KR20230042088A - 알라닌 라세마아제 단일 결실 및 트랜스 보완 - Google Patents

알라닌 라세마아제 단일 결실 및 트랜스 보완 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염색체 alr 유전자가 불활성화된 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) 종에 속하는 바실러스 (Bacillus) 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 박테리아 숙주 세포는 적어도 하나의 자율 복제 서열, 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 박테리아 숙주 세포의 배양을 기반으로 하는 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

알라닌 라세마아제 단일 결실 및 트랜스 보완
본 발명은 염색체 alr 유전자가 불활성화된 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) 종에 속하는 바실러스 (Bacillus) 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 박테리아 숙주 세포는 적어도 하나의 자율 복제 서열, 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 박테리아 숙주 세포의 배양을 기반으로 하는 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
유전자 조작 기술의 진보는 이종성 단백질의 생산자로서 미생물 세포의 개선을 허용하였다. 단백질 생산은 전형적으로 대량의 재조합 단백질을 발현하도록 미생물에서 유전자 발현의 조작을 통해 달성된다.
바실러스 (Bacillus) 속의 미생물은 가치있는 화합물, 예를 들어, 화학물, 중합체, 단백질, 및 특히 세척- 및/또는 세정-활성 효소와 같은 단백질의 생산을 위한 산업적 일꾼으로서 널리 적용된다. 이들 유용한 물질의 생물공학적 생산은 발효 및 생산물의 후속 정제를 통해 수행된다. 바실러스 종은 발효 액체배지로 상당한 양의 단백질을 분비할 수 있다. 이것은 세포내 생산과 비교하여 단순한 생산물 정제 과정을 가능하게 하고 산업적 적용에서 리체니포르미스 (B. licheniformis) 또는 B. 푸밀루스 (B. pumilus) 와 같은 바실러스 숙주 세포의 성공을 설명한다 (예를 들어 Kuppers et al., Microb Cell Fact. 2014;13(1):46, 또는 Schallmey et al., Can J Microbiol. 2004;50(1):1-17 참조).
재조합 생산 숙주에 의한 화합물의 고수준 생산을 위해서, 안정한 발현 시스템이 필수적이다. 재조합 생산 숙주는 더 높은 수준으로 관심 화합물을 생산하도록 천연 야생형 숙주와 비교하여 유전자 변형된다. 그러나, 재조합 생산 숙주는 야생형 숙주에 비해서 낮은 적합도의 단점을 가져, 발효 과정에서 야생형 세포의 과성장 및 생산물 수율의 손실을 초래한다.
자율 복제 플라스미드는 숙주 게놈과 독립적으로 복제되는 원형 DNA 플라스미드이다. 플라스미드는 관심 화합물의 생산을 위해 생물공학적 적용분야에서 수십여년 동안 원핵생물 및 진핵생물에서 사용되어 왔다.
일부 자연 발생 플라스미드와 달리, 대부분의 재조합 플라스미드는 특히 관심 화합물의 생산이 세포의 적합도에 대한 단점을 나타낼 때, 박테리아에서 다소 불안정하다. 게다가, 플라스미드의 안정한 유지는 박테리아 숙주에 대한 물질대사적 부담이다.
플라스미드 및 그에 따라 재조합 숙주의 생산성을 유지하기 위한 다수의 접근법이 시도되어 왔다. 예를 들어, 항생제 내성 마커 및 영양요구성 내성 마커에 의해 부여되는 양성 선택을 사용하여 만족할만한 수준으로 생산 수율을 유지시켰다.
플라스미드 상에 항생제 내성 마커의 사용 및 배지에 항생제의 보충이 발효 과정에서 양성 선택으로서 널리 사용되고 있다. 그러나, 관심 화합물의 강력한 생산 조건 하에서, 세포 개체군 내 플라스미드의 상실이 관찰되었는데 플라스미드 선택에 사용되는 항생제의 농도가 종종 희석 및/또는 효소 분해의 결과로서 장기간 배양 동안 감소되기 때문이다. 게다가, 최종 생산물 및 폐수 중에 항생제의 존재는 일반적으로 허용되지 않으므로, 추가 정제가 요구된다.
영양요구성 마커, 예를 들어, 아미노산 생합성 경로의 효소는 또한 상응하는 유전자에 결함이 있는 숙주 세포와 발효 과정 동안 순수 및 한정 배지가 사용될 때 플라스미드 상의 양성 선택에 사용될 수 있다. 다수-카피 플라스미드에 영양요구성 마커를 제공하는 것은 효소 기능이 야생형 숙주와 비교하여 세포 생리와 균형을 이루지 못하기 때문에 세포 성장 및 세포 생산성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 뿐만 아니라, 발효 과정 동안 세포 용해는 영양요구성 마커에 의해 만들어진 화합물의 교차-공급을 초래하여, 시스템이 플라스미드 유지에 덜 효과적이게 만든다.
EP 3 083 965 A1 은 필수, 세포질 유전자 frr (리보솜 재활용 인자) 의 염색체 카피를 결실시키고 그것을 플라스미드에 위치시킴에 의한 숙주 세포에서 플라스미드 안정성의 생성 및/또는 항생제 내성의 결실을 위한 방법을 개시한다. 그 결과, 오직 플라스미드-보유 세포만이 성장할 수 있어, 숙주 세포가 플라스미드에 전적으로 의존하게 만든다. 게다가, 영양요구성 마커에 대해 설명된 바와 같은 교차-공급 효과는 전체 단백질이 세포 내로 유입될 수 없으므로 존재하지 않는다.
재조합 숙주 세포 구축의 단점은 염색체 유전자의 결실이 플라스미드 상에 적어도 하나의 유전자 카피의 존재 하에서만 만들어질 수 있다는 것이다. 또 다른 플라스미드, 예를 들어, 생산하고자 하는 상이한 관심 유전자가 제 1 플라스미드와 상이한 플라스미드로의 이러한 플라스미드의 교체는 지루하고, 제 1 플라스미드의 효율적인 제거를 위해 역선택 마커를 필요로 할 수 있다.
단백질 생산을 위한 대안적인 접근법으로서, 효소 알라닌 라세마아제는 원핵생물에서 플라스미드 유지에 사용되었다. 알라닌 라세마아제 (EC 5.1.1.1) 는 L-알라닌을 D-알라닌으로 전환시키는 고유한 원핵생물 효소이다 (Wasserman,S.A., E.Daub, P.Grisafi, D.Botstein, and C.T.Walsh. 1984. Catabolic alanine racemase from Salmonella typhimurium: DNA sequence, enzyme purification, and characterization. Biochemistry 23: 5182-5187). D-알라닌은 세포벽의 기본 성분을 형성하는 펩티도글리칸 층의 필수 성분이다 (Watanabe,A., T.Yoshimura, B.Mikami, H.Hayashi, H.Kagamiyama, and N.Esaki. 2002. Reaction mechanism of alanine racemase from Bacillus stearothermophilus: x-ray crystallographic studies of the enzyme bound with N-(5'-phosphopyridoxyl)alanine. J. Biol. Chem. 277: 19166-19172).
Ferrari et al. (Ferrari,E. 1985. Isolation of an alanine racemase gene from Bacillus subtilis and its use for plasmid maintenance in B. subtilis. Biotechnology 3:1003-1007) 은 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 에서 결실시 신속한 세포 사멸을 초래하는 B. 서브틸리스의 D-알라닌 라세마아제 유전자 dal (alr 유전자라로도 지칭함) 을 단리하였고, B. 서브틸리스에서 복제성 플라스미드에 위치할 때 선택 마커로서 dal 유전자의 유효성을 보여주었다.
락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 의 alr 유전자를 동정하였고 알라닌 라세마아제로서 이의 기능성은 이의 2 개 알라닌 라세마아제 유전자 alr 및 dadX 에 결함이 있는 대장균 (E. coli) 의 성장 결함의 보완에 의해 증명되었다 (P Hols, C Defrenne, T Ferain, S Derzelle, B Delplace, J Delcour Journal of Bacteriology Jun 1997, 179 (11) 3804-3807).
Ferrari et al. 의 작업과 유사하게, 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 및 락토바실러스 플라타룸 (Lactobacillus plantarum) 유래 락트산 박테리아의 알라닌 라세마아제 유전자 (alr) 를 게놈에서 결실시켰고 플라스미드에 트랜스로 위치시켜, 200 세대 동안 안정한 플라스미드 유지를 초래하고 식품 등급 선택 마커로서 적용을 위해 상동성 alr 유전자의 사용을 보여주었다 (Bron,P.A., M.G.Benchimol, J.Lambert, E.Palumbo, M.Deghorain, J.Delcour, W.M.de Vos, M.Kleerebezem, and P.Hols. 2002. Use of the alr gene as a food-grade selection marker in lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 68: 5663-5670.; Ferrari, 1985).
WO 2015/055558 은 dal 유전자가 불활성화된 B. 서브틸리스 숙주 세포에서 플라스미드 유지를 위해 바실러스 서브틸리스 dal 유전자의 사용을 기재하고 있다. 플라스미드 상에서 dal 유전자의 발현 수준은 비변경된 RBS 와 비교하여 더 낮은 수준으로 리보솜 결합 위치 RBS 를 돌연변이시킴으로써 감소되었다. 그리하여, 플라스미드 카피수는 고카피수로 유지될 수 있었고 아밀라아제 생산 수율을 증가시킬 수 있었다.
많은 그람-음성 유기체, 예컨대 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 과 달리, 조사된 대부분의 그람-양성 박테리아 예컨대 바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 락토바실러스 플라타룸 (Lactobacillus plantarum), 및 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 은 오직 하나의 알라닌 라세마아제 유전자를 갖는 것으로 보인다 (Pierce,K.J., S.P.Salifu, and M.Tangney. 2008. Gene cloning and characterization of a second alanine racemase from Bacillus subtilis encoded by yncD. FEMS Microbiol. Lett. 283: 69-74). 바실러스 서브틸리스의 경우, 제 2 알라닌 라세마아제 유전자, 즉 yncD 가 동정되었고 대장균의 D-알라닌 영양요구성 균주에서 플라스미드에 위치된 yncD 유전자로의 보완이 나타났다 (Pierce et al., 2008). 유사하게, 제 2 알라닌 라세마아제 유전자 alr2 (B. 서브틸리스 yncD 유전자와 상동성) 가 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 에서 발견되었고, lac 프로모터의 제어 하에 플라스미드로부터 발현될 때 2 개 알라닌 라세마아제 유전자 alr 및 dadX 에 결함이 있는 대장균의 D-알라닌 영양요구성 표현형을 보완할 수 있는 것으로 나타났다 (Salifu,S.P., K.J.Pierce, and M.Tangney. 2008. Cloning and analysis of two alanine racemase genes from Bacillus licheniformis. Anals of Microbiology 58: 287-291).
최근 연구 (Munch,K.M., J.Muller, S.Wienecke, S.Bergmann, S.Heyber, R.Biedendieck, R.Munch, and D.Jahn. 2015. Polar Fixation of Plasmids during Recombinant Protein Production in Bacillus megaterium Results in Population Heterogeneity. Appl. Environ. Microbiol. 81: 5976-5986) 는 배양 동안 재조합 숙주의 생산성에 대한 세포 이종성의 효과를 기재하고 있다. 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 및 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 에서 이종성 단백질 생산으로 예시된 생산성의 손실은 단순한 플라스미드 상실에 의한 것이 아니라, 세포 분열 동안 플라스미드의 비대칭적 분포에 의해 야기되어, 적은 개체군의 소위 '고-생산자' 및 대량 개체군의 '저-생산자' 를 초래하였다.
따라서, 전체적으로 증강된 화합물 생산을 이끌어내는 안정한 플라스미드-숙주 시스템에 대한 필요성이 남아 있다.
발명의 개요
바실러스 숙주 세포에서 내인성 염색체 alr 유전자의 불활성화 및 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드의 도입은 대조군 세포와 비교하여 관심 폴리펩티드의 발현을 증가시킨다는 것이 본 발명에 기초되는 연구에서 발견되었다. 구체적으로, B. 서브틸리스 alrA 유전자를 내인성 alr 유전자가 불활성화된 B. 리체니포르미스 종에 속하는 숙주 세포에 도입하였다. B. 푸밀루스, B. 리체니포르미스는 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 2 개의 내인성 유전자: alr 및 yncD 를 포함한다. 흥미롭게도, yncD 유전자가 불활성화된 경우와 비교하여 alr 유전자가 불활성화된 경우에 발현 증진 효과가 더 표명되었다 (실시예 2 참조).
따라서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이다:
a) 염색체 alr 유전자가 불활성화되고 하기를 포함하는 플라스미드를 포함하는, 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) 종에 속하는 바실러스 숙주 세포를 제공하는 단계:
1. 적어도 하나의 자율 복제 서열,
2. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및
3. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드, 및
b) 상기 숙주 세포 내에 상기 플라스미드를 유지시키는데 도움이 되고 상기 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 발현시키는데 도움이 되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하여, 이로써 상기 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 생산하는 단계.
본 발명의 방법의 한 구현예에서, 단계 a) 는 하기 단계를 포함한다:
a1) 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 푸밀루스 종에 속하는 바실러스 숙주 세포를 제공하는 단계,
a2) 상기 숙주 세포의 염색체 alr 유전자를 불활성화시키는 단계, 및
a3) 상기 숙주 세포에 하기를 포함하는 플라스미드를 도입하는 단계:
1. 적어도 하나의 자율 복제 서열,
2. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및
3. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 방법의 한 구현예에서, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드는 박테리아 숙주 세포에 의해 발효 액체배지 내로 분비된다.
본 발명의 방법의 한 구현예에서, 방법은 단계 (b) 후에 수득된 박테리아 숙주 세포 배양물로부터 관심 폴리펩티드를 수득하는 단계, 및/또는 관심 폴리펩티드를 정제하는 추가 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 염색체 alr 유전자가 불활성화된 박테리아 숙주 세포에 관한 것으로서, 상기 박테리아 숙주 세포는 하기를 포함하는 플라스미드를 포함한다
1. 적어도 하나의 자율 복제 서열,
2. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및
3. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 박테리아 숙주 세포의 한 구현예에서, 박테리아 숙주 세포는 상기 나타낸 바와 같은 단계 a1), a2) 및 a3) 을 실행하여 수득되거나 수득가능하다.
