KR20000029180A - 인간 락토페리신 발현용 재조합 효모균주 및 이를 이용한인간 재조합 락토페리신 생산방법 - Google Patents

인간 락토페리신 발현용 재조합 효모균주 및 이를 이용한인간 재조합 락토페리신 생산방법 Download PDF

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복진덕
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Abstract

본 발명은 인간 락토페리신 발현용 재조합 효모균주 및 이를 이용한 재조합 인간 락토페리신 생산방법에 관한 것으로 인간 락토페리신 유전자를 PCR 기법으로 증폭하여 벡터 pPIC9K에 각각 삽입함으로서 재조합 인간 락토페리신 유전자 발현을 위한 재조합 발현벡터 pPICLFCin를 제작하고 이 재조합 발현벡터로 히스티딘 탈수소효소 활성이 결여된 영양요구주 Pichia pastoris GS115 균주를 각각 형질전환시켜 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2(기탁번호 KFCC-11104)를 얻고 이 재조합 효모균주를 발효배양하여 재조합 인간 락토페리신을 대량으로 제조하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

인간 락토페리신 발현용 재조합 효모균주 및 이를 이용한 인간 재조합 락토페리신 생산방법{Recombinant yeast strain for expressing human lactoferricin and process for preparation recombinant human lactoferricin using the same}
본 발명은 인간 락토페리신 발현용 재조합 효모균주 및 이를 이용한 재조합 인간 락토페리신 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 인간 락토페리신 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 Pichia pastoris GS115 효모균주에 도입하여 형질전환시킨 재조합 효모균주를 얻고 이를 발효배양하는 재조합 인간 락토페리신 생산방법에 관한 것이다.
최근 축산 및 식품분야에서 많은 문제를 야기시키고 있는 항생제의 오용 및 잔류성 문제, 즉 축산식품의 항생물질 잔류 및 이로 인한 내성문제 등이 매우 심각하게 대두되고 있는 실정이다. 따라서 축산물의 안정성을 확보하고, 축산물의 생산성을 동시에 제고할 수 있는 항생제 대체물질의 필요성이 절실히 요구되고 있다. 또한 세균감염에 의해 야기되는 여러 질병의 치료를 위해 사용되는 기존의 항생제를 대체할 수 있는 천연항생물질의 대한 요구가 높아지고 있으며, 장내 부패 균총에 대한 광범위한 항균작용 및 여러 가지 생리활성(장내 철 흡수의 조절 및 촉진, 식이철 공급원, 항산화제 효과)을 갖는 천연항생물질 함유 사료첨가제를 개발함으로써 축산에 있어서 사료효율과 증체량 증진 및 고품질 축산물 생산을 도모할 수 있을 것이다.
한편, 락토페리신(lactoferricin)은 광범위한 항미생물 활성을 가지고 있으며 점막부위, 초유 등에서 외부항원에 대한 방어시스템의 중요한 구성성분으로 알려져 있는 락토페린(lactoferrin)의 유도물질로 락토페린보다 항미생물활성이 약 100배 강한 효과적인 펩타이드이다. 이와 같이 광범위한 항미생물효과를 가지고 있는 락토페리신은 항생제의 효능과 유사하여 최근 문제가 되는 항생제 과다사용, 내성문제 및 축산물의 잔류성 문제를 해결할 수 있는 물질이라 사려된다. 이러한 이유 때문에 항생제와 거의 유사한 항미생물 활성을 보이는 락토페리신을 효과적으로 생산하기 위한 발현벡터를 구축하여 이들 재조합 벡터를 이용 Pichia pastoris를 숙주세포로 이용하여 락토페리신을 대량 생산하여 기존항생제 대체 천연항생물질을 개발하여 이를 이용한 천연항생제 락토페리신을 함유한 효모배양(yeast culture)을 개발하고자 한다. 이러한 천연항생물질인 락토페리신을 생산하는 숙주(host)로 사용하는 균주인 메탄올자화(methylotropic) 효모 Pichia pastoris는 메탄올(methanol)에 의해 발현이 정교하게 잘 조절되며 높은 발현율을 가지는 프로모터(promoter)인 AOX1 프로모터를 사용할 수 있다는 장점과 고농도의 세포배양을 할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 즉, AOX1 프로모터의 제어하에 비-메탄올(non-methanolic) 탄소원에서 외래 유전자가 발현정지(expression off) 상태로 유지되다가 메탄올 첨가에 의하여 발현이 시작되어지게 된다. 이러한 P. pastoris의 발현 시스템(system)이 여러 가지 외래 단백질을 생산하는 데 있어서 성공적으로 적용됐는데 특히 종양 회저 인자(Tumor necrosis factor)의 경우는 8g/L, 파상풍 독소 단편 C(Tetanus toxin fragment C)의 경우는 12g/L, 인간 혈청 알부민(Human serum albumin)의 경우는 4g/L 정도의 높은 발현율을 나타냈다.
