DE69833652T2

DE69833652T2 - System zum exprimieren einer hyperthermostabilen protease

Info

Publication number: DE69833652T2
Application number: DE69833652T
Authority: DE
Inventors: Hikaru Takakura; Mio Morishita; Tomoko Shimojo; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-06-10
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2018-06-05
Also published as: KR20010013540A; CN1260002A; US7144719B2; EP0994191A4; ATE318913T1; US20050084934A1; CN1657614A; EP0994191B1; US6358726B1; DE69833652D1; JP3601835B2; WO1998056926A1; US6783970B2; TW530088B; US20020132335A1; EP0994191A1; CN1311075C; CN1190494C; AU7550098A; KR100530598B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine hyperthermostabile Protease, die als ein Enzym zur industriellen Verwendung geeignet ist, ein Gen, das diese kodiert und ein Verfahren zum Herstellen des Enzyms durch Gentechnik.
Technischer Hintergrund
Eine Protease ist ein Enzym, das Peptidbindungen in Proteinen spaltet. Eine Anzahl an solchen Enzymen ist in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen gefunden worden. Die Protease wird als ein Reagenz sowohl zur Verwendung im Labor als auch als ein Pharmazeutikum in industriellen Gebieten, zum Beispiel als ein Zusatz zu einem Detergenz, zur Lebensmittelverarbeitung und zur chemischen Synthese unter Verwendung einer reversen Reaktion verwendet. Daher kann gesagt werden, dass die Protease für die Industrie ein außerordentlich wichtiges Enzym ist. Da hohe physikalische und chemische Stabilität für eine Protease benötigt wird, die in industriellen Gebieten verwendet wird, wird bevorzugt ein thermostabiles Enzym gegenüber anderen verwendet. Da durch Bakterien der Gattung Bacillus hergestellte Proteasen relativ hohe Thermostabilität aufweisen, werden sie hauptsächlich als Proteasen für industrielle Verwendung verwendet. Jedoch wurden bei der Suche eines besseren Enzyms Versuche unternommen, ein Enzym von einem bei hohen Temperaturen wachsenden Organismus zu erhalten, z.B. einem thermophilen oder einem hyperthermophilen Bakterium der Gattung Bacillus.
Zum Beispiel ist das hyperthermophile Pyrococcus furiosus für die Herstellung einer Protease bekannt (Appl. Environ. Microbiol., 56:1992-1998 (1990); FEMS Microbiol. Letters, 71:17-20 (1990); J. Gen. Microbiol., 137:1193-1199 (1991)).
Zusätzlich wurde von dem hyperthermophilen Pyrococcus sp.-Stamm KOD1 berichtet, dass er eine Thiol-Protease (eine Cystein-Protease) herstellt (Appl. Environ. Microbiol., 60:4559-4566 (1994)). Hyperthermophile der Gattungen Thermococcus, Staphylothermus und Thermobacteroides sind auch für die Herstellung von Proteasen bekannt (Appl. Microbiol. Biotechnol., 34:715-719 (1991)).
Die Proteasen der Hyperthermophilen wie vorstehend beschrieben haben eine hohe Thermostabilität. Daher wird davon ausgegangen, dass sie anstelle der momentan verwendeten thermostabilen Proteasen oder in einem Gebiet verwendet werden können, in dem die Verwendung einer Protease nicht erwägt worden ist.
Jedoch wachsen die meisten der diese Enzyme herstellenden Mikroorganismen nur bei hoher Temperatur. Zum Beispiel muss Pyrococcus furiosus bei 90-100°C kultiviert werden. Kultivierung bei solch hoher Temperatur ist im Hinblick auf Energiekosten nachteilig. Des Weiteren sind die Leistungsfähigkeiten der Proteasen von den Hyperthermophilen geringer als die Leistungsfähigkeiten der herkömmlichen mikrobiellen Proteasen. Daher haben die Verfahren zur industriellen Herstellung der Proteasen von Hyperthermophilen Nachteile.
Im Übrigen ist die Herstellung eines Enzyms durch Gentechnik, durch Isolierung des Gens für das Enzym von Interesse und sein Einbringen in einen Wirtsorganismus, der leicht kultiviert werden kann, momentan in der Technik üblich. Jedoch wird das in den Wirt eingebrachte Gen des Enzyms nicht immer so effizient exprimiert wie erwartet. Es wird angenommen, dass der Hauptgrund dafür ist, dass der GC-Gehalt oder die Codon-Verwendung des eingebrachten Gens von denen der Gene des Wirtes unterschiedlich ist. Daher ist es notwendig, das Expressionsverfahren für jedes einzubringende Gen und/oder jeden Wirt zu optimieren, um eine geeignete Leistungsfähigkeit eines Enzyms für die beabsichtigte Verwendung zu erreichen.
Aufgaben der Erfindung
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind die Bereitstellung einer Protease von einem Hyperthermophilen, die vorteilhaft für die industrielle Verwendung ist, die Isolierung eines Gens, das die Protease des Hyperthermophilen kodiert, und die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der hyperthermostabilen Protease unter Verwendung des Gens durch Gentechnik, um die vorstehend beschriebenen Probleme zu lösen.
Zusammenfassung der Erfindung
Unter den durch Hyperthermophile hergestellten Proteasen können einige als Subtilisin-Typ der alkalischen Proteasen basierend auf der Aminosäure-Sequenzhomologie klassifiziert werden. Wenn ein Gen für solch eine Protease in Bacillus subtilis eingeführt wird, das im Allgemeinen zur Herstellung durch Gentechnik verwendet wird, ist die Leistungsfähigkeit dieses Enzyms deutlich geringer als die eines von Natur aus von Bacillus subtilis hergestellten Proteins.
Die Erfinder haben nach intensiven Studien herausgefunden, dass durch Platzieren eines für ein Signalpeptid kodierenden Gens (Signalsequenz), abgeleitet von einem Subtilisin, upstream eines zu exprimierenden Protease-Gens, abgeleitet von einem Hyperthermophilen, und durch Modifizieren der Aminosäure-Sequenz um die Spaltstelle, das Gen von Interesse in Bacillus subtilis mit hoher Effizienz exprimiert wird. Des Weiteren ist herausgefunden worden, dass der Expressionsgrad des Enzyms durch Entfernen eines Teils, der nicht essentiell für die enzymatische Aktivität ist, im Protease-Gen, abgeleitet vom Hyperthermophilen von Interesse, erhöht werden kann. Folglich ist die vorliegende Erfindung vollständig ausgeführt worden.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden umrissen.
Der erste Gegenstand der Erfindung ist eine Protease, die aus einer Aminosäuresequenz besteht, in der ein oder mehrere Aminosäurereste vom C-Terminus der Aminosäuresequenz, dargestellt durch die SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls, entfernt worden sind, und die eine thermostabile Protease-Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform des ersten Gegenstands der Erfindung besteht die Protease aus der Aminosäuresequenz, dargestellt durch die SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls.
Der zweite Gegenstand der Erfindung ist ein Gen, das für ein Protein kodiert, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, in der ein oder mehrere Aminosäurereste vom C-Terminus der Aminosäuresequenz, dargestellt durch die SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls, entfernt worden sind, und das eine thermostabile Protease-Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform des zweiten Gegenstands der Erfindung kodiert das Protease-Gen die Aminosäuresequenz, dargestellt durch die SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls.
In einer zweiten Ausführungsform besteht das Protease-Gen aus der Basensequenz, dargestellt durch die SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls.
Der dritte Gegenstand der Erfindung ist ein Protease-Gen, das mit dem Protease-Gen gemäß der zweiten Ausführungsform des zweiten Gegenstands der Erfindung unter Bedingungen hybridisiert, die durch 6×SSC mit 0,5% SDS, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Ficoll 400, 0,01% denaturierte Lachs-Sperma-DNA bei 50°C definiert sind, und das ein Protein mit einer thermostabilen Protease-Aktivität kodiert.