본 발명의 방법 또는 숙주 세포의 한 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스의 종에 속한다. 예를 들어, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 ATCC14580 (DSM13) 숙주 세포이다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 인식 서열 GCNGC 를 갖는 제한 변형 시스템을 인코딩하는 바실러스 리체니포르미스 종에 속한다.
본 발명의 방법 또는 숙주 세포의 대안적 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 푸밀루스의 종에 속한다.
한 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 SEQ ID NO: 4 에 대해 적어도 75% 서열 동일성을 갖는다.
한 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 SEQ ID NO: 4 에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다.
한 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 SEQ ID NO: 4 에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 95.5%, 적어도 96%, 적어도 96.5%, 적어도 97%, 적어도 97.5%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99% 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 방법 또는 박테리아 숙주 세포의 한 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되는 프로모터는, B. 서브틸리스 alrA 유전자의 프로모터, 또는 상기 프로모터에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다. 바람직하게는, B. 서브틸리스 alrA 유전자의 프로모터는 SEQ ID NO: 46 에서 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
본 발명의 방법 또는 박테리아 숙주 세포의 한 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 효소이다. 예를 들어, 효소는 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 만난아제, 피타아제, 자일라나아제, 포스파타아제, 글루코아밀라아제, 뉴클레아제 및 셀룰라아제로 이루어지는 군에서 선택되는 효소일 수 있다.
본 발명의 방법 또는 박테리아 숙주 세포의 한 구현예에서, 효소는 아미노펩티다아제 (EC 3.4.11), 디펩티다아제 (EC 3.4.13), 디펩티딜-펩티다아제 또는 트리펩티딜-펩티다아제 (EC 3.4.14), 펩티딜-디펩티다아제 (EC 3.4.15), 세린-유형 카르복시펩티다아제 (EC 3.4.16), 메탈로카르복시펩티다아제 (EC 3.4.17), 시스테인-유형 카르복시펩티다아제 (EC 3.4.18), 오메가 펩티다아제 (EC 3.4.19), 세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21), 시스테인 엔도펩티다아제 (EC 3.4.22), 아스파르틱 엔도펩티다아제 (EC 3.4.23), 메탈로-엔도펩티다아제 (EC 3.4.24) 또는 트레오닌 엔도펩티다아제 (EC 3.4.25) 와 같은 프로테아제이다.
본 발명은 또한 본 발명의 박테리아 숙주 세포를 포함하는 발효 액체 배지에 관한 것이다.
도 1: 내인성 알라닌 라세마아제 유전자 (alr 및 ycnD)의 존재 (+) 또는 부재 (-) 하에 B. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 에서 실시예 2 에 기재된 바와 같은 유가식 발효에서 프로테아제 수율의 분석. 프로테아제 수율은 내인성 유전자 모두를 포함하는 B. 리체니포르미스 (BES#158) 에서의 프로테아제 수율에 대해 정규화되었다. 균주 BES#158 의 프로테아제 수율은 100% 로 설정되었다.
발명의 상세한 설명
명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은, 단수형 표현은 이것이 사용되는 문맥에 따라서, 하나 이상을 의미할 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서 예를 들어, "세포" 에 대한 언급은 적어도 하나의 세포가 이용될 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "적어도 하나" 는 용어 뒤에 언급된 항목 중 하나 이상이 본 발명에 따라서 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 용어가 적어도 하나의 공급 용액이 사용되어야 한다는 것을 의미하는 경우, 이는 하나의 공급 용액 또는 하나 초과의 공급 용액, 즉, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 임의의 다른 개수의 공급 용액으로서 이해될 수 있다. 항목에 따라, 용어는 존재시, 그 용어가 참조할 수 있는 상한치에 관하여 당업자가 이해한다는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약" 은 상기 용어 뒤에 인용되는 임의의 수와 관련하여 기술적 효과가 달성될 수 있는 간격 정확도가 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 나타내는 바와 같은 '약' 은 바람직하게는, ±20%, 바람직하게는 ±15%, 보다 바람직하게는 ±10%, 보다 더 바람직하게는 ±5% 의 정확한 수치 또는 상기 정확한 수치 근처 범위를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "포함하는" 은 제한적인 의미로 이해되어서는 안 된다. 그보다 이 용어는 언급된 실제 항목 이상이 존재할 수 있다는 것을 의미하고, 예를 들어, 특정 단계를 포함하는 방법을 언급하는 경우, 추가 단계의 존재를 배제해서는 안 된다. 그러나, 용어 "포함하는" 은 또한 언급된 항목만이 존재하는 구현예를 포함하고, 즉, "~로 이루어지는" 의 의미에서 제한적인 의미를 갖는다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 생산하는 위한 방법을 제공한다. 방법은 실험실 및 산업적 규모 발효 과정 모두에서 박테리아 숙주 세포를 배양하기 위해 적용될 수 있다. 방법은 a) 상기 정의된 바와 같은 박테리아 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 b) 상기 박테리아 숙주 세포에서 상기 플라스미드를 유지하는데 도움이 되고 상기 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 발현시키는데 도움이 되는 조건 하에 박테리아 숙주 세포를 배양하여, 이로써 상기 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 또한 추가 단계를 포함할 수 있다. 이러한 추가 단계는 배양의 종결 및/또는 적절한 정제 기법에 의한 숙주 세포 배양물로부터의 관심 단백질의 수득을 포괄할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 단계 (b) 이후에 수득된 박테리아 숙주 세포 배양물로부터 관심 폴리펩티드를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 방법은 관심 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "알라닌 라세마아제" 는 아미노산 알라닌의 L-이성질체를 이의 D-이성질체로 전환시키는 효소를 지칭한다. 따라서, 알라닌 라세마아제는 L-알라닌을 D-알라닌으로 전환시킨다. 알라닌 라세마아제는 국제 생화학 및 분자 생물학 연맹 (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) 의 명명법에 따라서 EC 5.1.1.1 로서 기재된 활성을 가져야 한다 (Recommendations (1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology including its supplements published (1993-1999) 참조). 폴리펩티드가 알라닌 라세마아제 활성을 갖는지 여부는 널리 공지된 알라닌 라세마아제 어세이에 의해 평가될 수 있다. 한 구현예에서, 실시예 부분에 기재된 바와 같이 평가된다 (실시예 3 참조).
본 발명에 따르면, 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 하나의 염색체 alr 유전자는 박테리아 숙주 세포에서 불활성화되어있어야 한다. 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 푸밀루스 종에 속하는 숙주 세포는 자연적으로 2 개의 상이한 알라닌 라세마아제, Alr 및 YncD 를 인코딩하는 2 개 염색체 유전자를 포함한다. 그러나, Alr 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 염색체 alr 유전자만이 숙주 세포에서 불활성화되어있어야 한다. 즉, YncD 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 염색체 yncD 유전자는 숙주 세포에서 불활성화되어있지 않아야 한다.
따라서, 본 발명의 방법의 단계 a) 에서 제공된 박테리아 숙주 세포는 하기 단계에 의해 수득되거나 수득가능하다:
a1) 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 푸밀루스 종에 속하는 바실러스 숙주 세포를 제공하는 단계,
a2) 상기 숙주 세포의 염색체 alr 유전자를 불활성화시키는 단계, 및
a3) 상기 숙주 세포에 하기를 포함하는 플라스미드를 도입하는 단계:
1. 적어도 하나의 자율 복제 서열,
2. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및
3. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드.
따라서, 본 발명의 방법의 단계 a) 는 상기 단계 a1), a2) 및 a3) 을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "숙주 세포" 는 박테리아 세포를 지칭한다.
한 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 종, 예컨대 미국 생물자원 센터 (American Type Culture Collection) 번호 ATCC14580 (DSM13 과 동일, Veith et al. "The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential." J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2004) 7:204-211 참조) 로서 기탁된 바실러스 리체니포르미스 균주의 숙주 세포에 속한다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 ATCC31972 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 ATCC53757 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 ATCC53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 ATCC55768 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 DSM394 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 DSM641 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 DSM1913 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 DSM11259 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스 균주 DSM26543 의 숙주 세포일 수 있다.
바람직하게는, 바실러스 리체니포르미스 균주는 바실러스 리체니포르미스 ATCC 14580, ATCC 31972, ATCC 53757, ATCC 53926, ATCC 55768, DSM 13, DSM 394, DSM 641, DSM 1913, DSM 11259 및 DSM 26543 으로 이루어지는 군에서 선택된다.
또한, 본원에서 나타낸 바와 같은 숙주 세포는 인식 서열 GCNGC 를 갖는 제한 변형 시스템을 인코딩하는 바실러스 리체니포르미스 종에 속한다는 것을 고려한다.
바실러스 리체니포르미스 alr 유전자의 코딩 서열을 SEQ ID NO: 1 에 나타낸다. 상기 유전자에 의해 인코딩된 알라닌 라세마아제 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
대안적 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 푸밀루스 속에 속한다 (예를 들어 Kuppers et al., Microb Cell Fact. 2014;13(1):46, 또는 Schallmey et al., Can J Microbiol. 2004;50(1):1-17 참조). 바실러스 푸밀루스에 관하여, 불활성화되는 Alr 알라닌 라세마아제는 바람직하게는, SEQ ID NO: 47 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
염색체 alr 유전자와 관련하여 용어 "불활성화" 는 바람직하게는, 각각 상기 염색체 alr 유전자에 의해 인코딩되는 Alr 알라닌 라세마아제의 효소 활성이 대조군 세포에서의 Alr 알라닌 라세마아제 활성과 비교하여 감소되었다는 것을 의미한다. 대조군 세포는 염색체 alr 유전자가 불활성화되지 않은 상응하는 숙주 세포, 즉 상기 염색체 alr 유전자를 포함하는 상응하는 숙주 세포이다. 바람직하게는, 본 발명의 박테리아 숙주 세포에서 Alr 알라닌 라세마아제의 효소 활성은 대조군 세포에서 Alr 의 상응하는 효소 활성과 비교하여 적어도 40% 예컨대 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소되었다. 보다 바람직하게는, 상기 효소 활성은 적어도 95% 감소되었다. 가장 바람직하게는, 상기 효소 활성은 100% 감소되며, 즉, 완전히 제거되었다.
본원에서 나타낸 바와 같은 alr 유전자의 불활성화는 적절한 것으로 간주되는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 한 구현예에서, Alr 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 염색체 alr 유전자는 돌연변이에 의해, 즉 상기 염색체 유전자를 돌연변이시킴으로써 불활성화되었다. 바람직하게는, 상기 돌연변이는 결실이고, 즉 상기 염색체 alr 유전자가 결실되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자의 "결실" 은 전체 코딩 서열의 결실, 코딩 서열의 일부의 결실, 또는 측접 부위를 포함하는 코딩 서열의 결실을 지칭한다. 최종 결과는 결실된 유전자가 효과적으로 비-기능성인 것이다. 단순 용어로, "결실" 은 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 각각이 제거 (즉, 부재) 된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화로서 정의된다. 따라서, 결실 균주는 각각의 야생형 유기체보다 더 적은 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는다.
또 다른 구현예에서, Alr 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 염색체 alr 유전자는 유전자 침묵화에 의해 불활성화되었다. 유전자 침묵화는 상기 박테리아 숙주 세포 안티센스 발현 구성체 내로 도입되어 상기 염색체 유전자의 mRNA 에 상보성인 안티센스 RNA 를 생성시켜, 이로써 상기 유전자의 발현을 억제함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 상기 유전자의 발현은 CRISPR-억제의 메커니즘을 통해 전사 개시 또는 전사 연장을 차단시켜 억제될 수 있다 (WO18009520).
박테리아 숙주 세포는 전형적으로 알라닌 라세마아제 유전자에 유전자 결실을 포함하는 야생형 세포이다. 산업적 발효 과정의 경우, 박테리아 숙주 세포는 최고 생산물 순도 및 규제 요건의 필요성을 충족하도록 유전자 변형될 수 있다. 그러므로, 관심 폴리펩티드의 생산, 회수 또는 적용에 유해할 수 있는 다른 유전자의 변형, 예를 들어 결실 또는 파괴를 추가적으로 함유할 수 있는 바실러스 생산 숙주를 사용하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 한 구현예에서, 박테리아 숙주 세포는 프로테아제-결핍 세포이다. 박테리아 숙주 세포, 예를 들어, 바실러스 세포는 바람직하게는 aprE, mpr, vpr, bpr 및/또는 epr 을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포외 프로테아제 유전자의 파괴 또는 결실을 포함한다. 더 바람직하게는, 박테리아 숙주 세포는 포자를 생산하지 않는다. 더 바람직하게는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어, 바실러스 세포는 spoIIAC, sigE 및/또는 sigG 의 파괴 또는 결실을 포함한다. 또한, 바람직하게는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어, 바실러스 세포는 서팩틴, 예를 들어 srfA , srfB , srfC 및/또는 srfD 의 생합성에 관여되는 유전자 중 하나의 파괴 또는 결실을 포함하며, 예를 들어 미국 특허 제 5,958,728 호를 참조한다. 박테리아 숙주 세포가 폴리글루탐산의 생합성에 관여하는 유전자 중 하나의 파괴 또는 결실을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 관심 폴리펩티드의 생산, 회수 또는 적용에 유해한, amyE 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 유전자가 또한 파괴되거나 결실될 수 있다.
플라스미드
본원에서 나타내는 바와 같은 박테리아 숙주 세포는 플라스미드를 포함할 것이다. 상기 플라스미드는 i) 적어도 하나의 자율 복제 서열, ii) 프로모터에 작동적으로 연결된, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 iii) 프로모터에 작동적으로 연결된, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "플라스미드" 는 숙주 세포에서 자율적으로 복제하는 염색체외 원형 DNA 를 지칭한다. 따라서, 플라스미드는 염색체외 벡터로서 이해된다 (그리고, 박테리아 염색체에 안정적으로 통합되지 않을 것이다).