상기 전술한 바와 같이 축산 및 식품분야에서 많은 문제점을 야기하고 있는 항생제의 문제, 즉 축산식품에 항생물질의 잔류 및 이로 인해 야기되는 내성의 문제 등은 축산물의 안정성을 확보하고, 축산물의 생산성을 동시에 제고하는데 있어서 매우 중요한 문제로 제기되고 있으며 이로인한 항생제 대체물질의 필요성이 절실히 요구되고 있어 본 발명자들은 락토페리신의 대량 제조방법에 관해 연구하였다. 락토페리신은 락토페린으로부터 유도된 물질로서 순수 펩타이드(Peptide)성 물질이다. 펩타이드성 물질은 일반 단백질의 대사경로와 아주 동일한 방법으로 대사된다. 즉 펩타이드를 구성하고 있는 구성성분은 아미노산인데 장내 분해효소들의 작용에 의하여 펩타이드로부터 아미노산으로 분해되어 소장에서 흡수되어 체내에서 이용되거나 또는 분해된 다음 대사되어 체외로 배출된다. 이러한 이유 때문에 항생제와 거의 유사한 항미생물활성을 보이는 락토페리신(lactoferricin)을 생산하는 Pichia pastoris 균주의 개발과 이를 이용한 천연항생물질 락토페리신 함유 효모 배양균(yeast culture)을 개발하였으며 이를 통하여 효모 분자생물학에 있어 새로운 산업용 효모균주를 육종하여 유용 대사산물의 효과적인 생산이 가능하며 나아가 축산업에서 천연항생제 락토페리신 함유 사료첨가제인 효모 배양균(yeast culture) 개발이라는 관점에서 그 산업적 의의와 가치가 크다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 락토페리신(Human lactoferricin) 유전자로 재조합된 벡터 pPICLFCin를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터 pPICLFCin로 Pichia pastoris GS115 효모균주를 형질전환시킨 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 효모균주를 배양하여 재조합 인간 락토페리신을 생산함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 인간 락토페리신 cDNA를 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하여 증폭한 유전자를 발현벡터 pPIC9K에 도입하여 인간 락토페리신 발현을 위한 재조합 발현벡터 pPICLFCin를 구축하고 이 재조합 발현벡터를 히스티딘 탈수소효소 활성이 결여된 영양요구주 Pichia pastoris 효모균주에 도입하여 형질전환시킨 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2를 얻은 후 배양하여 인간 락토페리신 유전자 발현에 따른 단백질의 생성을 조사하고 상기 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2를 발효배양하여 재조합 인간 락토페리신을 대량 생산하여 이를 함유하는 사료를 제조함으로서 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 PCR 증폭하여 얻은 인간 락토페리신 유전자를 pPIC9K 벡터에 도입하여 재조합 발현벡터 pPICLFCin을 제작하는 벡터모식도를 나타낸다.
도 2는 형질전환체로부터 얻은 재조합 인간 락토페리신을 확인하게 위해 아가로스 겔 전기영동한 사진도이다.
