DE69230825T2

DE69230825T2 - Genexpression in bazillen

Info

Publication number: DE69230825T2
Application number: DE69230825T
Authority: DE
Inventors: Eugenio Ferrari
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 2000-11-30
Anticipated expiration: 2012-04-25
Also published as: CA2108358A1; JPH06507075A; JP2654472B2; DK0600893T3; EP0600893A1; AU1911192A; WO1992019721A1; CA2108358C; EP0600893A4; KR100230613B1; FI934717A; DE69230825D1; NZ242507A; AU663321B2; EP0600893B1; FI934717A0; US5387521A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft neue Gene, Vektoren und Bazillen, die mit diesen transformiert sind und zur Überproduktion von Enzymen geeignet sind. Insbesondere betrifft die Erfindung spezifische Kombinationen von nicht verbundenen Genen, die, entweder mutiert oder als Wildtyp, eine Überproduktion von Enzymen synergistisch induzieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Viele industriell wichtige Produkte werden aus Mitgliedern der Gattung Bazillus hergestellt. Einige davon beinhalten Proteasen, Amylasen und Beta- Glucanasen (Priest, 1977, Bacteriological Review, 41: 711-753). Die meisten dieser Enzyme werden entweder durch Bazillen nach der Initiation der Sporulation hergestellt oder werden zeitlich mit dem Beginn der stationären Phase reguliert.
Bacillus subtilis I-168 ist das am extensivsten untersuchte Mitglied der Bazillen und hat ein gut entwickeltes genetisches System als Ergebnis vieler Jahre wissenschaftlicher Untersuchung. Als ein Ergebnis gibt es eine beachtliche Menge an Wissen über die Expression von extrazellulären Enzymen und es existieren viele Mutanten von B. subtilis I-168, die in der Expression dieser Enzyme verändert sind. Es gibt verschiedene unterschiedliche bekannte Gene, die für Proteine codieren, die die Expression von extrazellulären Enzymen regulieren. Obwohl der exakte molekulare Mechanismus dieser Regulation nicht vollständig verstanden ist, ist es mittlerweile klar, daß das Produkt dieser Gene entweder direkt oder indirekt auf der Transkriptionsebene der Zielenzyme wechselwirkt (Ferrari et al., 1988, J. Bacteriol. 170: 289-295; Henner et al., 1988, J. Bacteriol. 170: 296-300).
Regionen der DNA im Bereich von Promotoren können aktiv mit bestimmten Transkriptionskontrollfaktoren wechselwirken und wirkungsvoll die Stärke und Wirksamkeit eines bestimmten Promotors regulieren. Diese Wechselwirkung resultiert entweder in einer Stimulation oder einer Repression der Transkription dieses speziellen Zielgens. Als eine Folge erwartet man, daß Mutationen entweder in den Genen, die für diese Transkriptionskontrollfaktoren codieren oder in Regionen des Chromosoms mit dem sie wechselwirken zu mehr oder weniger mRNA des Zielgens führen. Dies führt wiederum zu einer höheren oder geringeren Menge von durch die Zelle synthetisierten Enzym.
Mit dem Aufkommen von Techniken des Genetic Engineering wurde es möglich, ein Gen aus einer anderen Spezies in B. subtilis I-168 oder anderen Bazillus-Spezies zu klonieren und zu exprimieren. Die meisten dieser Studien beinhalteten die Verwendung von Vielkopienplasmiden ("multicopy plasmid") als Klonierungsvektoren. Obwohl die Ausbeute des klonierten Proteins signifikant über der Produktion im Wildtypwirt erhöht wurde, lag es weit unterhalb der Enzymausbeute, die für Produktionsstämme berichtet wurde, die mittels Mutagenese erhalten wurden. Dies war auch der Fall, wenn das Enzym unter der Kontrolle von starken Transkriptions- und Translationselementen war, die von B. subtilis stammten. Offensichtlich war die Enzymproduktion, die aus den Vielkopien-Replikationsplasmiden erhalten wurde, nicht durch die Gegenwart von bestimmten Mutationen beeinflußt, d. h. sacU(Hy), sacQ(Hy) und hpr (Dedonder et al., Microbiology 1976, D. Schlessinger (Hrsg.), Seite 58-69, American Society for Microbiology, Washington, DC, Palva et al., 1983, FEMS Microbiology Letters, 17: 81-85; Ferrari, nicht veröffentlichte Beobachtung), von denen berichtet wurde, daß sie in der Lage waren eine Überproduktion von mehreren ausgeschiedenen Enzymen zu induzieren. Diese Regulationsgene sind nicht mit dem Struktur gen für die betroffenen Enzyme verbunden und somit sollte man erwarten, daß sie ihre stimulierende Aktivität zu einem größeren Maß auch ausführen, wenn das Gen in einem Vielkopienplasmid enthalten ist.
Es existieren mindestens sechs verschiedene Regulationsgene, von denen bekannt ist, daß sie entweder direkt oder indirekt mit der Transkription des Subtilisingens wechselwirken: sacU, sacQ, prtR, hpr, sin und abrB.
Bestimmte Mutationen in dem sacU-Gen codieren für ein modifiziertes Polypeptid, das den am meisten pleiotropen Effekt unter all diesen bekannten Regulationsgenen aufweist. Ein Stamm, der z. B. sacU(Hy)-Mutationen trägt, kann in Gegenwart von hohen Glucosespiegeln sporulieren, hat eine sehr geringe Transformationseffizienz, ihm fehlen Flagellen und sie sind auch verantwortlich für die Überproduktion von verschiedenen ausgeschiedenen Enzymen (Dedonder et al., Microbiology 1976, siehe oben).