본 발명에 따르면, 플라스미드의 복제는 박테리아 숙주 세포의 염색체의 복제에 독립적일 것이다. 자율 복제를 위해, 플라스미드는 자율 복제 서열, 즉 플라스미드가 박테리아 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있게 하는 복제 기원을 포함한다. 박테리아 복제 기원의 예는 바실러스에서 복제를 허용하는 플라스미드 pUB110, pBC16, pE194, pC194, pTB19, pAMß1, pTA1060, 및 대장균에서 복제를 허용하는 플라스미드 pBR322, colE1, pUC19, pSC101, pACYC177 및 pACYC184 의 복제 기원이다 (예를 들어 Sambrook,J. and Russell,D.W. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2001. 참조). 플라스미드의 카피수는 정상적인 성장 조건 하에 염색체 당 또는 박테리아 세포 당 플라스미드의 평균 수로서 정의된다. 게다가, 박테리아 숙주에서 상이한 카피수를 생성시키는 상이한 유형의 복제 기원이 존재한다. 플라스미드 레플리콘 pBS72 (등록 번호 AY102630.1) 및 플라스미드 pTB19 및 유도체 pTB51, pTB52 는 바실러스 세포 내에서, 각각 6 카피 및 1 내지 8 카피의 낮은 카피수를 부여하는데 반면, 플라스미드 pE194 (등록 번호 V01278.1) 및 pUB110 (등록 번호 M19465.1)/pBC16 (등록 번호 U32369.1) 은 각각 세포 당 14-20 의 저-중간 카피수 및 30-50 카피의 중간 카피수를 부여한다. 플라스미드 pE194 는 보다 상세히 분석되었고 (Villafane, et al (1987): J.Bacteriol. 169(10), 4822-4829), 몇몇 pE194 - cop 돌연변이체는 85 카피 내지 202 카피 범위로 바실러스 내에서 높은 카피수를 갖는 것으로 기재되었다. 게다가, 플라스미드 pE194 는 온도 민감성으로서, 37℃ 까지 안정한 카피수를 갖지만, 43℃ 이상에서는 복제가 없어진다. 또한, cop-repF 부위 (nt 1235 내지 nt 1431) 내에 2개 점 돌연변이를 갖는 pE194ts 로서 지칭되는 pE194 변이체가 존재하여, 보다 급격한 온도 민감성으로서 32℃ 까지 안정한 카피수이지만, 37℃ 에서는 세포 당 오직 1 내지 2 카피수를 초래한다.
일부 구현예에서, 플라스미드가 포함하는 자율 복제 서열은 박테리아 숙주 세포에서 낮은 카피수, 예컨대 박테리아 숙주 세포에서 1 내지 8 카피의 플라스미드를 부여한다.
일부 구현예에서, 자율 복제 서열은 박테리아 세포에서 저-중간 카피수, 예컨대 박테리아 숙주 세포에서 9 내지 20 카피의 플라스미드를 부여한다.
일부 구현예에서, 자율 복제 서열은 박테리아 세포에서 중간 카피수, 예컨대 박테리아 숙주 세포에서 21 내지 60 카피의 플라스미드를 부여한다.
일부 구현예에서, 자율 복제 서열은 박테리아 세포에서 고카피수, 예컨대 박테리아 숙주 세포에서 61 이상의 카피의 플라스미드를 부여한다.
바람직한 구현예에서, 플라스미드는 자율 복제 서열로서 레플리콘 pBS72 (등록 번호 AY102630.1) 를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 플라스미드는 자율 복제 서열로서 pUB110 (등록 번호 M19465.1)/pBC16 (등록 번호 U32369.1) 의 복제 기원을 포함한다.
플라스미드는 세포 내로 플라스미드를 전달하기에 적합한 임의의 방법에 의해, 예를 들어 전기천공을 사용하는 형질전환, 원형질체 형질전환 또는 접합에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
관심 폴리펩티드
적어도 하나의 자율 복제 서열에 추가로, 본원에서 나타내는 바와 같은 플라스미드는 (프로모터에 작동적으로 연결된) 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자" 는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 임의 길이의 중합체성 비분지 형태인, 뉴클레오티드, 전형적으로 데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드 결합에 의해 함께 연결된, 임의 길이의 중합체 형태의 아미노산을 지칭한다.
용어 "~를 코딩하는" 및 "~를 인코딩함" 은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 전형적으로, 이 용어는 다른 거대분자 예컨대 아미노산의 정의된 서열의 합성을 위한 주형으로서 제공되는, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 의 뉴클레오티드의 특정 서열의 성질을 지칭한다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA 의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산한다면, 단백질을 코딩한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "관심 폴리펩티드" 는 박테리아 숙주 세포에서 생산되도록 의도되는 임의의 단백질, 펩티드 또는 이의 단편을 지칭한다. 따라서, 단백질은 폴리펩티드, 펩티드, 이의 단편을 비롯하여 융합 단백질 등을 포괄한다.
바람직하게는, 관심 폴리펩티드는 효소이다. 특정 구현예에서, 효소는 옥시도리덕타아제 (EC 1), 트랜스퍼라아제 (EC 2), 히드롤라아제 (EC 3), 리아제 (EC 4), 이소머라아제 (EC 5), 또는 리가아제 (EC 6) 로서 분류된다. 바람직한 구현예에서, 관심 단백질은 세제에서 사용하기에 적합한 효소이다.
가장 바람직하게는, 효소는 히드롤라아제 (EC 3), 바람직하게는, 글리코시다아제 (EC 3.2) 또는 펩티다아제 (EC 3.4) 이다. 특히 바람직한 효소는 아밀라아제 (특히, 알파-아밀라아제 (EC 3.2.1.1)), 셀룰라아제 (EC 3.2.1.4), 락타아제 (EC 3.2.1.108), 만난아제 (EC 3.2.1.25), 리파아제 (EC 3.1.1.3), 피타아제 (EC 3.1.3.8), 뉴클레아제 (EC 3.1.11 내지 EC 3.1.31), 및 프로테아제 (EC 3.4) 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소이고; 특히, 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 만난아제, 피타아제, 자일라나아제, 포스파타아제, 글루코아밀라아제, 뉴클레아제 및 셀룰라아제로 이루어지는 군에서 선택되는 효소, 바람직하게는, 아밀라아제 또는 프로테아제, 바람직하게는, 프로테아제이다. 가장 바람직한 것은 세린 프로테아제 (EC 3.4.21), 바람직하게 서브틸리신 프로테아제이다.
특히, 하기 관심 단백질이 바람직하다:
단백질 가수분해 활성을 갖는 효소는 "프로테아제" 또는 "펩티다아제" 로 불린다. 프로테아제는 "프로테아제 활성" 또는 "단백질 가수분해 활성" 을 발휘하는 활성 단백질이다. 프로테아제는 EC 3.4 부류의 구성원이다. 프로테아제는 아미노펩티다아제 (EC 3.4.11), 디펩티다아제 (EC 3.4.13), 디펩티딜-펩티다아제 및 트리펩티딜-펩티다아제 (EC 3.4.14), 펩티딜-디펩티다아제 (EC 3.4.15), 세린-유형 카르복시펩티다아제 (EC 3.4.16), 메탈로카르복시펩티다아제 (EC 3.4.17), 시스테인-유형 카르복시펩티다아제 (EC 3.4.18), 오메가 펩티다아제 (EC 3.4.19), 세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21), 시스테인 엔도펩티다아제 (EC 3.4.22), 아스파르틱 엔도펩티다아제 (EC 3.4.23), 메탈로-엔도펩티다아제 (EC 3.4.24), 트레오닌 엔도펩티다아제 (EC 3.4.25), 미지의 촉매 메커니즘의 엔도-펩티다아제 (EC 3.4.99) 를 포함한다. 시판되는 프로테아제 효소는 Lavergy™ Pro (BASF); Alcalase®, Blaze®, Duralase™, Durazym™, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coro-nase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® 및 Esperase® (Novozymes A/S), 상표명 Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect® Prime, Pura-fect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Ex-cellase®, Eraser®, Ultimase®, Opticlean®, Effectenz®, Preferenz® 및 Optimase® (Dan-isco/DuPont) 로 시판되는 것들, Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) 알칼리 프로테아제 및 Kao 로부터의 KAP (바실러스 알칼로필루스 (Bacillus alkalophilus) 서브틸리신) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적어도 하나의 프로테아제는 세린 프로테아제 (EC 3.4.21) 에서 선택될 수 있다. 세린 프로테아제 또는 세린 펩티다아제 (EC 3.4.21) 는 촉매 반응 동안 기질과 공유 부가물을 형성하는, 촉매적 활성 위치에 세린을 갖는 것을 특징으로 한다. 세린 프로테아제는 키모트립신 (예를 들어, EC 3.4.21.1), 엘라스타아제 (예를 들어, EC 3.4.21.36), 엘라스타아제 (예를 들어, EC 3.4.21.37 또는 EC 3.4.21.71), 그랜자임 (예를 들어, EC 3.4.21.78 또는 EC 3.4.21.79), 칼리크레인 (예를 들어, EC 3.4.21.34, EC 3.4.21.35, EC 3.4.21.118 또는 EC 3.4.21.119), 플라스민 (예를 들어, EC 3.4.21.7), 트립신 (예를 들어, EC 3.4.21.4), 트롬빈 (예를 들어, EC 3.4.21.5,) 및 서브틸리신 (서브틸로펩티다아제, 예를 들어, EC 3.4.21.62 로도 공지됨) 으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있고, 후자는 이후에 "서브틸리신" 으로도 지칭한다. 본 발명에 따른 프로테아제는 단백질 가수분해 활성을 갖는다. 단백질 가수분해 활성을 결정하기 위한 방법은 문헌에 널리 공지되어 있다 (예를 들어 Gupta et al. (2002), Appl. Microbiol. Bio-technol. 60: 381-395 참조).
한 구현예에서, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아 숙주 세포에 이종성이다. 명세서 전반에서 사용되는 바와 같은 용어 "이종성" (또는 외인성 또는 외래 또는 재조합 또는 비-천연) 폴리펩티드 또는 단백질은 숙주 세포에 천연이 아닌 폴리펩티드 또는 단백질로서 본원에서 정의된다. 유사하게, 용어 "이종성" (또는 외인성 또는 외래 또는 재조합 또는 비-천연) 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 천연이 아닌 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아 숙주 세포에 천연이다. 따라서, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 천연일 수 있다. 명세서 전반에서 사용되는 바와 같은 용어 "천연" (또는 야생형 또는 내인성) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 숙주 세포에서 자연적으로 발견되는 대상 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 그러나, 폴리뉴클레오티드가 플라스미드 상에서 숙주 세포에 도입되었으므로, "천연" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 여전히 재조합으로서 간주된다.
숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제
적어도 하나의 자율 복제 서열 및 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 추가로, 본원에서 언급되는 플라스미드는 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 적합한 프로모터, 예컨대 항상성 프로모터에 작동적으로 연결될 것이다.
용어 "알라닌 라세마아제" 는 상기 정의되어 있다. 한 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 박테리아 숙주 세포에 대해 이종성이다. 따라서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제의 아미노산 서열은 Alr 알라닌 라세마아제의 아미노산 서열과 상이하다. 또한, 아미노산 서열은 Alr 알라닌 라세마아제의 서열과 상이할 것이다. 예를 들어, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 Alr (및 YncD) 알라닌 라세마아제에 대해 90% 미만의 서열 동일성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 박테리아 알라닌 라세마아제이다. 적합한 박테리아 알라닌 라세마아제는 예를 들어, 실시예 4 에 기재된 인 실리코 (in silico) 분석을 실행하여 확인할 수 있다. 따라서, COG0787 에 대해 유의한 정렬이 나타날 수 있다 (보다 상세한 설명은 실시예 참조).
숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 알라닌 라세마아제 활성을 갖는 한, 임의의 알라닌 라세마아제일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 박테리아 알라닌 라세마아제이다. 바람직한 아미노산 서열을 표 3 및 특히 표 4 에 나타낸다.
한 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 SEQ ID NO: 4, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 이의 변이체이다. 특히, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 SEQ ID NO: 4 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 이의 변이체이다.
SEQ ID NO: 4, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 알라닌 라세마아제는 본원에서 "부모 효소" 또는 "부모 서열" 로도 지칭한다. "부모" 서열 (예를 들어, "부모 효소" 또는 "부모 단백질") 은 부모 서열의 "변이체" 를 생성시키는 서열의 변화의 도입 (예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환의 도입에 의함) 을 위한 출발 서열이다. 따라서, 용어 "효소 변이체" 또는 "서열 변이체" 또는 "단백질 변이체" 는 각각의 변이체 효소에 대한 기원인 부모 효소와 관련하여 사용된다. 그러므로, 부모 효소는 추가 변이체의 개발에 사용되는 야생형 효소 및 야생형 효소의 변이체를 포함한다. 변이체 효소는 일정 정도까지 그들 아미노산 서열이 부모 효소와 상이하지만; 변이체는 적어도 각각의 부모 효소의 효소 성질을 유지한다. 한 구현예에서, 효소 성질은 각각의 부모 효소와 비교했을 때 변이체 효소에서 개선된다. 한 구현예에서, 변이체 효소는 각각의 부모 효소와 비교했을 때 적어도 동일한 효소 활성을 갖거나, 변이체 효소는 각각의 부모 효소와 비교했을 때 증가된 효소 활성을 갖는다.
부모 효소 분자의 변이체 (예를 들어, SEQ ID NO: 4, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제) 는 효소 활성을 갖는 각각의 부모 효소의 아미노산 서열과 적어도 n 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있고, 전체 길이 폴리펩티드 서열과 비교하여 n 은 50 내지 100 의 정수, 바람직하게는 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 이다. 부모 효소와 비교했을 때 n 퍼센트 동일한 본원에 기재된 변이체 효소는 효소 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제의 변이체는 SEQ ID NO: 4, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53 (바람직하게는, SEQ ID NO: 4) 에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 효소 변이체는 부모 효소와 비교했을 때 그들 서열 동일성에 의해 정의될 수 있다. 서열 동일성은 일반적으로 "% 서열 동일성" 또는 "% 동일성" 으로 제공된다. 제 1 단계에서 2 개 아미노산 서열 사이의 퍼센트-동일성을 결정하기 위해, 쌍별 서열 정렬이 2 개 서열 사이에 생성되고, 2 개 서열은 그들 전체 길이 상에서 정렬된다 (즉, 쌍별 전체 정렬). 정렬은 Needleman 및 Wunsch 알고리즘 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453) 을 구현하는 프로그램으로, 바람직하게는 프로그램 디폴트 매개변수 (갭개방=10.0, 갭확장=0.5 및 매트릭스=EBLOSUM62) 로 프로그램 "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) 을 사용하여 생성된다. 본 발명의 목적을 위해 바람직한 정렬은 최고 서열 동일성을 결정할 수 있는 정렬이다.
