JP6993339B2 - タンパク質産生の強化およびその方法 - Google Patents
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Description
本願は、2015年12月23日に出願された米国仮特許出願第62/387,578号、および2016年3月15日に出願された米国仮特許出願第62/308,440号の利益を主張するものであり、それらはいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「NB40883WOPCT_SequenceListing.txt」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、2016年11月16日に作成され、サイズは39KBであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
さらに他の実施形態では、rasP遺伝子は、配列番号2のRasPポリペプチドに対し80%のアミノ酸配列同一性を含むRasPポリペプチドをコードし、配列番号2のRasPポリペプチドの20~24のアミノ酸残基とアラインする、配列番号7の活性部位コンセンサス配列(HEXXH)を含む。
前述したように、rasP遺伝子は、「調節アンチシグマ因子プロテアーゼ」、すなわち「RasP」(以前はYluCとして知られる)をコードし、亜鉛依存性膜内切断プロテアーゼ(すなわち「iClip)の群に属し、本明細書ではさらに、サイト2プロテアーゼ(S2P)またはサイト2亜鉛メタロプロテアーゼ(例えば、Saito et al.,2011;Heinrich et al.,2008を参照)と定義される。本明細書で定義する場合、「rasP」遺伝子(または、そのORF)は「RasP」ポリペプチドをコードするが、特定のRasPポリペプチド配列(または、それをコードするrasP遺伝子もしくはORF配列)に限定するものではない。
本開示は、一般に、1種以上の目的タンパク質をより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞に関する。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、非改変(すなわち、親)グラム陽性菌細胞と比較して、より多量にPOIを産生する改変グラム陽性菌細胞を対象としており、その改変(すなわち、娘)細菌細胞は、rasP遺伝子の発現を増大させる改変を含んでいる。
改変グラム陽性菌細胞がPOIをより高いレベルで産生することを確認するために、様々なスクリーニング法を適用することができる。例えば、発現ベクターが、標的タンパク質へのポリペプチド融合をコードでき、検出可能な標識として機能するか、または標的タンパク質自体が選択可能な、もしくはスクリーニング可能なマーカーとして機能し得る。標識タンパク質もまた、ウエスタンブロット法、ドットブロット法(このような方法の詳細な説明は、Cold Spring Harbor Protocolsのウェブサイトで入手可能である)、ELISA、または、標識がGFPであれば、全細胞蛍光法またはFACSを用いて検出することができる。
Qp=gP/gDCW・hr
(式中、「gP」はタンク内で生成されたタンパク質のグラム数であり、「gDCW」はタンク内の乾燥細胞重量(DCW)のグラム数であり、「hr」は、生成時間および増殖時間を含む接種時点からの発酵時間(時間)である)。
他の実施形態では、本開示は、非改変(親)細胞と比較して(すなわち、同細胞に対して)改変細菌細胞のタンパク質生産性を高める方法を提供する。より具体的には、いくつかの実施形態において、改変細菌細胞のタンパク質生産性を高める方法は、改変細菌細胞を好適な発酵条件下で培養することを含み、その改変細胞は、rasP遺伝子の発現を増大させる改変を含む。
本開示のRasPポリペプチドまたはPOIをコードする核酸を含むポリヌクレオチドコンストラクトは、宿主細胞によって発現されるように構築することができる。知られている遺伝子コードの縮重のため、同一のアミノ酸配列をコードする異なるポリヌクレオチドを当該技術分野の一般的な技能により設計し作製することができる。例えば、コドン最適化は、特定の宿主細胞における産生の最適化に適用することができる。
他の実施形態では、本開示は、POIをより多量に発現する改変グラム陽性菌細胞を得る工程(ここで、改変細菌細胞は、rasP遺伝子(または、そのORF)の発現を増大させる改変を含む)と、POIを発現するような条件下で改変細胞を培養する工程(ここで、POIをより多量に発現する改変細菌細胞は、非改変グラム陽性菌細胞におけるPOIの発現との比較である)とを含む、POIをより高いレベルで産生する方法を提供する。
他の実施形態では、本開示は、1種以上の目的タンパク質を含むタンパク質性組成物を提供する。タンパク質性組成物は、好適には、本明細書に提示した方法を使用して生成される。本組成物は、本明細書に記載した方法を使用して発現させた、目的遺伝子によってコードされた目的タンパク質を含む。本組成物は、例えばバイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工、動物栄養、食品組成物、織物処理、パーソナルケア製品などの様々な有用な工業用途において使用することができる。
(a)POIをより多量に産生する改変グラム陽性菌細胞を得る工程(ここで、改変細菌細胞はrasP遺伝子の発現を増大させる改変を含む)と、