Das sacQ-Gen aus drei verschiedenen Bazillen ist cloniert und charakterisiert worden (Amory et al., 1987, J. Bacteriol., 169, 234; Yang et al., 1986, J. Bacteriol., 166, 133; und Tomioka et al., 1985, J. Biotechnol., 3,85). Das aus B. subtilis isolierte Gen codiert ein 46 Aminosäurepolypeptid. Das sacQ-Gen bewirkt, wenn es überexprimiert wird entweder aufgrund einer Mutationin seinem Promotor oder wenn es in einem Vielkopienplasmid vorhanden ist, Überproduktion von bestimmten extrazellulären Enzymen, einschließlich der alkalischen Protease (Yang et al., 1986, J. Bacteriol., 166, 113-119).
Das prtR-Gen codiert ein 60 Aminosäurepolypeptid. Wenn dieses Gen in B. subtilis in einem Vielkopienplasmid vorhanden ist, bewirkt es erhöhte Produktion von Proteinen. Jedoch anders als sacQ, existieren keine chromosomalen Mutationen bis heute für dieses Gen, welches die Herstellung von Proteasen erhöht (Yang et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 434-437).
Das hpr-Gen codiert ein 203 Aminosäureprotein und bestimmte Mutationen in diesem Gen simulieren die alkalische Proteaseproduktion. Es ist festgestellt worden, daß Mutationen, die den Verlust dieses Genprodukts bewirken, die Transkription des Subtilisingens stimulieren (Perego und Hoch, 1988, J. Bacteriol. 170, 2560-2567). Das Produkt des hpr-Gens ist deshalb sehr wahrscheinlich ein Repressor des Subtilisingens. Es wurde auch bestimmt, daß das scoC-Gen und möglicherweise das catA-Gen mit dem hpr identisch sind. Die Bezeichnung hpr wird demnach verwendet werden, um Bezug zu nehmen auf jedes der drei Allele, die hpr, scoC oder catA genannt werden.
Gas sin-Gen codiert ein Polypeptid mit 111 Aminosäuren (Gaur et al., 1986, J. Bacteriol., 168: 860-869). Eine Inaktivierung des Gens durch Insertion bewirkt die Produktion eines höheren alkalische Phosphatasespiegels, was darauf hinweist, daß dieses Gen auch als ein Repressor der Expression von alkalischer Protease wirkt.
Schließlich codiert das abrB-Gen für ein Polypeptid mit 97 Aminosäuren. Auch für dieses Gen gibt es Beweise, daß es ein Repressor der Transkription der alkalischen Protease ist und eine wichtige Rolle in der zeitlichen Regulation dieses Gens spielt.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden, daß ein synergistischer Effekt in einem Stamm erreicht werden kann, der Kombinationen von Mutationen in diesen Genen trägt. Solch ein Organismus wird, wenn er mit einem integrierenden Vektor oder Plasmid transformiert wird, indem das zu exprimierende Enzym unter der Kontrolle des Promotors mit all seinen regulatorischen Regionen steht, mehr Enzym exprimieren als vorhersagbar wenn entweder ein replikatives Vielkopienplasmid verwendet wird oder nur eines der oben beschriebenen regulatorischen mutierten Gene.
Demgemäß betrifft die Erfindung einen Bazillus, der in der Lage ist ein Enzym überzuproduzieren, umfassend:
a) die Enzymgensequenz,
b) eine funktionelle Promotorgensequenz, die die Expression des Enzymgens kontrolliert, die operativ mit der Enzymgensequenz verbunden ist, und
c) zwei oder mehr mutierte Gene, die bei der Transkriptionsregulation des Promotors beteiligt sind, worin jedes einzelne mutierte Gen die erhöhte Produktion des Enzyms induziert. Die mutierten Gene sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: hpr, sacQ, sacU, sin, abrB oder prtR.
Die Erfindung betrifft auch Vektoren, die das neue Gen umfassen, Zellen, die mit den Vektoren transformiert sind und ein Verfahren zum Herstellen der Enzyme.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt die Konstruktion des pSAR-Gens.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion des pSAICM-Gens.
Fig. 3 zeigt die Integration des pSAICM-Gens in das B. subtilis Chromosom.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Die Anmelder haben neue Kombinationen von mutierten oder Wildtypgenen, Vektoren und Bazillen, die mit diesen transformiert sind, dargestellt, welche einzigartig in ihrer Fähigkeit sind, eine Überproduktion von Enzymen zu induzieren. Zwei mutierte wie oben beschriebene Gene werden in einen Stamm eingeführt, der einen geeigneten Promotor und Gensequenz trägt. Die Promotorsequenz und die Gensequenz des Enzyms werden in einen solchen Wirtsstamm mittels eines integrierenden Vektors eingeführt. Solch ein Vektor, der mit der Integration amplifiziert wird oder nicht, wird stabil als Teil des Wirtsgenoms beibehalten und repliziert innerhalb der Zelle als integraler Teil seines Chromosoms. Die Integration kann an verschiedene Regionen des Chromosoms auftreten, einschließlich, aber nicht begrenzt, auf die Region einer Homologie mit dem Promotor, der in einer speziellen Konstruktion verwendet wird. Solch ein Wirt kann seine ursprünglichen Enzymsequenzen aufweisen oder andere Gensequenzen, schädlich für die gewünschte Enzymproduktion, deletiert oder anders funktionsunfähig durch Standardtechniken.
