DE69233178T2

DE69233178T2 - Ein bacillus-promotor, der von dem alpha-amylase-promotor einer variante des bacillus licheniformis abstammt

Info

Publication number: DE69233178T2
Application number: DE69233178T
Authority: DE
Inventors: Troels Steen JORGENSEN; Borge Krag Diderichsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1991-11-14
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2012-11-14
Also published as: EP0667910A1; CA2123496A1; AU661070B2; AU2943092A; WO1993010249A1; EP0667910B1; CA2123496C; FI112668B; IL103750A0; DK0667910T3; JPH07504085A; DE69233178D1; JP3529774B2; ATE248223T1; FI942228A0; US5698415A; FI942228A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Bacillus licheniformis Promotor, ein DNA-Konstrukt, das den Promotor umfasst, ein Wirtszelle, die mit dem DNA-Konstrukt transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins in Bacillus durch den Promotor.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bisher sind verschiedene Promotor-Sequenzen des Bacillus licheniformis α-Amylase-Gens beschrieben worden. So beschreiben M. Sibakov und I. Palva, Eur. J. Biochem. 145, 1984, pp. 567–572, die Isolierung und Bestimmung des 5' Endes des Bacillus licheniformis α-Amylase-Gens, einschließlich des Promotor-Sequenz; T. Yuuki et al., J. Biochem. 98, 1985, pp. 1147–1156, zeigen die vollständigen Nucleotid-Sequenz des Bacillus licheniformis α-Amylase-Gens einschließlich der Promotor-Sequenz; und B.M. Laoide et al., J. Bacteriol. 171(5), 1989, pp. 2435–2442, diskutieren die katabole Repression des Bacillus licheniformis α-Amylase-Gens von einer Region um das 5' Ende des Gens und zeigen die Sequenz dieser Region.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass ein neuer, zu den bisher publizierten Promotor-Sequenzen homologer Promotor einen dramatischen Anstieg des Ertrags eines Proteins zur Folge hat, wenn das Gen, das für das Protein kodiert, von dem Promotor transkripiert wird.
Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Bacillus Promotor, der in der folgenden DNA-Sequenz eingeschlossen ist,
wobei jedes von N¹-N⁹ A, T, C oder G ist, mit der Ausnahme, dass N²-N⁹ zusammen nicht die Sequenz ATGTTTCA oder GTGTTTCA bilden,
oder ein funktionelles Homolog der Sequenz.
In den bisher publizierten Sequenzen ist N¹ entweder T (vgl. T. Yuuki et al., oben) oder C (B.M. Laoide et al., oben), während N²-N⁹ entweder ATGTTTCA ist (T. Yuuki et al., oben, und B.M. Laoide et al., oben) oder GTGTTTCA (vgl. M Sibakov, oben). Mehrere Veröffentlichungen diskutieren die katabole Repression des Bacillus-Gens, einschließlich des B. licheniformis α-Amylase-Gens. So bilden B.M. Laoide et al, oben, und B.M. Laoide und D.J. McConnell, J. Bacteriol. 171, 1989, pp. 2443–2450 die cis-Sequenzen, die essentiell sind für die Vermittlung der katabolen Repression von amyL in B. subtilis auf eine 108 by Region unterhalb des Promotors und oberhalb der Signalsequenzschnittstelle ab. Sie identifizieren eine invertierte Wiederholungssequenz, TGTTTCAC-20 bp-ATGAAACA, in dieser Region, beobachten aber, dass Deletion in dem linken Teil dieser Sequenz die Expression entweder aufhob oder veränderte, ohne katabole Repression zu beeinflussen. Sie identifizieren um die transkriptionsiniziierenden Stellen in einer Vielzahl von B. subtilis Katabolismus-repremierbaren Genen Sequenzen, die zu dem linken Teil der amyL invertierten Wiederholungssequenz (5'-A/T T G T N A/T-3') homolog sind.
Y. Miwa und Y. Fujita, Nucl. Acids Res. 18, pp. 7049–7053, begrenzen die cis-Sequenzen, die in kataboler Repression des B. subtilis gnt Operons involviert sind, auf eine 11 by Region. Innerhalb dieser 11 by Region ist eine 8 by Sequenz, ATTGAAAG, von der die Autoren behaupten, dass sie eine Konsensus-Sequenz sein könnte, die in katabole Repression im Genus Bacillus involviert ist, da sie in anderen katabolisch repremierbaren Bacillus-Genen gefunden wurde. Interessanterweise folgt in dem B. licheniformis α-Amylase-Gen die oben gezeigte Konsensus-Sequenz unverzüglich auf den linken Teil der von Laoide et al. identifizierten invertierten Wiederholungssequenz.
