KR100332359B1 - 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 발현용 재조합효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 항균성 폴리펩타이드 - Google Patents

한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 발현용 재조합효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 항균성 폴리펩타이드 Download PDF

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Abstract

한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 발현용 재조합 효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 항균성 폴리펩타이드에 관한 것으로 한우로부터 분리한 항균성 폴리펩타이드 또는 변형된 한우유래 항균성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현벡터 pPML-E2에 삽입하여 얻은 재조합 벡터 pPML-SM2로 형질전환된 본 발명 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2(기탁번호 KCTC 0681BP)를 배양발효하여 항균성 폴리펩타이드를 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 발현용 재조합 효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 항균성 폴리펩타이드{Recombinant yeast strain for expressing antibacterial polypeptide gene derived from Bos taurus Coreanae and the recombinant antibacterial polypeptide obtained therefrom}
본 발명은 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 발현용 재조합 효모균주및 이로부터 얻은 재조합 항균성 폴리펩타이드에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 대한민국 전통 한우(Bos taurus Coreanae)로부터 유래한 항균성 폴리펩타이드 유전자로 재조합된 벡터를Phichia methanolica효모균주에 도입하여 얻은 재조합 효모균주Phichia methanolicaSM2를 배양발효시키는 재조합 항균성 폴리펩타이드의 대량생산방법에 관한 것이다.
최근 축산 및 식품분야에서 많은 문제가 되고 있는 항생제의 오용 및 잔류성 문제, 즉 축산식품의 항생물질 잔류 및 이로 인한 내성문제 등이 매우 심각하게 대두되고 있는 실정이다. 따라서 축산물의 안정성을 보호하고, 축산물의 생산성을 동시에 제고할 수 있는 항생제 대체물질의 필요성이 절실히 요구되고 있다. 또한 세균감염에 의해 야기되는 여러 질병의 치료를 위해 사용되는 기존의 항생제를 대체할 수 있는 천연항생물질에 대한 요구가 높아지고 있으며, 장내 부패균총에 대한 광범위한 항균작용 및 여러 가지 생리활성을 갖는 천연항생물질로 사료첨가제 및 식품ㆍ의약품 대체제가 요구되고 있다.
한편, 락토페린 폴리펩타이드는 광범위한 항미생물 활성을 가지고 있으며 점막부위, 초유 등에서 외부항원에 대한 방어시스템의 중요한 구성성분으로 알려져 있는 락토페린(lactoferrin)의 유도물질로 락토페린보다 항미생물활성이 약 500배 강한 효과적인 펩타이드이다. 이와 같이 광범위한 항미생물효과를 가지고 있는 항균성 폴리펩타이드는 항생제의 효능과 유사하여 최근 문제가 되는 항생제 과다사용, 내성문제 및 축산물의 잔류성 문제를 해결할 수 있는 물질이다. 락토페린 폴리펩타이드는 주로 우유의 유청으로부터 분리되었으며 최근 락토페린 폴리펩타이드를유전공학적인 방법으로 대량생산하려는 시도가 이루어지고 있다. Ward와 Piddington은Aspergillus awamori에서 글루코아밀레이즈 프로모터를 이용하여 락토페린을 2g/L 수준을 발현시켰다.(Ward, p.p. 등, Bio/Technology, 13.498(1995)). Qianwa는Saccharomyces cerevisiae에 켈라틴(chelatin) 프로모터를 이용하여 효모 인벌테이즈와 사람 락토페린의 융합단백질 형태로 발현시켜 1.5∼2.0mg/L의 재조합 사람락토페린을 얻었다고 보고하였다.(Qianwa Liang 등 J. Agric. Food Chem. 41:1800-1807).
한우 유래 항균성 폴리펩타이드는 항생제와 거의 유사한 항미생물 활성을 보이는 항생물질로 아직까지Phichia methanolica효모균주를 숙주세포로 이용하여 재조합 항균성 폴리펩타이드를 다량으로 얻는 방법은 연구된 바 없었다.
