JP4485081B2 - プラバスタチンの生産に関与するdnaおよびその使用 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子操作に関し、より具体的には、メバスタチン、そのラクトン開環体またはその塩(以下、総称してメバスタチン類という)からプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体(以下、総称してプラバスタチン類という)の変換に関与する遺伝子を含むDNA、ならびにそれらを使用するプラバスタチン類の生産系に関する。
【0002】
【従来の技術】
プラバスタチンの製造方法、特に生物学的変換方法によるものとしては、イヌおよびウサギ肝臓ホモジネートを用いてメバスタチンから変換する方法が、特開昭57-2240号に開示されている。微生物を用いてメバスタチンから変換する方法として、アブシディア(Absidia)属、カニンガメラ(Cunninghamella)属、シンセファロスポラム(Syncephalosporum)属およびストレプトマイセス(Streptomyces)属を用いる製法が、特開昭57-50894号および特開昭57-67575号に開示されている。また、特開昭57-155995号および特開昭58-10572号には、ムコール(Mucor)、リゾープス(Rhisopus)、チゴリンクス(Zygorynchus)、シルシネラ(Cireinella)、アクチノムコール(Actinomucor)、ゴングロネラ(Gongronella)、フィコマイセス(Phycomyces)、モルチエレラ(Mortierella)、ピタノポラス(Pythanoporus)およびリゾクトニア(Rhizoctonia)の各属に属する微生物を用いる方法が開示されている。
【0003】
また、特許第2672551号にはストレプトマイセス・カルボフィラス(Streptomyces carbophillus)由来のメバスタチンからプラバスタチンへの変換遺伝子をストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)に組み込むことでその活性を発現させることができること、特開平11-235174号には、高等生物の細胞系において該変換遺伝子の活性を発現させることができることがそれぞれ開示されている。しかし、工業化につながるほどの効果を示しているとは言い難く、より工業化につながる遺伝子源、発現システムなどが切望されている。
【0004】
【発明の構成】
本発明者らは、希少放線菌に分類されるミクロテトラスポーラ属に属するミクロテトラスポーラ・レクチカテナ(Microtetraspora recticatena)IFO14525株から、メバスタチン類からプラバスタチン類への変換に関与する遺伝子のクローニングを試み、多くの水酸化酵素(P450ファミリー)において、アミノ酸配列が高い確率で保存されている酸素結合領域とヘム結合領域の配列を基にプライマーをデザインし、これを用いて、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)法により増幅したDNA断片から目的の遺伝子が得られることを見出した。
【0005】
したがって、本発明によれば、ミクロテトラスポーラ属に属する放線菌から得ることのできるメバスタチン類からプラバスタチン類への変換に関与する遺伝子、あるいは該遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプラバスタチン類への変換能を有する改変体を含んでなる単離された純粋なDNAが提供される。
【0006】
より具体的には、メバスタチン類からプラバスタチン類への変換に関与する遺伝子は、
式(I)
【化5】
で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体またはその塩を、
式(II)、
【化6】
で示されるプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体へ水酸化する活性(以下、メバスタチン類の水酸化活性ということがある)を有するタンパク質またはフェレドキシンを一部にまたは全体としてコードするDNAあるいは、それらの改変体である。
【0007】
また、本発明によれば、上記DNAを担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミド、該組換えプラスミドで形質転換した形質転換体、さらには該形質転換体を使用するプラバスタチン類の生産方法も提供される。
【0008】
【発明の具体的な態様】
本発明のDNAの起源として用いることのできる微生物は、例えば、ミクロテトラスポーラ・レクチカテナ(Microtetraspora recticatena)に属し、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)を宿主として発現しうるメバスタチン類のプラバスタチン類への変換に関与するDNAを提供するものであれば、自然突然変異株を包含するミクロテトラスポーラ・レクチカテナのいかなる菌株であってもよい。しかし、入手容易であり、培養等の好適な取り扱い条件が確立されている、上記IFO 14525株を好ましいものとして挙げることができる。