"Enzymgensequenz" wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine DNA- Sequenz, die für die Expression eines Enzyms codiert, im allgemeinen entweder heterolog oder homolog zu Bazillen. Verschiedene Enzyme sind bekannt und innerhalb des Umfangs dieser Lehre, wobei sie einschließen, aber nicht begrenzt sind, auf die bevorzugten Enzyme aus Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens (z. B. ATCC 23844), Bacillus licheniformis (z. B. ATCC 21415), Bacillus alcalophilus (z. B. ATCC 21522), B. subtilis (z. B. ATCC 6051) und Bacillus cereus (z. B. ATCC 21768). Auch eingeschlossen sind all die Gene, die in der Lage sind, in Bazillen exprimiert zu werden, wie etwa diejenigen, die für Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Esterasen, Endoglycosidasen etc. codieren. Ein bevorzugtes Enzym ist Subtilisin. Andere bevorzugte Enzyme beinhalten Endoglycosidase H aus Streptomyces- Spezies und Lipase aus Pseudomonas mendocino ATCC 53552 (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD). Enzyme, wie etwa Subtilisin, die optimal bei höherem pH arbeiten, sind unter den bevorzugten Enzymen. Es wird auch anerkannt, daß nur die Promotoren durch die Erfindung umfaßt sein sollen, die beeinflußt werden (d. h. Überproduzieren) durch jedes der Transkriptionsregulationsgene (z. B. aprE und nprE). Die Enzymgensequenz beinhaltet auch die DNA-Sequenz, die für eine natürlich vorkommende Enzymgensequenz codiert, welche modifiziert ist, um eine mutante DNA Sequenz herzustellen, die eine Substitution, Insertion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren in der Gensequenz codiert.
Geeignete Modifikationsverfahren werden beschrieben in z. B. EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756, veröffentlicht am 9. Januar 1985.
Subtilisine sind alkalische Proteasen aus Bakterien, die im allgemeinen wirksam sind, um Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden zu spalten. "Subtilisin" wie hierin verwendet, bedeutet ein natürlich vorkommendes Subtilisin oder ein rekombinantes Subtilisin. Von einer Reihe von natürlich vorkommenden Subtilisinen ist bekannt, daß sie von verschiedenen Bakterienspezies hergestellt und oft sezerniert werden. Aminosäuresequenzen der Mitglieder dieser Gruppen sind nicht vollkommen homolog. Jedoch zeigen die Subtilisine in dieser Gruppe dieselbe oder ähnliche Art proteolytischer Aktivität. Diese Klasse von Serinproteasen teilt eine gemeinsame Aminosäuresequenz, die eine katalytische Triade definiert, welche sie von der Chymotrypsin verwandten Klasse von Serinproteasen unterscheidet. Die Subtilisine und Chymotrypsin verwandten Serinproteasen haben beide eine katalytische Triade, die Aspartat, Histidin und Serin umfaßt. In den Subtilisin verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge dieser Aminosäuren, wenn man vom Amino- zum Carboxyterminus liest, Asparat-Histidin-Serin. In den Chymotrypsin verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge jedoch Histidin-Aspartat-Serin. Somit bezieht sich Subtilisin hierin auf eine Serinprotease.
"Rekombinantes Subtilisin" bezieht sich auf ein Subtilisin, in dem die das Subtilisin codierende DNA-Sequenz modifiziert ist, um eine mutante DNA- Sequenz zu produzieren, welche die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in der natürlicherweise vorkommenden Subtilisinaminosäuresequenz enthält. Geeignete Verfahren, um solche Modifikationen herzustellen, schließen die hier beschriebenen ein und die in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756. Zum Beispiel kann eine Subtilisinvielfachmutante, die die Substitution von Methionin bei Aminosäureresten 50, 124 und 222 durch Phenylalanin, Isoleucin bzw. Glutamin enthält, als abgeleitet von dem rekombinanten Subtilisin, das die Sub stitution von Glutamin bei Rest 222 (Gln-222), wie sie in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 offenbart ist, betrachtet werden. Die Vielfachmutante wird somit durch die Substitution von Phenylalanin für Methionin bei Rest 50 und Isoleucin für Methionin bei Rest 124 in dem Gln-222 rekombinanten Subtilisin hergestellt.
"Eine funktionelle Promotorsequenz, die die Expression des Enzymgens operativ verbunden mit der Enzymgensequenz kontrolliert", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Promotorsequenz, die die Transkription und Translation der codierenden Sequenz in Bazillus kontrolliert. Die Promotorsequenz ist so ausgewählt, daß sie in dem zur Expression ausgewählten Mikroorganismus funktionell ist. Zum Beispiel kann eine Promotorsequenz (einschließlich ribosomaler Bindungsstellen), die aus Lambda P (Renaut et al., Gene 15, 81 [1981]) sowie aus dem trp (Russell et al., Gene 20, 23 (1982)) oder tac (de Boer et al., PNAS, USA 80, 21 [1983]) operativ verbunden sein mit codierenden Sequenzen, um alkalische Protease in E. coli zu exprimieren. Wenn B. subtilis I-168 der Expressionswirt ist, kann der B. subtilis alkalische Proteasepromotor (Stahl et al., J. Bacteriol. 158, 411- 418 [1984]), Alphaamylasepromotor von B. subtilis (Yang et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11, 237-249) oder B. aymloliquefaciens (Tarkinen et al., J. Biol. Chem. 258, 1007-1013 [1983]), der neutrale Proteasepromotor aus B. subtilis (Yang et al., J. Bacteriol., 160, 15-21 [1984]) oder jeder andere Promotor aus B. subtilis oder anderer verwandter Bazillen verwendet werden, deren Expression durch die beschriebenen stromaufwärts liegenden regulatorischen Gene beeinflußt wird. Der bevorzugte Promotor der Erfindung ist der aprE-Promotor. Auch bevorzugt ist der nprE-Promotor.
