KR20180088915A - 향상된 단백질 생산 및 이의 방법 - Google Patents

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KR20180088915A
KR20180088915A KR1020187021108A KR20187021108A KR20180088915A KR 20180088915 A KR20180088915 A KR 20180088915A KR 1020187021108 A KR1020187021108 A KR 1020187021108A KR 20187021108 A KR20187021108 A KR 20187021108A KR 20180088915 A KR20180088915 A KR 20180088915A
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다니스코 유에스 인크.
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    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)

Abstract

본 개시는 일반적으로 증가된 양의 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)을 생성하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 개시의 특정 구현예는 비변형(즉, 모) 그람 양성 박테리아 세포에 비해 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것으로, 여기에서 변형된(즉, 딸) 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 본 개시는 변형(딸) 세포가 증가된 수준의 관심 대상 단백질을 생산하도록 박테리아 세포를 변형시키는 방법에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 변형 박테리아 세포를 발효시킴으로써 생산된 관심 대상 단백질에 관한 것이다. 본 개시의 다른 특정 구현예는 그렇게 만들어진 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)을 포함하는 하나 이상의 단백질성 조성물에 관한 것이다.

Description

향상된 단백질 생산 및 이의 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 각각 본원에 그 전체가 참고로 포함되는, 2015년 12월 23일 출원된 미국 가출원 번호 제62/387,578호 및 2016년 3월 15일 출원된 미국 가출원 번호 제62/308,440호의 이익을 주장한다.
기술분야
본 개시는 일반적으로 세균학, 미생물학, 유전학, 분자 생물학, 효소학 등의 분야에 관한 것이다. 특정 구현예는 증가된 양의 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)을 발현 및 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
"NB40883WOPCT_SequenceListing.txt"로 명명된 서열 목록 텍스트 파일의 전자 제출 내용은 2016년 11월 16일자로 생성되었으며, 크기가 39 KB이고, 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
미생물 숙주에서 단백질(예를 들어, 효소, 항체, 수용체 등)의 생산은 생명공학 분야에서 특별한 관심 대상이다. 마찬가지로, 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)의 생산 및 분비를 위한 미생물 숙주 세포의 최적화는, 특히 산업적 생명공학 환경에서 높은 관련성을 갖는데, 여기에서 단백질 수율에서의 작은 개선은 단백질이 대량의 산업적인 양으로 생산될 때 매우 중요하다.
바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 바실루스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 같은 그람 양성 박테리아는, 이들의 우수한 발효 특성 및 높은 수율(배양액 리터 당 25그램까지; Van Dijl and Hecker, 2013)로 인해, 종종 산업적으로 관련된 단백질의 생산을 위한 미생물 공장으로서 사용된다. 예를 들어 B. 서브틸리스는 식품, 직물, 세탁, 제약 산업 등을 위해 필요한 α-아밀라아제(Jensen et al., 2000; Raul et al., 2014) 및 프로테아제(Brode et al., 1996)의 생산으로 잘 알려져 있다(Westers et al., 2004). 이들 비-병원성 그람 양성 박테리아는 독성 부산물(예를 들어, 리포폴리사카라이드; LPS, 내독소로도 알려짐)이 완전히 결여된 단백질을 생산하기 때문에, 유럽 식품 안전성 당국(European Food Safety Authority)의 "공인된 안전성 추정(Qualified Presumption of Safety, QPS)" 자격을 얻었으며, 이들 생산물 중 다수가 미국 식품 의약국(US Food and Drug Administration)으로부터 "일반적으로 안전한 것으로 인정됨(Generally Recognized As Safe, GRAS)" 자격을 얻었다(Olempska-Beer et al., 2006; Earl et al., 2008; Caspers et al., 2010).
그람 양성 박테리아인 B. 서브틸리스는 단백질을 분비하는 다양한 경로를 사용하는데, 이 중에서 Tat-시스템(Raul et al., 2014; Goosens et al., 2014; Tjalsma et al., 2004) 및 Sec-시스템(Tjalsma et al., 2004)이 가장 잘 연구된 두 가지이다. 대부분의 단백질은 비중첩(비-천연) 입체구조로 Sec-경로를 통해 분비되는데(Harwood and Cranenburgh, 2007), 여기에서는 소수성 신호 펩티드가 단백질을 세포의 전좌(translocation) 시스템으로 보낸다. ATPase SecA에 의해 촉진된 SecYEG 트랜스로콘(translocon)을 통한 전좌 직후, 단백질의 신호 펩티드는 신호 펩티다아제 SipS-SipW의 하나에 의해 유리되고(절단되고)(Tjalsma et al., 1997), 다음에 신호 펩티드 펩티다아제 TepA 및 SppA에 의해 분해된다(Bolhuis et al., 1999).
지난 30년간, B. 서브틸리스, B. 리케니포르미스, B. 아밀로리쿠에파시엔스 등에 의한 이종 단백질의 분비를 개선하기 위해 많은 연구가 수행되었다. 이 최적화의 주요 표적은 신호 펩티드, SRP, 전좌 시스템, 신호 펩티다아제 및 조절 인자의 조성이다(Kang et al., 2014). 최근, 필수 단백질 PrsA(전좌-후 중첩에 연루됨) 및 샤프롱 DnaK의 과발현이 B. 서브틸리스에서 아밀라아제의 개선된 분비를 초래하는 것이 밝혀져(Chen et al., 2015), 효과적인 단백질 분비에 대한 적절한 중첩의 영향을 보여주는데, 여기에서 PrsA는 효과적인 단백질 분비에 대한 제한 인자인 것으로 상정되었다(Kontinen and Sarvas, 1993). 더욱이, PrsA가 WprA 및 세포벽에 위치한 다른 프로테아제에 의해 분해될 수 있다는 것이 최근 밝혀져(Krishnappa et al., 2014), 이를 산업적 용도에 덜 적절하게 만든다.
따라서, 이들 미생물 세포 공장의 높은 상업적/산업적 용도로 인해, 그람 양성 박테리아에서 산업적으로 관련된 단백질의 분비 및/또는 생산의 개선을 위한 새로운 표적이 생명공학 분야에서 매우 요망된다.
본 개시는 그람 양성 박테리아 세포에서 관심 대상 단백질의 증가된 생산 및/또는 분비에 대한 충족되지 못한 요구를 다루고 이를 충족시킨다. 더욱 구체적으로, 아래의 '발명을 실시하기 위한 구체적인 내용'에서 제시되는 바와 같이, 본 개시는 "항-시그마 인자 조절 프로테아제(regulating anti-sigma factor protease)" 또는 "RasP"(이전에 YluC로서 알려짐)를 암호화하는 rasP 유전자를 발현 또는 과발현하도록 변형된 그람 양성 박테리아 세포가, 변형 그람 양성 박테리아 세포로부터 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)의 증가된 생산을 초래한다는 놀랍고도 예상치 못한 발견에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 개시는 비변형(모) 그람 양성 박테리아 세포에 비해 증가된 양의 관심 대상 단백질(이하, "POI")을 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포와 관한 것으로, 여기에서 변형 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형이다. 다른 구현예에서, 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터는 천연 rasP 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 임의의 프로모터로 교체된다. 다른 특정 구현예에서, 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터는 spoVG 프로모터 또는 aprE 프로모터로 교체된다. 또 다른 구현예에서, spoVG 프로모터는 서열번호: 3에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, aprE 프로모터는 서열번호: 4에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 5'-비번역 영역(5'-UTR)의 변형이다. 다른 구현예에서, 천연 rasP 염색체 5'-UTR은 서열번호: 5의 aprE 5'-UTR에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 5'-UTR로 교체된다. 또 다른 구현예에서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터 및 천연 5'-UTR 둘 다의 변형이다.
다른 특정 구현예에서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 rasP 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, rasP 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 염색체외 플라스미드 내에 포함된다. 다른 구현예에서, 염색체외 플라스미드는 발현 카세트이다. 다른 구현예에서, 염색체외 플라스미드는 통합 플라스미드이다. 다른 특정 구현예에서, 플라스미드는 변형 세포의 염색체로 안정적으로 통합된다.
다른 구현예에서, rasP 발현을 증가시키는 유전적 변형은 외인성 rasP 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, 여기에서 ORF는 구성적 프로모터, 유도 가능한 프로모터 또는 조건부 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 그의 제어 하에 있다. 특정 구현예에서, rasP ORF를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 염색체외 플라스미드 내에 포함된다. 특정 구현예에서, 염색체외 플라스미드는 발현 카세트이다. 다른 특정 구현예에서, 염색체외 플라스미드는 통합 플라스미드이다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 변형 세포의 염색체로 통합된다.
다른 구현예에서, rasP 유전자는 서열번호: 1의 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열에 대하여 적어도 60%의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 서열번호: 1의 ORF는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는데, 여기에서 RasP 폴리펩티드는 부위-2 프로테아제(S2P) 활성을 갖는 Zn2 + 메탈로프로테아제로서 추가로 정의된다. 다른 구현예에서, rasP 유전자는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드에 대하여 60%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 RasP 폴리펩티드를 암호화하고 서열번호: 6의 활성 부위 공통 서열(LVFFHELGHLL)을 포함하는데, 이는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 16 내지 26과 정렬된다. 또 다른 구현예에서, rasP 유전자는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드에 대하여 80%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 RasP 폴리펩티드를 암호화하고 서열번호: 7의 활성 부위 공통 서열(HEXXH)을 포함하는데, 이는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 20 내지 24와 정렬된다.
다른 구현예에서, 생산된 POI의 증가된 양은 비변형(모) 그람 양성 세포에 비해 적어도 5% 증가이다. 다른 구현예에서, 생산된 POI의 증가된 양은 비변형(모) 그람 양성 세포에 비해 적어도 10% 증가이다.
다른 특정 구현예에서, 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스(Bacillus) 속의 구성원이다. 또 다른 구현예에서, 바실루스는 B. 서브틸리스 ( subtilis ), B. 리케니포 르미스(licheniformis), B.　 렌투스 ( lentus ), B. 브레비스 ( brevis ), B. 스테아로서모 필루스(stearothermophilus), B. 알칼로필루스 ( alkalophilus ), B. 아밀로리쿠에파시 엔스(amyloliquefaciens), B. 클라우시이 ( clausii ), B. 소노렌시스 ( sonorensis ), B.　할로두란스(halodurans), B. 푸밀루스 ( pumilus ), B. 라우투스 ( lautus ), B. 파불 리(pabuli), B. 세레우스( cereus ), B. 아가라드하에렌 스(agaradhaerens), B 아키바이 ( akibai ), B. 클라르키이 ( clarkii ), B. 슈도피르무스 (pseudofirmus), B. 레헨시스 ( lehensis ), B. 메가테륨 ( megaterium ), B. 코아굴란 스(coagulans), B. 서쿨란스 ( circulans ), B. 깁소니이 ( gibsonii ), B. 마르마렌시스 (marmarensis), 및 B. 투린기엔시스(thuringiensis)로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 바실루스는 B. 서브틸리스 또는 B. 리케니포르미스이다.
다른 특정 구현예에서, POI는 변형 박테리아 세포에 대하여 외인성인 유전자 또는 변형 박테리아 세포에 대하여 내인성인 유전자에 의해 암호화된다. 또 다른 구현예에서, POI는 세포외로 분비되거나 수송된다. 추가의 구현예에서, 세포외로 분비되거나 수송된 POI는 추가로 단리 및 정제된다.
다른 특정 구현예에서, POI는 효소이다. 다른 구현예에서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아릴 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코오스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소오스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소오스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 변형 세포에 의해 생산되는 단리된 POI에 관한 것이다.
다른 특정 구현예에서, 본 개시는 (a) 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 얻는 단계(여기에서 변형 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함함), 및 (b) POI가 발현되도록 하는 조건 하에 변형 세포를 배양하는 단계(여기에서 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 박테리아 세포는 비변형(모) 그람 양성 박테리아 세포에서의 동일한 POI의 생산과 비교됨)를 포함하는, 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
다른 특정 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 방법에 의해 생산되는 단리된 POI에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 개시는 (a) 모 그람 양성 박테리아 세포로 rasP 유전자 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전자 변형을 도입하는 단계, 및 (b) 증가된 양의 POI를 발현하는 하나 이상의 딸 세포를 선택하는 단계(여기에서 증가된 양의 POI를 생산하기 위해 선택된 하나 이상의 딸 세포는 변형(딸) 그람 양성 박테리아 세포로 정의됨)를 포함하는, 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 결실된 tepA 유전자(ΔtepA) 또는 결실된 rasP 유전자(ΔrasP) 중 하나를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포로부터 배양 배지로 분비되는 AmyE 아밀라아제, AmyL 아밀라아제 및 프로테아제 BPN'-Y217L의 발현을, 비변형(모; 야생형) B. 서브틸리스 세포에 대하여 비교한다. 도 1a는 B. 서브틸리스 세포(모) 세포에 비해, rasP 또는 tepA 유전자가 결여된 B. 서브틸리스 세포로부터 분비된 효소(AmyE, AmyL 및 BPN'-Y217L)의 LDS-PAGE 겔을 보여준다. 도 1b는 비변형(모) 야생형 B. 서브틸리스 세포로부터 분비된 단백질의 비율에 대하여, 결실된 rasP(ΔrasP) 또는 tepA(ΔtepA) 유전자를 포함하는 B. 서브틸리스 세포로부터 분비된 단백질의 비율(즉, ΔtepA 세포/wt 세포 및 ΔrasP/wt 세포)로 제시되는, 분비된 AmyE, AmyL 및 BPN'-Y217L 단백질의 ImageJ를 사용한 정량화를 보여준다.
도 2는 야생형(모) B. 서브틸리스 세포, spoVG 프로모터의 제어 하 rasP 유전자를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, "PspoVG-rasP" 발현 카세트) 및 spoVG 프로모터 및 aprE 5'UTR의 제어 하 rasP 유전자를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, "PspoVG-UTR-rasP" 발현 카세트)로부터의 OD600에서 측정한 세포 밀도(도 2a) 및 AmyE의 생산(도 2b)을 보여준다.
도 3은 야생형(모) B. 서브틸리스 세포 및 spoVG 프로모터의 제어 하 rasP 유전자를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, "PspoVG-rasP" 발현 카세트)로부터의 아밀라아제 PcuAmy1-v6의 진탕 플라스크 생산을 보여준다.
도 4는 야생형(모) B. 서브틸리스 세포 및 spoVG 프로모터의 제어 하 tepA 유전자를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, "PspoVG-tepA" 발현 카세트)로부터의 세포 밀도(도 4a) 및 아밀라아제 PcuAmy1-v6의 생산(도 4b)을 보여준다.
도 5는 야생형(모) B. 서브틸리스 세포 및 spoVG 프로모터의 제어 하 rasP 유전자를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, "PspoVG-rasP" 발현 카세트)로부터의 베타-D-글루카나아제(BglC)의 생산을 보여준다.
도 6은 야생형(모) B. 서브틸리스 세포 및 spoVG 프로모터의 제어 하 rasP 유전자를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, "PspoVG-rasP" 발현 카세트)로부터의 세포 밀도(도 6a) 및 프로페라아제(Properase)의 생산(도 6b)을 보여준다.
도 7은 야생형(모) B. 서브틸리스 세포 및 spoVG 프로모터의 제어 하 rasP 유전자를 포함하고 발현/과발현하는 변형(딸) B. 서브틸리스(즉, "PspoVG-rasP" 발현 카세트)로부터의 세포 밀도(도 7a) 및 발현된 "AmyAc 패밀리" α-아밀라아제의 생산(도 7b)을 보여준다. 이 실험에 사용된 모 및 변형(딸) B. 서브틸리스 세포는 딥 웰(deep well) 미세적정 플레이트(DWMTP)에서 5SM12 성장 배지를 사용하여 성장시켰다.
본 개시는 일반적으로 증가된 양의 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)(이하, "POI")을 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 개시의 특정 구현예는 동일한 POI를 생산하는 비변형(모) 그람 양성 박테리아 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것으로, 여기에서 변형 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함한다.
본원에 제시되는 바와 같이, rasP 유전자는 "항-시그마 인자 조절 프로테아제(regulating anti-sigma factor protease)" 또는 "RasP"(이전에 YluC로서 알려짐)를 암호화한다. RasP는 아연-의존성 막내 절단 프로테아제(intramembrane cleaving proteases)(또는 "iClips)의 군에 속하고 본원에서 부위-2 프로테아제(S2P) 또는 부위-2 아연 메탈로프로테아제로서 추가로 정의된다(예를 들어, Saito et al., 2011; Heinrich et al., 2008 참조). 특정 구현예에서, 본 개시의 RasP 폴리펩티드는 효소 번호(Enzyme Commission, EC) 클래스 3.4.24(EC 3.4.24)에 속하는 하이드롤라아제(예를 들어, 펩티다아제), 더욱 구체적으로 메탈로엔도펩티다아제로서 추가로 정의된다.
본원에 기술된 변형 박테리아 세포, 이의 조성물 및 이의 방법을 고려하여, 하기 용어 및 어구를 정의한다. 본원에서 정의되지 않은 용어는 본 기술 분야에서 사용되는 통상적인 의미를 따를 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 적용되는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 시험에 또한 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본원에 인용된 모든 공보 및 특허는 참고로 포함된다.
청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있다는 것이 또한 주목된다. 이와 같이, 이러한 서술은 청구항 요소의 설명과 관련하여 "단독의", "단지", "제외하는" 등과 같은 배타적인 용어의 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행적 근거로서의 역할을 하기 위한 것이다.