M.J. Weickert und G.H. Chambliss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, pp. 6238–6242 beschreiben Platz-gerichtete Mutagenese einer katabolen Repressions-Operator-Sequenz in B. subtilis von dem amyE Gen. Sie beobachten, dass beides, Überproduktion und katabole Repression von Amylase, durch Mutationen in der gleichen Region beeinflusst waren, und manchmal durch die gleiche Mutation. Sie fanden, dass der B. subtilis α-Amylase katabole Repressions-Operator signifikante Homologie mit Sequenzen in anderen Bacillus Amylase-Gen regulatorischen Regionen und mit anderen katabolisch repremierten Genen teilt. Die Konsensus-Sequenz, die sie identifizierten, befindet sich in Bezug auf die B. licheniformis α-Amylase-Transkriptions-iniziierenden Stelle auf Position +70 bis +64.
Mindestens eine Gruppe zieht in Betracht, dass die Sequenz N²-N⁹ (nach der vorliegenden Nomenklatur) einen essentiellen Teil der cis-Sequenz bildet, die für katabole Repression erforderlich ist, während eine andere Gruppe auf eine direkt benachbarte Sequenz hinweist. Es ist bemerkenswert, dass N²-N⁹ einen Teil einer invertierten Wiederholungssequenz bilden. Modifizierungen dieser Sequenzen können gut die Transkriptionslevel, die von dem amyL-Promotor erhalten werden, beeinflussen. Dennoch kann es nicht unberücksichtigt gelassen werden, dass Ersetzungen in anderen Teilen der Promotor-Sequenz, wie z. B. bei N¹, auch die Transkriptionslevel, die von dem Promotor erhalten werden, beeinflussen können.
In dem vorliegenden Kontext ist der Ausdruck "funktionelles Homolog" dazu bestimmt, eine Promotor-Sequenz mit mindestens 70% Sequenz-Identität zu der oben gezeigten Sequenz anzuzeigen, welche Sequenz unter vergleichbaren Bedingungen eine effizientere Transkription des Gens, welchem sie vorangestellt ist, fördert, als der von T. Yuuki et al., oben, oder B. Laoide et al., oben, offenbarte Promotor. Die Transkriptions-Effizienz kann zum Beispiel durch eine direkte Messung der Menge der mRNA, die von dem Promotor transkripiert wurde, bestimmt werden, z. B. durch Northern Blotting oder Primer Verlängerung, oder indirekt durch Messen der Menge an Genprodukt, die von dem Promotor exprimiert wird. Der Ausdruck ist dazu bestimmt, dass er Derivate der oben gezeigten Promotor-Sequenz einschließt, zum Beispiel Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden in die Sequenz, Zugabe von einem oder mehreren Nukleotiden an beiden Enden der Sequenz und Deletion von einen oder mehreren Nukleotiden an beiden Enden oder innerhalb der Sequenz, vorausgesetzt, dass solche Modifikationen die Promotor-Funktion der Sequenz nicht beeinträchtigen. Fragmente der oben gezeigten Sequenz sind in diese Definition eines funktionellen Homologs eingeschlossen.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Der Promotor der Erfindung kann von dem Genom eines geeigneten Bacillus licheniformis Stammes durch Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidproben, die auf der Promoter-Sequenz, die von T. Yuuki et al., oben, oder B. Laoide et al., oben, bekannt ist, in Übereinstimmung mit Standardtechniken ab geleitet werden (vgl. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Die bekannte Promoter-Sequenz kann an einer oder mehreren Stellen durch ortgerichtete Mutagenese in Übereinstimmung mit gut bekannten Methoden modifiziert werden. Die Promoter-Sequenz kann auch durch etablierte Standardmethoden, z. B. das Phosphoamidit-Verfahren, beschrieben von S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859–1869, oder das von Matthes et al., EMBO J. 3, 1984, pp. 801–805 beschriebene Verfahren synthetisch hergestellt werden.
Beispiele von bevorzugten Promotoren der Erfindung sind solche, wobei N¹ C oder T ist; oder wobei N⁷ A, G oder C ist; insbesondere wobei N¹ C ist und N⁷ A ist. So bilden N²-N⁹ zusammen vorzugsweise die Sequenz ATGTTACA, während N¹ vorzugsweise C ist.
Ein Beispiel eines geeigneten Fragments der unten gezeigten Promotor-Sequenz hat die folgende DNA-Sequenz
wobei N¹-N⁹ die oben angegebene Bedeutung hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promoter der Erfindung von einem B. licheniformis Gen abgeleitet, und insbesondere ist er eine Variante eines Bacillus licheniformis α-Amylase-Promotors.
In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfasst, welche ein Protein von Interesse ko diert, dem eine wie oben beschriebene Promoter-Sequenz vorangestellt ist. Das Protein von Interesse kann vorteilhafterweise ein Enzym sein, z. B. α-Amylase, Cyclodextrin Glycosyl Transferase oder eine Protease. Das DNA-Konstrukt kann vorteilhafterweise auch eine Sequenz umfassen, die ein Signalpeptid kodiert, um eine Sekretion des besagten Proteins in das Kulturmedim sicherzustellen, wenn eine mit dem DNA-Konstrukt transformierte Zelle kultiviert wird.