"Transkriptionsregulationgene" wie hierin verwendet, bezieht sich auf jedes der Gene, dessen Produkt die Ebene der Transkription des Enzympromotors beeinflußt. Diese Genprodukte können auf der Promotorebene interagieren (z. B. AbrB) oder mit einer Region stromaufwärts oder stromabwärts von dieser (z. B. Hpr, SacU, SacQ, PrtR, Sin) entweder direkt oder indirekt. Die oben genannte Definition umfaßt das Genprodukt oder das Fehlen dieses Genprodukts und jede mögliche Mutation, die die Transkriptionshöhe eines speziellen Promotors (z. B. viele Kopien) erhöhen kann. Diese Definition soll einschließen, aber nicht begrenzt sein auf bestimmte Mutationen in der Promotorregion, stromabwärts oder stromaufwärts der Promotorregion des Zielgens, was zu einem Anstieg in der Transkription aufgrund einer besseren Wechselwirkung oder dem Fehlen dieser mit den regulatorischen Genen oder mit der Transkriptionsmaschinerie (z. B. RNA-Polymerase, Mutationen, die die Produktion eines Genprodukts vermindern, welches mit der Transkription interferiert) führen kann. Diese Gene und die Wirkung ihrer Mutationen sind oben beschrieben. Diese spezifischen Kombinationen, welche die Anmelder gefunden haben, zeigen einen synergistischen Effekt, wenn sie mit den Ergebnissen verglichen werden, die aus jeder einzelnen Mutation alleine vorhergesagt werden.
Es scheint so, daß um das Enzym mit großer Höhe zu exprimieren und seine Expression wirkungsvoller unter der Kontrolle dieser regulatorischen Mutationen zu haben, der Promotor in dem Genom der Bazillus-Wirtszelle integriert sein muß oder vielleicht von einem Plasmid mit geringer Kopienzahl getragen werden muß. Mit hoher Kopienzahl replizierende Plasmide, die das Enzymgen tragen, scheinen nur schlecht in Stämmen toleriert zu werden, die einige der regulatorischen Mutationen tragen und sie gehen verloren oder werden mit einer sehr hohen Frequenz umgeordnet.
Es ist bevorzugt, daß das Gen, welches für das auf hohem Niveau zu exprimierende Enzym codiert, in das Genom der Bazilluswirtszelle integriert wird.
"Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA- Sequenz enthält, die operativ mit einer geeigneten Kontrollsequenz verbunden ist, die in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Derartige Kontrollsequenzen können einen Promotor einschließen, um eine Transkription zu bewirken oder gegebenenfalls eine Funktionssequenz ("operation sequence"), um diese Transkription zu kontrollieren, eine Sequenz, die für geeignete ribosomale Bindungsstellen ("ribosome binding sites") (RBS) codiert und Sequenzen, die die Termination der Transkription und Translation kontrollieren. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder ein mögliches genomisches Insert sein. Ist der Vektor einmal in einen geeigneten Wirt transformiert, kann er replizieren und unabhängig von dem Wirtsgen funktionieren oder er kann von sich aus in das Gen integrieren. Ein bevorzugter Vektor ist pSAI.
Bazilluswirtszellen für den Zweck dieser Erfindung sind solche Bazilluswirte, die in der Lage sind, den Expressionsvektor funktionell aufzunehmen. Vorzugsweise sind sie mittels Methoden verändert worden, die in der EPO- Veröffentlichung Nr. 0130756 offenbart sind, um sie nicht in die Lage zu versetzen, andere Enzyme zu sezernieren, die für das gewünschte Enzym schädlich sind. Eine bevorzugte Wirtszelle zur Expression von Subtilisin ist der B. subtilis Stamm BG 2036, dem enzymatisch aktive Neutralprotease und alkalische Protease (natives Subtilisin) fehlt. Die Konstruktion des Stamms BG 2036 ist ausführlich in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756 beschrieben und weiterhin beschrieben von Yang et al (1984), J. Bacteriol., 160, 15-21. Andere Wirtszellen zur Expression von Subtilisin schließen jedes Derivat von B. subtilis I-168 und jedes andere Mitglied der Bazillusfamilie ein, in dem solch ein System arbeitet (d. h. B. amyloliquefaciens und B. licheniformis (EPO-Veröffentlichung Nr. 0130756).
"Operativ verbunden" wie hierin verwendet, beschreibt die Beziehung zwischen zwei DNA-Regionen und bedeutet, daß sie funktionell miteinander verbunden sind. Zum Beispiel ist ein Promotor operativ verbunden mit der Gensequenz, die für eine alkalische Protease codiert, wenn er die Transkription der Sequenz korrekt kontrolliert.
Die folgenden Beispiele sollen nicht begrenzend sein. Ein Fachmann könnte andere Promotoren auswählen, andere Mutationen finden oder verwenden und andere Enzyme in Bazillus exprimieren. Man kann auch leicht sehen, daß ein Fachmann die Lehren der Beispiele mit allgemein verfügbaren Materialien wiederholen könnte. Entsprechend muß keiner der hierin verwendeten Stämme hinterlegt werden.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Clonierung des Subtilisingens

