KR100357237B1 - 한우 유래 락토페린 발현용 재조합 효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 락토페린 - Google Patents

한우 유래 락토페린 발현용 재조합 효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 락토페린 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한우 유래 락토페린 유전자 발현용 재조합 효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 락토페린에 관한 것으로 한우 유래 락토페린 유전자가 도입된 재조합 벡터 pWE로 형질전환된 본 발명 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60(기탁번호 KCTC 8968P)을 발효배양하여 항균성 재조합 락토페린을 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

한우 유래 락토페린 발현용 재조합 효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 락토페린{Recombinant yeast strain for expressing lactoferrin derived from Bos taurus Coreanae and the recombinant lactoferrin obtainable therefrom}
본 발명은 한우 유래 락토페린 유전자 발현용 재조합 효모균주 및 이로부터 얻은 재조합 락토페린에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 한우로부터 유래한 락토페린 유전자로 재조합된 벡터에 의해 형질전환된 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60 및 이를 배양하여 얻은 재조합 락토페린에 관한 것이다.
최근 축산 및 식품분야에서 많은 문제가 되고 있는 항생제 오용 및 잔류성 문제, 즉 축산식품의 항생물질 잔류 및 이로 인한 내성문제 등이 매우 심각하게 대두되고 있는 실정이다. 따라서 축산물의 안정성을 높히고, 축산물의 생산성을 동시에 제고할 수 있는 항생제 대체물질의 필요성이 절실히 요구되고 있다. 또한 세균감염에 의해 야기되는 여러 질병의 치료를 위해 사용되는 기존의 항생제를 대체할 수 있는 천연항생물질에 대한 요구가 높아지고 있으며, 장내 부패 균총에 대한 광범위한 항균작용 및 여러 가지 생리활성을 갖는 천연항생물질로 사료첨가제 및 식품ㆍ의약품 대체제로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
한편, 락토페린은 영양물질로 각종 세균이나 이종단백질로부터 수유기의 새끼를 방어할 수 있는 생리활성 물질이 포함되어 있는데 광범위한 항미생물 활성을 가지고 있으며 점막부위, 소화기관, 초유 등에서 외부항원에 대한 방어시스템의 중요한 구성성분으로 알려져 있다. 상기와 같이 광범위한 항 미생물 효과를 가지고 있는 락토페린은 항생제의 효능과 유사하여 최근 문제가 되는 항생제 과다사용, 내성문제 및 축산물의 잔류성 문제를 해결할 수 있는 물질이다. 이러한 락토페린은 주로 우유의 유청으로부터 분리되었으나, 최근 락토페린을 유전공학적인 방법으로 대량생산하려는 시도가 이루어지고 있다. Ward와 Piddington은Aspergillus awamori에서 글루코아밀레이즈 프로모터를 이용하여 락토페린을 2.0g/L 수준으로 발현시켰고,Aspergillus oryzae에서는 25mg/L 수준으로 발현시켰다. (Ward, p.p. 등, Bio/Technology, 13.498 (1995)). Qianwa는Saccharomyces cerevisiae에 케라틴(chelatin) 프로모터를 이용하여 효모 인벌테이즈와 사람 락토페린의 융합단백질 형태로 발현시켜 1.5∼2.0mg/ℓ의 재조합 사람 락토페린을 얻었다고 보고하였다(Qianwa Liang 등 J. Agric. Food Chem. 41:1800-1807).
