いて、制限部位か ら酵素を切り出すのに用いた。制限酵素は、New England Biolabs社（マサチュ ーセッツ州ボストン所在）またはPromega社（ウィスコンシン州マディソン所在 ）より入手した。増殖培地は、GIBCO/BRL（メリーランド州ゲイザーズバーグ所 在）より入手した。 略語の意味は以下の通りである：「ｈ］は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意 味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、そして「ｄ」は日を意味する。培地： 合成Ｓ１２培地を、１,３−プロパンジオール生産能のある細菌形質転換体の スクリーニングに用いた。Ｓ１２培地は以下の成分を含む：硫酸アンモニウム、 １０ｍＭ；リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７.０、５０ｍＭ；ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ； ＣａＣｌ₂、０.７ｍＭ；ＭｎＣｌ₂、５０μＭ；ＦｅＣｌ₃、１μＭ；ＺｎＣｌ、 １μＭ；ＣｕＳＯ₄、１.７２μＭ；ＣｏＣｌ₂、２.５３μＭ；Ｎａ２ＭｏＯ₄、 ２.４２μＭ；およびチアミン塩酸塩、２μＭ。 合成Ｓ１５培地もまた、１,３−プロパンジオール生産能のある細菌形質転換 体のスクリーニングに用いた。Ｓ１５培地は以下の成分を含む：硫酸アンモニウ ム、１０ｍＭ；リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７.０、１ｍＭ；ＭＯＰＳ／ＫＯＨ 緩衝液、ｐＨ７.０、５０ｍＭ；ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ；ＣａＣｌ₂、０.７ｍＭ；Ｍ ｎＣｌ₂、５０μＭ；ＦｅＣｌ₃、１μＭ；ＺｎＣｌ、１μＭ；ＣｕＳＯ₄、１.７ ２μＭ；ＣｏＣｌ₂、２.５３μＭ；Ｎａ₂ＭｏＯ₄、２.４２μＭ；およびチアミ ン塩酸塩、２μＭ。１,３−プロパンジオールの単離および同定： グリセロールの１,３−プロパンジオールへの変換はＨＰＬＣでモニターした 。分析は、紫外線（２１０nm）および赤外線検出を用いる、Waters Maxima８２ ０ＨＰＬＣシステムにより実施した。試料を、ShodexＳＨ−１０１１Ｐ予備カラ ム（６mm×５０mm）を備えたShodexＳＨ−１０１１カラム(8mm×３００ｍｍ、マ サチューセッツ州ミルフォード所在のWaters社より購入)に注入した。温度は５ ０℃に調節し、移動相としての０.０１ＮＨ₂ＳＯ₄ を流速０.５ｍｌ／ｍｉｎで用いた。定量分析が望まれる場合は、外部標 準品としての、あらかじめ量のわかっているトリメチル酢酸と共に、試料を調製 した。典型的には、グリセロール（赤外線検出）、１,３−プロパンジオール（ 赤外線検出）、およびトリメチル酢酸（紫外線および赤外線検出）の保持時間は 、それぞれ、２０.６７ｍｉｎ、２６.０８ｍｉｎ、および３５.０３ｍｉｎであ った。 １,３−プロパンジオールの生成は、Hewlett Packard社製５８９０シリーズII ガスクロマトグラフを、Hewlett Packard社製５９７１シリーズ質量選択的検出 器(ＥＩ)と、HP-INNOWaxカラム（長さ３０ｍ、内径０.２５ｍｍ、フィルム厚さ ０.２５ミクロン）と組み合わせたガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ ＭＳ）により確認した。グリセロールから生成した１,３−プロパンジオールの 保持時間および質量スペクトルを、真正な１,３−プロパンジオールのもの（ｍ ／ｅ：５７，５８）と比較した。細胞： コスミド形質転換に用いた宿主細胞は、Jesseら［Focus,10,69(1988)］に十分 に記載されている大腸菌ＤＨ５αであり、GIBCO/BRL社より入手した。Ｋ．ニウモニエおよびＫ．