CN1142280C - 改进的蛋白质原核表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的原核表达系统和由其表达的蛋白质。已表明枯草芽孢杆菌基因组中的wprA基因的调节的表达或改变能够增强选择的天然的,异源的或重组的多肽的分泌。这种改变提供了一种方法,使得与携带野生型拷贝的wprA基因的菌林相比能够增加分泌多肽的产量。

Description

改进的蛋白质原核表达
技术领域
本发明涉及一种新的原核表达系统及由其表达的蛋白质。
背景技术
蛋白质的工业生产在很多情况下利用了天然表达和微生物特别是细菌分泌系统。例如,但不限于,已知细菌枯草芽孢杆菌能产生和分泌多种蛋白质。这些蛋白质中的一种α-淀粉酶在工业上是重要的,因此获取这种分泌蛋白仍是工业上目前进行的活动。然而,在穿过细胞膜过程中或穿膜后紧接着,或刚好穿膜后蛋白质的降解显著降低了蛋白质的产量。
因此其后需要提供一种增强天然蛋白或实际为异源或重组蛋白产量的,更特定地通过降低蛋白质降解提高产量的蛋白表达系统。
亦为众所周知的是提供,能够表达,有利的是分泌异源蛋白质,即对特定细菌不是天然蛋白质的微生物。这种系统典型地包括用异源DNA转化细菌细胞从而制造或产生重组蛋白质。在这种方式中使用大肠杆菌(细菌),酿酒酵母,构巢曲霉和粗糙链孢霉(真菌)等微生物。
在这些原始真核生物中异源蛋白质的表达亦允许对这些异源蛋白质进行一些所需的真核转录后修饰,导致表达蛋白质稳定性增强以及随之产量增加。最近开发利用哺乳动物和昆虫细胞培养系统,促进由于种种原因不能在原核宿主细胞中表达的真核蛋白质的表达。
然而产生重组蛋白质的成本效果仍旧是遗传工程真核表达系统的主要优势,并且事实上在遗传工程大肠杆菌菌株开发中已取得显著进展,增加了特定重组蛋白质的产出。并且这些细菌菌株的进展与无止境的改造为最适于重组蛋白质表达的更有效载体的开发相结合。这些载体通常含有可容易的切换的启动子元件。
但是使用大肠杆菌表达重组蛋白质有两大缺点。首先高水平的表达可能导致重组蛋白质在细菌细胞质中以“包涵体”形式沉积。由于提供了一种将不可溶重组蛋白质从可溶内源性大肠杆菌蛋白质分离的简单方法,这种特征曾认为是有利的。然而,实际上这种优点并非系统的一般特征,因为在很多情况下蛋白质保持不可溶沉淀物状态,只有通过使用强离液剂才能释放到溶液中。这就出现一个问题,如果目的蛋白特别不稳定并从而变性失去生化或生物活性。其次,外源蛋白质在大肠杆菌中的表达导致这些蛋白质通过有效的蛋白水解系统快速降解。因此从大肠杆菌细菌中分离完整重组蛋白质时出现困难。
已经改造了大肠杆菌菌株(TOPP系列,BL 21)使得通常在传统实验室大肠杆菌菌株中难以表达的重组蛋白质能够表达。但是这些改造大肠杆菌菌株总是不象传统实验室大肠杆菌菌株那样易于除去生物活性,因而需要比正常所需更高的防范等级。
显然需要确定替代的原核宿主细胞和开发方法,以促进可溶的,完整的和具生物学活性的蛋白质的生产。然而,要注意潜在的原核宿主细胞的数量是巨大的。
发明内容
为了产生新的蛋白质表达系统,我们选择遗传改造的枯草芽胞杆菌作为例子提供一种克服了与现有系统产量相关的问题的表达系统。我们把注意力集中于提供一种细菌表达系统,它能够产生并理想地分泌蛋白质(天然和/或异源和/或重组的)到培养物中,因为这种系统由于缺少污染的内源细菌蛋白质和其它大分子而能够纯化制造的蛋白质。
鉴定了多种编码分泌的蛋白酶的枯草芽胞杆菌基因。例如但不限于编码胞外蛋白酶的aprE,nprE,bpf,mpr,epr,nprB和vpr枯草芽胞杆菌基因。这些蛋白酶分泌到培养基中并且它们从枯草芽胞杆菌基因组中的缺失降低到低于野生型菌株胞外蛋白酶活性的1%。尽管如此,实验证据显示缺少胞外蛋白酶的枯草芽胞杆菌菌株仍表现通过蛋白水解降解而显著降低分泌蛋白的产生。
一种细胞壁相关蛋白酶的鉴定使我们开始研究它在枯草芽胞杆菌中天然和/或异源和/或重组蛋白的表达和分泌中是否起作用以及蛋白酶是否在确定分泌蛋白产生中起重要作用。
细胞壁蛋白酶A(wprA)基因编码一个96kDa的多肽,该多肽包括信号肽,前肽和蛋白酶,由于合成和输出形成两种细胞壁结合蛋白质,CWBP 23和CWBP 52(图1)。CWBP 52多肽具有蛋白酶活性,能被一种丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制。wprA的缺失不导致任何显著的生长速率,细胞形态,芽胞形成或运动性方面的表型。
wprA有下列特征:多肽是细胞壁相关的并且在指数期和稳定生长期表达的。