본 발명자들은 상기 항생제와 거의 유사한 항미생물 활성을 보이는 항균성 펩타이드를 대량으로 생산하기 위해 한우로부터 유래한 항균성 폴리펩타이드 유전자를 포함하는 발현벡터를 구축한 후 이들 재조합 벡터로Pichia methanolica효모세균주를 형질전환시키고 이형질전환된 재조합 균주를 배양하여 항균성 폴리펩타이드를 다량 생산하므로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 한우(Bos taurus Coreanae)로부터 유래한 항균성 폴리펩타이드 유전자 염기서열과 아미노산 서열을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 항균성 폴리펩타이드 유전자가 도입된 재조합 벡터 pPML-SM2를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터 pPML-SM2에 의해 형질전환된 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2(KCTC 1681BP)를 배양하여 재조합 항균성 폴리펩타이드를 대량 생산방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 한우의 간, 유선, 창자, 고환조직으로부터 분리한 전체 RNA로부터 분리한 항균성 폴리펩타이드 유전자와 이를 선택적으로 증폭하기 위한 프라이머를 제작하여 RT-PCR로 증폭한 후 pPML-E2벡터에 상기 항균성 폴리펩타이드 유전자와 프라이머를 라이게이션하고E.coliDH5α에서 발현시켜 서브클로닝한 후 여기서 얻은 본 발명 재조합 벡터 pPML-SM2를Pichia methanolica효모균주에 도입하여 형질전환시키므로써 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2를 얻은 다음 이 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2(KCTC 1681BP)를 발효배양하여 대량으로 재조합 항균성 폴리펩타이드를 생산하므로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 발현을 위한 벡터 제작 모식도이다.
도 2은 본 발명 재조합 효모균주Phichia methanolicaSM2 배양액의E.coliJM109에 대한 항균활성을 나타낸 사진도이다.
도 3는 본 발명 재조합 효모균주Phichia methanolicaSM2 배양액의E.coli0157에 대한 항균활성을 나타낸 사진도이다.
도 4은 본 발명 재조합 효모균주Phichia methanolicaSM2 배양액의Samonella flexmery와E.coliCJ236에 대한 항균활성을 나타낸 사진도이다.
본 발명은 한우의 간, 유선, 창자, 고환의 조직의 전체 RNA로부터 본 발명 한우 유래 항균성 폴리펩타이드를 분리하고 이를 증폭하기 위해 프라이머를 제작한 후 RT-PCR로 증폭한 다음 이를 pPML-E2 발현벡터에 삽입하여 라이게이션한 후 상기 라이게이션 산물로E.coliDH5α을 형질전환시켜 얻은 형질전환체로부터 재조합 벡터 pPML-SM2를 얻는 서브 클로닝 단계; 상기 단계에서 얻은 재조합 벡터 pPML-SM2를 효모균주Pichia methanolica에 전기 충격으로 도입하여 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2를 얻는 단계; 상기 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2를 배지에 패드-배치 타입으로 배양하여 한우 유래 항균성 폴리펩타이드를 생산하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 한우로부터 분리한 한우 유래 항균성 폴리펩타이드는 락토페린에서 유래되는 항균 폴리펩타이드 또는 항균 폴리펩타이드를 구성하는 일부 펩타이드를 다른 펩타이드로 치환하거나 또는 항균 폴리펩타이드 잔기 중 일부를 치환시킨 모든 펩타이드 또는 이에 상응하는 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명 재조합 균주Pichia methanolicaSM2는 한우 유래 항균성 폴리펩타이드에 강한 내성을 나타내므로 한우 유래 항균성 폴리펩타이드를 융합단백질 형태로 만들 뿐 아니라, 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 그 자체 및 변형 펩타이드를 대량 생산할 수 있다.
또한 본 발명 재조합 균주Pichia methanolicaSM2는 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 뿐만 아니라, 숙주 세포의 성장을 억제하거나 숙주 세포를 사멸시키므로써 미생물로부터 대량 생산이 어려운 다양한 항균성 펩타이드을 대량 생산할 수 있다.
본 발명에서 효모 균주로는Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Candida와 같은 효모 세포가 이용될 수 있으며, 바람직하게는Pichiasp. 세포를 이용할 수 있다.
