JP2006508686A - グラム陽性微生物内での増加したタンパク質生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は通常、グラム陽性微生物でのタンパク質発現に関し、具体的には、グラム陽性微生物分泌因子、SecGに関する。本発明はさらにグラム陽性微生物内でのタンパク質生産のための発現ベクター、方法及び系を提供する。
グラム陽性微生物、例えば、バチルス属のメンバーは、ひとつには発酵産物を培地内に分泌する能力のため大規模工業用発酵に用いられてきた。グラム陽性細菌において、分泌タンパク質は細胞膜及び細胞壁を通って輸送され、続いて外部媒体内に放出されて通常、未変性立体構造が得られる。既に同定されているグラム陽性微生物由来の分泌因子はSecA(Sadaie et.al.、Gene 98:101−105[1991])、SecY(Suh et.al.、Mol.Microbiol.,4:305−314[1990]、SecE(Jeong et.al.、Mol.Microbiol.,10:133−142[1993])、FtsY及びFfH(PCT/NL96/00278)及びPrsA(WO94/19471)が挙げられる。
本発明は通常、グラム陽性微生物でのタンパク質発現に関し、具体的には、グラム陽性微生物分泌因子、SecGに関する。本発明はさらにグラム陽性微生物内でのタンパク質生産のための発現ベクター、方法及び系を提供する。
本発明は通常、グラム陽性微生物でのタンパク質発現に関し、具体的には、グラム陽性微生物分泌因子、SecGに関する。本発明はさらにグラム陽性微生物内でのタンパク質生産のための発現ベクター、方法及び系を提供する。
本発明を説明する前に、出願人は以下の定義を用いる。
ここで用いる、バチルス属は当業界に公知の全ての種及び亜種を含み、限定されないが、B.ズブチリス、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ブレビス、B.ステアロサーモフィラス、B.アルカロフィラス、B.アミロリケファシエンス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.lautus及びB.チューリンゲンシスを含む。
本発明は新規なグラム陽性微生物分泌因子を提供し、及びタンパク質分泌及び分泌形態のタンパク質生産に対する障害を改善するためにグラム陽性微生物内で用いることができる方法を提供する。特に、タンパク質が組換え技術により導入され、宿主細胞により過剰発現された場合にかかる障害を改善するために用いることができる方法を提供する。特に好ましい実施態様において、本発明はB.ズブチリス由来分泌因子SecGを提供する。
A. SecG核酸配列
図1に示す配列(配列番号2)を有するSecGポリヌクレオチドはB.ズブチリス分泌因子SecGをエンコードする。大腸菌SecG配列のみを用いたB.ズブチリス翻訳ゲノム配列のFASTAサーチはB.ズブチリスSecGを同定しなかった。B.ズブチリスSecGを、図2に示す大腸菌(配列番号3)、ヘモフィルス(配列番号4)及びマイコプラズマ(配列番号5)種由来の30アミノ酸SecGのコンセンサス配列を用いてバチルス・ズブチリス翻訳ゲノム配列のFASTAサーチにより同定した。使用したコンセンサス配列は“LVGLILLQQG KGAXXGASFG GGASXTLFGS”(配列番号6)であり、アミノ酸末端からカルボキシ末端方向、FASTAサーチ(リリース1.0、1997年6月11日発売)パラメーターはスコアリングマトリックス;GenRunData:blosum50.cmp;変動パラメーターを用い:ギャップクリエーションペナルティ:12;及びギャップ伸張ペナルティ:2。
図1に示すB.ズブチリスsecGポリヌクレオチドはB.ズブチリスSecGをエンコードする。本発明は、図1に示すアミノ酸配列の新規なグラム陽性微生物アミノ酸変異体を包含し、アミノ酸配列変異体がグラム陽性微生物中で単独または他の分泌因子と組み合わせてタンパク質分泌を調節することで機能できる限りにおいて、図1に示す配列と少なくとも80%同一性、少なくとも90%同一性、または少なくとも95%同一性を有する。
本発明は、グラム陽性微生物における所望の異種またはタンパク質の生産及び分泌が高められた発現系を提供する。