본 발명은 히스티딘 탈수소효소(Histidin dehydrogenase) 활성이 결여된 영양요구주 Pichia pastoris GS115 균주를 외래 단백질 생산을 위한 숙주로서 선별하여 배양하는 단계; 프라이머를 이용하여 인간 락토페린 cDNA로부터 25개 아미노산 잔기를 가진 락토페리신에 해당되는 부위를 선택적으로 PCR 증폭하는 단계; 상기 증폭한 인간 락토페리신 cDNA의 시그널 염기서열인 α-메팅 인자 프레-프로 리더 염기서열(MF-α)을 절단하여 변형(modified)시킨 인간 락토페리신 염기서열을 벡터 pPIC9K에 라이게이션시키고 E.coli Top10F' 균주에 도입하여 형질전환시킨 후 이 형질전환체로부터 인간 락토페리신을 발현시킬 수 있는 재조합 발현벡터 pPICLFCin를 분리하는 단계; 상기 재조합 발현벡터 pPICLFCin로 히스티딘 탈수소 활성이 결여딘 Pichia pastoris GS115 효모균주를 형질전환시켜 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2를 얻고 배양하는 단계; 상기 형질전환시키고 배양한 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2 콜로니들을 히스티딘이 포함되지 않은 배지에서 배양하여 형질전환체를 선별하고 이어서 카나마이신(Kanamycin) 저항 유전자의 G418에 대한 저항성을 이용해 2차로 형질전환체를 선별하여 상기 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2의 콜로니들이 형질전환체임을 검정하는 단계; 상기 형질전환체 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2를 배양한 후 1차로 배양액을 원심분리하여 얻은 배양상층액을 농축하고 SDS-PAGE를 실시하여 인간 락토페리신의 단백질 발현을 확인하고 2차로 Pichia pastoris의 염색체 DNA내로 인간 락토페리신 유전자가 도입됨을 PCR로 확인하고 3차로 생분석 방법으로 인간 락토페릭신의 발현량을 측정하는 단계; 형질전환된 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2를 글리세롤로 프리인덕션(preinduction), 메탄올로 인덕션(induction)하여 발효시키므로써 재조합 인간 락토페리신을 대량 발현시키고 이를 함유하는 사료를 제조하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 인간 락토페리신 유전자는 서울대학교 농업생명과학대학 동물자원과학과 낙농 및 비유생리학 연구실에서 보유하고 있는 인간 락토페린 유전자 cDNA의 전체 염기서열인 2.1kb 클론을 PCR 기법을 이용하여 락토페리신 부위만을 선택적으로 증폭하였다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 락토페리신 생산을 위한 재조합 벡터 및 형질전환된 균주제조
제1공정: 인간 락토페리신의 생산을 위한 최적의 숙죽세포 선별
본 실시예에서는 문헌조사와 KCTC, ATCC 등의 미생물 보유기관을 통하여 히스티딘 탈수소효소(Histidinol dehydrogenase) 활성이 결여된 영양요구주 Pichia pastoris GS115 균주를 공시균주로 이용하였다. Pichia pastoris GS115 균주는 YPD와 같은 복합배지나 히스티딘(histidine)이 첨가된 MM(Minimal methanol) 또는 MD(Minimal Dextrose)배지에서 30℃ 온도로 진탕 배양하거나 평판배양하였다.
제2공정: PCR에 의한 인간 락토페리신 유전자의 증폭
보유하고 있는 인간 락토페린 유전자 cDNA로부터 25개의 아미노산 잔기를 가진 락토페리신(lactoferricin)에 해당되는 부위를 선택적으로 증폭하기 위하여 하기와 같은 프라이머(primer)를 디자인(design)하였다. 또한 증폭된 유전자를 pPIC9K 벡터에 구축(construction)시키기 위하여 벡터가 가지고 있는 복합 클로닝 부위(multi-cloning site)인 SnaBI과 EcoRI 부위에 맞게 디자인(design)하였다.