Nach der Erfindung kann das DNA-Konstrukt auf einem selbständig replizierenden Expressions-Vektor sein. Der Vektor umfasst ferner eine DNA-Sequenz, die den Vektor befähigt, in der Wirtszelle zu replizieren. Beispiele solcher Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19 (C. Yanisch-Perron et al., Gene 33, 1985, pp. 103–119), pACYC177 (A.C.Y. Chang und S.N. Cohen, J. Bacteriol. 134, 1978, pp. 1141–1156), pUB110 (Gryczan et al. 1978) oder pIJ702 (E. Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129, 1983, pp. 2703–2714). Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt eine Antibiotikum-Resistenz überträgt, wie z. B. Ampicillin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Resistenz, oder die dal Gene aus B. subtilis oder B. licheniformis (B. Diderichsen, 1986). Die Methoden, die verwendet werden, um die DNA-Sequenz, die das interessierende Protein kodiert, Promoter und Replikationsursprung zu ligieren, sind in der Technik ausgebildeten Personen wohl bekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Alternativ kann das DNA-Konstrukt auf dem Chromosom der Wirtszelle sein. Das ist oft von Vorteil, da das DNA-Konstrukt eher stabil in der Wirtszelle behalten wird. Integration des DNA-Konstrukts in das Wirts-Chromosom kann nach konventionellen Verfahren, z. B. durch homologe Rekombination, durch geführt werden. Es soll zur Kenntnis genommen werden, dass die Promotor-Sequenz, die DNA-Sequenz, die das Protein von Interesse kodiert, und optional die Signal-Sequenz auch getrennt in die Wirtszelle eingeführt werden können.
Die Wirtszelle kann geeigneterweise ein Stamm von Bacillus sein, insbesondere ein Stamm von Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus thuringiensis oder Bacillus subtilis.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Prozess zur Herstellung eines Proteins in Bacilli, der das Kultivieren einer Bacillus-Wirtszelle, die mit einem DNA-Konstrukt oder Vektor nach der Erfindung unter Bedingungen transformiert wurde, welche die Herstellung des Proteins und die Rückgewinnung des resultierenden Proteins aus der Kultur erlauben, umfasst.
Das Medium, das zum Kultivieren der Zellen verwendet wird, kann irgendein herkömmliches Medium, geeignet für das Züchten von Bakterien, sein. Das Produkt des exprimierten Gens wird vorzugsweise aus der Kultur zurückgewonnen. Rückgewinnung des Produkts kann durch herkömmliche Methoden ausgeführt werden, einschließlich Trennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugieren oder Filtrieren, Präzipitieren der proteinhaltigen Komponenten vom Überstand oder Filtrieren durch ein Salz, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt, falls nötig, von einer Vielfalt an chromatographischen Methoden, z. B. Ionenaustauscher-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, oder Ähnlichem.
Die Erfindung wird ferner in dem folgenden Beispiel unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen, in welchen die folgenden Abkürzungen verwendet sind, beschrieben:
"pBR322" bezeichnet pBR322-abgeleitete DNA;
"+ori pUB110" bezeichnet den Plus-Replikationsursprung von pUB110;
"rep" bezeichnet das rep-Gen von pUB110;
"kat" bezeichnet das Chloramphenicol-Resistenz-Gen von pC194;
"cgtA" bezeichnet das Thermoanaerobacter CGTase-Gen;
"PamyM" bezeichnet den Promotor des B. sterothermophilus maltogene Amylase-Gen (Diderichsen und Christiansen, 1988);
"bla" bezeichnet das Ampicillin-Resistenz-Gen von pBR322;
"pKK233-2" bezeichnet pKK233-2-abgeleitete DNA;
"PamyL" bezeichnet den Promotor des B. licheniformis α-Amylase-Gens;
"PamyQ" bezeichnet den Promotor des B. amyloliquefaciens α-Amylase-Gens;
"amyL-cgtA" bezeichnet das Fusions-Gen, das den das Signalpeptid kodierenden Teil des B. licheniformis α-Amylase-Gens und den Teil des Thermoanaerobacter CGTase-Gens, der das mature Enzym kodiert, umfasst;
"erm" bezeichnet das Erythromycin-Resistenz-Gen von pE194;
"ori pE194" bezeichnet den Plus-Replikationsursprung und die rep-Gen enthaltende Region von pE194; und
"amyL" bezeichnet ein DNA-Fragment, das das 3' Ende des B. licheniformis α-Amylase-Gens umspannt.