그러나 아직까지 한우로부터 유래한 락토페린 유전자를 재조합하여 재조합 락토페린을 대량으로 생산하는 방법은 없었다. 본 발명자들은 항생제와 거의 유사한 항미생물 활성을 보이는 한우 유래 항균성 락토페린을 생산하는 재조합 효모균주 개발과 이를 이용한 천연 항생물질인 재조합 락토페린을 개발하고자 연구한 결과, 한우로부터 락토페린 유전자를 분리하여 이를 함유하는 재조합 발현벡터를 구축하고 이들 재조합 발현벡터를 이용하여 숙주세포Candida methylicaMXL-6를 형질전환시켜 재조합 벡터Candida methylicaSKL60을 얻은 후 이를 배양하여 락토페린을 대량생산함으로서 기존항생제를 대체하는 천연 항생물질을 얻고 또 천연항생제 락토페린을 함유한 효모배양(yeast culture)방법을 개발하므로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 한우(Bos taurus Coreanae)로부터 유래한 락토페린 유전자 염기서열과 아미노산 서열을 제공함에 있다. 본 발명이 다른 목적은 상기 락토페린 유전자가 도입된 재조합 벡터 pWE를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터 pWE에 의해 형질전환된 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60를 배양하여 재조합 락토페린을 대량 생산함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 한우의 간, 유선, 창자, 고환조직으로부터 분리한 전체 RNA로부터 프라이머를 이용해 락토페린만을 선택적으로 PCR 증폭한 후 벡터 pYES2에 증폭한 유전자를 삽입하여 재조합 발현벡터 pWE를 제작하고 이 발현벡터로 효모균주Candida methylicaMXL-6에 전기충격으로 도입하여 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60을 얻은 후 이 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60를 발효배양하여 재조합 락토페린을 얻었다. 이어서, 상기 재조합 락토페린이 한우에서 유래한 것인지 DNA 염기서열과 아미노산 서열을 분석하여 확인하고 다른 병원성 미생물에 상기 재조합 락토페린을 처리하여 항균활성을 조사한 후 사료제조시에 첨가제로 일정량 첨가하여 사료를 제조함으로서 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 벡터 pYES2에 한우 유래 항균성 단백질인 락토페린 유전자를 도입하여 플라스미드를 구축하는 벡터 모식도이다.
도 2은 본 발명 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60가 생산한 재조합 락토페린의 병원성 미생물에 대한 항미생물 작용을 보여주는 사진도이다.
도 3는 본 발명 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60(기탁번호 KCTC 8968P)를 배양하여 생성되는 재조합 락토페린의 배양시간에 따른 발현을 보여주는 전기영동결과이다.
도 4은 본 발명 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60가 생산한 재조합 락토페린 cDNA의 제한효소지도를 나타낸다.
도 5a와 5b는 본 발명 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60가 생산한 재조합 락토페린의 유전자 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
도 6는 본 발명 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60이 생산한 재조합 락토페린의E.coli와Bacillus subtilis에 대한 항균력을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 한우의 간, 유선, 창자, 고환조직으로부터 전체 RNA를 분리하고항균성 폴리펩타이드 유전자 cDNA부터 프라이머를 이용해 락토페린만을 선택적으로 PCR 증폭한 후 벡터 pYES2에 삽입하여 재조합 발현벡터 pWE를 제작하는 단계; 상기 단계에서 얻은 재조합 벡터 pWE를 효모균주Candida methylicaMXL-6에 전기충격으로 도입하여 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60를 얻는 단계; 상기 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60을 글리세롤로 프리인덕션하고 에탄올로 인덕션한 후 규모를 확대하여 배양함으로서 재조합 락토페린을 생산하는 단계; 상기 단계에서 얻은 재조합 락토페린의 DNA를 증폭하여 벡터에 라이게이션하여 클로닝한 후 Gene Bank내 NCBI 데이터 베이스를 이용하여 분석함으로서 재조합 락토페린이 한우 유래임을 확인하는 단계; 재조합 락토페린 배양액을 병원성 미생물에 처리하여 항균활성을in vitro에서 조사하고 산란계에 재조합 락토페린과 살모넬라 균을 투여하고 산란계의 맹장, 회장, 분에서 살모넬라 타이피뮤리움 계수를 조사하여in vivo에서 항균활성을 조사하는 단계 및; 본 발명 재조합 락토페린과 재조합 효모균주를 가축사료에 첨가하여 가축사료를 제조하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 숙주균주Candida methylicaMXL-6은 일본 동경대학교 이병로 박사에게서 분양받은 것이며, 본 균주의 특징은 흰색의 아이스크림 색으로 버터색의 콜로니를 형성하며 출아에 의한 무성생식으로 가성균사(psedohyphae)를 가지며 미생물학적 특성 및 동정 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다.