본 개시 내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기술되고 예시된 각각의 개별적인 구현예는 본원에 기술된 본 발명의 조성물 및 방법의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않고서 임의의 다른 몇몇 구현예의 특징과 쉽게 구별되거나 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 열거된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "변형 세포", "변형 박테리아 세포" 또는 "변형 숙주 세포"는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있고 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형(예를 들어, 유전적 변형)을 포함하는 재조합 그람 양성 박테리아(숙주) 세포를 의미할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 "변형" 그람 양성 박테리아 세포는 모 박테리아 세포로부터 유래된 "변형(숙주) 세포"로서 추가로 정의될 수 있는데, 여기에서 변형(딸) 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "비변형 세포", "비변형 박테리아 세포" 또는 "비변형 숙주 세포"는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있고 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함하지 않는 "비변형"(모) 그람 양성 박테리아 세포를 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비변형"(모) 세포에서의 POI의 발현 및/또는 생산 및/또는 분비가 "변형"(딸) 세포에서의 동일한 POI의 발현 및/또는 생산 및/또는 분비와 비교될 때, "변형" 세포 및 "비변형" 세포는 본질적으로 동일한 조건(예를 들어, 동일한 배지, 온도, pH 등과 같은 조건) 하에 성장/배양/발효된다는 것이 이해될 것이다.
마찬가지로, 본원에서 정의되는 바와 같이, "증가된 생산", "향상된 생산", "증가된 POI의 생산", "향상된 POI의 생산" 등의 용어는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함하는 "변형"(딸) 세포를 의미하는데, 여기에서 "증가"는 항상 동일한 POI를 발현하는 "비변형"(모) 세포와 비교한(이에 대한) 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"은 센스 가닥을 나타내든지 안티센스 가닥을 나타내든지 간에, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, 및 RNA뿐만 아니라 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 단편 또는 일부도 나타낸다. 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 다수의 뉴클레오티드 서열이 주어진 단백질을 암호화할 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드(또는 핵산 분자)는 "유전자", "벡터" 및 "플라스미드"를 포함하는 것이 이해된다. 따라서, 용어 "유전자"는 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 예를 들어 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절(비-전사) DNA 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 전사 영역은 코딩 서열뿐만 아니라 인트론, 5'-비번역 영역(UTR), 및 3'-UTR을 포함하는 비번역 영역(UTR)도 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "코딩 서열"은 (암호화된) 단백질 생성물의 아미노산 서열을 직접적으로 특정하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임에 의해 결정되는데, 이는 보통 ATG 개시 코돈으로 시작된다. 전형적으로 코딩 서열은 DNA, cDNA, 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "오픈 리딩 프레임"(이하, "ORF")이라는 용어는 (i) 개시 코돈, (ii) 아미노산을 나타내는 일련의 둘(2) 이상의 코돈, 및 (iii) 종결 코돈으로 구성되는 연속된(uninterrupted) 리딩 프레임을 포함하는 핵산 또는 핵산 서열(천연적으로 존재하거나, 비-천연적으로 존재하거나, 합성이든 간에)을 의미하며, ORF는 5'에서 3' 방향으로 판독(또는 번역)된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, "rasP 유전자 발현을 증가시키는" 변형을 포함하는 변형 세포, 변형 박테리아 세포 또는 변형 숙주 세포는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 ORF를 포함하는 재조합 그람 양성 박테리아 세포를 포함하는데, 여기에서 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 ORF 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도 가능한 프로모터, 조건부 프로모터 등에 작동 가능하게 연결되고 그의 제어 하에 있으며; 선택적으로 5' 및 3' 조절(비-전사) 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대하여 3'(하류)에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래되는 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 핵산 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터들은 상이한 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 조건 또는 생리적 조건에 응답하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 세포 유형에서 대부분의 시점에 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터(constitutive promoter)"로 칭해진다. 또한, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편들이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인식된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 된 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열들의 회합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열(예를 들어, ORF)의 발현에 영향을 줄 수 있을 때(즉, 그 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있음) 그 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 회합된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱(processing) 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 조절 서열에는 프로모터, 번역 리더 서열, RNA 프로세싱 부위, 효과인자 결합 부위, 스템-루프 구조 등이 포함될 수 있다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(ORF), 또는 이의 유전자, 또는 이의 벡터를 "박테리아 세포 내로 도입하는"과 같은 어구에서 사용될 때, "도입하는"이라는 용어는 원형질 융합, 형질전환(예를 들어, 염화칼슘, 전기천공법), 형질도입, 형질감염, 콘쥬게이션 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌, 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 본 기술 분야에 공지된 방법을 포함한다(예를 들어, Ferrari et al., 1989 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환된" 또는 "형질전환"은 세포가 재조합 DNA 기법을 사용하여 형질전환된 것을 의미한다. 전형적으로 형질전환은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, ORF 또는 유전자)을 세포 내로 삽입함으로써 일어난다. 삽입되는 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열(즉, 형질전환되는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 서열)일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환"은 이전된 핵산 분자의 유전적으로 안정한 유전을 야기하는, 숙주 유기체의 게놈으로의 핵산 분자의 이전을 나타낸다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 숙주 세포 "게놈", 박테리아(숙주) 세포 "게놈", 또는 그람 양성 박테리아(숙주) 세포 "게놈"은 염색체 유전자 및 염색체외 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 염색체외 요소를 나타내며, 이는 종종 전형적으로 세포의 중추적인 대사의 일부가 아니고 대개 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태로 존재하는 유전자를 지닌다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의, 선형 또는 원형의, 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기서, 다수의 뉴클레오티드 서열은 선택된 유전자 생성물에 대한 DNA 서열 및 프로모터 단편을 적절한 3' 비번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구축물로 연결되거나 재조합된다.
"형질전환 카세트"는 외래 유전자(또는 이의 ORF)를 포함하며 이 외래 유전자에 더하여 특정한 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 요소를 갖는 특이적 벡터를 나타낸다.
"발현 카세트"는 외래 유전자(또는 이의 ORF)를 포함하며 이 외래 유전자에 더하여 숙주 세포에서 이 외래(이종) 유전자의 "증가된" 발현을 허용하는 요소를 갖는 특이적 벡터를 나타낸다.
많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 구매 가능하고 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식 내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 핵산을 유기체들, 세포들 또는 세포 성분들 사이에 전파 및/또는 이전시킬 수 있는 임의의 수단이다. 벡터는 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스(pro-virus), 플라스미드, 파지미드(phagemid), 트랜스포존(transposon), 및 인공 염색체, 예를 들어 YAC(효모 인공 염색체), BAC(박테리아 인공 염색체), 및 PLAC(식물 인공 염색체) 등을 포함하는데, 이들은 "에피좀"으로서, 즉, 자율적으로 복제되거나 숙주 미생물의 염색체 내에 통합될 수 있다.
"발현 벡터"는 이종 DNA를 외래 세포 내에 포함시키고 외래 세포에서 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 나타낸다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 구매 가능하다.
"표적화 벡터"는 이것이 형질전환시키는 숙주 세포의 염색체 내의 영역에 상동성이고 그 영역에서 상동 재조합을 구동시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다. 표적화 벡터는 상동 재조합을 통하여 세포의 염색체 내에 돌연변이 또는 외인성 유전자 서열을 도입하는 데 있어서 그 용도가 발견된다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는, 예를 들어 말단에 부가된 다른 비-상동성 서열(즉, 스터퍼(stuffer) 서열 또는 측면(flanking) 서열)을 포함한다. 말단은 표적화 벡터가, 예를 들어 벡터 내로의 삽입과 같이, 폐쇄된 원을 형성하도록 폐쇄될 수 있다. 적절한 벡터의 선택 및/또는 구축은 당업자의 지식 내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 클로닝 벡터로서 사용되는, 그리고 많은 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 염색체외 자가-복제 유전 요소를 형성하는 원형 이중 가닥(ds) DNA 구축물을 나타낸다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 숙주 세포의 게놈 내로 포함되게 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관심 대상 단백질(protein of interest)" 또는 "POI"는 변형 그람 양성 박테리아 세포(예를 들어, "숙주" 세포)에서 발현시키기를 원하는 관심 대상 폴리펩티드를 나타내는데, 여기에서 POI는 증가된 수준으로(즉, 비변형(모) 그람 양성 박테리아 세포에 비해) 생산된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, POI는 효소, 기질-결합 단백질, 표면-활성 단백질, 구조 단백질, 수용체 단백질, 항체 등일 수 있다.
유사하게, 본원에서 정의되는 바와 같이, "관심 대상 유전자(gene of interest)" 또는 "GOI"는 POI를 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 오픈 리딩 프레임)을 나타낸다. POI를 암호화하는 GOI는 천연적으로 존재하는 유전자, 돌연변이된 유전자 또는 합성 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환 가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 길이의 중합체를 나타낸다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 한(1) 문자 또는 세(3) 문자 코드가 본원에서 사용된다. 폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다.
폴리펩티드라는 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어 표지(labeling) 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 본 기술 분야에 공지된 다른 변형도 포함하는 폴리펩티드가 이 정의 내에 또한 포함된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 유전자는 상업적으로 관련된 산업용 관심 대상 단백질, 예를 들어 효소(예를 들어, 아세틸 에스테라아제, 아릴 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 언하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코오스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소오스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소오스 옥시다아제, 및 이들의 조합)를 암호화한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내 이의 자연적인 위치의 유전자를 나타낸다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종" 유전자, "비-내인성" 유전자, 또는 "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로는 발견되지 않고, 유전자 전달(gene transfer)에 의해 숙주 유기체 내로 도입되는 유전자(또는 ORF)를 나타낸다. 외래(이종) 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자(또는 ORF) 및/또는 천연 또는 비-천연 유기체 내로 삽입된 키메라 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 본 개시의 핵산 분자로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 나타낼 수 있다. 따라서, 용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형, 분비 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌, 폴리펩티드의 생산에 연루된 임의의 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변이형" 폴리펩티드는, 전형적으로 재조합 DNA 기법에 의해 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가, 또는 결실에 의해 모(또는 기준) 폴리펩티드로부터 유래되는 폴리펩티드를 나타낸다. 변이형 폴리펩티드들은 적은 수의 아미노산 잔기가 모 폴리펩티드와 상이할 수 있으며, 모(기준) 폴리펩티드와의 일차 아미노산 서열 상동성/동일성 수준에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는, 변이형 폴리펩티드는 모(기준) 폴리펩티드 서열과의 아미노산 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변이형" 폴리뉴클레오티드는 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타내는데, 여기에서 "변이형 폴리뉴클레오티드"는 모 폴리뉴클레오티드와 특정한 정도의 서열 상동성/동일성을 갖거나, 엄격한 혼성화 조건 하에 모 폴리뉴클레오티드(또는 이의 상보체)와 혼성화된다. 바람직하게는, 변이형 폴리뉴클레오티드는 모(기준) 폴리뉴클레오티드 서열과의 뉴클레오티드 서열 동일성이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이"는 핵산 서열에서의 임의의 변화 또는 변경을 나타낸다. 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 침묵(silent) 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 스플라이싱 돌연변이 등을 포함하는 몇몇 유형의 돌연변이가 존재한다. 돌연변이는 특이적으로(예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발을 통하여) 또는 무작위로(예를 들어, 화학 물질, 복구 결핍된 박테리아 주를 통한 계대를 통하여) 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 이의 아미노산 서열의 맥락에서, 용어 "치환"은 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것(즉, 치환하는 것)을 의미한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종" 핵산 구축물 또는 "이종" 핵산 서열은 그 서열이 발현되는 세포에 대하여 천연적인 것이 아닌 일부분의 서열을 갖는다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종 제어 서열"은 자연에서 GOI의 발현을 조절하는(제어하는) 기능을 하지 않는 유전자 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)을 나타낸다. 일반적으로, 이종 핵산 서열은 이들이 존재하는 세포 또는 게놈의 일부에 대하여 내인성(천연)이 아니고, 감염, 형질감염, 형질전환, 미세주입, 전기천공, 원형질 융합 등에 의해 세포에 부가된다. "이종" 핵산 구축물은 천연 숙주 세포에서 발견되는 제어 서열/DNA 코딩 서열 조합과 동일하거나 상이한 제어 서열/DNA 코딩(ORF) 서열 조합을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신호 서열" 및 "신호 펩티드"는 성숙 단백질 또는 전구체 형태의 단백질의 분비에 참여하거나 이의 수송을 지시할 수 있는 아미노산 잔기의 서열을 나타낸다. 신호 서열은 전구체 또는 성숙 단백질 서열에 대해 전형적으로 N-말단에 위치한다. 신호 서열은 내인성 또는 외인성일 수 있다. 신호 서열은 보통 성숙 단백질에 부재한다. 신호 서열은 전형적으로 단백질이 수송된 후 신호 펩티다아제에 의해 단백질로부터 절단된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "모(parental)" 세포는 변형 "딸" 세포를 생성하도록 "모" 세포의 게놈이 변형되는(예를 들어, 하나 이상의 돌연변이가 모 세포로 도입되거나 하나 이상의 유전자 또는 ORF가 모 세포로 도입됨) 임의의 세포 또는 미생물의 균주를 나타낸다.
용어 "유래된"은 용어 "기인된", "수득된", "수득 가능한" 및 "생성된"을 포함하며, 일반적으로 하나의 특정된 물질 또는 조성물이 또 다른 특정된 물질 또는 조성물에서 이의 기원을 찾거나, 또 다른 특정된 물질 또는 조성물과 관련하여 기술될 수 있는 특징을 가짐을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질 생산을 "증가시키는 것"은 증가된 양의 단백질이 생산됨을 의미한다. 단백질은 숙주 세포 내에서 생산되거나, 또는 배양 배지 내로 분비될(또는 수송될) 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 대상 단백질은 배양 배지 내로 생산된다.
증가된 단백질 생산은 예를 들어, 비변형(모) 세포와 비교하여 변형(딸) 세포에 의해 생산된 전체 세포외 단백질, 또는 단백질 또는 효소 활성, 예를 들어 프로테아제 활성, 아밀라아제 활성, 셀룰라아제 활성, 헤미셀룰라아제 활성 등의 더 높은 최대 수준으로서 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성"은 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련된다. 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 둘 이상의 폴리펩티드가 상동성일 경우, 이것은 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 한층 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 98%의 "동일성 정도"를 갖는 것을 의미한다. 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 본원에서 정의된 바와 같이 상동성이기에 충분히 높은 정도의 동일성을 갖는지 여부는 본 기술 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 GCG 프로그램 패키지(위스콘신 패키지용 프로그램 매뉴얼(Program Manual for the Wisconsin Package), 버전 8, 1994년 8월, 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))에 제공된 "GAP"을 사용하여 두 서열을 정렬함으로써 적합하게 조사될 수 있다(Needleman and Wunsch, 1970).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성 백분율(%)"은, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬될 때, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열들 또는 그 폴리펩티드의 아미노산 서열들 사이의 핵산 또는 아미노산 서열 동일성의 수준을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비생산성(specific productivity)"은 주어진 기간에 걸쳐 시간 당 세포 당 생산된 단백질의 총량이다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "정제된", "단리된" 또는 "풍부화된"이라는 용어는 생체분자(예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 자연에서 이것이 회합되어 있는 천연적으로 존재하는 구성 성분의 일부 또는 이들 전부로부터 이를 분리하는 것에 의해 그의 자연 상태로부터 변경됨을 의미한다. 이러한 단리 또는 정제는 최종 조성물에서 요망되지 않는 전 세포, 세포 잔사, 불순물, 외부 단백질, 또는 효소를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테아제 처리, 황산암모늄 침전 또는 기타 단백질 염 침전, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 미세여과, 겔 전기영동 또는 구배에서의 분리와 같은 본 기술 분야에서 인정된 분리 기법에 의해 성취될 수 있다. 그 후 추가 이득을 제공하는 구성 성분, 예를 들어 활성화제, 항-저해제, 바람직한 이온, pH를 제어하기 위한 화합물 또는 기타 효소 또는 화학물질을 정제되거나 단리된 생체분자 조성물에 첨가하는 것이 추가로 가능하다.
I. RasP 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 유전자
위에 앞서 제시된 바와 같이, rasP 유전자는 "항-시그마 인자 조절 프로테아제(regulating anti-sigma factor protease)" 또는 "RasP"(이전에 YluC로서 알려짐)를 암호화하는데; 이는 아연-의존성 막내 절단 프로테아제(또는 "iClips)의 군에 속하고, 본원에서 부위-2 프로테아제(S2P) 또는 부위-2 아연 메탈로프로테아제로 추가로 정의된다(예를 들어, Saito et al., 2011; Heinrich et al., 2008 참조). 본원에서 정의되는 바와 같이, "rasP" 유전자(또는 이의 ORF)는 "RasP" 폴리펩티드를 암호화하고, 특정 RasP 폴리펩티드 서열(또는 이를 암호화하는 rasP 유전자 또는 ORF 서열)로 제한되는 것을 의미하지 않는다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 개시의 rasP 유전자(또는 이의 ORF)는, rasP 핵산 또는 이의 상동 또는 오르소로그 핵산 서열이 본 개시의 변형 그람 양성 세포에서 발현 또는 과발현될 때 이러한 암호화된 폴리펩티드(S2P Zn2 + 메탈로프로테아제 활성을 가짐)가 POI의 생산을 증가시키는 한, S2P Zn2 + 메탈로프로테아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 핵산(폴리뉴클레오티드) 또는 이의 임의의 상동 또는 오르소로그 핵산 서열일 수 있다.