【0009】
本発明のDNA、すなわちメバスタチン類からプラバスタチン類への変換に関与するDNAとは、メバスタチン類の水酸化活性を有するタンパク質、フェレドキシンおよびそれらの転写制御因子より選ばれる少なくとも一種のタンパク質をコードする遺伝子を含むDNAを意味する。具体的にはメバスタチン類の水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAとは、配列番号1における塩基313〜塩基1533までの連続する塩基配列を、フェレドキシンをコードするDNAとは、配列番号1における塩基1547〜塩基1741までの連続する塩基配列をそれぞれ含むDNAである。また、転写制御因子をコードするDNAとは、配列番号2における塩基1〜塩基549までの連続する塩基配列を含むDNAである。
【0010】
本発明のDNAを取得する方法はいかなる方法であってもよいが、好ましくは、多くのP450水酸化酵素ファミリーにおいて高い確率でアミノ酸配列が保存されていることが知られている(J.Bacteriol.172,3335-3345(1990),J.Biol.Chem.260,16122-16130(1985)等)領域のアミノ酸配列を参考にデザインしたプライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)法により得ることができる。例えば、本発明のメバスタチン類のプラバスタチン類への変換に関与するDNAは、次のようにして取得できる。
【0011】
一定の培養条件下で、ミクロテトラスポーラ・レクチカテナ(Microtetraspora recticatena)を培養し、得られた菌株を破砕して染色体DNAを得る。得られた染色体DNAに対して、P450水酸化酵素ファミリーに共通して存在する酸素結合領域とヘム結合領域のアミノ酸配列から設計したプライマーを用いてPCR反応を行う。PCR反応で増幅されたDNA断片を取得し、これを基にさらにPCR反応を行い、最初のPCR反応で増幅されたDNA断片の両外側の周辺領域を取得する。こうして本発明の目的とするメバスタチン類のプラバスタチン類への変換に関与するDNAを得ることができる。
【0012】
さらに本発明のDNAには、上記各DNAだけでなく、それらの改変体であって、それぞれ各DNAに対して、一定のハイブリダイゼーション条件下、例えば、60℃で2×SSC(標準クエン酸食塩水)中、好ましくは60℃で0.5×SSC中、特に好ましくは60℃で0.2×SSC中のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつメバスタチン類の水酸化活性を欠損した突然異変体あるいは元来その水酸化活性を有していない微生物にメバスタチン類の水酸化活性を付与しうる機能を有する改変体も包含される。このような改変体のより具体的として、以下のようなものが挙げられる。
【0013】
メバスタチン類の水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAの改変体は、配列番号1における塩基313〜塩基1533の塩基配列と少なくとも55%、好ましくは70%、さらに好ましくは95%の同一性を示すものであり、フェレドキシンをコードするDNAの改変体は、配列番号1における塩基1547〜塩基1741の塩基配列と少なくとも55%、好ましくは70%、さらに好ましくは95%の同一性を示すものである。また転写制御因子をコードするDNAの改変体は、配列番号2における塩基1〜塩基549の塩基配列と少なくとも55%、好ましくは70%、さらに好ましくは95%の同一性を示すものである。
【0014】
このような改変体は、上記各塩基配列の、それぞれ、5′末端もしくは3′末端または途中において塩基が除去または付加されたもの、あるいは塩基の一部が他の塩基により置換されているものを含む。この塩基の一部が他の塩基により置換されている改変体には、同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重に伴い、上記各DNAと異なる塩基配列を有するものも含まれる。
【0015】
遺伝暗号の縮重に伴うもの以外の塩基の置換は、それぞれ、上記各DNAがコードする推定アミノ酸配列を参照し、各アミノ酸に由来する側鎖の類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどを基準に、タンパク質全体として類似の形状を有するように行うのがよい。上記の改変体は、上記各DNAと同等の機能、すなわち、メバスタチン類の水酸化活性を欠損した突然変異体あるいは元来その水酸化活性を有していない微生物にメバスタチン類の水酸化活性を付与しうる機能を有するものが、相当高い確率で得られると推定される。
【0016】
このような本発明の改変体は、上記各DNAの塩基配列またはそれらによりコードされる推定アミノ酸配列を参考に、核酸合成機を用いて合成するか、あるいは、自体既知の点突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により作成することができる。