(b)POIが発現するような条件下で改変細胞を培養する工程(ここで、POIをより多量に産生する改変細菌細胞は、非改変(親)グラム陽性菌細胞における同じPOIの産生との比較である)と
を含む方法。
(a)親グラム陽性菌細胞に、rasP遺伝子発現を増大させる、少なくとも1つの遺伝子改変を導入する工程と、
(b)POIをより多量に発現する1つ以上の娘細胞を選択する工程
(ここで、POIをより多量に産生させるために選択された1つ以上の娘細胞は、改変(娘)グラム陽性菌細胞と定義される)と
を含む方法。
改変バチルス・サブティリス(BACILLUS SUBTILIS)宿主細胞の構築
Taqポリメラーゼ、dNTPおよび緩衝液をTakara Bio Inc.(Clontech Laboratories、Inc.;Mountain View,CA)から購入し、下記の変異B.サブティリス(B.subtilis)細胞の構築に使用した。Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabs;Ipswich,MA)をベクターの構築に使用した。プライマーをEurogentec(Liege,Belgium)から得た。
B.サブティリス(B.subtilis)細胞のrasP欠失変異体(“ΔrasP”)を、Fabret et al.(2002)に記載の修正変異送達法を用いて構築した。親B.サブティリス(B.subtilis)細胞は欠失upp遺伝子(“Δupp”)を含む。B.サブティリス(B.subtilis)(Δupp)細胞中のrasP遺伝子を完全に置換(欠失)するために、rasP遺伝子の5’側および3’側フランキング領域を、配列番号44および配列番号45のPCRプライマー対を使用して増幅させた。
Fabret et al.(2002)の修正変異送達法をさらに用いて、B.サブティリス(B.subtilis)(Δupp)細胞のtepA遺伝子欠失変異体(「ΔtepA」)を構築した。こうして、tepA遺伝子を完全に置換するために、これらの遺伝子の5’側および3’側フランキング領域を、配列番号12/配列番号13、および配列番号14/配列番号15のPCRプライマー対を使用して増幅させた。増幅させた断片を、upp遺伝子およびcI遺伝子を含むフレオマイシン耐性カセットに融合させた(see,Fabret et al.,2002)(Fabret et al.,2002を参照)。その後、得られた融合産物を用いて、コンピテンスを0.3%キシロースで誘導したコンピテントB.サブティリス(B.subtilis)Δupp::neoR(親)細胞を形質転換した。これにより、標的tepA遺伝子を欠損した、フレオマイシン耐性でネオマイシンに感受性を有する菌株が得られた。配列番号16/配列番号15、および配列番号16/配列番号11のプライマーの組み合わせを用いてPCR反応を行い、tepA遺伝子の正確な欠失を確認した。
1.組み込み型ベクターpRS-spoIIIAA~AGの構築
spoIIIAA~AB遺伝子の1,040塩基対DNA断片(配列番号17)を、配列番号 18/配列番号 19のプライマー対を用いて増幅した。2つのlox配列(すなわち、配列番号20)で挟まれたスペクチノマイシン耐性マーカーを、IDT(Integrated DNA Technologies)にg-Blockとして合成発注し取り寄せた。spoIIIAF~AG遺伝子の981塩基対DNA配列(すなわち、配列番号21)を、配列番号22および配列番号23のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。商業的に入手可能なプラスミド「pRS426」を、配列番号24および配列番号25のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。その後、上記DNA配列(すなわち、配列番号17、配列番号20、配列番号21)、およびpRS426増幅ベクターをGibson Assembly(登録商標)HiFi 1 Step Kit(SGI)を用いてインビトロでアセンブルして、組み込み型ベクター「pRS-spoIIIAA~AG」を生成した。
本明細書に記載のいくつかのrasP過剰発現実験のために、B.サブティリス(B.subtilis)spoVG遺伝子のプロモーターを使用して、rasP遺伝子を駆動(過剰発現)させた。例えば、spoVGプロモーターの配列(配列番号3)を含む合成g-BlockをIDT(Integrated DNA Technologies)から取り寄せた。rasPコード配列を、配列番号26および配列番号27のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより増幅させた。「pRS-spoIIIAA~AG」として示されるプラスミドを、配列番号28および配列番号29のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。spoVGプロモーター配列、rasPコード配列およびプラスミドpRS-spoIIIAA~AGをGibson Assembly(登録商標)HiFi 1 Step Kit(SGI)によりアセンブルして、プラスミド「pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP」を作った。RasPポリペプチドの発現および産生をさらに増大させるために、配列番号5のaprE(遺伝子)リーダー配列(すなわち、5’-UTR)を、rasP遺伝子の前(5’側)にクローニングして、プラスミド「pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-UTR-rasP」を生成した。