예를 들어, B. 서브틸리스 균주 168(예를 들어, UniProtKB; RASP_BACSU; Accession No. O31754 참조)로부터 단리된 RasP 폴리펩티드는 서열번호: 2로 제시되는 422개 아미노산을 포함하는데(약 46.7 kDa), 여기에서 위치 20 및 24의 히스티딘 아미노산 잔기는 Zn2 + 배위/결합 부위로 추정되고 위치 21의 글루탐산 잔기는 단백질 가수분해 활성 부위이다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 개시의 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자(또는 이의 ORF)는 서열번호: 2로 제시되는 RasP 폴리펩티드에 대하여 약 60%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 ORF이다. 예를 들어, UniProtKB 데이터베이스에서 BLAST 검색(대상 서열로서 서열번호: 2의 B. 서브틸리스 RasP 폴리펩티드 서열 및 다음 검색 파라미터: E-threshold = 10; Matrix = auto; gapped = yes를 사용함)에서는 서열번호: 2에 대하여 100% 내지 약 60%의 서열 동일성을 포함하는 다양한 RasP 폴리펩티드를 확인하였다.
다른 특정 구현예에서, 본 개시의 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자(또는 이의 ORF)는 서열번호: 6의 근접 활성 부위 공통 서열(LVFFH ELGHLL; 여기에서 밑줄 친 히스티딘 아미노산은 Zn2 + 결합 부위이고 굵은 활자체의 글루탐산 잔기는 활성 부위 잔기임)을 포함하는 폴리펩티드인데, 여기에서 서열번호: 6의 RasP 폴리펩티드 공통 서열의 아미노산 서열은 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 16 내지 26과 정렬될 수 있고 적어도 60%의 서열 상동성을 생성할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시의 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자(또는 이의 ORF)는 서열번호: 7의 활성 부위 공통 서열(H EXXH; 여기에서 밑줄 친 히스티딘 아미노산은 Zn2 + 결합 부위이고 굵은 활자체의 글루탐산 잔기는 활성 부위 잔기이고 X는 임의의 아미노산임)을 포함하는 폴리펩티드인데, 여기에서 서열번호: 7의 RasP 폴리펩티드 공통 서열의 아미노산 서열은 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 20 내지 24와 정렬될 수 있고 적어도 80%의 서열 상동성을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시의 RasP 폴리펩티드는 EC 클래스 3.4.24(EC 3.4.24)에 속하는 메탈로엔도펩티다아제로 추가로 정의된다.
II. 박테리아 세포 및 사용 방법
일반적으로 본 개시는 증가된 양의 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)을 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 개시의 특정 구현예는 비변형(즉, 모) 그람 양성 박테리아 세포에 비해 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것으로, 여기에서 변형(즉, 딸) 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 변형(딸) 세포가 증가된 수준의 관심 대상 단백질을 생산하도록 박테리아 세포를 변형시키는 방법에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 변형 박테리아 세포를 발효시킴으로써 생산된 관심 대상 단백질에 관한 것이다. 본 개시의 다른 특정 구현예는 그렇게 만들어진 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)을 포함하는 하나 이상의 단백질성 조성물에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 본원에 제시된 변형 박테리아 세포를 이용한 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)의 생산 방법뿐 아니라, 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)을 포함하는 하나 이상의 단백질성 조성물의 생산 및 사용 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 박테리아 세포의 변형은 변형 숙주에서 rasP 유전자(또는 이의 ORF)의 발현을 향상 또는 증가시키는 임의 유형의 유전적 변형일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 박테리아 세포의 변형은 요망되는 숙주 세포에서 향상된 발현을 위한 rasP 유전자(또는 이의 ORF)의 코돈 최적화를 포함한다. 다른 구현예에서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 숙주 세포의 변형은 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 발현 카세트로, 여기에서 발현 카세트는 (변형) 세포 내로 도입된다. 다른 특정 구현예에서, RasP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 ORF를 포함하는 발현 카세트는 유도 가능한 프로모터, 구성적 프로모터, 조건부 프로모터 등의 제어 하에 있다.
특정 구현예에서, POI 또는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 지시하는 프로모터는 야생형 aprE 프로모터, 돌연변이 aprE 프로모터 또는 공통(consensus) aprE 프로모터(PCT 국제 공개 WO2001/51643에 제시됨)이다. 다른 특정 구현예에서, POI 또는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 지시하는 프로모터는 야생형 spoVG 프로모터, 돌연변이 spoVG 프로모터 또는 공통 spoVG 프로모터이다(Frisby and Zuber, 1991).
특정 구현예에서, 본 개시의 변형 박테리아 세포는 바실라세아에 패밀리의 구성원이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 변형 박테리아 세포는 바실루스 속의 구성원이다. 특정 구현예에서, 본 개시의 변형 박테리아 세포는 B. 서브틸리스, B. 리케니포르미스, B.　 렌투스, B. 브레비스, B. 스테아로서모필루스, B. 알칼로필 루스, B. 아밀로리쿠에파시엔스, B. 클라우시이, B. 소노렌시스 , B.　 할로두란스 , B. 푸밀루스 , B. 라우투스 , B. 파불리 , B. 세레우스, B. 아가라드하에렌스 , B 아키 바이, B. 클라르키이 , B. 슈도피르무스 , B. 레헨시스 , B. 메가테륨, B. 코아굴란스, B. 서쿨란스, B. 깁소니이 및 B. 투린기엔시스 , B. 마르마렌시스로부터 선택되는 바실루스 세포이다. 다른 구현예에서, 바실루스 세포는 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스이다.
본 기술 분야에서 바실루스 속은 분류학적 재편성을 계속 겪고 있음이 인정된다. 따라서, 이 속은 현재 "지오바실루스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus)"로 명명된 B. 스테아로서모필루스, 또는 현재 "파에니바실루 스 폴리믹사 ( Paenibacillus polymyxa)인 B. 폴리믹사와 같은 유기체를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌, 재분류된 종을 포함하는 것으로 본다.
III. 증가된 수준의 관심 대상 단백질을 생산하는 변형 세포
변형 그람 양성 박테리아 세포가 증가된 수준의 POI를 생산함을 확인하기 위하여, 다양한 스크리닝 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 표적 단백질에의 폴리펩티드 융합물을 암호화할 수 있고, 검출 가능한 표지체로서의 역할을 하거나, 또는 대안적으로, 표적 단백질 그 자체가 선택 가능하거나 스크리닝 가능한 마커로서의 역할을 할 수 있다. 표지된 단백질은 또한 웨스턴 블로팅(Western blotting), 도트 블로팅(dot blotting)(이러한 방법의 상세한 설명은 콜드 스프링 하버 프로토콜즈(Cold Spring Harbor Protocols)의 웹사이트에서 입수 가능함), ELISA, 또는, 표지체가 GFP일 경우, 전 세포 형광(whole cell fluorescence) 또는 FACS를 사용하여 검출될 수 있다.
예를 들어, 6-히스티딘 태그를 포함시켜 표적 단백질에의 융합물을 만들 수 있고, 웨스턴 블롯을 사용하여 이러한 태그를 검출할 수 있다. 게다가, 표적 단백질이 충분히 높은 수준으로 발현될 경우, 쿠마시(Coomassie)/은 염색과 조합된 SDS-PAGE를 수행하여 야생형에 대비한 돌연변이체 발현의 증가를 적절히 검출할 수 있으며; 이러한 경우에, 분자의 표지는 전혀 필요하지 않을 것이다.
다른 구현예에서, 비변형(모) 세포에 대한 변형(숙주) 세포에서의 POI의 발현을 mRNA 전사체 수준과 상관시킨다. 예를 들어, 특정 구현예는 POI를 암호화하는 유전자 또는 ORF의 분자적 특성화에 관한 것으로, 이는 대개 RNA 발현의 시간적 및 공간적 분포의 철저한 분석을 포함한다. 다수의 널리 사용되는 절차가 존재하고 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는 전체 또는 폴리(A) RNA 샘플에서의 특정 mRNA의 풍부도의 검출 및 결정을 위한 것이다. 비제한적 예는 노던 블롯(Northern blot) 분석, 뉴클레아제 보호 분석법(nuclease protection assay; NPA), 원위치 혼성화, 및 역전사-폴리머라아제 연쇄 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)과 같은 방법을 포함한다.
예를 들어, 세포 당 단백질의 활성 또는 양, 배지 1 밀리리터 당 단백질의 활성 또는 양의 증가의 검출을 비롯하여, 배양 또는 발효가 더 오랜 기간 동안 효율적으로 계속되도록 하는 다른 방법, 또는 이들 방법의 조합을 통한 다른 방법이 개선된 수준의 관심 대상 단백질을 확인하기 위해 이용될 수 있다.
비생산성의 검출은 단백질 생산의 평가에 적합한 또 다른 방법이다. 비생산성(Qp)은 다음 식을 사용하여 결정될 수 있다:
Qp = gP/gDCW·hr
여기에서, "gP"는 탱크에서 생산된 단백질의 그램수이고, "gDCW"는 탱크 내 건조 세포 중량(DCW)의 그램수이고, "hr"은 접종 시점으로부터의 발효 시간(hour)으로, 이는 생산 시간 및 성장 시간을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시의 변형 박테리아 세포는 이의 비변형(모) 세포와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10% 이상의 POI를 생산한다.
IV. 관심 대상 단백질의 생산을 위한 변형 세포의 배양
다른 구현예에서, 본 개시는 비변형(모) 세포와 비교하여(즉, 이에 비해) 변형 박테리아 세포의 단백질 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 특정 구현예에서, 변형 박테리아 세포의 단백질 생산성을 증가시키는 방법은 변형 박테리아 세포를 적합한 발효 조건 하에 배양시키는 단계를 포함하는데, 여기에서 변형 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함한다.
따라서, 숙주 세포 및 형질전환된 세포는 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 형질전환된 숙주 세포용 배양 배지는 프로모터의 활성화 및 형질전환체의 선택을 위하여 적절할 경우 변형될 수 있다. 특정 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택되는 숙주 세포에 사용되는 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 게다가, 배양 조건은 과학 문헌, 예를 들어 Sambrook (1982; 2001), Harwood et al. (1990) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)에서 발견될 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 개시는 변형 박테리아 세포를 발효시키는 단계를 포함하는 POI의 생산 방법에 관한 것으로, 여기에서 변형 세포는 POI를 배양 배지 내로 분비한다. 본 기술 분야에 잘 알려진 발효 방법을 적용하여 변형 및 비변형 박테리아 세포를 발효시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리아 세포는 배치식 또는 연속식 발효 조건 하에서 배양된다. 전통적인 배치식 발효는 발효 초반에 배지의 조성을 설정하고 발효 동안 변경하지 않는 폐쇄 시스템이다. 발효 초반에, 배지에 요망되는 유기체(들)가 접종된다. 이 방법에서는, 임의의 구성요소를 이 시스템에 추가하지 않고 발효가 일어나도록 허용된다. 전형적으로, 배치식 발효는 탄소원의 첨가와 관련하여 "배치"로서의 자격이 있으며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하기 위한 시도가 종종 이루어진다. 배치식 시스템의 대사 산물 및 바이오매스의 조성은 발효가 중단되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 전형적인 배치식 배양 내에서, 세포는 정적 지체기를 통하여 고성장 대수기까지, 그리고 마지막으로 성장 속도가 감소되거나 중지되는 정지기까지 진행될 수 있다. 비처리될 경우, 정지기에 있는 세포는 결국 사멸한다. 일반적으로, 대수기에 있는 세포가 생산물의 대량 생산의 원인이 된다.
표준 배치식 시스템에 대한 적합한 변동으로는 "유가식 발효" 시스템이 있다. 전형적인 배치식 시스템의 이러한 변동에서는, 발효가 진행됨에 따라 기질이 증분 첨가된다. 유가식 시스템은 이화대사 억제가 세포의 대사를 저해할 가능성이 있을 때, 그리고 배지 중에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템에서 실제 기질 농도를 측정하는 것은 어렵고, 따라서 pH, 용존 산소 및 폐가스, 예컨대 CO2의 분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 개산된다. 배치식 및 유가식 발효는 본 기술 분야에서 일반적이며 공지되어 있다.
연속식 발효는 규정 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고, 동량의 조정 배지(conditioned medium)가 프로세싱을 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속식 발효는 일반적으로 배양물을 일정한 고밀도로 유지하는데, 이때 세포는 주로 대수기 성장에 있다. 연속식 발효는 세포 성장 및/또는 생성물 농도에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절을 허용한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 비율로 유지되고 다른 모든 파라미터는 적정 수준이 되도록 한다. 다른 시스템에서는, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도를 일정하게 유지하면서, 성장에 영향을 미치는 다수의 인자를 계속 변경할 수 있다. 연속식 시스템은 정상 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 배지의 배출로 인한 세포 손실은 발효에서 세포 성장 속도와 균형을 이룰 것이다. 연속식 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라, 생성물 형성 속도를 최대화하기 위한 기법은 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
이러한 특정 구현예에서, 형질전환된(변형) 숙주 세포에 의해 생산된 POI는 숙주 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하는 것, 또는 필요할 경우 세포를 파괴하는 것 및 상청액을 세포 분획 및 잔사로부터 제거하는 것을 포함하는 통상적인 절차에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 청징화 후 상청액 또는 여액의 단백질성 성분을 염, 예를 들어 황산암모늄에 의해 침전시킨다. 그 후, 침전된 단백질은 가용화되고, 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
V. 형질전환
본 개시의 RasP 폴리펩티드 또는 POI를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물은 숙주 세포에 의해 발현되도록 구축될 수 있다. 공지된 유전자 코드 축퇴성 때문에, 동일 아미노산 서열을 암호화하는 상이한 폴리뉴클레오티드들이 본 기술 분야에서의 일상적인 기술을 이용하여 설계되고 만들어질 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주 세포에서의 생산을 최적화하기 위하여 코돈 최적화가 적용될 수 있다.
관심 대상 단백질을 암호화하는 핵산이 벡터 내로 포함될 수 있는데, 여기에서 벡터는 잘 알려진 형질전환 기법, 예를 들어 본원에 개시된 것을 사용하여 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
벡터는 숙주 세포를 형질전환시키고 그 안에서 복제될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 예를 들어, POI를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 벡터의 증식(propagating) 및 증폭의 수단으로서의 박테리아 숙주 세포를 형질전환시키고 숙주 세포에서 복제될 수 있다. 벡터는 또한, 단백질 암호화 핵산(즉, ORF)이 기능성 단백질로서 발현될 수 있도록, 발현 숙주를 형질전환시킬 수 있다. 발현 숙주로서의 역할을 하는 박테리아 세포(즉, 변형 박테리아 "숙주" 세포)는 바실라세아에 패밀리의 구성원 및 바실루스 속의 구성원을 포함한다.
POI를 암호화하는 핵산을 포함하고 발현하도록 일상적인 기술로 변형될 수 있는 대표적인 벡터로는 벡터 p2JM103BBI가 있다(Vogtentanz, 2007 참조).
위에 간략하게 명시된 바와 같이, RasP 폴리펩티드 또는 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 전사를 허용하는 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 대하여 동종성이거나 이종성인 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, rasP 유전자의 발현을 증가시키는 변형은 천연 rasP 유전자 프로모터를 천연 rasP 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 임의의 프로모터로 교체하는 것을 포함한다. 프로모터 활성/강도를 평가하는 수단은 당업자에게 일상적이다.
본 개시의 POI 또는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를, 특히 박테리아 숙주에서 지시하기에 적합한 프로모터의 예는 E. 콜라이의 lac 오페론의 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) 아가라아제 유전자 dagA 또는 celA 프로모터, 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라아제 유전자(amyL)의 프로모터, 바실루스 스테아로서모필루스 말토게닉 아밀라아제 유전자(amyM)의 프로모터, 바실루스 아밀로리쿠에파시엔스 알파-아밀라아제(amyQ)의 프로모터, 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 등을 포함한다.
특정 구현예에서, POI 또는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 지시하는 프로모터는 야생형 aprE 프로모터, 돌연변이 aprE 프로모터 또는 공통 aprE 프로모터(PCT 국제 공개 WO2001/51643에 제시됨)이다. 다른 특정 구현예에서, POI 또는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 지시하는 프로모터는 야생형 spoVG 프로모터, 돌연변이 spoVG 프로모터 또는 공통 spoVG 프로모터이다(Frisby and Zuber, 1991).
특정 구현예에서, aprE 프로모터는 서열번호: 4에 대하여 약 90 내지 95%의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, spoVG 프로모터는 서열번호: 3에 대하여 약 90 내지 95%의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, RasP 폴리펩티드 또는 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 지시하는 프로모터는 리보솜 프로모터, 예를 들어 리보솜 RNA 프로모터 또는 리보솜 단백질 프로모터이다. 더욱 구체적으로, 특정 구현예에서, 리보솜 RNA 프로모터는 B. 서브틸리스로부터 유래된 rrn 프로모터이며, 더욱 구체적으로, rrn 프로모터는 B. 서브틸리스 유래의 rrnB, rrnI 또는 rrnE 리보솜 프로모터이다. 특정 구현예에서, 리보솜 RNA 프로모터는 PCT 국제 공개번호 WO2013/086219에 제시된 B. 서 브틸리스 유래의 P2 rrnI 프로모터이다.