【0017】
本発明のDNAの使用形態は、これらのDNAを組み込んだ微生物を構築し、それらのDNAを発現させて、そのコードするメバスタチン類の水酸化活性を有するタンパク質、フェレドキシンまたはそれらの転写制御因子を生成、機能させることである。本発明のDNAまたはそれらの改変体を組み込む部位は、宿主微生物のプラスミド上または染色体上のいずれでもよい。このようなプラスミドは、上記DNAまたはそれらの改変体以外に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子等を含む自律複製性であることができる。さらに、プラスミドは、使用が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列をもつ組込み型プラスミドであることもできる。
【0018】
このように本発明のDNAでコードされるタンパク質を発現させるための宿主、プラスミドベクター系は、これらのDNAが安定に保持され発現される系であればいずれの系でもよいが、放線菌のホスト・ベクター系として確立されている点で、宿主としてストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)TK21株、プラスミドベクターとしてpIJ702等が好適である。
【0019】
本発明によれば、宿主としてストレプトマイセス属またはミクロテトラスポーラ属に属する放線菌を、上記プラスミドベクターから作成された組換えプラスミドで形質転換して得られる形質転換体も提供される。上記形質転換体の具体的な一例としては、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)TK21株を、pIJ702から作成したプラスミドpEMmoxABで形質転換したものを挙げることができる。
【0020】
さらに本発明によれば、上記形質転換体を用いるプラバスタチン類の生産方法が提供される。この方法では、培地中で増殖した形質転換体を、出発原料であるメバスタチン類と接触させるか、あるいは増殖した形質転換体またはその処理菌体(例えば、有機溶媒処理物、菌体抽出物、固定化処理物)と接触させ、出発原料をプラバスタチン類に変換する。
【0021】
培地の炭素源としては、形質転換体の利用可能なものであればいかなるものも使用でき、宿主として、ストレプトマイセス・リビダンスを用いた場合には、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、グリセロール、ソルビトールなどの糖アルコール、フマル酸、クエン酸等の有機酸や菜種油等の油脂類を使用でき、これらの炭素源の培地への添加量は、通常、0.1〜10重量%(以下、%と略称する)程度とすることが望ましい。
【0022】
培地の窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸アンモニウム塩やフマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸アンモニウム塩ないし、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物等の天然窒素源を使用でき、これらの窒素源の培地への添加量は、通常、0.1〜10%程度とすることが望ましい。
【0023】
また、無機塩類としては、例えば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のリン酸アルカリ金属塩や塩化カリウム、塩化ナトリウム、等の塩化アルカリ金属塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸金属塩を使用でき、これらの無機塩類の培地への添加量は、通常、0.001〜1%程度とすることが望ましい。
【0024】
これらのうち、通常の放線菌用の増殖培地を用いた液体培養が好ましく、炭素源としてはグルコース、マルトース、澱粉などが、窒素源としては硫酸アンモニウム、ペプトン、酵母エキス、大豆粉などが特に有効である。その他に、無機塩としてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、食塩などが通常用いられる。
【0025】
微生物の培養は、上記の培地で20〜40℃、好ましくは28〜37℃でpHは5〜9、好ましくは6〜8で好気的条件下に実施すればよい。
【0026】
培養中に、上記により増殖した形質転換体と出発原料の接触は、あらかじめ培地に出発原料を加えておくか、または培養中に出発原料を適宜加えることにより行う。また、培養終了後に、集菌した菌体または処理菌体と出発原料を培地または適当な緩衝液中で、必要により適当な補助因子等を加え、反応器中で撹拌または振盪するか、固定された菌体上に出発原料含有物を流動させることにより、上記接触を行うことができる。
【0027】