我们决定研究wprA缺失菌株的表型,特别是异源蛋白质的分泌。
使用同源重组,我们得到的菌株,其中将来自枯草芽胞杆菌基因组的wprA基因置于可诱导启动子的控制下。如上所述,这种wprA可控制菌株没有明显的表型,甚至在缺乏诱导剂时亦是如此。然而令人惊奇的是,当将来自地衣芽胞杆菌(AmyL)的天然杆菌性的模式蛋白α-淀粉酶的产量与野生型不含wprA菌株相比时,在指数生长末期测定的α-淀粉酶的量大约增加25%,参看图2A。在延长培养后产量进一步增加到41%(图3)。与野生型wprA菌株相比,敲除wprA基因亦导致改造的α-淀粉酶,AmyLQS 50.5的产量增加(图2B)。这提示在枯草芽胞杆菌中关闭或缺失wprA基因显著增强分泌的同源和异源蛋白质的产生。
wprA基因在天然,异源或重组蛋白质的分泌中的重要性亦通过试图确定参与分泌途径的其它基因的实验得以显示。我们使用了用表达嵌合α淀粉酶基因的载体转化的枯草芽胞杆菌菌株CJ 278,对于嵌合α淀粉酶基因和枯草芽胞杆菌的构建的细节,参看材料和方法。与表达野生型α淀粉酶的野生型菌株分泌水平相比,这种菌株表现降低嵌合α-淀粉酶分泌。我们使用了用mini-Tn10传递载体pIC 333的转座子诱变。这种转座子在枯草芽胞杆菌基因组中的整合是随机的。筛选过程包括鉴定表现嵌合α-淀粉酶增强分泌的整合突变体。对这样鉴定的突变菌株进一步分析,是通过从突变菌株中拯救质粒DNA,将转座子整合位点周围的侧翼区测序,从而确认转座子整合的枯草芽胞杆菌染色体区域。对来自转座子突变体TK108拯救的质粒测序显示,转座子插入到wprA基因的2059位点。
因此显然缺乏WprA会促进自枯草芽胞杆菌的天然,异源或重组蛋白的分泌。
由此,本发明的目的是开发一种在原核表达系统中表达重组蛋白的方法,使得产生具生物活性形式高浓度的多肽。
本发明的进一步目的是开发原核表达系统,使重组蛋白分泌到培养液中,以促进保持生物活性的完整重组蛋白的纯化。
根据本发明的第一方面,提供了通过缺失和/或插入和/或突变和/或取代改变了wprA基因或其相应启动子的细菌菌株,从而阻止了所述基因产物的产生或基因产物的非功能程度能够促进使用该菌株产生的天然,异源或重组蛋白。
本发明的一个优选实施方案中,所述细菌菌株在上述改变前对该wprA基因是野生型的。
在进一个优选实施方案中,所述菌株是一种革兰氏阳性细菌菌株。
在又一个优选实施方案中,所述细菌菌株属于芽胞杆菌属。
此处术语细菌菌株包括任何细菌菌株,但理想地是一种革兰氏阳性细菌菌株并且更理想但非限制的,是芽胞杆菌属细菌菌株。
对本领域技术人员而言下面所述是显然的,当需产生异源蛋白质时,将所述细菌菌株转化从而包括编码至少一种选择的天然和/或异源和/或重组蛋白质的DNA。
在本发明优选实施方案中,处理所述菌株使至少一部分wprA基因缺失。理想地缺失了显著量的该基因,但在本发明的某些方面,缺失了前序列或其部分,或可选择的地缺失了原序列或其部分,或可选择的地缺失了丝氨酸蛋白酶序列或其部分。或者,缺失该基因选择的可替代部分或缺失选择部分的组合。
在本发明的另一个实施方案中,在至少一个选择位点向wprA基因中插入遗传物质,以阻止该基因表达或至少部分的功能蛋白质产物的合成。
另外,在所述基因中可提供至少一个选择性点突变,以阻止蛋白质的合成或阻止该基因表达。例如,但不限于,改变阅读框以编码终止密码子从而阻止功能蛋白质的合成。
在本发明又一个优选实施方案中通过修饰表达调控序列,理想地是一种启动子从而使启动子对特定信号起反应来改变所述wprA基因,例如,可将wprA基因置于可诱导启动子的控制下,使wprA基因产物可选择性控制。
在本发明一优选实施方案中,细菌菌株属于芽胞杆菌属并且理想地是枯草芽胞杆菌或其近亲诸如解淀粉芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。
需注意的是wprA基因编码具有由于它所衍生的氨基酸序列的特定结构域的蛋白质。如Margot和Karamata的精确定义(Microbiology 1996 1423437-3444),可将该多肽分为信号肽,前肽和蛋白酶多肽。信号肽参与将wprA基因产物靶向于穿细胞膜运输所需的分泌装置。前肽看来是一种伴侣型分子,参与将CWBP 52蛋白质折叠和成熟至生物活性形式。前肽是稳定的并可能行使其它重要功能。蛋白酶多肽将需要前和原序列的存在才能有效靶定和有效行使功能。
依据本发明的第二方面,提供了一种细菌菌株,优选地是芽胞杆菌菌属,理想地是枯草芽胞杆菌菌种,至少具有显示于图1的从核酸碱基对+154至+247(包括+154和+247)的序列的部分或同源基因相应部分的缺失。