1 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pNV601;
2 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1878;
3 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1419;
4 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1489;
5 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1540;
6 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pDN3000;
7 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1759;
8 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1892;
9 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1796;
10 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pBB37;
11 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1385;
12 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1893;
13 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ1111;
14 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pDN3060;
15 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ1277;
16 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ994;
17 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ1283;
18 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ1342;
19 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ1359;
20 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1483;
21 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pPL1487;
22 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ932;
23 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ948;
24 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ980;
25 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ1391;
26 ist eine schematische Darstellung des durch homologe Rekombination erfolgten Austausches zwischen dem chromosomalen α-Amylase-Gen und dem auf Plasmid pSJ1391 getragenen amyL-cgtA Fusions-Gen;
27 ist eine schematische Darstellung der in vivo Rekombination zwischen den 5' Enden des maturen Teils von cgtA; und
28 ist eine Restriktionsmappe von Plasmid pSJ1755.
Die Erfindung wird ferner in den folgenden Beispielen veranschaulicht, die nicht in irgendeiner Weise dazu gedacht sind, den Umfang der Erfindung wie beansprucht zu begrenzen.
BEISPIEL
Allgemeine Verfahren
Die experimentellen Techniken, die verwendet wurden, um das Plasmid zu konstruieren, waren Standardtechniken innerhalb des Gebietes der rekombinanten DNA-Technologie, vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982.
Restriktions-Endonucleasen wurden von New England Biolabs und Boehringer Mannheim gekauft und wurden, wie von den Herstellern empfohlen, verwendet.
T4 DNA-Ligase wurde von New England Biolabs gekauft und wie von dem Hersteller empfohlen verwendet.
Herstellung von Vektor-DNA aus allen Stämmen wurde durch das von Kieser, 1984, beschriebene Verfahren durchgeführt.
Transformation von E. coli
Zellen von E. coli wurden kompetent gemacht und wie von Mandel und Higa, 1970, beschrieben, transformiert.
Transformation von B. subtilis
Kompetente Zellen wurden hergestellt und wie von Yasbin et al., 1975, beschrieben, transformiert.
Transformation von B. licheniformis
Plasmide wurden durch Polyethylen Glycol-vermittelte Protoplastentransformation wie von Akamatzu, 1984, beschrieben in B. licheniformis eingeführt.
CGTasen-produzierende Kolonien von entweder E. coli, B. subtilis oder B. licheniformis wurden durch Plattieren der Transformanten auf LB Agar-Platten, angereichert mit 1% löslicher Stärke, identifiziert. Nach über Nacht Inkubation bei entweder 37°C oder 30°C wurden die Platten durch Joddampf gefärbt, um Hydrolysezonen, die durch die Aktivität der CGTase an der Stärke produziert wurden, zu zeigen. Medien
1. Klonieren eines Thermoanaerobacter sp. CGTase-Gens in Bacillus subtilis
Die Konstruktion des E. coli Plasmids pNV601 (1), welches das Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 CGTase-Gen trägt, im folgenden als cgtA bezeichnet, ist in WO 89/03421 offenbart. Das B. subtilis Plasmid pPL1878 (2), welches das cgtA Gen enthält, ist in WO 91/09129 offenbart. Es wurde wie folgt konstruiert:
pNV601 wurde teilweise mit Sau3A verdaut, dann religiert und in E. coli SCS1 (gefrorene kompetente Zellen, gekauft von Stratagene, La Jolla, Kalifornien) transformiert, selektioniert auf Ampicillin-Resistenz (200 μg/ml). Eine CGTase positive Kolonie war PL1419, enthaltend pPL1419 (3). Plasmid pPL1419 wurde teilweise mit Sau3A verdaut, und die Fragmente wurden mit BglII verdautem pPL1489 (4) ligiert. Ein CGTase positiver, Ampicillin-resistenter (200 μg/ml) E. coli SCS1 Transformant enthielt pPL1540 (5). pPL1489 wurde aus Plasmid pKK233-2 (gekauft von Pharmacia LKB Biotechnology) durch Insertion eines synthetischen DNA-Verbindungsstückes zwischen den PstI und HindIII Stellen in pKK233-2 erhalten. Dieses Verbindungsstück war das PstI-HindIII Fragment aus pDN3000 (6; WO 91/09129, Diderichsen et al., 1990).
pPL1540 wurde mit HaeII und SphI verdaut, und das 2,4 kb Fragment, das das cgtA Gen enthält, wurde in HaeII + SphI verdautes Plasmid pDN1380 (Diderichsen und Christiansen, 1988) inseriert. Eine CGTase positive, Chloramphenicolresistente (6 μg/ml) Transformante von B. subtilis DN1885 (Diderichsen et al., 1990) enthielt pPL1878.
2. Konstruktion eines α-Amylase/CGTase Fusions-Gens
Klonierung des Bacillus licheniformis α-Amylase-Gens, amyL, resultierend in Plasmid pDN1981, wird von Jørgensen et al., 1990, beschrieben.
