CN102858981B - 重组crm197的高水平表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在细菌宿主中生产重组蛋白的领域。特别是，本发明涉及用于从细菌宿主获得高水平的重组CRM197蛋白的制备方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年3月30日提交的题目为“重组CRM197的高水平表达”的美国专利申请序列号61/319,152的优先权。
发明背景
白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素。产毒菌株含有携带毒素基因的噬菌体溶素原。DT被合成为535个氨基酸的多肽，其经历蛋白水解以形成成熟的毒素。成熟的毒素包含由二硫键连接的两个亚基A和B。由完整DT的C末端部分形成的B亚基使DT能够结合细胞膜并通过细胞膜进入到胞质中。一旦进入细胞，由完整DT的N末端部分形成的酶的A亚基催化延伸因子2(EF-2)的ADP核糖基化。其结果是，EF-2被灭活、蛋白质合成停止和细胞死亡。白喉毒素是高度细胞毒性的，单个分子可以致死细胞，且10ng/kg的剂量可以杀死动物和人。
CRM197蛋白是DT的无毒的、免疫学交叉反应的形式。已研究了其作为DT增强剂或疫苗抗原的潜在用途。CRM197是通过由产毒的β棒状杆菌噬菌体的亚硝基胍诱变构建的非产毒噬菌体β197tox-感染的白喉杆菌产生的。CRM197蛋白具有与DT相同的分子量，但在A亚基中有单碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)的差异。这一单碱基变化导致氨基酸置换(谷氨酸置换为甘氨酸)，并消除了DT的毒性性质。
使用CRM197作为载体蛋白的结合多糖疫苗已批准人体使用。疫苗包括：Menveo(Novartis Vaccines and Diagnostics)(标明用于预防由脑膜炎球菌亚群A、C、Y和W-135引起的侵袭性脑膜炎球菌疾病的疫苗)、Menjugate(Novartis Vaccines)(脑膜炎双球菌C群结合疫苗)、和Prevnar(Wyeth Pharmaceuticals，Inc.)(靶向于肺炎链球菌的七种血清型的儿童肺炎疫苗)和HibTITER(Wyeth)(流感嗜血杆菌b型疫苗)。此外，CRM197具有用作白喉的增强抗原的潜力并正在研究作为用于其它疫苗中的载体蛋白。
用于批准的治疗和研究用途的CRM197高水平表达的方法尚未见报道。CRM197已在例如白喉杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中以数十mg/L的水平表达。单剂Prevnar结合疫苗含有大约20μg CRM197。因此，用于经济地以约1g/L或以上的水平生产CRM197的方法将极大地促进疫苗研究和生产。
发明概述
本发明涉及用于在假单胞菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法，所述方法包括：将编码与指导CRM197蛋白转移到周质的分泌信号融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表达载体中；用所述表达载体转化假单胞菌宿主细胞；并在适合重组CRM197蛋白表达的培养基中培养转化的假单胞菌的宿主细胞；其中所得的可溶性CRM197的产率是每升约1至约12克。
在实施方式中，假单胞菌宿主细胞是至少一种蛋白酶表达缺陷的，或假单胞菌宿主细胞过表达至少一种折叠调节因子。在某些实施方式中，假单胞菌宿主细胞是hslUV-、prc1-、degP1-、degP2-和aprA-。在实施方式中，假单胞菌宿主细胞是hslUV-、prc1-、degP1-、degP2-和aprA-，并且分泌前导序列是Azu、IbpS31A、CupA2或PbpA20V。在其它实施方式中，假单胞菌宿主细胞是hslUV-、prc1-、degP1-、degP2-和aprA-，并且分泌前导肽序列是Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V或Pbp。在其它实施方式中，假单胞菌宿主细胞是Serralysin、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2或AprA表达缺陷的，或假单胞菌宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD。
在具体实施方式中，宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且分泌前导序列是Azu。在其它具体实施方式中，宿主细胞是Serralysin表达缺陷的，并且分泌前导序列是Pbp或Azu。在某些实施方式中，宿主细胞是HslU和HslV表达缺陷的，且分泌前导序列是Pbp或Azu。在再其它实施方式中，假单胞菌宿主细胞是野生型的，且分泌前导序列是Pbp或Azu。
在实施方式中，分泌前导序列是Azu、Pbp、IbpS31A、CupA2或PbpA20V。在其它实施方式中，分泌前导序列是Azu、IbpS31A、CupA2或PbpA20V。
在实施方式中，CRM 197核苷酸序列已对于在假单胞菌宿主细胞中的表达进行优化。
在实施方式中，获得的可溶性CRM197的产率为约0.5g/L、约0.6g/L、约0.7g/L、约0.8g/L、约0.9g/L、约1g/L、约1.5g/L、约2g/L、约2.5g/L、约3g/L、约3.5g/L、约4g/L、约4.5g/L、约5g/L、约5.5g/L、约6g/L、约6.5g/L、约7g/L、约7.5g/L、约8g/L、约8.5g/L、约9g/L、约9.5g/L、约10g/L、约10.5g/L、约11g/L、约12g/L、约0.5g/L至约1g/L、约0.5g/L至约2g/L、约0.5g/L至约3g/L、约0.5g/L至约4g/L、约0.5g/L至约5g/L、约0.5g/L至约6g/L、约0.5g/L至约7g/L、约0.5g/L至约8g/L、约0.5g/L至约9g/L、约0.5g/L至约10g/L、约0.5g/L至约11g/L、约0.5g/L至约12g/L、约1g/L至约2g/L、约1g/L至约3g/L、约1g/L至约4g/L、约1g/L至约5g/L、约1g/L至约6g/L、约1g/L至约7g/L、约1g/L至约8g/L、约1g/L至约9g/L、约1g/L至约10g/L、约1g/L至约11g/L、约1g/L至约12g/L、约2g/L至约3g/L、约2g/L至约4g/L、约2g/L至约5g/L、约2g/L至约6g/L、约2g/L至约7g/L、约2g/L至约8g/L、约2g/L至约9g/L、约2g/L至约10g/L、约2g/L至约11g/L、约2g/L至约12g/L、约3g/L至约4g/L、约3g/L至约5g/L、约3g/L至约6g/L、约3g/L至约7g/L、约3g/L至约8g/L、约3g/L至约9g/L、约3g/L至约10g/L、约3g/L至约11g/L、约3g/L至约12g/L、约4g/L至约5g/L、约4g/L至约6g/L、约4g/L至约7g/L、约4g/L至约8g/L、约4g/L至约9g/L、约4g/L至约10g/L、约4g/L至约11g/L、约4g/L至约12g/L、约5g/L至约6g/L、约5g/L至约7g/L、约5g/L至约8g/L、约5g/L至约9g/L、约5g/L至约10g/L、约5g/L至约11g/L、约5g/L至约12g/L、约6g/L至约7g/L、约6g/L至约8g/L、约6g/L至约9g/L、约6g/L至约10g/L、约6g/L至约11g/L、约6g/L至约12g/L、约7g/L至约8g/L、约7g/L至约9g/L、约7g/L至约10g/L、约7g/L至约11g/L、约7g/L至约12g/L、约8g/L至约9g/L、约8g/L至约10g/L、约8g/L至约11g/L、约8g/L至约12g/L、约9g/L至约10g/L、约9g/L至约11g/L、约9g/L至约12g/L、约10g/L至约11g/L、约10g/L至约12g/L或约11g/L至约12g/L。
