CN1279722A

CN1279722A - 革兰氏阳性微生物甲酸途径

Info

Publication number: CN1279722A
Application number: CN98811347A
Authority: CN
Inventors: B·米勒; M·狄亚兹－托瑞斯
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 2001-01-10
Also published as: WO1999027107A3; WO1999027107A2; DE69833276D1; DK1038010T3; ATE316143T1; GB9724627D0; EP1038010A2; CA2309781A1; NZ504195A; DE69833276T2; EP1038010B1; AU1700899A; BR9814982A; US6458557B1; WO1999027107A9; JP2002508928A

Abstract

本发明涉及革兰氏阳性微生物甲酸运输系统,并提供在革兰氏阳性微生物中生产产品的方法。本发明还提供与甲酸运输有关的四个分子FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的核酸和氨基酸序列。

Description

革兰氏阳性微生物甲酸途径

本发明的领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及芽孢杆菌属(Bacillus)中参与甲酸运输和利用的分子的鉴定。本发明还提供用于增加芽孢杆菌属(Bacillus)生产多肽的产量的方法。

序言

革兰氏阳性微生物，例如芽孢杆菌属已被应用于大规模工业发酵，部分原因是其能将发酵产物分泌至培养基中。分泌的蛋白质穿过细胞膜和细胞壁导出，随后释放到胞外培养基中。因为导出的蛋白质通常保持其天然构象，所以在革兰氏阳性微生物中生产感兴趣的蛋白质是有利的。

Suppmann等(1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)，vol．11(5)，965-982页)描述了革兰氏阴性微生物大肠杆菌(E．coli)中的一种推断的甲酸转运蛋白。Nagy等(1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)，vol：177，1292页)描述了大肠杆菌中的甲酰四氢叶酸水解酶。Mazel等(1997，分子生物学杂志(J．Mol．Biol．)266：939-949)描述了真细菌系统中的多肽去甲酰酶功能。然而，关于大规模发酵法生产异源蛋白质所使用的革兰氏阳性微生物中甲酸的摄取和利用，人们知之甚少。

芽孢杆菌属中可能与甲酸利用相关的基因产物已经得到鉴定。deSiazieu(1997，微生物学(Microbiology)143：979-989)揭示了产生辅酶四氢叶酸(THF)的操纵子。枯草芽孢杆菌(B．subtilis)中已显示存在10-甲酰四氢叶酸合成酶(连接酶)活性和5，10-亚甲四氢叶酸脱氢酶(Whitehead等，1988，细菌学(Bacteriology)170：995-997)。而且，Saxild等(1994，Mol．Gen．Genet．242：415-420)已鉴定了嘌呤生物合成中催化单碳转移反应的5-磷酸核糖-1-甘氨酰胺(GAR)转甲酰酶(transforylase)。该酶是purT位点的产物，发现其依赖于生长培养基或无细胞提取物体外实验中添加的甲酸盐。

在本领域中，仍需要优化革兰氏阳性表达系统以便增加这些系统的产物产量。

本发明概要

在本发明之前，对革兰氏阳性微生物中甲酸的运输、利用或循环知之甚少。当在摇瓶中研究不同添加物对革兰氏阳性微生物芽孢杆菌属生长的影响时，观察到向培养基中添加甲酸钠时生长增加。还观察到在革兰氏阳性微生物发酵过程中没有外源甲酸盐时，产生内源甲酸。

因此本发明部分地基于内源或外源甲酸钠存在时观察到的革兰氏阳性微生物生长的改变。本发明还基于本文提出的证据，即甲酸是通过一种共运输的机制运送至芽孢杆菌属的。因此，本发明提供了改变革兰氏阳性微生物生长的方法，其包括更改革兰氏阳性微生物中甲酸的运输。

本发明还部分基于枯草芽孢杆菌基因组核酸序列编码的四个芽孢杆菌属蛋白的鉴定和特性分析，这些蛋白看来与甲酸的运输、利用和循环相关：甲酸运输相关蛋白1(FTAP1)和甲酸运输相关蛋白2(FTAP2)，其分别与大肠杆菌蛋白FocA(一种甲酸通道蛋白)大约35％和30％相同；枯草芽孢杆菌PurU，其与大肠杆菌PurU(在四氢叶酸和甲酰四氢叶酸循环中涉及的N10-甲酰四氢叶酸水解酶)在氨基酸水平上大约48％相同；甲酰甲硫氨酸去甲酰酶(FMD)，其与另一种甲酰甲硫氨酸去甲酰酶(YkrB)大约40％相似。

本发明还基于如下数据，即在有外源甲酸存在时，摇瓶培养的中断了FTAP1编码基因的芽孢杆菌属细胞显示其生长增加比外源甲酸存在时正常观察到的生长增加降低大约50％。在有外源甲酸存在时，摇瓶培养的中断了FTAP2编码基因的芽孢杆菌属细胞生长得更慢，而且培养物的密度随着时间下降。因此，看来在芽孢杆菌属中FTAP1和FTAP2与甲酸运输和利用相关。

因此，调整甲酸运输、利用和循环所涉及分子(例如，FTAP1、FTAP2、PurU和FMD单独、彼此联合或和其它相关分子联合)的表达，提供了一种调节革兰氏阳性微生物的甲酸产生水平的方法。人们可能期望增加这些分子的表达、降低这些分子的表达或调节这些分子的表达，即提供一种根据革兰氏阳性微生物类型和希望的培养条件在细胞生长的一定时期表达这些分子的方法。

因此，本发明提供了一种增加革兰氏阳性微生物中产品产量的方法，其包括如下步骤：获得能表达所述产品的微生物，所述微生物还包含编码1)甲酸运输相关蛋白1(FTAP1)和2)甲酸运输相关蛋白2(FTAP2)之一或两者的核酸序列；在甲酸存在并适合所述产品生产的条件下培养所述微生物。所述产品包括可从革兰氏阳性微生物中获得的天然存在的产品，例如抗菌化合物、抗生素、抗原、抗体、表面活性剂、化学产品和酶，也包括重组导入的核酸编码的产品，如蛋白质和多肽。

一方面，所述产品是重组蛋白。在一个实施方案中，重组蛋白与所述革兰氏阳性微生物同源，在另一个实施方案中，重组蛋白与所述革兰氏阳性微生物异源。本发明的一方面，所述革兰氏阳性微生物是芽孢杆菌属，而在另一实施方案中所述芽孢杆菌属包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌( Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B. alkalophilus)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B. circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。

本发明的一个方面，所述重组蛋白包括激素、酶、生长因子和细胞因子，而另一方面，所述酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、漆酶、蛋白质二硫键异构酶。

在无外源甲酸存在的大规模芽孢杆菌发酵条件下，在培养基中可观察到过量内源性甲酸或甲酸“溢出物”。因此，为了维持合适的内源甲酸水平，可能应缺失、突变或以其它方式中断FTAP1和2的编码基因。因此，本发明提供了一种在革兰氏阳性微生物中生产产品的方法，其包括步骤：a)获得一种能表达所述产品的革兰氏阳性微生物，所述微生物在编码FrAP1和2之一或两者的核酸中含有突变，所述突变导致所述微生物FTAP1和／或FTAP2活性的产生受到抑制；和b)在适合所述产品表达的条件下培养所述微生物。