アエロゲネスのコスミドライブラリーの構築： マサチューセッツ州ケンブリッジ所在のハーバード医学校の、E.C.C.Lin教授 より入手し、またRuch,F.E.およびLin,E.C.C.,Journal of Bacteriology,Vol.12 4,p.348（１９７５年１０月）に記載されている、Ｋ．ニウモニエ（ＡＴＣＣ受 託番号第２５９５５番）およびＫ．アエロゲネス（Ｋ．ニウモニエまたはアエロ バクター・アエロゲネス）ＥＣＬ第２１０６番）を、１００ｍｌのＬＢ培地で、 通気下３７℃で８ｈ増殖させた。菌（チューブあたり２５ｍｌ）を、DuPont社の SorvallGLC2.B遠心機により、室温で１５min、３,０００ｒｐｍで遠心した。細 菌をペレット状にし、上清を捨てた。細菌細胞ペレットは、−２０℃で凍結した 。ＤＮＡを切断しないよう特別に注意して（即ちボルテックスは行わない）、以 下に概説するようにして染色体ＤＮＡを単離した。一つのチューブの菌を、２. ５ｍｌの５０ｍＭトリス−１０ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、５００μｌのリゾチ ーム（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。ペレットをそっと再懸濁し、懸濁液を３７℃で １５ｍｉｎインキュベートした。ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％ となるように加 えた。これによって溶液が透明となった。プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ） を加え、懸濁液を５５℃で２ｈインキュベートした。チューブを取り出し、氷浴 に移して、塩化ナトリウムを最終濃度が０.４Ｍとなるように加えた。２倍容の エタノールをこの液体に加えた。ガラス管を界面に挿入して、ＤＮＡをそっと巻 き取った。ＤＮＡを７０％エタノールを含むチューブに浸けた。真空乾燥の後、 ＤＮＡを５００μｌの水に再懸濁し、ＤＮＡ濃度を分光工学的に測定した。等量 の希釈ＤＮＡを０.５％アガロースゲルに流し、このＤＮＡの本来の長さを決定 した。 染色体ＤＮＡを、上記のSambrookらの文献に概説されているようにして、Sau3 Aで部分的に消化した。ＤＮＡ（２μｇ）を２ユニットのSau3A（ウィスコンシン 州マディソン所在のPromega社製）で、全体積を２００μｌとして室温で切断し た。０、５、１０および２０ｍｉｎの時点で試料（５０μｌ）を取り出し、５μ ｍｏｌのＥＤＴＡを含むチューブに移した。これらのチューブを、７０℃で１０ ｍｉｎ間インキュベートした。等量の試料（２μｌ）を抜き出して、０.５％ア ガロースゲル電気泳動により分析し、切断の度合いを決定し、残りの試料（４８ μｌ）を−２０℃で保存した。アガロースゲルをエチジウムブロミドで染色し、 紫外線下で可視化して、染色体ＤＮＡの部分切断を決定した。時間の経過と共に 染色体ＤＮＡの長さの減少が観察され、染色体ＤＮＡの長さの減少がSau3Aの作 用によることを示した。残りの試料から、標準的なプロトコール（上記したSamb rookらの文献）によってＤＮＡを抽出した。 Ｋ．ニウモニエまたはＫ．アエロゲネス由来の部分切断ＤＮＡのコスミドライ ブラリーを、SupercosコスミドベクターキットおよびGigapack II（登録商標） パッケージング抽出物、ならびにStratagene社（カリフォルニア州ラホラ所在） より購入した試薬を用いて調製した。製造者の指示に従って実施した。大腸菌XL 1-Blue MRをトランスフェクションして決定した１ｍｌあたりのファージ力価は 、パッケージングされたＫ．ニウモニエが４×１０⁴〜１.０×１０⁵、パッケー ジングされたＫ．アエロゲネスが１.２×１０⁵であった。 コスミドＤＮＡを大腸菌形質転換体６株から単離したところ、長いＤＮＡ（２ ５〜３０ｋｂ）の挿入があることがわかった。実施例１ Ｋ．