Der vierte Gegenstand der Erfindung ist ein Gen, das eine Aminosäuresequenz kodiert, dargestellt durch Formel I: SIG-Ala-Gly-Gly-Asn-PRO, wobei SIG eine Aminosäuresequenz eines Signalpeptids, abgeleitet von einem Subtilisin, darstellt und PRO die Aminosäuresequenz der Protease gemäß des ersten Gegenstands der Erfindung umfasst.
Der fünfte Gegenstand der Erfindung ist ein Plasmid-Vektor, der das Gen gemäß dem vierten Gegenstand der Erfindung umfasst.
In einer Ausführungsform des fünften Gegenstands der Erfindung ist der Plasmid-Vektor pSPO124ΔC (FERM BP-6294).
Der sechste Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das die Kultivierung eines Bakteriums der Gattung Bacillus, in welches der Plasmid-Vektor gemäß des fünften Gegenstands der Erfindung eingeführt ist, und die Isolierung des Proteins von Interesse aus der Kultur umfasst.
In einer Ausführungsform des sechsten Gegenstands der Erfindung ist das Bakterium der Gattung Bacillus Bacillus subtilis.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Plasmid pSPO124 Δ C (FERM BP-6294) in das Bakterium der Gattung Bacillus eingeführt.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Kultivierung von Bacillus subtilis DB104/pSPO124 Δ C FERM BP-6294 und das Isolieren des Proteins von Interesse aus der Kultur.
Eine Mutation wie Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von einem bis einigen Aminosäureresten in einer Aminosäuresequenz kann in einem natürlich vorkommenden Protein einschließlich des durch die vorliegende Erfindung offenbarten Proteins gebildet werden. Solch eine Mutation kann aufgrund eines Polymorphismus oder einer Mutation des das Protein kodierenden Gens gebildet werden oder sie kann aufgrund einer Modifikation des Proteins in vivo oder während Reinigung nach der Synthese geschehen. Dennoch ist es bekannt, dass solch ein mutiertes Protein physiologische und biologische Aktivitäten aufweisen kann, die äquivalent zu denen eines Proteins ohne eine Mutation sind. Dies ist auf ein Protein anwendbar, in das solch eine Mutation künstlich in seine Aminosäuresequenz eingeführt wird. In diesem Fall ist es möglich, eine große Vielfalt an Mutationen zu bilden. Zum Beispiel ist bekannt, dass ein Polypeptid, in dem ein Cystein-Rest in der Aminosäuresequenz des humanen Interleukin-2 (IL-2) durch einen Serin-Rest ersetzt wird, eine Interleukin-2-Aktivität beibehält (Science, 224:1431 (1984)). Folglich kann eine Protease mit einer Aminosäuresequenz, in der ein oder mehrere Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz, offenbart durch die vorliegende Erfindung, deletiert, substituiert, insertiert oder addiert sind, und mit einer Protease-Aktivität, die äquivalent zu der der erfindungsgemäßen Protease ist, gebildet werden.
Soweit hierin verwendet ist "ein Gen, das (mit einem bestimmten Gen) hybridisiert", ein Gen mit einer Basensequenz ähnlich zu der des bestimmten Gens. Es ist wahrscheinlich, dass ein Gen mit einer Basensequenz ähnlich zu der eines bestimmten Gens ein Protein kodiert mit einer Aminosäuresequenz und einer Funktion ähnlich zu denen des durch das bestimmte Gen kodierten Proteins. Ähnlichkeiten von Basensequenzen von Genen können durch die Bestimmung untersucht werden, ob die Gene oder Teile davon ein Hybrid miteinander unter stringenten Bedingungen bilden (hybridisieren) oder nicht. Durch Ausnutzung dieses Verfahrens kann ein Gen erhalten werden, das ein Protein kodiert mit einer ähnlichen Funktion wie der des durch das bestimmte Gen kodierten Proteins. Das heißt, dass ein Gen mit einer zu der des Gens der vorliegenden Erfindung ähnlichen Basensequenz durch Verwendung des durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Gens oder einem Teil davon als eine Sonde zum Ausführen einer Hybridisierung gemäß eines bekannten Verfah rens erhalten werden kann. Hybridisierung kann gemäß des Verfahrens ausgeführt werden, z.B. wie beschrieben in T. Maniatis et al., Hrsg., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Insbesondere kann Hybridisierung unter den folgenden Bedingungen ausgeführt werden. Kurz zusammengefasst wird eine Membran, auf die DNAs immobilisiert worden sind, in 6×SSC (1×SSC bedeutet 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) mit 0,5% SDS, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Ficoll 400, 0,01% denaturierter Lachs-Sperma-DNA bei 50°C für 12-20 Stunden mit einer Sonde inkubiert. Nach Inkubation wird die Membran gewaschen, bis die Signale für die immobilisierten DNAs vom Hintergrund unterschieden werden können, angefangen mit Waschen in 2×SSC mit 0,5% SDS bei 37°C unter Verringerung der SSC-Konzentration bis 0,1x und Erhöhung der Temperatur bis 50°C.
Alternativ kann anstatt der Hybridisierung ein Gen-Vervielfältigungsverfahren (z.B. ein PCR-Verfahren) verwendet werden, das Teile der Basensequenz des durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Gens als Primer einsetzt. Ob das dadurch erhaltene Gen ein Protein mit der Funktion von Interesse kodiert oder nicht, kann durch Expression des Gens unter Verwendung eines geeigneten Wirts und eines geeigneten Expressionssystems und Untersuchung der Aktivität des erhaltenen Proteins bestimmt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pSTC3.
2 vergleicht die Aminosäuresequenzen der Protease PFUS, der Protease TCES und eines Subtilisins.
3 vergleicht die Aminosäuresequenzen der Protease PFUS, der Protease TCES und eines Subtilisins.
4 vergleicht die Aminosäuresequenzen der Protease PFUS, der Protease TCES und eines Subtilisins.
5 vergleicht die Aminosäuresequenzen der Protease PFUS, der Protease TCES und eines Subtilisins.
6 ist die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pSNP1.
7 ist die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pPS1.
8 ist die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pNAPS1.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäße hyperthermostabile Protease umfasst Proteasen von verschiedenen Hyperthermophilen. Zum Beispiel beschreibt WO 95/34645 Proteasen von Pyrococcus furiosus und Thermococcus celer.
Ein Protease-Gen von Pyrococcus furiosus DSM3638 wurde aus einer genomischen DNA-Bibliothek des Stamms basierend auf der Expression einer thermostabilen Protease-Aktivität isoliert. Ein dieses Gen enthaltendes Plasmid wird als Plasmid pTPR12 bezeichnet. Mit diesem Plasmid transformiertes Escherichia coli JM109 wird bezeichnet und gekennzeichnet als Escherichia coli JM109/pTPR12 und wurde am 24. Mai 1994 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) gemäß dem Budapester Vertrag am Nationalen Institut für Biowissenschaft und Humantechnologie, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-5103 hinterlegt.
Diese Protease wird hierin nachstehend als Protease PFUL bezeichnet. Protease PFUL ist eine Protease mit hoher Thermostabilität und weist eine Protease-Aktivität sogar bei 95°C auf.