此外，基于芽孢杆菌PurU和大肠杆菌PurU整体氨基酸序列的同源性，看来芽孢杆菌PurU通过充当N¹⁰-甲酰四氢叶酸水解酶在甲酸转运中起作用。Saxi1d等(1994，Mol．Gen．Genet，242：415-420)推测枯草芽孢杆菌可通过N¹⁰-甲酰四氢叶酸和N-甲酰甲硫氨酸的去甲酰化产生甲酸。因此，在过量内源甲酸似乎从正常甲酸转运通道之外溢出的生长条件下，为了减少N¹⁰-甲酰四氢叶酸的水解从而增加细胞内留存的甲酸，可能应在革兰氏阳性微生物细胞中缺失、突变或以其它方式中断PurU编码基因。在某些细胞生长条件下也可能希望增加PurU的表达。而且，正如下文所阐明的，PurU的表达也可通过向培养基中添加甘氨酸或甲硫氨酸来进行代谢调节。

因此，本发明提供了一种在革兰氏阳性微生物中生产产品的方法，其包括：获得能表达所述产品并在PurU编码核酸中含有突变的革兰氏阳性微生物，所述突变导致所述微生物PurU活性生产的抑制；在适合所述产品表达的条件下培养所述微生物。

基于与芽孢杆菌Def全序列的同源性，看来革兰氏阳性FMD在修饰起始甲硫氨酸中起作用。所以，在大规模发酵条件下修饰革兰氏阳性宿主细胞的FMD表达可能是可取的。因此，本发明提供了一种增加革兰氏阳性微生物中产品产量的方法，其包括步骤：a)获得能表达所述产品的革兰氏阳性微生物；b)修饰所述微生物的FMD表达；和c)在适合所述产品表达的条件下培养所述微生物。

本发明还提供了含有分离的FTAP1和／或2和／或PurU和／或FMD编码核酸的表达载体和革兰氏阳性微生物。本发明还提供在编码FTAP1和／或2和／或PurU和／或FMD的部分或全部核酸中含有缺失或突变的革兰氏阳性微生物。

本发明也提供了检测枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD同源多核苷酸的方法，其包括将枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的部分或全部核酸序列与革兰氏阳性微生物的来源于基因组或cDNA的核酸进行杂交。

附图的简要说明

图1A-1C为FTAP1(YRHG)的核酸序列(序列识别号SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图2A-2C为FTAP2(YWCJ)的核酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图3A-3C为PurU(YKKE)的核酸序列(SEQ ID NO：5)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

图4A和4B为FMD(Def)的核酸序列(SEQ ID NO：7)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。

图5为加或不加MOPS缓冲液和3克／升甲酸钠的1％SBG中枯草芽孢杆菌(BG125)培养物的生长和pH值随时间变化的比较。

图6为在1％SBG、含有80mM MOPS的1％SBG和含有3克／升甲酸钠的1％SBG中连续加入盐酸时，pH值的改变。

图7为不加或加入递增浓度甲酸的1％SBG枯草芽孢杆菌(BG125)培养物的生长随时间变化的比较。

图8为按“材料和方法”所述之高效液相色谱法测定的图5之培养物对甲酸的摄取量。

图9为按“材料和方法”所述之高效液相色谱法测定的图5之培养物随时间产生的乙酸的量。

图10为按“材料和方法”所述之高效液相色谱法测定的图5之培养物的葡萄糖摄取量。

图11为加入甲氧苄胺嘧啶(trimethaprim)对在含所指明添加剂和甲酸的1％SBG中培养的枯草芽孢杆菌的生长的影响。所指明处甲氧苄胺嘧啶(药物)的添加量为25Klett单位。

图12为FTAP1(YRHG)与EcopFlz．p1(其含有大肠杆菌FocA)(SEQ IDNO：9)的氨基酸序列对比。

图13为FTAP2(YWCJ)与EcopFIz．p1的氨基酸序列对比。

图14为大肠杆菌PurU(SEQ ID NO：10)与枯草芽孢杆菌PurU(YKKE)的氨基酸序列对比。

图15为革兰氏阳性微生物甲酸运输、利用和循环相关分子的示意图。

图16说明yrgh基因中断(int．)对BG125细胞生长的影响。含有中断基因的细胞生长在按所示加入3克／升甲酸和卡那霉素的1％SBG中。生长情况按“材料和方法”所述测定。对照(-□-)，甲酸 (……)ywcJint．(…○…)，ywcJ int．+甲酸(---△---)，ywcJ int．+卡那霉素ywcJ int．+甲酸+卡那霉素

图17说明ywcJ基因中断(int．)对BG125细胞生长的影响。含有中断基因的细胞生长在按所示加入3克／升甲酸和卡那霉素的1％SBG中。生长情况按“材料和方法”所述测定。对照(-□-)，甲酸 (……)，ywcJ int．(…○…)，ywcJ int．+甲酸(---△---)，ywcJ int．+卡那霉素ywcJ int．+甲酸+卡那霉素

本发明详细描述定义

本文所用的芽孢杆菌属包括本领域技术人员所知的所有成员，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌。

本发明包含革兰氏阳性生物的FTAP1、FTAP2、PurU和FMD。在一个优选实施方案中，所述革兰氏阳性生物为芽孢杆菌属。另一优选实施方案中，所述革兰氏阳性生物为枯草芽孢杆菌。本文所用“枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD”分别指图1、2、3和4所示氨基酸序列，并分别命名为YRHG，YWCJ，YKKE和DeF。本发明包括枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的同源氨基酸序列，即图1、2、3和4所示氨基酸序列的保留了功能的变体，本文也称作FTAP1、FTAP2、PurU和FMD。

本文所用的“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列和其片段或部分，也指来源于基因组或合成的DNA或RNA，其既可是双链也可是单链，既可是有义链也可是反义链。本文所用的“氨基酸”是指多肽或蛋白序列或其部分。本文所用的“同源多核苷酸”是指革兰氏阳性微生物多核苷酸，其与枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD至少80％、至少85％、至少90％和至少95％同源，或其能在高度严格的杂交条件下与枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD杂交。