Das Subtilisingen aus B. amyloliquefaciens wurde wie beschrieben durch Wells et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 7911-7925 isoliert. Kurzum wurde partiell Sau3A verdaute chromosomale DNA aus B. amyloliquefaciens mit BamH1 verdautem pBS42 ligiert und verwendet, um E. coli zu transformieren. pBS42 ist ein Plasmidvektor, zusammengesetzt aus einem Replikationsursprung aus pUB110, welcher von B. subtilis erkannt wird, einem Replikationsursprung aus pBR322, welcher eine Replikation des Plasmids in E. coli erlaubt und einer Chlormphenicolacetyltransferase (CAT oder CmR) aus pC194, einem vollständig charakterisiertem Plasmid aus Staphilococcus aureus (Horinouchi und Weisblum, 1982), welches CmR sowohl in E. coli als auch in B. subtilis exprimieren kann. Synthetische DNA-Sonden, die von der bekannten Aminosäuresequenz des Subtilisin designed wurden, wurden verwendet, um ein Plasmid (p54) zu isolieren, das die DNA trägt, die für das Gen codiert. Das isolierte DNA- Fragment war in der Lage zur Subtilisinproduktion zu codieren, wenn es in B. subtilis überführt wurde und die translatierte DNA-Sequenz stimmte mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz der alkalischen Protease überein (Wells et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 7911-7925).
Ein Sau3A BamH1-Fragment aus pS4-5 (ein Derivat von p54), welches das Subtilisinstrukturgen aus dem achten Codon der Signalsequenz bis 250 bp nach dem 3'-Ende des Gens (alles B. amyloliquefaciens DNA) umfaßt, wurde mit einem 750 bp EcoR1-Sau3A-Fragment verbunden, welches den Promotor und die ersten acht Codons der translatierten Sequenz des B. subtilis Subtilisingens (Fig. 1) trägt. Das so konstruierte Gen, getragen in einem EcoR1-BamH1-Fragment, das nur Bazillus-DNA enthält, wurde in BamH1-EcoR1 verdauten pBS42 insertiert und führte zu Plasmid pSAR. Für dieses Plasmid wurde nachgewiesen, daß es in der Lage ist, Subtilisin in B. subtilis herzustellen.
Das EcoR1-BamH1-Fragment aus pSAR, welches den B. subtilis aprE- Promotor verbunden mit dem B. amyloliquefaciens Subtilisingen trug, wurde mit einem EcoR1-BamH1 verdauten pJH101 ligiert (Ferrari et al., Journal of Bacteriol., Vol. 154, Seiten 1513-1515). Das erhaltene Plasmid, welches in Escherichia coli aber nicht in B. subtilis replizieren kann, wurde pSA1 genannt. Nach Transformation in B. subtilis, gefolgt von Chloramphenicolselektion, wird dieses Plasmid in das Chromosom an der Homologiestelle mit dem aprE-Promotor integrieren.
Das CmR-Gen aus pC194, enthalten in einem 1,6 Kilobasen (Kb) CIaI- Fragment, wurde in CIaI verdauten pBR322 cloniert. Nach Verdau mit EcoR1 und HindIII wird dieses Plasmid das CmR-Resistenzgen, flankiert von wenigen Basenpaaren des pBR322-Ursprungs (siehe unten), freisetzen.
Gas EcoR1-BamH1-Fragment aus entweder pSAR oder pSAI, welche das Subtilisingen tragen, wurde in EcoR1-BamH1-Stellen der synthetischen Polylinkerregion von pUC9 subcloniert. Nach Verdau mit EcoR1 und HindIII wird dieses Plasmid ein 2,2 Kb-Fragment, welches das Subtilisingen, flankiert von einer Seite von 17 bp des synthetischen Linkers (Fig. 2), freisetzen.
Diese zwei EcoR1-HindIII-Fragmente wurden zusammenligiert und verwendet, um B. subtilis zu transformieren, wobei für CmR selektiert wird. Nach Transformation integriert dieses Plasmid in das Chromosom, wie durch PBS1-Transduktion (Fig. 3) gezeigt wurde. Das letztendliche Kon strukt in B. subtilis besteht aus 1,6 Kb aus pC194 und dem Subtilisingen, verbunden durch kurze Linkerregionen. Ein Linker setzt sich zusammen aus 20 bp von pUC9, und der andere besteht aus 17 bp aus pBR322, eingeschlossen zwischen den EcoR1- und den CIa1-Stellen.