Die Basensequenz des von Pyrococcus furiosus abgeleiteten DNA-Fragments, eingefügt in das Plasmid pTPR12, ist bestimmt worden. Die Basensequenz des etwa 4,8 kb großen, von zwei DraI-Schnittstellen flankierten Teils des in das Plasmid pTPR12 eingefügten DNA-Fragments ist in der SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls gezeigt. Des Weiteren ist die Aminosäuresequenz des von dieser Basensequenz abgeleiteten Genprodukts in der SEQ ID NO:6 des Sequenzprotokolls gezeigt. Mit anderen Worten ist die in der SEQ ID NO:6 des Sequenzprotokolls gezeigte Aminosäuresequenz, die Aminosäuresequenz der Protease PFUL. Wie in der Sequenz gezeigt besteht die Protease PFUL aus 1398 Aminosäureresten und ist eine Protease mit einem hohen Molekulargewicht von über 150 000.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz der Protease PFUL, wie gezeigt in SEQ ID NO:6 des Sequenzprotokolls, mit bekannten Aminosäuresequenzen von Proteasen von Mikroorganismen hat gezeigt, dass die Aminosäuresequenz der ersten Hälfte der Protease PFUL homolog zu denen einer Reihe von alkalischen Serin-Proteasen ist, dargestellt durch ein Subtilisin (Protein Engineering, 4:719-737 (1991)). Es gibt eine extrem hohe Homologie um die vier Aminosäurereste, von denen angenommen wird, dass sie wichtig für die katalytische Aktivität der Protease sind.
Wie vorstehend beschrieben ist herausgefunden worden, dass eine unter Proteasen abgeleitet von Mesophilen gemeinsame Region in der Aminosäuresequenz der Protease PFUL, hergestellt durch ein hyperthermophiles Pyrococcus furiosus, konserviert ist. Daher wird davon ausgegangen, dass eine durch ein anderes Hyperthermophil als Pyrococcus furiosus hergestellte Protease ebenfalls diese Region aufweist.
Zum Beispiel kann ein Gen für eine hyperthermostabile Protease mittels Durchführung einer PCR unter Verwendung einer chromosomalen DNA von verschiedenen Hyperthermophilen als ein Template und der Oligonukleotide PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R und PRO-4R in Kombination als Primer gescreent werden. Diese Oligonukleotide werden basierend auf der Basensequenz im Gen der Protease PFUL synthetisiert, die eine Region in der Aminosäuresequenz der Protease PFUL kodiert, die hohe Homologie mit Subtilisinen oder dergleichen aufweist. Die Basensequenzen der Oligonukleotide PRO-1F, PRO-2F, PRO-2R und PRO-4R sind in den SEQ ID NOs: 7, 8, 9 bzw. 10 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Als ein Hyperthermophil, von dem die erfindungsgemäße Protease abgeleitet ist, kann ein Bakterium verwendet werden, das zur Gattung Pyrococcus, Thermococcus, Staphylothermus, Thermobacteroides und dergleichen gehört. Als ein Bakterium, das zur Gattung Thermococcus gehört, kann z.B. Thermococcus celer DSM2476 verwendet werden. Dieser Stamm ist von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH erhältlich. Bei Durchführung einer PCR unter Verwendung einer chromosomalen DNA von Thermococcus celer DSM2476 als ein Template und einer Kombination der Oligonukleotide PRO-1F und PRO-2R oder der Oligonukleotide PRO-2F und PRO-4R als Primer werden spezifische DNA-Fragmente amplifiziert, was die Anwesenheit eines Protease-Gens anzeigt. Des weiteren können durch Herstellung rekombinanter Plasmide, in denen die DNA-Fragmente in einen geeigneten Plasmid-Vektor eingefügt sind, und Bestimmung der Basensequenzen der eingefügten DNA-Fragmente durch ein Didesoxy-Verfahren, die durch die Fragmente kodierten Aminosäuresequenzen abgeleitet werden. Als Ergebnis ist es erwiesen, dass solche DNA-Fragmente eine Aminosäuresequenz kodieren, die homolog zu den Aminosäuresequenzen der Protease PFUL und alkalischer Serinproteasen von verschiedenen Mikroorganismen ist, und dass die PCR-amplifizierten DNA-Fragmente von einem Protease-Gen als ein Template amplifiziert wurden.
Als nächstes kann ein Gen für eine hyperthermostabile Protease (zum Beispiel ein Gen für eine hyperthermostabile Protease hergestellt durch Thermococcus celer) durch Screenen einer Gen-Bibliothek von einem Hyperthermophilen unter Verwendung des PCR-amplifizierten DNA-Fragments oder des Oligonukleotids wie vorstehend beschrieben als eine Sonde erhalten werden.
Zum Beispiel kann ein das Gen von Interesse enthaltender Phagen-Klon mittels Durchführen einer Plaque-Hybridisierung gegen eine Bibliothek unter Verwendung des PCR-amplifizierten DNA-Fragments als eine Sonde erhalten werden. Solch eine Bibliothek wird durch Ligation von lambda-GEM-11-Vektor (Promega) und DNA-Fragmenten, die aus einem teilweisen Verdau der chromosomalen DNA von Thermococcus celer DSM2476 mit dem Restriktionsenzym Sau3AI erhalten wurden, und dann durch Verpackung von diesen in lambda-Phagenpartikel mittels eines in vitro-Verpackungsverfahrens gebildet.
Es ist durch Analyse eines DNA-Fragments, das in einem so erhaltenen Phagen-Klons enthalten ist, herausgefunden worden, dass ein Protease-Gen in einem SacI-Fragment von etwa 1,9 kb enthalten ist. Des weiteren ist durch Bestimmung seiner Basensequenz herausgefunden worden, dass diesem Fragment die 5'-Region des Protease-Gens fehlt. Die 5'-Region kann durch PCR unter Verwendung einer Kassette und von Kassettenprimern erhalten werden (Takara Shuzo Gene Technology Product Guide, 1994-1995, Seiten 250-251). Folglich kann ein DNA-Fragment erhalten werden, das die 5'-Region des Gens der hypothermostabilen Protease umfasst, die in dem Plasmid pTCS6 nicht vorhanden ist. Des weiteren kann die Basensequenz des gesamten Gens der hyperthermostabilen Protease abgeleitet von Thermococcus celer aus den Basensequenzen der zwei DNA-Fragmente bestimmt werden.
Die Basensequenz eines in der bestimmten Basensequenz gefundenen offenen Leserahmens ist in der SEQ ID NO:11 des Sequenzprotokolls gezeigt, und die von die ser Basensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NO:12 des Sequenzprotokolls gezeigt. Die Basensequenz des Gens, das die hyperthermostabile Protease von Thermococcus celer kodiert, und die Aminosäuresequenz der Protease wurden daher bestimmt. Diese Protease wird als Protease TCES bezeichnet.
Ein Expressionsvektor, in dem das gesamte Gen der Protease TCES durch Kombinieren der zwei DNA-Fragmente wiederhergestellt worden ist, kann konstruiert werden. Als jedoch Escherichia coli als Wirt verwendet wurde, wurden keine Transformanten erhalten, in die das Expressionsplasmid von Interesse eingeführt worden war, wahrscheinlich weil die Bildung des von dem Gen exprimierten Produkts in Zellen schädlich oder tödlich für Escherichia coli sein kann. In solch einem Fall ist es z.B. möglich, Bacillus subtilis als Wirt für eine extrazelluläre Sekretion der Protease zu verwenden und die Aktivität zu bestimmen.
Als ein Bacillus subtilis-Stamm kann Bacillus subtilis DB 104 verwendet werden, der ein bekannter Stamm ist wie beschrieben in Gene, 83:215-233 (1989). Als ein Klonierungsvektor kann das Plasmid pUB 18-P43 verwendet werden, das ein Geschenk von Dr. Sui-Lam Wong, University of Calgary, ist. Das Plasmid enthält ein Kanamycin-Resistenzgen als einen selektierbaren Marker.