In Plasmid pPL1759 (7) wurde das PstI-HindIII Fragment von pDN1981 durch das PstI-HindIII Multiverbindungsstück-Fragment von pDN3000 (6) ersetzt. Es behielt den amyL Promotor und das meiste der das Signalpeptid kodierenden Sequenz.
Plasmid pPL1892 (8) wurde durch Insertion des cgtA Gens, ausgeschnitten aus pPL1878 auf einen 2,4 kb SalI-NotI Fragments in SalI + NotI verdautes pPL1759, konstruiert, und durch Transformation von DN1885 zu Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml).
Plasmid pPL1796 (9) wurde durch Insertion eines 0,5 kb SacI-EcoRV Fragments von pBB37 (10; Jørgensen, P. et al., 1991) in SacI + SmaI verdautes pPL1385 (11; Diderichsen et al., 1990) konstruiert, und durch Transformation von DN1885 zur Chloramphenicol-Resistenz (6 μg/ml).
Plasmid pPL1893 (12) wurde durch Insertion des CGTase-Gens, ausgeschnitten aus pPL1878 auf einem 2,4 kb BamHI-NotI Fragment in BamHI + NotI verdautes pPL1796 konstruiert, und durch Transformation von DN1885 zur Chloramphenicol-Resistenz (6 μg/ml).
Die Technik der in vivo Genmanipulation (Jørgensen et al., 1990), durch welche zwei DNA-Sequenzen, die auf dem gleichen Plasmid enthalten sind und eine homologe Region teilen, durch Rekombination zwischen den homologen Regionen in vivo (siehe 27) zusammen fusioniert werden können, wurde verwendet, um eine Fusion zwischen den Genen amyL und cgtA, in welchen die cgtA Signalpeptid kodierende Sequenz genau durch die Signalpeptid kodierende Sequenz des amyL Gens ersetzt worden ist, zu konstruieren.
Zu diesem Zweck wurde das folgende Oligonukleotidverbindungsstück synthetisiert und in SaII verdautes pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985) ligiert, ergebend pSJ1111 (13) nach Transformation von E. coli SJ2 (Diderichsen et al., 1990) und Selektion auf Ampicillin-Resistenz (200 μg/ml): 3' Ende der amyL Signalpeptid kodierenden Region
Das pC194 (Horinouchi und Weisblum, 1982) abgeleitete Chloramphenicol-Resistenz-Gen, kat, wurde aus pDN3060 (14; WO 91/09129) als ein 1,1 kb BamHI-BglII Fragment ausgeschnitten und in BclI verdautes pSJ1111 inseriert, ergebend pSJ1277 (15) nach Transformation von E. coli SJ 6 (Diderichsen et al., 1990), und Selektion auf Ampicillin (200 μg/ml) und Chloramphenicol (6 μg/ml) Resistenz.
pSJ994 (16) wurde durch Ligation des 0,6 kb NotI-NcoI Fragments von pPL1893 zu dem 5,4 kb NotI-NcoI Fragments von pPL1892 konstruiert, und durch Transformation in B. subtilis DN1885, unter Selektion auf Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml).
pSJ1283 (17) wurde durch Ligation des 1,1 kb SaII Fragments von pSJ1277 mit SaII verdautem pSJ994 konstruiert, und durch Transformation in DN1885, unter Selektion auf Kanamycin (10 μg/ml) und Chloramphenicol (6 μg/ml) Resistenz.
pSJ1342 (18) wurde durch Deletion des 1,1 kb PstI Fragments von pSJ1283 konstruiert, und durch Transformation in DN1885, unter Selektion auf Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml).
pSJ1359 (19) wurde durch die tatsächliche in vivo Rekombination von pSJ1342 konstruiert. Es besteht Homologie zwischen den Start des maturen Teils des CGTase-Gens und dem Teil des synthetischen Oligonukleotids, das sich zwischen PstI und SaII auf pSJ1342 erstreckt. Falls das Plasmid ein Rekombinations-Ereignis zwischen diesen zwei homologen Regionen durchmacht, werden die einzigen Stellen für XbaI, SaII und BamHI deletiert werden.
Eine Charge von pSJ1342, hergestellt aus dem Wirtsstamm DN1885, wurde mit BamHI, XbaI und SaII gründlich verdaut, und das verdaute Plasmid wurde direkt (d.h. ohne Ligation) in kompetente Zellen von DN1885 transformiert, unter Selektion auf Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml). Diese Methode reichert die rekombinierten Plasmide stark an, da linearisierte Plasmidmonomere nicht in der Lage sind, B. subtilis kompetente Zellen zu transformieren (Mottes et al., 1979). Rekombinierte Plasmide würden nicht durch die Restriktionsenzyme geschnitten werden, und so als eine Mischung von monomeren und oligomeren Formen existieren, die gut in der Lage sind, kompetente B. subtilis Zellen zu transformieren. Ein so erhaltener Transformant enthält pSJ1359. Dieses Plasmid enthält den Replikationsursprung pUB 110 (Lacey und Chopra, 1974, Gryczan et al., 1978, McKenzie et al., 1986), das pUB 110 Rep-Protein-Gen, das Kanamycin-Resistenz-Gen, und den B. licheniformis α-Amylase (amyL) Promotor und Signalpeptid kodierende Region, perfekt fusioniert mit der DNA, die den maturen Teil der CGTase von Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 kodiert.