本明細書において「pRS-spoIIIAA~AG-PaprE-rasP」と称するrasP(遺伝子)過剰発現プラスミドを構築するために、B.サブティリス(B.subtilis)aprE(遺伝子)プロモーター(「PaprE」;配列番号4)をベクターの5’側に導入し、rasPコード配列に作動可能に連結させた。B.サブティリス(B.subtilis)aprEプロモーターの核酸配列を、配列番号30および配列番号31のオリゴヌクレオチドを用いて、B.サブティリス(B.subtilis)ゲノムからPCRによって増幅させた。プラスミド「pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP」を、配列番号32および配列番号33のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより増幅させた。aprEプロモーター(PaprE)およびプラスミドをGibson Assembly(登録商標)HiFi 1 Step Kit(SGI)によりライゲートした。
シグナルペプチドペプチダーゼのヌクレオチド配列を、配列番号34および配列番号35のオリゴヌクレオチドを用いてB.サブティリス(B.subtilis)ゲノムDNAから増幅させた。pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasPのプラスミド骨格を、配列番号36/配列番号37のオリゴヌクレオチド対を使用してPCRにより増幅させた。tepA遺伝子配列および増幅したプラスミドをGibson Assembly(登録商標)HiFi 1 Step Kit(SGI)によりライゲートした。得られたプラスミドをpRS-spoIIIAG-PspoVG-tepAと名付けた。
異種rasPまたはtepA遺伝子コンストラクトによるB.サブティリス(B.subtilis)宿主細胞の形質転換
プラスミドpRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP(実施例1.C.2を参照)、pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-UTR-rasP(実施例1.C.2を参照)、pRS-spoIIIAA~AG-PaprE-rasP(実施例1.C.3を参照)およびpRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-tepA(実施例1.C.4を参照)をそれぞれ、制限エンドヌクレアーゼScaIで線状化し、各プラスミドを個別にコンピテントバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)細胞に形質転換した。ポジティブコロニーを、スペクチノマイシンを100μg/ml含有するルリア寒天プレート上で選択した。得られた(形質転換された)B.サブティリス(B.subtilis)(娘)細胞を、本明細書では、「PspoVG-rasP」、「PspoVG-UTR-rasP」、「PaprE-rasP」および「PspoVG-tepA」と称する。
目的タンパク質をコードする異種遺伝子(発現コンストラクト)を有する改変B.サブティリス(B.subtilis)(宿主)細胞の形質転換
A.AmyL発現コンストラクト
B.サブティリス(B.subtilis)aprEプロモーター(「PaprE」)およびaprEシグナル配列(「aprE UTR」、以下「UTR」;実施例1.C.2を参照)を使用して、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)「AmyL」アミラーゼ(成熟配列配列番号38)の発現を駆動した。本明細書において「PaprE-AmyL-catR」として示した発現コンストラクト(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性(「catR」)マーカー遺伝子を含む)を、(1)B.サブティリス(B.subtilis)野生型(「wt」)細胞(すなわち、親細胞)に、(2)rasP欠失(ΔrasP)を含む改変(娘)B.サブティリス(B.subtilis)細胞に、および(3)tepA欠失(ΔtepA)を含む改変(娘)B.サブティリス(B.subtilis)細胞に形質転換した。5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で形質転換体を選択した。