Ein rekombinantes Plasmid, in dem das Gen der Protease TCES downstream des Promoters P43 in dem Plasmid-Vektor pUB 18-P43 eingefügt ist, wird als Plasmid pSTC3 bezeichnet. Mit diesem Plasmid transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wird bezeichnet und gekennzeichnet als Bacillus subtilis DB 104/pSTC3 und wurde am 1. Dezember 1995 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) gemäß dem Budapester Vertag am Nationalen Institut für Biowissenschaft und Humantechnologie, Amt für Industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-5635 hinterlegt.
Die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pSTC3 ist in 1 gezeigt. In 1 kennzeichnet die breite Linie das DNA-Fragment, das in den Plasmid-Vektor pUB 18-P43 eingefügt worden ist.
Eine thermostabile Protease-Aktivität ist sowohl im Überstand als auch im Zellextrakt der Kultur von Bacillus subtilis DB104/pSTC3 gefunden worden.
Die Haupteigenschaften einer ungereinigten Enzym-Präparation der Protease erhalten von der Kultur des Transformanten sind wie folgt.
(1) Aktivität:
Baut Casein und Gelatine unter Bildung kurzkettiger Polypeptide ab.
Hydrolysiert Succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosin-4-methylcoumarin-7-amid (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA) unter Bildung einer fluoreszierenden Substanz (7-Amino-4-methylcoumarin).
Hydrolysiert Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanin-p-nitroanilid (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA) unter Bildung einer gelben Substanz (p-Nitroanilin).
(2) Optimale Temperatur:
Weist eine enzymatische Aktivität bei 37-95°C mit der optimalen Temperatur bei 70-80°C auf.
(3) Optimaler pH:
Weist eine enzymatische Aktivität bei pH 5,5-9 mit dem optimalen pH bei pH 7-8 auf.
(4) Thermostabilität:
Behält 90% oder mehr von ihrer enzymatischen Aktivität nach Behandlung bei 80°C für 3 Stunden.
Beim Abgleich der Aminosäuresequenzen der Protease PFUL, der Protease TCES und eines Subtilisins (Subtilisin BNP'; Nucl. Acids Res., 11:7911-7925 (1983)), so dass homologe Regionen sich zueinander anordnen wie gezeigt in 2-5, wurde herausgefunden, dass am C-Terminus und zwischen den homologen Regionen der Protease PFUL Sequenzen liegen, die nicht in der Protease TCES oder dem Subtilisin gefunden werden. Nach diesen Ergebnissen kann eine Protease mit einem Molekulargewicht geringer als das der Protease PFUL und ähnlich zu dem der Protease TCES oder von Subtilisinen in Pyrococcus furiosus zusätzlich zur Protease PFUL vorkommen.
Daraufhin wurde eine Southern-Hybridisierung gegen eine chromosomale DNA hergestellt aus Pyrococcus furiosus unter Verwendung einer DNA-Sonde aus der homologen Region durchgeführt. Es wurde ein Signal beobachtet, das unterschiedlich von dem für das Gen der Protease PFUL war, was auf die Existenz eines anderen Protease-Gens hinweist.
Dieses neue Protease-Gen kann durch das folgende Verfahren isoliert werden.
Zum Beispiel wird ein DNA-Fragment, das ein für die neue Protease kodierendes Gen enthält, durch Verdau einer chromosomalen DNA von Pyrococcus furiosus mit einem geeigneten Restriktionsenzym und Durchführung einer Southern-Hybridisierung gegen die verdaute DNA wie vorstehend beschrieben erhalten. Die Basensequenz des DNA-Fragments wird bestimmt, um zu bestätigen, dass die Basensequenz eine Aminosäuresequenz kodiert, die homolog zu der vorstehend genannten Protease ist. Wenn das DNA-Fragment nicht das gesamte Gen von Interesse enthält, wird der restliche Teil des weiteren durch ein inverses PCR-Verfahren oder dergleichen erhalten.
Wenn zum Beispiel eine chromosomale DNA von Pyrococcus furiosus mit den Restriktionsenzymen SacI und SpeI (Takara Shuzo) verdaut und für eine Southern-Hybridisierung verwendet wird, wird ein Signal mit einer Größe von etwa 0,6 kb beobachtet. DNA-Fragmente dieser Größe werden isoliert und zwischen die SpeI-SacI-Stellen in den Plasmid-Vektor pBluescript SK(–) (Stratagene) eingefügt, und Escherichia coli JM 109 wird mit den erhaltenen rekombinanten Plasmiden transformiert. Ein Klon, in den das Fragment von Interesse eingebaut worden ist, kann von den Transformanten durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung der gleichen Sonde wie die, die für die Southern-Hybridisierung wie vorstehend beschrieben verwendet wurde, erhalten werden. Ob das in den erhaltenen Klonen enthaltene Plasmid die Sequenz hat, die die Protease kodiert oder nicht, kann durch Bestimmung der Basensequenz des DNA-Fragments, das in das Plasmid eingefügt worden ist, bestätigt werden. Die Anwesenheit des Protease-Gens in dem Plasmid wurde dadurch bestätigt. Dieses Plasmid wird als das Plasmid pSS3 bezeichnet.
Es ist herausgefunden worden, dass die Aminosäuresequenz, die von der Basensequenz des in das Plasmid pSS3 eingefügten DNA-Fragments abgeleitet worden ist, Homologie mit Sequenzen von Subtilisinen, der Protease PFUL, der Protease TCES und dergleichen hat. Das Produkt des von dem Gen der Protease PFUL unterschied lichen Protease-Gens, von dem ein Teil neu von Pyrococcus furiosus wie vorstehend beschrieben erhalten worden war, wird als Protease PFUS bezeichnet. Die Regionen, die die N-terminalen und C-terminalen Regionen der Protease kodieren, können durch ein inverses PCR-Verfahren erhalten werden.
Für eine inverse PCR verwendete Primer können basierend auf der Basensequenz des DNA-Fragments, das in das Plasmid pSS3 eingefügt worden ist, hergestellt werden. Eine chromosomale DNA von Pyrococcus furiosus wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und die erhaltenen DNA-Fragmente werden dann einer intramolekularen Ligationsreaktion unterworfen. Durch Durchführung einer PCR unter Verwendung des Reaktionsgemisches als Template und der vorstehend genannten Primer können DNA-Fragmente erhalten werden, die den Regionen entsprechen, die das Fragment des Protease-Gens flankieren, das in dem Plasmid pSS3 enthalten ist. Die Aminosäuresequenz des durch diese Regionen kodierten Enzymproteins kann durch Analyse der Basensequenzen der so erhaltenen DNA-Fragmente abgeleitet werden. Des weiteren können Primer hergestellt werden, die zur Amplifikation des gesamten Gens der Protease PFUS unter Verwendung einer chromosomalen DNA von Pyrococcus furiosus als Template imstande sind. Die Primer NPF-4 und NPR-4 können entworfen werden. Der Primer NPF-4 hat die Basensequenz, die direkt upstream des Anfangscodons des Gens der Protease PFUS liegt, und kann eine BamHI-Schnittstelle 5' zu der Sequenz einfügen. Der Primer NPR-4 hat eine Sequenz, die komplementär zu dem 3'-Teil des Gens der Protease PFUS ist, und kann eine SphI-Schnittstelle 5' zu der Sequenz einfügen.
Die Basensequenzen der Primer NPF-4 und NPR-4 sind in den SEQ ID NOs: 13 und 14 des Sequenzprotokolls gezeigt. Diese zwei Primer können zur Amplifikation des gesamten Gens der Protease PFUS unter Verwendung einer chromosomalen DNA von Pyrococcus furiosus als Template verwendet werden.