在一优选实施方案中,提供了缺失了WprA前体蛋白编码序列的编码信号肽的部分wprA基因的枯草芽胞杆菌菌株。
依据本发明的第三个方面,提供了优选地属于芽胞杆菌属并且理想地是枯草芽胞杆菌的细菌菌株,其至少具有包括显示于图1的从核酸碱基对+154至+1392(包括+154和+1392)的序列的部分或同源基因相应部分的缺失。
在一个优选实施例中,所述细菌菌株可能另外地或可选择地通过至少显示于图1的从+247至+1392的DNA序列的部分或同源基因相应那部分缺失得以修饰。
在进一步优选实施方案中所述枯草芽胞杆菌菌株缺失了部分wprA基因,该基因至少编码部分CWBP 23多肽。
依据本发明的第四方面,提供了一种细菌菌株,优选地是芽胞杆菌属,理想地是枯草芽胞杆菌菌种,至少具有包括显示于图1的从核酸碱基对+1392至+2835(包括+1392和+2835)部分的序列或同源基因相应部分的缺失。
在一优选实施方案中,提供了枯草芽胞杆菌菌株,其缺失了至少编码部分CWBP 52多肽的部分wprA基因。
在本发明进一步优选实施方案中,所述细菌菌株至少缺失了显示于图1的从核酸碱基+247至+2835的部分序列。
在本发明另一优选的实施方案中,提供一种缺失部分wprA基因的枯草芽胞杆菌菌株,该基因编码所述前肽(CWBP 23)或丝氨酸蛋白酶(CWBP 52)中的一个或全部。
在另一优选的实施方案中,所述菌株包括了编码丝氨酸蛋白酶的多肽的部分基因的缺失。
本发明的再一个方面提供了一种生产所需多肽的方法,其中如上所述的微生物菌株通过在有益于产生上述目的多肽的条件下培养并回收上述目的多肽来制备所述多肽。
设想的是目的多肽对所研究菌株可以是内源的或异源的。
依据这方面的实施方案,将上述微生物菌株用作宿主,将编码所述目的多肽的多核苷酸构建体以有功能的方式引入宿主使该菌株能够表达上述多肽。
多核苷酸构建体可通过本技术领域任何已知方法诸如转化,接合,或原生质体转化等转入菌株。构建体可以是适合用于将上述多核苷酸构建体引入微生物细胞的特定方法相适应的质粒或任何其它载体。
在细胞中所述构建体可以是质粒或整合到上述菌株染色体中。此外,它可以是单拷贝或由扩增或多重整合提供的多拷贝。
多肽可以是任何类型的肽或蛋白质,特别地是一种工业酶。所述酶可以是任何可由依据本发明的菌株中产生的任何酶,诸如羰基水解酶,糖酶,蛋白酶,脂肪酶,淀粉酶,纤维素酶,氧化还原酶,葡糖淀粉酶,或酯酶。
本质上,本发明提供了一种细菌菌株,理想地是枯草芽胞杆菌菌株,通过突变,取代,插入或缺失改变了全部或部分wprA基因或其同系物,该基因编码细胞壁相关的丝氨酸蛋白酶。令人惊奇的是如果枯草芽胞杆菌中存在其它的胞外蛋白酶基因,单拷贝wprA基因的缺失能对内源的和异源重组蛋白质的产生有显著效应。
附图说明
现在通过实施例子描述本发明的实施方案,参照下列图示,其中:
图1图示含wprA基因的枯草芽胞杆菌基因组中区的核苷酸序列及其产物WprA的氨基酸序列;
图2A代表释放到培养基中的α-淀粉酶产量。闭合符号代表生长,开口符号代表α-淀粉酶活性。枯草芽胞杆菌菌株KS408(■),KS408wprA∷pMutin2含有(◆)或不含(·)IPTG(10mM);
图2B类似于图2A中所述的实验,但枯草芽胞杆菌菌株表达重组制出的嵌合α-淀粉酶(AmyLQS 50.5)。与诱导wprA基因产物相关的实验细节如图2A并在材料和方法中详述;
图2C是构建编码诱导行wprA基因的枯草芽胞杆菌菌株的流程图。闭合旗代表天然wprA启动子(PwprA),开口旗代表IPTG-可诱导启动子(Pspac)。OriEc;大肠杆菌复制起点;A代表将wprA PCR 5′片段亚克隆到pMutin2的BamH1位点;B代表pM2wprAFP和枯草芽胞杆菌wprA基因间的单交换事件;C代表pM2wprAFP通过同源重组整合到枯草芽胞杆菌染色体中;D代表整合后枯草芽胞杆菌染色体的结构。
图3代表野生型枯草芽胞杆菌菌株与具有处于IPTG诱导启动子控制下的wprA基因产物的菌株在缺乏或含有IPTG情况下的AmyL产生的比较。将枯草芽胞杆菌培养至稳定期并比较指数生长期和稳定期大约30小时后的AmyL活性;