B.サブティリス(B.subtilis)aprEプロモーター(「PaprE」)およびaprEシグナル配列(「UTR」)を使用して、PcuAmy1-v6と称する、パエニバチルス・カードラノリティカス(Paenibacillus curdlanolyticus)アミラーゼ(成熟配列配列番号39)多様体の発現を駆動した。「PaprE-PcuAmy1-v6-catR」と称する発現カセット(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性(catR)マーカー遺伝子を含む)を、(1)rasP遺伝子を含み、「PspoVG」プロモーターの制御下にrasP遺伝子を発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)(娘)細胞(すなわち、上記実施例2に記載した「PspoVG-rasP」細胞)に、(2)rasP遺伝子を含み、PaprEプロモーターの制御下にrasP遺伝子を発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)(娘)細胞(すなわち、上記実施例2に記載した「PaprE-rasP」細胞)に、(3)tepA遺伝子を含み、「PspoVG」プロモーターの制御下にtepA遺伝子を発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)(娘)細胞(すなわち、上記実施例2に記載した「PspoVG-tepA」細胞)に、および(4)B.サブティリス(B.subtilis)(親)細胞に形質転換した。5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。
B.サブティリス(B.subtilis)aprEプロモーター(「PaprE」)を使用して、B.サブティリス(B.subtilis)「AmyE」アミラーゼ(成熟配列配列番号40)の発現を駆動した。「PaprE-amyE-catR」と称する発現カセット(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性(catR)マーカー遺伝子を含む)を、(1)rasP遺伝子を含み、「PspoVG」プロモーターの制御下にrasP遺伝子を発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞(すなわち、上記実施例2に記載した「PspoVG-rasP」細胞)、(2)rasP遺伝子を含み、“PspoVG”プロモーターおよびaprE UTRの制御下にrasP遺伝子を発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞(すなわち、上記実施例2に記載した「PspoVG-UTR-rasP」細胞)、(3)rasP遺伝子を含み、「PaprE」プロモーターの制御下にrasP遺伝子を発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞(すなわち、上記実施例2に記載した「PaprE-rasP」細胞)、(4)tepA遺伝子を含み、「PspoVG」プロモーターの制御下にtepA遺伝子を発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞(上記実施例2に記載した「PspoVG-tepA」細胞)、(5)rasP(ΔrasP)遺伝子欠失を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞(実施例1.Aを参照)、(6)tepA(ΔtepA)遺伝子欠失を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞(実施例1.Bを参照)、および(7)非改変(親)B.サブティリス(B.subtilis)対照細胞のゲノムaprE遺伝子座に導入した。5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。
aprEプロモーター(PaprE)の制御下に発現する、B.サブティリス(B.subtilis)β-D-グルコシダーゼ(以下、「BglC」;成熟配列配列番号41)をコードする発現コンストラクトを構築し、「PaprE-BglC-catR」と称した。PaprE-BglC-catRコンストラクトを、(1)野生型(非改質;親)B.サブティリス(B.subtilis)細胞、(2)「PspoVG-rasP」を含み、発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞、(3)「PaprE-rasP」を含み、発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞、および(4)“PspoVG-tepA”を含み、発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞のaprE遺伝子座に導入した。5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。
aprEプロモーター(PaprE)の制御下に発現する、プロテアーゼProperase(成熟配列配列番号42)をコードする発現コンストラクトを構築し、「PaprE-Properase-catR」と称した。PaprE-Properase-catR発現コンストラクトを、(1)「PspoVG-rasP」を含み、発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞、(2)「PaprE-rasP」を含み、発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞、(3)「PspoVG-tepA」を含み、発現/過剰発現する、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞、および(4)野生型(非改質;親)B.サブティリス(B.subtilis)細胞のaprE遺伝子座に導入した。5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。25μg/mlのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、ポジティブコロニーを選択した。