本文所用的术语“分离的”或“纯化的”是指去除了至少一种天然联合成分的核酸或蛋白质或多肽。本发明中，分离的核酸可包括含有所述核酸的载体。

本文所用的术语“产物”是指可从革兰氏阳性微生物获得的任何天然存在或重组导入的产物，例如蛋白、多肽、肽、化学物质，也包括但不限于抗菌化合物、抗生素、抗原、抗体、表面活性剂、化学产品和酶。重组蛋白质指由导入所述微生物的核酸编码的蛋白质。所述核酸可通过表达载体导入，该表达载体含有能表达所述导入核酸编码的蛋白质的信号，所述核酸也可整合入所述微生物的染色体。重组蛋白质可与所述微生物同源也可与所述微生物异源。本文所用的术语“异源蛋白质”是指非天然存在于革兰氏阳性宿主细胞中的蛋白质或多肽。异源蛋白质的例子包括酶，如水解酶(包括蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、糖酶和脂酶)；异构酶(如消旋酶、差向异构酶、互变异构酶或变位酶)；转移酶，激酶和磷酸酶。所述的异源基因可编码治疗上重要的蛋白质或多肽，例如生长因子、细胞因子、配体、受体和抑制剂，以及疫苗和抗体。所述的基因可编码商业上重要的工业蛋白质或多肽，如蛋白酶、糖酶(如淀粉酶和葡糖淀粉酶)、纤维素酶、氧化酶和脂酶。感兴趣的基因可以是天然存在的基因，也可是突变基因或合成基因。

术语“同源蛋白质”指革兰氏阳性宿主细胞中与生俱来的或天然存在的蛋白质或多肽。本发明包括通过重组DNA技术产生同源蛋白质的宿主细胞。本发明包括革兰氏阳性宿主细胞，其在编码天然存在的同源蛋白质(如蛋白酶)的核酸中含有突变或中断，并且其编码所述同源蛋白质的核酸以重组形式重新导入。在另一实施方案中，所述宿主细胞生产所述同源蛋白质。

在本领域中很好理解，甲酸可以以各种电离状态存在，如果处于溶液形式，则依赖于周围的介质，如果处于固体形式，则依赖于其从中制备的溶液。用诸如甲酸的术语命名这些分子意在包括所指有机分子的所有电离状态。因此，例如，甲酸和甲酸盐均指相同的物质，而不是旨在指定特定的电离状态。优选实施方案的描述Ⅰ．芽孢杆茵属甲酸的运输

向枯草芽孢杆菌的摇瓶培养物中添加甲酸钠观察到生长增强的现象，揭示了关于甲酸运输进入细胞的机制的信息。加入甲酸钠后，总细胞密度高出很多，而且所述培养物能更长时间地保持其生长速率。在1％SBG培养基中生长时，甲酸的生长增强作用与避免pH值正常地降至6．0以下相关，从3g／l(44 mM)到21g／l(308mM)范围的甲酸钠浓度对总的生长增强产生相似的效果。然而，3g／l甲酸钠仅引起最初生长速率的微小的延迟，随着甲酸浓度的增加所述延迟变得更加明显。枯草芽孢杆菌在1％SBG中的生长伴随乙酸的产生，这可能是正常的pH降低和生长速率下降的原因。使用MOPS缓冲液的实验显示，缓冲液的pH控制在很大程度上重现了甲酸引起的生长增强。我们观察到对于甲酸和甲酸加MOPS的培养瓶，从培养基中摄取甲酸均始于早指数生长期，并在稳定期开始之前已完全停止。此外，与对照和对照加MOPS培养瓶相比，甲酸和甲酸加MOPS的培养瓶的确显示了乙酸产生的增加。尽管乙酸浓度更高，但甲酸培养瓶的pH并不降到6．4以下。在甲酸、甲酸加MOPS和MOPS培养瓶中葡萄糖摄取速率相同，提示甲酸引起的乙酸产生增加与葡萄糖代谢的某步而不是与葡萄糖运输相连。看来甲酸对pH的控制是由于甲酸共运输进入细胞伴随质子从培养基中去除。实施例中显示的采用甲氧苄胺嘧啶的研究提示，被运输的甲酸要求四氢叶酸合成以避免生长速率下降。Ⅱ．FTAP1和2，PurU和FMD序列

具有如图所示序列的FTAP1、FTAP2、PurU和FMD多核苷酸编码枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD。正如本领域技术人员所理解的，由于遗传密码的简并性，许多种多核苷酸能编码枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD。本发明囊括所有这些多核苷酸。

所述DNA可通过本领域已知的标准程序获得，例如从克隆DNA(如DNA文库)获得，通过化学合成、CDNA克隆或克隆从目的细胞纯化的基因组DNA或其片段获得(见例如Sambrook等，1989，分子克隆实验手册，第二版冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Glover，D．M．(ed．)，1985，DNA克隆：实用手册，MRL Press，LtdOxford，U．K．Vol．I，11．)。优选来源是基因组DNA。从基因组DNA来源的核酸序列除编码区外还可含有调节区。无论何种来源，分离的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD基因应分子克隆至合适载体上以增殖该基因。

从基因组DNA分子克隆所述基因时，先产生DNA片段，其中一些片段编码期望的基因。基因组DNA可用各种限制性酶在特异位点切开。此外，还可在锰离子存在时用DNase使DNA片段化，或用物理法例如超声处理剪切DNA。然后，得到的线性DNA片段可用标准技术包括但不限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳以及柱层析法按大小分离。

一旦产生了DNA片段，含有FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的特异DNA片段的鉴定就可用许多方法来实现。例如，可分离和标记本发明的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD基因或其特异RNA，或其片段(例如探针或引物)，然后用于杂交分析以检测产生的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD基因(Benton，W．and Davis，R1977，Science 196：180；Grunstein，M．And Hogness，D1975，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 72：3961)。那些真正与探针序列类似的DNA片段会在严格的条件下杂交。

本发明包括分别编码革兰氏阳性微生物FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的FTAP1、FTAP2、PurU和FMD同源多核苷酸，这些同源多核苷酸与从枯草芽孢杆菌得到的FTAP1、FTAP2、PurU和FMD至少有80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％的相同性，只要所述同源多核苷酸编码的蛋白质保持功能活性。

枯草芽孢杆菌的革兰氏阳性微生物同源多核苷酸可通过基因组或cDNA来源的革兰氏阳性微生物核酸的核酸杂交来鉴定。所述同源多核苷酸序列可通过用图中所公开的探针、部分或片段进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。因此，本发明提供了检测枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD同源多核苷酸的方法，其包括用枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD核酸序列的部分或全部与基因组或cDNA来源的革兰氏阳性微生物核酸杂交。

本发明的范围还包括能在中等到最大严格的条件下与枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD核苷酸序列杂交的革兰氏阳性微生物多核苷酸序列。杂交条件基于核酸结合复合体的变性温度(Tm)，如Berger和Kimmel所示(1987，分子克隆技术指南，酶学方法，Vol 152，AcademicPress，San Diego CA)，后者并入本文作为参考。“严格”的定义参照下文解释。

典型地，“最大严格”在约Tm-5℃进行(比探针的Tm低5℃)；“高度严格”在Tm以下约5℃到10℃进行；“中等严格”在Tm以下约10℃到20℃进行；“低度严格”在Tm以下约20℃到25℃进行。正如本领域技术人员所理解的，最大严格杂交可用于鉴定或检测相同多核苷酸序列，而中等或低度严格杂交可用于鉴定或检测同源多核苷酸序列。

本文所用术语“杂交”应包括“核酸的一条链和互补链通过碱基配对结合的过程”(Coombs J(1994)生物技术词典，Stockton Press，NewYork NY)。