Candida methylicaMXL-6의 미생물학적 특성과 동정
발효 성장
당 Gla Glc Mal Suc Lac Raf Sta 당 Gla Glc Mal Suc Lac Inu Sta Gly
성장 + - - - - - - -
발효 + - - - - - - 당 Suc Cit Met Eth Nit Bio Thi Xyl
성장 + - + + + - + +
상기 숙주균주Candida methylicaMXL-6은 한우 락토페린에 내성이 있는 균주를 탐색하여 선정한 것으로 한우 유래 항균성 단백질인 락토페린에 강한 내성을 나타내므로 한우유래 항균성 단백질인 락토페린을 융합단백질 형태로 만들 뿐 아니라, 한우유래 항균성 단백질인 락토페린 그 자체 및 변형 단백질을 대량 생산할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 숙주균주Candida methylicaMXL-6는 한우 유래 항균성 단백질인 락토페린 뿐만 아니라, 숙주 세포의 성장을 억제하거나 숙주 세포를 사멸시킴에 의해 미생물로부터 대량 생산이 어려운 다양한 항균성 펩타이드의 대량 생산에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 한우 유래 항균성 단백질인 락토페린를 코딩하는 서열은 다른 펩타이드와 융합된 융합 펩타이드 또는 한우유래 항균성단백질인 락토페린에 몇 개의 아미노산이 부가된 서열을 코딩하는 서열이거나, 한우유래 항균성 단백질인 락토페린 만을 코딩하는 서열 또는 락토페린을 변형시킨 서열을 코딩하는 서열일 수 있다.
본 발명에서 사용한 모든 제한효소와 RT-PCR system kit는 BoehringerMannheim Biochemica사에서 구입하였다. 올리고누클레오타이드 프라이머는 Bioneer사에서, 아미노산, 효모 nitrogen base(YNB), 효모 추출물, 펩톤과 글루코오스 등과 같은 배지 구성 성분은 Difco사에서 구입하였다. 기타 단백질 전기영동 등에 사용되는 시약은 Sigma사 제품을 이용하였다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 Candida methylica SKL60 제조
제 1 공정: 한우유래 항균성 단백질인 락토페린의 서브 클로닝
한우의 간, 유선, 창자, 고환조직으로부터 Total RNA를 분리하고 표 2에 나타낸 바와 같은 조건으로 RT-PCR을 실시하여 한우유래 항균성 폴리펩타이드 유전자 cDNA로부터 항균성 단백질인 락토페린에 해당하는 부위를 선택적으로 증폭하기 위하여 프라이머(Primer)를 만들었다. 프라이머 A와 B는 한우유래 항균성 단백질인 락토페린의 염기서열 중 락토페린 전체를 증폭할 수 있도록 하기와 같이 디자인하였다. 또한 증폭된 유전자를 pYES2 벡터에 구축시키기 위하여 벡터가 가지고 있는 복합 클로닝 부위인XhoⅠ부위에 맞게 디자인하였다.
프라이머 A : 5'-GGAAAAGACTCGAGAAATGCTTCCAATGG-3'
XhoⅠ
프라이머 B : 5'-GGCTCGAGTCAAAATCTCTTTATGCAGCTG-3'
XhoⅠ
도 1에 나타낸 바와 같이 증폭시킨 락토페린 유전자와 pYES2을XhoⅠ으로 처리하고 이들을 연결하여E.coliTop10'에 도입하여 형질전환시킨 다음 이들을 가나마이신이 들어있는 배지에 도말하여 자라는 콜로니를 형질전환체로 선별하고 이로부터 재조합 발현벡터 pWE를 얻었다.