培養中に形質転換体とメバスタチン類を接触させる場合を例に、さらに具体的に説明すると次のとおりである。培地に形質転換体を接種した後、例えば、20〜35℃で12〜120時間培養することにより、形質転換体である微生物を1ml中に106〜1010個含む菌株培養液を得、その培養液に原料化合物であるメバスタチン類を通常、単回の添加濃度としては0.05〜0.2mg/ml、バッチフィードまたは連続フィードする場合は最終濃度が0.05〜20mg/mlになるように、水または補助溶剤に溶解して加えるか、あるいは溶解せずにそのまま添加し、通常、20〜35℃で18時間〜7日、好ましくは18時間〜5日反応させる。得られた反応液から、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等を用いた各種イオン交換クロマトグラフィー、HP20などの吸着クロマトグラフィー、溶媒や温度を利用しての沈殿化や結晶化等の通常の精製手段またはラクトン化やエステル化してからの精製工程を経る手段によりプラバスタチン類を得ることができる。
【0028】
添加するメバスタチン類の形状および添加時期については特に制限されるものではないが、溶解性などの点からナトリウム塩として用いるのが好ましく、培養開始時の添加でもよく培養途中1〜5日目にも添加してもよい。
【0029】
【実施例】
以下、具体例により本発明をさらに詳細に説明する。
【0030】
実施例1
(1)ミクロテトラスポーラ・レクチカテナ(Microtetraspora recticatena) IFO14525株染色体のDNAの調製
グルコース1%、麦芽エキス0.4%、酵母エキス1%からなる培地にIFO14525株を接種し、28℃、3日間培養した。得られた培養液を3000rpm、10分間遠心して菌体を集めた。その菌体からBlood & Cell Culture kit(QIAGEN社)を用いて染色体DNAを調製した。
【0031】
(2)メバスタチン類の水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAの部分的配列のクローニング
Gene 164,81-85(1995)の記載に基づき、P450sca-2の酸素結合領域のアミノ酸配列(Ala Gly His Glu Thr)とヘム結合領域のアミノ酸配列(Cys Leu Gly Gln Asn)から以下のようなミックス・プライマー(P450F2およびP450R2)を設計し作成した(配列表の配列番号3および4参照)。
P450F2: 5'-GGIGGICAYGARAC-3'
P450R2: 5'-TTYTGICCIARRCA-3'
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、以下に示した混合塩基あるいはイノシンを使用した。 R: A+G, Y: C+T, I: イノシン
【0032】
次に、この2種のプライマー(P450F2およびP450R2)と前項(1)で得たミクロテトラスポーラ・レクチカテナ IFO14525株染色体DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。PCR反応は、Takara LA Taq(宝酒造社)とPCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを40℃、2分間、伸長を68℃、30秒間行う3段階の反応を30回繰り返した。その結果、約350bpの大きさのDNA断片(以下、DNA断片-Aという)が増幅された。このDNA断片-Aは水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAの一部分である可能性が高い。PCR反応にて増幅したDNA断片-Aを含む反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した。この約350bpの大きさのDNA断片-Aをアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造社)によって回収した。
【0033】
次に得られたDNA断片-Aの塩基配列を解析するに足る量のDNA断片-Aを得るために、プラスミドベクターpT7Blue T(Novagen社)にDNA Ligation kit ver.2(宝酒造社)を用いてDNA断片-Aを連結し、大腸菌JM109株を形質転換した。その後、アンピシリン(50μg/ml)、X-gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside;40μg/ml)、IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside;100μM)を含むLB寒天培地(1.0%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン(50μg/ml)を含むLB液体培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0)で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット(QIAfilter Plasmid Midi Kit,QIAGEN社)を用いてプラスミドDNAの分離精製を行い、一定量のDNA断片-Aを得た。