HindIII SnaBI
Primer A : 5'-GGAAGCTTAAAGATACGTAAAATGCTTCCAATGG-3'
EcoRI
Primer B : 5'-GGGAATTCTCAAAATCTCTTTATGCAGCTG-3'
PCR 조건은 94℃에서 3분간 디내츄레이션(denaturation)시킨 다음 30 사이클(cycle)의 PCR 증폭을 실시하였다. 디내츄레이션(Denaturation)은 95℃, 어닐링(annealing)은 56℃에서 각각 1분씩, 신장(extension)은 72℃에서 130초간 그리고 마지막 사이클에서 마지막 신장(last extension)은 72℃에서 10분간 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 DNA는 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)를 통하여 확인하였다.
제3공정: 발현벡터 구축
상기 2공정에서 PCR를 이용하여 증폭한 락토페리신(lactoferricin)유전자를 SnaBI 과 EcoRI 제한효소처리를 하고, 마찬가지로 pPIC9K 벡터도 동일한 제한효소로 처리한 다음 라이게이션(ligation)시켰다. 라이게이션 산물(Ligation product)을 E. coli TOP10F'균주에 형질 전환하여 형질전환체를 얻었다. 형질 전환된 형질전환체로부터 락토페리신을 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드(recombinant plasmid)인 pPICLFCin 벡터를 분리하였다. 이 벡터 모식도는 도 1에 나타낸 바와 같다.
제4공정: Pichia pastoris로의 형질전환
본 공정에서는 His+Mut+Pichia 균주를 만들기 위해 재조합 벡터 pPICLFCin 를 제한효소 SalⅠ로 절단하였다. 이 경우 선형 DNA(linearized DNA)는 Pichia의 HIS 부위에 삽입(integration)되어 His+Mut+Pichia 균주를 형성한다. 먼저 형질전환을 위해 Pichia pastoris GS115(His-mutant)를 YPD 배지 50mL에 접종하여 30℃에서 하룻밤 배양한 다음 2L 플라스크내 500mL의 YPD 배지에 0.1∼0.5mL의 배양균(culture)를 접종하여 OD600이 1.3∼1.5가 될 때까지 배양하였다. 그리고, 4℃에서 1500 × g로 5분간 원심분리한 후 500mL의 냉각 멸균 증류수로 펠렛(pellet)을 녹인 후 동일한 조건으로 원심분리하고 다시 250mL의 냉각 멸균 증류수로 같은 과정을 반복하였다. 그리고 20mL, 1mL의 1M 솔비톨(sorbitol)을 이용하여 동일한 과정을 반복하여 최종 부피(volume)가 1.5mL이 되는 컴페턴트 세포(competent cell)를 만들었다. 이 컴페턴트 세포(competent cell) 80μL와 재조합 발현벡터 pPICLFCin를 제한효소 Sal I으로 처리한 선형 DNA(linearized DNA) 5-20㎍을 섞어 0.2㎝ 전기천공 큐벳(electroporation cuvette)에 넣고 얼음에서 5분간 배양한 후 1500 볼트, 200Ω에서 전기천공(electroporation)하여 형질 전환시켰다. 그리고 즉시 1mL의 1M 솔비톨(sorbitol)을 붓고 멸균된 1.5mL 원심분리 튜브에 옮긴 후 MD 플레이트에 깔은 후(spreading) 30℃에서 콜로니(colony)가 형성될 때까지 배양하였다.