2 개 서열 정렬 후, 제 2 단계에서, 동일성 값은 정렬로부터 결정될 것이다. 따라서, 본 발명에 따라서 퍼센트-동일성의 하기 계산이 적용된다:
%-동일성 = (동일한 잔기 / 이의 전체 길이 상에서 본 발명의 각각의 서열을 보여주는 정렬 부위의 길이) *100. 따라서, 이러한 구현예에 따라서 2 개 아미노산 서열의 비교에 대한 서열 동일성은 이의 전체 길이 상에서 본 발명의 각각의 서열을 보여주는 정렬 부위의 길이로 동일한 잔기의 개수를 나누어 계산된다. 이러한 값에 100 을 곱하여 "%-동일성" 을 제공한다.
2 개 DNA 서열의 퍼센트 동일성을 계산하기 위해, 일부 사양을 갖는 2 개 아미노산 서열의 퍼센트 동일성의 계산에 동일하게 적용된다. 단백질을 인코딩하는 DNA 서열의 경우, 쌍별 정렬은 인트론을 제외한 출발부터 중지 코돈까지 코딩 부위의 전체 길이 상에서 이루어져야 한다. 비-단백질-코딩 DNA 서열의 경우, 본 발명의 서열의 전체 길이 상에서 쌍별 정렬이 이루어져야 하므로, 본 발명의 전체 서열은 또 다른 서열, 또는 또 다른 서열 외의 부위와 비교된다. 또한, Needleman 및 Wunsch 알고리즘 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453) 을 구현하는 바람직한 정렬 프로그램은 프로그램 디폴트 매개변수 (갭개방=10.0, 갭확장=0.5 및 매트릭스=EDNAFULL) 를 사용하는 "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) 이다.
효소 변이체는 부모 효소와 비교했을 때 그들의 서열 유사성으로 정의될 수 있다. 일반적으로 서열 유사성은 "% 서열 유사성" 또는 "%-유사성" 으로 제공된다. 제 1 단계에서 서열 유사성을 계산하기 위해, 서열 정렬은 상기 기재된 바와 같이 생성되어야 한다. 제 2 단계에서, 퍼센트-유사성이 계산되어야 하는 한편, 퍼센트 서열 유사성은 아미노산의 정의된 세트가 예를 들어, 그들 크기, 그들 소수성, 그들 전하, 또는 다른 특징에 의해 유사한 성질을 공유한다는 것을 고려한다. 본원에서, 유사한 아미노산으로의 한 아미노산의 교환을 "보존성 돌연변이" 로 지칭한다. 보존성 돌연변이를 포함하는 효소 변이체는 부모 효소의 효소 성질과 비교했을 때 일정 효소 성질이 실질적으로 유지되게 단백질 폴딩에 최소 효과를 갖는 것으로 보인다.
본 발명에 따른 %-유사성을 결정하기 위해, 또한 데이터베이스 검색 및 서열 정렬을 위해 가장 많이 사용되는 아미노산 유사성 매트릭스 중 하나인, BLOSUM62 매트릭스에 따라, 하기가 적용된다.
아미노산 A 는 아미노산 S 와 유사하고,
아미노산 D 는 아미노산 E; N 과 유사하고,
아미노산 E 는 아미노산 D; K; Q 와 유사하고,
아미노산 F 는 아미노산 W; Y 와 유사하고,
아미노산 H 는 아미노산 N; Y 와 유사하고,
아미노산 I 는 아미노산 L; M; V 와 유사하고,
아미노산 K 는 아미노산 E; Q; R 과 유사하고,
아미노산 L 은 아미노산 I; M; V 와 유사하고,
아미노산 M 은 아미노산 I; L; V 와 유사하고,
아미노산 N 은 아미노산 D; H; S 와 유사하고,
아미노산 Q 는 아미노산 E; K; R 과 유사하고,
아미노산 R 은 아미노산 K; Q 와 유사하고,
아미노산 S 는 아미노산 A; N; T 와 유사하고,
아미노산 T 는 아미노산 S 와 유사하고,
아미노산 V 는 아미노산 I; L; M 과 유사하고,
아미노산 W 는 아미노산 F; Y 와 유사하고,
아미노산 Y 는 아미노산 F; H; W 와 유사하다.
보존성 아미노산 치환은 기능성 단백질 예컨대 효소의 폴리펩티드 서열의 서열의 전체 길이 상에서 일어날 수 있다. 한 구현예에서, 이러한 돌연변이는 효소의 기능성 도메인과 관련되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 보존성 돌연변이는 효소의 촉매 중심과 관련되지 않는다.
그러므로, 본 발명에 따라서, 퍼센트-유사성의 하기 계산이 적용된다:
%-유사성 = [ (동일한 잔기 + 유사한 잔기) / 이의 전체 길이 상에서 본 발명의 각각의 서열을 나타내는 정렬 부위의 길이] *100. 따라서, 본원에서 2 개 아미노산 서열의 비교와 관련한 서열 유사성은 동일한 잔기의 개수 + 유사한 잔기의 개수를 이의 전체 길이 상에서 본 발명의 각각의 서열을 나타내는 정렬 부위의 길이로 나누어 계산된다. 이러한 값에 100 을 곱하여 "%-유사성" 을 제공한다.
특히, 전체 길이 폴리펩티드 서열과 비교하여 m 이 70 내지 100 의 정수, 바람직하게 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 인, 각각의 부모 서열과 적어도 m 퍼센트 유사한 보존성 돌연변이를 포함하는 변이체 효소는 본질적으로 변화되지 않은 효소 성질을 갖는다고 예상된다. 부모 효소와 비교했을 때 m 퍼센트-유사성을 갖는 본원에 기재된 변이체 효소는 효소 활성을 갖는다.
프로모터
관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아 숙주 세포에서 발현될 것이다. 따라서, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 둘 모두는 프로모터에 작동적으로 연결될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된" 은 프로모터 서열이 관심 유전자의 전사를 개시할 수 있도록, 프로모터 서열 및 관심 유전자 사이의 기능성 연결을 지칭한다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열" 은 그 유전자의 전사를 가능하게 하는 유전와 동일한 가닥 상의 유전자의 업스트림에 위치된 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 유전자의 전사 출발 위치가 후속된다. 프로모터는 RNA 중합효소 (임의의 필요한 전사 인자와 함께) 에 의해 인식되어, 전사를 개시한다. 프로모터의 기능성 단편 또는 기능성 변이체는 RNA 중합효소에 의해 인식가능하고, 전사를 개시할 수 있는, 뉴클레오티드 서열이다.
"활성 프로모터 단편", "활성 프로모터 변이체", "기능성 프로모터 단편" 또는 "기능성 프로모터 변이체" 는 여전히 프로모터 활성을 갖는, 프로모터의 뉴클레오티드 서열의 단편 또는 변이체를 기재한다.
프로모터는 항상성 프로모터 또는 다른 세포 조절 인자의 제어 하에 있는 프로모터를 포함하는 "유도인자-의존적 프로모터" 또는 "유도인자-독립적 프로모터"일 수 있다. 한 구현예에서, 프로모터는 항상성 프로모터이다.
당업자는 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제 및 관심 폴리펩티드를 발현하기 위해 적합한 프로모터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, "유도인자-의존적 프로모터" 또는 "유도인자-독립적 프로모터"에 작동적으로 연결된다. 또한, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, "유도인자-독립적 프로모터", 예컨대 항상성 프로모터에 작동적으로 연결된다.
"유도인자 의존적 프로모터" 는 본원에서 "유도인자 분자" 를 발효 배지에 첨가시 프로모터가 작동적으로 연결되는 유전자의 전사가 가능하도록 이의 활성이 증가하는 프로모터로서 이해된다. 따라서, 유도인자-의존적 프로모터의 경우, 유도인자 분자의 존재는 신호 전달을 통해 프로모터에 작동적으로 연결된 유전자의 발현 증가를 촉발시킨다. 유도인자 분자의 존재에 의한 활성화 이전 유전자 발현은 부재할 필요는 없으나, 또한 유도인자 분자의 첨가 후 증가하는 낮은 수준의 기본 유전자 발현으로 존재할 수 있다. "유도인자 분자" 는 발효 배지 중 존재가 유전자에 작동적으로 연결된 유도인자-의존적 프로모터의 활성을 증가시킴으로써 유전자의 발현 증가에 영향을 미칠 수 있는 분자이다. 바람직하게는, 유도인자 분자는 탄수화물 또는 이의 유도체이다. 한 구현예에서, 유도인자 분자는 바실러스 세포의 제 2 탄소원이다. 탄수화물의 혼합물의 존재 하에, 세포는 그들에게 최고의 에너지 및 성장 장점을 제공하는 탄소원 (1차 탄소원) 을 선택적으로 흡수한다. 동시에, 그들은 덜 바람직한 탄소원 (2차 탄소원) 의 흡수 및 이화작용에 관여하는 다양한 기능을 억제한다. 전형적으로, 바실러스에 대한 1차 탄소원은 글루코오스이고, 다양한 다른 당 및 당 유도체가 2차 탄소원으로서 바실러스에 의해 사용된다. 2차 탄소원은 예를 들어 만노오스 또는 락토오스를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
유도인자 의존적 프로모터의 예는 각각의 오페론과 관련하여 하기 표에 제공된다:
Figure pct00001
이와 대조적으로, 유도인자 분자의 존재에 의존하지 않는 프로모터 (본원에서 '유도인자-독립적 프로모터' 로 지칭함) 의 활성은 항상적으로 활성이 있거나 발효 배지에 첨가되는 유도인자 분자의 존재와 무관하게 증가할 수 있다.
전형적으로, 항상성 프로모터는 다른 세포 조절 인자에 독립적이고 전사 개시는 시그마 인자 A (sigA) 에 의존적이다. sigA-의존적 프로모터는 시그마 인자 A 특이적 인식 위치 '-35'-부위 및 '-10'-부위를 포함한다.
바람직하게는, '유도인자-독립적 프로모터' 서열은 항상성 프로모터, 제한없이 프로모터 Pveg, PlepA, PserA, PymdA, Pfba 및 상이한 유전자 발현 강도의 이의 유도체 (Guiziou et al, (2016): Nucleic Acids Res. 44(15), 7495-7508), aprE 프로모터, 박테리오파지 SPO1 프로모터 P4, P5, P15 (WO15118126), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 유래 cryIIIA 프로모터 (WO9425612), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 유래 amyQ 프로모터, 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 유래 amyL 프로모터 및 프로모터 변이체 (US5698415) 및 이의 조합, 또는 이의 활성 단편 또는 변이체, 바람직하게는 aprE 프로모터 서열로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서, 유도인자-독립적 프로모터는 aprE 프로모터이다.
"aprE 프로모터" 또는 "aprE 프로모터 서열" 은 aprE 유전자의 전사를 가능하게 하는 aprE 유전자와 동일한 가닥 상에, aprE 유전자, 즉, 바실러스 서브틸리신 칼스버그 프로테아제를 코딩하는 유전자의 업스트림에 위치하는 뉴클레오티드 서열 (또는 이의 일부 또는 변이체) 이다.
칼스버그 프로테아제를 인코딩하는 유전자로부터의 천연 프로모터는 aprE 프로모터로도 지칭되며, 당분야에서 충분히 설명되어 있다. aprE 유전자는 시그마 인자 A (sigA) 에 의해 전사되고, 이의 발현은 몇몇 조절인자 - aprE 발현의 활성제로서 작용하는 DegU 에 의해 고도로 제어되는 한편, AbrB, ScoC (hpr) 및 SinR 은 aprE 발현의 억제인자이다.
WO9102792 는 바실러스 리체니포르미스에서 서브틸리신 칼스버그-유형 프로테아제의 대규모 생산을 위한 알칼리 프로테아제 유전자의 프로모터의 기능성을 개시하고 있다. 특히, WO9102792 는 기능성 aprE 유전자 프로모터를 포함하는 바실러스 리체니포르미스의 서브틸리신 칼스버그 프로테아제 인코딩 aprE 유전자의 5' 부위 (도 27), 및 리보솜 결합 위치 (샤인 달가르노 (Shine Dalgarno) 서열) 를 포함하는 5' UTR 을 기재하고 있다.
또한, 사용하려는 프로모터는 발현시키고자 하는 폴리뉴클레오티드로부터의 내인성 프로모터일 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제는 박테리아 알라닌 라세마아제일 수 있다. 따라서, 상기 박테리아 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 내인성, 즉, 천연의, 박테리아 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 alr 프로모터, 예컨대 바실러스 alr 프로모터에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 바실러스 서브틸리스 alrA 프로모터, 또는 이의 변이체이다. 바람직하게는, 바실러스 서브틸리스 유래의 alrA 프로모터는 SEQ ID NO: 46 에서 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함한다. 이러한 프로모터의 변이체는 바람직하게는, SEQ ID NO: 46 에서 나타낸 바와 같은 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 바실러스 서브틸리스 alrA 유전자인 경우, 따라서 프로모터는 천연 프로모터일 수 있다.
용어 "전사 출발 위치" 또는 "전사의 출발 위치" 는 전사가 유전자 서열의 5' 말단에서 출발하는 위치로서 이해될 것이다. 원핵생물에서, +1 로서 지칭하는 제 1 뉴클레오티드는 일반적으로 아데노신 (A) 또는 구아노신 (G) 뉴클레오티드이다. 이러한 문맥에서, 용어 "위치" 및 "신호" 는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 "발현" 또는 "유전자 발현" 은 특정 유전자 또는 특정 유전자들 또는 특정 핵산 구성체의 전사를 의미한다. 용어 "발현" 또는 "유전자 발현" 은 특히, 유전자 또는 유전자들 또는 유전자 구성체의 구조적 RNA (예를 들어, rRNA, tRNA) 또는 단백질로의 후속 번역이 있거나 또는 없는 mRNA 로의 전사를 의미한다. 과정은 DNA 의 전사 및 생성 mRNA 생산물의 프로세싱을 포함한다.
또한 임의로는, 프로모터는 5'UTR 을 포함한다. 이는 -1 프로모터 위치의 다운스트림에 전사되지만 번역되지 않는 부위이다. 이러한 미번역 부위는 예를 들어 표적 유전자가 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 경우에 번역을 촉진하기 위해 리보솜 결합 위치를 함유해야 한다.