本发明涉及用于在假单胞菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法，所述方法包括：将编码与指导CRM197蛋白转移到周质的分泌信号融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表达载体中，用该表达载体转化假单胞菌宿主细胞，并在适合重组CRM197蛋白表达的培养基中培养转化的假单胞菌宿主细胞；其中所得的可溶性CRM197的产率是每升约1至约12克；并且还包括在活性分析中测定重组CRM197蛋白的活性，其中产生的可溶性CRM197的约40％至约100％是活性的。在相关的实施方式中，活性分析是免疫学分析或受体结合分析。
在实施方式中，表达载体包含可操作地连接到蛋白编码序列上的lac衍生启动子(derivative promoter)，且其中所述培养包括使用浓度为约0.02至约1.0mM的IPTG诱导启动子，诱导时的细胞密度是约40至约200个吸光度单位(AU)的光密度，培养物的pH为约6至约7.5，和生长温度为约20至约35℃。
在某些实施方式中，宿主细胞是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。
通过引用引入
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用引入本文，正如各个出版物、专利或专利申请都特别地和单独地说明通过引用引入本文一样。
附图简述
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中详细说明。参照下面给出的利用了本发明原理的说明性实施方式的详细说明和附图可以更好的理解本发明的特征和优势。
图1.示例性的优化CRM197基因的氨基酸和DNA序列。A.氨基酸序列(SEQ ID NO：1)B.DNA序列(SEQ ID NO：2)
图2.CRM197的高通量表达分析。用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析使用如图1B所示的DNA序列表达的CRM 197蛋白。测试的40个CRM197表达菌株的可溶性部分显示于由SDS-CGE数据产生的凝胶样图像。如表6中描述的菌株名称列于各道上方。荧光假单胞菌表达的CRM197在SDS-CGE上作为约为58kDa的单一条带迁移(箭头)。
发明详述
CRM197
交叉反应物质197(CRM197)是由具有错义突变的DT基因产生的白喉毒素变异体。CRM197缺乏ADP-核糖基转移酶(ADPRT)活性，且因此是无毒的。CRM197的基因具有单碱基置换，导致谷氨酸替代甘氨酸结合在第52位残基上(见，例如Bishai等，1987，“High-LevelExpression of a Proteolytically Sensitive Diphtheria Toxin Fragment inEscherichia coli”，J.Bact.169(11)：5140-51，Giannini等，1984，“The Amino-Acid Sequence of Two Non-Toxic Mutants of Diphtheria Toxin：CRM45和CRM197”，Nucleic Acids Research 12(10)：4063-9和GenBank Acc.No.1007216A，全部通过引用引入本文)。
可以通过本领域中已知的方法或通过在白喉杆菌或其它微生物中表达以低水平制备CRM197蛋白。可以从可由很多公开来源包括美国典型培养物保藏中心得到的产生毒素的菌株中获得天然存在的或野生型的白喉毒素。用于在白喉杆菌中产生CRM197蛋白的质粒系统由例如美国专利No.5,614,382，“Plasmid for Production of CRM Protein andDiphtheria Toxin”的描述，其以其整体通过引用引入。
核苷酸序列可使用重组DNA技术(由例如Sambrook等，MolecularCloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，19899描述)制备，且也可以基于由棒状杆菌噬菌体β携带的白喉毒素的野生型结构基因的已知DT核苷酸序列通过定点诱变技术制备(参见，例如，Greenfield等，1993，“Nucleotide Sequence of the Structural Gene forDiphtheria Toxin Carried by Corynebacteriophage 18”，Proc Nat Acad Sci80：6953-7，其通过引用引入)。核苷酸序列可如本文其他地方所述进行优化。
密码子优化
在异源表达系统中，优化步骤可以提高宿主产生外源蛋白的能力。蛋白质表达是由一系列包括那些影响转录、mRNA加工及翻译的稳定性和起始的因素的许多因素控制的。多核苷酸优化步骤可以包括提高宿主产生外源蛋白能力的步骤，以及辅助研究人员有效地设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括，例如，翻译起始区的修饰、mRNA结构元件的改变和不同密码子偏倚性的使用。优化核酸序列以提高在细菌宿主中异源蛋白的表达的方法在本领域中是已知的，并在文献中描述。例如，用于假单胞菌宿主菌株中表达的密码子优化描述在美国专利申请公开号2007/0292918，“Codon Optimization Method”中，其全部内容通过引用并入本文。
因此，优化可以处理异源基因的多种序列特征中的任意一种。作为具体的实例，稀有密码子引起的翻译中止可导致异源蛋白表达的降低。稀有密码子引起的翻译中止包括在目标多核苷酸中存在很少在宿主生物体中使用的密码子可能对蛋白质的翻译有负面影响，因为它们在可用的tRNA池中的缺少。提高宿主生物体中最佳翻译的方法包括可导致稀有宿主密码子从合成的多核苷酸序列中去除的密码子优化。
替代的翻译起始也可以导致异源蛋白表达的降低。替代的翻译起始可包含偶然地包含能够作为核糖体结合位点(RBS)发挥功能的基序的合成多核苷酸序列。这些位点可引起从基因内部位点起始截短蛋白的翻译。降低产生截短蛋白(其可能难以在纯化过程中去除)的可能性的一种方法包括从优化的多核苷酸序列中消除推定的内部RBS序列。
重复引起的聚合酶滑脱可以导致异源蛋白表达的下降。重复引起的聚合酶滑脱涉及表明会引起可产生移码突变的DNA聚合酶的滑脱或口吃(stuttering)的核苷酸序列重复。这样的重复序列也能引起RNA聚合酶的滑脱。在具有高G+C含量偏倚性的生物体中，可以有更高程度的由G或C核苷酸重复构成的重复序列。因此，降低引起RNA聚合酶滑脱的可能性的一种方法包括改变G或C核苷酸的延伸重复序列。
干扰二级结构也可能导致异源蛋白表达的下降。二级结构可以隔离RBS序列或起始密码子，且与蛋白质表达的下降相关。茎-环结构也可以参与转录中止和减弱。优化的多核苷酸序列在核苷酸序列的RBS和基因编码区中可以含有最少的二级结构以允许转录和翻译的改善。
另一种可能影响异源蛋白表达的特征是限制性位点的存在。可以通过除去可能干扰随后转录单位亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点优化多核苷酸序列。
例如，可以通过识别由宿主异源表达所需的氨基酸序列开始优化过程。可以从该氨基酸序列设计候选多核苷酸或DNA序列。在设计合成DNA序列时，密码子选择的频率可以与宿主表达有机体的密码子选择进行比较和稀有宿主密码子可以从合成序列中除去。此外，合成的候选DNA序列可以被修饰以除去不想要的限制性酶切位点，以及添加或移除任何所需的信号序列、接头或非翻译区。可以分析合成DNA序列中可能会干扰的翻译过程的二级结构的存在，如G/C重复序列和茎-环结构。在候选DNA序列合成之前，可以检验优化的序列设计以确认该序列正确编码所需的氨基酸序列。最后，可以使用DNA合成技术合成候选DNA序列，如本领域中已知的那些合成技术。