图4代表存在或缺乏wprA基因产物时指数生长期枯草芽胞杆菌AmyL的分泌动力学。代表性的数据来自对菌株KS408和KS408wprA∷pMutin 2+/-10Mm IPTG进行的脉冲-示踪实验。(A)免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后AmyL的脉冲-示踪放射自显影图。上图代表来自全培养样品免疫淀沉的前体(p)和成熟的(m)以及下图是释放到培养物中的成熟AmyL(m)。在不同时间间隔追踪后通过不同形式AmyL磷酸成像定量;全培养样品中的AmyL前体( )和成熟AmyL(◆),以及释放到生长培养基中的成熟AmyL(·)。每种形式的AmyL的量以脉冲中合成的总AmyL(前体+成熟物)的百分数表示;
图5代表通过从获自全培养样品的数据减去释放的成熟AmyL的数据测定的细胞相关的AmyL降解。以脉冲中合成的最大量AmyL(前体+成熟的)的百分数表示各间隔的AmyL的量;
图6表示AmyL在4℃时耗尽的培养基(spent medium)中的稳定性。(A)各时间间隔缺乏(■)或存在(◆)10mM EDTA时α-淀粉酶的活性。(B)各时间间隔缺乏和存在10mM EDTA时耗尽培养基中AmyL的western印迹;以及
图7表示使用wprAΔ-lacZ转录融合的wprA基因的转录活性。在枯草芽孢杆菌KS408(■)和KS408wprA∷pMutin 2的存在(◆)或不存在(·)IPTG(10mM)的培养物中测定生长(闭合符号)和β-半乳糖苷酶活性(开口符号)。
表2显示枯草芽胞杆菌在缺乏或存在wprA基因产物时在极富营养工业型培养基中持续单批发酵时AmyL α-淀粉酶的产生。各菌株在37℃下培养约7天并在该时期后在上清中测定α淀粉酶活性。实验细节在材料和方法中提供。
具体实施方式
材料和方法
对在内源和异源重组蛋白分泌中的wprA基因产物相关性的最初分析涉及其中用IPTG可诱导启动子取代单拷贝wprA基因启动子的枯草芽胞杆菌菌株构建体。缺乏IPTG时wprA基因的表达受抑制。加入IPTG时wprA基因被诱导。
可选择地,如前文描述和下面方法中所详述,可从枯草芽胞杆菌基因组中全部或部分缺失wprA基因。细菌菌株
使用的细菌菌株列于表1。
表1.细菌菌株
菌株 注释
大肠杆菌XL1-Blue -
枯草芽孢杆菌DN1885 xy1R∷pKS405B 编码嵌合α-淀粉酶AmyLQS50.5
枯草芽孢杆菌DN1885 xy1R∷pKS408 编码野生型α-淀粉酶,AmyL
枯草芽孢杆菌DN1885 xy1R∷pKS405B,wprA∷pM2wprAFP. 枯草芽孢杆菌DN1885 xy1R∷pKS405B具有IPTG-可诱导的wprA
枯草芽孢杆菌DN1885 xy1R∷pKS408wprA∷pM2 wprAFP 枯草芽孢杆菌DN1885 xy1R∷pKS408具有IPTG-可诱导的wprA
枯草芽孢杆菌DN1885 Novo Nordisk微生物学杂志172:4315-4321,1991 α-淀粉酶(amyE)阴性枯草芽孢杆菌RUB200的衍生物
生长培养基
枯草芽胞杆菌和大肠杆菌保存在用1.5%w/v琼脂固化的,含1%w/v可溶性淀粉的3号抗生素培养基中(Difco)。分批培养在2xYT液体培养基中进行,该培养基含有;胰化蛋白胨(1.6%w/v),酵母抽提物(1.0%w/v)和氯化钠(0.5%w/v)。需要时在生长培养基中包括下列终终度的抗生素:氯霉素克/毫升,氨苄青霉素克/毫升和红霉素克/毫升。加入木糖1%(w/v)诱导木糖-可诱导启动子的α-淀粉酶的合成。亦在工业类型培养基中比较了野生型枯草芽胞杆菌和有wprA基因产物缺失的菌株中α-淀粉酶的产生,培养基中含有马铃薯淀粉(100克/升),大麦面粉(50克/升),BAN5000SKB(0.1克/升),酪蛋白酸钠(10克/升),黄豆粉(20克/升),Na2HPO4·12H2O(9克/升)和Pluronic(0.1克/升)。对野生型菌株,在培养基中补充6克/毫升氯霉素和0.2%木糖。对wprA缺失菌株,向培养基中补充6克/毫升氯霉素5克/毫升红霉素和0.2%木糖。
DNA操作和细菌转化
如前所述(Sambrook等,1989)进行大肠杆菌的限制性酶切消化,DNA片段纯化,连接和转化。使用IGi基因组提取试剂盒(ImmunogenInternational)从枯草芽胞杆菌中分离染色体DNA。以枯草杆菌DN1885染色体DNA为模板使用Taq DNA聚合酶(Appligene)进行PCR。用Tip-100质粒提取试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中纯化质粒DNA。使用Beckman oligo 1000合成用于PCR的寡聚核苷酸引物。枯草芽孢杆菌培养到感受态并用整合型质粒转化。
α-淀粉酶检测