3. Konstruktion eines chromosomalen Integrations-Vektors
Ein 1,4 kb BamHI Fragment, das das pUB110 Kanamycin-Resistenz-Gen (kan) enthält, wurde aus Plasmid pDN2904 (WO 91/09129) ausgeschnitten, mit BglII verdautem pDN3000 (6) ligiert, in E. coli SCS1 unter Selektion auf Ampicillin-Resistenz (100 μg/ml) transformiert, und pPL1483 (20) wurde aus einem solchen Transformanten wiedergewonnen.
Dieses Plasmid wurde dann mit einem Bacillus-Vektor, der temperaturabhängig repliziert, vereinigt, Plasmid pE194 (Horinouchi und Weisblum, 1982b). pPL1483 wurde mit AccI verdaut, pE 194 wurde mit ClaI verdaut, die zwei linearisierten Plasmide gemischt, ligiert und in B. subtilis DN1885 unter Selektion auf Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml) bei 30°C transformiert. Eine solche Transformante enthielt pPL1487 (21).
Ein 3'-terminales Fragment des amyL-Gens wurde als ein 0,7 kb SalI-HindIII Fragment aus Plasmid pDN1528 (Jørgensen, S. et al., 1991) ausgeschnitten, mit SalI+HindIII verdautem pUC19 ligiert, und in E. coli SJ2 transformiert, selektioniert auf Ampicillin-Resistenz (200 μg/ml). Eine solche Transformante enthielt pSJ932 (22).
Plasmid pSJ948 (23) wurde durch Insertion eines BglII Verbindungsstücks in HindII verdautes pSJ932 erhalten, nochmals auf Ampicillin-Resistenz (200 μg/ml) selektioniert nach Transformation von SJ2.
pSJ980 (24) wurde durch Ligation des 5,1 kb HindIII Fragments von pPL1487 mit HindIII verdautem pSJ948 konstruiert, selektioniert auf Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml) in B. subtilis DN1885 bei 30°C.
Schließlich wurde pSJ1391 (25) durch Ligation des 4,0 kb BglII Fragments von pSJ1359 mit dem 5,6 kb BglII Fragments von pSJ980 konstruiert, selektioniert auf Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml) in DN1885 bei 30 °C. Dieses Plasmid enthält auf einem Vektor, der temperaturabhängig repliziert und Resistenz gegen Kanamycin und Erythromycin trägt, den Promotor und aufwärtsgelegene Region (ungefähr 0,4 kb) des B. licheniformis α-Amylase-Gens (amyL), das α-Amylase/CGTase Fusions-Gen (amyL-cgtA), und dann ungefähr 0,7 kb der 3'-Region des α-Amylase-Gens ('amyL).
4. Transfer des Fusions-Gens auf B. licheniformis und Integration in das Chromosom
Ein α-Amylase-produzierender Stamm von B. licheniformis wurde mit pSJ1391 durch die Protoplasten-Transformation-Methode (Akamatzu, 1984) transformiert. Eine sich neubildende, Kanamycin-resistente Kolonie wurde isoliert, und es wurde entdeckt, dass sie beides, α-Amylase und CGTase, herstellt. Herstellung der beiden Enzyme kann durch Auftrennung der Proteine in dem Kulturüberstand aus Schüttelflaschen-Kulturen BPX-Medium (WO 91/09129) auf isoelektrischen Fokussierungsgelen (z. B. unter Verwendung des Pharmacia Phast Systems) leicht unterschieden werden, gefolgt durch Überschichtung mit einem Agarose-Gel, das 1% lösliche Stärke enthält, und nachfolgendes Färben durch Joddampf. Die CGTase-Aktivität wurde bei pI 4,5 detektiert, die α-Amylase-Aktivität bei pI 8.
Als dieser Transformant auf sein Plasmid-Gehalt hin untersucht wurde, stellte sich heraus, dass ein Rekombinations-Ereignis zwischen dem hereinkommenden Plasmid und dem Chromosom stattgefunden hatte: Eine Doppel-Rekombination hatte das chromosomale α-Amylase (amyL) Gen und das Plasmid-hervorgebrachte amyL-cgtA-Fusions-Gen ausgetauscht, so dass das isolierte Plasmid das amyL-Gen (B. subtilis DN1885 transformiert mit diesem Plasmid produziert α-Amylase) trug, wohingegen das amyL-cgtA Fusions-Gen jetzt auf dem Chromosom blieb (26).