5'UTR 과 관련하여, 본 발명은 특히 본 발명의 프로모터를 하나 이상의 안정화 구성요소를 포함하는 5'UTR 과 조합한다고 교시한다. 이러한 방식으로 프로모터 부위로부터 합성된 mRNA 는 프로세싱되어 전사물의 5' 말단에 안정화 서열을 갖는 mRNA 전사물을 생성시킬 수 있다. 바람직하게는, mRNA 전사물의 5' 말단에 이러한 안정화 서열은 [Hue et al, 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471] 에 의해 기재된 바와 같이 그들의 반감기를 증가시킨다. 적합한 mRNA 안정화 구성요소는 하기에 기재된 것들이다:
- WO08148575, 바람직하게는 WO08140615 의 SEQ ID NO. 1 ~ 5, 또는 mRNA 안정화 기능을 유지하는 이들 서열의 단편, 및
- WO08140615, 바람직하게는 바실러스 투린지엔시스 CrylllA mRNA 안정화 서열 또는 박테리오파지 SP82 mRNA 안정화 서열, 보다 바람직하게는 WO08140615 의 SEQ ID NO. 4 또는 5 에 따른 mRNA 안정화 서열, 보다 바람직하게는 WO08140615 의 SEQ ID NO. 6 에 따른 변형된 mRNA 안정화 서열, 또는 mRNA 안정화 기능을 유지하는 이들 서열의 단편.
바람직한 mRNA 안정화 구성요소는 aaprE, grpE, cotG, SP82, RSBgsiB, CrylllA mRNA 안정화 구성요소, 또는 mRNA 안정화 기능을 유지하는 이들 서열의 단편으로 이루어지는 군에서 선택된다. 바람직한 mRNA 안정화 구성요소는 grpE mRNA 안정화 구성요소 (WO08148575 의 SEQ ID NO. 2 에 상응함) 이다.
5'UTR 은 또한 바람직하게는 프로모터의 다운스트림 및 리보솜 결합 위치 (RBS) 의 업스트림에 위치하는 변형된 rib 리더 서열을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, rib 리더는 본원에서 바실러스 세포, 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 세포에서 리보플라빈 생합성 유전자 (rib 오페론) 업스트림의 리더 서열로서 정의된다. 바실러스 서브틸리스에서, 리보플라빈 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는, rib 오페론은 ribG (ribD), ribB (ribE), ribA 및 ribH 유전자를 포함한다. B. 서브틸리스에서 rib 프로모터 (Prib) 로부터 리보플라빈 오페론의 전사는 오페론의 제 1 유전자, ribG의 전사 출발 및 번역 출발 코돈 사이에서 rib 오페론의 5'-부위에 위치된 거의 300 개 뉴클레오티드의 미번역 조절 리더 부위 (rib 리더) 를 포함하는 리보스위치에 의해 제어된다. 적합한 rib 리더 서열은 참조로 본원에 포함되는, WO2015/1181296, 특히, 페이지 23-25 에 기재되어 있다.
본 발명의 방법의 단계 b) 에서, 박테리아 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포에서 상기 플라스미드를 유지하고 상기 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 발현시키는데 도움이 되는 조건 하에 배양된다. 그리하여, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드가 생산된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "배양되는" 은 적어도 사전결정된 시간 동안 배양물에 포함된 박테리아 숙주 세포를 살아있도록 유지시키고/시키거나 번식시키는 것을 지칭한다. 이 용어는 접종 이후 성장 시작 시 기하급수적 세포 성장기 뿐만 아니라 성장 정지기를 포괄한다. 당업자는 박테리아 숙주 세포에서 상기 플라스미드를 유지하고 상기 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 발현하도록 허용하는 조건을 선택할 수 있다. 바람직하게는, 조건은 상기 숙주 세포에서 상기 플라스미드를 유지하기 위해 선택적이다. 조건은 박테리아 숙주 세포 균주에 의존적일 수 있다. 바실러스 리체니포르미스를 위한 예시적인 배양 배지 및 예시적인 배양 조건은 실시예 2 에 개시되어 있다. 박테리아 숙주 세포에서 플라스미드를 유지하도록 허용하기 위해, 박테리아 숙주 세포는 바람직하게는 외부적으로 첨가된 D-알라닌의 부재 하에 배양되고, 즉, 배양 배지에 D-알라닌은 첨가되지 않았다.
또한, 배양이 항생제 부재 하에 실행되는 것이 고려된다. 따라서, 본원에서 언급되는 플라스미드가 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는다는 것이 고려된다.
본 발명의 방법은, 적용되는 경우, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드의 발현, 즉 생산의 증가를 허용한다. 바람직하게는, 발현은 대조군 세포와 비교하여 증가한다. 대조군 세포는 2 개 염색체 알라닌 라세마아제 유전자가 불활성화되지 않은 동일한 종의 대조군 세포일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드의 발현은 대조군 세포에서 발현과 비교하여 적어도 4%, 예컨대 적어도 6%, 예컨대 적어도 7% 까지 증가한다. 예를 들어, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드의 발현은 대조군 세포와 비교하여 4% 내지 10%, 예컨대 6% 내지 10% 까지 증가할 수 있다. 발현은 숙주 세포 및/또는 배양 배지에서 폴리펩티드의 양을 결정하여 측정될 수 있다.
상기 본원에서 제공된 정의 및 설명은 바람직하게는, 준용하여 하기에 적용된다:
본 발명은 또한, 염색체 alr 유전자가 불활성화되고 바람직하게는 하기를 포함하는 플라스미드를 포함하는, 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 푸밀루스 종에 속하는 바실러스 숙주 세포에 관한 것이다:
1. 적어도 하나의 자율 복제 서열,
2. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및
3. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드.
숙주 세포는 바람직하게는 하기 단계를 실행하여 수득되거나 수득가능하다:
a1) 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 푸밀루스 종에 속하는 바실러스 숙주 세포를 제공하는 단계,
a2) 상기 숙주 세포의 염색체 alr 유전자를 불활성화시키는 단계, 및
a3) 상기 숙주 세포에 상기 플라스미드를 도입하는 단계.
바람직하게는, 박테리아 숙주 세포는 적어도 하나의 관심 폴리펩티드 및 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 발현한다. 보다 바람직하게는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드의 발현은 (본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이) 대조군 세포에서의 발현과 비교하여 증가한다.
대안적으로, 숙주 세포는 유전자좌 확장에 사용될 수 있다 (예를 들어 WO09120929 에서 기재된 바와 같음). 따라서, 숙주 세포는:
u) 비-복제성 벡터로서,
u1) 임의로, 플러스 복제 기원 (ori+),
u2) 프로모터에 작동적으로 연결된, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드,
u3) 프로모터에 작동적으로 연결된, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
u4) 재조합에 의한 박테리아 숙주 세포의 염색체 내로 비-복제성 벡터의 통합을 허용하도록 박테리아 숙주 세포의 염색체 폴리뉴클레오티드에 대해 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 비-복제성 벡터를 포함할 수 있다.
실시예
재료 및 방법
달리 명시하지 않으면, 하기 실험은 미생물의 배양에 의한 화학적 화합물의 발효적 생산 및 유전자 조작에서 사용되는 표준 장비, 방법, 화학물, 및 생화학물을 적용하여 수행되었다. 또한, Sambrook et al. (Sambrook, J. and Russell, D.W. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2001) 을 참조한다.
전기적격 바실러스 리체니포르미스 세포 및 전기천공
B. 리체니포르미스 ATCC53926 으로 DNA 의 형질전환을 전기천공을 통해 수행한다. 전기적격 B. 리체니포르미스 ATCC53926 세포의 제조 및 DNA 의 형질전환을 하기 변형과 함께 Brigidi et al. (Brigidi, P., Mateuzzi, D. (1991), Biotechnol. Techniques 5, 5) 에 의해 본질적으로 기재된 바와 같이 수행한다: DNA 의 형질전환시, 세포는 1 ml LBSPG 완충액 중 회수하고, 선택적 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 후에 60 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션한다 (Vehmaanpera J., 1989, FEMS Microbio. Lett., 61: 165-170). 알라닌 라세마아제에 결함이 있는 B. 리체니포르미스 균주, 100 μg/ml D-알라닌을 모든 배양 배지, 배양-한천 플레이트 및 완충액에 첨가하였다. 알라닌 라세마아제 유전자를 보유하는 플라스미드, 예를 들어 pUA58P 의 형질전환시, D-알라닌을 회수 LBSPG 완충액에 첨가하였으나, 선택 플레이트에는 첨가하지 않았다.
바실러스 리체니포르미스 균주 ATCC53926 의 바실러스 리체니포르미스 특이적 제한 변형 시스템을 극복하기 위해, 플라스미드 DNA 를 하기 기재한 바와 같이 Ec#098 세포 또는 B. 서브틸리스 Bs#056 세포로부터 단리한다.
플라스마 단리
플라스미드 DNA 를 (Sambrook, J. and Russell, D.W. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2001) 에 기재된 표준 분자 생물학 방법 또는 알칼리 용해 방법 (Birnboim, H. C., Doly, J. (1979), Nucleic Acids Res 7(6): 1513-1523) 에 의해 바실러스 및 대장균 세포로부터 단리하였다. 바실러스 세포를 대장균과 비교하여 10 mg/ml 리소자임으로 30 분 동안 37℃ 에서 세포 용해 전에 처리하였다.
분자 생물학 방법 및 기법
바실러스 및 대장균 미생물의 배양, DNA 의 전기천공, 게놈 및 플라스미드 DNA 의 단리, PCR 반응, 클로닝 기술에 제한되지 않는 분자 생물학의 표준 방법을 Sambrook 및 Rusell (상기 참조) 에 본질적으로 기재된 바와 같이 수행하였다.
균주
B. 서브틸리스 균주 Bs #056
자가영양 바실러스 서브틸리스 균주 KO-7S (BGSCID: 1S145; Zeigler D.R.) 를 Spizizen 의 방법 (Anagnostopoulos,C. and Spizizen,J. (1961). J. Bacteriol. 81, 741-746.) 에 따라 적격하게 만들었고, WO2019/016051 에서 B. 서브틸리스 Bs#053 의 생성에 대해 기재된 바와 같이 amyE 유전자에 DNA-메틸트랜스퍼라아제의 통합을 위해 선형화된 DNA-메틸트랜스퍼라아제 발현 플라스미드 pMIS012 로 형질전환하였다. 세포를 10 μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 스프레딩하고 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 37℃ 에서 밤새 인큐베이션한 후, 성장한 콜로니를 선택하고, 10 μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 LB-한천 플레이트 및 10 μg/ml 클로람페니콜 및 0.5% 용해성 전분 (Sigma) 을 함유하는 LB-한천 플레이트 둘 모두 상에 스트리킹하였다. 전분 플레이트를 요오드 함유 Lugols 용액으로 덮었고, 양성 통합 클론을 음성 아밀라아제 활성으로 확인하였다. 양성 클론의 게놈 DNA 를 PCR 에 의한 MTase 발현 카세트의 올바른 통합의 분석 이후, 3℃ 에서 리소자임 (10 mg/ml) 으로 30 분 처리 후 표준 페놀/클로로포름 추출 방법에 의해 단리하였다. 생성 B. 서브틸리스 균주를 Bs#056 으로 명명한다.
대장균 균주 Ec #098
대장균 균주 Ec#098 은 DNA-메틸트랜스퍼라아제 인코딩 발현 플라스미드 pMDS003 을 보유하는 대장균 INV110 균주 (Invitrogen/Life technologies) 이다 (WO2019016051).
B. 리체니포르미스 유전자 녹-아웃 균주의 생성
B. 리체니포르미스 균주 ATCC53926 (US5352604) 및 이의 유도체에서 유전자 결실을 위해, 결실 플라스미드를 100 μg/ml 암피실린 및 30 μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에서 37℃ 에서 선택 이후에, Chung 의 방법 (Chung, C.T., Niemela, S.L., and Miller, R.H. (1989). One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86, 2172-2175) 에 따라 적격하게 만들어진 대장균 균주 Ec#098 에 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA 를 개별 클론으로부터 단리하였고 PCR 분석에 의해 정확성을 분석하였다. 단리된 플라스미드 DNA 는 B. 리체니포르미스 ATCC53926 의 DNA 메틸화 패턴을 보유하고, B. 리체니포르미스로 전달시 분해로부터 보호된다.
aprE 유전자 결실 균주 Bli #002
전기적격 B. 리체니포르미스 ATCC53926 세포 (US5352604) 를 상기 기재된 바와 같이 제조하였고, 37℃에서 5 μg/ml 에리쓰로마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 이후에 대장균 Ec#098 로부터 단리된 1 μg 의 pDel003 aprE 유전자 결실 플라스미드로 형질전환하였다. 유전자 결실 절차를 하기에 기재된 바와 같이 수행하였다: 플라스미드를 보유하는 B. 리체니포르미스 세포를 5 μg/ml 에리쓰로마이신이 있는 LB-한천 플레이트 상에 45℃ 에서 성장시켜, aprE 유전자의 서열 5' 또는 3' 에 상동성인 pDel003 의 상동성 부위 중 하나를 사용하여 염색체 내로 캠벨 (Campbell) 재조합을 통해 결실 플라스미드의 통합을 강제하였다. 30℃ 에서 5 μg/ml 에리쓰로마이신이 있는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 이후에, 클론을 선택하였고, 6 시간 동안 45℃ 에서 선택 압력 없는 LB-배지에서 배양하였다. 개별 클론을 선택하였고, aprE 유전자의 성공적인 결실에 대해 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 28 을 사용한 콜로니-PCR 에 의해 분석하였다. 추정 결실 양성 개별 클론을 선택하였고 플라스미드를 큐어링하기 위해 45℃ 에서 항생제가 없는 LB 배지 중에 2 회 연속 밤샘 인큐베이션을 통해 선택하고, 30℃ 에서 밤샘 인큐베이션을 위해 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 단일 클론을 5 μg/ml 에리쓰로마이신이 있는 LB-한천 플레이트 상에 다시 재스트리킹하였고, aprE 유전자의 성공적인 결실에 대해 콜로니 PCR 에 의해 분석하였다. aprE 유전자가 올바르게 결실된 단일 에리쓰로마이신-민감성 클론을 단리하였고 Bli#002 로 명명하였다.
amyB 유전자 결실 균주 Bli #003
전기적격 B. 리체니포르미스 Bli#002 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하였고, 30℃ 에서 5 μg/ml 에리쓰로마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 이후에 대장균 Ec#098 로부터 단리된 1 μg 의 pDel004 amyB 유전자 결실 플라스미드로 형질전환시켰다. 유전자 결실 절차를 aprE 유전자에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. amyB 유전자의 결실을 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 30 및 SEQ ID NO: 31 을 사용한 PCR 에 의해 분석하였다. 결실된 aprE 및 결실된 amyB 유전자를 갖는 생성 B. 리체니포르미스 균주를 Bli#003 으로 지정한다.
sigF 유전자 결실 균주 Bli #004
전기적격 B. 리체니포르미스 Bli#003 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하였고, 30℃ 에서 5 μg/ml 에리쓰로마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 이후에 대장균 Ec#098 로부터 단리된 1 μg 의 pDel005 sigF 유전자 결실 플라스미드로 형질전환시켰다.