本発明において、ベクターはグラム陽性微生物SecG分泌因子をエンコードする核酸のコピーを少なくとも1含み、好ましくは複数のコピーを含む。好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルスである。他の好ましい実施態様において、グラム陽性微生物はバチルス・ズブチリスである。好ましい実施態様において、B.ズブチリスSecGまたはその断片、または融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドまたはSecGのアミノ酸変異体をエンコードするポリヌクレオチド相同体配列は、グラム陽性宿主細胞中でそれぞれ、SecGまたはそのアミノ酸変異体の発現を目的とする組換えDNA分子を生成するために用いることができる。好ましい実施態様において、宿主細胞はバチルス属に属する。他の好ましい実施態様において、宿主細胞はB.ズブチリスである。
グラム陽性微生物中において本発明の分泌因子の発現に用いる発現ベクターは、グラム陽性SecGに関する少なくとも1のプロモーターを含み、当該プロモーターは宿主細胞内で機能する。本発明の1の実施態様において、当該プロモーターは選択した分泌因子の野生型プロモーターであり、本発明の他の実施態様において、当該プロモーターは分泌因子と異種であるが依然として宿主細胞内で機能するものである。
本発明の1の実施態様において、1以上の本発明のグラム陽性分泌因子をエンコードする核酸を宿主細胞内で複製できる発現ベクターによりグラム陽性宿主細胞内に導入する。バチルスの適当な複製プラスミドは公知である(例えば、Harwood and Cutting[編集]、Molecular Biological Methods for Bacillus(バチルスの分子生物学的方法),John Wiley&Sons[1990]を参照;特に、第3章[プラスミドについて(on plasmids)]を参照されたい。B.ズブチリスの適当な複製プラスミドの例が92頁に記載されている)。
マーカー遺伝子発現の存在/不存在により目的遺伝子の存在も示唆されるが、本発明の好ましい実施態様において、その存在及び発現が確認される。例えば、SecGをエンコードする核酸をマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、当該挿入を含む組換え細胞はマーカー遺伝子機能の不存在により同定できる。もしくは、マーカー遺伝子は1のプロモーターの制御下で分泌因子をエンコードする核酸と並行して位置することができる。誘導または選択に応えたマーカー遺伝子の発現は通常、分泌因子の発現も同様に示す。
ここで実施例IVに開示される実施態様において、SecGをエンコードする核酸において阻害を有するB.ズブチリス細胞はいくつかの細胞外タンパク質の分泌において欠陥を有するようである。
異種または同種タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列を用いて形質転換したグラム陽性宿主細胞は、発現及びエンコードされたタンパク質を細胞培養から回収するのに適した条件下で培養できる。本発明の分泌因子を含む組換えグラム陽性宿主細胞により生産されたタンパク質は培養基内で分泌される。その他の組換え構築体は異種または同種ポリヌクレオチド配列を、可溶性タンパク質の精製を促進する、ポリペプチドドメインをエンコードするヌクレオチド配列に結合させることができる(例えば、Kroll et.al.、DNA Cell Biol.、12:441−53[1993]を参照されたい)。
以下の実施例は本発明の特定の好ましい実施態様をさらに示し、説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
実験に使用する物質及び方法は実施例II−VIに記載する。
菌株をルリア栄養(LB)培養液またはルリア寒天培地中で成長させた。必要に応じ、培地は実施例で示すように関連抗生物質を用いて補った。ベクター構築は大腸菌DH5α内で行った(supE44、ΔlacU169(Φ80lacZΔM15)、hsdR17、recA1、endAI、gyrA96、thi−1、relA1)。染色体欠失及び成長実験は当業界で公知のB.ズブチリスDB104(nprE18、aprEΔ3)内で行った(例えば、Yang et.al.、J.Bacteriol.,160:15−21[1984]を参照されたい)。