Um einen Stamm zu erhalten, der hauptsächlich die Protease herstellt, an der wir interessiert sind, haben wir zwei Hauptproteasen, die in fast allen Bazillen enthalten sind (die alkalische Protease und die neutrale Protease) deletiert, wie beschrieben von Stahl und Ferrari (1984), J. Bacteriol., 158: 411-418 und Yang et al., (1984), J. Bacteriol., 160: 15-21. Das oben beschriebene Plasmid wurde dann in BG 2036 mittels Transformation und Selektion für CmR eingeführt. Dieses pSAI ähnliche Plasmid wird in das Chromosom in die Region der Homologie integrieren (wir waren niemals in der Lage, irgendwelche replizierenden Plasmide nachzuweisen), die durch den B. subtilis Subtilisinpromotor (Fig. 3) übertragen wurde. Southern-Blot- Analyse der chromosomalen DNA, die mit richtigen Restriktionsenzymen verdaut wurde und PBS1-Kartierungsexperimente bestätigten die Integration und die Gegenwart der Fragmente mit richtiger Größe.
Um eine Überproduktion zu erhalten, führten wir dann chromosomale Mutationen durch, von denen bekannt ist, daß sie den Pegel an sekretierten Enzymen erhöhen, entweder durch kompetente Zelltransformation oder PBS1-Transduktion. Beide Techniken werden üblicherweise für genetische Untersuchungen in B. subtilis verwendet. Der erhaltene Stamm ist ein prototrophes sporenbildendes Derivat von B. subtilis I-168 (Katalog Nr. 1- A1, Bacillus Genetic Stock Center), welches das B. amyloliquifaciens Subtilisingen und das CmR-Gen aus pC194 integriert in das Chromoson enthält.
Konstruktion von Hpr97-, ScoC-, Cat A-Stämmen: Alle hier beschriebenen Stammbildungen sind ausgeführt worden unter Verwendung von Standard B. subtilis genetischen Techniken. Die Transformationen wurden durch geführt gemäß dem Verfahren, welches von Anagnostopoulos und Spizizen beschrieben wurde (J. Bacteriol., 81: 741-746, 1961). Die Transduktion wurde durchgeführt unter Verwendung des Bakteriophagen PBS1, gemäß dem Verfahren, welches von Hoch et al. beschrieben wurde (J. Bacteriol., 93: 1925-1937, 1967). Das integrierende Plasmid pSAI wurde in den Stamm BG2907 (ein Stamm, der öffentlich zugänglich ist und Deletionen in den aprE- und nprE-Genen trägt) durch Transformation, um Stamm-BG3002 zu generieren. Aus BG3002 präparierte DNA wurde verwendet, um die Stämme IPCC 7698 (erhältlich von der Pasteuer Institute Culture Collection, Paris, Frankreich), 1A151 (erhältlich vom Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, Ohio) und Hpr97 (erhältlich von Dr. J. A. Hoch, Research Institute of Scripps Clinic, La Jolla, Kalifornien) zu transformieren, die die scoC&sub1;-, catA- bzw. hpr-97-Mutation für Chloramphenicolresistenz enthalten. Die resultierenden Chloramphenicol resistenten Stämme wurden auf Festmedium (Tryptoseblutagarbasisagar, TBAB) aufgebracht, das Magermilch zum Nachweis der Protease-Überproduktions-Charakteristik (aufgrund der Gegenwart der scoC-, catA- und hpr-Mutationen) des Elternstamms, enthielt. PBS-1-Lysate (siehe oben) wurden mittels veröffentlichter Standardtechnik (Hoch et al., 1967, siehe oben) von den ScoC-, CatA- und Hpr- Stämmen hergestellt, die das pSAI integrierende Plasmid tragen. Diese Lysate wurden verwendet, um Stamm BG2097 zu transduzieren. Diese Transduktionen führten das Subtilisingen ein, integriert in das Chromosom mit Plasmid pSAI in BG2097 und überführten auch die scoC- oder catA- oder hpr-Mutationen aufgrund ihrer Verbindung mit dem aprE-Gen (d. h. pSAI). Ungefähr 10 bis 20% der Chloramphenicol resistenten transduzierten Zellen zeigten eine höhere Menge an Proteaseproduktion, was darauf hinweist, daß diese Stämme tatsächlich den scoC- oder catA- oder hpr- überproduzierenden Phenotyp angenommen hatten.