유전자 결실 절차를 aprE 유전자에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. sigF 유전자의 결실을 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34 를 사용한 PCR 에 의해 분석하였다. 결실된 aprE, 결실된 amyB 유전자 및 결실된 sigF 유전자를 갖는 생성 B. 리체니포르미스 균주를 Bli#004 로 지정한다. B. 리체니포르미스 균주 Bli#004 는 (Fleming,A.B., M.Tangney, P.L.Jorgensen, B.Diderichsen, and F.G.Priest. 1995. Extracellular enzyme synthesis in a sporulation-deficient strain of Bacillus licheniformis. Appl. Environ. Microbiol. 61: 3775-3780) 에 기재된 바와 같이 더 이상 포자를 형성할 수 없다.
폴리-감마 글루타메이트 합성 유전자 결실 균주 Bli #008
전기적격 바실러스 리체니포르미스 Bli#004 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하였고, 30℃ 에서 5 μg/ml 에리쓰로마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 이후 대장균 Ec#098 로부터 단리된 1 μg 의 pDel007 pga 유전자 결실 플라스미드로 형질전환시켰다.
유전자 결실 절차를 aprE 유전자의 결실에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. pga 유전자의 결실을 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 36 및 SEQ ID NO: 37 을 사용한 PCR 에 의해 분석하였다. 결실된 aprE, 결실된 amyB 유전자, 결실된 sigF 유전자 및 결실된 pga 유전자 클러스터를 갖는 생성 바실러스 리체니포르미스 균주를 Bli#008 로 지정한다.
alr 유전자 결실 균주 Bli #071
전기적격 B. 리체니포르미스 Bli#008 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하였고, 30℃ 에서 5 μg/ml 에리쓰로마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 이후에, 대장균 Ec#098 로부터 단리된 1 μg 의 pDel0035 alr 유전자 결실 플라스미드로 형질전환시켰다. 유전자 결실 절차를 aprE 유전자에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으나, 모든 배지 및 배지-한천 플레이트에 추가로 100 μg/ml D-알라닌을 보충하였다 (Ferrari, 1985). alr 유전자의 결실을 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 39 및 SEQ ID NO: 40 을 사용한 PCR 에 의해 분석하였다. 결실된 aprE, 결실된 amyB 유전자, 결실된 sigF 유전자, 결실된 pga 유전자 클러스터 및 결실된 alr 유전자를 갖는 생성 B. 리체니포르미스 균주를 B. 리체니포르미스 Bli#071 로 지정한다.
yncD 유전자 결실 균주 Bli #073
전기적격 B. 리체니포르미스 Bli#008 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하였으나, 모든 시점에 배지, 완충액 및 용액에 100 μg/ml D-알라닌을 보충하였다. 전기적격 Bli#008 세포를 30℃ 에서 5 μg/ml 에리쓰로마이신 및 100 μg/ml D-알라닌을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 이후에 대장균 Ec#098 로부터 단리된 1 μg 의 pDel0036 yncD 유전자 결실 플라스미드로 형질전환시켰다.
유전자 결실 절차를 aprE 유전자에 대해 기재된 바와 같이 수행하였으나, 모든 배지 및 배지-한천 플레이트에 추가로 100 μg/ml D-알라닌을 보충하였다. yncD 유전자의 결실을 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 42 및 SEQ ID NO: 43 을 사용한 PCR 에 의해 분석하였다. 결실된 aprE, 결실된 amyB 유전자, 결실된 sigF 유전자, 결실된 pga 유전자 클러스터 및 결실된 yncD 를 갖는 생성 B. 리체니포르미스 균주를 B. 리체니포르미스 Bli#073 으로 지정한다.
플라스미드
플라스미드 pUK57S : II형-조립 목적 셔틀 플라스미드
repU 유전자 내 BsaI 위치 뿐만 아니라 프로테아제 발현 플라스미드 pUK56S (WO2019016051) 의 카나마이신 내성 유전자의 5' BpiI 위치를 각각 quickchange 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 과 Quickchange 돌연변이유발 키트 (Agilent) 를 적용하여 2 회 순차적 라운드에서 제거하였다. 후속하여, 플라스미드를 효소 NdeI 및 SacI 로 절단된, 변형된 II-형 조립 mRFP 카세트와 결찰 이후에 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 SacI 를 사용하여 제한하였다.
변형된 mRFP 카세트 (SEQ ID NO: 14) 는 측접된 BpiI 의 II형 제한 효소 위치, 바실러스 리체니포르미스 유래 aprE 유전자의 종결인자 부위, 및 측접된 NdeI 및 SacI 위치를 갖는, 플라스미드 pBSd141R (등록 번호: KY995200, Radeck,J., D.Meyer, N.Lautenschlager, and T.Mascher. 2017. Bacillus SEVA siblings: A Golden Gate-based toolbox to create personalized integrative plasmids for Bacillus subtilis. Sci. Rep. 7: 14134) 유래 mRPF 카세트를 포함하고, 유전자 합성 단편으로서 주문하였다 (Geneart, Regensburg). 결찰 혼합물로 대장균 DH10B 세포 (Life technologies) 를 형질전환시켰다. 형질전환체를 100 μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 스프레딩하고 밤새 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA 를 개별 클론으로부터 단리하였고, 제한 분해에 의해 정확성을 분석하였다. 생성 플라스미드를 pUK57S 로 명명한다.
플라스미드 pUK57 : II형-조립 목적 바실러스 플라스미드
pUK57S 의 골격을 추가의 EcoRI 위치를 포함하는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16 을 사용하여 PCR-증폭하였다. EcoRI 및 DpnI 제한 이후에, PCR 단편을 20 μg/ml 카나마이신이 있는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 후 Spizizen 의 방법 (Anagnostopoulos,C. and Spizizen,J. (1961). J. Bacteriol. 81, 741-746) 에 따라 적격하게 만들어진 B. 서브틸리스 Bs#056 세포로 형질전환 이후 T4 리가아제 (NEB) 를 사용하여 결찰하였다. 최종 플라스미드 pUK57 의 올바른 클론을 제한 효소 분해 및 서열분석에 의해 분석하였다.
플라스미드 pUKA57 : alrA 유전자를 갖는 II형-조립 목적 바실러스 플라스미드
이의 천연 프로모터 부위 (SEQ ID 005) 를 갖는 B. 서브틸리스 유래 alrA 유전자를 추가적인 EcoRI 위치를 포함하는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18 을 사용하여 PCR-증폭하였다. pUK57S 의 골격을 추가적인 EcoRI 위치를 포함하는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID 015, SEQ ID 016 을 사용하여 PCR-증폭하였다. EcoRI 및 DpnI 제한 후에, 2 개 PCR 단편을 20 μg/ml 카나마이신 및 160 μg/ml CDA (β-클로로-D-알라닌 히드로클로라이드, Sigma Aldrich) 를 갖는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 후 Spizizen 의 방법 (Anagnostopoulos,C. and Spizizen, J. (1961). J. Bacteriol. 81, 741-746) 에 따라 적격하게 만들어진 B. 서브틸리스 Bs#056 세포로 형질전환 후 T4 리가아제 (NEB) 를 사용하여 결찰시켰다. 최종 플라스미드 pUKA57 의 올바른 클론을 제한 효소 분해 및 서열분석에 의해 분석하였다. alrA 유전자의 오픈 리딩 프레임은 카나마이신 내성 유전자에 반대이다.
플라스미드 pUA57 : alrA 유전자를 갖는 II형-조립 목적 바실러스 플라스미드
이의 천연 프로모터 부위를 갖는 B. 서브틸리스 유래 alrA 유전자 (SEQ ID NO: 5) 를 추가적인 EcoRI 위치를 포함하는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18 을 사용하여 PCR-증폭하였다. 카나마이신 내성 유전자가 없는 pUK57S 의 골격은 추가적인 EcoRI 위치를 포함하는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 015 및 SEQ ID NO: 19 를 사용하여 PCR-증폭하였다. EcoRI 및 DpnI 제한 후에, 2 개 PCR 단편을 160 μg/ml CDA (β-클로로-D-알라닌 히드로클로라이드, Sigma Aldrich) 를 갖는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 후에, Spizizen 의 방법 (상기 참조) 에 따라 적격하게 만든 B. 서브틸리스 Bs#056 세포로 형질전환 후 T4 리가아제 (NEB)를 사용하여 결찰시켰다. 최종 플라스미드 pUA57 의 올바른 클론을 제한 효소 분해 및 서열분석에 의해 분석하였다. alrA 유전자의 오픈 리딩 프레임은 repU 유전자에 반대이다.
프로테아제 발현 플라스미드 pUKA58P
프로테아제 발현 플라스미드는 3 개 부분 - pUKA57 의 플라스미드 골격, pCB56C 로부터의 바실러스 리체니포르미스 유래 aprE 유전자의 프로모터 (US5352604), 및 pCB56C 의 프로테아제 유전자 (US5352604) 로 구성된다. 프로모터 단편을 제한 엔도뉴클레아제 BpiI 에 대한 추가적인 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 20 및 SEQ ID NO: 21 을 사용하여 PCR-증폭하였다. 프로테아제 유전자를 제한 엔도뉴클레아제 BpiI 에 대한 추가적인 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 22 및 SEQ ID NO: 23 을 사용하여 플라스미드 pCB56C (US5352604) 로부터 PCR-증폭하였다. 제한 엔도뉴클레아제 BpiI 을 사용한 II형 조립을 기재된 바와 같이 수행하였고 (Radeck et al., 2017), 반응 혼합물을 후속하여 20 μg/ml 카나마이신 및 160 μg/ml CDA (β-클로로-D-알라닌 히드로클로라이드, Sigma Aldrich) 를 갖는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅한 후 Spizizen 의 방법 (상기 참조) 에 따라 적격하게 만든 B. 서브틸리스 Bs#056 세포에 형질전환시켰다. 최종 플라스미드 pUKA58P 의 올바른 클론을 제한 효소 분해 및 서열분석에 의해 분석하였다.
바실러스 온도 민감성 결실 플라스미드
플라스미드 pE194 를 측접된 PvuII 위치를 갖는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID 006 및 SEQ ID 007 을 사용하여 PCR-증폭하였고, 제한 엔도뉴클레아제 PvuII 로 분해시키고, 제한 효소 SmaI 로 분해된 플라스미드 pCE1 에 결찰시킨다. pCE1 은 pUC18 유도체로서, 여기서 암피실린 내성 유전자 내 BsaI 위치를 침묵 돌연변이에 의해 제거하였다. 결찰 혼합물을 대장균 DH10B 세포 (Life technologies) 에 형질전환시켰다. 형질전환체를 100 μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 스프레딩하고 밤새 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA 를 개별 클론으로부터 단리하였고, 제한 분해에 의해 정확성을 분석하였다. 생성 플라스미드를 pEC194S 로 명명한다.
II형-조립 mRFP 카세트를 제한 위치 BamHI 에 대한 추가적인 뉴클레오티드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드 SEQ ID 008 및 SEQ ID 009 를 사용하여 플라스미드 pBSd141R (등록 번호: KY995200)(Radeck et al., 2017) 로부터 PCR-증폭하였다. PCR 단편 및 pEC194S 를 결찰 후에 제한 효소 BamHI 를 사용하여 제한시키고, 대장균 DH10B 세포 (Life technologies) 로 형질전환시켰다. 형질전환체를 100 μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 스프레딩하고 밤새 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA 를 개별 클론으로부터 단리하였고, 제한 분해에 의해 정확성을 분석하였다. 생성 플라스미드 pEC194RS 는 에리쓰로마이신 내성 유전자의 리딩 프레임에 반대인 오픈 리딩 프레임을 갖는 mRFP 카세트를 보유한다.
pDel003 - aprE 유전자 결실 플라스미드
바실러스 리체니포르미스의 aprE 유전자에 대한 유전자 결실 플라스미드를 pEC194RS 와 상용성인 BsaI 위치가 측접된 aprE 유전자의 게놈 부위 5' 및 3' 을 포함하는 유전자 합성 구성체 SEQ ID NO: 26 및 플라스미드 pEC194RS 를 사용하여 구축하였다. 제한 엔도뉴클레아제 BsaI 과 II형 조립을 기재된 바와 같이 수행하였고 (Radeck et al., 2017), 반응 혼합물을 후속하여 대장균 DH10B 세포 (Life technologies) 에 형질전환시켰다. 형질전환체를 100 μg/ml 암피실린을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 스프레딩하고 밤새 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA 를 개별 클론으로부터 단리하였고, 제한 분해에 의해 정확성을 분석하였다. 생성 aprE 결실 플라스미드를 pDel003 으로 명명한다.
pDel004 - amyB 유전자 결실 플라스미드
바실러스 리체니포르미스의 amyB 유전자에 대한 유전자 결실 플라스미드를 pDel003 에 대해 기재된 바와 같이 구축하였으나, pEC194RS 에 상용성인 BsaI 위치가 측접된 amyB 유전자의 게놈 부위 5' 및 3' 을 포함하는 유전자 합성 구성체 SEQ ID 02 를 사용하였다. 생성 amyB 결실 플라스미드를 pDel004 로 명명한다.
pDel005 - sigF 유전자 결실 플라스미드
바실러스 리체니포르미스의 igF 유전자 (spoIIAC 유전자) 에 대한 유전자 결실 플라스미드를 pDel003 에 대해 기재된 대로 구축하였으나, pEC194RS 에 상용성인 BsaI 위치가 측접된 sigF 유전자의 게놈 부위 5' 및 3' 을 포함하는 유전자 합성 구성체 SEQ ID 032 를 사용하였다. 생성 sigF 결실 플라스미드를 pDel005 로 명명한다.
pDel007 - 폴리 -감마- 글루타메이트 합성 유전자 결실 플라스미드
폴리-감마-글루타메이트 (pga) 생산에 관여되는 유전자, 즉 바실러스 리체니포르미스의 ywsC (pgsB), ywtA (pgsC), ywtB (pgsA), ywtC (pgsE) 의 결실을 위한 결실 플라스미드를 pDel003 에 대해 기재된 바와 같이 구축하였으나, pEC194RS 에 상용성인 BsaI 위치가 측접된 ywsC , ywtA (pgsC), ywtB (pgsA), ywtC (pgsE) 유전자에 측접한 게놈 부위 5' 및 3' 을 포함하는 유전자 합성 구성체 SEQ ID 035 를 사용하였다. 생성 pga 결실 플라스미드를 pDel007 로 명명한다.
pDel035 - alr 유전자 결실 플라스미드
바실러스 리체니포르미스의 alr 유전자 (SEQ ID 001) 에 대한 유전자 결실 플라스미드를 pDel003 에 대해 기재된 대로 구축하였으나, pEC194RS 에 상용성인 BsaI 위치가 측접된 alr 유전자의 게놈 부위 5' 및 3' 을 포함하는 유전자 합성 구성체 SEQ ID 038 을 사용하였다. 생성 alr 결실 플라스미드를 pDel035 로 명명한다.
pDel036 - yncD 유전자 결실 플라스미드
바실러스 리체니포르미스의 yncD 유전자 (SEQ ID 024) 에 대한 유전자 결실 플라스미드를 pDel003 에 대해 기재된 바와 같이 구축하였으나, pEC194RS 에 상용성인 BsaI 위치가 측접된 yncD 유전자의 게놈 부위 5' 및 3'을 포함하는 유전자 합성 구성체 SEQ ID NO: 41 을 사용하였다. 생성 yncD 결실 플라스미드를 pDel036 으로 명명한다.