PCR 반응 조건
반응조건 시간 사이클 수
열 사이클(thermal cycle) 변성과정(denaturation) 94℃ 1초 35사이클
94℃ 1분 30초
복원과정(annealing) 50℃ 1초
50℃ 2분 30초
중합과정(polymerization) 72℃ 1초
72℃ 3분 30초
최종확장(final extension) 72℃ 5분
소크(soak) 4℃
제 2 공정:재조합 벡터 pWE를 이용한 효모균주 Candida methylica 형질전환
본 공정에서는 Chang 등(Chang, D. 등, Guide to electroporation and electrofusion. Academic Press. p501(1992))의 방법에 따라, 일렉트로포레이터(Invitrogen, USA)를 이용하여 1500V에서 일렉트로포레이션하여Candida methylicaMXL-6에 재조합 플라스미드 벡터 pWE를 형질전환시켰다. 즉,Candida methylicaMXL-6을 YPD 액체배지(효모추출물 1%, 펩톤 2%, 덱스트로오스 2%)에서 OD600＝1.0∼1.5 까지 배양한 후 배양액 500mL을 원심분리하여 펠렛을 모았다. 100mL의 YPD 배지에 재현탁한 후 HEPES(N-(2-하이드록시 에틸) 피페라진-N'(2-에탄-설포닌산)), pH8.0)과 디티오트레이톨을 각각 20mM, 25mM 되게 처리하고 30℃에서 15분간 반응시켰다. 이것을 1M 솔비톨 0.5mL에 녹인 후 40㎕을 취하여 pWE 100ng과 함께, 미리 냉각시킨 갭 큐벳(gap cuvette)에 넣고 얼음에서 5분간 반응시킨 후 1500V, 25mA에서 일렉트로포레이션 시켰다. 전기충격 후 즉시 차가운 1M 솔비톨 750㎕을 넣고 YM배지에 100㎕씩 도말하였다. YM배지에서 자라는 형질 전환체의 게놈 DNA를 정제하여, 앞에서 기재한 프라이머 A와 B를 사용하여 PCR 반응을 이용하여 한우유래 항균성 단백질인 락토페린 유전자가 삽입된 균을 최종 선별하였다. 최종 선발된 형질 전환체를 YPD 배지에서 OD600＝1.0∼1.5 까지 배양한 후, LB 한천 아가배지에E.coliO157와Bacillus subtilis각각을 고르게 도말한 중층배지 위에 배양한 시간대별로 형질 전환체 배양액 60㎕을 적신 종이 디스크를 상치하여 배양한 후 생육 저해환의 형성여부를 관찰하였으며 항균활성이 있음을 확인하였다(도 2).
실시예 2:재조합 효모균주 Candida methylica SKL60 배양에 의한 재조합 락토페린 대량생산
본 실시예에서 사용한 배지는 표 3에 나타낸 바와 같으며 상기 실시예 1에서 형질전환된 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60 1콜로니를 20mL의 플라스크 배지(flask medium)가 함유된 100mL 배플 삼각 플라스크(baffle flask)에 접종하여 24시간동안 30℃에서 진탕하면서 배양하였다. 이를 1차 종 배양균(seed culture)라 하고, 1차 종 배양균으로부터 2차 종 배양균으로 규모 확대(scale-up)하기 위하여 100mL 플라스크 배지(flask medium)에 함유된 500mL 배플 삼각 플라스크(baffle flask)에 5mL의 1차 종 배양균을 무균적으로 접종하였다. 이를 다시 14 ~ 20시간 동안 30℃에서 진탕하면서 배양하였다. 삼각 플라스크 배양시, 형질전환된Candida methylicaSKL60 균주를 10% 글리세롤로 프리인덕션(preinduction)하고, 락토페린 분비를 인덕션(induction)하기 위하여 에탄올 0.5∼6%를 첨가하여 항균성 단백질인 락토페린을 인덕션하였다. 그리고 5L 발효기(fermenter)에 1.5L의 기초배지(basal medium)를 멸균시킨 후 암모니아수로 pH를 4.0 ~ 6.0으로 조정한 다음 100mL의 2차 플라스크 종(flask seed)을 접종하여 발효기(fermenter) 본 배양을 실시하였다. 본 배양은 페드-배치 타입(fed-batch type)으로 추가적으로 탄소원을 공급하는 방식으로 진행하였다. 발효조건은 공기 공급량 1VVM(volume of air per volume of medium per minute), 교반속도 900 ~ 1200 rpm, 온도 28.0 ~ 33.0℃, pH 4.0 ~ 6.0으로 수행하였다. 이때 생산되는 락토페린 단백질을 확인하기 위하여 배양을 시작하면서 각각 4, 8, 16, 32, 48후에 시료를 취하여 전기영동을 시행하고 단백질 크기 85,000 달톤의 생성을 경시적으로 확인하였다. 이 결과를 도 3에 나타냈다.