用聚合酶链式反应(PCR)技术进行的扩增过程参见Dieffenbach CW和GS Dveksler(1995，PCR Primer，a Laboratory Manual，冷泉港出版社，Plainview NY)。从枯草芽孢杆茵FTAP1、FTAP2、PurU或FMD来源的至少约10个核苷酸、多至约60个核苷酸，优选约12至30个核苷酸，更优选20至25个核苷酸的核酸序列可用作探针或PCR引物。

枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的氨基酸序列(分别见图1，2，3和4所示)通过枯草芽孢杆菌基因组核酸序列的FASTA搜索来鉴定。本发明包括枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的革兰氏阳性微生物氨基酸序列变体，这些变体与枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD有至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％的相同性，只要所述氨基酸序列变体保持功能活性。Ⅲ．表达系统

本发明提供了用于在革兰氏阳性微生物中提高生产和分泌异源或同源蛋白质的宿主细胞、表达方法和系统。在一个实施方案中，宿主细胞通过遗传工程在编码革兰氏阳性FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的基因中产生缺失或突变，从而缺失了各自的活性。在本发明的另一个实施方案中革兰氏阳性微生物通过遗传工程增加FTAP1、FTAP2、PurU或FMD、或其它甲酸运输、利用或循环相关分子的水平。宿主细胞中FTAP1、2或PurU的失活

获得不能产生天然存在的甲酸相关蛋白质的革兰氏阳性微生物表达宿主细胞，需要替换和／或失活宿主细胞基因组天然存在的这些基因。在一个优选实施方案中，所述突变是不可逆突变。

突变革兰氏阳性甲酸相关蛋白质编码核酸的一种方法是克隆所述核酸或其部分，通过定点突变更改所述核酸并将突变的核酸通过质粒重新导入细胞。通过同源重组，突变的基因可被导入染色体。在亲本宿主细胞中，结果是天然存在的核酸和突变核酸串联存在于染色体上。第二轮重组之后，在染色体上留下更改的序列，因此有效地将突变导入至亲本宿主细胞后裔的染色体基因中。

另一个失活天然基因活性的方法是通过缺失染色体基因拷贝来实现。在一个优选实施方案中，缺失完整基因，以这种方式进行的缺失不可能产生回复突变。在另一个优选实施方案中，产生部分缺失，其条件是留在染色体上的核酸序列太短，不足以与编码FTAP1、FTAP2、PurU和FMD基因的质粒发生同源重组。在另一个优选实施方案中，缺失编码催化氨基酸残基的核酸。

天然存在的革兰氏阳性微生物的甲酸运输、利用和循环相关蛋白质的缺失可按如下方法进行。分离编码甲酸相关蛋白的基因，包括其5’和3’区域，并将其插入克隆载体。体外缺失载体上的基因编码区，同时保留足够长的5’和3’侧翼序列用于和亲本宿主细胞中天然存在的基因发生同源重组。然后，将载体转化至革兰氏阳性宿主细胞中。通过侧翼区的同源重组载体整合至染色体中。本方法可产生甲酸相关基因缺失的革兰氏阳性菌株。

整合法采用的载体优选质粒。可包括选择性标记以便鉴定重组微生物。此外，正如本领域技术人员会认识到的，所述载体优选可选择性整合入染色体的载体。这可通过向质粒中导入一个诱导型复制起点如温度敏感型起点来实现。在复制起点敏感的温度条件下使转化体生长，质粒的复制功能失活，从而提供了一种选择染色体整合体(integrant)的方法。整合体可通过能在高温和存在选择性标记如抗生素时生长来筛选。整合机制的描述见WO 88／06623。

通过坎贝尔型(Campbell-type)机制的整合可发生在蛋白酶基因的5’侧翼区，导致蛋白酶阳性菌株在染色体甲酸相关蛋白位点带有整个质粒载体。因为异常重组会产生不同的结果，所以有必要确定完整基因是否已被缺失，例如通过核酸序列分析或限制性图谱分析。

失活天然存在基因的另一种方法是通过用突变的寡核苷酸转化革兰氏阳性微生物来突变其染色体基因拷贝。另一种方法是，所述染色体基因可通过同源重组用突变基因替代。

本发明包括具有额外蛋白酶缺失或突变的宿主细胞，如在apr、npr、epr、mpr和其它本领域专业人员已知的基因中缺失或突变。Ⅳ．FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的产生

为了在宿主细胞中产生FTAP1、FTAP2、PurU或FMD，将含有至少一个编码革兰氏阳性微生物FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的核酸拷贝(优选含有多个拷贝)的表达载体，在适合表达所述蛋白的条件下转化入宿主细胞。根据本发明，编码革兰氏阳性微生物FTAP1、FTAP2、PurU或FMD或其片段、或融合蛋白的多核苷酸，或编码具有活性的枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD氨基酸变体的同源多核苷酸序列，均可用于产生指导其在宿主细胞中表达的重组DNA分子。在一个优选实施方案中，革兰氏阳性宿主细胞属于芽孢杆菌属。在另一个优选实施方案中，革兰氏阳性宿主细胞是枯草芽孢杆菌。

正如本领域专业人员所理解的，产生含有非天然存在密码子的多核苷酸序列可能是有利的。例如可选择特定革兰氏阳性宿主细胞偏倚的密码子，以增加表达率或产生具有期望特性的重组RNA转录本，例如具有比天然存在序列产生的转录本更长的半衰期。

根据本发明，可使用的改变的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD多核苷酸序列包括不同核苷酸残基的缺失、插入或替换，其产生编码相同蛋白的多核苷酸或分别编码功能上等同的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD同源蛋白的多核苷酸。本文所用的“缺失”，定义为分别缺少一或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸序列上的改变。

本文所用的“插入”或“添加”是指导致比天然存在的蛋白分别多出一或多个核苷酸或氨基酸残基的核酸或氨基酸序列上的改变。

本文所用的“替换”是指一或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸替代。

所编码的蛋白也可表现为产生沉默突变而导致FTAP1、FTAP2、PurU或FMD功能变体的氨基酸残基的缺失、插入或替换。慎重的氨基酸替换可基于残基在极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和／或两亲性上的相似性，只要变体保持调节分泌的能力。例如，带负电荷的氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水值和非荷电极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。

为了修饰基因产物的克隆、加工和／或表达，可人工改造本发明的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD多核苷酸。例如，可采用本领域熟知技术(例如定点诱变)引入突变以插入新的限制酶切位点、改变糖基化模式或改变密码的偏倚性等。

在本发明的一个实施方案中，革兰氏阳性微生物FTAP1、FTAP2、PurU或FMD多核苷酸可与异源序列连结以编码融合蛋白。融合蛋白也可改造成在FTAP1、FTAP2、PurU或FMD核苷酸序列和异源蛋白质序列之间包含一个切割位点，以便所述蛋白能与异源部分切割并纯化出来。Ⅴ．载体序列