適当なリボソーム結合部位を含む大腸菌secG及びB.ズブチリスyvaL遺伝子をPCRによりそれぞれDH5α及びDB104株由来の染色体DNAからBamHI−XbaIカセットとして増幅し、pブルースクリプト(pBluescript)SK+内にクローンした。使用したプライマーを表1に記載する。両オープンリーディングフレーム配列を決定し、及び関連データベースと比較した。大腸菌内で発現するため、当該遺伝子をpET324内でクローンし(Van der Does et.al.、Mol.Microbiol.、22:619−629[1996])、pET304(大腸菌secG)及びpET820(B.ズブチリスyvaL)を産出した。
ベクターpDELG2をPvuIIを用いて消化し、クロラムフェニコール耐性マーカーにより置換された、yvaLに隣接する領域を含む2.8kb直鎖断片を生じた。B.ズブチリスDB104を当業界に公知の天然コンピテンスを用いて当該断片と形質転換し(Young、Nature 213:773−775[1967]を参照)、及びクロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。染色体置換の正しい位置をPCRにより確認した。得られた菌株中、DB104ΔG、yvaLが、原型を保って隣接領域を離れる間、クロラムフェニコール耐性遺伝子により置換された。
B.ズブチリスDB104及びDB104ΔGを試験用に構築した6つのプラスミドをそれぞれ用いて形質転換した(すなわち、pPR111、pET470、pET471、pET468、pET472、及びpET473)。形質転換後、プレートを30℃で一晩中培養した。適当な抗菌薬を用いて選択圧力をこの時点から加えた。この段階でクロラムフェニコールは用いなかった。各形質転換体から1のコロニーを採取し、液体培地中、30℃で一晩中培養した。次に、5μlの一晩たった培養物をプレート上で植菌し、野生型株コロニーが直径数ミリメートルに達するまで、15℃〜30℃の温度範囲で培養した。プレートは毎日点検し、コロニーの発生及びサイズを記録した。
プラスミドpET468を用いて形質転換したB.ズブチリスDB104を液体培地中、30℃で一晩中成長させた。培養物を氷上で冷却し、細胞断片と培養基に遠心分離により分画した。もしくは、一晩たった培養物を新しい培養基中で1:50に希釈し、OD600を0.6まで成長させ、15℃で一晩中培養させた。培養上澄液を10%w/v TCAを用いて沈殿し、冷アセトンで2回洗浄し、SDS−PAGEにより分析した。培養物の細胞ペレットをサンプルバッファー中で再懸濁し、超音波分解し、SDS−PAGEにより分析した。細胞断片をさらに分析するために、プロテイナーゼKのアクセシビリティを分析した。形質転換DB104及びDB104ΔGを30℃で一晩中成長させ、遠心分離により集菌した。細胞ペレットをTN(50mM TRIS−C1、pH7.5、100mM NaCl)バッファーを用いて1回洗浄し、0.5mg/mlリゾチームを含む同じバッファー内で再懸濁させた。氷上、15分間の培養後、プロテイナーゼKを0〜2mg/mlの最終濃度で加え、懸濁液をさらに15分間培養した。最終的に、懸濁液をTCAで沈殿させ、アセトンで洗浄し、SDS−PAGEにより分析した。
大腸菌SF100をB.ズブチリスSecY、SecE及び大腸菌(pET812)のSecGまたはB.ズブチリス(pET822)のYvaLを過剰発現させるために用いた。当該タンパク質の発現及び内側と外側(inside out)ベシクルの単離を当業者に公知の通り行った(Van der Does et.al.、[1996]、上記を参照)。
大腸菌SecAを内側と外側(inside out)ベシクルから取り除くために、100μlのベシクル(10mg/ml)を大腸菌SecAに対する50μlのポリクローナル抗体を用いて培養した(Schiebel et.al.、Mol.Microbiol.,22:619−629[1991]を参照)。125I標識his−prcPhoB(Van Wely et.al.、Eur.J.Biochem.,255:690−697[1998])の内膜ベシクル内のin vitro転座を当業者に公知の通り分析し(例えば、Van der Does et.al.、[1996]、上記)、例外として精製B.ズブチリスSecA(Van der Wolk et.al.、Mol.Microbiol.,8:31−42[1993])を大腸菌SecA(0.5μg)の代わりに用いた。