실시예 1: B. 리체니포르미스 효소 발현 균주의 생성
표 1 에 열거된 바와 같은 바실러스 리체니포르미스 균주를 상기 기재된 바와 같이 적격하게 만들었다. alr 유전자 및/또는 yncD 에 결실을 갖는 B. 리체니포르미스 균주의 경우, D-알라닌을 모든 배지 및 완충액에 보충하였다. 프로테아제 발현 플라스미드 pUKA58P 를 B. 리체니포르미스 특이적 DNA 메틸화 패턴을 보유하도록 B. 서브틸리스 Bs#056 균주로부터 단리하였다. 플라스미드를 표시된 균주에 형질전환시켰고 20 μg/μl 카나마이신을 갖는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 개별 클론을 제한 분해에 의해 플라스미드 DNA 의 정확성을 분석하였고, 기능성 효소 발현을 프로테아제 생산 균주의 투명대 형성에 대해서 1% 탈지유를 갖는 LB-플레이트 상에 개별 클론의 전달에 의해 평가하였다. 생성 B. 리체니포르미스 발현 균주를 표 1 에 열거한다.
표 1: B. 리체니포르미스 발현 균주에 대한 개요
Figure pct00002
실시예 2: 바실러스 리체니포르미스 프로테아제 발현 균주의 배양
바실러스 리체니포르미스 균주를, 화학적 한정 발효 배지를 사용하는 발효 과정으로 배양하였다.
하기 대량원소가 발효 과정에서 제공되었다:
화합물 식 농도 [g/L 초기 부피]
시트르산 C6H8O7 3.0
칼슘 술페이트 CaSO4 0.7
모노포타슘 포스페이트 KH2PO4 25
마그네슘 술페이트 MgSO4*7H2O 4.8
소듐 히드록시드 NaOH 4.0
암모니아 NH3 1.3
하기 미량 원소가 발효 과정에서 제공되었다:
미량 원소 기호 농도 [mM]
망간 Mn 24
아연 Zn 17
구리 Cu 32
코발트 Co 1
니켈 Ni 2
몰리브덴 Mo 0.2
철 Fe 38
발효를 8 g/l 포도당을 함유하는 배지로 시작하였다. 50% 글루코오스를 함유하는 용액을 공급 용액으로서 사용하였다. pH 를, 암모니아를 사용하여 발효 동안 조정하였다. 양쪽 실험에서, 첨가된 화학적 한정 탄소원의 총량은 초기 배지 리터 당 200 g 이상으로 유지하였다. 발효를 70 시간 초과 기간 동안 호기성 조건 하에 실행하였다.
발효 과정의 종료 시에, 샘플을 추출하였고 프로테아제 활성을 광도측정으로 결정하였다: 단백질 가수분해 활성을 기질로서 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드 (Suc-AAPF-pNA, 짧게 AAPF; 예를 들어 DelMar et al. (1979), Analytical Biochem 99, 316-320 참조) 를 사용하여 결정하였다. pNA 를 30℃, pH 8.6 TRIS 완충액에서 단백질가수분해 절단에 의해 기질 분자로부터 절단하여 유리 pNA 의 황색 방출이 초래되며, 이를 OD405 에서 측정함으로써 정량하였다.
프로테아제 수율을, 최종 반응기 부피 당 첨가된 글루코오스의 양으로 생산물 역가를 나누어 계산하였다. 균주 BES#158 의 프로테아제 수율을 100% 로 설정하였고, 그에 따라서 다른 균주의 프로테아제 수율은 BES#158 을 참조하였다. alr 유전자가 결실된, B. 리체니포르미스 발현 균주 BES#159 는 B. 리체니포르미스 발현 균주 BES#158 과 비교하여 프로테아제 수율의 9% 개선을 보였다.
대조적으로, yncD 유전자의 단일 녹아웃은 103% 의 프로테아제 수율을 보였다 (도 1 참조).
실시예 3: B. 리체니포르미스 균주의 알라닌 라세마아제 활성
바실러스 리체니포르미스 세포를 200 μg/ml D-알라닌이 보충된 LB 배지 중에 30℃ 에서 배양하였고 16 시간의 배양 후 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 펠렛을 1x PBS 완충액을 사용하여 2 회 세척하였고, 10 mg/mL 의 리소자임이 보충된 1xPBS 에 재현탁하였다. 리소자임 처리를 30 분 동안 37℃ 에서 수행하였다. 완전한 세포 용해를 ribolyser (Precellys 24) 를 사용하여 수행하였다. 시토졸 단백질을 원심분리에 의해 회수하였고 상청액을 알라닌 라세마아제 활성의 결정에 사용하였다. 활성을 Wanatabe et al. 1999 (Watanabe et al., 1999; J Biochem.;126(4):781-6) 에 의해 기재된 방법을 사용하여 결정하였다. 간략하게, 알라닌 라세마아제를 37℃ 에서 기질로서 D-알라닌을 사용하여 분광광도측정으로 어세이하였다. D-알라닌의 L-알라닌으로의 전환은 L-알라닌 데히드로게나아제와의 커플링 반응에서 NADH 의 형성 이후에 결정되었다. 어세이 혼합물은 0,2 ml 의 최종 부피로, 100 mM CAPS 완충액 (pH 10.5), 0.15 유닛의 L-알라닌 데히드로게나아제, 30 mM D-알라닌, 및 2.5 mM NAD+ 를 함유하였다. 반응은 15 분 동안 37℃ 에서 혼합물의 사전-인큐베이션 후 알라닌 라세마아제를 첨가함으로써 시작되었다. NADH 의 형성으로 인한 340 nm 에서의 흡광도 증가를 모니터링하였다. 효소의 1 유닛은 분 당 1 μmol 기질의 라세미화를 촉매화한 효소의 양으로서 정의되었다. 활성을 브래드포드 (Bradford) 결정에 의해 측정한 단백질 함량을 사용하여 정규화하였다. 표 2 는 상이한 B. 리체니포르미스 균주의 알라닌 라세마아제 활성을 요약한다.
표 2: 상이한 B. 리체니포르미스 균주에서 알라닌 라세마아제 활성
Figure pct00003
WT (야생형): 내인성 염색체 알라닌 라세마아제 유전자 모두를 함유함
Dalr: 내인성 염색체 alr 유전자의 결실
DyncD: 내인성 염색체 yncD 유전자의 결실
n.a: 이용불가
표 2 는 결실된 alr 유전자를 갖는 바실러스 리체니포르미스 균주 Bli#071 이 알라닌 라세마아제 활성의 완전한 상실 (<5 [U/mg], 배경 수준 이하) 을 보인다는 것을 보여준다. 대조적으로, 결실된 yncD 유전자를 갖는 바실러스 리체니포르미스 균주 Bli#073 은 71.2 U/mg 의 알라닌 라세마아제 활성을 보인다.
실시예 4: 박테리아 세포에서 알라닌 라세마아제 유전자의 존재의 인 실리 코 평가
인 실리코 분석을 EggNOG 5.0 데이터베이스를 사용하여 박테리아 세포에서 alr 유전자 패밀리의 모든 구성원을 확인하기 위해 실행하였다 (Huerta-Cepas J, Szklarczyk D, Heller D, et al. eggNOG 5.0: a hierarchical, functionally and phylogenetically annotated orthology resource based on 5090 organisms and 2502 viruses. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D309D314). EggNOG 5.0 에 의해 제공되는 오솔로그 유전자의 클러스터 (COG) 의 컬렉션에 대해 검색했을 때 COG0787 에 대한 유의한 정렬을 갖는다면, 유전자는 이 패밀리의 구성원으로 간주된다. 즉, COG0787 은 e-값 > 1e-10 및 점수 > 100 으로, 최고 히트이다. 이러한 검색은 eggNOG-mapper 를 사용하여 다수 서열에 대해 수행할 수 있다 (Huerta-Cepas J, Forslund K, Coelho LP, et al. Fast Genome-Wide Functional Annotation through Orthology Assignment by eggNOG-Mapper. Mol Biol Evol. 2017;34(8):21152122).
1 내지 5 개 알라닌 라세마아제 유전자를 포함하는 4214 개의 상이한 박테리아 종이 확인되었다. 829 개 종은 2 개의 상이한 알라닌 라세마아제 유전자를 함유한다 (나타내지 않음).
확인된 알라닌 라세마아제를 B. 리체니포르미스 유래 라세마아제와 비교하였다. 표 3 은 B. 리체니포르미스 YncD 폴리펩티드와 높은 정도의 동일성을 갖는 YncD 상동체에 대한 개요를 제공한다. 실시예 부분에서 표 4 는 B. 리체니포르미스 Alr 폴리펩티드와 높은 정도의 동일성을 갖는 Alr 상동체에 대한 개요를 제공한다.
표 3: 상이한 바실러스 종에서의 YncD 상동체에 대한 개요
Figure pct00004
표 4: 상이한 바실러스 종에서의 Alr 상동체에 대한 개요
Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Alanine racemase single deletion and transcomplementation <130> B191284PC <150> EP20187745.3 <151> 2020-07-24 <150> EP20187746.1 <151> 2020-07-24 <160> 60 <170> According Wipo Std 25 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> <223> CDS alr <400> 1 atgagcttaa aaccattcta tagaaagaca tgggccgaaa tcgatttaac ggctttaaaa 60 gaaaacgtcc gcaatatgaa gcggcacatc ggcgagcatg tccgcctgat ggccgtcgtt 120 aaagcgaatg cctacggaca cggggatgca caggtagcga aggcggctct tgcagaaggg 180 gcgtccattc ttgctgtggc tttattggat gaagcgcttt cgctgagggc gcaggggatt 240 gaagaaccga ttcttgtcct cggtgcagtg ccgaccgaat atgcaagcat tgccgcggaa 300 aagcgcatta tcgtgactgg ctactccgtc ggctggctga aagacgtgct cggttttctg 360 aatgaggccg aagctcctct tgaatatcat ttgaagatcg acacgggcat gggccgcctt 420 ggctgcaaaa cggaagaaga gatcaaagaa atgatggaga tgaccgaatc gaacgataag 480 ctcaattgta cgggcgtgtt cactcatttc gccacggcgg acgaaaagga caccgattat 540 ttcaacatgc agcttgaccg ctttaaagag ctgatcagcc ccctcccgct tgaccgtttg 600 atggtgcatt cgtcaaacag cgccgcgggt ctgcgcttca gggaacagct atttaatgcc 660 gtccgcttcg gcatcggcat gtacggtttg gcgccgtcaa ccgaaataaa agacgagctg 720 ccgtttcgtc tgcgggaagt gttttcgctt cataccgaac tcacccatgt gaaaaaaatt 780 aaaaaaggcg agagcgtcag ctacggggcg acatatacag ctcagcgcga cgaatggatc 840 gggacagtcc ccgtcgggta tgccgacgga tggctgaggc gcctggccgg aacggaagtg 900 ctgatcgacg gaaaacgcca aaaaatagca gggagaatct gcatggacca gttcatgatt 960 tcccttgccg aagaataccc tgtcggcaca aaggttacct tgatcggaaa gcaaaaagac 1020 gaatggatct cagtcgacga aatcgcccaa aatttgcaga cgatcaatta tgaaattacc 1080 tgtatgataa gttcaagggt gccccgtatg tttttggaaa atgggagtat aatggaaata 1140 aggaatccga tcttgcctga tcaatcctga 1170 <210> 2 <211> 389 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <223> CDS alr <400> 2 Met Ser Leu Lys Pro Phe Tyr Arg Lys Thr Trp Ala Glu Ile Asp Leu 1 5 10 15 Thr Ala Leu Lys Glu Asn Val Arg Asn Met Lys Arg His Ile Gly Glu 20 25 30 His Val Arg Leu Met Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly 35 40 45 Asp Ala Gln Val Ala Lys Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Ile Leu 50 55 60 Ala Val Ala Leu Leu Asp Glu Ala Leu Ser Leu Arg Ala Gln Gly Ile 65 70 75 80 Glu Glu Pro Ile Leu Val Leu Gly Ala Val Pro Thr Glu Tyr Ala Ser 85 90 95 Ile Ala Ala Glu Lys Arg Ile Ile Val Thr Gly Tyr Ser Val Gly Trp 100 105 110 Leu Lys Asp Val Leu Gly Phe Leu Asn Glu Ala Glu Ala Pro Leu Glu 115 120 125 Tyr His Leu Lys Ile Asp Thr Gly Met Gly Arg Leu Gly Cys Lys Thr 130 135 140 Glu Glu Glu Ile Lys Glu Met Met Glu Met Thr Glu Ser Asn Asp Lys 145 150 155 160 Leu Asn Cys Thr Gly Val Phe Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Glu Lys 165 170 175 Asp Thr Asp Tyr Phe Asn Met Gln Leu Asp Arg Phe Lys Glu Leu Ile 180 185 190 Ser Pro Leu Pro Leu Asp Arg Leu Met Val His Ser Ser Asn Ser Ala 195 200 205 Ala Gly Leu Arg Phe Arg Glu Gln Leu Phe Asn Ala Val Arg Phe Gly 210 215 220 Ile Gly Met Tyr Gly Leu Ala Pro Ser Thr Glu Ile Lys Asp Glu Leu 225 230 235 240 Pro Phe Arg Leu Arg Glu Val Phe Ser Leu His Thr Glu Leu Thr His 245 250 255 Val Lys Lys Ile Lys Lys Gly Glu Ser Val Ser Tyr Gly Ala Thr Tyr 260 265 270 Thr Ala Gln Arg Asp Glu Trp Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Tyr Ala 275 280 285 Asp Gly Trp Leu Arg Arg Leu Ala Gly Thr Glu Val Leu Ile Asp Gly 290 295 300 Lys Arg Gln Lys Ile Ala Gly Arg Ile Cys Met Asp Gln Phe Met Ile 305 310 315 320 Ser Leu Ala Glu Glu Tyr Pro Val Gly Thr Lys Val Thr Leu Ile Gly 325 330 335 Lys Gln Lys Asp Glu Trp Ile Ser Val Asp Glu Ile Ala Gln Asn Leu 340 345 350 Gln Thr Ile Asn Tyr Glu Ile Thr Cys Met Ile Ser Ser Arg Val Pro 355 360 365 Arg Met Phe Leu Glu Asn Gly Ser Ile Met Glu Ile Arg Asn Pro Ile 370 375 380 Leu Pro Asp Gln Ser 385 <210> 3 <211> 1170 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <223> CDS alrA <400> 3 atgagcacaa aaccttttta cagagatacg tgggcggaaa ttgacttgtc cgcgataaag 60 gaaaatgtca gcaatatgaa aaaacatatc ggtgaacatg tccacttgat ggcagttgtg 120 aaagcaaacg cctacgggca tggtgatgca gaaacagcaa aggctgctct tgacgcaggt 180 gcttcatgct tggccgtggc cattttggat gaagcgattt cactgcgcaa aaagggattg 240 aaggcgccta tattggtgct tggcgcggtt cccccggagt atgtggcaat cgctgctgag 300 tatgacgtga ccttaacagg ttattctgtt gaatggcttc aggaggcagc ccgccacacg 360 aaaaaaggtt ctcttcattt tcatctgaag gtcgatacgg ggatgaacag acttggtgta 420 aaaacagagg aagaagttca gaacgtgatg gcaattcttg accgcaaccc tcgtttaaag 480 tgcaaagggg tatttaccca ttttgcgaca gcggatgaaa aagaaagagg ctatttctta 540 atgcagtttg agcgctttaa agagctgatt gctccgctgc cgttaaagaa tctaatggtc 600 cactgcgcga