Durch Vermehrung in TY-Medium (WO 91/09129) ohne Kanamycin wurden Stämme isoliert, die spontan ihr Plasmid verloren hatten (SJ1599, SJ1603-1607).
Der ursprüngliche B. licheniformis Transformant wurde auch experimentellen Bedingungen unterworfen, um chromosomale Integration und nachfolgendes Ausschneiden aus dem Plasmid zum Fördern der Rekombinations-Ereignisse sicherzustellen. Der Transformant wurde auf LB-Agar (WO 91/09129) mit 10 μg/ml Kanamycin bei 50°C ausplattiert, Einzelkolonien wurden einige Male bei 50°C ausgestreift, und jede wurde dann in aufeinanderfolgenden über Nacht TY-Kulturen bei 30°C ohne Kanamycin hochgezogen, um Plasmid-Herausschneiden und -Verlust zu ermöglichen. Kana^s Isolate aus jeder ursprünglichen 50°C Kolonie wurden in BPX Schüttelflaschen inkubiert, und Produktion von entweder α-Amylase oder CGTase wurde durch Analyse auf isoelektrisch fokussierenden Gelen wie oben bestimmt. Die analysierten Plasmid-freien Stämme produzierten alle entweder CGTase oder α-Amylase. CGTase produzierende Isolate sind z. B. SJ1561-62, 1580-83, 1586-91 und 1595.
Ein Stamm, genannt SJ 1608, schien CGTase in größeren Mengen als die anderen zu produzieren.
Southern Blot-Analysen der Stämme SJ1561, 1562, 1599, 1606 und 1608 bestätigten, dass diese Stämme das chromosomale amyL-Gen durch das amyL-cgtA Gen ersetzt hatten.
Die folgenden Ergebnisse wurden durch Quantifizierung der CGTase-Aktivität, die durch Inkubation in BPX Schüttelflaschen für 6 Tage bei 37°C produziert wurde, erhalten (Ergebnisse von verschiedenen Experimenten; die Variation innerhalb jeder Gruppe von Stämmen war hauptsächlich auf den Gebrauch von verschiedenen Chargen von Schüttelflaschen zurückzuführen):
5. Promotor-Analyse
Wir haben untersucht, ob der große Unterschied in CGTase-Produktion zwischen dem Stamm SJ1608 und den anderen Stämmen, die das amyL-cgtA Gen enthalten auf Unterschiede in dem amyL-Promotor, der verantwortlich für die CGTase-Expression ist, zurückzuführen war.
Die amyL-Promotor-Sequenz des B. licheniformis Wirtsstammes ist in SEQ ID#4 angegeben.
Die Promotor-Region einer Anzahl von CGTase-produzierenden B. licheniformis Stämmen wurde aus chromosomaler DNA durch die PCR-Technik (Saiki et al., 1988) amplifiziert, als Primer wurden ein Oligonukleotid, das Pos. 204–233, abwärts gelesen durch den amyL-Promotor, entspricht, und ein anderes Oligonukleotid, das in der Sequenz dem 5'-Ende der DNA, entspricht die die mature CGTase kodiert und aufwärts gelesen, verwendet. Die Sequenz dieses zweiten Oligonukleotids war 5'-CCTGTTGGATTATTACTGGG-3' (SEQ ID#5).
Das aus jedem Stamm amplifizierte DNA-Fragment wurde aus einem Agarose-Gel ausgeschnitten und unter Verwendung der gleichen Oligonukleotide, die für PCR-Amplifikation als Sequenzier-Primer in dem Dideoxy-Verfahren (Sanger et al., 1977) verwendet wurden, direkt sequenziert.
Die Ergebnisse der Sequenz-Analyse zeigen, dass eine oder beide der zwei Punkt-Mutationen in der Promotor-Region für den beobachteten großen Unterschied in der CGTase-Produktion verantwortlich sind.
Stämme SJ1599 und 1603-06, alle niedrigergiebig, haben die in SEQ ID#4 gezeigte Promotor-Sequenz. Wie auch immer, der hochergiebige Stamm SJ1608 enthält die in SEQ ID#6 gezeigte Promotor-Sequenz.
Die Unterschiede treten bei Pos. 533 auf, wo SJ1608 ein C anstelle eines T enthält, und an Pos. 593, wo SJ1608 ein A anstelle eines T enthält.
Die Sequenz des amyL-Promotors auf pSJ1359 und pSJ1391 wurde unter Verwendung der PCR-Amplifikation und des oben beschriebenen Sequenzierungsverfahrens bestimmt. Diese zeigte, dass beide Plasmide die in SEQ ID#1 gezeigte Promotor-Sequenz enthalten, d. h. identisch zu der Promotor-Sequenz von SJ1608.