제5공정: 형질전환체의 선별
본 공정에서는 상기 4공정에서 형성한 콜로니(colony)가 형질전환체인지 여부를 확인하기 위하여 2단계의 선별과정을 거쳤다. 우선 형질전환에 사용된 Pichia 균주가 His-mutant이므로 형질전환체의 경우에만 His+균주이고 형질전환되지 않은 콜로니의 경우 여전히 His-이므로 히스티딘(histidine)이 포함되지 않은 MD(Minimal Dextrose Medium -Histidine; 1.34% YNB, 4×10-5% biotin, 2% dextrose) 플레이트에서 형성된 콜로니를 선택하여 형질전환체를 선별하였다. 다음 단계로 벡터내에 포함되어 있는 카나마이신 내성 유전자(Kanamycin resistant gene)가 G418(Geneticin)에 대해 저항성을 갖기 때문에 이를 이용하여 하기와 같은 방법으로 이차 선별 및 복합 도입 형질전환체(multiple inserts transformant)를 선발(screening)하였다. 우선 다양한 농도(0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 1.75, 2.0, 3.0 및 4.0㎎/mL)의 G418을 포함하는 YPD-G418 플레이트를 만들었고, 각 플레이트에 자란 His+형질전환체 콜로니(transformant colony)위에 1∼2mL의 멸균 증류수를 떨어뜨린 다음 멸균 스프래더(sterile spreader)를 이용하여 His+형질전환체 콜로니(transformant colony)를 재현탁(resuspension)시켰다. 현탁(Suspension)된 세포들을 50mL 원심분리 튜브에 옮긴 후 교반(vortex) 하고 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 세포농도(cell density)를 측정하였다. 측정된 세포 농도(cell density)를 기준으로 농도별 YPD-G418 플레이트에 10만개의 세포를 도말(plating)하였다. 30℃에서 배양하면서 콜로니형성 여부를 확인하였고, 높은 농도의 YPD-G418 플레이트에서 형성된 콜로니들일 수록 보다 많은 카피수(copy number)를 가지고 있음을 알 수 있었다.
제6공정: 형질전환체로부터 인간 락토페리신의 발현여부 조사
본 공정에서는 SDS-PAGE에 의한 방법과 PCR에 의한 유전자 도입여부 조사 및 생분석(Bioassay) 방법에 의해 재조합 인간 락토페리신 발현을 확인하였다. 먼저 형질전환된 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2를 MM 유도배지에서 72시간 동안 배양한 후 배양액 1mL를 원심분리(5,000 rpm, 5분)하여 배양상등액과 균체를 얻었다. 배양상등액을 농축하여 각 10μL을 10% SDS-PAGE한 후 단백질 밴드는 쿠마식 브릴리언트 블루(commassie brilliant blue)로 염색하여 재조합 인간 락토페리신 단백질을 확인하였다. 다음은 Pichia pastoris의 크로모좀 DNA(chromosomal DNA)내로 인간 락토페리신 유전자가 도입되었는지에 여부를 PCR방법에 의하여 확인하였다. 즉, PCR을 통해서 유전자의 도입여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 직접 PCR 선발(direct PCR screening) 방법을 사용하였다. 1.5mL 원심분리 튜브에 10μL의 Pichia pastoris 배양균(culture)를 넣거나 1μL의 배양균과 9μL의 멸균증류수 또는 10μL의 멸균증류수에 단일 콜로니(single colony)를 현탁(suspension)시켰다. 그리고, 5μL의 라이티카아제(lyticase 5U/μL)를 첨가한 후 30℃에서 10분간 배양하였다. 