用于在革兰氏阳性微生物中表达本发明蛋白质的表达载体包含至少一个与选自FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的蛋白相关的启动子，该启动子在宿主细胞中有功能。在本发明的一个实施方案中，所述启动子是所选蛋白的野生型启动子，在本发明的另一个实施方案中，所述启动子与该蛋白异源，但在宿主细胞中仍有功能。在本发明的一个优选实施方案中，编码所述蛋白的核酸稳定整合或以别的方式稳定存在于所述微生物基因组中。

在一个优选实施方案中，表达载体含有多克隆位点盒，其优选含有至少一个载体特有的限制性酶切位点，以便核酸操作。在一个优选实施方案中，所述载体还含有一个或多个选择性标记。本文所用之术语“选择性标记”是指能够在革兰氏阳性宿主中表达的基因，其允许方便地筛选含有所述载体的宿主。这些选择性标记的例子包括但不限于抗生素，例如红霉素、放线菌素、氯霉素和四环素。Ⅵ．转化

多种宿主细胞可用于生产FTAP1、FTAP2、PurU和FMD，包括细菌、真菌、哺乳动物和昆虫细胞。标准转化程序见John Wiley & Sons公司1987年出版Ausubel等编辑的“分子生物学最新方法”第一卷第九章(CurrentProtocols In Molecular Biology vol．1，edited by Ausubel et alJohn Wiley & Sons，Inc．1987，chapter 9)，包括磷酸钙法、DEAE-葡聚糖转化法和电穿孔转化法。植物转化方法见Rodriquez(WO 95／14099，1995年5月26日出版)。

在一个优选实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性微生物，在另一个优选实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属。在本发明的一个实施方案中，编码本发明一个或多个蛋白质的核酸通过能在芽孢杆菌属宿主细胞中复制的表达载体导入宿主细胞。能在芽孢杆菌属中复制的合适质粒参见Harwood和Cutting编辑John Wiley & Sons 1990年出版的“芽孢杆菌属分子生物学方法”(Molecular Biological Methods for Bacillus，Ed．Harwood and Cutting，John Wiley & Sons，1990)，特此以参考文献方式并入；见关于质粒的第三章。能在芽孢杆菌属中复制的合适质粒列在第92页。

在另一个实施方案中，编码本发明蛋白质的核酸稳定整合到所述微生物基因组中。优选的宿主细胞是革兰氏阳性宿主细胞。另一个优选宿主是芽孢杆菌属。另一个优选宿主是枯草芽孢杆菌。在芽孢杆菌属中直接克隆DNA的几种策略参见文献。质粒标记获救转化涉及含有部分同源之宿主质粒的感受态细胞摄取供体质粒(Contente等，质粒(Plasmid)2：555-571(1979)；Haima等，Mol．Gen．Genet．223：185-191(1990)；Weinrauch等，细菌学杂志(J．Bacteriol．)154(3)：1077-1087(1983)；和Weinrauch等，细菌学杂志．169(3)：1205-1211(1987))。摄入的供体质粒以类似染色体转化的过程与宿主“辅助”质粒的同源区重组。

对于不同宿主的原生质体转化参见下列文献：芽孢杆菌属见Chang和Cohen，(1979)Mol. Gen．Genet 168：111-115；巨大芽孢杆菌(B．Megaterium)见Vorobjeva等，(1980)FEMS Microbiol．Letters7：261-263；淀粉液化芽孢杆菌(B．amyloliquefaciens)见Smith等，(1986)Appl．and Env．Microbiol．51：634；苏云金芽孢杆菌(B．thuringiensis)见Fisher等，(1981)Arch．Microbiol．139：213-217；球状芽孢杆菌(B．sphaericus)见McDonald(1984)普通微生物学杂志(J．Gen．Microbiol．)130：203；幼虫芽孢杆菌(B．larvae)见Bakhiet等，(1985)49：577。Mann等(1986，Current Microbiol．13：131-135)报道了芽孢杆菌属原生质体转化，Holubova(1985，Folia Microbiol．30：97)公开了使用包含DNA的脂质体将DNA导入原生质体的方法。Ⅶ．转化体的鉴定

不论宿主细胞转化的是突变的还是天然存在的编码革兰氏阳性FTAP1、FTAP2、PurU或FMD基因，检测标记基因是否表达可提示所感兴趣的基因是否存在。但是，所述基因的表达应进一步确证。例如，如果编码FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的核酸插入标记基因序列中，则含有插入基因的重组细胞可用标记基因功能的缺失来鉴定。另一种方法是，标记基因可与编码FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的核酸串联在同一个启动子的控制下。诱导或选择引起的标记基因的表达通常也指示了FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的表达。

此外，含有FTAP1、FTAP2、PurU和FMD编码序列并表达该蛋白的宿主细胞可用本领域专业人员已知的各种程序来鉴定。这些程序包括但不局限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交，和蛋白质生物测定或免疫测定技术，其包括用于检测和／或定量核酸或蛋白质的基于膜的、溶液的或芯片的技术。

所述多核苷酸的存在可通过采用枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的探针、部分或片段进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。Ⅷ．重组蛋白质的分泌

用于确定革兰氏阳性宿主细胞异源或同源蛋白质的分泌水平和检测分泌蛋白的方法，包括使用对所述蛋白特异的多克隆或单克隆抗体。例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分类术(FACS)。这些分析或其它分析参见Hampton R等(1990，SerologicalMethods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，J Exp Med 158：1211)及其它文献．

本领域专业人员已知的广泛的标记和偶联技术可用于各种核酸和氨基酸分析。产生用于检测特异多核苷酸序列的标记杂交或PCR探针的方法包括寡核苷酸标记、切口平移、末端标记或用标记的核苷酸进行PCR扩增。另一种方法是，所述核苷酸序列或其任何部分可克隆到载体中以产生mRNA探针。这些载体是本领域已知的，可通过商业途径获得，并可通过加入合适的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6聚合酶和标记核苷酸用于体外合成RNA探针。

许多公司例如Pharmacia Biotech (Piscataway NJ)、Promega(Madison WI)和US Biochemical Corp (Cleveland OH)提供用于这些方法的商业试剂盒和操作程序。适合的报告分子或标记物包括那些放射形核素、酶、荧光、化学发光或生色试剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒和诸如此类的物质。这些标记物的使用参见美国专利3，817，837；3，850，752；3，939，350；3，996，345；4，277，437；4，275，149和4，366，241。重组免疫球蛋白还可按美国专利4，816，567号所示生产，上述专利作为参考文献并入本文。Ⅸ．蛋白质纯化

转化了编码异源或同源蛋白质之多核苷酸序列的革兰氏阳性宿主细胞可在适合于表达的条件下培养并从细胞培养物中回收所编码蛋白。含有本发明FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的重组革兰氏阳性宿主细胞产生的所述蛋白质会分泌到培养基中。其它重组构建可将异源或同源多核苷酸序列和编码便于纯化可溶性蛋白的多肽域核苷酸序列连接起来(Kroll DJ等(1993) DNA Cell Biol 12：441-53)。