在本发明的另一个实施方式中，可以使用宿主生物体如荧光假单胞菌中的通用密码子选择来优化异源多核苷酸序列的表达。可以评估在宿主表达系统中被视为对于特定氨基酸优选的稀有密码子的百分比和分布。5％和10％的选择率值可作为确定稀有密码子的临界值。例如，表1中列出的密码子在荧光假单胞菌MB214基因组中的计算出现率小于5％，因而通常避免用于在荧光假单胞菌宿主中表达的优化基因中。
表.1荧光假单胞菌MB214中出现率低于5％的密码子
本发明考虑使用任何CRM197编码序列，包括已针对在所使用的假单胞菌宿主细胞中表达进行优化的任何序列。预想使用的序列可以进行任何程度的优化，包括，但不限于，优化以消除：在假单胞菌宿主细胞中出现率小于5％的密码子、在假单胞菌宿主细胞中出现率小于10％的密码子、稀有密码子引起的翻译中止、推定的内部RBS序列、G或C核苷酸的延伸重复序列、干扰性二级结构、限制性位点或它们的组合。
此外，在本发明的实施中任何有用的分泌前导序列的氨基酸序列可以由任何合适的核酸序列编码。
表达系统
用于在假单胞菌宿主细胞以及可用于本发明的方法中的宿主细胞中表达异源蛋白质的方法(包括可用的调控序列(例如，启动子、分泌前导序列和核糖体结合位点))在下列文献中有描述，例如，题目均为“Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strainswith Improved Yield and/or Quality in the Expression of HeterologousProteins”的美国专利申请公开号2008/0269070和美国专利申请系列号12/610,207、题目为“Expression of Mammalian Proteins in PseudomonasFluorescens”的美国专利申请公开号2006/0040352和题目为“Process forImproved Protein Expression by Strain Engineering”的美国专利申请公开号2006/0110747，通过引用将所有这些文献全文引入。这些出版物中，还描述了可用于实施本发明方法的细菌宿主菌株，其已被工程化以过表达折叠调节因子或其中为了增加异源蛋白质的表达，已引入蛋白酶突变(包括缺失)。
前导序列
前导序列在下列文献中有详细描述：美国专利申请公开号2008/0193974和2010/0048864，题目均为“Bacterial Leader Sequences forIncreased Expression”及美国专利申请公开号2006/0008877，题目为“Expression systems with Sec-secretion”，其全部通过引用引入本文，以及美国专利申请公开号2008/0269070和美国专利申请系列号12/610,207。
表2.示例性分泌前导序列
应该了解，可用于本发明方法中的分泌前导序列并不限于在表2中所公开的那些。
在实施方式中，分泌前导序列是Azu、IbpS31A、CupA2或PbpA20V。在其它实施方式中，分泌前导序列是Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V或Pbp。
天然CRM197通过分泌前导序列从白喉杆菌转运到细胞外间隙，该分泌前导序列被切割以留下GADD的氨基末端序列(SEQ IDNO：21)。为了在荧光假单胞菌中表达后保持CRM197的天然氨基酸末端并确保形成二硫键，将蛋白质靶向于周质间隙。
启动子
根据本发明使用的启动子可以是组成型启动子或调控启动子。常见的可用调控型启动子的实例包括那些源自lac启动子(即lacZ启动子)家族的启动子，尤其是在DeBoer的美国专利号4,551,433中描述的tac和trc启动子，以及Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5和T7lac启动子。在一个实施方式中，所述启动子不是源自于宿主细胞生物体。在某些实施方式中，所述启动子是源自于大肠杆菌生物体。
根据本发明的方法，诱导型启动子序列可用于调控CRM197的表达。在实施方式中，可用于本发明方法中的诱导型启动子包括那些源自lac启动子(即lacZ启动子)家族的启动子，尤其是在DeBoer的美国专利号4,551,433中描述的tac和trc启动子，以及Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5和T7lac启动子。在一个实施方式中，所述启动子不是源自于宿主细胞生物体。在某些实施方式中，所述启动子是源自于大肠杆菌生物体。
可用于根据本发明的表达系统中非lac型启动子的常见实例包括，例如，表3中所列出的那些启动子。
表3.非-lac启动子的实例
| 启动子 | 诱导剂 |
| PR | 高温 |
| PL | 高温 |
| Pm | 烷基-或卤代-苯甲酸盐 |
| Pu | 烷基-或卤代-甲苯 |
| Psal | 水杨酸盐 |
参见，例如J.Sanchez-Romero&V.De Lorenzo(1999)Manual ofIndustrial Microbiology and Biotechnology(A.Demain&J.Davies，eds.)pp.460-74(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer(2001)CurrentOpinion in Biotechnology，12：439-445和R.Slater&R.Williams(2000Molecular Biology and Biotechnology(J.Walker&R.Rapley，eds.)pp.125-54(The Royal Society of Chemistry，Cambridge，UK))。对于所选择的细菌宿主细胞天然的启动子的核苷酸序列的启动子也可用于控制编码靶多肽的转基因的表达，例如，假单胞菌邻氨基苯甲酸或苯甲酸操纵子启动子(Pant，Pben)。也可使用串联启动子，其中超过一个启动子与另一个启动子共价连接，无论序列相同或不同，例如，Pant-Pben串联启动子(启动子间杂合体(interpromoter hybrid))或Plac-Plac串联启动子，或无论源自相同或不同的生物体。
为了控制启动子作为其部分的基因的转录，调控启动子利用了启动子调控蛋白。在本发明中使用调控启动子的情况下，相应的启动子调控蛋白也是根据本发明的表达系统的部分。启动子调控蛋白的实例包括：激活剂蛋白，例如，大肠杆菌分解代谢物激活剂蛋白、MalT蛋白；AraC家族转录激活因子；阻遏蛋白，例如，大肠杆菌LacI的蛋白；和双重功能的调控蛋白，如大肠杆菌NagC蛋白。本领域已知许多调控启动子/启动子调控蛋白对。在一个实施方式中，靶蛋白和目标异源蛋白的表达构建体是在相同调控元件的控制下。
启动子调控蛋白与效应子化合物(即，可逆或不可逆地与调控蛋白结合的化合物)相互作用，以使该蛋白质能够脱离或结合处于该启动子控制下的基因的至少一个DNA转录调控区域，从而允许或阻断启动基因转录的转录酶的作用。效应子化合物被分类为诱导物或共阻遏物，且这些化合物包括天然的效应子化合物和安慰诱导物化合物。本领域已知很多调控启动子/启动子调控蛋白/效应子化合物三元组合。虽然效应子化合物可以用在整个细胞培养或发酵过程中，但在其中在宿主细胞生物质生长到所需数量或密度后才使用调控启动子的优选实施方式中，将效应子化合物加到培养物中直接或间接导致编码目标蛋白质或多肽的所需基因的表达。
在其中利用lac家族启动子的实施方式中，lacI基因也可以存在于系统中。lacI基因(其正常情况下是组成型表达的基因)编码Lac阻遏蛋白LacI蛋白，其结合lac家族启动子的lac操纵子。因此，在使用lac家族启动子的的情况下，lacI基因也可以包括并在表达系统中表达。
在假单胞菌中可用的启动子系统被描述在文献中，例如，美国专利申请公开号2008/0269070，也在上引用献。
其他调控元件
在实施方式中，产生过程中可溶性蛋白质存在于细胞质或细胞周质中。用于蛋白靶向的分泌前导序列在本文其他地方及文献美国专利申请公开号2008/0193974、美国专利申请公开号2006/0008877和美国专利申请系列号12/610,207中进行了描述。