使用Phadebas α-淀粉酶检测试剂盒(Kabi Pharmacia)定量分泌的α-淀粉酶量。通过微量离心沉淀培养样品中的细胞并依据操作手册中所述测定上清中的α-淀粉酶活性。
构建编码可诱导wprA的菌株
为了确定wprA基因产物是否参与AmyL共转移或后转移(co-orpost-translocational)的降解,我们构建了枯草芽胞杆菌菌株,其中完整拷贝的基因处于异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(2PJT)-可诱导的Pspac启动子控制下。使用pMutin2整合载体进行构建。使用寡核苷酸引物WPR-F(5′GCGCGCGCGGATCCGGGATAACATGAAACGC3′)和WPR-R(5′GCGCGCGCGGATCCCCATCCTCCGCTGTG3′)通过PCR从枯草芽胞杆菌KS408染色体DNA扩增了相应于wprA基因5′末端的357碱基对DNA片段。以大肠杆菌XL1-Blue作为宿主将此片段克隆到pMultin2的单一BamH1限制性位点。
使用产生的质粒pM2wprAFP转化枯草芽胞杆菌KS408,产生菌株KS408wprA∷pMultin2。由于KS408wprA∷pMultin 2的wprA基因处于Pspac启动予控制下,其表达可通过IPTG的存在或缺失来控制。另外,在野生wprA启动子的lacZ之间创造了转录融合(wprAΔ-lacZ),使wprA的表达可通过β-半乳糖苷酶活性监测,图7。通过缺失枯草芽胞杆菌DN1885中的wprA基因构建WprA阴性菌株
通过四个步骤构建了编码枯草芽胞杆菌DN1885的wprA基因的N-末端片段(碱基对(bp)133至bp615)和C末端片段(bp2364至bp2781)的质粒pCJ791:
i)使用寡核苷酸引物CLJe7(5′-GGAATTCCAAAGCTGCAGCGGCCGGCGCG-3′),和CLJe8(5′-GAAGATCTCGTATACTTGGCTTCTGCAGCT-3′)通过PCR从枯草芽胞杆菌DN1885扩增了wprA基因的382bp N-端片段。此片段在5′末端有EcoRI限制性位点并且在3′-末端有BglII限制性位点。同时,使用寡核苷酸引物。CLJe9(5′-AGATCTGGTCAACAAGCTGGAAAGCACTC-3′)和CLJe10(5′-CCCAAGCTTCGTGACGTACAGCACCGTTCCGGC-3′)通过PCR从枯草芽胞杆菌DN1885扩增了wpr基因的419bp C-末端片段。此C-末端片段在5′末端有BglII限制性位点并且在3′末端有HindIII限制性位点。
ii)用限制酶BglII消化编码wprA基因N-和C-末端序列的两DNA片段并连接形成801bp的片段。使用寡聚核苷酸引物CLJe7和CLJe10通过PCR从连接混合物中扩增801bp的片段。用EcoRI和HindIII限制酶消化扩增的801bp片段。
iii)纯化质粒pSJ2739的一段4.4kbp EcoRI至HindIII片段(描述于专利申请WO 96123073,图6)并用作801bp片段的载体。此质粒基于pE194复制起点,意味着质粒的复制是温度敏感的。
iv)连接两个EcoRI至HindIII片段(801bp和4.4kbp)并使用枯草芽胞杆菌DN1885作为宿主菌株通过选择28℃下对红霉素的抗性获得质粒pCJ 791。
通过选择37℃下对红霉素的抗性,质粒PCJ 791整合到枯草芽胞杆菌DN1885的染色体上。由于pCJ 791是基于pE194复制起点,选择的转化体中质粒通过一个质粒wprA序列与相应染色体wprA序列之间的同源单交换重组整合到染色体中。此整合事件可产生两种类型的整合菌株,i)整合的质粒位于野生型wprA基因后面或ii)野生型wprA基因位于整合的质粒后面。为了构建完全(clean)的wprA缺失菌株,两类整合菌株都可使用。因此,未进一步研究该整合事件。
然后通过导致整合质粒释放的同源单交换构建了完全的(clean)wprA缺失菌株。质粒从染色体的释放有两种方式i)通过与质粒整合一样的重组或ii)通过未参与整合的序列间的重组。对第一种情况,产生的菌株会在染色体上含野生型wprA基因。第二种情况发生时,产生的菌株会在染色体上缺失wprA基因,此即所需情况。为了释放整合的质粒,将12个转化体接种到无选择的TY-培养基并在28℃培养过夜。再一次将培养物接种到新鲜TY-培养基并在28℃培养过夜。接种3轮后,将培养物在无选择的LB-平板上铺展并随后筛选获得克隆对红霉素的敏感性。使用寡聚核苷酸引物CLJe7和CLJe10通过对菌落的直接PCR检查了24个对红霉素的敏感菌落(Erms)之缺失wprA基因的情况。有四株Erms克隆在染色体上缺失wprA基因。通过Southern印迹杂交确认了枯草芽胞杆菌DN1885ΔwprA菌株的可靠性。