这些便利纯化的结构域包括但不限于可用固定化金属纯化的金属螯合多肽例如组氨酸-色氨酸组件(Porath J (1992) Protein Expr Purif3：263-281)，可用固定化免疫球蛋白纯化的蛋白A结构域，和FLAGS延伸／亲合纯化系统(Immunex Corp，Seattle WA)所使用的结构域。为了便于纯化可在纯化结构域和异源蛋白质之间插入可切割的接头序列例如因子XA或肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)。Ⅹ．本发明的用途FTAP1、FTAP2、PurU和FMD以及遗传工程化宿主细胞

本发明提供了遗传工程化革兰氏阳性微生物，其优选在编码FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的天然存在基因中包含导致活性完全丧失或消除的不可逆突变或缺失。

在另一个实施方案中，所述微生物可进一步遗传改造以产生重组蛋白或多肽。在一个优选实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属。在另一个优选实施方案中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌。

在可替代的另一实施方案中，宿主细胞被遗传改造以产生革兰氏阳性FTAP1、FTAP2、PurU或FMD。在一个优选实施方案中，宿主细胞在大规模发酵条件下生长，并分离和／或纯化FTAP1、FTAP2、PurU或FMD。FTAP1、FTAP2、PurU和FMD多核苷酸

枯草芽孢杆菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD多核苷酸或其任何部分提供了利用杂交技术或PCR技术检测革兰氏阳性微生物同源多核苷酸存在的基础。

因此，本发明的一个方面是提供核酸杂交和PCR探针，其用于检测编码革兰氏阳性FTAP1、FTAP2、PurU或FMD或其部分的多核苷酸序列(包括基因组或cDNA序列)。

上述说明书中提及的所有出版物和专利均以参考文献并入本文。本领域专业人员将明了本发明描述的方法和系统的各种修改和变更而不脱离本发明的范围和精神。尽管本发明是联系特定优选实施方案来描述的，但应该理解本发明不应该不适当地局限于这些特定实施方案。事实上，为分子生物学和相关领域技术人员所明了的实施本发明的所描述模式的各种修改都应当包含在下列权利要求的范围之内。

实施例材料和方法菌株和培养基

所用的枯草芽孢杆茵菌株是I168衍生茵株，称为BG125(hisAl thr5trpC2)，由J．A．Hoch提供。该菌株生长于Luria-Bertani琼脂(LA．1％SBG)培养基上，其含有如下成分：豆胨(soytone)，Difco，10g／L；葡萄糖，Sigma，10g／L；酵母提取物，Difco，5g／L；NaCl，Norton，10g／L，pH7．0。1％SBG加MOPS(Sigma)含有pH7．0的80mM MOPS。在指明的地方向1％SBG中加入各种浓度的甲酸钠(EM Science)。所有培养基的pH值用NaOH调节至7。甲酸杀菌测试所用生长培养基是1％SBG，其补充了50mM MES(Sigma)和50mM HEPES(Sigma)，然后用NaOH或HCl调节pH至所指明的值。然后加入甲酸至终浓度50mM，这不会导致生长培养基的pH值改变。质粒的构建和增殖采用MM294感受态细胞(Ausubel等。1992，Short Protocols in Molecular Biology。JohnWiley and Sons，New York)。LB液体培养基和琼脂培养基用于MM294感受态细胞的生长，用于筛选时补充50ug／ml羧苄青霉素。用于筛选时BG125生长在补充了10ug／ml卡那霉素的LB琼脂或LB液体培养基上。

甲氧苄胺嘧啶溶解在50％乙醇中，在指明处当生长达到克莱特(Klett)读数在20-30单位时，添加至终浓度50ug／ml。用于甲氧苄胺嘧啶实验的添加物按下列终浓度加入：10ug／ml甘氨酸，10ug／ml甲硫氨酸，50ug／ml胸苷，20ug／ml腺苷和20ug／ml鸟苷。DNA操作

染色体DNA提取、质粒DNA提取、PCR产物纯化和DNA片段凝胶回收分别使用QIAGEN血液和培养细胞DNA提取试剂盒、QlAprep SpinMiniprep试剂盒、QlAquick PCR纯化试剂盒和QlAquick凝胶回收试剂盒进行。DNA的PCR酶法扩增按照标准程序进行。DNA的限制酶消化和连接按生产厂家说明进行。yrhG(FTAP1)和ywcJ(FTAP2)基因的DNA序列同源性搜索用GCG软件包进行(Genetics Computer Group)。质粒构建

本研究所用克隆载体是pUC／Ts／Kan，一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。该质粒含有pUC19质粒、来自金黄色葡萄球菌(Staphylcoccusaureus)质粒衍生物pEl94Ts的温度敏感型复制起点(Fleming等。1995，App．Env．Microb．61：3775-3780)和来自于粪链球菌(Streptococcusfaecalis)的卡那霉素基因(Trieu-Cuot等1983，Gene 23：331-341)。

通过PCR从枯草芽孢杆菌BG125染色体DNA中扩增yrhG基因的一个0．483kb DNA片段，扩增采用Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)和寡核苷酸引物GCGCGCGGATCCGTAATTGGCGATCTTCCGAAAGAATGG(SEQ ID NO：11)和GCGCGCCTGCAGGGGAACCAGATGCCAAGGATTTTTCC(SEQ IDNO：12)(BamHⅠ和PstⅠ位点以下划线表示)。PCR产物用BamHⅠ和PstⅠ消化，并与质粒pUC／Ts／Kan的5．3-Kb BamHⅠ-PstⅠ片段连接，以构建yrhG同源基因中断的质粒pTRANS1。质粒pTRANS2的构建采用类似方法：用Taq DNA聚合酶和寡核苷酸引物GCGCGCGGATCCTTGGTTTTGGCATTACAGCCGC (SEQ ID NO：13)和GCGCGCCTGCAGAGGGTGCTCGATCAAAAGCGAGATGG (SEQ ID NO：14)扩增ywcJ基因的一个0．543kb DNA片段(BamHⅠ和PstⅠ位点以下划线表示)，PCR产物用BamHⅠ和PstⅠ消化，并与质粒pUC／Ts／Kan的5．3-Kb BamHⅠ-PstⅠ片段连接，以构建ywcJ同源基因中断的质粒。在pTRANS1和pTRANS2中断质粒上用Applied Biosystems 373A DNA测序仪进行DNA序列分析，以确证PCR产生片段的正确性。所用测序引物是从New England Biolabs购买的mp19／pUC19 24-mer反向测序引物和mp19／pUC19 24-mer测序引物。中断基因导入枯草芽孢杆菌

为了构建含有中断的yrhG或ywcJ基因的枯草芽孢杆菌菌株，用原生质体转化法(见Chang等1979，Mol．Gen．Genet．168：111-115)分别将pTRANS1和pTRANS2转化至BG125中，并在30℃铺平板于含200ug／ml卡那霉素的原生质体再生培养基上。产生的卡那霉素抗性转化体在含卡那霉素的LB液体培养基中45℃过夜生长。将整合体铺平板，然后含卡那霉素的LB平板上于45℃进行菌落纯化。然后将分离的菌落置于含30％甘油的LB液体培养基中，-70℃冰冻保存。生长条件