チロシン残基によりKLHに結合した内部YvaL配列Tyr−Ala−Glu−Gln−Leu−Phe−Gly−Lys−Gln−Lys−Ala−Arg−Gly−Leu−Asp(配列番号19)に対するペプチドポリクローナル抗体をNeosystemから公表されている標準手順に従ってウサギ内で生産した。
B.ズブチリスSecGは大腸菌SecGの機能的相同体である
この実施例はB.ズブチリスSecGが大腸菌SecGの機能的相同体であるかどうかを測定するための実験について説明する。pET812及びpET822を発現する細胞由来の膜ベシクルからSecAに対するポリクローナル抗体を用いて固有大腸菌SecAを取り出し、125I−標識his−prePhoBを用いたin vitro転座分析に供した。図8に転座結果を示す。B.ズブチリスSecAを加えない場合、SecYEGまたはSecYE及びYVALを含む両ベシクルは背景転座をほとんど示さなかった。しかしながら、B.ズブチリスSecAをSecYE及びYVALを含むベシクルに加えた場合、125I−prePhoBの転座効率の非常に大きい増加が観測され、一方、SecYE及び大腸菌SecGを含むベシクルでは余分な転座は観測されなかった。これらのデータから、B.ズブチリスSecYEはB.ズブチリスYval及びSecAと一緒にin vitroでバチルスprePhoBタンパク質の転座を仲介する機能的プレタンパク質トランスロカーゼを形成すると結論付けることができる。
大腸菌内でのバチルスタンパク質の過剰発現
この実施例はB.ズブチリスSecY、SecE及びSecG(YVAL)タンパク質が大腸菌内で過剰発現できることを示す。pET812及びpET822が大腸菌SF100内で発現するかどうかを確証するために、内側と外側(inside out)ベシクルを15% SDS−PAGE上で分析した。B.ズブチリスのSecY及びSecEの両方はクマシー染色ゲル上で容易に視認できた(図7Aを参照)。B.ズブチリスSecG及び増加した大腸菌SecG量がこれらのタンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロット上で検出でき、図7B−7Cに示す。
タンパク質分泌
この実施例は野生型細胞とB.ズブチリスSecG内に欠失を有する細胞のタンパク質分泌におけるタンパク質分泌機構の関連を示す。様々な温度で成長させた細胞の培養上澄中、野生型と変異細胞間で違いは見られなかった(図6Aを参照)。細胞断片はバンドパターンにいくつかの違いを示した。この違いは主に変異体でいくつかのバンドが欠如しているというものである。これらタンパク質の局在性はリゾチームによる細胞壁の崩壊及びその後の接近可能な(accessible)タンパク質のプロテアーゼ消化により決定した(図6B)。いくつかのタンパク質バンドは低濃度プロテイナーゼKにより既に消化され、一方、その他のほとんどのタンパク質の崩壊はTriton X−100による細胞膜崩壊後にのみ起こる。これらのタンパク質が分泌されるようである。いくつかのこれら分泌タンパク質は変異株には存在しない。従って、B.ズブチリスSecGが崩壊した変異体はいくつかの細胞外タンパク質の分泌に欠陥があると考えられる。
SecG欠失の効果
この実施例はSecG欠失の細胞成長における効果を示す。大腸菌secG遺伝子の破壊は低温感受性表現型(Nishiyama et.al.、EMBO J.、13:3272−3277[1994]を参照)における、25℃以下の非許容状態温度での結果に示されている。染色体のB.ズブチリスsecGの欠失は細胞をリッチまたは最小培地上、37℃で成長させた場合、いかなる表現型も生じない。20℃以下の培養は軽い低温感受性を示し、DB104ΔG株はDB104と比較して徐々に遅くなる成長を示した。しかしながら、変異株は完全に成長停止することはなかった。野生型と比較すると、温度をさらに下げた場合、成長はさらに大幅に遅れた。細胞を再度高温に移すと、より速い速度で成長を再開した。
発現効果