Wie die Protease TCES kann die Protease PFUS in Bacillus subtilis als Wirt exprimiert werden. Ein Plasmid zur Expression der Protease PFUS kann basierend auf dem Expressionsplasmid für die Protease TCES, pSTC3, hergestellt werden. Insbesondere kann ein Plasmid zur Expression der Protease PFUS durch Ersetzen des Gens der Protease TCES im Plasmid pSTC3 mit dem DNA-Fragment, das das gesamte Gen der Protease PFUS enthält und durch PCR mit den Primern wie vorstehend beschrieben amplifiziert worden ist, hergestellt werden. Das so hergestellte Expressionsplasmid wird als das Plasmid pSNP1 bezeichnet. Mit diesem Plasmid transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wird bezeichnet und gekennzeichnet als Bacillus subtilis DB104/pSNP1 und wurde am 1. Dezember 1995 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) gemäß dem Budapester Vertrag am Nationalen Institut für Biowissenschaft und Humantechnologie, Amt für Industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-5634 hinterlegt. Die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pSNP1 ist in 6 gezeigt.
Die Basensequenz, die einem offenen Leserahmen in dem für die Protease PFUS kodierenden Gen entspricht, und die Aminosäuresequenz der Protease PFUS, die von der Basensequenz abgeleitet ist, sind in den SEQ ID NOs: 15 bzw. 16 des Sequenzprotokolls bezeichnet.
Eine thermostabile Protease-Aktivität wurde sowohl in dem Überstand als auch in dem Zellextrakt der Kultur von Bacillus subtilis DB104/pSNP1 gefunden. Das heißt, dass ein Teil der exprimierten Protease PFUS in den Überstand der Kultur sekretiert wird.
Die Haupteigenschaften der Protease, die aus der Kultur des Transformanten erhalten worden ist, sind wie folgt.
(1) Aktivität:
Baut Casein und Gelatine unter Bildung kurzkettiger Polypeptide ab.
Hydrolysiert Succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosin-4-methylcoumarin-7-amid (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA) unter Bildung einer fluoreszierenden Substanz (7-Amino-4-methylcoumarin).
Hydrolysiert Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanin-p-nitroanild (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA) unter Bildung einer gelben Substanz (p-Nitroanilin).
(2) Optimale Temperatur:
Weist eine enzymatische Aktivität bei 40-110°C mit der optimalen Temperatur von 80-95°C auf.
(3) Optimaler pH:
Weist eine enzymatische Aktivität bei pH 5-10 mit dem optimalen pH bei pH 6-8 auf.
(4) Thermostabilität:
Behält 90% oder mehr von ihrer enzymatischen Aktivität nach Behandlung bei 95°C für 8 Stunden.
(5) pH-Stabilität:
Behält 95% oder mehr von ihrer Aktivität nach Behandlung bei pH 5-11 bei 95°C für 60 Minuten.
(6) Molekulargewicht:
Weist ein Molekulargewicht von etwa 45 kDa auf einer SDS-PAGE auf.
Protease-Gene, die homolog zu dem Gen der Protease TCES und dem Gen der Protease PFUS sind, können aus anderen Hyperthermophilen als Pyrococcus furiosus und Thermococcus celer unter Verwendung eines Verfahrens erhalten werden, das ähnlich zu dem ist, das zum Erhalten des Gens der Protease TCES und des Gens der Protease PFUS verwendet worden ist.
Ein DNA-Fragment von etwa 1 kb, das eine Sequenz von dem Rest an Position 323 zu dem Rest an Position 650 der Aminosäure-Sequenz der Protease PFUL wie in SEQ ID NO:6 des Sequenzprotokolls gezeigt kodiert, kann hergestellt werden und als eine Sonde für eine genomische Southern-Hybridisierung gegen chromosomale DNAs von Staphylothermus marinus DSM3639 und Thermobacteroides proteoliticus DSM 5265 verwendet werden. Als ein Ergebnis werden Signale an der Position von etwa 4,8 kb für die mit PstI (Takara Shuzo) verdaute chromosomale DNA von Staphylothermus marinus und an der Position von etwa 3,5 kb für die mit XbaI verdaute chromosomale DNA von Thermobacteroides proteoliticus beobachtet.
Mit diesen Ergebnissen wurde bewiesen, dass es Sequenzen auf den chromosomalen DNAs von Staphylothermus marinus und Thermobacteroides proteoliticus gibt, die homolog zu denen der Gene der Protease PFUL, der Protease PFUS, der Protease TCES und dergleichen sind. Die die hyperthermostabilen Proteasen kodierenden Gene in Staphylothermus marinus und Thermobacteroides proteoliticus können von den so detektierten DNA-Fragmenten durch Verwenden eines Verfahrens isoliert und identifiziert werden, das zur Isolierung und Identifizierung der die Protease TCES und die Protease PFUS kodierenden Gene verwendet wurde.
Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass die Verwendung eines Promotors, der wirksam in einem Wirt arbeitet, vorteilhaft gegenüber einem Promotor, der inhärent mit dem das Protein von Interesse kodierenden Gen assoziiert ist, zur Herstellung eines Proteins in einer großen Menge durch Gentechnik sein würde. Obwohl der P43-Promotor, der zur Herstellung der Expressionssysteme für die Protease TCES und die Protease PFUS verwendet wurde, ein von Bacillus subtilis abgeleiteter Promotor ist, war er für die Expression der zwei Proteasen nicht ausreichend wirksam.
Daher kann ein Gen, das zu einem hohen Grad in Bacillus subtilis exprimiert wird, insbesondere ein Gen für ein sekretiertes Protein, zur Erhöhung des Expressionsgrads verwendet werden. Gene für α-Amylase oder verschiedene extrazelluläre Proteasen können verwendet werden. Zum Beispiel wird erwartet, dass die Verwendung eines Promotors und einer Signalpeptid-kodierenden Region eines Subtilisin-Gens den Expressionsgrad der Protease PFUS erhöhen kann.
Insbesondere kann die Protease PFUS als ein Fusionsprotein unter Kontrolle des Promotors des Subtilisin-Gens durch Platzieren des gesamten Gens der Protease PFUS downstream der Region, die das Signalpeptid des Subtilisin-Gens kodiert, einschließlich der Promotorregion exprimiert werden, so dass die Translationsrahmen der zwei Gene übereinstimmen.
Zum Beispiel kann das Gen, das Subtilisin E kodiert, als das erfindungsgemäß verwendete Subtilisin-Gen verwendet werden. Der Promotor und die Signalpeptid-kodierende Region des Subtilisin E-Gens, die in das Plasmid pKWZ wie beschrieben in J. Bacteriol., 171:2657-2665 (1989) eingefügt worden sind, können verwendet werden. Die Basensequenz der 5'-upstream-Region einschließlich der Promotorsequenz ist in der Referenz (supra) beschrieben und die Basensequenz der Region, die Subtilisin kodiert, ist in J. Bacteriol., 158:411-418 (1984) beschrieben.
Basierend auf diesen Sequenzen werden der Primer SUB4 zum Einfügen einer EcoRI-Schnittstelle upstream von der Promotorsequenz des Gens und der Primer BmR1 zum Einfügen einer BamHI-Schnittstelle downstream der das Signalpeptid von Subtilisin E kodierenden Region synthetisiert. Die Basensequenzen der Primer SUB4 und BmR1 sind in den SEQ ID NOs:17 bzw. 18 des Sequenzprotokolls gezeigt. Die Primer SUB4 und BmR1 können zur Amplifikation eines DNA-Fragments von etwa 0,3 kb, das den Promotor und die Signalpeptid-kodierende Region des Subtilisin E-Gens enthält, mittels PCR unter Verwendung des Plasmids pKWZ als Template verwendet werden.