RasP 또는 POI 코딩 서열은 신호 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 발현되는 rasP 유전자 또는 GOI(POI를 암호화함)와 천연적으로 회합된 DNA 서열일 수 있거나, 상이한 속 또는 종 유래의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 구축물 또는 벡터를 포함하는 신호 서열 및 프로모터 서열은 박테리아 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 이들 서열은 동일한 공급원 또는 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 신호 서열은 PCT 국제 공개 WO2001/51643에 제시된 aprE 프로모터에 작동 가능하게 연결된 aprE 신호 서열(예를 들어, Vogtentanz et al., 2007; Wang et al., 1988 참조)이다.
특정 구현예에서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연의 5'-비번역 영역(5'-UTR)의 변형이다. 다른 구현예에서, 천연의 rasP 염색체 5'-UTR은 서열번호: 5의 aprE 5'-UTR에 대하여 약 90 내지 95%의 서열 동일성을 포함하는 5'-UTR로 교체된다.
발현 벡터는 또한 적합한 전사 종결자 및, 진핵 생물에서 특정한 폴리아데닐화 서열이 관심 대상 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 것을 포함할 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 동일한 공급원으로부터 적합하게 유래될 수 있지만, 다른 구현예에서는, 종결 및 폴리아데닐화 서열이 서로 상이한 공급원 및/또는 프로모터와는 상이한 공급원으로부터 잘 유래될 수 있다.
적합한 벡터는 벡터가 숙주 세포에서 복제되는 것을 가능하게 하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이와 같이 가능하게 하는 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pIJ702 등의 복제 원점을 포함한다.
적합한 벡터는 또한 선택가능 마커, 예를 들어, 유전자 생성물이 단리 숙주 세포에서의 결함을 보완하는 유전자, 예를 들어 B. 서브틸리스 또는 B. 리케니포르 미스 유래의 dal 유전자; 또는 항생제 내성, 예를 들어 암피실린 내성, 카나마이신 내성, 클로람페니콜 내성, 테트라사이클린 내성 등을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로, 예를 들어 선택된 숙주 유기체에서의 벡터의 자율 복제를 가능케 하는 요소, 및 선택 목적을 위한 표현형으로 검출 가능한 하나 이상의 마커와 같은 클로닝 벡터의 구성 요소를 포함한다. 전형적으로 발현 벡터는 또한, 예를 들어 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 선택적으로, 리프레서 유전자, 하나 이상의 활성화 유전자(activator gene) 서열 등과 같은 제어 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
부가적으로, 적합한 발현 벡터는 관심 대상 단백질을 숙주 세포 소기관, 예컨대 퍼옥시좀으로, 또는 특정 숙주 세포 구획으로 표적화할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 표적화 서열은, 예를 들어 아미노산 서열 "SKL"일 수 있다. 제어 서열의 지시 하의 발현을 위하여, 관심 대상 단백질의 핵산 서열은 발현이 일어나도록 하는 적합한 방식으로 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
관심 대상 단백질을 암호화하는 DNA 구축물, 프로모터, 종결자 및/또는 기타 요소를 라이게이션하고, 이들을 복제에 필요한 정보를 포함하는 적합한 벡터 내로 삽입하는 데 사용되는, 본원에 개시된 것과 같은 프로토콜은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook et al., 1989, and 3rd edition 2001 참조).
폴리뉴클레오티드 구축물 또는 발현 벡터 중 어느 하나를 포함하는 단리된 세포는 POI의 재조합 생산에서 숙주 세포로서 유리하게 사용된다. 세포는 편리하게는 POI를 암호화하는 DNA 구축물(하나 이상의 카피)을 숙주 염색체 내로 통합시킴으로써 이 구축물로 형질전환될 수 있다. 일반적으로 통합은 이점으로 여겨지는데, 이와 같이 도입된 DNA 서열은 세포 내에서 안정하게 유지될 가능성이 더 크기 때문이다. DNA 구축물의 숙주 염색체 내로의 통합은 통상적인 방법을 적용하여, 예를 들어 상동 재조합 또는 이종 재조합에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 세포는 상이한 유형의 숙주 세포들과 관련하여 위에 기술한 바와 같은 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.
다른 구현예에서, 발현 숙주로부터 유전자를 결실시키는 것이 유리한데, 여기에서 유전자 결핍은 발현 벡터에 의해 큐어링될(cured) 수 있다. 공지된 방법을 사용하여 하나 이상의 불활성화 유전자를 갖는 박테리아 숙주 세포를 수득할 수 있다. 유전자 불활성화는 완전 또는 부분 결실에 의해, 삽입에 의한 불활성화에 의해, 또는 유전자가 그의 의도된 목적을 위해 비기능성이 되게 하는 임의의 다른 수단에 의해, 유전자가 기능성 단백질을 발현하는 것이 방지되도록 하여 성취될 수 있다.
박테리아의 형질전환 및 박테리아의 배양을 위한 기법은 표준으로서 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이는 관심 대상 재조합 단백질의 생산을 위하여 본 개시의 개선된 숙주를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. DNA 구축물 또는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 형질전환; 전기천공법; 핵 미세주입법; 형질도입; 형질감염, 예를 들어, 리포펙션 매개 및 DEAE-덱스트린 매개 형질감염; 인산칼슘을 이용한 인큐베이션에 의한 DNA 침전; DNA-코팅된 미세발사체(microprojectile)를 이용한 고속 충격(bombardment); 유전자 총 또는 바이오리스틱 형질전환(biolistic transformation) 및 원형질 융합 등과 같은 기법을 포함한다. 박테리아의 형질전환 및 발현 방법은 또한 Brigidi et al. (1990)에 개시되어 있다. 프로테아제 결실된 바실루스 주에 바람직한 일반 형질전환 및 발현 프로토콜은 페라리(Ferrari) 등의 미국 특허 제5,264,366호에 제공된다.
VI. 변형 세포에 의해 생산된 관심 대상 단백질
다른 구현예에서, 본 개시는 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 단계(여기에서 변형 박테리아 세포는 rasP 유전자(또는 이의 ORF)의 발현을 증가시키는 변형을 포함함), 및 변형 세포를 POI가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계(여기에서, 증가된 양의 POI를 발현하는 변형 박테리아 세포는 비변형 그람 양성 박테리아 세포에서의 POI의 발현과 비교됨)를 포함하는, 증가된 수준의 POI의 생산 방법을 제공한다.
POI는 임의의 내인성 또는 이종 단백질일 수 있고, 이러한 POI의 변이형일 수 있다. 단백질은 하나 이상의 디술피드 가교체를 함유할 수 있거나 기능적 형태가 단량체 또는 다량체인 단백질로, 즉, 단백질은 4차 구조를 갖고 복수의 동일한(상동성) 또는 동일하지 않은(이종) 서브유닛으로 구성되는데, 여기에서 POI 또는 이의 변이형 POI는 바람직하게는 관심 대상의 특성을 갖는 것이다.
특정 구현예에서, POI 또는 이의 변이형 POI는 아세틸 에스테라아제, 아릴 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르보닉 언하이드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코오스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글리코실 하이드롤라아제, 헤미셀룰라아제, 헥소오스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 펩티다아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소오스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
POI 또는 변이형 POI는 또한 펩티드, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원(예를 들어, HBV 표면 항원, HPV E7 등), 및 이들의 변이형 또는 이들의 단편일 수 있다.
관심 대상 단백질(또는 변이형)의 다른 유형은 식품 또는 작물에 영양적 가치를 제공할 수 있는 것일 수 있다. 비제한적인 예는 항-영양성 인자의 형성을 저해할 수 있는 식물성 단백질 및 더 바람직한 아미노산 조성(예를 들어, 비-형질전환 식물보다 더 높은 라이신 함량)을 갖는 식물성 단백질을 포함한다.
VII. 단백질성 조성물의 용도
다른 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 관심 대상 단백질(들)을 포함하는 단백질성 조성물을 제공한다. 단백질성 조성물은 적합하게는 본원에 제공된 방법을 사용하여 생산된다. 단백질성 조성물은 관심 대상 유전자에 의해 암호화되고 본원에 기술된 방법을 사용하여 발현되는 관심 대상 단백질을 포함한다. 이 조성물은, 예를 들어 바이오매스 가수분해, 세척(cleaning) 응용, 곡물 가공, 동물 영양, 식품 조성물, 직물 처리, 개인 케어(care) 제품 등에서와 같은 다양한 유용한 산업적 응용에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 이와 같이 생산된 단백질성 조성물은 세척 응용에서 사용될 수 있다. 효소적 세척 성분은 종래의 화학 세제로는 쉽게 제거되지 않는 오염물(soil), 얼룩 및 기타 잔사를 분해하는 능력 때문에 인기가 있다. 세척에 유용한 주지의 효소는 리파아제, 펙티나아제, 만나나아제, 심지어 특정 셀룰라아제와 같은 다른 효소와 함께 프로테아제 및 아밀라아제를 포함하며, 이들 각각은 일련의 상이한 기능성을 제공한다. 예를 들어, 프로테아제는 단백질 기반의 얼룩에 대항하고; 아밀라아제는 탄수화물 및 전분에 작용하고; 리파아제는 지질 또는 지방을 분해한다. 본 개시는 변형 박테리아 세포를 제공하는데, 이는 세척 응용에서 관심 대상 산업용 효소, 변이형, 및 혼합물의 생산자로서 이러한 사용에 적합하고 유리한 개선된 단백질 생산을 보여주었다.
또 다른 예에서, 이와 같이 제조된 단백질성 조성물은 곡물 가공에서 사용될 수 있다. 전분은 식물에서 가장 흔한 저장 탄수화물로, 식물 그 자신뿐만 아니라 미생물 및 고등 유기체에 의해서도 사용된다. 매우 다양한 효소가 전분 가수분해에 촉매 반응을 할 수 있다. 모든 식물 공급원으로부터의 전분은 과립 형태로 존재하지만, 식물 공급원의 종에 따라 전분은 현저하게 상이한 크기 및 물리적 특성으로 존재한다. 전분의 산 가수분해는 과거에는 광범위한 용도를 가졌지만, 이러한 공정은 현재 대부분 효소적 공정으로 대체되었으며, 이는 더 적은 내-부식성 재료 및 다른 혜택을 요구하는 것으로 알려져 있고, 가열에 더 적은 에너지가 필요하고 제어가 산 공정보다 상대적으로 더 쉽다. 본 개시는 엔지니어링된, 형질전환된, 또는 유도된 진정세균 세포를 제공하는데, 이는 전분 분해 및 곡물 가공에서 관심 대상 산업용 효소, 변이형, 및 혼합물의 생산자로서 이러한 사용에 적합하고 유리한 개선된 단백질 생산을 보여주었다.
또 다른 예에서, 이와 같이 제조된 단백질성 조성물은 식품 응용에서 사용될 수 있다. 박테리아, 효모 및 곰팡이에 의해 생산된 효소는 수천 년 동안 빵, 치즈, 맥주 및 포도주와 같은 식품의 제조를 위하여 식품 응용에서 사용되어 왔다. 오늘날 효소는 베이커리, 치즈 제조, 전분 가공 및 과일 주스 및 기타 음료의 생산에 사용되어 개선된 질감, 외관 및 영양적 가치와 같은 다양한 혜택을 제공하며, 바람직한 풍미 및 방향 등을 생성한다. 전형적으로, 식품용 효소는 일련의 유익한 미생물로부터 기원할 뿐만 아니라 동물 및 식물에서도 기원한다(예를 들어, 전분-소화 효소인 아밀라아제는 발아 중인 보리 종자로부터 수득될 수 있다). 효소는 많은 공정에서 합성 화학물질을 대체하는, 전통적인 화학-기반 기술에 대한 실행 가능하고 바람직한 대안으로 여겨진다. 효소는 식품 생산 공정의 환경 성능의 개선을 도와서 에너지 소비를 감소시키고 폐기물 또는 부산물의 생분해성을 개선할 수 있다. 효소는 그 작용에 있어서 합성 화학물질보다 더 특이적인 경향이 있으며, 따라서, 효소 공정은 더 적은 부반응 및 폐기물 또는 부산물을 제공하는 경향이 있고, 그 결과 더 높은 품질의 제품을 생산하고 오염 가능성을 감소시킨다. 흔히 효소 공정은 유일하게 가능한 공정이기도 하다. 이의 예는 투명 사과 주스 농축액의 생산에 있는데, 이는 펙티나아제라는 효소의 사용에 의존한다. 대부분의 식품용 효소는 바실루스, 아스페르길루스(Aspergillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 클루이 베로마이세스(Kluyveromyces)와 같은 미생물로부터 생산된다. 본 개시는 엔지니어링된, 형질전환된, 또는 유도된 진정세균 세포를 제공하는데, 이는 식품 응용에서 관심 대상 산업용 효소, 변이형, 및 혼합물의 생산자로서 이러한 사용에 적합하고 유리한 개선된 단백질 생산을 보여주었다.
또 다른 예에서, 이와 같이 제조된 단백질성 조성물은 동물 사료 첨가제에서 사용될 수 있다. 셀룰라아제, 자일라나아제, β-글루카나아제, 프로테아제, 리파아제, 피타아제 및 다른 관심 대상 탄수화물 분해효소가 동물 사료 산업에 널리 사용되고 있다. 많은 식물 기반 사료가 동물 성장을 감소시키는 항-영양 인자를 갖는 물질을 함유하기 때문에, 이러한 사료에 첨가되는 효소는 섬유, 단백질, 전분 및 피테이트를 분해시킴으로써 이들 항-영양 인자의 소화성을 개선시켜, 이들이 동물에 의해 더 많이 분해될 수 있게 하고, 더 저렴한 그리고 흔히 현지 생산된 사료의 사용을 가능하게 하는 한편 고기, 난류 또는 우유 생산성을 최대화한다. 이와 동시에, 이러한 사료에 첨가된 효소는 또한 소화기관 건강 및 향상된 동물 능력을 지원하는 혜택을 제공할 수 있다. 본 개시는 엔지니어링된, 형질전환된, 또는 유도된 진정세균 세포를 제공하는데, 이는 동물 사료 응용에서 관심 대상 산업용 효소, 변이형, 및 혼합물의 생산자로서 이러한 사용에 적합하고 유리한 개선된 단백질 생산을 보여주었다.
또한 추가의 예에서, 이와 같이 제조된 단백질성 조성물은 직물 응용에서 사용될 수 있다. 효소는 직물 가공의 필수적인 부분이 되었다. 직물 산업에는 두 가지 잘 확립된 효소 응용이 있다. 첫째, 아밀라아제와 같은 효소는 보통 발호(desizing)를 위한 예비적 마감 영역에서 사용된다. 둘째, 셀룰라아제와 같은 효소는 보통 면 제품의 유연화, 바이오-스토닝(bio-stoning) 및 보풀(pilling) 경향 감소를 위한 마감 영역에서 사용된다.
예를 들어, 펙티나아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 자일라나아제 등과 같은 다른 효소도 직물 가공에서 사용된다. 게다가, 데님 및 비-데님의 효소 포함된 색바램, 바이오-스코어링(bio-scouring), 바이오-폴리싱(bio-polishing), 울 피니싱(wool finishing), 과산화물 제거, 염료의 탈색 등을 수반하는 다양한 응용이 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시는 직물 응용에서 관심 대상 산업용 효소, 변이형, 및 혼합물의 생산자로서 이러한 사용에 변형 그람 양성 박테리아 세포(이는 본원에서 개선된 단백질 생산을 갖는 것으로 입증됨)를 제공한다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 비제한적인 예는 다음과 같다:
1. 비변형(모) 그람 양성 박테리아 세포에 비해 증가된 양의 관심 대상 단백질(POI)을 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포로서, 여기에서 변형 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함하는 변형 세포.
2. 제1항에 있어서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형인 변형 세포.
3. 제2항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터는 천연 rasP 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 임의의 프로모터로 교체된 변형 세포.
4. 제2항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터는 spoVG 프로모터 또는 aprE 프로모터로 교체된 변형 세포.
5. 제4항에 있어서, spoVG 프로모터는 서열번호: 3에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형 세포.
6. 제4항에 있어서, aprE 프로모터는 서열번호: 4에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형 세포.
7. 제2항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 5'-비번역 영역(5'-UTR)의 변형인 변형 세포.
8. 제7항에 있어서, 천연 rasP 염색체 5'-UTR은 서열번호: 5의 aprE 5'-UTR에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 5'-UTR로 교체된 변형 세포.
9. 제2항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터 및 천연 5'-UTR 둘 다의 변형인 변형 세포.
10. 제1항에 있어서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 rasP 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드인 변형 세포.
11. 제10항에 있어서, rasP 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 염색체외 플라스미드 내에 포함되는 변형 세포.
12. 제11항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 발현 카세트인 변형 세포.
13. 제11항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 통합 플라스미드인 변형 세포.
14. 제13항에 있어서, 플라스미드는 변형 세포의 염색체로 안정적으로 통합되는 변형 세포.
15. 제1항에 있어서, rasP 발현을 증가시키는 유전적 변형은 외인성 rasP 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, 여기에서 ORF는 구성적 프로모터, 유도 가능한 프로모터 또는 조건부 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 그의 제어 하에 있는 변형 세포.
16. 제15항에 있어서, rasP ORF를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 염색체외 플라스미드 내에 포함되는 변형 세포.
17. 제16항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 발현 카세트인 변형 세포.
18. 제16항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 통합 플라스미드인 변형 세포.
19. 제18항에 있어서, 플라스미드는 변형 세포의 염색체로 통합되는 변형 세포.
20. 제1항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 1의 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열에 대하여 적어도 60%의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 변형 세포.
21. 제20항에 있어서, 서열번호: 1의 ORF는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는데, 여기에서 RasP 폴리펩티드는 부위-2 프로테아제(S2P) 활성을 갖는 Zn2 + 메탈로프로테아제로서 추가로 정의되는 변형 세포.