ニウモニエ由来のコスミドライブラリーＤＮＡで形質転換され、かつ１,３ −プロパンジオールを生成するグリセロールデヒドラターゼ酵素を含有する大腸 菌株のスクリーニング 実施例１は、Ｋ．ニウモニエ由来のコスミドライブラリーＤＮＡで形質転換し た大腸菌細胞で、グリセロールを１,３−プロパンジオールに変換した酵素が存 在するもののスクリーニングを証明した。二つの陽性クローンの配列決定により 、それぞれのクローンが、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子に対 し、高度のホモロジーを有する遺伝子を含むことがわかった。 Ｋ．ニウモニエのＤＮＡを感染させた大腸菌XL1-Blue MRの約１,０００個のコ ロニーを含む６つの形質転換皿を、５ｍｌのＬＢ培地で洗浄し、遠心した。菌を ペレット状にし、５ｍｌのＬＢ培地+グリセロールに再懸濁した。等量(５０μｌ )を、０.２％グリセロール+１ｍｌにつき４００ｎｇのビタミンＢ₁₂+０.００１ ％の酵素エキス+５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（５０ａｍｐ）を加えたＳ１２ 合成培地を入れた１５ｍｌのチューブに接種した。このチューブを上端まで培地 で満たし、パラフィンで包んで３０℃でインキュベートした。４８ｈ後、わずか な濁りが観察された。７８ｈおよび１３２ｈ後に、等量について、上記したよう にして生成物分布を分析したところ、１,３−プロパンジオールに陽性であり、 また後者の時点では、１,３−プロパンジオールの量が増えていた。 １,３−プロパンジオール生産について陽性と判断された菌をＬＢ+５０ａｍｐ に植え付け、個々のコロニーを単離するために段階希釈を実施した。４８個の独 立したコロニーを単離し、１,３−プロパンジオール生産について再度チェック した。コスミドＤＮＡを６個の独立したコロニーから単離し、大腸菌ＤＨ５α株 を形質転換した。形質転換体の１,３−プロパンジオール生産について再度チェ ックした。二つの形質転換体が特性を表し、ＤＨ５α−ｐＫＰ１およびＤＨ５α −ｐＫＰ２と命名した。 ＤＨ５α−ｐＫＰ１およびＤＨ５α−ｐＫＰ２のＤＮＡ配列分析により、グリ セロールデヒドロゲナーゼおよびグリセロールデヒドラターゼ遺伝子の双方の存 在が示された。更に、形質転換したこの大腸菌のグリセロールデヒドラターゼ遺 伝子は、シトロバクター・フリウンジ由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子 に対し、９６％の類似性および９５％の同一性を有していた（図４）。したがっ て、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２が、Ｋ．ニウモニエ由来のｄｈａレギュロン遺伝子 を含むことが明らかとなった。実施例２ Ｋ．ニウモニエ由来のコスミドライブラリーＤＮＡで形質転換され、かつ１,３ −プロパンジオールを生成する１,２−プロパンジオールデヒドラターゼ酵素を 含有する大腸菌株のスクリーニング 実施例２は、Ｋ．ニウモニエ由来のコスミドライブラリーＤＮＡで形質転換し た大腸菌細胞で、グリセロールの１,３−プロパンジオールへの変換を可能とし た活性酵素が存在するもののスクリーニングを証明した。陽性クローンの配列決 定により、それぞれのクローンが、ｐｄｕオペロンにコードされる１,２−プロ パンジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子に対し、高度のホモロジーを有 する遺伝子を含むことがわかった。 パッケージングしたＫ．ニウモニエ由来のコスミドＤＮＡを感染させた大腸菌 XL1-Blue MRの個々のコロニーを、２００μｌのＳ１５培地+０.２％グリセロー ル+４００ｎｇ／ｍｌのビタミンＢ₁₂+０.００１％酵素エキス+５０μｇ／ｍｌの アンピシリン（５０ａｍｐ）を入れたマイクロタイターウェルに接種した。