이 샘플을 -70℃에서 10분간 냉각시킨 후 5' AOX1 프라이머와 3' AOX1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. Taq 폴리머라아제(polymerase)를 첨가하기 전에 95℃에서 5분간 디내츄레이션(denaturation)한 후 5ul의 Taq 폴리머레이즈(polymerase 0.15U/μL)를 첨가하고 디내츄레이션(denaturation)은 95℃, 어닐링(annealing)은 54℃, 신장(extension)은 72℃에서 각각 1분간 그리고 마지막으로 신장(last extension)은 72℃에서 5분간 PCR 증폭(amplification)을 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 DNA는 도 2에 나타낸 바와 같이 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통해 확인할 수 있었으며, 2.2kb의 wild-type AOX1 유전자 밴드(gene band)와 약 0.5kb의 락토페리신 유전자 (lactoferricin gene)을 포함한 밴드가 나타났다. 마지막으로 생분석(Bioassay) 방법에 의한 인간 락토페리신의 발현을 조사하였다. 시험 균주(Test organism)로는 E. coli JM109로서 생분석(bioassay)를 실시하기 위하여 LB broth 배지에 1 콜로니를 접종하여 16시간동안 배양하였다. 배양액을 톱 아가(top agar)배지에 접종하기 전에 배양액을 멸균된 증류수를 이용하여 1000배 희석하여 50mL의 톱 아가(top agar)배지에 희석액 100ul를 접종하여 LB 플레이트에 오버레이(overlay)시켰다. 톱 아가(Top agar)가 굳은 다음 디스크 막(disc membrane)을 톱 아가 플레이트(top agar plate)위에 적당한 간격으로 올려놓아 생분석 준비한 후 인간 락토페리신의 발현량을 측정하기 위하여 형질 전환된 Pichia pastoris를 배양한 배양액의 일정량 (20ul가량)을 디스크 막(disc membrane)위에 점적하여 37℃에 16시간 배양하여 성장 저해 지역(growth inhibition zone)의 생성유무로서 인간 락토페리신 (Lactoferricin)의 발현량을 측정하여 인간 락토페리신 발현을 확인하였다.
본 실시예에서는 인간 락토페리신 유전자를 삽입하여 구축한 발현벡터 pPICLFCin에 의해 형질전환된 균주 Pichia pastoris LFC2는 한국종균협회 한국미생물보존센터에 1999년 10월 18일 수탁번호 KFCC-11104로 수탁하였다.
실시예 2: 인간 락토페리신 대량 생산을 위한 Pichia pastoris 발효배양
본 실시예에서 사용한 배지는 하기 표 1과 같으며 발효방법은 형질전환된 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2를 5L 발효기의 발효배지에 접종하여 4% 글리세롤 공급 배치(glycerol feed batch)에서 24시간 배양한 후 4시간 동안 글리세롤로 프리인덕션(preinduction)을 실시하였으며 나중에 메탄올에 의한 인덕션 (induction)은 총 72시간 동안 실시하여 재조합 인간 락토페린신의 생산을 위한 발효를 수행하였다. 발효조건 온도는 30℃에서 pH는 암모니아수를 이용하여 pH 5.0±0.05 범위로 유지하면서 공기유속은 1vvm, 교반은 1000rpm으로 실시하였다. 즉, 형질전환된 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2 균주의 1 콜로니를 20mL의 플라스크 배지(flask medium)가 함유된 100mL 배플 플라스크(baffle flask)에 접종하여 24시간동안 30℃에서 교반하면서 배양하였다. 이를 1차 종 배양균(seed culture)이라 하고, 1차 종 배양균으로부터 2차 종 배양균으로 규모확대(scale up)하기 위하여 100mL의 플라스크 배지(flask medium)를 넣은 500mL 배플 플라스크(baffle flask)에 5mL의 1차 종 배양균(seed culture)를 무균적으로 접종하였다. 이를 다시 16시간동안 30℃에서 교반하면서 배양하였다. 5L 발효기(fermenter)에 2L의 기초 배지(basal medium)를 멸균시킨 후 암모니아수로 pH를 5.0으로 조정한 다음 100mL의 2차 플라스크 종균(flask seed)을 접종하여 발효기(fermenter)에서 본 배양을 실시하였다. 본 배양은 fed-batch type으로 추가적으로 탄소원을 공급하는 방식으로 진행하였다. 발효 조건은 공기 공급량 1 VVM(volume of air per volume of medium per minute), 교반속도 1000 rpm, 온도 30℃, pH 5.0 으로 수행하였다.