본 발명에서 한우 유래 항균성 폴리펩타이드를 암호화는 아미노산 서열은 다른 펩타이드와 융합된 융합 펩타이드 또는 한우 유래 항균성 폴리펩타이드에 몇 개의 아미노산이 부가된 서열이거나 한우 유래 항균성 폴리펩타이드만을 암호화하는 서열 또는 락토페린 폴리펩타이드와 유사한 폴리펩타이드를 암호화하도록 한우 유래 항균성 폴리펩타이드를 변형시킨 서열이다.
본 발명에서 사용한 모든 제한효소와 효소는 Takara Biotechnology사에서 구입하였다. 올리고누클레오타이드 프라이머는 Bioneer사에서, 아미노산, 효모 nitrogen base(YNB), 효모 추출물, 펩톤과 글루코오스 등 배지 구성 성분은 Difco사에서 구입하였다. 기타 단백질 전기영동 등에 사용되는 시약은 Sigma사 제품을 이용하였고 형질전환에는E.coliDH5α와Pichia methanolica를 사용하였다.
본 발명에서 한유 유래 항균성 폴리펩타이드의 항균실험에 일본 동경 대학교 이병로 박사에게서 분양받은E.coliJM109와E.coliDH5-α 및E.coli0157 ATCC 15491와Salmonella flexmeryATCC 12022를 사용하였다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 효모균주 Pichia methanolica SM2 제조
제 1 공정: 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 서브 클로닝
한우의 간, 유선, 창자, 고환조직으로부터 전체(Total) RNA를 분리하고 RT-PCR을 이용해 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 cDNA로부터 서열목록 1에 기재된 바와 같은 25개의 아미노산 잔기를 가진 항균성 폴리펩타이드에 해당하는 부위를 선택적으로 증폭하기 위하여 프라이머(Primer) A와 B를 제작하였다. 프라이머 A와 B는 하기 나타낸 바와 같이 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 염기서열 중 시스테인의 이황화 결합을 포함하도록 하였으며 또한 증폭된 유전자를 pPML-E2 벡터에 구축시키기 위하여 벡터가 가지고 있는 복합 클로닝 부위인SnaBⅠ과AvrⅡ부위에 맞게 디자인하였다.
프라이머 A : 5'-GGAAAAGATACGTAAAATGCTTCCAATGG-3'
SnaBⅠ
프라이머 B : 5'-GGCCTAGGTCAAAATCTCTTTATGCAGCTG-3'
AvrⅡ
한우(Bos taurus Coreanae) 조직에서 유래된 항균성 폴리펩타이드 유전자 염기서열 및 아미노산 염기서열은 다음과 같으며 이는 서열목록 1에 동일하게 작성하였다.
TTC AAA TGC CGC CGA TGG CAG TGG AGG ATG AAG AAG CTG GGT GCT CCC
F K C R R W Q W R M K K L G A P
TCT ATC ACC TGT GTG AGG AGG GCC GAC
S I T C V R R A D
따라서 최종적으로 증폭시킨 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 염기서열 및 아미노산 염기서열은 하기 나타낸 바와 같았다.
GAG TGG TTC AAA TGC CGC CGA TGG CAG TGG AGG ATG AAG AAG CTG GGT
E W F K C R R W Q W R M K K L G
프라이머A에서 유래
GCT CCC TCT ATC ACC TGT GTG AGG AGG GCC GAC GCC TTG GAA
A P S I T C V R R A D A L E
프라이머B에서 유래
상기 증폭시킨 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자와 발현벡터 pPML-E2를 제한효소SnaBⅠ과AvrⅡ로 처리하여 라이게이션 시킨 후 라이게이션 산물을E.coliDH5α에 도입하여 형질전환시킨 다음 이들을 가나마이신이 들어있는 배지에 도말하여 자라는 콜로니를 형질전환체로 선별하고 이로부터 재조합 벡터 pPML-SM2를 얻었다. 벡토 모식도는 도 1에 나타낸 바와 같다.