マイ クロタイターウェルのほかに、ＬＢ+５０ａｍｐを入れたマスタープレートにも 接種した。９６ｈの後、１００μｌを取って、０.２ミクロンのナイロン膜フィ ルターを含むRainin社製のマイクロフュージ・チューブ（microfuge tube）で遠 心した。菌体を残して、濾液をＨＰＬＣ分析にかけた。約２４０個のコロニーを スクリーニングした後、１,３−プロパンジオール生産を証明した陽性クローン を同定した。３個の陽性クローンが同定され、そのうち２個はＬＢ+５０ａｍｐ で増殖し、他の１個は増殖しなかった。ＬＢ+５０ａｍｐで増殖した２個の陽性 クローンから個々のコロニーを単離し、１,３−プロパンジオールの生産を証明 し、ｐＫＰ４およびｐＫＰ５と命名した。ｐＫＰ４およびｐＫＰ５を含む大腸菌 株からコスミドＤＮＡを単離し、大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。６個の独立 した形質転換体が、１,３−プロパンジオールの生産を証明した。ｐＫＰ４また はｐＫＰ５を含む大腸 菌株ＤＨ５αは、後述するように、グリセロールを１,３−プロパンジオールに 変換することができた。大腸菌株ＤＨ５α−ｐＫＰ４およびＤＨ５α−ｐＫＰ５による１,３−プロパン ジオールの生産 培地をいっぱいに満たした２ｍｌのスクリューぶたのサイロジェニック・バイ アル(cyrogenic vial)に、ｐＫＰ４またはｐＫＰ５を含む大腸菌株ＤＨ５αを接 種し、かつ、３０℃で培養した。培地は、０.０１％酵素エキス、０.００８％カ ザミノ酸、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１０μｇ／ｍｌのカナマイシン、０ .４μｇ／ｍｌのビタミンＢ₁₂、および０.２％グリセロール、または０.１％グ リセロール+０.１％Ｄ−グルコースを補足したＳ１２培地からなっていた。接種 は、寒天平板培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢ）から直接行っ た。６６ｈ後、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ₆₀₀）により増殖を測定し、反応の すすみ具合と生成物分布をＨＰＬＣで測定した。結果を表１および表２に示す： 試料は、個々の形質転換体を示す接尾表記により示し、Glyはグリセロールであ り、GluはＤ−グルコースであり、Con.は転化率であり、Sel.は選択率であり、Y ldは収率であり、NAは適用不可ということである。転化率、選択率、および収率 は、グリセロールの消費量に基づいた。 ｐＫＰ４およびｐＫＰ５のＤＮＡ配列分析 ｐＫＰ４およびｐＫＰ５の双方の場合における挿入ＤＮＡの長さは、２５〜３ ０ｋｂにわたっていた。双方のクローンとも共通な断片を有していたが、ある断 片は異なっていた。ｐＫＰ４の２２ｋｂのＥｃｏＲ１断片を、GeneCIeanを用い てアガロースゲルから溶出した後、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＶで切断して、得 られる多様な断片を、ＥｃｏＲ１、ＢａｍＨ１またはＨｉｎｃＩＩで切断したプ ラスミドｐＩＢＩ３１にサブクローニングした。挿入断片を含むクローンを同定 し、ＤＮＡ配列を作製した。 作製したＤＮＡ配列は、Ｓ．ティフィムリウムのｃｏｂ、ｐｏｃＲおよびｐｄ ｕ遺伝子にホモロジーを示した。Ｓ．ティフィムリウムのｐｄｕオペロンが、１ ,２−プロパンジオール利用に必要な遺伝子をコードすることは、よく知られて いる[Bobikら、J.Bacteriol,174,2253(1992)]。同様に、ｃｏｂオペロンがビタ ミン Ｂ₁₂合成に必要な遺伝子をコードすることが知られている。ｐｄｕオペロン内に ついては、更に、ｐｄｕＣ遺伝子がジオールデヒドラターゼ生成をコードするこ とが認められている。 Ｋ．ニウモニエの、ｐｄｕオペロン遺伝子をコードする領域を図１に示す。図 １は、Ｋ．