【0034】
(3)クローニングされたDNA断片-Aの塩基配列の解析
前項(2)で得られたDNA断片-Aの塩基配列をDNA塩基配列解析装置(PE Biosystems 377XL)を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。塩基配列解析の結果、PCR反応で増幅されたDNA断片-Aは電気泳動で約350 bpと測定されたが、塩基配列分析の結果、正確には347bpであることが明らかとなった(配列番号1の塩基1045〜塩基1391参照)。クローニングされた前記の347bpのDNA配列の両端には前記のPCR反応の時に使用した2種類のプライマーに対応するDNA配列が見出されたので、前記のPCR反応ではDNA断片-Aがこの2種類のプライマー(P450F2およびP450R2)により特異的に増幅されたことが明らかとなった。
【0035】
(4)DNA断片-Aの周辺領域の解析
前記のとおり、ミクロテトラスポーラ・レクチカテナ IFO14525株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAの部分的配列が決定されたのでインバースPCR法(細胞工学14巻、p.591-593,1995年)によって、クローニング断片の上流、下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、クローニング、配列解析した。すなわち、ミクロテトラスポーラ・レクチカテナ IFO14525株染色体DNA((1)参照)をH緩衝液(50mM Tris-HCl,pH7.5,10mM MgCl2,10mMジチオスレイトール,100mM NaCl)中で制限酵素BamHIとXhoIでそれぞれ消化した。得られた各制限酵素切断DNA断片をDNA Ligation Kit ver.2(宝酒造社)を用いて自己環状化させた。
【0036】
他方、DNA断片-Aの塩基配列から、以下のようなプライマー(InvF1およびInvR1)を設計し作成した(配列表の配列番号5および6参照)。
InvF1: 5'-TGTTCAAGGACCCGGCCGTGCTGGATGT-3'
InvR1: 5'-CGGTCAGTTGCTCCGGGTGAGAGAGCA-3'
次にこの2種のプライマー(InvF1およびInvR1)と前記の自己環状化させたミクロテトラスポーラ・レクチカテナ IFO14525株染色体DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。PCR反応は、Takara LA Taq(宝酒造社)とPCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングと伸長を68℃、6分間行う2段階の反応を25回繰り返した。
【0037】
この結果、約8kbpの大きさのDNA断片(DNA断片-B)と約4kbpの大きさのDNA断片(DNA断片-C)が増幅したが、これらは、水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAおよびその上流と下流領域を含むDNA配列を有するDNAである可能性が高い。
【0038】
このPCR増幅反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて分画した。約8kbpおよび約4kbpの大きさのDNA断片をそれぞれアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造社)によって回収した。次に得られたDNA断片-BおよびDNA断片-Cについて、塩基配列を解析するに足る量の各DNA断片を得るために、前記(2)と同様にプラスミドベクターpT7Blue T(Novagen社)、DNA Ligation kit ver.2(宝酒造社)、大腸菌JM109株およびプラスミド精製キット(QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社)を用いて、一定量の各DNA断片を得た。
【0039】
(5)DNA断片-B(約8kbpのサイズ)およびDNA断片-C(約4kbpのサイズ)の塩基配列の解析
前項(4)で得られたDNA断片-BおよびDNA断片-Cの塩基配列をDNA塩基配列解析装置(PE Biosystems 377XL)を用い、ダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。このように塩基配列の解析を行い、DNA断片-BおよびDNA断片-C配列から、後記の配列表の配列番号1に示された2696bpの塩基配列の情報を得た。
【0040】