22. 제1항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드에 대하여 60%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 RasP 폴리펩티드를 암호화하고 서열번호: 6의 활성 부위 공통 서열을 포함하는데, 이는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 16 내지 26과 정렬되는 변형 세포.
23. 제1항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드에 대하여 80%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 RasP 폴리펩티드를 암호화하고 서열번호: 7의 활성 부위 공통 서열(HEXXH)을 포함하는데, 이는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 20 내지 24와 정렬되는 변형 세포.
24. 제1항에 있어서, 생산된 POI의 증가된 양은 비변형(모) 그람 양성 세포에 비해 적어도 5% 증가인 변형 세포.
25. 제1항에 있어서, 생산된 POI의 증가된 양은 비변형(모) 그람 양성 세포에 비해 적어도 10% 증가인 변형 세포.
26. 제1항에 있어서, 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스(Bacillus) 속의 구성원인 변형 세포.
27. 제26항에 있어서, 바실루스는 B. 서브틸리스 ( subtilis ), B. 리케니포르미스(licheniformis), B. 렌투스 ( lentus ), B. 브레비스 ( brevis ), B. 스테아로서모필루스 (stearothermophilus), B. 알칼로필루스 ( alkalophilus ), B. 아밀로리쿠에파시엔스 (amyloliquefaciens), B. 클라우시이 ( clausii ), B. 소노렌시스 (sonorensis), B. 할로두란스 ( halodurans ), B. 푸밀루스 ( pumilus ), B. 라우투스 (lautus), B. 파불리 ( pabuli ), B. 세레우스( cereus ), B. 아가라드하에렌스 (agaradhaerens), B 아키바이 ( akibai ), B. 클라르키이 ( clarkii ), B. 슈도피르무스 (pseudofirmus), B. 레헨시스 ( lehensis ), B. 메가테륨 ( megaterium ), B. 코아굴란스 (coagulans), B. 서쿨란스 ( circulans ), B. 깁소니이 ( gibsonii ), B. 마르마렌시스 (marmarensis), 및 B. 투린 기엔시스(thuringiensis)로부터 선택되는 변형 세포.
28. 제27항에 있어서, 바실루스는 B. 서브틸리스 또는 B. 리케니포르미스인 변형 세포.
29. 제1항에 있어서, POI는 변형 박테리아 세포에 대하여 외인성인 유전자 또는 변형 박테리아 세포에 대하여 내인성인 유전자에 의해 암호화되는 변형 세포.
30. 제1항에 있어서, POI는 세포외로 분비되거나 수송되는 변형 세포.
31. 제30항에 있어서, 세포외로 분비되거나 수송된 POI는 추가로 단리 및 정제되는 변형 세포.
32. 제1항에 있어서, POI는 효소인 변형 세포.
33. 제32항에 있어서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아릴 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코오스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소오스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소오스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형 세포.
34. 제1항의 변형 세포에 의해 생산되는 단리된 POI.
35. (a) 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 얻는 단계(여기에서 변형 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함함), 및
(b) POI가 발현되도록 하는 조건 하에 변형 세포를 배양하는 단계(여기에서 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 박테리아 세포는 비변형(모) 그람 양성 박테리아 세포에서의 동일한 POI의 생산과 비교됨)를 포함하는,
그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법.
36. 제35항에 있어서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형인 방법.
37. 제36항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터는 천연 rasP 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 임의의 프로모터로 교체되는 방법.
38. 제35항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터는 spoVG 프로모터 또는 aprE 프로모터로 교체되는 방법.
39. 제38항에 있어서, spoVG 프로모터는 서열번호: 3에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
40. 제38항에 있어서, aprE 프로모터는 서열번호: 4에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
41. 제35항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 5'-비번역 영역(5'-UTR)의 변형인 방법.
42. 제41항에 있어서, 천연 rasP 염색체 5'-UTR은 서열번호: 5의 aprE 5'-UTR에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 5'-UTR로 교체되는 방법.
43. 제35항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터 및 천연 5'-UTR 둘 다의 변형인 방법.
44. 제35항에 있어서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 rasP 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드인 방법.
45. 제44항에 있어서, rasP 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 염색체외 플라스미드 내에 포함되는 방법.
46. 제45항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 발현 카세트인 방법.
47. 제45항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 통합 플라스미드인 방법.
48. 제47항에 있어서, 플라스미드는 변형 세포의 염색체로 통합되는 방법.
49. 제35항에 있어서, rasP 발현을 증가시키는 유전적 변형은 외인성 rasP 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, 여기에서 ORF는 구성적 프로모터, 유도 가능한 프로모터 또는 조건부 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 그의 제어 하에 있는 방법.
50. 제49항에 있어서, rasP ORF를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 염색체외 플라스미드 내에 포함되는 방법.
51. 제50항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 발현 카세트인 방법.
52. 제50항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 통합 플라스미드인 방법.
53. 제52항에 있어서, 플라스미드는 변형 세포의 염색체로 통합되는 방법.
54. 제35항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 1의 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열에 대하여 적어도 60%의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 방법.
55. 제54항에 있어서, 서열번호: 1의 ORF는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는데, 여기에서 RasP 폴리펩티드는 부위-2 프로테아제(S2P) 활성을 갖는 Zn2 + 메탈로프로테아제로서 추가로 정의되는 방법.
56. 제35항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드에 대하여 60%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 RasP 폴리펩티드를 암호화하고 서열번호: 7의 활성 부위 공통 서열을 포함하는데, 이는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 16 내지 26과 정렬되는 방법.
57. 제35항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드에 대하여 80%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 RasP 폴리펩티드를 암호화하고 서열번호: 7의 활성 부위 공통 서열을 포함하는데, 이는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 20 내지 24와 정렬되는 방법.
58. 제35항에 있어서, 생산된 POI의 증가된 양은 비변형(모) 그람 양성 세포에 비해 적어도 5% 증가인 방법.
59. 제35항에 있어서, 생산된 POI의 증가된 양은 비변형(모) 그람 양성 세포에 비해 적어도 10% 증가인 방법.
60. 제35항에 있어서, 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스(Bacillus) 속의 구성원인 방법.
61. 제60항에 있어서, 바실루스는 B. 서브틸리스 ( subtilis ), B. 리케니포르미스(licheniformis), B. 렌투스 ( lentus ), B. 브레비스 ( brevis ), B. 스테아로서모필루스 (stearothermophilus), B. 알칼로필루스 ( alkalophilus ), B. 아밀로리쿠에파시엔스 (amyloliquefaciens), B. 클라우시이 ( clausii ), B. 소노렌시스 ( sonorensis ), B. 할로두란스(halodurans), B. 푸밀루스 ( pumilus ), B. 라우투스 ( lautus ), B. 파불리 (pabuli), B. 세레우스( cereus ), B. 아가라드하에렌스 ( agaradhaerens ), B 아키바이 (akibai), B. 클라르키이 ( clarkii ), B. 슈도피르무스 ( pseudofirmus ), B. 레헨시스 (lehensis), B. 메가테륨 ( megaterium ), B. 코아굴란스 ( coagulans ), B. 서쿨란스 (circulans), B. 깁소니이 ( gibsonii ), B. 마르마렌시스 ( marmarensis ), 및 B. 투린 기엔시스(thuringiensis)로부터 선택되는 방법.
62. 제61항에 있어서, 바실루스는 B. 서브틸리스 또는 B. 리케니포르미스인 방법.
63. 제35항에 있어서, POI는 변형 박테리아 세포에 대하여 외인성인 유전자 또는 변형 박테리아 세포에 대하여 내인성인 유전자에 의해 암호화되는 방법.
64. 제35항에 있어서, POI는 세포외로 분비되거나 수송되는 방법.
65. 제64항에 있어서, 세포외로 분비되거나 수송된 POI는 추가로 단리 및 정제되는 방법.
66. 제35항에 있어서, POI는 효소인 방법.
67. 제66항에 있어서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아릴 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코오스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소오스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소오스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
68. 제35항의 방법에 의해 생산되는 단리된 POI.
69. (a) 모 그람 양성 박테리아 세포로 rasP 유전자 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전자 변형을 도입하는 단계, 및
(b) 증가된 양의 POI를 발현하는 하나 이상의 딸 세포를 선택하는 단계(여기에서 증가된 양의 POI를 생산하기 위해 선택된 하나 이상의 딸 세포는 변형(딸) 그람 양성 박테리아 세포로 정의됨)를 포함하는,
증가된 양의 POI를 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 방법.
실시예
본 개시의 특정 양태는 다음 실시예를 고려하여 추가로 이해될 수 있는데, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 재료 및 방법에 대한 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1
변형 바실루스 서브틸리스 숙주 세포의 구축
Taq 폴리머라아제, dNTP 및 완충액은 Takara Bio Inc.(Clontech Laboratories, Inc.; Mountain View, CA)에서 구입하였고 아래 기술된 돌연변이체 B. 서브틸리스 세포의 구축에 사용하였다. Phusion High Fidelity DNA 폴리머라아제(New England Biolabs; Ipswich, MA)는 벡터의 구축에 사용하였다. 프라이머는 Eurogentec(Liege, Belgium)으로부터 입수하였다.
A. 결실된 rasP 유전자를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 숙주의 구축.
B. 서브틸리스 세포에서 rasP 결실 돌연변이체("ΔrasP")의 구축은 Fabret et al. (2002)에 의하여 기술된 변형 돌연변이 전달 방법을 사용하여 수행하였는데, 여기에서 모 B. 서브틸리스 세포는 Fabret et al. (2002)에 제시된 바와 같이 결실된 upp 유전자("Δupp")를 포함한다. B. 서브틸리스(Δupp) 세포에서 rasP 유전자를 완전히 교체(결실)시키기 위해, rasP 유전자의 5' 및 3' 측면(flanking) 영역을 서열번호: 44 및 서열 번호: 45의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다.
증폭된 rasP 단편을 upp 유전자 및 cI 유전자를 포함하는 플레오마이신 저항성 카세트에 융합시켰다(Fabret et al., 2002 참조). 생성된 융합 생성물을 사용하여 컴피턴트(competent) B. 서브틸리스 Δupp :: neoR(모) 세포를 형질전환시켰는데, 여기에서 컴피턴스(competence)는 0.3% 자일로오스로 유도되었다. 이것은 표적 rasP 유전자가 결여된 플레오마이신 저항성 및 네오마이신 민감성 (딸) 세포를 생성하였다. PCR 반응은 표적 rasP 유전자의 정확한 결실을 확인하기 위해 서열번호: 10/서열번호: 9의 올리고뉴클레오티드 쌍 및 서열번호: 10/서열번호: 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행하였다.
B. 결실된 tepA 유전자를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 숙주의 구축
Fabret et al. (2002)의 변형 돌연변이 전달 방법을 추가로 이용하여 B. 서 브틸리스(Δupp) 세포에서 tepA 유전자의 결실 돌연변이체("ΔtepA")를 구축하였다. 이에 따라, tepA 유전자를 완전히 교체하기 위해, 이들 유전자의 5' 및 3' 측면 영역을 서열번호: 12/서열번호: 13 및 서열번호: 14/서열번호: 15의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다. 다음에 증폭된 단편을 upp 및 cI 유전자를 포함하는 플레오마이신 저항성 카세트에 융합시켰다(Fabret et al., 2002 참조). 다음에 생성된 융합 생성물을 사용하여 컴피턴트 B. 서브틸리스 Δupp :: neoR(모) 세포를 형질전환시켰는데, 여기에서 컴피턴스는 0.3% 자일로오스로 유도되었다. 이것은 표적 tepA 유전자가 결여된 플레오마이신 저항성 및 네오마이신 민감성 균주를 생성하였다. PCR 반응은 tepA 유전자의 정확한 결실을 확인하기 위해 서열번호: 16/서열번호: 15 및 서열번호: 16/서열번호: 11의 프라이머 조합을 사용하여 수행하였다.
C. rasP 유전자를 과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포의 구축
1. 통합 벡터 pRS - spoIIIAA ~AG 의 구축.
spoIIIAA ~AB 유전자의 1,040 염기쌍 DNA 단편(서열번호: 17)을 서열번호: 18/서열번호: 19의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다. 스펙티노마이신 저항성 마커는 두 개의 lox 서열을 측면으로 하여(즉, 서열번호: 20), IDT(Integrated DNA Technologies)로부터 g-Block으로서 주문 합성하였다. spoIIIAF ~AG 유전자에서 981 염기쌍 DNA 서열(즉, 서열번호: 21)은 서열번호: 22 및 서열 번호: 23의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켰다. 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 "pRS426"을 서열번호: 24 및 서열 번호: 25의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켰다. 이어서, 위의 DNA 서열(즉, 서열번호: 17, 서열번호: 20, 서열번호: 21) 및 pRS426 증폭된 벡터를 Gibson Assembly® HiFi 1 Step Kit(SGI)를 사용하여 시험관내 조립하여 통합 벡터 "pRS-spoIIIAA~AG"를 생성하였다.
2. 플라스미드 pRS - spoIIIAA ~AG- PspoVG - rasP 의 구축.
본원에 기술된 특정 rasP 과발현 실험을 위해, B. 서브틸리스 spoVG 유전자의 프로모터를 사용하여 rasP 유전자를 구동(과발현)시켰다. 예를 들어, spoVG 프로모터의 서열을 포함하는 합성 g-Block(서열번호: 3)을 IDT(Integrated DNA Technologies)로부터 주문하였다. rasP 코딩 서열을 서열번호: 26 및 서열 번호: 27의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. "pRS-spoIIIAA ~AG"로 지칭된 플라스미드를 서열번호: 28 및 서열 번호: 29의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켰다. 플라스미드 "pRS-spoIIIAA ~AG- PspoVG - rasP"는 Gibson Assembly® HiFi 1 Step Kit(SGI)를 사용하여 spoVG 프로모터 서열, rasP 코딩 서열 및 플라스미드 pRS-spoIIIAA ~AG의 조립에 의해 제작하였다. RasP 폴리펩티드의 발현 및 생산을 더욱 증가시키기 위해, 서열번호: 5의 aprE(유전자) 리더 서열(즉, 5'-UTR)을 rasP 유전자의 앞(5')으로 클로닝하여, 플라스미드 "pRS-spoIIIAA ~AG- PspoVG - UTR -rasP"를 생성하였다.
3. 플라스미드 pRS - spoIIIAA ~AG- PaprE - rasP 의 구축.
본원에서 "pRS-spoIIIAA ~AG- PaprE - rasP"로 칭한 rasP(유전자) 과발현 플라스미드를 구축하기 위해, B. 서브틸리스 aprE(유전자) 프로모터("PaprE"; 서열번호: 4)를 벡터 내에 5'로 포함시키고 rasP 코딩 서열에 작동 가능하게 연결하였다. B. 서브틸리스 aprE 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 PCR에 의해 B. 서브틸리스의 게놈으로부터 서열번호: 30 및 서열번호: 31의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켰다. 플라스미드 "pRS-spoIIIAA ~AG- PspoVG - rasP"를 PCR에 의해 서열번호: 32 및 서열번호: 33의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켰다. aprE 프로모터(PaprE) 및 플라스미드를 Gibson Assembly® HiFi 1 Step Kit(SGI)로 연결시켰다.
4. 플라스미드 pRS - spoIIIAA ~AG- PspoVG - tepA 의 구축.
신호 펩티드 펩티다아제 tepA의 뉴클레오티드 서열을 B. 서브틸리스 게놈 DNA로부터 서열번호: 34 및 서열번호: 35의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켰다. pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP의 플라스미드 골격을 PCR에 의해 서열번호: 36/서열번호: 37의 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 증폭시켰다. tepA 유전자 서열 및 증폭된 플라스미드를 Gibson Assembly® HiFi 1 Step Kit(SGI)로 연결시켰다. 생성된 플라스미드를 pRS-spoIIIAG-PspoVG-tepA로 명명하였다.
실시예 2
이종 rasP 또는 tepA 유전자 구축물로 B. 서브틸리스 숙주 세포의 형질전환
플라스미드 pRS-spoIIIAA ~AG- PspoVG - rasP(실시예 1.C.2 참조), pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-UTR-rasP(실시예 1.C.2 참조), pRS-spoIIIAA ~AG- PaprE - rasP(실시예 1.C.3 참조) 및 pRS-spoIIIAA ~AG- PspoVG - tepA(실시예 1.C.4 참조)를 각각 제한 엔도뉴클레아제 ScaI로 선형으로 하고 각각의 플라스미드를 별개로 컴피턴트 바실루스 서브틸리스 세포를 형질전환시켰다. 양성 콜로니를 100 ㎍/mL의 스펙티노마이신을 함유하는 루리아(Luria) 한천 플레이트에서 선택하였다. 생성된(형질전환된) B. 서브틸리 스(딸) 세포는 본원에서 "PspoVG-rasP", "PspoVG-UTR-rasP", "PaprE-rasP" 및 PspoVG-tepA로서 언급된다.