分离具有提高水平的分泌的嵌合α-淀粉酶的wprA突变体
在先前对于枯草芽胞杆菌中蛋白质的净电荷怎样影响它们穿过带负电细胞壁的研究中,我们发现野生型AmyL(地衣芽胞杆菌的α-淀粉酶)和嵌合变体均出现运输同时和/或其后的降解。由于蛋白酶解出现在细胞质膜外表面,行使降解功能的蛋白酶可能结合于细胞质膜或细胞壁(“嵌合α-淀粉酶的构建及其在研究枯草芽胞杆菌蛋白分泌中的应用”,Keith Stephenson的博士论文,University of Newcastle Upon Tyne,1996;“嵌合α-淀粉酶从枯草芽胞杆菌的分泌”,Christina Lund Jensen博士论文,TechnicalUniversity of Demark,1997)。在寻找参与该降解的因子时,建立了基于枯草芽胞杆菌菌株CJ278,表达嵌合α-淀粉酶(AmyLQS 55-6)的筛选系统。通过转座子诱变制备了突变库,随后在淀粉酶筛选平板上筛选具有增加的晕圈形成的突变体。
构建嵌合α-淀粉酶,AmyL QS55-6:
下面简要给出了关于构建嵌合α-淀粉酶AmyLQS 55-6的步骤。详细的描述参看Christina Lund Jensen的博士论文,“枯草芽胞杆菌中嵌合α-淀粉酶的分泌”,Technical University of Denmark,1997。
嵌合α-淀粉酶,AmyL QS55-6是通过将地衣芽胞杆菌α-淀粉酶(AmyL)成熟部分的特定模块(block)用解淀粉芽胞杆菌(AmyQ)或嗜热脂肪芽胞杆菌的α-淀粉酶(Amys)的相应模块替换构建成的。使用基于PCR的体外基因剪接方法,SOE方法(通过重叠延伸来剪接,Horton et al.Gene 77,61-68,1989)构建了各DNA模块。amyL基因在信号序列中有单一的PstI位点并对转录终止子3′端有单一HindIII位点。因此将amyL QS55-6基因设计为编码α-淀粉酶成熟部分的符合读框的PstI至HindIII DNA片段。amyL QS55-6分为3个单独的DNA模块,覆盖PstI-BamHI片段的模块1,KpnI-SalI片段的模块3和SalI-HindIII的模块4。
下面给出各模块特征,碱基序数是相对于各基因起始密码子计算的。
模块1:bp79-132amyL,bp151-174amyS,bp157-198amyQ,bp199-213amyL,
模块3:bp562-993amyL,bp1018-1095amyS,bp1072-1095amyL
模块4:bp1096-1221amyL,bp1237-1419amyS,bp1411-1542amyQ,bp1537-1798amyL
模块1和3之间是覆盖bp214-561的野生型amyL模块。
将各模块按正确顺序克隆到pUC19以产生编码成熟AmyL QS55-6蛋白质的PstI至HindIII基因片段。为了组装各模块,利用了它们末端产生的单一限制性位点的优点(通过SOE方法产生的)。
表达嵌合α-淀粉酶,amyL QS55-6
通过质粒编码和染色体编码的xy1R-基因拷贝之间的同源重组将amyLQS55-6基因整合到枯草芽胞杆菌染色体。将组装的amyL QS55-6基因克隆到质粒pCJ 92。质粒pCJ 92衍生于具编码木糖可诱导启动子系统的pSX63(构建质粒pCJ 92的细节资料;枯草芽胞杆菌嵌合α-淀粉酶的分泌。Christina Lund Jensen的博士论文,Technical University of Denmark,1997)。将pCJ 92编码的amyL QS55-6基因的EcoRI至BglII片段克隆到大肠杆菌SJ2的pUC 19EcoRI和BamHI限制性位点,产生质粒pCJ 272。质粒pCJ 272不含在枯草芽胞杆菌中有功能的复制起点。将整合质粒pCJ 272引入枯草芽胞杆菌菌株DN1885并通过筛选氯霉素抗性克隆获得转化体。通过质粒编码和染色体编码的xy1R-基因拷贝间的单一同源重组将质粒整合到DN1885的染色体。
将α-淀粉酶表达盒整合到DN1885的染色体产生了一个稳定的系统,能够在含有木糖时诱导α-淀粉酶的产生。
筛选系统:
对具改进的α-淀粉酶分泌的突变体进行鉴定的筛选系统基于携带编码嵌合α-淀粉酶AmyL QS55-6的基因的枯草芽胞杆菌菌株CJ 278(DN1885xy1R∷pCJ 272)。与野生型AmyL相比,菌株CJ 278的α-淀粉酶分泌水平大约是1%,意思是CJ 278在平板上的菌落具有小的和清晰的淀粉降解晕圈。因此,认为它是筛选产生的突变体的理想候选。