この2696bp中のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を検索したところ、三種類のタンパク質がコードされていることが判明した(図1参照)。これらのタンパク質のアミノ酸配列をBLAST searchにて検索した結果、配列番号1の塩基313〜塩基1533にモノオキシゲナーゼと比較的高い相同性を有する407個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするORF(以下、moxAという)が存在した。そして、MoxAは、図2に示すように、ストレプトマイセス・テンダエ(Streptomyces tendae) Tji901株の有するニッコーマイシン(nikkomycin)生合成経路にあるピリジルホモスレオニン・モノオキシゲナーゼ(pyridylhomothreonine monooxygenase)をコードする遺伝子であるNikFに最も高い相同性を有し(相同性50%)、さらにP450sca-2(Gene 164,81-85(1995))にも比較的高い相同性を有した(相同性49%)。このことからmoxAが、メバスタチン類を水酸化して、プラバスタチン類へ変換する酵素をコードする可能性が高いと考えられた。
【0041】
またmoxAのすぐ下流(配列番号1の塩基1547〜塩基1741)には、3F−4S−タイプのフェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードするORF(以下、moxBという)が存在した。MoxBがコードするタンパク質は65個のアミノ酸からなり、ストレプトマイセス・テンダエ(Streptomyces tendae) Tji901の有する遺伝子NikGがコードするタンパク質(フェレドキシン)のアミノ酸配列と52%の相同性を示した。そのため、MoxBは電子伝達を担い、MoxAと共にメバスタチン類の水酸化を行うものと考えられた。
【0042】
さらにmoxBの下流(配列番号1の塩基1822〜塩基2370)には、MarR familyに属する転写制御因子に高い相同性を有するタンパク質をコードする逆向きのORF (以下、mdmRという)が存在した。mdmRの相補鎖の塩基配列と対応するアミノ酸配列を配列番号2に示す。mdmRがコードするタンパク質は、MarR familyに属するエルウィニア・クリサンテミ(Erwinia chrysanthemi)のPecSタンパク質のアミノ酸配列と43%の相同性を示した。mdmRがmoxAおよびmoxBの転写に関与する可能性が考えられた。
【0043】
実施例2
(1)ミクロテトラスポーラ・レクチカテナ IFO14525株由来のmoxAおよびmoxBの両方を含有するDNA断片の調製
実施例1において解析した配列番号1の塩基配列を参考にして、5’末端にBglII siteを付加したプライマー(PSKFおよびPSKR)を設計し作製した(配列表の配列番号7および8参照)。
PSKF: 5'-ATAGATCTATCTCTCACCAGGAGGTTATTC-3'
PSKR: 5'-TGAGATCTAGCTGGGTACGGCCGAGTCGA-3'
次に、この2種のプライマー(PSKFおよびPSKR)と実施例1の(1)項で得たミクロテトラスポーラ・レクチカテナ IFO14525株染色体DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。PCR反応は、Takara LA Taq(宝酒造社)とPCR増幅装置(Biometra社 T Gradient)を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングと伸長を68℃、2分間行う2段階の反応を25回繰り返した。
【0044】
この結果、moxAおよびmoxBを含む約1.5kbpの大きさのDNA断片(以下、DNA断片-Dという)が増幅された。このPCR増幅反応液を、アガロースゲル電気泳動にかけて分画した。上記の約1.5kbpの大きさのDNA断片-Dをアガロースゲルから切り出して、SUPREC 01(宝酒造)によって回収した。
【0045】
(2)プラスミドpEMmoxABの構築
pIJ702のKpnI、BamHI siteに、Streptomyces erythraeus由来のermEプロモーター領域を含むKpnI、BamHI断片を導入し、プラスミドpEM703を作成した。プラスミドpEM703をH緩衝液(50mM Tris-HCl,pH8.5,10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール,100mM NaCl)中で制限酵素BglIIにより消化してプラスミド消化物を得た。同様に前項(1)で得たDNA断片-Dを制限酵素BglIIで消化し、得られたDNA断片-Dの消化物とプラスミド消化物とを、DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)を用いて連結した。これによって、メバスタチン類のプラバスタチン類への生物学的変換に関与するDNAであるmoxAおよびmoxBの両方を内部に含有するDNA断片-Dと、プラスミドpEM703とが連結された約9.5Kbpのサイズのプラスミド(プラスミドpEMmoxABと称する)が構築された。
【0046】
(3)形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)pEMmoxAB株の調製