Einige der transduzierten Zellen wurden auf Platten gescreent, die 1,6% Magermilch enthielten und mit BG3002 verglichen. Die transduzierten Zellen, die einen größeren Hof auf dieser Art von Platten hatten, wurden selektiert und die Stämme BG3008, BG3005 und BG3007 wurden erhalten. Der Genotyp dieser Stämme ist isogenisch (hisA, aprE, nprE, pSAI: :CmR) mit Ausnahme für das hpr-Gen, wo die Mutationen scoC1, catA bzw. hpr97 vorhanden waren. Wenn Vertreter dieser Transduktion in Schüttelflaschen unter Verwendung eines Nährstoffwuchsmediums untersucht wurden, produzierten sie ungefähr 19 bis 17 mg/l, Subtilisin oder 5-10-fach mehr als der Stamm, der die Überproduktionsmutation nicht enthielt.
Konstruktion von SacU(Hy) Stämme: Eine der Eigenschaften von SacU(Hy)- Stämmen ist, daß ihnen die Fähigkeit zur Bildung von Flagellen und beweglich zu werden, fehlt. Da PBS-1 sich an bewegliche Flagellen anheftet, ist es nicht möglich, ein PBS-1 wirksames Lysat auf SacU(Hy)-Stämmen herzustellen. Dieses Problem wurde umgangen durch die Isolierung einer Spontanmutante, die beweglich war und ihren Protease überproduzierenden Phenotyp beibehielt. Die Art der Mutation, die zu Beweglichkeit führt, ist unbekannt. Ein Lysat wurde aus dem beweglichen SacU(Hy)-Stamm hergestellt. Dieses Lysat wurde verwendet, um jeden BG3002 (Δ apr, Δ npr, hisA) zu transduzieren, der das pSAI-Plasmid für Histidinprototrophie enthielt. Da das sacU-Gen und das hisA-Gen durch Transduktion verbunden sind, wird von einem bestimmten Prozentsatz der transduzierten Zellen erwartet, daß sie das sacU(Hy)32-Gen enthalten. Der Prozentsatz dieser Mutation wurde auf Magermilchplatten nachgewiesen; ~90% der transduzierten Zellen zeigten den Überproduktionsphenotyp. Ein repräsentativer Stamm, der die sacU(Hy) Mutation enthält, produzierte 35 bis 45 mg/l, wenn er in Nährstoffwachstumsmedium kultiviert wurde. Dasselbe allgemeine Schema traf zu, wenn ein Stamm, der die scoC- oder catA-Mutation enthielt, mit einem PBS1-Lysat, hergestellt aus einem SacU(Hy)- Stamm, transduziert wurde. Stämme, die die socC (BG3008) und catA (BG3005) Mutationen enthielten, konnten erfolgreich zu sacU(Hy) transduziert werden. Die Stämme, die sowohl die sacU(Hy)32 und entweder die scoC- oder catA-Mutationen enthielten, zeigten eine größere klare Zone auf den Magermilchplatten als jeder der Stämme, die die individuellen Mutationen enthielten. Diese Stämme produzierten ungefähr 55 mg/l, in Nährstoffwachstumsmedium.
Konstruktion von SacQ(Hy)-Stämmen: Ein Lysat wurde hergestellt aus einem SacQ(Hy)-Stamm. Dieses Lysat wurde verwendet, um einen Stamm für Threoninprototrophie zu transduzieren. Wiederum wurde, da das thr-Gen und sacQ(Hy)-Gen durch Transduktion verbunden werden, für einen bestimmten Prozentsatz der Population erwartet, daß er das Überproduktions- sacQ(Hy)-Gen enthielt. Dieselbe Verfahrensweise wurde verwendet, um Stämme herzustellen, die entweder die sacQ(Hy)-Mutation alleine oder in Kombination mit entweder der scoC- oder catA-Mutation enthielt.
Konstruktion von Triple-Mutanten: Stämme, die die sacU(Hy)32, sacQ(Hy) und entweder die scoC- oder catA-Mutation enthielten, konnten unter Verwendung einer Kombination der obigen Verfahrensweisen konstruiert werden. Allgemein gesprochen wurde die catA/scoC-Mutation in einem Schritt mit dem Plasmid pSAI eingeführt, gefolgt durch die Transduktion der sacQ(Hy)-Mutation und schließlich wurde die sacU(Hy)-Mutation in den Stamm eingeführt.