除蛋白编码序列以外，可用于实施本发明方法的表达构建体还可以包括下列可操作地与其连接的调控元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、转录终止子和翻译起始信号和终止信号。根据，例如美国专利申请公开号2008/0269070和美国专利申请系列号12/610,207，可以从可用作表达系统中的宿主的任何物种获得有用的RBS。已知很多特定的和多样的共有RBS，例如D.Frishman等，Gene 234(2)：257-65(8 Jul.1999)和B.E.Suzek等，Bioinformatics 17(12)：1123-30(2001年12月)中或其引用的文献中所描述的那些。此外，可以使用天然的或合成的RBS，例如，EP 0207459(合成的RBS)；O.Ikehata等，Eur.J.Biochem.181(3)：563-70(1989)(AAGGAAG的天然RBS序列)中所描述的那些。本领域已知可用于本发明中的方法、载体及翻译和转录元件以及其它元素的进一步实例，并在例如Gilroy等的美国专利号5,055,294和Gilroy等的美国专利号5,128,130；Rammler等的美国专利号5,281,532；Barnes等的美国专利号4,695,455和4,861,595；Gray等美国专利号4,755,465及Wilcox的美国专利号5,169,760，以及许多其它通过引用整体引入的出版物中有描述。
宿主菌株
细菌宿主(包括假单胞菌属)和密切相关的细菌生物体用来实施本发明的方法。在某些实施方式中，假单胞菌宿主细胞为荧光假单胞菌。宿主细胞也可以是大肠杆菌细胞。
假单胞菌和密切相关的细菌一般是定义为“革兰氏(-)变形菌亚群1”或“革兰氏阴性需氧杆菌和球菌”的部分(Buchanan和Gibbons(eds.)(1974)Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，pp.217-289)。假单胞菌宿主菌株在文献，例如，以上引用的美国专利申请公开号2006/0040352中有描述。
例如，假单孢菌宿主可以包括来自假单胞菌属、Pseudomonasenalia(ATCC 14393)、黑色假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciensi)(ATCC19375)和腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)(其已被分别重新分类为Alteromonas haloplanktis、产黑交替单胞菌(Alteromonasnigrifaciens)和腐败交替单胞菌(Alteromonas putrefaciens))的细胞。类似地，例如，食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)(ATCC 11996)之后被分别重新分类为食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)；黑色假单胞菌(ATCC 19375)和Pseudomonas piscicida(ATCC 15057)被分别重新分类为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)和杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)。
宿主细胞可以选自“革兰氏阴性变形菌亚群16”。“革兰氏阴性变形菌亚组16”被定义为以下的假单胞菌种(在括号中显示示例性菌株的ATCC或其它保藏号)的变形菌群：Pseudomonas abietaniphila(ATCC700689)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909)、鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)(ATCC 33660)、香矛醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)(ATCC 13674)、变黄假单胞菌(Pseudomonasflavescens)(ATCC 51555)、门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)(ATCC 25411)、硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)(ATCC 33634)、食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)(ATCC 8062)、类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)(ATCC 17440)、食树脂假单胞菌(Pseudomonasresinovorans)(ATCC 14235)、稻草假单胞菌(Pseudomonasstraminea)(ATCC 33636)、伞菊假单胞菌(Pseudomonas agarici)(ATCC25941)、嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)、Pseudomonasalginovora、Pseudomonas andersonii、铁角蕨假单胞菌(Pseudomonasasplenii)(ATCC 23835)、Pseudomonas azelaica(ATCC 27162)、Pseudomonas beyerinckii(ATCC 19372)、Pseudomonas borealis、Pseudomonas boreopolis(ATCC 33662)、油菜假单胞菌(Pseudomonasbrassicacearum)、Pseudomonas butanovora(ATCC 43655)、Pseudomonascellulosa(ATCC 55703)、桔黄假单胞菌(Pseudomonas aurantiaca)(ATCC33663)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446、ATCC13985、ATCC 17418、ATCC 17461)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)(ATCC 4973)、海雀假单胞菌(Pseudomonas lundensis)(ATCC49968)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)(ATCC 4683)、青紫菖假单胞菌(Pseudomonas cissicola)(ATCC 33616)、晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)、Pseudomonas diterpeniphila、伸长假单胞菌(Pseudomonas elongata)(ATCC 10144)、弯曲假单胞菌(Pseudomonasflectens)(ATCC 12775)、生氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、布氏假单胞菌(Pseudomonas brenneri)、Pseudomonas cedrella、起皱假单胞菌(Pseudomonas corrugata)(ATCC 29736)、Pseudomonasextremorientalis、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC35858)、Pseudomonas gessardii、Pseudomonas