Candida methylicaSKL60 균주의 발효을 위한 사용배지
플라스크 배지(Flask medium) YPD 배지, 1% 효모추출물, 2% 펩톤, 10% 글리세롤, 10% 포타슘 포스페이트
기초배지(Basal medium) 인산(85% phosphoric acid) 26.7mL, 인산칼륨(KH2PO4) 10g, 황산마그네슘-7H2O(MgSO4) 15.0g, C-탄소원 40.0g, 리터당 PTM 용액 4.0mL
PTM 용액 요오드화 칼륨 0.08g
공급배지(Feeding medium) 50% 글리세롤, 6mL PTM 용액
도입배지(Induction medium) 100% 에탄올, 12mL PTM 용액
실시예 3: 재조합 락토페린의 DNA 염기서열 및 아미노산 서열 분석
한우조직으로부터 전체 RNA을 분리하고 RT-PCR을 이용하여 한우 락토페린 cDNA을 분리하여 이 산물(product)이 한우 락토페린인가를 확인하기 위하여 얻어진 cDNA 중간 중간에 인터날 프라이머(internal primer)를 이용하여 증폭여부로 확인하였고 또한 이 cDNA에 락토페린 결합부위(binding site)가 존재하는가를 알아보기 위하여 제한효소를 처리하여 확인하여 한우 락토페린임을 확인하였다. 상기 얻어진 한우 유래 항균성 단백질인 락토페린 유전자를 벡터인 pUC118에 라이게이션시켜 pHKF을 얻어 클로닝을 위한 재조합 플라스미드을 구축하였다. 이때 사용된 제한효소로는XbaI과BamHI을 사용하였다. 상기 클로닝한 한우 유래 단백질인 락토페린의 전체 길이(full length)를 500bp 전후로 잘라 7개의 조각들(fragments)을 각각 pUC118 벡터에 라이게이션 시켜 Bioneer사에 의뢰하였고, 아미노산 염기서열의 상동성은 Gene Bank내 NCBI 데이터 베이스를 이용하여 분석하였다. 도 4에는 한우 락토페린 전체 길이(full length) 중 염기서열을 밝히기 위해 각각을 잘라 클로닝한 부위를 나타낸 것이다. 결과적으로 도 5a와 5b에 나타낸 바와 같은 유전자 염기서열과 이 유전자 염기서열에 해당하는 아미노산 서열을 확인하여 재조합 락토페린이 한우에서 유래한 것임을 확인하였다.
실시예 4: 재조합 락토페린의 항균효과
실험예 1: 재조합 락토페린의 항미생물 작용 조사
실시예 2에서 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60를 배양하여 얻은 재조합 락토페린 배양액을 병원성 미생물인Escherichia coliO157:H7 ATCC 35150와Bacillus subtilisATCC1021 미생물에 투여하고 콜로니수를 계수하여 항미생물 효과를 조사하였다. 실험결과, 도 6에 나타낸 바와 같이E.coli0157의 경우는 50mg/L와 10mg/L 두 경우 모두 콜로니 형성이 급속하게 감소하여 락토페린을 넣지 않은 대조군에 비해 항미생물 작용이 우수하다는 것을 알 수 있었고Bacillus. subtilisATCC1021의 경우도E.coli와 마찬가지로 콜로니 형성이 저하되었다.
이때 이용한 미생물E. coliO157:H7 ATCC 35150와B.subtilisATCC 1021은 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, USA)에서 분양받았다.