この実施例は分泌タンパク質の発現効果について説明する。secGのB.ズブチリス細胞変異体及び野生型細胞をプラスミドpET468及び誘導体を用いて形質転換した。これらのプラスミドはα−アミラーゼを発現し、それにより分泌ストレスを誘発する。pET472及びpET473の誘導体はそれぞれ大腸菌SecGまたはB.ズブチリスSecGと一緒にα−アミラーゼを発現する。α−アミラーゼの発現によっては、細胞をプレ培養するために用いる温度である30℃で欠失変異体の成長は遅延しなかった。この温度で、野生型及び欠失変異体の形質転換体によりでんぷん含有プレート上のα−アミラーゼにより形成されるハロは同じ大きさであった。欠失変異体のpET468形質転換体を低温に移した場合、明確かつ完全な低温感受性を示した。既に20℃で細胞成長が完全に停止した。細胞を許容温度の30℃に変換して戻した場合、20℃で培養延長後、成長は再開しなかった。従って、欠失変異体は低温であっても分泌の基準レベルを維持できるが、広温度範囲にわたって分泌タンパク質の過剰発現を操作することはできない。
SecGタンパク質の同定
この実施例はグラム陽性微生物内のSecGの検出について説明する。グラム陽性微生物由来DNAは当業界に公知の通り調製する(Current Protocols in Molecular Biology、第2章または3章に開示の方法に従う)。当該核酸はSecG由来プローブまたはプライマーを用いてハイブリダイゼーション及び/またはPCR増幅にかける。好ましいプローブは保存アミノ酸配列を含む核酸部分を含む。
変異SecGプロモーターを含むB.ズブチリス宿主細胞の構築
上述及びここに詳細に記載するように、secGプロモーターの変性後に生じるSecGタンパク質レベルは、染色体プロモーターまたはリボソーム結合部位をRNAポリメラーゼσ因子A(σA)コンセンサス配列にさらに適合するようにまたは適合しないように変化させることにより調節して、転写に影響を与えることができ、またはコンセンサスシャイン・ダルガーノ配列にさらに適合するようにまたは適合しないように変化させることにより調節して翻訳に影響を与えることができる。
ここに示すように、シャイン・ダルガーノ部位を変異させるため、当該配列は天然配列AGTCTGGAGGTGT(配列番号21)をAGAAAGGAGGTGA(配列番号22)に変化させてコンセンサスに正確に適合するように変異させる。以下の説明はシャイン・ダルガーノ部位の変異に適した方法を提供する。
BC4 PCR融合は3工程で構築する:1)2つの分離断片をB.ズブチリス168染色体DNAからPCRにより増幅;2)プライマーを用いずに、PCR型プロセスにおいて2つの精製PCR断片を集積;及び3)BCBS−1及びBCBS−8末端プライマーを用いて、PCRにより集積生成物を増幅させる。
3.3×XLバッファーII ― 30μl
10mM dNTPブレンド ― 3μl
25mM Mg(OAc)2 ― 4μl
25uM BCBS−1プライマー(BCBS−3) ― 2μl
25uM BCBS−2fプライマー(またはBCBS−2r) ― 2μl
2U/ul rTthポリメラーゼ ― 2μl
水 ― 100μlに調整
PCR条件は:95℃―30秒、54℃―30秒、68℃―3分を30サイクルである。得られたPCR断片は、各3kbであり、取扱説明書に従ってQIAGEN PCR精製キットで精製し、PCR集積物に用いる。
ここに示すように、σAプロモーター部位を変異するために、天然配列GTGACATGCCAACCCTTTTCATGTAAAAT(配列番号25)をTTGACATGCCAACCCTTTTCATGTATAAT(配列番号26)に変化させて、コンセンサスに正確に適合するように当該配列を変異させる。ここで配列番号26の最初の6ヌクレオチド(TTGACA)はコンセンサス−35プロモーター配列であり、配列番号26の最後の6ヌクレオチド(TATAAT)はコンセンサス−10プロモーター配列である。
Claims (27)
- 分泌因子G(SecG)を含む転写物の翻訳を調節する変異シャイン・ダルガーノ配列をエンコードするグラム陽性微生物。
- 前記グラム陽性微生物がバチルス属の1種である、請求項1のグラム陽性微生物。
- 前記バチルスが、B.ズブチリス、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ブレビス、B.ステアロサーモフィラス、B.アルカロフィラス、B.アミロリケファシエンス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.lautus及びB.チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項2のグラム陽性微生物。