실시예 3
관심 대상 단백질을 암호화하는 이종 유전자(발현 구축물)로의 변형 B. 서브틸리스 (숙주) 세포의 형질전환
A. AmyL 발현 구축물
B. 서브틸리스 aprE 프로모터("PaprE") 및 aprE 신호 서열("aprE UTR", 이하 "UTR"; 실시예 1.C.2 참조)을 사용하여 바실루스 리케니포르미스 "AmyL" 아밀라아제(성숙 서열 서열번호: 38)의 발현을 구동하였다. 본원에서 "PaprE-AmyL-catR"(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 저항성("catR") 마커 유전자를 포함함)로서 지칭되는 발현 구축물로 (1) B. 서브틸리스 야생형("wt") 세포(즉, 모 세포)를, (2) rasP 결실(ΔrasP)을 포함하는 변형(딸) B. 서브틸리스 세포를, 그리고 (3) tepA 결실(ΔtepA)을 포함하는 변형(딸) B. 서브틸리스 세포를 형질전환시켰다. 형질전환체를 5 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아 한천 플레이트 상에서 선택하였다.
B. 아밀라아제 PcuAmy1 -v6를 위한 발현 구축물
B. 서브틸리스 aprE 프로모터("PaprE") 및 aprE 신호 서열("UTR")을 사용하여 PcuAmy1-v6로 지칭된 파에니바실루스 쿠르들라놀리티쿠스(Paenibacillus curdlanolyticus) 아밀라아제(성숙 서열 서열번호: 39) 변이형의 발현을 구동시켰다. "PaprE-PcuAmy1-v6-catR"(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 저항성(catR) 마커 유전자를 포함함)로 지칭된 발현 카세트로 (1) rasP 유전자를 포함하고 "PspoVG" 프로모터의 제어 하에 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스(딸) 세포(즉, 위의 실시예 2에 기술된 "PspoVG-rasP" 세포)를, (2) rasP 유전자를 포함하고 PaprE 프로모터의 제어 하에 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스(딸) 세포(즉, 위의 실시예 2에 기술된 "PaprE-rasP" 세포)를, (3) tepA 유전자를 포함하고 "PspoVG" 프로모터의 제어 하에 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스(딸) 세포(즉, 위의 실시예 2에 기술된 "PspoVG-tepA" 세포)를, 그리고 (4) B. 서브틸리스(모) 세포를 형질전환시켰다. 양성 콜로니를 5 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아 한천 플레이트 상에서 선택하였다.
C. AmyE 발현 구축물
B. 서브틸리스 aprE 프로모터("PaprE")를 사용하여 B. 서브틸리스 "AmyE" 아밀라아제(성숙 서열 서열번호: 40)의 발현을 구동시켰다. "PaprE-amyE-catR"(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 저항성(catR) 마커 유전자를 포함함)로 지칭된 발현 카세트를 (1) rasP 유전자를 포함하고 "PspoVG" 프로모터의 제어 하에 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, 위의 실시예 2에 기술된 "PspoVG-rasP" 세포)로, (2) rasP 유전자를 포함하고 "PspoVG" 프로모터 및 aprE UTR의 제어 하에 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, 위의 실시예 2에 기술된 "PspoVG-UTR-rasP" 세포)로, (3) rasP 유전자를 포함하고 "PaprE" 프로모터의 제어 하에 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, 위의 실시예 2에 기술된 "PaprE-rasP" 세포)로, (4) tepA 유전자를 포함하고 "PspoVG" 프로모터의 제어 하에 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(위의 실시예 2에 기술된 "PspoVG-tepA" 세포)로, (5) rasP(ΔrasP) 유전자 결실을 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포(실시예 1.A 참조)로, (6) tepA(ΔtepA) 유전자 결실을 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포(실시예 1.B 참조)로, 그리고 (7) 비변형(모) B. 서브틸리스 대조 세포의 게놈 aprE 유전자좌로 도입하였다. 양성 콜로니를 5 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아 한천 플레이트 상에서 선택하였다.
D. BglC 발현 구축물
B. 서브틸리스 β-D-글루코시다아제(이하, "BglC"; 성숙 서열 서열번호: 41)를 암호화하는 발현 구축물(이의 발현은 aprE 프로모터(PaprE)의 제어 하에 있음)을 구축하고 "PaprE - BglC - catR"로 지칭하였다. PaprE - BglC - catR 구축물을 (1) 야생형(비변형; 모) B. 서브틸리스 세포, (2) "PspoVG-rasP"를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포, (3) "PaprE-rasP"를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포, 및 (4) "PspoVG-tepA"를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포의 aprE 유전자좌로 도입하였다. 양성 콜로니를 5 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아 한천 플레이트 상에서 선택하였다.
E. 프로페라아제 발현 구축물
프로테아제인 프로페라아제(성숙 서열 서열번호: 42)를 암호화하는 발현 구축물(이의 발현은 aprE 프로모터(PaprE)의 제어 하에 있음)을 구축하고 "PaprE -Properase-catR"로 지칭하였다. PaprE - Properase - catR 발현 구축물을 (1) "PspoVG-rasP"를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포, (2) "PaprE-rasP"를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포, (3) "PspoVG-tepA"를 포함하고 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포, 및 (4) 야생형(비변형; 모) B. 서브 틸리스 세포의 aprE 유전자좌로 도입하였다. 양성 콜로니를 5 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 클로람페니콜 저항성 콜로니를 25 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아 한천 플레이트 상에서 증폭시켰다.
F. BPN '- Y217L 발현 구축물
바실루스 아밀로리쿠에파시엔스 프로테아제 BPN'-Y217L(서열번호: 43)를 암호화하는 발현 구축물(이의 발현은 aprE 프로모터(PaprE)의 제어 하에 있음)을 구축하고 "PaprE-BPN'-Y217L-catR"로 지칭하였다. PaprE-BPN'-Y217L-catR 발현 카세트로 (1) rasP(ΔrasP) 유전자 결실을 포함하는 변형 바실루스 서브틸리스 세포, (2) tepA(ΔtepA) 유전자 결실을 포함하는 변형 바실루스 서브틸리스 세포, 및 (3) 야생형(비변형; 모) B. 서브틸리스 세포를 형질전환시켰다. PaprE-BPN'-Y217L-catR 구축물을 갖는 콜로니를 5 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아 한천 플레이트 상에서 선택하였다.
실시예 4
관심 대상 단백질의 발현 및 생산
A. 재료 및 방법
박테리아 성장 조건. B . 서브틸리스 세포를 용원성 브로스(Lysogeny Broth, LB; Oxoid Limited) 또는 MBU 배지에서 37℃, 280 rpm으로 성장시켰다. MBU 배지는 Vogtentanz et al., (2007)에 기술된 바와 같이 MBD 배지와 유사하지만 소이톤이 결여되고, 7.5% 글루코오스 대신 2.1% 글루코오스 및 3.5% 말토덱스트린 DE13-17을 함유한다. 필요시, 배지는 돌연변이의 선택을 위해 네오마이신 15 ㎍/mL 또는 플레오마이신 4 ㎍/mL, 또는 아밀라아제 또는 프로테아제 유전자의 선택 또는 증폭을 위해 (각각) 클로람페니콜 5 ㎍/mL 또는 25 ㎍/mL로 보충되었다. MBU 배지 상에서의 펄스-추적 표지 실험에서 2.5 ㎍/mL 클로람페니콜이 사용되었다.
성장의 분석. B. 서브틸리스 세포를 LB 중 2.5 ㎍/mL 클로람페니콜과 함께 37℃, 250 rpm으로 밤새 성장시켰다. 배양액을 96-웰 미세적정 플레이트에서 LB 중에 50배 희석하고 미세적정 플레이트 인큐베이터(Grant-bio PHMP-4, Grant Instruments Ltd)에서 37℃, 800 rpm으로 대략 3시간 동안 성장시켰다. 다음에 배양액을 MBU 중에 50배 희석하고 미세적정 플레이트 인큐베이터에서 37℃, 800 rpm으로 3시간 동안 성장시켰다. 신선한 MBU 중에 최종 50배 희석을 하고 PowerWave HT 마이크로플레이트 분광 광도계(Biotek)에서 OD600 측정에 의해 성장을 모니터링하였다.
단백질 발현 및 분비의 분석. B. 서브틸리스 배양물을 25 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 LB 플레이트에 접종하고 25 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 LB 브로스에서 대략 8시간 동안 성장시켰다. 이들 배양물을 2.5 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 MBU 배지로 진탕 플라스크에서 1000배 희석하고 Multitron 궤도 진탕기(Infors)에서 고습도 중 37℃, 280 rpm으로 대략 16시간 동안 인큐베이션하였다. OD600을 측정 및 보정한 후, 동량의 세포를 원심분리에 의해 배양 배지로부터 분리하였다. 세포외 단백질의 분석을 위해, 배양 배지의 단백질을 트리클로로아세트산(TCA; 10% w/v 최종 농도)으로 침전시키고, LDS 완충액(Life Technologies)에 용해하여 95℃에서 10분 동안 가열하였다. 다음에, 단백질을 10% NuPage 겔(Life Technologies) 상에서 LDS-PAGE에 의해 분리하고 SimplyBlueTM SafeStain(Life Technologies)으로 염색하였다.
펄스-추적 단백질 표지 실험. B. 서브틸리스 단백질의 펄스-추적 표지는 Easy 태그 35S 메티오닌(PerkinElmer Inc.)을 사용하여 수행하였다. 면역침전 및 LDS-PAGE는 이전에 기술된 바와 같이(Van Dijl et al., 1991) 다음 조정을 사용하여 수행하였다. 세포를 이전에 기술된 바와 같이 2.5 ㎍/mL 클로람페니콜이 함유된 MBU에서 16시간 동안 성장시키고 실제 표지 1시간 전에 대략 0.7의 OD600까지 2.5 ㎍/mL 클로람페니콜을 함유하는 신선한 MBU 중에 희석하였다. 표지를 25 μCi 35S Met으로 30초 동안 수행한 후 과량의 비표지 메티오닌(추적; 0.625 mg/mL 최종 농도)을 첨가하였다. 샘플을 수 회의 시점에서 수집한 다음, 얼음 상에서 10% TCA로 단백질의 직접 침전이 이어졌다. 침전을 용해 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 25 mM MgCl2, 200 mM NaCl 및 5 mg/mL 리소자임)에 재현탁하였다. 37℃에서 10 내지 15분의 인큐베이션 후, 1%(w/v) SDS를 첨가하고 100℃에서 10분 동안 가열함으로써 용해를 달성하였다.
AmyE 또는 AmyL에 대한 특이적 다클론 항체가 단백질-A 친화성 배지(Mabselect Sule, GE Healthcare Life Sciences)의 지원으로 STD-트리스 완충액(10 mM 트리스 pH 8.2, 0.9% (w/v) NaCl, 1.0% (v/v) 트리톤 X-100, 0.5% (w/v) 데옥시콜산나트륨)에서 각각의 표지된 단백질의 면역침전을 위해 사용되었다. 이 또한 항체를 분해시키는 BPN'-Y217L의 높은 단백질분해 활성 때문에, BPN'-Y217L의 면역침전은 특이적 세린 프로테아제 저해제(4 mM, Pefablock SC, Roche)의 존재 중에 수행되었다. B. 서브틸리스의 미확인 세포 단백질에 대한 BPN'-Y217L 항체의 특이적 결합으로 인해, BPN'-Y217L의 면역침전은 TCA-침전 배양 배지 샘플에서 분비된 BPN'-Y217L 분석에 대해서만 수행되었다. 표지된 단백질을 10% NuPage 겔(Life Technologies)을 사용하여 LDS-PAGE에 의해 분리하고 Cyclon Plus Phosphor Imager(Perkin Elmer)를 사용하여 가시화하였다.
B. 서브틸리스 에서 프로페라아제의 발현 및 생산. B. 서브틸리스 프로페라아제 발현을 시험하기 위해, RasP를 과발현하는 B. 서브틸리스 세포(예를 들어, 실시예 1.C 참조) 및 야생형(비변형; 모) B. 서브틸리스 세포를 5 mL LB에서 5시간 동안 성장시켰다. 1.5 OD의 예비-배양물을 사용하여 진탕 플라스크에서 25 mL의 MBU 배지에 접종하고 세포를 37℃, 250 rpm, 70% 습도에서 성장시켰다. 샘플을 성장 18, 25, 41, 48 및 65시간에 채취하였다. 세포 밀도를 SpectraMax 분광 광도계(Molecular Devices, Downington, PA, USA)를 사용하여 OD600nm에서 측정하고 600 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였다. 프로페라아제 효소 발현을, WO 2010/144283에 기술된 바와 같이, N-suc-AAPF-pNA 기질(본원에서, "AAPF"; Sigma Chemical Co.로부터)를 사용하여 모니터링하였다. 간략하게는, 전 브로스를 분석용 완충액(100 mM 트리스, 0.005% 트윈(Tween) 80, pH 8.6)에서 400배 희석시키고, 10 μL의 희석 샘플을 미세적정 플레이트에 배열시켰다. AAPF 스톡을 희석시키고, 분석용 완충액(DMSO 중 100 mg/mL AAPF 스톡의 100배 희석물) 및 190 μL의 이 용액을 미세적정 플레이트에 첨가하고 용액의 흡광도를 SpectraMax 분광 광도계를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 405 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였다.
B. 야생형 및 변형 B. 서브틸리스 세포에서 AmyE , AmyL 및 BPN '- Y217L 단백질 생산 분석.
rasP 또는 tepA 분비 시스템 요소가 결여된 각각의 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, ΔrasP 세포 또는 ΔtepA 세포)에서 AmyE, AmyL 또는 BPN'-Y217L의 생산을 2.5 ㎍/mL 클로람페니콜이 함유된 MBU에서 16시간의 성장 이후 LDS-PAGE에 의해 분석하였다. 이 목적으로 세포를 원심분리에 의해 성장 배지로부터 분리하고, 세포 밀도로 수정된 동량의 성장 배지를 겔 상에 로딩하였다. 각각의 돌연변이체 B. 서브틸리스 세포(즉, ΔrasP 세포 또는 ΔtepA 세포)에 의해 분비된 세포외 AmyE, AmyL 또는 BPN'-Y217L의 양을, 완전한 분비 시스템을 갖는 상응하는 B. 서브틸리스(야생형) 대조 세포(즉, 천연 rasP 또는 tepA 유전자를 포함하는 B. 서브틸리스 세포)에 의해 분비된 이들 단백질 각각의 양과 비교하였다. 분비된 효소의 정량화는 ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
도 1a 및 도 1b에 제시된 바와 같이, LDS-PAGE 겔 및 막대그래프 플롯은 각각 AmyE, AmyL 및 BPN'-Y217L의 생산이 야생형(모) 세포에 비해 ΔrasP 돌연변이체 세포에서 저하되는 것을 보여준다. 도 1a 및 도 1b에 제시된 ΔtepA 돌연변이체 세포는 tepA 결실이 야생형(모) 세포와 비교할 때 AmyE 또는 BPN'-Y217L의 생산에 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다.
C. 야생형 B. 서브틸리스 세포 및 rasP 를 발현/과발현하는 발현 카세트로 변형된 B. 서브틸리스 세포에서 AmyE의 발현.
각각 AmyE 아밀라아제 구축물("PaprE-amyE-catR")을 포함하는 B. 서브틸리스 야생형 세포, "PspoVG-rasP"를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포, 및 "PspoVG-UTR-rasP"를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포를 5 ppm의 클로람페니콜이 함유된 5 mL의 루리아 브로스에 밤새 접종하였다. 일(1) mL의 예비-배양물을 사용하여 진탕 플라스크에서 25 mL의 BHI(뇌-심근 침출) 배지에 접종하였다. 실험은 37℃, 250 rpm에서 Infors 진탕기를 사용하여 수행하였다. 성장 중에 시점을 선택하고, 세포 성장은 600 nm에서 측정하였다.
전 브로스의 AmyE 아밀라아제 활성을 세랄파(Ceralpha) HR 키트(Megazyme, Wicklow, Ireland)로부터 세랄파 시약을 사용하여 측정하였다. 세랄파 시약 믹스를 처음에 10 mL의 밀리큐(MilliQ) 물에 용해시키고, 이어서 30 mL의 50 mM 말레이트 완충액, pH 5.6을 첨가하였다. 배양 상청액을 밀리큐 물에 40배 희석하고 10 μL의 샘플을 55 μL의 희석된 표준 기질 용액(working substrate solution)에 첨가하였다. MTP 플레이트를 진탕 후 실온에서 4분 동안 인큐베이션하였다. 70 μL의 200 mM 보레이트 완충액, pH 10.2(정지 용액)의 첨가에 의해 반응을 정지시켰다. 용액의 흡광도를 400 nm에서 SpectraMax 분광 광도계를 사용하여 측정하고, 400 nm에서 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였다.
도 2a에 제시된 바와 같이, rasP 유전자를 포함하고 PspoVG 프로모터 및 aprE 5' UTR의 제어 하에 발현/과발현하는 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, PspoVG-UTR-rasP)는 개선된 세포 성장을 나타내어, 최고 수준의 rasP 발현이 시험된 조건에서 세포 성장에 양성적으로 영향을 미치는 것을 시사한다. 도 2b에 제시된 데이터는 추가로, 야생형 B. 서브틸리스 대조 세포와 비교할 때 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, "PspoVG-rasP" 세포 및 "PspoVG-UTR-rasP" 세포)에서 AmyE 아밀라아제의 증가된 생산을 나타낸다.
D. 야생형 B. 서브틸리스 세포 및 rasP 를 발현/과발현하는 발현 카세트로 변형된 B. 서브틸리스 세포에서 변이형 PcuAmy1-v6 아밀라아제의 발현.
각각 변이형 "PaprE-PcuAmy1-v6-catR" 구축물을 포함하는, B. 서브틸리스 야생형 세포 및 "PspoVG-rasP"를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포를 25 ppm의 클로람페니콜을 함유하는 5 mL의 루리아 브로스에 수일에 걸쳐 접종하였다. 일(1) mL의 예비-배양물을 사용하여 진탕 플라스크에서 25 mL의 적절한 배지에 접종하였다. 실험은 37℃, 250 RPM에서 Infors 진탕기를 사용하여 수행하였다. 성장 동안 아밀라아제의 활성을 측정하기 위해 성장 중 시점을 선택하였다.