libanensis、孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)(ATCC 700871)、边缘假单胞菌(Pseudomonasmarginalis)(ATCC 10844)、米氏假单胞(Pseudomonas migulae)、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)(ATCC 4685)、Pseudomonasorientalis、Pseudomonas rhodesiae、产黄假单胞菌(Pseudomonassynxantha)(ATCC 9890)、托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)(ATCC33618)、威隆假单胞菌(Pseudomonas veronii)(ATCC 700474)、弗雷德里克斯堡假单胞菌(Pseudomonas frederiksbergensis)、弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)(ATCC 19374)、Pseudomonas gingeri、Pseudomonas graminis、格氏假单胞菌(Pseudomonas grimontii)、Pseudomonas halodenitrificans、嗜盐假单胞菌(Pseudomonas halophila)、栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)(ATCC 19867)、赫替假单胞菌(Pseudomonas huttiensis)(ATCC 14670)、噬氢假单胞菌(Pseudomonashydrogenovora)、Pseudomonas jessenii(ATCC 700870)、Pseudomonaskilonensis、柳叶刀假单胞菌(Pseudomonas lanceolata)(ATCC 14669)、亚麻假单胞菌(Pseudomonas lini)、划界假单胞菌(Pseudomonasmarginata)(ATCC 25417)、臭味假单胞菌(Pseudomonas mephitica)(ATCC33665)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)(ATCC 19244)、穿孔假单胞菌(Pseudomonas pertucinogena)(ATCC 190)、皮克特假单胞菌(Pseudomonas pictorum)(ATCC 23328)、Pseudomonas psychrophila、黄褐假单胞菌(Pseudomonas filva)(ATCC 31418)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)(ATCC 700476)、Pseudomonas mosselii、栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)(ATCC 43272)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)(ATCC 700383)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(ATCC 12633)、Pseudomonas reactans、多刺假单胞菌(Pseudomonas spinosa)(ATCC 14606)、巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)(ATCC43273)；.施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588)、扁桃假单胞菌(Pseudomonas amygdali)(ATCC 33614)、Pseudomonas avellanae(ATCC700331)、番木瓜假单胞菌(Pseudomonas caricapapayae)(ATCC 33615)、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)(ATCC 10857)、天仙果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae)(ATCC 35104)、褐鞘假单胞菌(Pseudomonasfuscovaginae)、苦楝假单胞菌(Pseudomonas meliae)(ATCC 33050)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(ATCC 19310)、绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)(ATCC 13223)、Pseudomonasthermocarboxydovorans(ATCC 35961)、耐热假单胞菌(Pseudomonasthermotolerans)、赛维瓦尔假单胞菌(Pseudomonas thivervalensis)、温哥华假单胞菌(Pseudomonas vancouverensis)(ATCC 700688)、Pseudomonaswisconsinensis和厦门假单胞菌(Pseudomonas xiamenensis)。
宿主细胞也可以选自“革兰氏阴性变形菌亚群17”。“革兰氏阴性变形菌亚群17”被定义为本领域中已知为“发荧光的假单胞菌”的变形菌群，包括，例如属于下列假单胞菌种的那些：生氮假单胞菌、布氏假单胞菌、Pseudomonas cedrella、起皱假单胞菌、Pseudomonasextremorientalis、荧光假单胞菌、Pseudomonas gessardii、Pseudomonaslibanensis、孟氏假单胞菌、边缘假单胞菌、米氏假单胞菌、霉味假单胞菌、Pseudomonas orientalis；Pseudomonas rhodesiae、产黄假单胞菌、托拉斯假单胞菌和威隆假单胞菌。
可以使用本领域已知的或以其整体引入作为参考的文献，例如美国专利申请公开号2009/0325230，″Protein Expression Systems″中描述的试剂和方法鉴别或制备可用于实施本发明方法的宿主细胞和构建体。该出版物描述了通过将核酸构建体引入到含有染色体lacI基因插入的营养缺陷型荧光假单胞菌宿主细胞中产生重组多肽。该核酸构建体包含与启动子可操作地连接的编码重组多肽的核苷酸序列，该启动子能够指导宿主细胞中核酸的表达，构建体也包括编码营养缺陷型选择标记的核苷酸序列。营养缺陷型选择标记是对于营养缺陷型宿主细胞恢复原养型的多肽。在实施方式中，该细胞是脯氨酸、尿嘧啶或其组合营养缺陷的。在实施方式中，宿主细胞源自MB101(ATCC保藏号PTA-7841)。美国专利申请公开号2009/0325230，“Protein Expression Systems”和Schneider等，2005，″Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibioticmarkers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonasfluorescens fermentation，″Biotechnol.Progress 21(2)：343-8(这两篇文献以其整体引入作为参考)描述了通过删除MB101菌株中的pyrF基因构建的尿嘧啶营养缺陷型宿主菌株的产生。从菌株MB214(ATCC保藏号PTA-7840)克隆pyrF基因以生成能够补充pyrF缺失的质粒以恢复原养型。在特定实施方式中，在荧光假单胞菌的宿主细胞中使用双重pyrF-proC双营养缺陷型选择标记系统。如所描述的pyrF产生宿主菌株可以用作用于引入其它所需的基因组变化的背景，包括本文所述为可用于实施本发明的方法的那些。