ニウモニエのｐｄｕ−ｃｏｂ領域の遺伝子構成の概略図である。この ｐｄｕ−ｃｏｂ領域と、Ｓ．ティフィムリウムに属する遺伝子の同じ領域とを、 ウィスコンシン州立大学のSequence Analysis Software［米国５３７１１ウィス コンシン州、マディソン、サイエンス・ドライブ５７５所在、Genetics Compute r Group(1991)、バージョン７、１９９１年４月］により提供されるアルゴリズ ムを用いて比較した。Genetics Computer GroupのＧＡＰプログラムにより計算 した同一性％および類似性％の表を、以下に示す。 類似性％ 同一性％ ｐｏｃＲ ９０.４８％ ８４.３５％ ｐｄｕＡ １００％ ９４.８５％ ｐｄｕＢ ９９.１６％ ９６.６４％ ｐｄｕＣ ９８.３１％（部分配列） ９４.９２％ ｐｄｕＦ ９２.４２％ ８２.２０％ この比較および図２からわかるように、ｐｄｕＣオープンリーディングフレー ムは、Ｓ．ティフィムリウムのｐｄｕＣ遺伝子に対し広範囲なホモロジー（９８ .３１％）を示した。ｐｄｕＣをｐｄｕＦに連結すると、シトロバクター・フリ ウンジ由来のグリセロール・デヒドラターゼをコードする遺伝子に対しホモロジ ーを示した（図３）。 図３は、Ｋ．ニウモニエ由来のｐｄｕＣ遺伝子にコードされる推定アミノ酸配 列と、Ｃ．フリウンジのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子にコードされるアミ ノ酸配列との比較である。これらの比較により、類似性％が８４％しかなく、ま た同一性％が７０％しかないことがわかった。このように、ジオールデヒドラタ ーゼをコードするｐｄｕＣ遺伝子は、明らかに異なる酵素をコードしており、こ れらの形質転換大腸菌株で、グリセロールを１,３−プロパンジオールへ変換す るのに利用されている。ジオールデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子の配列 を、配列番号１に示す。 また、ｐｄｕ遺伝子上に、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする領域と高 度のホモロジーを示す別のオープンリーディングフレームが同定された。たとえ ば、推定アミノ酸の比較によれば、このオープンリーディングフレームは、大腸 菌のアルコールデヒドロゲナーゼに対し４３％のホモロジーを有し、またＣ．フ リウンジの酸化還元酵素に対し５４％のホモロジーを有していた。このオープン リーディングフレームの配列を決定し、配列番号２とした。実施例３ Ｋ．アエロゲネス由来のコスミドライブラリーＤＮＡで形質転換され、かつ１， ３−プロパンジオールを生成するグリセロールデヒドラターゼ酵素を含有する大 腸菌株のスクリーニング 実施例３は、Ｋ．アエロゲネス由来のコスミドライブラリーＤＮＡで形質転換 した大腸菌細胞で、グリセロールを１,３−プロパンジオールへ変換した活性酵 素が存在するもののスクリーニングを証明した。陽性クローンの配列決定により 、それぞれのクローンが、ｐｄｕオペロンにコードされる１,２−プロパンジオ ールデヒドラターゼをコードする遺伝子に対し、高度のホモロジーを有する遺伝 子を含むことが示された。 Ｋ．アエロゲネス由来のＤＮＡを感染させた大腸菌XL1-Blue MRの個々のコロ ニーを、２００μｌのＳ１５培地+０.２％グリセロール+４００ｎｇ／ｍｌのビ タミンＢ₁₂+０.００１％酵素エキス+５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（５０ａｍ ｐ）を入れたマイクロタイターウェルに接種した。 培養上清について、９６ｈ後の１,３−プロパンジオールが存在するか分析し た。２枚のマイクロタイタープレートで二つのコロニーが陽性だったが、室温で １週間おくと、菌は見えなくなった。３枚目のマイクロタイタープレートに接種 し、ＬＢ+５０ａｍｐを入れたマスタープレートにも接種した。