摇瓶实验之前，取自冰冻储存物的BG125在LB琼脂平板上37℃生长过夜。将细胞从平板转移至含有6ml 1％SBG的试管中，37℃生长三小时。取0．2ml上述种子培养物接种于预热的含有20ml适宜培养基的300ml浊度计(nephlometer)烧瓶中。将烧瓶置于New Brunswick科研用摇床(New Brunswick Scientific Shaker)在37℃(除非特殊指出)以300rpm孵育，在指定的时间点，用Klett-Summerson光电色度计测定细胞量，用Corning pH计(Corning pH／iometer)测量烧瓶pH值，并取1．25ml培养物用于进一步分析。将该样品在eppendorf微量离心机中离心，取1ml上清液与30μl高氯酸混合进行HPLC分析。保存剩余上清用于葡萄糖分析。所有样品在分析之前均保存在-70℃。以逐步加入HCl并测定pH值来进行培养基pH滴定。PH值和甲酸对枯草芽孢杆菌的杀菌实验通过按上述方法在1％SBG中培养BG125至5×10⁶ cfu／ml密度来进行。然后用pH已调至所指明值的含或不含50mM甲酸的缓冲1％SBG调节细胞浓度至5×10⁴cfu／ml。之后，将培养物在37℃振荡培养3小时。分别在0、1、2和3小时取样，系列稀释，并铺板于37℃LB上，用于细胞活力测定。代谢副产物分析

将1ml酸处理的培养物上清液通过0．2μm薄膜滤器过滤。代谢副产物的浓度用高效液相层析(HPLC)测定。采用加热至50℃的Shodex SH1011阳离子交换柱。所用的溶剂是流速为0．4ml／min的5mM硫酸(H₂SO₄)。所述HPLC系统包括带有LP-21型脉冲阻尼器SSI的Waters 510型泵，折射率检测器Waters 410型示差折光仪，每个样品用712WISP型Waters自动进样器注射20μl。所述HPLC和Millennium 2．15．01 HPLC控制系统连接，用于流动相的流量控制、积分以及数据收集和储存。为了鉴定不同的峰，分析标准样品并与样品中的峰比较。所述标准品包括：3-羟基丁酮，乙酸，2，3-丁二醇，丁酸，柠檬酸，甲酸，乙醇，富马酸，苹果酸，甘油，乳酸，丙酸，丙酮酸，所有标准品均来自Sigma。

实施例Ⅰ

实施例Ⅰ阐明了甲酸的添加通过控制pH值来提高生长。

按“材料和方法”所述培养BG125。在含或不含3g／l(44mM)甲酸钠的1％SBG(pH7)培养基中，与对照烧瓶相比添加甲酸盐导致了总生长的增加，并且避免了摇瓶pH值降至6．5以下，而对照烧瓶pH值降至5．5(图5)。甲酸的pKa值为3．73，在起始pH值为7时应没有缓冲活性。为排除我们培养基的任何缓冲效果，对1％SBG和含有3g／l甲酸钠或80mMMOPS的1％SBG进行滴定实验。图6显示，1％SBG和含有甲酸钠的1％SBG在pH值一直降至5．0的过程中均无缓冲活性。含MOPS(pKa 7．20)的1％SBG在期望范围内表现出缓冲活性。当BG125在含有避免pH降至6．3以下的80mM MPOS的1％SBG中生长时，所述茵株的生长与含有甲酸盐烧瓶的水平相近(图5)。此外，含有MOPS和甲酸盐的烧瓶中菌株的生长与MOPS烧瓶中菌株的生长基本相同(图5)。

实施例Ⅱ

实施例Ⅱ阐明了甲酸盐浓度的增加造成起始生长速率的延迟。

当使用3g／l甲酸钠时，观察到起始生长速率的轻微延迟。为进一步研究这种延迟，检测了更高浓度甲酸钠(高达21g／l)存在下BG125的生长。发现在甲酸浓度增加和初始延迟期的持续时间之间存在相关性。所有测试的培养物在延迟期之后以相似的速率保持生长，并达到比对照更高的密度。

实施例Ⅲ

实施例Ⅲ阐明了添加甲酸导致了乙酸产生的增加。

为进一步研究甲酸对BG125生长的影响，我们还研究了在图5的摇瓶中各种有机副产物的产生和葡萄糖的利用。图8显示，对于甲酸和甲酸加MOPS的烧瓶，从培养基中摄取甲酸开始于指数生长早期，并在稳定期开始之前完全停止(图8)。乙酸水平(图9)的测定揭示这种化合物在所有烧瓶中大量产生，这可能是在1％SBG中生长期间pH降低的原因；然而，在不同烧瓶中所产生的乙酸量的确不同。首先，仅含1％SBG的对照烧瓶产生乙酸缓慢，并达到约1．5g／l。有MOPS缓冲的烧瓶以比对照更快的速率达到接近2g／l的乙酸。含有甲酸的两个烧瓶产生乙酸的持续时间最长，并达到2．5-3g／l的乙酸。

实施例Ⅳ

实施例Ⅳ阐明了甲酸不能增强葡萄糖的摄取。

实验过程中测定葡萄糖水平(图10)时，MOPS、甲酸、和MOPS加甲酸烧瓶以同样速率利用葡萄糖，至450分钟葡萄糖的利用不能检测为止。对照烧瓶以相同速率利用葡萄糖，直至250分钟时摄取开始减慢并终止于6g／l。

实施例Ⅴ

实施例Ⅴ显示了在存在甲酸时甲氧苄胺嘧啶的添加减缓菌株生长。

为研究甲氧苄胺嘧啶(一种四氢叶酸合成抑制剂)的作用，我们进行了如下实验：向含1％SBG、1％SBG加甲酸加生长添加剂的烧瓶和含有1％SBG加生长添加剂的对照烧瓶中加入甲氧苄胺嘧啶。还测定了用于溶解甲氧苄胺嘧啶的乙醇的作用。图11显示，与仅含1％SBG的培养基相比，在1％6SBG培养基中添加甲氧苄胺嘧啶对培养的枯草芽孢杆菌的生长有抑制作用。向含甲氧苄胺嘧啶的烧瓶中加入添加剂，通过依赖四氢叶酸的辅助途径菌株生长得以部分恢复。当甲酸加入含有甲氧苄胺嘧啶和生长增强添加剂的烧瓶中，生长速率明显降低，但仍然高于仅含甲氧苄胺嘧啶的烧瓶的生长速率。乙醇对生长无任何作用。