在实施方式中，假单胞菌宿主细胞为HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、AprA或它们的组合的表达缺陷的。在实施方式中，宿主细胞为蛋白酶HslU、HslV、Ppc1、DegP1、DegP2和AprA表达缺陷的。这种菌株的实例本文中描述为DC1100。这些蛋白酶在本领域中已知，并在例如美国专利申请公开号2006/0110747中有描述。AprA，一种细胞外serralysin型金属蛋白酶金属蛋白酶，由Maunsell等，2006，“Complexregulation of AprA metalloprotease in Pseudomonas fluorescens M114：evidence for the involvement of iron，the ECF sigma factor，PbrA andpseudobactin M114 siderophore，Microbiology 152(Pt 1)：29-42及美国专利申请公开号2008/0193974和2010/0048864中有描述。
在其它实施方式中，假单胞菌宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD。DsbA、B、C和D是二硫键异构酶，在例如美国专利申请公开号2008/0269070和美国专利申请序列号12/610,207中描述。
在其它实施方式中，假单胞菌的宿主细胞是野生型的，即没有蛋白酶表达缺陷，且也不过表达任何折叠调节因子。
蛋白酶表达缺陷的宿主细胞可以具有导致相对于野生型宿主，该蛋白酶的正常活性或表达水平下降的任何修饰。例如，错义或无义突变可导致非活性的蛋白质的表达，且基因缺失可以导致完全没有蛋白质的表达。该基因的上游调节区域的变化可以导致蛋白表达减少或不表达。其他的基因缺陷可影响蛋白质的翻译。蛋白酶的表达也可以是缺陷的，如果对于加工该蛋白酶所需的蛋白质的活性是缺陷的。
可用于本发明的方法中的蛋白酶和折叠调节因子的实例分别显示于表4和表5中。RXF号是指开放阅读框(参见，例如美国专利申请公开号2008/0269070和美国专利申请序列号12/610,207)。
表4.荧光假单胞菌菌株MB214蛋白酶
某些蛋白酶可以有蛋白酶和伴侣蛋白样活性。当这些蛋白酶对蛋白质的产率和/或质量造成负面影响时，删除他们可能是有利的，且当他们的伴侣蛋白活性对蛋白产率和/或质量产生正面影响时，可以将他们过表达。这些蛋白酶包括，但不限于：Hsp100(Clp/Hsl)家族成员RXF04587.1(clpA)、RXF08347.1、RXF04654.2(clpX)、RXF04663.1、RXF01957.2(hslU)、RXF01961.2(hslV)；肽酰-脯氨酰-顺-反式异构酶家族成员RXF05345.2(ppiB)；金属肽酶M20家族成员RXF04892.1(氨基水解酶)；金属肽酶M24家族成员RXF04693.1(甲硫氨酸氨肽酶)和RXF03364.1(甲硫氨酸氨肽酶)及丝氨酸肽酶S26信号肽酶I家族成员RXF01181.1(信号肽酶)。
表5.荧光假单胞菌菌株MB214蛋白折叠调节因子
发酵模式
根据本发明的表达系统可以以任何发酵模式培养。例如，分批、补料分批、半连续和连续发酵模式可以用于本发明中。
在实施方式中，发酵培养基可以选自丰富培养基、基本培养基和矿物盐培养基。在其它实施方式中，可以选择基本培养基或矿物盐培养基。在某些实施方式中，可以选择矿物盐培养基。
矿物盐培养基由矿物盐和碳源组成，例如，葡萄糖、蔗糖或甘油。矿物盐培养基的实例包括，例如，M9培养基、假单胞菌培养基(ATCC 179)及Davis和Mingioli培养基(见B D Davis&E S Mingioli(1950)J.Bact.60：17-28))。用于制备矿物盐培养基的矿物盐包括选自以下的那些：例如，磷酸钾、硫铵酸盐或氯化铵、硫酸镁或氯化镁及微量矿物质，如氯化钙、硼酸盐及铁、铜、锰和锌的硫酸盐。通常情况下，矿物盐培养基中没有有机氮源，如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物。相反，使用无机氮源，且其可以选自例如，铵盐、氨水以及气态氨。矿物盐培养基中通常会包含葡萄糖或甘油作为碳源。在矿物盐培养基相比，基本培养基也可以包含矿物盐和碳源，但可补充，例如，低水平的氨基酸、维生素、蛋白胨或其它成分，尽管这些成分以非常低的水平添加。可以使用本领域，例如，美国专利申请公开号2006/0040352、上述引用和引入的文献中描述的方法制备培养基。可用于本发明的方法中的培养过程和矿物盐培养基的细节见Riesenberg，D等，1991，″High cell density cultivation of Escherichia coli at controlledspecific growth rate，″J.Biotechnol.20(1)：17-27中的描述。
在实施方式中，可以在生物反应器培养中进行生产。通过添加氨，培养物可以在例如，含有矿物盐培养基的最多2升的生物反应器中生长，并维持温度为32℃和pH值为6.5。通过增加搅拌并进入到发酵罐中的鼓泡空气和氧气流使溶解氧保持过量。甘油可以在整个发酵过程中输送到培养基物以维持在过量水平。在实施方式中，保持这些条件直到达到用于诱导的培养细胞目标密度，例如，575nm(A575)的光密度，此时添加IPTG以开始靶蛋白生产。可以理解，可以各自改变诱导时的细胞密度、IPTG浓度、pH值和温度以确定最佳表达条件。在实施方式中，诱导时的细胞密度变化范围是40至200个吸光度单位(AU)的A575。IPTG浓度的变化范围为0.02至1.0mM、pH变化范围为6-7.5、温度变化范围为20到35℃。16-24小时后，通过离心从来自各生物反应器收获培养物，且细胞沉淀可以在-80℃下冷冻。可通过例如SDS-CGE分析样品的产物形成。
发酵可以以任何规模进行。根据本发明的表达系统可用于任何规模的重组蛋白表达。因此，可以使用，例如微升规模、毫升规模、厘升规模、分升规模的发酵体积，且可以使用1升规模和更大的发酵体积。
在实施方式中，发酵体积约为1升或大于1升。在实施方式中，发酵体积为约1升至约100升。在实施方式中，发酵体积为约1升、约2升、约3升、约4升、约5升、约6升、约7升、约8升、约9升或约10升。在实施方式中，发酵体积为约1升至约5升、约1升至约10升、约1升至约25升、约1升至约50升、约1升至约75升、约10升至约25升、约25升至约50升或约50升至约100升。在其它实施方式中，发酵体积大约为或大于5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1000升、2000升、5000升、10000升或50,000升。
产物的验证
本领域已知用于表征蛋白的多种分析方法。本文考虑使用用于表征重组CRM197的产率或质量的任何适当的方法。
蛋白质产率
可以通过本领域技术人员已知的方法测定本文所述的任何纯化部分中的蛋白质产率，例如，通过毛细管凝胶电泳(CGE)和Western印迹分析。如本文所述的和本领域中已知的，活性测定也可以提供涉及蛋白质产率的信息。
可用的蛋白质产率的量度包括，例如，每体积培养物的重组蛋白质量(例如，克或毫克蛋白质/升培养物)、细胞裂解后得到的不溶性沉淀中测定的重组蛋白质的百分比或分数(例如，提取的上清液中重组蛋白质的量/不溶性成分中蛋白质的量)、活性蛋白的百分比或分数(例如，活性蛋白的量/分析中使用的蛋白质量)、总细胞蛋白质(tcp)的百分比或分数、蛋白质量/细胞和干生物质的百分比或比例。
在其中产率用培养物体积表示的实施方式中，可以考虑培养物细胞密度，尤其是在不同培养物之间进行产率比较时。