ＫＡＥ３Ｅ１０ と標識した陽性クローンが一つ同定された。ＫＡＥ３Ｅ１０を含むマスタープレ ートを、 陽性クローンを再培養するのに用い、コスミドＤＮＡを単離した。ＤＨ５α細胞 をＫＡＥ３Ｅ１０ＤＮＡで形質転換し、形質転換体のうち、グリセロールを１, ３−プロパンジオールに変換するものをスクリーニングした。ＫＡＥ３Ｅ１０を ｐＫＡ３と命名し直した。ｐＫＡ３は、約４０ｋｂの挿入断片を含んでいた。ｐ ＫＡ３のＤＮＡ配列は、Ｓ．ティフィムリウムのｃｏｂ、ｐｏｃＲおよびｐｄｕ オペロンに対しホモロジーのある領域を示した。 したがって、ｐＫＡ３が１,２−プロパンジオールを利用するオペロンをコー ドすることは明らかである。ジオールデヒドラターゼは、グリセロールの１,３ −プロパンジオールへの変換に寄与していたと考えられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成９年３月２０日（１９９７．３．２０） 【補正内容】 「形質転換」または「トランスフェクション」なる用語は、核酸導入後、細胞 において新たな遺伝子が獲得されることを指す。 「発現」なる用語は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの、その遺伝 子産物への転写および翻訳を指す。発現に際しては、遺伝子産物の配列をコード するＤＮＡ鎖を、たいていはメッセンジャーＲＮＡである相補的ＲＮＡにまず転 写し、ついで転写したメッセンジャーＲＮＡを、上記遺伝子産物がタンパク質で ある場合はその遺伝子産物に翻訳する。 ここで用いる「プラスミド」または「ベクター」または「コスミド」なる用語 は、細胞の主要な代謝に関与しない遺伝子をたいてい担持する、染色体外の要素 を指し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形である。 「炭素基質」なる用語は、微生物によって代謝されうるあらゆる炭素源を意味 し、少なくとも一つの炭素原子を含むものである。 「デヒドラターゼ酵素」なる用語は、グリセロール分子を生成物の３−ヒドロ キシプロピオンアルデヒドに変換可能なあらゆる酵素を指すものとする。本発明 の目的においては、デヒドラターゼ酵素は、好ましい基質がそれぞれグリセロー ルおよび１,２−プロパンジオールである、グリセロールデヒドラターゼまたは ジオールデヒドラターゼのいずれかである。 「１,３−プロパンジオール」なる用語は、式ＨＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨの化合 物を指し、繊維製造用のポリマーの生産において、モノマーとして有用である。 以下の菌株は、１９９５年４月１８日、ブダペスト条約の規定のもとにアメリ カ基準菌株保存機構[American Type Culture Collection(ATCC)、米国20852メリ ーランド州、ロックビル、パックローンドライブ12301所在]に寄託された：コス ミドｐＫＰ１を含む大腸菌ＤＨ５αに対応するＡＴＣＣ受託番号第６９７８９番 。ＡＴＣＣ受託番号第６９７９０番は、コスミドｐＫＰ４を含む大腸菌ＤＨ５α を指す。 本発明は、組換え生物を用いた、グリセロールからの１,３−プロパンジオー ルの生物学的製造法を含む。この方法は、１,２−プロパンジオールに特異性を 有す る異種のｐｄｕジオールデヒドラターゼ遺伝子で形質転換した形質転換大腸菌を 組み込んでいる。この形質転換大腸菌は、炭素源としてのグリセロールの存在下 で増殖し、その増殖培地から１,３−プロパンジオールが単離される。 請求の範囲 １．クレブシエラ・ニウモニエから単離した約３５kbのＤＮＡ断片を含有するコ スミドであって、前記断片が、ＡＴＣＣ受託番号第６９７９０番としてアメリカ 菌株保存機構に寄託されている組換え大腸菌内に含まれるような、活性ジオール デヒドラターゼ酵素をコードすることを特徴とするコスミド。 ２．宿主微生物と、請求項１のコスミドとを含有することを特徴とする形質転換 微生物。 ３．前記宿主微生物が大腸菌であり、かつアメリカ基準菌株保存機構にＡＴＣＣ 受託番号第６９７９０番として寄託されていることを特徴とする請求項２に記載 の形質転換微生物。 ４．細菌を形質転換させた場合に、グリセロールから１,３−プロパンジオール への代謝を生じせしめることを特徴とする請求項１に記載のコスミド。 ５．宿主微生物と、活性機能タンパク質をコードする、請求項１のコスミドのＤ ＮＡ断片とを含有することを特徴とする形質転換微生物。 ６．請求項１のコスミドに包含される、ジオールデヒドラターゼ酵素をコードす る遺伝子を含有することを特徴とするＤＮＡ断片。 ７．グリセロールの１,３−プロパンジオールへの生物変換を具える方法であっ て、ジオールデヒドラターゼを発現可能な遺伝子で微生物宿主を形質転換し、そ して形質転換微生物宿主をグリセロールに接触させることを特徴とする方法。 ８．グリセロールの１,３−プロパンジオールへの生物変換を具える方法であっ て、クレブシエラ・ニウモニエから単離した約３５kbの断片を含有するコスミド に由来し、かつ活性ジオールデヒドラターゼ酵素、および前記コスミドによりコ ードされる他のあらゆる機能細菌タンパク質をコードする遺伝子で微生物宿主を 形質転換し、そして形質転換微生物宿主をグリセロールに接触させることを特徴 とする方法。 ９．前記の他の機能細菌タンパク質がアルコールデヒドロゲナーゼであることを 特徴とする請求項８に記載の方法。 １０．前記微生物宿主が、エシェリヒア、バシラス、クレブシエラ、シトロバク ター、サッカロミセス、クロストリジウム、およびピヒア属からなる群より選ば れることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。 １１．前記微生物宿主が、大腸菌、枯草菌、バシラス・リヒェニフォルミス、お よびピヒア・パストリス種からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１ ０に記載の方法。 １２．前記微生物宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項１１に記載の方法 。 １３．前記遺伝子が、クレブシエラ、クロストリジウム、サルモネラ、およびシ トロバクター属からなる群より単離されたジオールデヒドラターゼ遺伝子である ことを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。 １４．前記形質転換微生物宿主が、ジオールデヒドラターゼ酵素をコ ードし、かつ配列番号１のＤＮＡ配列を含有する遺伝子を含む組換え大腸菌ＤＨ ５αであることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。 １５．前記形質転換微生物宿主が、ジオールデヒドラターゼ酵素をコードし、か つ配列番号２のＤＮＡ配列を含有する遺伝子を含む組換え大腸菌ＤＨ５αである ことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。 【手続補正書】 【提出日】平成１１年７月６日（１９９９．７．６） 【補正内容】 【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:145） (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ナカムラ，チャールズ，エドウィン アメリカ合衆国 19703−2422 デラウェ ア州 クレイモント マウント ヴァーノ ン ドライブ ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．クレブシエラ・ニウモニエから単離した約３５kbのＤＮＡ断片を含有するコ スミドであって、前記断片が、図５、第４列の制限部位を有する活性ジオールデ ヒドラターゼ酵素をコードすることを特徴とするコスミド。 ２．