Das Gen der Protease PFUS, das downstream des DNA-Fragments eingefügt werden soll, kann von einer chromosomalen DNA von Pyrococcus furiosus durch ein PCR-Verfahren erhalten werden. Der Primer NPF-4 kann als ein Primer verwendet werden, der mit der 5'-Region des Gens hybridisiert. Der Primer NPM-1, der basierend auf der Basensequenz downstream des Terminator-Codons des Gens entwickelt wurde und eine SphI-Schnittstelle hat, kann als ein Primer verwendet werden, der mit der 3'-Region des Gens hybridisiert. Diese Sequenz des Primers NPM-1 ist in der SEQ ID NO:19 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Eine im Gen vorhandene BamHI-Schnittstelle würde ein Problem für ein Verfahren darstellen, in dem eine BamHI-Schnittstelle zum Verbinden des Gens der Protease PFUS mit dem 0,3 kb-DNA-Fragment verwendet wird. Die Primer mutRR und mutFR zum Entfernen der BamHI-Schnittstelle durch ein PCR-Mutageneseverfahren können basierend auf der Basensequenz des Gens der Protease PFUS wie gezeigt in der SEQ ID NO:15 des Sequenzprotokolls hergestellt werden. Die Basensequenzen der Primer mutRR und mutFR sind in den SEQ ID NOs:20 bzw. 21 des Sequenzprotokolls gezeigt. Wenn diese Primer zum Entfernen der BamHI-Schnittstelle verwendet werden, wird der durch diese Stelle kodierte Aminosäurerest (d.h. Glycin an Position 560 in der Aminosäuresequenz der Protease PFUS wie gezeigt in der SEQ ID NO:16 des Sequenzprotokolls), aufgrund der in diese Stelle eingefügten Basensubstitution durch Valin ersetzt.
Das Gen der Protease PFUS, das mit dem Promotor und der Signalpeptid-kodierenden Region des Subtilisin E-Gens verbunden werden soll, kann durch Verwendung dieser Primer erhalten werden. Insbesondere werden zwei PCRs unter Verwendung einer chromosomalen DNA von Pyrococcus furiosus als Template und des Primerpaares mutRR und NPF-4 oder des Primerpaares mutFR und NPM-1 durchgeführt. Zusätzlich wird eine zweite PCR unter Verwendung eines Heteroduplexes, der durch Vermischen der entsprechenden PCR-amplifizierten DNA-Fragmente gebildet wird, als Template und der Primer NPF-4 und NPM-1 durchgeführt. Folglich kann das gesamte Gen der Protease PFUS mit etwa 2,4 kb amplifiziert werden, ohne dass es eine interne BamHI-Schnittstelle enthält.
Ein DNA-Fragment mit etwa 2,4 kb, das durch Verdau des PCR-amplifizierten DNA-Fragments mit BamHI und SphI erhalten wird, wird isoliert und verwendet, um ein BamHI-SphI-Fragment in dem Plasmid pSNP1 zu ersetzen, das das Gen der Protease PFUS enthält. Ein so hergestellter Expressionsvektor wird als das Plasmid pPS1 bezeichnet. Mit diesem Plasmid transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wird als Bacillus subtilis DB104/pPS1 bezeichnet. Eine Protease-Aktivität wird in sowohl dem Überstand als auch dem Zellextrakt der Kultur dieses Transformanten gefunden, die ähnlich ist zu der, die für den das Plasmid pSNP1 beinhaltenden Transformanten beobachtet wurde. Dies zeigt, dass die Aminosäure-Substitution die enzymatische Aktivität nicht beeinflusst. Die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pPS1 ist in 7 gezeigt.
Das DNA-Fragment von etwa 0,3 kb, das den Promotor und die Signalpeptid-kodierende Region des Subtilisin E-Gens enthält, wird mit EcoRI und BamHI verdaut und verwendet, um das EcoRI-BamHI-Fragment, das den Promotor P43 und eine Ribosom-Bindestelle enthält, in dem Plasmid pPS1 zu ersetzen. Ein so hergestelltes Expressionsplasmid wird als pNAPS1 bezeichnet. Mit diesem Plasmid transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wird als Bacillus subtilis DB 104/pNAPS1 bezeichnet. Eine thermostabile Protease-Aktivität wird sowohl im Überstand als auch im Zellextrakt der Kultur des Transformanten gefunden, wobei der Expressionsgrad verglichen mit dem von Bacillus subtilis DB104/pSNP1 erhöht ist. Die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pNAPS1 ist in 8 gezeigt.
Die von dem Transformanten exprimierte Protease weist enzymatische Eigenschaften auf, die äquivalent zu denen der durch Bacillus subtilis DB104/pSNP1 exprimierten Protease wie vorstehend beschrieben sind. Die durch den Transformanten exprimierte Protease wurde gereinigt. Die Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz der gereinigten Protease lieferte die Aminosäuresequenz wie gezeigt in der SEQ ID NO:22 des Sequenzprotokolls. Diese Sequenz ist identisch mit der Sequenz von Position 133 bis Position 144 der Aminosäuresequenz der Protease PFUS wie gezeigt in der SEQ ID NO:15 des Sequenzprotokolls, was zeigt, dass die vollprozessierte Protease PFUS ein Enzym ist, das aus einem Polypeptid besteht, das an dieser Position startet. Die aufgrund dieser Ergebnisse angenommene Aminosäuresequenz der vollprozessierten Protease PFUS ist in der SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Obwohl die Menge an durch Bacillus subtilis DB 104/pNAPS1 gebildeter Protease im Vergleich mit der Menge der durch Bacillus subtilis DB104/pSNP1 (FERM BP-5634) gebildeten Protease erhöht ist, ist eine höhere Produktivität wünschenswert. Es wird erwartet, dass der Expressionsgrad der Protease durch Modifizieren der Verbindung in dem durch pNAPS1 kodierten fusionierten Peptid zwischen dem Signalpeptid des Subtilisins und der Protease PFUS zur Steigerung der Effizienz beim Entfernen des Signalpeptids erhöht wird. Dem Plasmid pNAPS1 wird ein Peptid, das aus den drei Aminosäureresten Ala-Gly-Ser besteht, zwischen den C-terminalen Aminosäurerest des Signalpeptids von Subtilisin E wie gezeigt in der SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls (Ala) und dem N-terminalen Aminosäurerest der Protease PFUS (Met) eingefügt. Ein Transformant mit erhöhtem Expressionsgrad der Protease kann durch Einführen einer Mutation in die dieses Peptid kodierende DNA in das Plasmid pNAPS1 und durch Untersuchen der Protease-Produktivität des Transformanten, in den das mutierte Plasmid eingefügt wurde, erhalten werden.
Zuerst wird ein mutiertes Plasmid hergestellt, indem der Ser-kodierende Teil in dem 3-Aminosäurepeptid in dem Gen, das das Fusionsprotein, Subtilisin E-Protease PFUS, kodiert, in dem Plasmid pNAPS1 so modifiziert wird, dass die Basensequenz des Teils zwei zufällige Aminosäurereste kodiert. Solch ein mutiertes Plasmid kann mittels PCR hergestellt werden. Zum Beispiel können die Primer SPOF0 und SPOR0 mit Sequenzen, in denen das Ser-kodierende Codon (TCC) durch sechs zufällige Basen substituiert ist (die Basensequenzen der Primer SPOF0 und SPOR0 sind in den SEQ ID NOs:24 bzw. 25 des Sequenzprotokolls gezeigt), und die Primer SUB3 und NPR-10, die basierend auf der Basensequenz um diese Region herum hergestellt worden sind (die Basensequenzen der Primer SUB3 und NPR-10 sind in den SEQ ID NOs:26 bzw. 27 des Sequenzprotokolls gezeigt), zur Durchführung einer PCR zum Erhalten eines DNA-Fragments verwendet werden, in das die beabsichtigte Mutation an der dem Ser-kodierenden Codon (TCC) entsprechenden Stelle eingefügt wurde. Ein mutiertes Plasmid, das das Protease-Gen mit der eingefügten Mutation enthält, kann durch Ersetzen der entsprechenden Region in dem Plasmid pNAPS1 mit dem erhaltenen Fragment erhalten werden.