前項(2)で調製したプラスミドpEMmoxABを用い、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)TK21株を、Genetic Manipulation of Streptomyces:A Laboratory Manual. John Innes Foundation,Norwich,1985に記載された方法に従い形質転換した。こうして、プラスミドpEMmoxABで形質転換されたストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)pEMmoxAB株が得られた。
【0047】
(4)形質転換体によるメバスタチンのプラバスタチンへの変換
前項(3)で得た形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)pEMmoxAB株の凍結種母をチオペプチン 25μg/mlを含むトリプティック・ソイ・ブロス(Difco社) 25mlに植菌し28℃で48時間振とう培養した。得られた培養液の10mlを遠心分離(6000rpm、10分間)し、菌体を集め、25mMリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄して、洗浄菌体を得た。こうして得られたpEMmoxAB株の洗浄菌体を、変換反応用の緩衝液(25mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.2%グルコース、100μg/ml硫酸第一鉄、250μg/mlメバスタチンを含有)1mlに懸濁した。これを28℃、17時間反応させた。反応液をメタノールで抽出し、HPLCでプラバスタチン量を測定した。
【0048】
HPLC条件
カラム:YMC A−307(4.6mm I.D.×75mm)
移動相:(A)水/トリエチルアミン/酢酸(100:0.1:0.1)
(B)メタノール/トリエチルアミン/酢酸(100:0.1:0.1)
(A)と(B)のグラジエントで、タイムプログラムは以下のとおり。
開始時間 移動相(B)
0.01分 40%
5.0分 90%
6.0分 90%
6.1分 40%
10.0分 40%
流速:1.5ml/分
波長:237nm
カラム温度:40℃
【0049】
この結果、moxAおよびmoxBを持たないストレプトマイセス・リビダンスpEM703株では確認されない保持時間4.8分のプラバスタチンのピークが形質転換体ストレプトマイセス・リビダンスpEMmoxAB株では確認され、基質であるメバスタチン(保持時間7.2分)が減少していた(図3参照)。このことからmoxAおよびmoxBがメバスタチンからプラバスタチンへの変換に関与していることを示唆している。なお、図3中、pEMmoxABはmoxAおよびmoxBを組み込んだプラスミドpEMmoxABを導入した形質転換体を用いて変換したもの、pEM703はプラスミドpEM703のみ導入して変換を試みたものである。またPr.はプラバスタチンの、Me.はメバスタチンのピークをそれぞれ示している。
【0050】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】moxA、moxBおよびmdmRのORFの存在位置を示す図である。
【図2】moxAと他のモノオキシゲナーゼ遺伝子であるnikkomycin生合成経路のピリジルホモスレオニン・モノオキシゲナーゼおよびP450sca-2のアミノ酸配列を比較した図である。
【図3】moxAおよびmoxBを組み込んだプラスミドpEMmoxABにより形質転換されたストレプトマイセス・リビダンスpEMmoxABを用いて、メバスタチンを変換した変換液のHPLC分析の結果を示した図である。
Claims (5)
- 下記のいずれかの塩基配列を有するDNA。
(1)配列番号1の塩基313〜塩基1533までの連続する塩基配列を有し、メバスタチン類の水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(2)配列番号1の塩基313〜塩基1533までの連続する塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、メバスタチン類の水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 下記のいずれかの塩基配列を有するDNA。
(1)配列番号1の塩基1547〜塩基1741までの連続する塩基配列を有し、フェレドキシンをコードするDNA。
(2)配列番号1の塩基1547〜塩基1741までの連続する塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、フェレドキシンをコードするDNA。 - 請求項1記載のDNAおよび請求項2記載のDNAを担持する自律複製性または組込み複製性の組換えプラスミド。
- 宿主であるストレプトマイセス属に属する放線菌またはミクロテトラスポーラ属に属する放線菌を請求項3記載の組換えプラスミドで形質転換した形質転換体。
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