Pichia pastoris LFC2 균주 발효를 위한 사용배지
플라스크 배지(Flask medium) 1.34% YNB, 1% 글리세롤, 4.×10-5비오틴
기초배지(Basal medium) 인산(phosphoric acid 85%) 26.7mL, 황산칼슘(calcium sulfate)0.93g, 황산칼륨(potassium sulfate) 18.2g, 황산마그네슘(magnesium sulfate-7H2O) 14.9g, 수산화칼륨(potassium hydroxide)4.13g, C-탄소원(C-source) 40.0g, PTM 용액 4.35ml per liter.
PTM 용액 황산구리-5H2O(cupric sulfate-5H2O) 6.0g, 요오드화 칼륨(potassium iodide) 0.08g, 황산망간-H2O(manganese sulfate-H2O)3.0g, 몰리브덴 나트륨-2H2O(sodium molybdate-2H2O 0.2g,붕산(boric acid) 0.02g, 염화코발트(cobalt chloride) 0.5g,염화아연(zinc chloride) 20.0g, 황화철-7H2O(ferrous sulfate-7H2O)65.0g, 비오틴(biotin) 0.2g, 황산(sulfuric acid) 5.0mL per liter.
공급배지(Feeding medium) 50% 글리세롤, 6mL PTM 용액
유도배지(Induction medium) 100% 메탄올, 12mL PTM 용액
실시예 3: 본 발명 재조합 인간 락토페리신을 함유하는 사료 제조
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 발효배양하여 얻은 본 발명 재조합 인간 락토페리신 뿐만 아니라 균체까지 모두 사료 첨가제로 사용하여 사료를 제조하였다. 발효배양이 끝난 배양액으로부터 균체와 원심분리하여 얻은 상층액을 동결건조하고 동결건조한 형질전환된 재조합 효모균주와 재조합 인간 락토페리신을 대두박, 콩 등이 포함된 사료분말 총량에 대해 0.1 ~ 0.5% 범위로 혼합하였다.
본 발명은 상기 실시예에서 설명한 바와 같이 인간 락토페리신 유전자를 PCR 기법으로 증폭하여 벡터 pPIC9K에 각각 삽입함으로서 재조합 인간 락토페리신 유전자 발현을 위한 재조합 발현벡터 pPICLFCin를 제작하고 이 재조합 발현벡터로 히스티딘 탈수소효소 활성이 결여된 영양요구주 Pichia pastoris GS115 균주를 형질전환시켜 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2(KFCC-11104)를 얻고 이 재조합 효모균주를 발효배양하여 재조합 인간 락토페리신을 대량으로 제조하는 뛰어난 효과가 있으며 상기 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2와 이로부터 얻은 재조합 인간 락토페리신은 사료에 첨가되어 장내 유해균의 증식을 구제하는 천연항생제 대체효과가 있고 가축의 사료효율을 증진시키는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업 및 축산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 인간 락토페리신 유전자를 벡터 pPIC9K에 삽입하여 제작한 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 pPICLFCin.
  2. 인간 락토페리신 유전자를 벡터 pPIC9K에 삽입하여 제작한 상기 제 1 항 기재의 재조합 벡터 pPICLFCin를 Pichia pastoris GS115 효모균주에 도입하여 형질전환시킨 것을 특징으로 하는 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2(기탁번호 KFCC-11104).
  3. 제2항 기재의 재조합 효모군주 Pichia pastoris LFC2(KFCC-11104)를 발효배양하여 얻은 것을 특징으로 하는 재조합 인간 락토페리신.
  4. 제2항 기재의 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2(기탁번호 KFCC-11104)를 4% 글리세롤 공급배치에서 24시간 배양한 후 4시간 동안 글리세롤로 프리인덕션을 실시하고 나중에 메탄올을 도입하여 72시간 동안 30℃에서 발효배양함을 특징으로 하는 제 3 항 기재의 재조합 인간 락토페리신 생산방법.
  5. 제2항 기재의 재조합 효모균주 Pichia pastoris LFC2(KFCC-11104) 또는 제 3 항 기재의 재조합 인간 락토페리신을 함유하는 가축사료.
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