전 브로스에서 PcuAmy1-v6 아밀라아제 활성을 세랄파 HR 키트(Megazyme, Wicklow, Ireland)로부터 세랄파 시약을 사용하여 측정하였다. 세랄파 시약 믹스를 처음에 10 mL의 밀리큐 물에 용해시키고, 이어서 30 mL의 50 mM 말레이트 완충액, pH 5.6을 첨가하였다. 배양 상청액을 밀리큐 물에 40배 희석시키고, 10 μL의 샘플을 55 μL의 희석된 표준 기질 용액에 첨가하였다. MTP 플레이트를 진탕 후 실온에서 4분 동안 인큐베이션하였다. 70 μL의 200 mM 보레이트 완충액 pH 10.2(정지 용액)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 용액의 흡광도를 400 nm에서 SpectraMax 분광 광도계를 사용하여 측정하고 400 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였다.
도 3에 제시된 바와 같이, 진탕 플라스크에서 PcuAmy1-v6 아밀라아제의 생산(OD600 nm에서의 세포 밀도로 보정됨)은 야생형 B. 서브틸리스 대조 세포와 비교할 때 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, rasP 과발현)에서 아밀라아제의 증가된 분비를 나타낸다.
E. 야생형 B. 서브틸리스 세포 및 tepA 를 발현/과발현하는 발현 카세트로 변형된 B. 서브틸리스 세포에서 변이형 PcuAmy1-v6 아밀라아제의 발현
각각 변이형 "PaprE-PcuAmy1-v6-catR" 구축물을 포함하는, B. 서브틸리스 야생형 세포 및 "PspoVG-tepA"를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포를 또한, TepA 신호 펩티드 펩티다아제를 과발현하는 효과를 결정하기 위해 진탕 플라스크에서 시험하였다. 따라서, 야생형 B. 서브틸리스 세포 및 "PspoVG-tepA"를 포함하는 변형 B. 서 브틸리스 세포를 루리아 브로스 배지에서 37℃로 밤새 성장시켰다. 일(1) mL의 예비-배양물을 사용하여 진탕 플라스크에서 25 mL의 BHI(뇌-심근 침출) 배지에 접종하였다. 실험은 37℃, 250 RPM에서 Infors 진탕기를 사용하여 수행하였다. 세포 성장을 600 nm에서 측정하고 성장 동안 시점을 선택하였다. 아밀라아제 분석은 위 실시예 5.D에 기술된 바와 같이 수행하였다.
도 4a에서 보여주는 바와 같이, 야생형 B. 세포 및 변형 B. 세포의 세포 밀도는 이들 세포가 유사한 성장 프로파일을 갖는 것을 나타낸다. 도 4b에서 보여주는 바와 같이, 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, tepA 과발현)에서 아밀라아제의 생산은 야생형 B. 서브틸리스 세포에 비해 약간 저하되었다.
F. 야생형 B. 서브틸리스 세포 및 rasP 를 발현/과발현하는 발현 카세트로 변형된 B. 서브틸리스 세포에서 베타-D-글루카나아제(BglC)의 발현
각각 "PaprE - BglC - catR" 구축물을 포함하는, B. 서브틸리스 야생형 세포 및 "PspoVG-rasP"를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포를 5 mL의 루리아 브로스에서 밤새 성장시켰다. 일(1) mL의 예비-배양물을 사용하여 진탕 플라스크에서 25 mL의 BHI 배지에 접종하고, 분비된 β-D-글루카나아제의 발현을 시험하기 위해 배양물을 37℃, 250 rpm에서 성장시켰다. 20배 희석된 전 브로스의 세포 밀도를 600 nm에서 1시간 간격으로 SpectraMax 분광 광도계를 사용하여 측정하고, 흡광도(600 nm에서)를 시간의 함수로서 도시하였으며, 이는 야생형 및 변형 B. 서브틸리스 세포가 유사한 세포 밀도를 갖는 것을 나타내었다.
β-D-글루카나아제 발현(즉, 활성)은 4-니트로페닐-β-D-셀로비오사이드 기질(Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA, Catalogue No. N57590)을 사용하여 모니터링하였다. 기질을 1 mL의 DMSO에 용해하여 100 mg/mL로 스톡 용액을 생성하였다. 표준 기질 용액은 35 μL의 스톡 용액을 10 mL의 분석용 완충액(100 mM 트리스, 0.005% 트윈 80, pH 8.6)에 희석하여 조제하였다. 사십(40) 마이크로리터의 각 배양액을 96 웰 미세적정 플레이트로 옮기고 180 μL의 표준 기질 용액을 각 웰로 첨가하였다. 미세적정 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고 인큐베이션 시기 종결시 용액의 흡광도를 405 nm에서 SpectraMax 분광 광도계를 사용하여 측정하였다. 405 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였다(도 5). 도 5에 제시된 바와 같이, 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, "PspoVG-rasP" 발현 구축물을 포함)는 야생형 B. 서브틸리스 세포에 비해 β-D-글루카나아제의 생산에서 증가를 나타내었다.
G. 야생형 B. 서브틸리스 세포 및 rasP 를 발현/과발현하는 발현 카세트로 변형된 B. 서브틸리스 세포에서 프로페라아제의 발현
각각 "PaprE - Properase - catR" 구축물을 포함하는, B. 서브틸리스 야생형 세포 및 "PspoVG-rasP"를 포함하는 변형 B. 서브틸리스 세포를 5 mL의 루리아 브로스에서 5시간 동안 성장시켰다. 1.5 OD의 예비-배양물을 사용하여 진탕 플라스크에서 25 mL의 적절한 배지에 접종하고 세포를 37℃, 250 rpm, 70% 습도에서 배양하였다. 샘플을 성장 18, 25, 41, 48 및 65시간에 채취하였다. 40배 희석된 전 브로스의 세포 밀도를 600 nm에서 SpectraMax 분광 광도계를 사용하여 측정하고, 600 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였다(도 6a). 도 6a에 제시된 바와 같이, 변형 B. 서브틸리스 세포는 야생형 B. 서브틸리스 세포에 비해 증가된 세포 밀도를 나타내었다.
프로페라아제 발현(즉, 활성)을 WO 2010/144283에 기술된 바와 같이 N-suc-AAPF-pNA 기질("AAPF"; Sigma Chemical Co.)을 사용하여 모니터링하였다. 간략하게는, 전 브로스를 분석용 완충액(100 mM 트리스, 0.005% 트윈 80, pH 8.6)에서 40배 희석시키고, 10 μL의 희석 샘플을 미세적정 플레이트에 배열시켰다. AAPF 스톡을 희석시키고, 분석용 완충액(DMSO 중 100 mg/mL AAPF 스톡의 100배 희석물) 및 190 μL의 이 용액을 미세적정 플레이트에 첨가하고 용액의 흡광도를 SpectraMax 분광 광도계를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 405 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였으며, 도 6b에 제시된다. 도 6b에 제시된 바와 같이, 변형 B. 서 브틸리스 세포에서 프로테아제인 프로페라아제의 생산은 야생형 B. 서브틸리스 대조 세포에서의 프로페라아제 생산보다 대략 5배 더 컸다.
실시예 5
rasP 폴리펩티드를 과발현하는 B. 서브틸리스 숙주 세포에서 AmyAc 패밀리 α-아밀라아제의 발현
AmyAc 패밀리에 속하는 박테리아 α-아밀라아제(예를 들어, (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=CARRMWTZ01N&mode=all 참조)를 B. 서브틸리스 야생형 숙주 세포(즉, 비변형; 모 세포) 및 변형 B. 서브틸리스 숙주 세포(즉, 변형 딸 세포)에서 발현시켰는데, 여기에서 변형 세포는 위의 실시예에 개괄적으로 기술한 바와 같이, rasP의 과발현을 위한 발현 카세트(spoIIIAH::PspoVG-rasP)를 포함한다. 더욱 구체적으로, aprE의 프로모터를 사용하여 (AmyAc 패밀리) α-아밀라아제(예를 들어, Pro aprE-α-아밀라아제)의 발현을 구동시켰는데, 여기에서 아세틸트랜스퍼라아제 유전자(catR)를 포함하는 발현 카세트를 25 μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 LB 플레이트에서 증폭시켰다. 각각의 균주(즉, 야생형 모 숙주 세포 및 rasP를 과발현하는 변형 딸 숙주 세포)로부터 네(4) 개의 콜로니를 사용하여 25 μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 LB 여덟(8) 개 튜브에 접종하고 37℃에서 네(4) 시간 동안 성장시켰다. 0.075 OD를 사용하여 이(2) mL의 5SM12 배지를 이십사(24) 웰 딥 미세적정 플레이트에서 접종시켰으며, 여기에서 B. 서브틸리스 숙주 세포를 사십팔(48) 시간 동안 성장시켰다. 시점은 18, 25, 41 및 48 시간으로 선택하였다. OD600 측정은 배양물을 실험에 사용된 배지 중에 40배 희석하여 실시하였다.
5SM12(5% 소이톤, 12% 말토덱스트린) 배지는 일반적으로 다음과 같이 제조된다: 1 mM 시트르산나트륨, 0.03 mM CaCl2, 0.0053% 시트르산 제2철 암모늄, 0.2 mM MnCl2, 0.5 mM MgSO4, 75 mM K2HPO4, 25 mM NaH2PO4, 12% 말토덱스트린 및 5% Difco Bacto 소이톤. 배지의 pH를 BPN 프로테아제에서는 pH 7.4로 조정하고(KOH로) 아밀라아제에서는 pH 7.7로 조정하였다(KOH로). 진탕 플라스크 조건은 다음과 같다: 배양액(32 내지 35 mL)을 Thomason AirOtop 향상된 밀봉(카탈로그 no. 899423)이 구비된 250 mL Thomson Ultra Yield Flasks(카탈로그 no. 931144)에서 성장시켰다. 성장을 위해, 배양액을 280 rpm, 37℃, 70% 습도(증발을 감소시키기 위함)에서 50 mm 스로(throw)로 Infors MultiTron 진탕기를 사용하여 진탕시켰다.
전 브로스의 아밀라아제 활성은 세랄파 HR 키트(Megazyme, Wicklow, Ireland)로부터 세랄파 시약을 사용하여 측정하였다. 세랄파 시약 믹스를 처음에 10 mL의 밀리큐 물에 용해시키고, 이어서 30 mL의 50 mM 말레이트 완충액, pH 5.6을 첨가하였다. 배양 상청액을 밀리큐 물에 40배 희석하고 10 μL의 샘플을 55 μL의 희석된 표준 기질 용액에 첨가하였다. MTP 플레이트를 진탕 후 실온에서 사(4) 분 동안 인큐베이션하였다. 70 μL의 200 mM 보레이트 완충액, pH 10.2(정지 용액)의 첨가에 의해 반응을 정지시켰다. 용액의 흡광도를 400 nm에서 SpectraMax 분광 광도계를 사용하여 측정하고, 400 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하였다(도 7b). 도 7b에 제시된 바와 같이, 변형 B. 서브틸리스 세포(즉, rasP 구축물을 발현)로부터의 아밀라아제 생산은 비변형(모) B. 서브틸리스 세포에 비해 아밀라아제 생산성에서 대략 2.5배 증가를 포함하였다.
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SEQUENCE LISTING <110> DANISCO <120> ENHANCED PROTEIN PRODUCTION AND METHODS THEREOF <130> 40883-WO-PCT <150> US62/387,578 <151> 2015-12-23 <150> US62/308,440 <151> 2016-03-15 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1269 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgttcgtga atacagttat agcgtttatc attattttcg gaacgctcgt tttcttccat 60 gaactgggcc atttattgct agcccaaaga gcgggaattc tctgccgtga atttgcgatc 120 ggcttcggtc caaagatttt ttctttcaaa aaaaatgaaa cagtttatac gatcaggctg 180 cttccggtcg gcggatttgt tcgtatggcc ggcgaagatc cggaaatgat tgaggtgaaa 240 cccggataca cggtcgggct tctgtttaat aaggaagatc aagttgagaa agtcatcatc 300 aatcaaaagg aaaaatatcc ggatgcttta gtcattgaag tggaaacagc ggatctagag 360 catgacatga agatcaccgg ttatgaacag gggaaagagg acgaactttc cagctttact 420 gtcagcgaaa catccttttt tattgtagac ggagaagaag tgcagattgc gccgtataat 480 cgccaatttg gttccaaacc tgtatggcag cggattaaag caattgctgc agggccgatt 540 atgaacttta ttttagctta cgtcatttta gtgatgcttg ggctgattca aggcgtaccg 600 tcaaatgaac ctatgctcgg gcagctgaca gacaatggac gggcggctga agcagggcta 660 aaagaagggg attatatcca aagcattaac ggagagaaaa tgaggtcttg gactgacatt 720 gtctccgctg taaaagaaaa cccggagaaa gaaatggacg ttgcagtaaa aagagataac 780 aaaacgcttc atatttcggt gactccggaa gctgttaaag atgagaacaa aaaaacaatc 840 ggacgtttcg gttcctatgc gccgactgaa aaaggcgtac tctcagcggt tgcttacggc 900 gcgacatcaa cagttgatgt caccaaagcc attttaacca atctgagcaa attagtaaca 960 ggccaattta aactcgatat gctgtcaggt cctgtcggca tatatgacat gacagaccaa 1020 gtggcgaaaa cagggatcgt gaacttattt cagtttgcgg cgtttttaag cattaacctt 1080 gggattgtca acctgcttcc gattccggca cttgacggag gaagactgtt gtttctattt 1140 attgaagcga ttcggggcaa accgattaac agggaaaaag aagcatttgt tgtgtttatc 1200 ggagtagctt tcttaatgct tcttatgctg gttgtcacat ggaacgatat ccagcggctg 1260 tttttgtaa 1269 <210> 2 <211> 422 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Phe Val Asn Thr Val Ile Ala Phe Ile Ile Ile Phe Gly Thr Leu 1 5 10 15 Val Phe Phe His Glu Leu Gly His Leu Leu Leu Ala Gln Arg Ala Gly 20 25 30 Ile Leu Cys Arg Glu Phe 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Lys Glu Met Asp Val Ala Val 245 250 255 Lys Arg Asp Asn Lys Thr Leu His Ile Ser Val Thr Pro Glu Ala Val 260 265 270 Lys Asp Glu Asn Lys Lys Thr Ile Gly Arg Phe Gly Ser Tyr Ala Pro 275 280 285 Thr Glu Lys Gly Val Leu Ser Ala Val Ala Tyr Gly Ala Thr Ser Thr 290 295 300 Val Asp Val Thr Lys Ala Ile Leu Thr Asn Leu Ser Lys Leu Val Thr 305 310 315 320 Gly Gln Phe Lys Leu Asp Met Leu Ser Gly Pro Val Gly Ile Tyr Asp 325 330 335 Met Thr Asp Gln Val Ala Lys Thr Gly Ile Val Asn Leu Phe Gln Phe 340 345 350 Ala Ala Phe Leu Ser Ile Asn Leu Gly Ile Val Asn Leu Leu Pro Ile 355 360 365 Pro Ala Leu Asp Gly Gly Arg Leu Leu Phe Leu Phe Ile Glu Ala Ile 370 375 380 Arg Gly Lys Pro Ile Asn Arg Glu Lys Glu Ala Phe Val Val Phe Ile 385 390 395 400 Gly Val Ala Phe Leu Met Leu Leu Met Leu Val Val Thr Trp Asn Asp 405 410 415 Ile Gln Arg Leu Phe Leu 420 <210> 3 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OLIGO <400> 3 taagaaaagt gattctggga gagccgggat cactttttta tttaccttat gcccgaaatg 60 aaagctttat gacctaattg tgtaactata tcctattttt tcaaaaaata ttttaaaaac 120 gagcaggatt tcagaaaaaa tcgtggaatt gatacacta 159 <210> 4 <211> 568 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 4 aattcctcca ttttcttctg ctatcaaaat aacagactcg tgattttcca aacgagcttt 60 caaaaaagcc tctgcccctt gcaaatcgga tgcctgtcta taaaattccc gatattggct 120 taaacagcgg cgcaatggcg gccgcatctg atgtctttgc ttggcgaatg ttcatcttat 180 ttcttcctcc ctctcaataa ttttttcatt ctatcccttt tctgtaaagt ttatttttca 240 gaatactttt atcatcatgc tttgaaaaaa tatcacgata atatccattg ttctcacgga 300 agcacacgca ggtcatttga acgaattttt tcgacaggaa tttgccggga ctcaggagca 360 tttaacctaa aaaagcatga catttcagca taatgaacat ttactcatgt ctattttcgt 420 tcttttctgt atgaaaatag ttatttcgag tctctacgga aatagcgaga gatgatatac 480 ctaaatagag ataaaatcat ctcaaaaaaa tgggtctact aaaatattat tccatctatt 540 acaataaata atactcacat aaggtggt 568 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 5 acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt aaaaggagag ggtaaaga 58 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-amino acid residue active site consensus sequence, which aligns with amino acid residues 16-26 of SEQ ID NO: 2. <220> <221> ACT_SITE <222> (1)..(11) <223> 11-amin acod residue consensus sequence qhich aligns to amino acid residues 16-26 of SEQ ID NO: 2. <400> 6 Leu Val Phe Phe His Glu Leu Gly His Leu Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Active site consnesus sequence, aligns to amino acid residues 20-24 of SEQ ID NO:2 <220> <221> ACT_SITE <222> (1)..(5) <223> 5-amino acid consensus sequence which aligns with amino acid residues 20-24 of SEQ ID NO: 2. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid <400> 7 His Glu Xaa Xaa His 1 5 <210> 8 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 8 cgagctcgaa ttcactggcc gtcgggatac gtcaattcaa tactcacata aggtggtacg 60 aaaagtaaat caatcagagg tgc 83 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 9 gatcgtacgg cgcaacg 17 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 10 gctcttcaag gcgaacagg 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 11 cttcaacgct aactttgag 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 12 ctgtccgttc cagtgtacgg 20 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 13 cgacctgcag gcatgcaagc tctcgctttc atcctttccg 40 <210> 14 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 14 cgagctcgaa ttcactggcc gtcgcaaaga gaaactcgga aaggatgaaa gcgagttctt 60 tataccgtga tgcctcag 78 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 15 ggtctgtcat tcaatttaga ctccag 26 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 16 cgcacgggca cgatg 15 <210> 17 <211> 1040 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 17 tcgctgaggt tctccctgaa tccatgaaaa acgccctttc tgaaataccg gaacaacaat 60 ggctggaaat cgaagaagtc agaattcgga tcaaccgccc tgttgaattg attcgaagag 120 gacaacctgt ttatttgtcc tatgcgggca cggccgagga tgcccatctg atcctgagcc 180 ggctcagcaa ctatagtatg tatacacttg aagaagagct gaagaaaggg tatgtcacga 240 tcagaggcgg ccacagagtc ggactggcgg gcagagtcat tacggaaaac ggaggtgtga 300 aaggcctccg tgacatcgca tcttttaata tacgaattgc ccggcaaaag ctggggattg 360 cggagccgct gcttccatac ttatatcaaa acagctggct gaatacgctg attatcggac 420 cgccccaaac cggcaaaaca acacttctcc gggaccttgc gaggctctca agcaccggca 480 aaaaaaacat gctgcccgta aagacaggga tcgtcgatga acggtcagag attgccggat 540 gtcttcgcgg tattccgcag catcaatttg gtcagagaat tgacgtgtta gacgcctgtc 600 caaaagctga agggctgatg atgatgattc gatccatgag ccctgaggtg atgattgtcg 660 atgaaatcgg gcgtatggaa gatacagatg cacttctgga ggcgctgcat gccggtgttt 720 cagtaatcgt atcggcgcat ggctggagta tatccgacct gatgaagcgg ccttcattga 780 agcgtttgtg ggaagaaaga gcctttgacc gctatttgga attatcaaga gcaaaagggc 840 cgggcacagt gagccaaatt tatgacaaag acggaaatgt gctgtctagg acgacgggcg 900 tgaaaacatg ctgaagctgc tgggcgctgt attcattgtg gtagcgacaa catggacagg 960 ttttgagatg gcgaagattt atacagaacg gccgcggcaa atccgccagc tgcgtgcggc 1020 gcttcaatcc ctcgaggctg 1040 <210> 18 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 18 cgagaaagga agggaagaaa gcgaaatcgc tgaggttctc cctgaatcca tg 52 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 19 cagcctcgag ggattgaagc gc 22 <210> 20 <211> 1131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpcR <400> 20 gcgcttcaat ccctcgaggc tgtcgacggt atcttattgc ggatccataa cttcgtataa 60 tgtatgctat acgaagttat ctagataaaa aatttagaag ccaatgaaat ctataaataa 120 actaaattaa gtttatttaa ttaacaacta tggatataaa ataggtacta atcaaaatag 180 tgaggaggat atatttgaat acatacgaac aaattaataa agtgaaaaaa atacttcgga 240 aacatttaaa aaataacctt attggtactt acatgtttgg atcaggagtt gagagtggac 300 taaaaccaaa tagtgatctt gactttttag tcgtcgtatc tgaaccattg acagatcaaa 360 gtaaagaaat acttatacaa aaaattagac ctatttcaaa aaaaatagga gataaaagca 420 acttacgata tattgaatta acaattatta ttcagcaaga aatggtaccg tggaatcatc 480 ctcccaaaca agaatttatt tatggagaat ggttacaaga gctttatgaa caaggataca 540 ttcctcagaa ggaattaaat tcagatttaa ccataatgct ttaccaagca aaacgaaaaa 600 ataaaagaat atacggaaat tatgacttag aggaattact acctgatatt ccattttctg 660 atgtgagaag agccattatg gattcgtcag aggaattaat agataattat caggatgatg 720 aaaccaactc tatattaact ttatgccgta tgattttaac tatggacacg ggtaaaatca 780 taccaaaaga tattgcggga aatgcagtgg ctgaatcttc tccattagaa catagggaga 840 gaattttgtt agcagttcgt agttatcttg gagagaatat tgaatggact aatgaaaatg 900 taaatttaac tataaactat ttaaataaca gattaaaaaa attataaaaa aattgaaaaa 960 atggtggaaa cacttttttc aatttttttg ttttattatt