Ein Transformant mit erhöhtem Expressionsgrad kann dann durch Einführen der so erhaltenen mutierten Plasmide in einen geeigneten Wirt, z.B. Bacillus subtilis DB 104, und durch Bestimmen der Menge der durch die Transformanten exprimierten Protease erhalten werden. Der Expressionsgrad der Protease kann durch Bestimmen der Aktivität in der unabhängigen Kultur des isolierten Transformanten bestätigt werden. Alternativ kann ein Transformant mit erhöhtem Expressionsgrad leicht durch Verwenden einer Agarplatte ausgewählt werden, die ein Substrat enthält.
Insbesondere werden die Transformanten, in die die mutierten Plasmide eingefügt worden sind, auf Agarplatten wachsen gelassen, die Magermilch enthalten. Danach werden die Platten bei einer Temperatur inkubiert, bei der die Protease PFUS ihre Aktivität zeigt, z.B. bei 70°C. Magermilch um eine Kolonie eines Transformanten, der eine Protease exprimiert, wird abgebaut und dadurch klar. Der Expressionsgrad der Protease kann aus der Größe des klaren Bereichs abgeschätzt werden.
Einer der so erhaltenen Transformanten, der einen hohen Grad an Protease-Aktivität verglichen mit Bacillus subtilis DB104/pNAPS1 exprimiert, wird als Bacillus subtilis DB 104/pSPO124 bezeichnet. Das in diesem Transformanten enthaltene Plasmid wurde präpariert (dieses Plasmid wird als pSPO124 bezeichnet). Eine Analyse der Basensequenz des Plasmids zeigte, dass der Ser-kodierende Teil in die Basensequenz GGGAAT geändert wurde, d.h. dass ein Protein durch das Plasmid kodiert wurde, indem Ser in Gly-Asn geändert wurde.
Folglich wurde bewiesen, dass der Expressionsgrad des Proteins von Interesse in einem Bakterium der Gattung Bacillus als Wirt dadurch erhöht werden kann, dass ein Peptid, das aus den vier Aminosäureresten Ala-Gly-Gly-Asn besteht, downstream des Signalpeptids eines Subtilisins platziert wird, es an den N-Terminus des Proteins von Interesse fusioniert wird und das fusionierte Protein exprimiert wird. Zusätzlich zu Subtilisin E (von Bacillus subtilis), das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind Subtilisin BPN' von Bacillus amyloliquefaciens (Nucl. Acids Res., 11:7911-7925 (1983)), Subtilisin Carlsberg von Bacillus licheniformis (Nucl. Acids Res., 13:8913-8926 (1985)) und dergleichen als Subtilisine bekannt, die durch Bakterien der Gattung Bacillus hergestellt werden. Die Signalpeptide von ih nen können vorzugsweise für die vorliegende Erfindung verwendet werden, obwohl ihre Aminosäuresequenzen voneinander leicht variieren. Verschiedene Promotoren, die in einem Bakterium der Gattung Bacillus wirken, können anstatt des Promotors des Subtilisin E-Gens verwendet werden, das in der vorliegenden Erfindung zur Expressionskontrolle verwendet wird.
Das zu exprimierende Protein ist nicht eingeschränkt. Es ist möglich, ein Protein durch Gentechnik durch Anwenden der vorliegenden Erfindung stark zu exprimieren, solange das Gen für das Protein verfügbar ist. Es ist offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung zur Expression eines Proteins verwendet werden kann, das von einem anderen Organismus als dem Wirt abgeleitet ist, da ein Protein abgeleitet von Pyrococcus furiosus, das taxonomisch unterschiedlich von Bakterien der Gattung Bacillus ist, stark exprimiert wird. Die vorliegende Erfindung wird bevorzugt zur Herstellung der Protease PFUL, der Protease TCES sowie von Proteasen von Staphylothermus marinus und Thermobacteroides proteoliticus, die strukturell ähnlich zur Protease PFUS sind, mittels Gentechnik verwendet.
Basierend auf der Homologie mit Subtilisinen wird vermutet, dass die Protease PFUS als ein Vorläufer-Protein mit einem Signalpeptid und einem Pro-Peptid exprimiert wird und dann zur Bildung eines gereiften Enzyms prozessiert wird. Des Weiteren kann basierend auf den Ergebnissen der N-terminalen Aminosäuresequenzanalyse des ausgereiften Protease PFUS-Enzyms angenommen werden, dass das ausgereifte Enzym ein Enzym ist, das aus der Aminosäuresequenz wie in der SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls gezeigt besteht. Jedoch liegt das Molekulargewicht der gereinigten ausgereiften Protease PFUS bei etwa 45 kDa, was geringer als das für die Aminosäuresequenz berechnete ist. Dies legt nahe, dass die als ein Vorläufer exprimierte Protease PFUS in eine ausgereifte Protease umgewandelt wird, nachdem auch ihr C-terminales Peptid prozessiert wurde.
Wenn das durch die Prozessierung entfernte C-terminale Peptid nicht essentiell für die enzymatische Aktivität oder für die Faltung des Enzymproteins in die richtige Struktur ist, wird erwartet, dass der Expressionsgrad der Protease PFUS auch durch Entfernen der diesen Teil kodierenden Region vom Gen und Exprimieren der Protease erhöht werden kann.
Das Molekulargewicht der ausgereiften, von Bacillus subtilis DB104/pNAPS1 erhaltenen Protease PFUS kann präzise, z.B. durch Verwendung eines Massenspektrometers, gemessen werden. Durch das gemessene Molekulargewicht und die N-terminale Aminosäuresequenz der ausgereiften Protease PFUS, die wie vorstehend beschrieben bestimmt wurden, wurde herausgefunden, dass die Protease ein Polypeptid ist, das der Aminosäuresequenz wie gezeigt in der SEQ ID NO:15 des Sequenzprotokolls von Ala bei Position 133 bis Thr bei Position 552 entspricht. Des Weiteren kann ein Plasmid, das die Protease PFUS ohne ein Polypeptid exprimiert, das nicht essentiell für ihre enzymatische Aktivität ist, durch Einführung eines Terminationscodons in der Nähe des Teils hergestellt werden, der Thr an Position 552 im Gen der Protease PFUS enthalten im Plasmid pNAPS1 kodiert. Insbesondere kann ein DNA-Fragment mit einer Basensequenz, in die das beabsichtigte Terminationscodon eingeführt worden ist, mittels PCR unter Verwendung des Primers NPR544, der ein Terminationscodon (TGA) an der C-terminalen Seite des den 544. Aminosäurerest kodierenden Codons aus den vom Initiationscodon im Gen der Protease PFUS im Plasmid pNAPS1 (Ser) einführen kann (die Basensequenz des Primers NPR544 ist in der SEQ ID NO:28 des Sequenzprotokolls gezeigt) und des Primers NPFE81 erhalten werden, der die Basensequenz des Gebiets upstream der NspV-Schnittstelle im Gen aufweist (die Basensequenz des Primers NPFE81 ist in der SEQ ID NO:29 des Sequenzprotokolls gezeigt). Ein mutiertes Plasmid, das das Protease-Gen enthält, in das die Mutation von Interesse eingeführt worden ist, kann durch Ersetzen der entsprechenden Region in dem Plasmid pNAPS1 durch das Fragment erhalten werden. Dieses Plasmid wird als das Plasmid pNAPSΔC bezeichnet. Mit diesem Plasmid transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wird als Bacillus subtilis DB104/pNAPSΔC bezeichnet.