aprEプロモーター(PaprE)の制御下に発現する、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)プロテアーゼBPN’-Y217L(配列番号43)をコードする発現コンストラクトを構築し、「PaprE-BPN’-Y217L-catR」と称した。PaprE-BPN’-Y217L-catR発現カセットを、(1)rasP(ΔrasP)遺伝子欠失を含む改変バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)細胞、(2)tepA(ΔtepA)遺伝子欠失を含む改変バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)細胞、および(3)野生型(非改質;親)B.サブティリス(B.subtilis)細胞に形質転換した。5μg/mlのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で、PaprE-BPN’-Y217L-catRコンストラクトを持つコロニーを選択した。
目的タンパク質の発現および産生
A.材料および方法
細菌増殖条件。B.サブティリス(B.subtilis)細胞を溶原培地(LB;Oxoid Limited)またはMBU培地中、37℃、280rpmで増殖させた。MBU培地は、Vogtentanz et al.、(2007)に記載されるMBD培地に類似するが、ソイトンは含有せず、7.5%グルコースの代わりに、2.1%グルコースおよび3.5%マルトデキストリンDE13-17を含有する。必要に応じて、変異の選択のために、ネオマイシン15μg/mlもしくはフレオマイシン4μg/mlを、または、アミラーゼまたはプロテアーゼ遺伝子の選択もしくは増幅(それぞれ)のために、クロラムフェニコール5μg/mlもしくは25μg/mlを、培地に追加した。MBU培地でのパルス・チェイスラベル実験に、2.5μg/mlのクロラムフェニコールを使用した。
クロラムフェニコール2.5μg/mlを含むMBUにより16時間増殖させた後、rasPまたはtepA分泌装置要素を欠損した改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞(すなわち、ΔrasP細胞またはΔtepA細胞)それぞれにおけるAmyE、AmyLまたはBPN’-Y217Lの産生をLDS-PAGEによって分析した。この目的のために、細胞を遠心分離によって清澄培地から分離し、細胞密度に対して補正した、等量の成長培地をゲルにロードした。変異B.サブティリス(B.subtilis)細胞(すなわち、ΔrasP細胞またはΔtepA細胞)それぞれから分泌された細胞外のAmyE、AmyLまたはBPN’-Y217Lの量を、完全な分泌装置を有するそれぞれのB.サブティリス(B.subtilis)(野生型)対照細胞(すなわち、天然rasPまたはtepA遺伝子を含むB.サブティリス(B.subtilis)細胞)によって分泌されたこれらの各タンパク質の量と比較した。分泌酵素の定量化を解析ソフトウエアImageJを用いて行った。
それぞれAmyEアミラーゼコンストラクト(「PaprE-amyE-catR」)を含む、B.サブティリス(B.subtilis)野生型細胞、「PspoVG-rasP」を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞、および「PspoVG-UTR-rasP」を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞を、クロラムフェニコール5ppmを含有するルリア培地5mlに終夜植え付けた。予備培養物1mlを使用して振盪フラスコ内のBHI(ブレインハートインフュージョン)培地25mlに植菌した。Inforsシェーカーを使用して、37℃、250rpmで実験を行った。増殖期間に時点をとり、細胞の増殖を600nmで測定した。
それぞれ変異「PaprE-PcuAmy1-v6-catR」コンストラクトを含む、B.サブティリス(B.subtilis)野生型細胞、および「PspoVG-rasP」を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞を、クロラムフェニコール25ppmを含有するルリア培地5mlに数日にわたって植え付けた。予備培養物1mlを使用して振盪フラスコ内のBHI(ブレインハートインフュージョン)培地25mlに植菌した。Inforsシェーカーを使用して、37℃、250RPMで実験を行った。増殖期間に時点をとり、増殖期間中のアミラーゼの活性を測定した。
それぞれ変異「PaprE-PcuAmy1-v6-catR」コンストラクトを含む、B.サブティリス(B.subtilis)野生型細胞、および「PspoVG-tepA」を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞をまた、振盪フラスコにおいて試験し、TepAシグナルペプチドペプチダーゼ過剰発現の効果を調べた。したがって、野生型B.サブティリス(B.subtilis)細胞、および「PspoVG-tepA」を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞を、ルリア培地中、37℃で終夜増殖させた。予備培養物1mlを使用して振盪フラスコ内のBHI(ブレインハートインフュージョン)培地25mlに植菌した。Inforsシェーカーを使用して、37℃、250rpmで実験を行った。細胞の増殖を600nmで測定し、増殖期間に時点をとった。アミラーゼアッセイを上記実施例5.Dに記載のように実施した。