실험예 2: 재조합 락토페린의 살모넬라균에 대한 항균효과
산란계 12마리 중 각각 4마리씩을 1그룹으로 3그룹을 구성하여 증류수(5mL)만을 먹였을 경우(T1), 증류수(4.5mL)에 재조합 락토페린(0.5mL) 배양액을 혼합 했을 경우(T2), 재조합 락토페린(5mL) 배양액 만을 투여했을 경우(T3)에 대한 산란계의 맹장, 회장, 분(糞)에서의 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimuriumKCCM40253) 계수를 조사하여 한우 유래 항균성 단백질인 락토페린의 항미생물 작용이 있는지를 알아보았다. 계수 방법은 Brilliant green agar modified 배지를 사용하여 24 ~ 48시간 배양한 후 살모넬라의 특이 집락수를 측정하였다. 이때 재조합 락토페린의 투여기간은 10일 10회 구강 투여를 하였으며, 살모넬라 투여기간은 1주 5회 1mL(1×108cfu/mL)씩 구강 투여를 하였다. 실험기간 중 산란계에서 설사증상은 거의 나타나지 않았으며 각 장기의 살모넬라 계수 결과는 통계처리를 이용하였다. 이때, 사용한 미생물Salmonella typhimuriumKCCM40253은 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에서 분양을 받았다. 실험결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 재조합 락토페린을 투여한 산란계에서 맹장의 경우, T1과 T2, T1과 T3, T2와 T3 모두에서 통계학적 유의적 차이가 나타났으며, 회장의 경우에는 약간의 수적인 차이만 보일 뿐 유의적 차이는 나타나지 않았다. 분(糞)의 경우에는 T1과 T2, T2와 T3는 유의적 차이가 없었으나 T1과 T3는 유의적 차이가 있음을 알 수 있었다.
재조합 락토페린의 산란계 투여 결과
샘플
처리구 맹장 회장 분
log10No. 생존 살모넬라/g
T1 6.545±0.220a1 7.790±0.577 8.358±0.509a
T2 5.632±0.203b 6.788±0.645 7.434±0.554ab
T3 4.461±0.285c 6.403±0.787 5.882±0.738b
실시예 5: 재조합 락토페린을 함유한 사료 제조
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60를 발효배양하여 얻은 재조합 락토페린을 균체와 함께 사료 첨가제로 사용하여 사료를 제조하였다. 발효배양이 끝난 배양액으로부터 부형제(carrier)로 혼합건조된 사료제품을 사료 총중량에 대해 0.05 ~ 1.5% 범위로 형질전환된 재조합 효모균주와 재조합 락토페린을 혼합하였다.
이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 한우 유래 락토페린 유전자가 도입된 재조합 벡터 pWE로 형질전환된 본 발명 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60을 발효배양하여 재조합 락토페린을 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 및 축산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열목록 1에 기재된 한우 유래 항균성 락토페린 유전자를 플라스미드 벡터 pYES2에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pWE.
  4. 서열목록 1에 기재된 한우 유래 항균성 락토페린 유전자를 플라스미드 벡터 pYES2에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pWE를 효모균주Candida methylicaMXL-6에 도입하여 형질전환시킨 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60(기탁번호 KCTC 8968P).
  5. 삭제
  6. 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60 (기탁번호 KCTC 8968P) 를 플라스크 배지에 접종하여 24시간동안 30℃에서 1차 종 배양한 후 규모를 확대하기위해(scale-up) 상기 1차 종 배양균을 14 ~ 20시간동안 30℃에서 2차 종 배양하면서 10% 글리세롤과 에탄올 0.5 ~ 6%를 첨가하여 항균성 락토페린 분비를 유도한 후 발효기(fermenter)에 상기 2차 종 배양물을 pH 4.0 ~ 6.0인 기초배지에 접종하고 본 배양을 실시함을 특징으로 하는 한우유래의 재조합 항균성 락토페린의 생산방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 플라스크 배지는 YPD 배지, 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 10% 글리세롤, 10% 인산칼륨을 함유하며 상기 기초배지는 리터당 85% 인산 26.7mL, 인산칼륨 10g, 황산마그네슘-7H2O 15g, C-탄소원 40g, PTM 용액 4mL을 함유함을 특징으로 하는 한우유래의 재조합 항균성 락토페린의 생산방법.
  8. 재조합 효모균주Candida methylicaSKL60(기탁번호 KCTC 8968P) 와 상기 재조합 효모균주로부터 생산되는 재조합 항균성 락토페린을 함유하는 것을 특징으로 하는 가축사료.
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