taatatttgg gaaatattca 1020 ttctaattgg taatcagatt ttagaaaaca ataaaccctt gcatatgtct agataacttc 1080 gtataatgta tgctatacga agttatgcgg ccgccatatg catcctaggc c 1131 <210> 21 <211> 981 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 21 aagcttccca gcgcgcatat attctagaag aaatggctgt ccaactaaaa aagaaagcgg 60 aggagagatt cagtcatgat gaatataaag taggccgcat caaactcacg gcaggagaaa 120 aggtagattc agaagaggat attaaaacaa tcagcgtgta tatggccccg tcttctgaaa 180 aaacggtcca aacggtcgcg ccggtccaca ttgatacaga tcatgcatac gtaacaaaag 240 aagcagccga acaaaaagaa gccaaacaga tacaaacgca gctcgcggac atttgggaaa 300 tcggaagtga gaaaattacg gttcatatgg aaggcgggga gagtgtcggc aatgaataaa 360 aacggattat ggaatgtatt gaaaaagcag tttcttccgg gacaaacgaa ggacggcgaa 420 aagccgaagc tgaccaaata tcattacttt ctattcgttt ttgttctcgg agtttccttt 480 atgcttgtca gccagctgtt ttcttcacct gagaaaactg aaaacgccaa aacgataacg 540 gccgtatcat cacaacattc cgcagacagc aaagagaaaa cagccgaagt gtttaaagcc 600 tcaaaatctg ataaacctaa agactcgatc gatgactatg aaaaagaata cgaaaatcaa 660 ctgaaagaaa ttcttgaaac aatcattggt gtggacgatg tctcggttgt cgtgaatgta 720 gatgcaacgt cgctgaaagt atacgaaaaa aacaaatcaa acaaaaatac aaccactgaa 780 gaaactgaca aagaaggcgg aaaaagaagc gttacagacc aatcatcgga ggaagaaatc 840 gtcatgatca aaaacggcga taaagaaaca cctgtcgtcg tccaaacgaa aaaacctgat 900 atacgcggtg tactcgttgt tgctcaagga 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Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Thr Tyr Asp Leu Gly 50 55 60 Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser 65 70 75 80 Glu Leu Ile Ser Ala Val Asn Asn Leu His Ala Lys Gly Ile Ala Val 85 90 95 Tyr Gly Asp Val Val Leu Asn His Arg Met Asn Ala Asp Ala Thr Glu 100 105 110 Leu Val Asp Ala Val Glu Val Asp Pro Asn Asn Arg Tyr Val Glu Thr 115 120 125 Thr Ser Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Gln Tyr Asp Phe Pro Gly 130 135 140 Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Trp Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp 145 150 155 160 Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gly Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Leu 165 170 175 Asp Gly Lys Asp Trp Asp Trp Pro Val Asp Ser Glu Tyr Gly Asn Tyr 180 185 190 Asp Tyr Leu Met Gly Ala Asp Leu Asp Phe Asn His Pro Asp Val Val 195 200 205 Asn Glu Thr Lys Thr Trp Gly Lys Trp Phe Val Asn Thr Val Asn Leu 210 215 220 Asp Gly Val Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Asp Phe Met 225 230 235 240 Arg Asp Trp Val Asn Asn Val Arg Ser Thr Thr Gly Lys Asn Leu Phe 245 250 255 Ala Val Gly Glu Tyr Trp His Tyr Asp Val Asn Lys Leu Asn Ser Tyr 260 265 270 Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu His 275 280 285 Phe Arg Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Gly Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg 290 295 300 Asn Leu Leu Asn Asn Thr Leu Met Ser Ser Asn Pro Met Lys Ala Val 305 310 315 320 Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser 325 330 335 Thr Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu Thr 340 345 350 Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Thr 355 360 365 Ser Asp Gly Lys Ile Ser Ser Tyr Lys Pro Ile Met Asp Lys Leu Leu 370 375 380 Asn Ala Arg Lys Val Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Asp Tyr Phe Asp 385 390 395 400 His Pro Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ala Ala His Ala 405 410 415 Gly Ser Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ser Lys 420 425 430 Trp Met Tyr Val Gly Thr Ser Lys Ala Gly Gln Val Trp Thr Asp Lys 435 440 445 Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asp Ala Asn Gly Trp Gly 450 455 460 Asn Phe Trp Val Asn Lys Gly Ser Val Ser Val Trp Ala Lys 465 470 475 <210> 40 <211> 425 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 40 Leu Thr Ala Pro Ser Ile Lys Ser Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ser Phe Asn Thr Leu Lys His Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala 20 25 30 Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly 35 40 45 Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met Ser Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro 50 55 60 Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe 65 70 75 80 Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala Glu Glu Tyr Gly Ile Lys Val Ile Val 85 90 95 Asp Ala Val Ile Asn His Thr Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asn 100 105 110 Glu Val Lys Ser Ile Pro Asn Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys 115 120 125 Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp Val Thr Gln Asn Ser Leu Leu Gly Leu 130 135 140 Tyr Asp Trp Asn Thr Gln Asn Thr Gln Val Gln Ser Tyr Leu Lys Arg 145 150 155 160 Phe Leu Asp Arg Ala Leu Asn Asp Gly Ala Asp Gly Phe Arg Phe Asp 165 170 175 Ala Ala Lys His Ile Glu Leu Pro Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Gln 180 185 190 Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn Thr Ser Ala Glu Phe Gln Tyr Gly Glu 195 200 205 Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser Arg Asp Ala Ala Tyr Ala Asn Tyr Met 210 215 220 Asp Val Thr Ala Ser Asn Tyr Gly His Ser Ile Arg Ser Ala Leu Lys 225 230 235 240 Asn Arg Asn Leu Gly Val Ser Asn Ile Ser His Tyr Ala Ser Asp Val 245 250 255 Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr Trp Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala 260 265 270 Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr Trp Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu 275 280 285 Gly Trp Ala Val Ile Ala Ser Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe 290 295 300 Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly Asn Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser 305 310 315 320 Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser Ala Leu Phe Glu Asp Gln Ala Ile Thr 325 330 335 Ala Val Asn Arg Phe His Asn Val Met Ala Gly Gln Pro Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn Gln Ile Phe Met Asn Gln Arg Gly Ser 355 360 365 His Gly Val Val Leu Ala Asn Ala Gly Ser Ser Ser Val Ser Ile Asn 370 375 380 Thr Ala Thr Lys Leu Pro Asp Gly Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala 385 390 395 400 Gly Ser Phe Gln Val Asn Asp Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ile Asn Ala 405 410 415 Arg Ser Val Ala Val Leu Tyr Pro Asp 420 425 <210> 41 <211> 470 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 41 Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys 1 5 10 15 Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly 20 25 30 Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp 35 40 45 Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala 50 55 60 Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys 65 70 75 80 Asn Lys Val Lys Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr 85 90 95 Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn 100 105 110 Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly 115 120 125 Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp 130 135 140 Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser 145 150 155 160 Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly 165 170 175 Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp 180 185 190 Ala Asn Val Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln 195 200 205 Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile 210 215 220 Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val 225 230 235 240 Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr 245 250 255 Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser 260 265 270 Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp 275 280 285 Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys 290 295 300 Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro Glu Thr Pro Ser Lys Asp Lys Pro Thr 305 310 315 320 Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met 325 330 335 Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn 340 345 350 Thr Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Lys Ala 355 360 365 Lys Asn Lys Gly Gln Asn Phe Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys 370 375 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Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 43 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 43 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 44 cgcctcatca ttacggcatc 20 <210> 45 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo <400> 45 cgacctgcag gcatgcaagc taccacctta tgtgagtatt gaattgac 48 <210> 46 <211> 29 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 46 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala 20 25

Claims (35)

  1. 비변형(모) 그람 양성 박테리아 세포에 비해 증가된 양의 관심 대상 단백질(POI)을 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포로서, 여기에서 변형 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함하는 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  2. 제1항에 있어서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  3. 제2항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터는 천연 rasP 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 임의의 프로모터로 교체된, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  4. 제2항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터는 spoVG 프로모터 또는 aprE 프로모터로 교체된, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  5. 제4항에 있어서, spoVG 프로모터는 서열번호: 3에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  6. 제4항에 있어서, aprE 프로모터는 서열번호: 4에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  7. 제2항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 5'-비번역 영역(5'-UTR)의 변형인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  8. 제7항에 있어서, 천연 rasP 염색체 5'-UTR은 서열번호: 5의 aprE 5'-UTR에 대하여 95%의 서열 동일성을 포함하는 5'-UTR로 교체된, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  9. 제2항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터 및 천연 5'-UTR 둘 다의 변형인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  10. 제1항에 있어서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 rasP 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  11. 제10항에 있어서, rasP 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 염색체외 플라스미드 내에 포함되는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  12. 제11항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 발현 카세트인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  13. 제11항에 있어서, 염색체외 플라스미드는 통합 플라스미드인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  14. 제13항에 있어서, 플라스미드는 변형 세포의 염색체로 안정적으로 통합되는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  15. 제1항에 있어서, rasP 발현을 증가시키는 유전적 변형은 외인성 rasP 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, 여기에서 ORF는 구성적 프로모터, 유도 가능한 프로모터 또는 조건부 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 그의 제어 하에 있는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  16. 제15항에 있어서, rasP ORF를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드는 염색체외 플라스미드 내에 포함되는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  17. 제1항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 1의 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열에 대하여 적어도 60%의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함하는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  18. 제17항에 있어서, 서열번호: 1의 ORF는 RasP 폴리펩티드를 암호화하는데, 여기에서 RasP 폴리펩티드는 부위-2 프로테아제(S2P) 활성을 갖는 Zn2 + 메탈로프로테아제로서 추가로 정의되는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  19. 제1항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드에 대하여 60%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 RasP 폴리펩티드를 암호화하고, 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 16 내지 26과 정렬되는 서열번호: 6의 활성 부위 공통 서열을 포함하는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  20. 제1항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드에 대하여 80%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 RasP 폴리펩티드를 암호화하고, 서열번호: 2의 RasP 폴리펩티드의 아미노산 잔기 20 내지 24와 정렬되는 서열번호: 7의 활성 부위 공통 서열(HEXXH)을 포함하는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  21. 제1항에 있어서, 비변형(모) 그람 양성 세포에 비해, 생산된 POI의 증가된 양은 적어도 5% 증가인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  22. 제1항에 있어서, 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스(Bacillus) 속의 구성원인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  23. 제1항에 있어서, POI는 변형 박테리아 세포에 대하여 외인성인 유전자 또는 변형 박테리아 세포에 대하여 내인성인 유전자에 의해 암호화되는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  24. 제1항에 있어서, POI는 효소인, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  25. 제24항에 있어서, 효소는 아세틸 에스테라아제, 아릴 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코오스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소오스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소오스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 변형 그람 양성 박테리아 세포.
  26. 제1항의 변형 그람 양성 박테리아 세포에 의해 생산되는 단리된 POI.
  27. 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 얻는 단계(여기에서 변형 박테리아 세포는 rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형을 포함함), 및
    (b) POI가 발현되도록 하는 조건 하에 변형 세포를 배양하는 단계(여기에서 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 박테리아 세포는 비변형(모) 그람 양성 박테리아 세포에서의 동일한 POI의 생산과 비교됨).
  28. 제27항에 있어서, rasP 유전자 발현을 증가시키는 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형인, 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 5'-비번역 영역(5'-UTR)의 변형인, 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 내인성 염색체 rasP 유전자에 대한 변형은 내인성 염색체 rasP 유전자의 천연 프로모터 및 천연 5'-UTR 둘 다의 변형인, 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법.
  31. 제27항에 있어서, rasP 유전자는 서열번호: 1의 오픈 리딩 프레임(ORF) 핵산 서열에 대하여 적어도 60%의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함하는, 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법.
  32. 제27항에 있어서, 비변형(모) 그람 양성 세포에 비해, 생산된 POI의 증가된 양은 적어도 5% 증가인, 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법.
  33. 제27항에 있어서, 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스(Bacillus) 속의 구성원인, 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 생산을 증가시키는 방법.
  34. 제27항의 방법에 의해 생산되는 단리된 POI.
  35. 증가된 양의 POI를 생산하는 변형 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 모 그람 양성 박테리아 세포로 rasP 유전자 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전자 변형을 도입하는 단계, 및
    (b) 증가된 양의 POI를 발현하는 하나 이상의 딸 세포를 선택하는 단계(여기에서 증가된 양의 POI를 생산하기 위해 선택된 하나 이상의 딸 세포는 변형(딸) 그람 양성 박테리아 세포로 정의됨).
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