在实施方式中，本发明的方法可以用于获得的重组CRM197蛋白产率为大约1克每升至大约12克每升。在实施方式中，产率是约0.5克每升至约12克每升。在某些实施方式中，重组蛋白产率为约0.5g/L、约0.6g/L、约0.7g/L、约0.8g/L、约0.9g/L、约1g/L、约1.5g/L、约2g/L、约2.5g/L、约3g/L、约3.5g/L、约4g/L、约4.5g/L、约5g/L、约5.5g/L、约6g/L、约6.5g/L、约7g/L、约7.5g/L、约8g/L、约8.5g/L、约9g/L、约9.5g/L、约10g/L、约10.5g/L、约11g/L、约12g/L、约0.5g/L至约1g/L、约0.5g/L至约2g/L、约0.5g/L至约3g/L、约0.5g/L至约4g/L、约0.5g/L至约5g/L、约0.5g/L至约6g/L、约0.5g/L至约7g/L、约0.5g/L至约8g/L、约0.5g/L至约9g/L、约0.5g/L至约10g/L、约0.5g/L至约11g/L、约0.5g/L至约12g/L、约1g/L至约2g/L、约1g/L至约3g/L、约1g/L至约4g/L、约1g/L至约5g/L、约1g/L至约6g/L、约1g/L至约7g/L、约1g/L至约8g/L、约1g/L至约9g/L、约1g/L至约10g/L、约1g/L至约11g/L、约1g/L至约12g/L、约2g/L至约3g/L、约2g/L至约4g/L、约2g/L至约5g/L、约2g/L至约6g/L、约2g/L至约7g/L、约2g/L至约8g/L、约2g/L至约9g/L、约2g/L至约10g/L、约2g/L至约11g/L、约2g/L至约12g/L、约3g/L至约4g/L、约3g/L至约5g/L、约3g/L至约6g/L、约3g/L至约7g/L、约3g/L至约8g/L、约3g/L至约9g/L、约3g/L至约10g/L、约3g/L至约11g/L、约3g/L至约12g/L、约4g/L至约5g/L、约4g/L至约6g/L、约4g/L至约7g/L、约4g/L至约8g/L、约4g/L至约9g/L、约4g/L至约10g/L、约4g/L至约11g/L、约4g/L至约12g/L、约5g/L至约6g/L、约5g/L至约7g/L、约5g/L至约8g/L、约5g/L至约9g/L、约5g/L至约10g/L、约5g/L至约11g/L、约5g/L至约12g/L、约6g/L至约7g/L、约6g/L至约8g/L、约6g/L至约9g/L、约6g/L至约10g/L、约6g/L至约11g/L、约6g/L至约12g/L、约7g/L至约8g/L、约7g/L至约9g/L、约7g/L至约10g/L、约7g/L至约11g/L、约7g/L至约12g/L、约8g/L至约9g/L、约8g/L至约10g/L、约8g/L至约11g/L、约8g/L至约12g/L、约9g/L至约10g/L、约9g/L至约11g/L、约9g/L至约12g/L、约10g/L至约11g/L、约10g/L至约12g/L或约11g/L至约12g/L.
在某些实施方式中，产生的重组蛋白的量占总细胞蛋白质的约1％至75％。在某些实施方式中，产生的CRM 197的量为总细胞蛋白质的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约1％至约5％、约1％至约10％、约1％至约20％、约1％至约30％、约1％至约40％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约75％、约2％至约5％、约2％至约10％、约2％至约20％、约2％至约30％、约2％至约40％、约2％至约50％、约2％至约60％、约2％至约75％、约3％至约5％、约3％至约10％、约3％至约20％、约3％至约30％、约3％至约40％、约3％至约50％、约3％至约60％、约3％至约75％、约4％至约10％、约4％至约20％、约4％至约30％、约4％至约40％、约4％至约50％、约4％至约60％、约4％至约75％、约5％至约10％、约5％至约20％、约5％至约30％、约5％至约40％、约5％至约50％、约5％至约60％、约5％至约75％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约75％、约20％至约30％、约20％至约40％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约75％、约30％至约40％、约30％至约50％、约30％至约60％、约30％至约75％、约40％至约50％、约40％至约60％、约40％至约75％、约50％至约60％、约50％至约75％、约60％至约75％或约70％至约75％。活性
虽然与质量相关，蛋白质的“溶解性”和“活性”一般通过不同的方式来测定。蛋白质的溶解性，特别是疏水蛋白，通常与蛋白质的折叠相关；不溶性表示疏水性氨基酸残基不适当地位于折叠蛋白的外侧。蛋白质的活性(它可以使用例如，下面所描述的方法进行评价)是适当蛋白质构象的另一个指标。本文所用“可溶性的、活性的或这两者”是指通过本领域技术人员已知的方法确定为可溶的、活性的或同时为可溶的和活性的蛋白质。给定蛋白质的“活性”可以包括结合活性，例如，以与受体、特异性抗体或另一已知底物结合或通过酶活性(如果相关)表现的活性。活性水平可以例如，就绝对或相对意义来描述，如相比于标准或对照样品或作为基准使用的任何样品的活性时。
用于评估CRM197的活性测定方法是本领域已知的，并在文献中有描述。活性测定方法包括免疫学分析，例如，Western印迹分析和ELISA，以及受体结合试验，如白喉毒素受体(proHB-EGF)结合。因此，活性的测定能体现抗体或受体结合能力。
在实施方式中，活性表示为与分析的总量相比，提取物上清液中活性重组CRM197蛋白的％。这是基于相对于在分析中使用的重组CRM197蛋白的总量，确定为活性的重组CRM197蛋白的量。在其它实施方式中，活性以与标准品(例如，天然蛋白质)相比该蛋白质的％活性水平表示。这是基于相对于标准样品中活性蛋白质的量，上清提取物样品中活性重组CRM197蛋白的量(其中，来自各样品的相同量的蛋白质被用于分析中)。
在实施方式中，约40％至约100％的CRM197蛋白被确定为活性的。在实施方式中，约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的重组CRM197蛋白确定为活性的。在实施方案中、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约40％至约90％、约40％至约95％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约60％至约90％、约60％至约95％、约60％至约100％、约70％的至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％或约70％至约100％的重组CRM197蛋白被确定为活性的。
在其它实施方式中，约75％至约100％的重组CRM197蛋白确定为活性的。在实施方式中，约75％至约80％、约75％至约85％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约85％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约85％至约90％、约85％至约95％、约85％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％或约95％至约100％的重组CRM197蛋白确定为活性的。
确认诱导的蛋白质的身份的方法在本领域中也是已知的。例如，蛋白质可以通过使用MALDI-TOF质谱仪的肽质量指纹图谱、N-末端测序分析或肽谱法进行分析。
虽然本发明的优选实施方式中已经显示和描述，本领域技术人员将会很明白，这些实施方式仅作为实施例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员将会想到多种变化、改变和替换。应当了解在本发明的实施过程中，对本文描述的本发明的实施方式可以进行各种改动。意图的是下面的权利要求限定本发明的范围，从而涵盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
实施例
实施例1：重组CRM197蛋白的高通量表达