それぞれ変異「PaprE-BglC-catR」コンストラクトを含む、B.サブティリス(B.subtilis)野生型細胞、および「PspoVG-rasP」を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞を、ルリア培地5mL中で終夜増殖させた。予備培養物1mlを使用して振盪フラスコ内のBHI培地25mlに植菌し、分泌β-D-グルカナーゼの発現を試験するため、37℃、250rpmで増殖させた。1時間毎に、SpectraMax分光光度計を用いて、20倍に希釈した全培地の細胞密度を600nmで測定し、その吸光度(600nmにおける)を時間の関数としてプロットしたところ、野生型B.サブティリス(B.subtilis)および改変B.サブティリス(B.subtilis)は、似た細胞密度を有することが示された。
それぞれ「PaprE-Properase-catR」コンストラクトを含む、B.サブティリス(B.subtilis)野生型細胞、および「PspoVG-rasP」を含む改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞を、ルリア培地5mL中で5時間増殖させた。1.5ODの予備培養物を用いて振盪フラスコ中の25mlのMBUに植菌し、細胞を37℃、250rpm、湿度70%で増殖させた。増殖18時間、25時間、41時間、48時間および65時間後に試料を採取した。SpectraMax分光光度計を用いて、40倍に希釈した全培地の細胞密度を600nmで測定し、その600nmにおける吸光度を時間の関数としてプロットした(図6A)。図6Aに示すように、改変B.サブティリス(B.subtilis)細胞は、野生型B.サブティリス(B.subtilis)細胞に比べ、細胞密度が増加したことを示している。
rasPポリペプチドを過剰発現するB.サブティリス(B.subtilis)宿主細胞におけるAmyAcファミリーα-アミラーゼの発現
AmyAcファミリーに属する細菌α-アミラーゼ(例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=CARRMWTZ01N&mode=allを参照)を、B.サブティリス(B.subtilis)野生型宿主細胞(すなわち、非改変;親細胞)、および改変B.サブティリス(B.subtilis)宿主細胞(すなわち、改変娘細胞)で発現させた(ここで、改変細胞は、上記実施例で一般に記載したような、rasPを過剰発現させるための発現カセット(spoIIIAH::PspoVG-rasP)を含む)。より詳しくは、aprEプロモーターを使用して、(AmyAcファミリー)α-アミラーゼ(例えば、ProaprE-α-アミラーゼ)の発現を駆動し、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(catR)を含む発現カセットをクロラムフェニコール25μg/mlを含有するLBプレートで増幅させた。各菌株(すなわち、野生型宿主細胞、およびrasPを過剰発現する改変娘宿主細胞)からの4コロニーを使用して、クロラムフェニコール25μg/mlを含有するLBの8本のチューブに植菌し、37℃で4時間増殖させた。0.075ODを使用して、24ウェルディープマイクロタイタープレート内の2mlの5SM12培地に植菌し、B.サブティリス(B.subtilis)宿主細胞を48時間増殖させた。18時間、25時間、41時間および48時間に時点をとった。実験で使用した培地で培養物を40倍に希釈して、OD600を測定した。
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Claims (22)
- 非改変(親)バチルス(Bacillus)属の細胞に比べ、目的タンパク質(POI)をより多く産生する改変バチルス属の細胞であって、rasP遺伝子の発現を増大させる改変を含み、前記rasP遺伝子の発現を増大させる改変は、内因性染色体rasP遺伝子に対する改変であるか、rasP遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドであり、前記rasP遺伝子は、配列番号1のオープンリーディングフレーム(ORF)核酸配列に対し少なくとも90%の配列同一性を含む核酸配列を含み、前記POIは、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素である、改変細胞。
- 前記内因性染色体rasP遺伝子の天然プロモーターは、前記天然rasPプロモーターより高い活性を有するいずれかのプロモーターで置換されている請求項1に記載の改変細胞。
- 前記内因性染色体rasP遺伝子の天然プロモーターは、spoVGプロモーターまたはaprEプロモーターで置換されており、前記spoVGプロモーターは、配列番号3に対し95%の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含み、前記aprEプロモーターは、配列番号4に対し95%の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含む請求項1に記載の改変細胞。