诱变方案:
使用mini-Tn10传递载体pIC 333进行菌株CJ 278的转座子诱变(Steinmetz,M.and Richter,R.1994.J.Bacteriol.172:5019)。除转座子外,该质粒携带赋予松驰靶专一性的修饰的转座酶基因,用于在允许温度下选择的热敏感复制起点和红霉素抗性基因。2.2kbp转座子编码壮观霉素抗性基因和pUC8复制起点,便能在大肠杆菌中复制。将质粒pIC 333转化到菌株CJ 278并将红霉素抗性转化体接种到补充有0.4%葡萄糖和壮观霉素(120微g/ml)的TY培养基中,在28℃培养过夜。将过夜培养物在补充有0.4%葡萄糖和壮观霉素(120微g/ml)的TY-培养基中稀释为1/100。培养3小时后将温度切换到37℃(限制性温度)再培养4小时。将小份培养物在补充有0.4%葡萄糖,0.01M磷酸盐pH7,0.2%木糖和120微g/ml壮观霉素的LB-支链淀粉(与Cibacrone红偶合)平板上涂布并在37℃培养过夜。具有明显较大晕圈的克隆,表示较高量的α-淀粉酶的分泌,以1/150的频率出现。其中一个这种转座子突变体,比亲本菌株形成更大的淀粉降解晕圈,是菌株TK108。
利用转座子中的pUC复制起点,拯救mini-Tn10转座子及自菌株TK108其侧翼区。将TK108染色体用EcoRI完全消化,并用T4DNA连接酶重新连接。将连接混合物转化到大肠杆菌SJ2(Diderichsen et al,1990.J.Bacteriology 172,4315-4321),筛选壮观霉素抗性。将来自壮观霉素抗性转化体的质粒DNA用于DNA测序。通过双脱氧链终止法(Sanger etal 1997)并使用mini-Tn10特异引物:5′-CCAATACGCAAACGCCCTCTC-3′和5′-TAGTGACATTTGCATGCTTC-3′测定了DNA序列,该引物分别相应于mini-Tn10转座子序列的位置137-117和2181-2200。
从转座子突变体TK108获拯的质粒序列表明该转座子在位置2059插入wprA基因。
结果和讨论
显然需要开发制造天然的,异源的或重组蛋白质的有效替代方法。明显的并非所有异源蛋白质均以可溶的具生物活性的形式产生,因此不断设计出促进此类蛋白质产生的方法。
我们采取的方法是开发芽胞杆菌属和其近亲作为天然和异源和重组蛋白产生的替代宿主。由于它们易于在分批培养基中生长,快速的细胞分裂以及进一步能够将蛋白质高浓度分泌到培养基中,因而这些细菌比其它菌种有相当的优势。另外我们决定集中开发一种表达系统,能够向培养液中分泌可溶性蛋白,从而有利于将这种蛋白从污染的内源性细菌蛋白质和其它大分子中纯化出来。这种方法的一个大问题是许多细菌系统活跃分泌蛋白酶到培养基中,在细菌细胞的邻近环境中降解蛋白质。已经改造了一些枯草芽胞杆菌菌株,从细菌染色体缺失这些基因从而降低由于蛋白酶解活性造成的蛋白质损失。但是,这样仍会导致完整蛋白的产量降低,其中一个原因在于胞内蛋白酶释放到生长培养基中,即由于具有胞外蛋白酶多重缺陷的菌株易于裂解从而将细胞内含物释放到周围的生长培养基中。
另外,我们采用脉冲-追踪标记实验确定分泌的蛋白质发生蛋白酶解的位置。可以观察到释放到培养基中的成熟AmyL的量(一种模式分泌蛋白)随时间增加直到达到一稳定水平。该水平只有合成的总AmyL量的大约25%,与全培养物样品中保留的AmyL量一致。这意味着起始合成的AmyL的75%降解了。通过确定每个时间点加入追踪溶液后保持与细胞结合的AmyL的比例,通过从全培养样品观测量中减去释放的AmyL量,可以确定AmyL降解发生在细胞结合的位置且在加入追踪溶液7分钟内,图6。这些数据提示观测到的AmyL的降解发生在穿膜运输过程中或其后短时间内,并且在细胞相联系的位置。
枯草芽胞杆菌的wprA基因编码细胞壁结合的丝氨酸蛋白酶。该wprA基因产物由帮助蛋白酶定位于分泌装置的前导序列(信号肽),产生极有可能具有伴侣型活性的稳定23KDa蛋白质产物的原序列和52KDa丝氨酸蛋白酶组成。我们改造的wprA基因是将其置于IPTG可诱导的启动子元件控制之下。这使得wprA的表达简单的通过生长培养基中IPTG的存在或缺失而处于严格调节之下。当将显示降低的α-淀粉酶产生的枯草芽胞杆菌菌株用mini Tn10转座子随机诱变时,确认出具有增强α-淀粉酶产生的整合突变体。拯获的Tn10 DNA序列测定揭示整合位点是wprA基因。我们亦制造出一枯草芽胞杆菌菌株,其通过遗传改造为从染色体中完全缺失了wprA基因。