제 2 공정: 재조합 벡터 pPML-SM2를 이용한 효모균주 Pichia methanolica 형질전환
본 공정에서는 Chang 등(Chang, D. 등, Guide to electroporation and electrofusion. Academic Press. p501(1992))의 방법에 따라, 일렉트로포레이션에 의해Pichia methanolica에 pPML-SM2를 형질전환시켰다. 즉,Pichia methanolica를YPD 액체배지(효모추출물 1%, 펩톤 2%, 덱스트로오스 2%)에서 OD600＝1.3 ~ 1.5 까지 배양한 후 배양액 500mL을 원심분리하여 펠렛을 모았다. 100mL의 YPD 배지에 재현탁한 후 HEPES(N-(2-하이드록시 에틸) 피페라진-N'(2-에탄-설포닌산)), pH8.0)과 디티오트레이톨을 각각 20mM, 25mM 되게 처리하고 30℃에서 15분간 반응시켰다. 이것을 1M 솔비톨 0.5mL에 녹인 후 40㎕을 취하여 pPML-SM2 100ng과 함께, 미리 냉각시킨 갭 큐벳(gap cuvette)에 넣고 얼음에서 5분간 반응시킨 후 1500V, 25mA에서 일렉트로포레이션시켰다. 전기충격 후 즉시 차가운 1M 솔비톨 750㎕을 넣고 YM배지에 100㎕씩 도말하였다. YM배지에서 자라는 형질전환체의 게놈 DNA를 정제하여, 상기 제 1 공정에 기재한 프라이머 A와 B를 사용하여 PCR 반응을 이용하여 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자가 삽입된 균을 최종 선별하였다. 결과적으로 형질전환된 재조합 균주Pichia methanolicaSM2가 생산하는 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 서열 및 아미노산 서열은 하기와 같다.
GCT TAC GAG TGG TTC AAA TGC CGC CGA TGG CAG TGG AGG ATG AAG AAG CTG
A Y E W F K C R R W Q W R M K K L
pPML-E2에서유래 프라이머A에서 유래
GGT GCT CCC TCT ATC ACC TGT GTG AGG AGG GCC GAC GCC TTG GAA
G A P S I T C V R R A D A L E
프라이머B에서 유래
상기 최종 선발한 형질전환된 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2를 YPD 배지에서 OD600＝1.3 ~ 1.5 까지 배양한 후, LB 한천 아가배지에E.coliJM109를 고르게 도말한 중층배지 위에 형질전환체 배양액 60㎕을 적신 종이 디스크를 상치하여 배양한 후 투명존의 형성여부를 관찰하였다. 실험결과, 도 2에 나타낸 바와같이 투명존이 형성됨을 관찰하여 항균활성이 있음을 확인하였다. 이와 동일한 항균활성 실험을E.coliJM109 균주가 아닌E.coli0157,Salmonella flexmery및E.coliCJ236균주를 대상으로 실시하였으며 그 결과는 각각 도 3와 도 4에 나타낸 바와 같이 클리어 존이 형성되어 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 상기 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2를 생명공학연구소내 미생물기탁센터에 1999년 11월 5일 기탁번호 KCTC 0681BP로 기탁하였다.
실시예 2: 재조합 효모균주 Pichia methanolica SM2 배양에 의한 재조합 항균성 폴리펩타이드 대량생산
본 실시예에서 사용한 배지는 표 1에 나타낸 바와 같으며 발효방법은 먼저 상기 실시예 1에서 형질전환시켜 얻은 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2 균주의 1콜로니를 20mL의 플라스크 배지(flask medium)가 함유된 100mL 배플 삼각 플라스크(baffle flask)에 접종하여 24시간동안 30℃에서 셰이킹(shaking)하면서 배양하였다. 이를 1차 종 배양균(seed culture)이라 하고, 1차 종 배양균으로부터 2차 종 배양균으로 규모 확대(scale-up)하기 위하여 100mL 플라스크 배지(flaskmedium)에 함유된 500mL 배플 삼각 플라스크(baffle flask)에 5mL의 1차 종 배양균을 무균적으로 접종하였다. 이를 다시 14 ~ 20시간 동안 30℃에서 셰이킹(shaking)하면서 배양하였다. 삼각 플라스크 배양시, 형질전환된 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2 균주를 10% 글리세롤로 예비유도(preinduction)하고, 2차 대사산물로 포름알데히드(HCHO)가 분비되는 메탄올(CH3OH) 대신 아세트알데히드(CH3CHO)가 2차대사산물로 한우 유래 항균성 폴리펩타이드와 더불어 분비되는 에탄올(CH3CH2OH)을 0.05∼6%을 첨가하여 항균성 폴리펩타이드 분비를 유도하였다. 5L 발효기(fermenter)에 1.5L의 기초배지(basal medium)를 멸균 시킨 후 암모니아수로 pH를 4.0 ~ 6.0으로 조정한 다음 100mL의 2차 플라스크 종(flask seed)을 접종하여 발효기(fermenter)에서 본 배양을 실시하였다. 본 배양은 패드-배치 타입(fed-batch type)에 따라 추가적으로 탄소원을 공급하는 방식으로 진행하였다. 발효조건은 공기 공급량 1VVM(volume of air per volume of medium per minute), 교반속도 900 ~ 1200 rpm, 온도 28.0 ~ 33.0℃, pH 4.0-6.0으로 수행하였다.