构建CRM197表达菌株，并用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析在菌株中产生的可溶性CRM197蛋白的量。基于所获得的数据，选择特定的菌株用于大规模表达。
CRM197表达菌株的构建和生长
使用荧光假单胞菌的优先密码子构建CRM 197编码序列来编码CRM 197氨基酸序列。图1显示表达的合成CRM 197基因的氨基酸序列和DNA序列。
使用标准的分泌前导序列和宿主菌株组。构建与如表6中所示的10个荧光假单胞菌分泌前导序列融合的携带密码子优化的CRM197序列的质粒。前导序列被包括以将蛋白质靶向于周质，从而在此处以正确折叠的和活性的形式回收。
表6.用于CRM197表达筛选的分泌前导序列
| 道 | 分泌前导序列 |
| 1 | DsbA |
| 2 | Azu |
| 3 | Ibp-S31A |
| 4 | Tpr |
| 5 | CupB2 |
| 6 | CupA2 |
| 7 | NikA |
| 8 | Pbp A20V |
| 9 | DsbC |
| 10 | TolB |
在荧光假单胞菌宿主中测试包含与重组CRM197蛋白融合的10个分泌前导序列的构建体。如表7所列出的4个宿主用各个前导序列进行测试。用标明的质粒电穿孔转化宿主细胞，在具有微量矿物质和5％甘油的HTP生长培养基中重悬，然后转移到含有400μl M9盐1％葡萄糖培养基和微量元素的96孔深孔板中。96-孔板在30℃下振荡孵育48小时。将10μl的40个种培养基中的各个一式三份转移至96孔深孔板中，每孔含有500μl的补充有微量元素和5％甘油的HTP培养基，并如前所述孵育24小时。
表7.用于CRM197表达筛选的宿主菌株
| 菌株名称 | 基因型 | 类型 |
| DC1073 | Lon-，La-，aprA- | PD |
| DC1100 | hslUV-，prc1-，degP1-，degP2-，aprA- | PD |
| DC1125 | dsbABCD | FMO |
| DC462 | grpE，dnaKJ | FMO |
PD＝蛋白酶缺失；FMO＝折叠调节因子过表达者
向各孔中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)达到终浓度0.3mM以诱导靶蛋白的表达。向各孔中加入甘露醇(Sigma，M1902)达到终浓度1％以在折叠调节因子过表达菌株中诱导折叠调节因子的表达，且温度下降至25℃。诱导后24小时，使用PBS以400μl的体积将细胞标准化至OD600＝15。冷冻样品用于通过超声和离心进行后续处理，以生成可溶性和不溶性部分。
样品制备和SDS-CGE分析
通过超声处理OD标准化的培养物后进行离心来制备可溶性和不溶性细胞部分。解冻冷冻的标准化的培养液(400μL)，并超声处理3.5分钟。以20,800×g离心裂解物20分钟(4℃)，并用手动或自动液体处理除去上清液(可溶性部分)。冷冻沉淀(不溶性部分)，然后解冻以用20,080xg在4℃下再离心20分钟，从而除去残留的上清液。然后再将沉淀重悬于400μL的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH值为7.4中。在pH值为7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进一步稀释可溶性和不溶性样品用于SDS-CGE分析。在二硫苏糖醇(DTT)存在下制备可溶性和不溶性样品用于SDS毛细管凝胶电泳(CGE)(Caliper LifeSciences，Protein Express LabChip Kit，Part 760301)。
来自表达靶蛋白的各菌株的可溶性部分通过译解SDS CGE分析进行了分析。典型的凝胶样图像如图2所示。表8示出了构建的各CRM197表达菌株的3个重复的平均可溶性CRM197产率和标准差。也对于各菌株标明了用于筛选的宿主菌株和分泌前导序列。
前导序列和宿主菌株都对CRM197的表达表现出显著影响。以0.5毫升的规模，表达产率范围为从检测不到至1.2克/升，在DC1100宿主背景中观察到最高表达水平。在CS538-746中观察到的产率为1263毫克/升，在CS538-742中为1241mg/L，二者均远远超过平均产率340毫克/升。在同一宿主菌中观察到高和低的产率，这取决于所使用的前导序列，且在不同宿主菌株中使用相同的前导序列观察到高和低的产率。
选择CS538-742、CS538-743、CS538-746、CS538-748、CS538-752用于大规模发酵。
表8.CRM197表达菌株的平均CRM197产率
实施例2：重组CRM197蛋白的大规模表达
荧光假单胞菌Pfēnex Expression TechnologyTM菌株CS538-742，CS538-743、CS538-746、CS538-748、CS538-752在2升的发酵罐中产生重组CRM197蛋白。
通过添加氨盐，使培养物在含有本文和也在例如Riesenberg，D.等，1991中所描述的矿物盐培养基的2升发酵罐中生长，温度维持在32℃，pH值为6.5。通过增加搅拌和进入到发酵罐中的鼓泡空气和氧气流使溶解氧保持过量。在整个发酵过程中向培养物中输送甘油以维持过量水平。保持这些条件直到达到用于诱导的目标培养细胞密度(575nm的吸光度(A575))，此时添加IPTG以开始产生靶蛋白。以0.5mM的浓度添加IPTG以开始产生CRM197。16-24小时后，通过离心收获各生物反应器的培养物，并将细胞沉淀在-80℃下冷冻。通过SDS-CGE分析样品的产物形成，并通过Western印迹分析其活性。
大规模发酵培养(例如，约1升或以上)的产率通常高于小HTP培养物所获得的产率。基于上述HTP表达数据，预期大规模发酵产率为约0.5至至少10g/L。
Claims (5)
1.用于在荧光假单胞菌宿主细胞中产生重组CRM197蛋白的方法，所述方法包括：
将编码与指导CRM197转移到周质的分泌信号融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表达载体中；
用该表达载体转化所述荧光假单胞菌宿主细胞；
在适合所述重组CRM197蛋白表达的培养基中培养转化的假单胞菌宿主细胞；
其中当以0.5ml规模培养时，所述荧光假单胞菌宿主细胞产生0.105-1.263克每升的可溶性CRM197；
其中所述荧光假单胞菌宿主细胞选自：
Lon、La和AprA的表达缺陷的、其中所述分泌信号为DsbA、Azu、Ibp-S31A、Tpr、CupA2、NikA、Pbp A20V或TolB的宿主细胞；
HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2和AprA的表达缺陷的、其中所述分泌信号为DsbA、Azu、Ibp-S31A、Tpr、CupB2、CupA2、NikA、Pbp A20V、DsbC或TolB的宿主细胞；
过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD、其中所述分泌信号为DsbA、Azu、Ibp-S31A、Tpr、CupA2、Pbp A20V或DsbC的宿主细胞；和
过表达GrpE、DnaK和DnaJ，其中所述分泌信号为DsbA的宿主细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列已对于在假单胞菌宿主细胞中表达进行优化。
3.权利要求1所述的方法，还包括在活性分析中测定重组CRM197蛋白的活性，其中40％至100％所产生的可溶性CRM197确定为活性的。
4.权利要求4所述的方法，其中所述活性分析是免疫学分析或受体结合分析。
5.权利要求1所述的方法，其中所述表达载体包含可操作地连接到所述蛋白编码序列的lac衍生启动子，且其中所述培养包括使用浓度为0.02至1.0mM的IPTG诱导启动子，诱导时的细胞密度是40至200个吸光度单位(AU)的光密度，培养物的pH是从6至7.5，和生长温度为20至35℃。
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