Ergebnisse

Enzympegel Schüttelflaschen (Medium: Schaeffers Nährstoffmedium + 0,1% Glucse.)

Stamm (mq/I)

BG 3002 (Wildtyp) pSAI 0.5
BG 3004 sacU(Hy), pSM 40
sacU(Hy), pSAI, pBS7AS 36
BG 3005 catA, PSAI 2
BG 3006 catA, sacU(Hy), pSAI 56
BG 3007 hpr97, pSAI 10
BG 3008 scoC, pSAI 4
BG 3009 sacQ(Hy), pSAI 5
BG 3010 scoC, sacU(Hy), pSAI 60
BG 3013 sacQ(Hy), sacU(Hy), pSAI 30
BG 3015 catA, sacQ(Hy) 26
BG 3016 scoC, sacQ(Hy) 27
BG 3017 catA, sacQ(Hy), sacU(Hy), pSAI 55
BG 3020 scoC, sacQ(Hy), sacU(Hy), pSAI 89,61

Claims

1. Bazillus zur Verwendung bei der Überproduktion eines Enzyms umfassend:

(a) ein Enzymstrukturgen,

(b) eine funktionelle Promotorsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Bacillus aprE und nprE, worin der Promotor operativ mit dem Enzymstrukturgen verbunden ist, und

(c) eine Kombination aus zwei oder mehr mutierten Transkriptionsregulationsgenen, die bei der Transkriptionsregulation des Promotors beteiligt sind, wobei die Kombination ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer catA Mutation und einer sacQ(HY) Mutation, einer catA Mutation und einer sacU(HY) Mutation, einer scoC1 Mutation und einer sacQ(HY) Mutation, einer scoC1 Mutation und einer sacU(HY) Mutation; einer catA Mutation, einer sacQ Mutation und einer sacU Mutation; und einer scoC1 Mutation, einer sacQ Mutation und einer sacU Mutation.

2. Bazillus nach Anspruch 1, wobei das hergestellte Enzym Subtilisin ist.

3. Bazillus nach Anspruch 1, wobei das hergestellte Enzym Endoglycosidase H oder Lipase ist.

4. Bazillus nach Anspruch 1, wobei eine erhöhte Herstellung des Enzyms durch Überexpression der Transkriptionsregulationsgene erreicht wird.

5. Bazillus nach Anspruch 1, wobei die sacU(Hy) Mutation die sacU(Hy)32 Mutation ist.

6. Bazillus nach Anspruch 1, wobei die sacQ(Hy) Mutation die sacQ(Hy)36 Mutation ist.

7. Bazillus nach Anspruch 1, wobei das Enzymgen in das Genom der Wirtsbazilluszelle integriert ist.

8. Bazillus nach Anspruch 1, wobei die erhöhte Produktion des Enzyms durch Konstruieren des Bazillus mit einer Vielzahl von Kopien der Kombination der Transkriptionsregulationsgene erreicht wird.

9. Bazillus nach Anspruch 1, der von B. subtilis I-168 abgeleitet ist.

10. Verfahren zur Überproduktion eines Enzyms in Bazillus umfassend:

(a) Konstruieren eines Bazillus, umfassend ein Enzymstrukturgen, eine funktionelle Promotorsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus aprE und nprE, wobei der Promotor operativ mit dem Enzymstrukturgen verbunden ist und eine Kombination aus zwei oder mehr mutierten Transkriptionsregulationsgenen, die bei der Transkriptionsregulation des Promotors beteiligt sind, wobei die Kombination ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einer catA Mutation und einer sacQ(HY) Mutation, einer catA Mutation und einer sacU(HY) Mutation, einer scoC1 Mutation und einer sacQ(HY) Mutation, einer scoC1 Mutation und einer sacU(HY) Mutation; einer catA Mutation, einer sacQ Mutation und einer sacU Mutation; und einer scoC1 Mutation, einer sacQ Mutation und einer sacU Mutation; und

(b) Kultivieren des Bazillus in einem geeigneten Medium zur Expression des Enzyms.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Enzym aus der Gruppe, bestehend aus Subtilisin, Endoglycosidase H und Lipase ausgewählt wird.