- 前記調節が前記SecGの発現の増加を含む、請求項1のグラム陽性微生物。
- 前記調節が前記SecGの発現の減少を含む、請求項1のグラム陽性微生物。
- 前記微生物が少なくとも1の異種タンパク質を発現できる、請求項1のグラム陽性微生物。
- 前記異種タンパク質がホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される、請求項6のグラム陽性微生物。
- 前記異種タンパク質が酵素である、請求項7のグラム陽性微生物。
- 前記酵素がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される、請求項8のグラム陽性微生物。
- 分泌因子G(SecG)の発現を調節する変異RNAポリメラーゼσ因子アルファ(σA)配列をエンコードするグラム陽性微生物。
- 前記グラム陽性微生物がバチルスである、請求項10のグラム陽性微生物。
- 前記バチルスが、B.ズブチリス、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ブレビス、B.ステアロサーモフィラス、B.アルカロフィラス、B.アミロリケファシエンス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.lautus及びB.チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項11のグラム陽性微生物。
- 前記調節が前記SecGの発現の増加を含む、請求項10のグラム陽性微生物。
- 前記調節が前記SecGの発現の減少を含む、請求項10のグラム陽性微生物。
- 前記微生物が少なくとも1の異種タンパク質を発現できる、請求項10のグラム陽性微生物。
- 前記異種タンパク質がホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される、請求項15のグラム陽性微生物。
- 前記異種タンパク質が酵素である、請求項16のグラム陽性微生物。
- 前記酵素がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される、請求項17のグラム陽性微生物。
- グラム陽性微生物における改善されたタンパク質の分泌方法であって、SecGをエンコードする核酸を含むグラム陽性微生物宿主細胞を得る工程を含み、ここで前記核酸はグラム陽性微生物内でSecGを発現できる発現シグナルにより制御され、さらに当該グラム陽性微生物宿主細胞は前記タンパク質をエンコードする核酸を含み;及びSecG発現及び前記タンパク質の発現及び分泌に適した条件下で前記微生物を培養する工程を含む、方法。
- 前記グラム陽性微生物がさらに、SecY、SecE及びSecAからなる群より選択される少なくとも1の他の分泌因子をエンコードする核酸を含む、請求項19の方法。
- 前記タンパク質が前記宿主細胞と同種である、請求項19の方法。
- 前記タンパク質が前記宿主細胞と異種である、請求項19の方法。
- 前記グラム陽性微生物がバチルス属の1種である、請求項19の方法。
- 前記バチルスが、B.ズブチリス、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ブレビス、B.ステアロサーモフィラス、B.アルカロフィラス、B.アミロリケファシエンス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.lautus及びB.チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項23の方法。
- 前記異種タンパク質がホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群より選択される、請求項19の方法。
- 前記異種タンパク質が酵素である、請求項25の方法。
- 前記酵素がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、ムターゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される、請求項26の方法。
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