实施例Ⅵ

甲酸增强了低pH对枯草芽孢杆菌培养物的杀菌效果

为了确定在pH7．0时所观察到的甲酸的任何作用如枯草芽孢杆菌生长延迟是否涉及对一部分细胞群体的致死毒性，我们测定了甲酸对pH7或更低的培养物中细胞活力的影响。因为甲酸pKa值为3．75，我们认为甲酸在该pH值附近是有毒的。在pH3．6、4．0、4．6和7．0时，将BG125培养物接种至含或不含50mM甲酸的缓冲1％SBG培养基中。结果显示，在pH3．6时，含有或不含甲酸的培养物在2小时孵育时间内完全丧失了活力。在pH3．6培养1小时后，基于初始滴定量的存活细胞百分数为1．8％，而甲酸的加入使存活百分数持续降低至平均0．13％。在pH4．0时，在不含甲酸的培养基中孵育导致了比pH3．6时较少的活力丧失，孵育3小时后存活细胞达到38％。在pH4．0时，甲酸使活力丧失增加，3小时后存活细胞降至1．2％。含或不含甲酸的培养物在pH4．6孵育时没有显示活力降低。在pH7．0孵育时也没有显示活力的降低，并有细胞计数增加，提示出现了该浓度甲酸下期望的某种生长。

这些结果提示革兰氏阳性微生物发酵需要控制pH值，并且，如果在培养物中产生了甲酸则不应使pH降至4．6以下。

实施例Ⅶ

FTAP1和FTAP2的同源基因

FTAP1(YrhG)和FTAP2(YwcJ)的同源基因显示在表1A和表1B中。已发现的所有这些同源基因指示YrhG和YwcJ与甲酸或其它小分子运输中涉及的蛋白质相关。预测YrhG和YwcJ是含有多个跨膜区的小分子疏水蛋白质。

实施例Ⅷ

实施例Ⅷ阐明了中断FTAP1或FTAP2编码基因对芽孢杆菌属细胞生长的影响，分别见图16和17。

对于两个基因，构建PCR引物以扩增基因的内部区用于基因中断。将这些内部片段克隆至带有芽孢杆菌属温度敏感型复制起点的复制性质粒中。当转化入枯草芽孢杆菌测试菌株时，通过质粒标记的抗生素筛选来维持所述质粒。

在抗生素存在时提高温度，获得了所述质粒已通过同源区整合入芽孢杆菌属染色体中的克隆。这就导致了被测基因的中断，这种基因中断通过在抗生素存在时高于复制起点活性温度的条件下培养所述细胞来维持。在含有1％SBG、抗生素和含或不含甲酸的摇瓶中测定了整合体。据测定，单独存在抗生素对整合体的生长无影响。以含有无所述质粒的菌株的烧瓶为对照测定整合体。

结果显示，每种基因的中断仅在加入甲酸时对生长有影响。YrhG基因中断使正常的甲酸生长增强效果降低了一半。这些现象可用基因中断引起的甲酸摄入降低来解释。YwcJ(FTAP2)基因中断导致了毒性作用，致使细胞生长远低于不含甲酸的对照菌株的生长。因此看来两个基因都在甲酸运输或利用中起作用。

在阅读了本公开书的本领域专业人员会明了各种其它例子和以上描述和实施例的修改，而不违背本发明的精神和范围，并且所有这些例子和修改都应包含在附及的权利要求的范围之内。本文所参考的所有出版物和专利在此以参考文献完整并入本文。

表1A

YrhG和YwcJ蛋白与有关多肽之间的氨基酸序列同源性与YrhG蛋白的同源性

^aSalmonella thyphimuriun鼠伤寒杆菌^bMethanobacteria甲烷细菌^cHaemophilus influenzae流感嗜血杆菌

表1B与YwcJ蛋白的同源性

所有值都是序列相同百分数^aSalmonella thyphimuriun鼠伤寒杆菌^bMethanobacteria甲烷细菌^cHaemophilus influenzae流感嗜血杆菌

Claims

1．一种用于在革兰氏阳性微生物中生产产品的方法，其包括：

a)获得能表达所述产品的微生物，所述微生物包含ⅰ)甲酸运输相关蛋白1(FTAP1)和ⅱ)甲酸运输相关蛋白2(FTAP2)之一或二者兼有；和

b)在存在甲酸并适合所述产品生产的条件下培养所述微生物。

2．权利要求1的方法，其中所述产品是重组蛋白。

3．权利要求2的方法，其中所述重组蛋白与所述微生物同源。

4．权利要求2的方法，其中所述重组蛋白与所述微生物异源。

5．权利要求1的方法，其中所述革兰氏阳性微生物是芽孢杆菌属。

6．权利要求5的方法，其中所述芽孢杆菌属包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

7．权利要求2的方法，其中所述重组蛋白包括激素、酶、生长因子和细胞因子。

8．权利要求7的方法，其中所述蛋白是酶。

9．权利要求8的方法，其中所述酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、漆酶和蛋白质二硫键异构酶。

10．权利要求1的方法，其中所述FTAP1具有图1所示的氨基酸序列。

11．权利要求1的方法，其中所述FTAP2具有图2所示的氨基酸序列。

12．一种在革兰氏阳性微生物中生产产品的方法，其包括：

a)获得可表达所述产品并在编码PurU的核酸中含有一个突变的革兰氏阳性微生物，所述突变导致所述微生物PurU活性生产的抑制；

b)在适合生产所述产品的条件下培养所述微生物。

13．权利要求12的方法，其中所述产品是重组蛋白。

14．权利要求13的方法，其中所述重组蛋白与所述革兰氏阳性微生物同源。

15．权利要求13的方法，其中所述重组蛋白与所述革兰氏阳性微生物异源。

16．权利要求13的方法，其中所述革兰氏阳性微生物是芽孢杆菌属。

17．权利要求16的方法，其中所述芽孢杆菌属包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

18．权利要求13的方法，其中所述重组蛋白包括激素、酶、生长因子和细胞因子。

19．权利要求18的方法，其中所述蛋白是酶。

20．权利要求19的方法，其中所述酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、漆酶和蛋白质二硫键异构酶。

21．一种在革兰氏阳性微生物中生产产品的方法，其包括步骤：

a)获得可表达所述产品并在编码FTAP1和FTAP2的核酸之一或两者中有一个突变的革兰氏阳性微生物，所述突变导致所述微生物FTAP1和／或FTAP2活性生产的抑制；和

b)在适合生产所述产品的条件下培养所述微生物。

22．一种在革兰氏阳性微生物中生产产品的方法，其包括步骤：

a)获得可表达所述产品的革兰氏阳性微生物；

b)修饰所述微生物的FMD表达；和

c)在适合生产所述产品的条件下培养所述微生物。

23．权利要求21或22的方法，其中所述产品是重组蛋白。

24．一种改变革兰氏阳性微生物生长的方法，其包括修改所述革兰氏阳性微生物中的甲酸运输。

25．一种革兰氏阳性微生物，其包括编码FTAP1和FTAP2之一或两者的分离的核酸。

26．一种革兰氏阳性微生物，其PurU编码基因中含有一个突变，所述突变导致PurU活性的抑制。

27．权利要求25或26的微生物，其还包括编码一种蛋白质的核酸。

28．权利要求27的微生物，其中所述蛋白质是酶。

29．权利要求28的微生物，其中所述酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、漆酶和蛋白质二硫键异构酶。

30．一种表达载体，其包含编码至少FTAP1、FTAP2、PurU和FMD之一的核酸。

31．包含权利要求30的表达载体的宿主细胞。