6. Analyse des Promotor-Effekts auf Expression des B. licheniformis α-Amylase-Gen amyL
pSJ1755 (28) wurde durch Ligation des 3,3 kb BglII-HindIII Fragments von pDN1981 (vgl. Beispiel 2) mit dem 4,9 kb BglII-HindIII Fragments von pSJ1391 (25) konstruiert, selektioniert auf Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml) in DN1885 bei 30 °C. Dieses Plasmid enthält das gesamte amyL-Gen mit der in SEQ ID#6 gezeigten Promotor-Sequenz (der in dem hochergiebigen CGTase-Stamm SJ1608 gefundenen Promotor) auf einem Vektor, der temperaturabhängig repliziert und Resistenz gegen Kanamycin und Erythromycin trägt.
Der α-Amylase-produzierende B. licheniformis-Stamm, aus welchem SJ1608 abgeleitet worden war, enthielt ein in das alkaline Protease-Gen inserierte Chloramphenicol-Resistenz-Gen, dadurch dieses Gen unterbrechend und den Stamm alkaline Protease negativ machend. Ein abgeleiteter Stamm, SJ1707, ist identisch mit SJ1608, mit der Ausnahme, dass das Chloramphenicol-Resistenz-Gen durch eine ungefähr 150 by Deletion ersetzt wurde, welche ebenfalls den Stamm alkaline Protease negativ macht.
Plasmid pSJ1755 wurde in den Stamm SJ1707 durch Proteoplasten-Transformation eingeführt, und Austausch des amyL-cgtA Fusions-Gens durch das amyL-Gen wurde durch Integration/Herausschneiden wie in Beispiel 4 beschrieben erreicht.
Erträge an α-Amylase aus dem transformierten Stamm SJ1707, in welchem dem amyL-Gen die in SEQ ID#6 gezeigte Promotor-Sequenz vorangestellt ist, wurden mit dem Ertrag aus dem Stamm, aus welchem SJ1608 abgeleitet wurde und in welchem dem amyL-Gen die in SEQ ID#4 gezeigte Promotor-Sequenz vorangestellt ist, verglichen.
Die Ergebnisse wurden von BPX Schüttelflaschen-Kulturen, inkubiert für 6 Tage bei 37°C, erhalten.
Aus diesen Ergebnissen wird klar ersichtlich, dass der Gehalt an α-Amylase durch Verwendung der in SEQ ID#6 gezeigten Promotor-Sequenz außerordentlich erhöht wird.
REFERENZEN

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AUFLISTUNG DER SEQUENZEN

Claims

Bacillus Promotor, umfassend:
wobei jedes von N³-N⁹ A, T, C, oder G ist, N¹ C oder T ist und N² A oder G ist, vorausgesetzt, dass N²-N⁹ zusammen nicht die Sequenz ATGTTTCA oder GTGTTTCA bilden; oder ein funktionelles Homolog der Sequenz, wie hierin definiert, mit mindestens 70% Sequenzidentität zu der oben gezeigten Sequenz, welche Sequenz unter vergleichbaren Bedingungen eine effizientere Transkription des Gens, welchem sie vorangestellt ist, fördert, als die oben gezeigte Promotorsequenz, wobei N¹ C oder T ist und N²-N⁹ zusammen die Sequenz ATGTTACA bilden.
Bacillus Promotor, umfassend:
wobei jedes von N³-N⁹ A, T, C oder G ist und N² A oder G ist, vorausgesetzt, dass N²-N⁹ zusammen nicht die Sequenz ATGTTTCA oder GTGTTTCA bilden.
Promotor nach Anspruch 1 oder 2, wobei N⁷ A, G oder C ist.
Promotor nach Anspruch 1 oder 2, wobei N⁷ A ist.
Promotor nach Anspruch 1 oder 2, wobei N²-N⁹ zusammen die Sequenz ATGTTACA bilden.
Promotor nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, welcher von einem Bacillus licheniformis Gen abgeleitet ist und insbesondere er eine Variante eines Bacillus licheniformis α-Amylasepromotors ist.
DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein von Interesse kodiert, welchem eine Promotorsequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 vorangestellt ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 7, wobei das Protein von Interesse ein Enzym ist, wie eine α-Amylase, Cyclodextrin, Glycosyltransferase oder Protease.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 7 oder 8, welches ferner eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Signalpeptid kodiert.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, wobei das Signalpeptid das B. licheniformis α-Amylasesignalpeptid ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 10.
Wirtszelle, transformiert mit einem DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 7 bis 10 oder mit einem Vektor nach Anspruch 11.
Wirtszelle nach Anspruch 12, welche ein Stamm von Bacillus ist, insbesondere ein Stamm von Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus thuringiensis oder Bacillus subtilis.
Prozess zum Herstellen eines Proteins in Bacilli, umfassend Kultivieren einer Bacillus Wirtszelle, transformiert mit einem DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 7 bis 10 oder mit einem Vektor nach Anspruch 11, unter Bedingungen, welche die Herstellung des Proteins und die Rückgewinnung des resultierenden Proteins aus der Kultur erlauben.