acagcgccgc tggactccgg ctgaaaaaag gcttttttaa tgcagtcaga 660 ttcggcatcg gcatgtatgg ccttcgcccg tctgctgaca tgtcggacga gataccgttt 720 cagctgcgtc cggcatttac cctgcattcg acactgtcac atgtcaaact gatcagaaaa 780 ggcgagagcg tcagctacgg agccgagtac acagcggaaa aagacacatg gatcgggacg 840 gtgcctgtag gctatgcgga cggctggctc cgaaaattga aagggaccga catccttgtg 900 aagggaaaac gcctgaaaat tgccggccga atttgcatgg accaatttat ggtggagctg 960 gatcaggaat atccgccggg cacaaaagtc acattaatag gccggcaggg ggatgaatat 1020 atttccatgg atgagattgc aggaaggctc gaaaccatta actatgaggt ggcctgtaca 1080 ataagttccc gtgttccccg tatgtttttg gaaaatggga gtataatgga agtaagaaat 1140 cctttattgc aggtaaatat aagcaattaa 1170 <210> 4 <211> 389 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <220> <223> CDS alrA <400> 4 Met Ser Thr Lys Pro Phe Tyr Arg Asp Thr Trp Ala Glu Ile Asp Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ile Lys Glu Asn Val Ser Asn Met Lys Lys His Ile Gly Glu 20 25 30 His Val His Leu Met Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly 35 40 45 Asp Ala Glu Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asp Ala Gly Ala Ser Cys Leu 50 55 60 Ala Val Ala Ile Leu Asp Glu Ala Ile Ser Leu Arg Lys Lys Gly Leu 65 70 75 80 Lys Ala Pro Ile Leu Val Leu Gly Ala Val Pro Pro Glu Tyr Val Ala 85 90 95 Ile Ala Ala Glu Tyr Asp Val Thr Leu Thr Gly Tyr Ser Val Glu Trp 100 105 110 Leu Gln Glu Ala Ala Arg His Thr Lys Lys Gly Ser Leu His Phe His 115 120 125 Leu Lys Val Asp Thr Gly Met Asn Arg Leu Gly Val Lys Thr Glu Glu 130 135 140 Glu Val Gln Asn Val Met Ala Ile Leu Asp Arg Asn Pro Arg Leu Lys 145 150 155 160 Cys Lys Gly Val Phe Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Glu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Tyr Phe Leu 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Bacillus atrophaeus <220> <223> CDS yncD <400> 56 Met Thr Lys Leu Cys Arg Glu Val Trp Ile Glu Val Asn Leu Asp Ala 1 5 10 15 Ile Lys Lys Asn Leu Arg Ala Ile Arg His His Ile Pro Lys Lys Ser 20 25 30 Lys Ile Met Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Ser Val 35 40 45 Glu Val Ala Arg His Ala Leu Glu Asn Gly Ala Ser Glu Leu Ala Val 50 55 60 Ala Ser Val Glu Glu Gly Ile Val Leu Arg Lys Ala Gly Ile Thr Ala 65 70 75 80 Pro Ile Leu Val Leu Gly Phe Thr Ser Leu Ser Cys Val Lys Glu Ser 85 90 95 Ala Ala Trp Asn Ile Glu Leu Ser Ala Phe Gln Val Asp Trp Ile Lys 100 105 110 Glu Ala Asn Glu Ile Leu Lys Asn Glu Ala Arg Pro Asn Arg Leu Gly 115 120 125 Ile His Ile Asn Val Asp Thr Gly Met Gly Arg Leu Gly Val Arg Thr 130 135 140 Lys Glu Glu Leu Leu Ala Val Val Asn Ala Leu Thr Ala Ser Lys Phe 145 150 155 160 Leu Arg Trp Ala Gly Ile Phe Thr His Phe Ser Thr Ala Asp Glu Pro 165 170 175 Asp Thr Thr Leu Thr Lys Leu Gln His Asp Lys Phe Ile Arg Phe Leu 180 185 190 Arg Phe Leu Lys Asn Gln Gly Ile Glu Leu Pro Thr 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Val Thr Lys Pro Arg Thr Val Ser Tyr 260 265 270 Gly Ala Thr Tyr Val Ala Lys Pro Asp Glu Val Ile Ala Thr Ile Pro 275 280 285 Ile Gly Tyr Ala Asp Gly Tyr Ser Arg Ala Leu Ser Asn Arg Gly Phe 290 295 300 Met Leu Phe Arg Gly Lys Arg Val Pro Ile Ala Gly Arg Val Thr Met 305 310 315 320 Asp Met Thr Met Ile Ser Leu Gly Glu Met Lys Ala Lys Gln Gly Glu 325 330 335 Glu Val Val Ile Tyr Gly Arg Gln Lys Gly Gly Asp Ile Ser Val Asp 340 345 350 Glu Ile Ala Glu Met Leu Asn Thr Ile Asn Tyr Glu Val Ile Ala Thr 355 360 365 Leu Ser Arg Arg Val Pro Arg Phe Tyr Arg Arg Gly Gly Lys Ile Ile 370 375 380 Lys Ile Ser Thr Pro Val Met Tyr Val 385 390 <210> 60 <211> 393 <212> PRT <213> Bacillus sonorensis <220> <223> CDS yncD <400> 60 Met Lys Lys Leu Cys Arg Glu Val Trp Ala Glu Val Asp Leu Asp Ala 1 5 10 15 Ile Lys Lys Asn Leu Arg Ala Ile Arg His His Ile Pro Lys Lys Ser 20 25 30 Lys Ile Met Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Ser Val 35 40 45 Glu Val Ala Arg His Ala Leu Glu His Gly Ala Ser Glu Leu Ala Val 50 55 60 Ala Ser Leu Glu Glu Gly Ile Val Leu Arg Lys Ala Gly Ile Thr Ala 65 70 75 80 Pro Ile Leu Val Leu Gly Phe Thr Pro Leu Arg Cys Val Lys Glu Ser 85 90 95 Ala Ala Trp Asn Ile Thr Leu Ser Ala Phe Gln Val Asp Trp Ile Lys 100 105 110 Glu Ala Asn Glu Ile Leu Glu Lys Glu Ala Glu Thr Asn Arg Leu Asn 115 120 125 Ile His Ile Asn Val Asp Thr Gly Met Gly Arg Leu Gly Val Arg Thr 130 135 140 Lys Glu Lys Leu Leu Glu Ile Val Lys Ala Leu Thr Ala Ser Lys Phe 145 150 155 160 Leu Arg Trp Lys Gly Ile Phe Thr His Phe Ser Thr Ala Asp Glu Pro 165 170 175 Asp Thr Thr Leu Thr Arg Leu Gln His Asp Lys Phe Ile Ser Phe Leu 180 185 190 Arg Phe Leu Lys Asp Gln Gly Phe Glu Leu Pro Thr Val His Met Asn 195 200 205 Asn Thr Ala Ala Ser Ile Ala Phe Pro Glu Phe Ser Ala Asp Met Ile 210 215 220 Arg Leu Gly Ile Gly Met Tyr Gly Leu Tyr Pro Ser Glu Tyr Ile Lys 225 230 235 240 Gln Leu Asn Leu Val Lys Leu Val Pro Ala Leu Ser Leu Lys Ala Arg 245 250 255 Ile Ala Tyr Val Lys Thr Met Leu Thr Glu Pro Arg Thr Ile Ser Tyr 260 265 270 Gly Ala Thr Tyr Ile Ala Glu Pro Gly Glu Val Ile Ala Thr Leu Pro 275 280 285 Val Gly Tyr Ala Asp Gly Tyr Ser Arg Ala Leu Ser Asn Arg Gly Phe 290 295 300 Val Leu His Arg Gly Arg Arg Val Pro Val Ala Gly Arg Val Thr Met 305 310 315 320 Asp Met Ile Met Val Ser Leu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Gln Gly Glu 325 330 335 Glu Val Val Ile Tyr Gly Arg Gln Lys Gly Ala Glu Ile Ser Val Asp 340 345 350 Glu Val Ala Asp Met Leu Asp Thr Ile Asn Tyr Glu Val Val Ser Thr 355 360 365 Ile Ser Arg Arg Val Pro Arg Ile Tyr Ile Arg Asp Gly Glu Ile Leu 370 375 380 Lys Val Ser Thr Pro Val Leu Tyr Val 385 390

Claims (17)

  1. 하기 단계를 포함하는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드의 생산 방법:
    a) 염색체 alr 유전자가 불활성화되고 하기를 포함하는 플라스미드를 포함하는, 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) 종에 속하는 바실러스 숙주 세포를 제공하는 단계:
    1. 적어도 하나의 자율 복제 서열,
    2. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및
    3. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드, 및
    b) 상기 숙주 세포 내에 상기 플라스미드를 유지시키는데 도움이 되고 상기 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 발현시키는데 도움이 되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하여, 이로써 상기 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 생산하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 a) 가 하기 단계를 포함하는 방법:
    a1) 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) 종에 속하는 바실러스 숙주 세포를 제공하는 단계,
    a2) 상기 숙주 세포의 염색체 alr 유전자를 불활성화시키는 단계, 및
    a3) 상기 숙주 세포에 하기를 포함하는 플라스미드를 도입하는 단계:
    1. 적어도 하나의 자율 복제 서열,
    2. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및
    3. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염색체 alr 유전자가 돌연변이에 의해 불활성화된 것인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 염색체 alr 유전자, 또는 이의 단편의 결실인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스 숙주 세포가 바실러스 리체니포르미스 종에 속하는 것인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 바실러스 리체니포르미스 숙주 세포가 인식 서열 GCNGC 를 갖는 제한 변형 시스템을 인코딩하는 바실러스 리체니포르미스 종에 속하는 것인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제가 SEQ ID NO: 4 에 대해 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제가 SEQ ID NO: 4 에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 95.5%, 적어도 96%, 적어도 96.5%, 적어도 97%, 적어도 97.5%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되는 프로모터가 항상성 프로모터인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되는 프로모터가 B. 서브틸리스 (B. subtilis) alrA 유전자의 프로모터, 또는 상기 프로모터에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, B. 서브틸리스 alrA 유전자의 프로모터가 SEQ ID NO: 46 에서 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 것인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 바람직하게는 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 만난아제, 피타아제, 자일라나아제, 포스파타아제, 글루코아밀라아제, 뉴클레아제 및 셀룰라아제로 이루어지는 군에서 선택되는 효소인 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 프로테아제가 아미노펩티다아제 (EC 3.4.11), 디펩티다아제 (EC 3.4.13), 디펩티딜-펩티다아제 또는 트리펩티딜-펩티다아제 (EC 3.4.14), 펩티딜-디펩티다아제 (EC 3.4.15), 세린-유형 카르복시펩티다아제 (EC 3.4.16), 메탈로카르복시펩티다아제 (EC 3.4.17), 시스테인-유형 카르복시펩티다아제 (EC 3.4.18), 오메가 펩티다아제 (EC 3.4.19), 세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21), 시스테인 엔도펩티다아제 (EC 3.4.22), 아스파르틱 엔도펩티다아제 (EC 3.4.23), 메탈로-엔도펩티다아제 (EC 3.4.24) 또는 트레오닌 엔도펩티다아제 (EC 3.4.25) 인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 발효 액체배지 내로 분비되는 것인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드를 정제하는 단계 c) 를 추가로 포함하는 방법.
  16. 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 푸밀루스 종에 속하는 바실러스 숙주 세포로서, 염색체 alr 유전자가 불활성화되었고 하기를 포함하는 플라스미드를 포함하는 것인, 바실러스 숙주 세포:
    1. 적어도 하나의 자율 복제 서열,
    2. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 적어도 하나의 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및
    3. 프로모터에 작동적으로 연결되는, 숙주 세포에 천연이 아닌 알라닌 라세마아제를 인코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드.
  17. 제 16 항의 바실러스 숙주 세포를 포함하는 발효 액체배지.
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