- 内因性染色体rasP遺伝子に対する前記改変は、前記内因性染色体rasP遺伝子の天然5’非翻訳領域(5’-UTR)の改変である請求項1に記載の改変細胞。
- 前記天然rasP染色体5’-UTRは、配列番号5のaprE5’-UTRに対し95%の配列同一性を含む5’-UTRで置換されている請求項4に記載の改変細胞。
- 内因性染色体rasP遺伝子に対する前記改変は、前記内因性染色体rasP遺伝子の天然プロモーターおよび天然5’-UTRの改変である請求項1に記載の改変細胞。
- 前記rasP遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている請求項1に記載の改変細胞。
- 前記染色体外プラスミドは発現カセットである請求項7に記載の改変細胞。
- 前記染色体外プラスミドは組み込みプラスミドである請求項7に記載の改変細胞。
- 前記プラスミドは前記改変細胞の染色体に安定に組み込まれる請求項9に記載の改変細胞。
- 前記rasPの発現を増大させる遺伝子改変は、外因性rasPオープンリーディングフレーム(ORF)を含むポリヌクレオチドであり、前記ORFは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたはコンディショナルプロモーターに作動可能に連結され、その制御下にある請求項1に記載の改変細胞。
- 前記rasP ORFを含む外因性ポリヌクレオチドは、染色体外プラスミドに含まれている請求項11に記載の改変細胞。
- 前記配列番号1のORFは、RasPポリペプチドをコードし、前記RasPポリペプチドはさらに、サイト2プロテアーゼ(S2P)活性を有するZn2+メタロプロテアーゼと定義される請求項1に記載の改変細胞。
- 前記rasP遺伝子は、配列番号2のRasPポリペプチドに対し90%のアミノ酸配列同一性を含むRasPポリペプチドをコードし、前記配列番号2のRasPポリペプチドの16~26のアミノ酸残基とアラインする、配列番号6の活性部位コンセンサス配列を含む請求項1に記載の改変細胞。
- 前記rasP遺伝子は、配列番号2のRasPポリペプチドに対し90%のアミノ酸配列同一性を含むRasPポリペプチドをコードし、前記配列番号2のRasPポリペプチドの20~24のアミノ酸残基とアラインする、配列番号7の活性部位コンセンサス配列(HEXXH)を含む請求項1に記載の改変細胞。
- 前記非改変(親)バチルス属の細胞と比べた、前記産生POIの増加量は、少なくとも5%の増加である請求項1に記載の改変細胞。
- 前記POIは、前記改変細胞に対し外因性の遺伝子、または前記改変細胞に対し内因性の遺伝子によってコードされる請求項1に記載の改変細胞。
- バチルス(Bacillus)属の細胞におけるPOIの産生を増大させる方法であって、
(a)POIをより多量に産生する改変バチルス属の細胞を得る工程であって、前記改変細胞はrasP遺伝子の発現を増大させる改変を含み、前記rasP遺伝子の発現を増大させる改変は、内因性染色体rasP遺伝子に対する改変であるか、rasP遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドであり、前記rasP遺伝子は、配列番号1のオープンリーディングフレーム(ORF)核酸配列に対し少なくとも90%の配列同一性を含む核酸配列を含む工程と、
(b)前記POIが発現するような条件下で前記改変細胞を培養する工程であって、POIをより多量に産生する前記改変細胞は、非改変(親)バチルス属の細胞における同じPOIの産生との比較である工程と、
を含み、前記POIは、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素である、方法。 - 内因性染色体rasP遺伝子に対する前記改変は、前記内因性染色体rasP遺伝子の天然5’非翻訳領域(5’-UTR)の改変である請求項18に記載の方法。
- 内因性染色体rasP遺伝子に対する前記改変は、前記内因性染色体rasP遺伝子の天然プロモーターおよび天然5’-UTRの両方の改変である請求項18に記載の方法。
- 前記非改変(親)バチルス属の細胞と比べた、前記産生POIの増加量は、少なくとも5%の増加である請求項18に記載の方法。
- POIをより多量に産生する改変バチルス(Bacillus)属の細胞を得る方法であって、
(a)親バチルス属の細胞に、rasP遺伝子発現を増大させる、少なくとも1つの遺伝子改変を導入する工程であって、前記遺伝子改変は、内因性染色体rasP遺伝子に対する改変であるか、rasP遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドであり、前記rasP遺伝子は、配列番号1のオープンリーディングフレーム(ORF)核酸配列に対し少なくとも90%の配列同一性を含む核酸配列を含む工程と、
(b)POIをより多量に発現する1つ以上の娘細胞を選択する工程であって、前記POIをより多量に産生させるために選択された1つ以上の娘細胞は、改変(娘)バチルス属の細胞と定義される工程と、
を含み、前記POIは、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素である、方法。
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