본 발명 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2 균주 발효을 위한 사용배지
플라스크 배지(Flask medium) YPD medium, 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 10% 글리세롤, 10% 인산칼륨
기초배지(Basal medium) 인산(85% phosphoric acid) 26.7ml, 인산칼륨(KH2PO4) 10g, 황산마그네슘-7H2O(MgSO4) 15.0g, 수산화칼륨(KOH) 4.0g, C-탄소원(C-source) 40.0g, PTM 용액 4.0mL per liter
PTM 용액 요오드화 칼륨(potassium iodide) 0.08g, 황산망간-H2O(manganese sulfate-H2O) 2.97g, 붕산(boric acid) 0.02g, KI(zinc chloride) 10.0g, 황산구리 5H2O (cupric sulfate-5H2O) 5.0g, 황화철-7H2O(ferrous sulfate-7H2O) 60.0g, 비오틴(biotin) 0.2g, 황산(sulfuric acid) 4.0ml per liter
공급배지(Feeding medium) 50% 글리세롤, 6mL PTM 용액
도입배지(Induction medium) 100% 에탄올, 12mL PTM 용액
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 한우로부터 분리한 항균성 폴리펩타이드 또는 변형된 한우 유래 항균성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현벡터 pPML-E2에 삽입하여 얻은 재조합 벡터 pPML-SM2로 형질전환시켜 얻은 본 발명 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2(KCTC 0681BP)를 발효배양하여 항균성 폴리펩타이드를 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 및 축산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

  1. 서열목록 1에 기재된 바와 같으며 한우로부터 유래한 항균성 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전자 염기서열.
  2. 서열목록 1에 기재된 바와 같으며 제 1 항 기재의 유전자 염기서열로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열.
  3. 제 1 항 기재의 한우 유래 항균성 유전자를 벡터 pPML-E2에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pPML-SM2.
  4. 제 3 항 기재의 재조합 벡터 pPML-SM2를 효모균주Pichia methanolica에 도입하여 형질전환시킨 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2(KCTC 0681BP).
  5. 제 4 항 기재의 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2(KCTC 0681BP)를 배양발효하여 얻은 재조합 항균성 폴리펩타이드.
  6. 제 4 항 기재의 재조합 효모균주Pichia methanolicaSM2(KCTC 0681BP)를 플라스크 배지에 접종하여 1차 종 배양한 후 규모를 확대하여 2차 종 배양하면서 글리세롤과 에탄올을 첨가하여 항균성 폴리펩타이드 분비를 유도한 후 발효기에 기초배지를 첨가하고 상기 2차 종 배양물을 접종하고 본 배양을 실시함을 특징으로 하는 재조합 항균성 폴리펩타이드 생산방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 플라스크 배지는 YPD 배지, 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 10% 글리세롤, 10% 인산칼륨을 함유하며 기초배지는 85% 인산, 인산칼륨, 황산마그네슘-7H2O, 수산화칼륨, C-탄소원, 리터당 PTM 용액 4.0mL을 함유하는 것을 특징으로 하는 하는 재조합 항균성 폴리펩타이드 생산방법.
KR1019990050315A 1999-10-02 1999-11-12 한우 유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 발현용 재조합효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 항균성 폴리펩타이드 KR100332359B1 (ko)

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CN105533757A (zh) * 2015-12-03 2016-05-04 赤峰陆尔草中蒙药科技有限公司 一种牛肉多肽膏的制备方法

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