我们用嵌合α-淀粉酶基因转化了野生型枯草芽胞杆菌菌株DN1885xy1R∷pKS405B以及用野生型α-淀粉酶转化了菌株DN1885 xy1R∷pKS408并用包含于质粒pM2wprAFP的IPTG可诱导启动子置换了wprA启动子序列(参看材料和方法)。
在含有或缺乏10mM IPTG的枯草芽胞杆菌培养物中评价了分泌的野生型α-淀粉酶的活性。使用由其野生型启动子表达的wprA的培养物作为对照培养物。按培养物光密度测定,图2A表明枯草芽胞杆菌菌株的生长速度和动力学不受WprA蛋白质缺失的(未加IPTG)显著影响。但是,缺乏10mMIPTG时,与由其野生型启动子表达wprA基因的野生型菌株相比,培养物中α-淀粉酶活性大约增长25%(图2A)。图2B表明对嵌合淀粉酶产生的相当的效应。
亦评价了野生型或IPTG-可诱导wprA基因的枯草芽胞杆菌稳定期培养物中天然α-淀粉酶的产量(图3)。将菌株培养大约39个小时,此时的培养物已处于稳定期大约30小时。缺乏IPTG时,与由其野生型启动子表达wprA的菌株相比培养物中α-淀粉酶的产量增加了大约40%。与此相反,存在IPTG时(wprA on)KS408wprA∷pMutin 2α-淀粉酶的产量较低并且转到稳定期时α-淀粉酶的产出是KS408的95%。
另外,将菌株在丰富工业型培养基中延时分批发酵培养时,缺乏WprA蛋白时α-淀粉酶活性增加大约78%。
这些资料证明wprA的表达显著影响释放的α-淀粉酶的产量。
我们还使用联合脉冲-追踪和免疫沉淀技术研究AmyL在KS408和KS408wprA∷pMutin 2中的分泌动力学。将培养物培养至指数期(OD600~0.6)并用L-(35S)甲硫氨酸脉冲追踪。免疫沉淀和随后的SDS-PAGE之后,通过放射自显影看到前体和成熟形式的AmyL,图4。对于KS408,AmyL前体至成熟形式的过程迅速;在脉冲后立即取样时(0分钟),脉冲中合成的总AmyL(前体+成熟的)只有27%是前体形式,图4。追踪5分钟后过程完成,所有的α-淀粉酶处于成熟形式。全培养样品(细胞+生长培养基)中成熟AmyL的量在1分钟时达到峰值,随后降低直到大约25%最大检测值的稳定水平,显示穿过细胞质膜运输时或其后短时间内新合成α-淀粉酶的显著损失。
通过采用突变体筛选确定显示增强的嵌合α-淀粉酶分泌的突变菌株亦证实了WprA蛋白质与枯草芽胞杆菌蛋白质分泌有关。将mini-Tn10转座子随机整合到细菌基因组DNA,如果转座子未整合到关键基因,这样会产生插入突变。与野生型控制菌株相比,突变菌株TK108显示增加的嵌合α-淀粉酶分泌。从TK108基因组DNA回收mini-Tn10传递载体并将围绕载体的侧翼区测序,确定整合位点。转座子整合于wprA基因的2059位置。通过测定在淀粉琼脂平板上与CJ 278(野生型)比较的TK108周围产生的晕圈监测到破裂的枯草芽胞杆菌菌株TK108显示提高的α-淀粉酶分泌。
总的来说,我们表明关闭或损坏或缺失单拷贝wprA基因能显著提高培养基中来自枯草芽胞杆菌的天然的,异源的或重组蛋白质的产量。重要的是,枯草芽胞杆菌胞外蛋白酶仍旧积极地分泌到培养基中,表明分泌α-淀粉酶增加的产量的生产主要贡献因素在于除去了由wprA基因编码的细胞壁结合蛋白酶。
表2α-淀粉酶的相对产量是野生型和wprA IPTG可诱导的枯草芽胞杆菌菌株。
B.subtilisDN1885 xy1R∷pKS408 B.subtilisDN1885 xy1R∷pKS408wprA∷pM2wprAFP
100 178

Claims (3)

1.一种从芽孢杆菌属菌株产生天然和/或异源和/或重组多肽的方法,该菌株在wprA基因或其相应启动子中具有缺失和/或插入和/或突变和/或取代,从而影响由wprA基因编码的基因产物的产出和/或功能,影响方式是使有利于上述多肽的产生,包括:
i.在有利于产生和分泌上述多肽的条件下培养上述菌株;以及
ii.从生长培养基和/或上述细菌菌株回收上述多肽。
2.权利要求1的方法,其中上述细菌菌株选自枯草芽孢杆菌,解淀粉芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌。
3.权利要求1或2的方法,其中上述多肽选自羰基水解酶,糖酶,蛋白酶,脂肪酶,淀粉酶,纤维素酶,氧化还原酶,葡糖淀粉酶或酯酶。
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