宿主微生物と、請求項１のコスミドとを含有することを特徴とする形質転換 微生物。 ３．前記宿主微生物が大腸菌であり、かつアメリカ基準菌株保存機構にＡＴＣＣ 受託番号第６９７９０番として寄託されていることを特徴とする請求項２に記載 の形質転換微生物。 ４．細菌を形質転換させた場合に、グリセロールから１,３−プロパンジオール への代謝を生じせしめることを特徴とする請求項１に記載のコスミド。 ５．宿主微生物と、活性機能タンパク質をコードする、請求項１のコスミドのＤ ＮＡ断片とを含有することを特徴とする形質転換微生物。 ６．請求項１のコスミドに包含される、ジオールデヒドラターゼ酵素をコードす る遺伝子を含有することを特徴とするＤＮＡ断片。 ７．活性ジオールデヒドラターゼ酵素をコードし、配列番号１に記載するような ＤＮＡ配列を有することを特徴とする遺伝子。 ８．活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードし、配列番号２に記載するような ＤＮＡ配列を有することを特徴とする遺伝子。 ９．宿主微生物と、請求項７または請求項８のＤＮＡ配列とを含有することを特 徴とする形質転換微生物。 １０．大腸菌ＤＨ５αと、請求項７または請求項８のＤＮＡ配列とを含有するこ とを特徴とする形質転換微生物。 １１．炭素基質の生物変換を具える方法であって、ジオールデヒドラターゼを発 現可能な遺伝子で微生物宿主を形質転換し、そして前記形質転換宿主を前記基質 に接触させることを特徴とする方法。 １２．炭素基質の生物変換を具える方法であって、クレブシエラ・ニウモニエか ら単離した約３5kbの断片を含有するコスミドに由来し、かつ活性ジオールデヒ ドラターゼ酵素、および前記コスミドによりコードされる他のあらゆる機能細菌 タンパク質をコードする遺伝子で微生物宿主を形質転換し、そして前記形質転換 宿主を前記基質に接触させることを特徴とする方法。 １３．前記の他の機能細菌タンパク質がアルコールデヒドロゲナーゼであること を特徴とする請求項１２に記載の方法。 １４．前記炭素基質が、エチレングリコール、１,２−プロパンジオール、グリ セロール、および２,３−ブタンジオールからなる群より選ばれることを特徴と する、請求項１１または１２に記載の方法。 １５．前記炭素基質がグリセロールであることを特徴とする請求項１４に記載の 方法。 １６．グリセロールを１,３−プロパンジオールに変換することを特徴とする請 求項１５に記載の方法。 １７．前記微生物宿主が、エシェリヒア、バシラス、クレブシエラ、シトロバク ター、サッカロミセス、クロストリジウム、およびピヒア属からなる群より選ば れることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。 １８．前記微生物宿主が、大腸菌、枯草菌、バシラス・リヒェニフォルミス、お よびピヒア・パストリス種からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１ ７に記載の方法。 １９．前記微生物宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項１８に記載の方法 。 ２０．前記遺伝子が、クレブシエラ、クロストリジウム、サルモネラ、およびシ トロバクター属からなる群より単離されたジオールデヒドラターゼ遺伝子である ことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。 ２１．前記形質転換宿主が、ジオールデヒドラターゼ酵素をコードし、かつ配列 番号１のＤＮＡ配列を含有する遺伝子を含む組換え大腸菌ＤＨ５αであることを 特徴とする、請求項１６に記載の方法。 ２２．前記形質転換宿主が、ジオールデヒドラターゼ酵素をコードし、かつ配列 番号１のＤＮＡ配列を含有する遺伝子を含む組換え大腸菌ＤＨ５αであることを 特徴とする、請求項２０に記載の方法。 ２３．請求項１１または１２の方法の生成物。