Dieser Transformant exprimiert eine Protease-Aktivität mit Eigenschaften äquivalent zu denen der Protease PFUS und mit einem höheren Expressionsgrad als dem von Bacillus subtilis DB104/pNAPS1.
Folglich wurde herausgefunden, dass das im Plasmid pNAPSΔC enthaltene Gen der Protease PFUS eine Region umfasst, die ausreichend für die Expression der Aktivität des Enzyms ist. Die Basensequenz der Region, die die in dem Plasmid vorhandene Protease PFUS kodiert, ist in der SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls gezeigt. Die durch die Basensequenz kodierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Des Weiteren kann die Protease PFUS ohne ihr C-terminales Peptid durch Einführung einer Mutation ähnlich zu der im Plasmid pNAPSΔC in das Gen der Protease PFUS im Plasmid pSP0124 exprimiert werden.
Insbesondere kann das Plasmid von Interesse durch Mischen und Ligieren eines DNA-Fragments von etwa 13 kb erhalten durch Verdau des Plasmids pNAPSΔC mit NspV und SphI mit dem Plasmid pSP0124 hergestellt werden, das mit NspV und SphI verdaut worden ist. Dieses Plasmid wird als das Plasmid pSO124ΔC bezeichnet. Mit diesem Plasmid transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wird bezeichnet und gekennzeichnet als Bacillus subtilis DB 104/pSO124ΔC und wurde am 16. Mai 1997 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) gemäß dem Budapester Vertrag am Nationalen Institut für Biowissenschaften und Humantechnologie, Amt für Industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan unter der Zugriffsnummer FERM BP-6294 hinterlegt. Der Expressionsgrad der Protease ist in dieser Transformante verglichen mit dem von Bacillus subtilis DB104/pNAPS1 erhöht.
Die enzymatischen Eigenschaften sowie die physikalischen und chemischen Eigenschaften der durch die Transformanten Bacillus subtilis DB104/pNAPSΔC und Bacillus subtilis DB 104/pSPO124ΔC hergestellten Proteasen scheinen identisch mit denen der durch Bacillus subtilis DB104/pSNP1 hergestellten Protease zu sein. Die Haupteigenschaften der von den Kulturen der zwei Transformanten erhaltenen Proteasen sind wie folgt:
(1) Aktivität:
Baut Casein und Gelatine unter Bildung kurzkettiger Polypeptide ab.
Hydrolysiert Succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosin-4-methylcoumarin-7-amid (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA) unter Bildung einer fluoreszierenden Substanz (7-Amino-4-methylcoumarin).
Hydrolysiert Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanin-p-nitroanild (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA) unter Bildung einer gelben Substanz (p-Nitroanilin).
(2) Optimale Temperatur:
Weist eine enzymatische Aktivität bei 40-110°C mit einer optimalen Temperatur bei 80-95°C auf.
(3) Optimaler pH-Wert:
Weist eine enzymatische Aktivität bei pH 5-10 mit einem optimalen pH-Wert bei 6-8 auf.
(4) Thermostabilität:
Behält 90% oder mehr ihrer enzymatischen Aktivität nach Behandlung bei 95°C für 8 Stunden.
(5) pH-Stabilität:
Behält 95% oder mehr ihrer Aktivität nach Behandlung bei pH 5-11 bei 95°C für 60 Minuten.
(6) Molekulargewicht:
Weist ein Molekulargewicht von etwa 45 kDa auf einer SDS-PAGE auf.
Folglich werden Proteasen mit hoher Thermostabilität und Gene davon bereitgestellt. Auch wird durch die vorliegende Erfindung ein neues System zur Expression eines Proteins offenbart, das die Expression der Protease in hohen Mengen ermöglicht. Das Expressionssystem ist für die Herstellung der erfindungsgemäßen Protease sowie von verschiedenen Proteinen durch Gentechnik geeignet.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung genauer, sind aber nicht beschränkend aufzufassen.
Beispiel 1
(1) Herstellung einer chromosomalen DNA von Pyrococcus furiosus
Pyrococcus furiosus DSM3638 wurde wie folgt kultiviert.
Ein Medium mit 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% löslicher Stärke, 3,5% Jamarine S Feststoff (Jamarine Laboratory), 0,5% Jamarine S Flüssigkeit (Jamarine Laboratory), 0,003% MgSO₄, 0,001% NaCl, 0,0001% FeSO₄·7H₂O, 0,0001% CoSO₄, 0,0001% CaCl₂·7H₂O, 0,0001% ZnSO₄, 0,1 ppm CuSO₄·5H₂O, 0,1 ppm H₃BO₃, 0,1 ppm KAl (SO₄)₂, 0,1 ppm Na₂MoO₄·2H₂O und 0,25 ppm NiCl₂·H₂O wurde in eine 2 1-Mediumflasche gegeben und bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert. Stickstoffgas wurde zur Entfernung von gelöstem Sauerstoff hindurchgeleitet und dann wurde das Medium mit dem Bakterienstamm angeimpft und bei 95°C für 16 Stunden ohne Schütteln kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt.
Die erhaltenen Zellen wurden dann in 4 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 25% Sucrose aufgenommen. 2 ml 0,2 M EDTA und 0,8 ml Lysozym (5 mg/ml) wurden zu der Suspension zugegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 20°C inkubiert. 24 ml SET-Lösung (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0), 4 ml 5% SDS und 400 μl Proteinase K (10 mg/ml) wurden dem Gemisch zugeführt. Dieses wurde für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Extrahieren des Gemisches mit Phenol-Chloroform beendet. Dann wurde eine Ethanolfällung zum Erhalten von etwa 3,2 mg der chromosomalen DNA durchgeführt.
Beispiel 2
(1) Synthese der Primer zum Herstellen des Plasmids pNSP1
Zur Synthese von Primern, die zur Amplifizierung des gesamten Gens der Protease PFUS verwendet werden, wurde das Plasmid pSNP1, das das gesamte Gen enthält, von Bacillus subtilis DB104/pSNP1 (FERM BP-5634) isoliert und die Basensequenz der benötigten Region wurde bestimmt. Basierend auf der Basensequenz wurden der Primer NPF-4 zum Einfügen einer BamHI-Schnittstelle direkt upstream des Initiationscodons des Gens der Protease PFUS und der Primer NPM-1 synthetisiert, der mit der 3'-Region des Gens hybridisiert und eine Erkennungsstelle für SphI enthält. Die Basensequenzen der Primer NPF-4 und NPM-1 sind in den SEQ ID NOs:13 bzw. 19 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Die Primer mutRR und mutFR zum Entfernen der etwa 1,7 kb downstream des Initiationscodons im Gen der Protease PFUS vorhandenen BamHI-Schnittstelle wur den auch synthetisiert. Die Basensequenzen der Primer mutRR und mutFR sind in den SEQ ID NOs:20 bzw. 21 des Sequenzprotokolls gezeigt.
(2) Herstellung des Plasmids pPS1
Zwei Sätze der LA-PCR-Reaktionsgemische, von denen jedes eine chromosomale DNA von Pyrococcus furiosus als Template und eine Kombination der Primer NPF-4 und mutRR oder eine Kombination der Primer mutFR und NPM-1 enthält, wurden hergestellt und 30 Reaktionszyklen von 94°C für 30 Sekunden-55°C für 1 Minute-68°C für 3 Minuten unterworfen. LA-PCR-Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) wurde zum Herstellen der LA-PCR-Reaktionsgemische verwendet. Aliquots der Reaktionsgemische wurden einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und die Amplifizierung eines DNA-Fragments von etwa 1,8 kb mit den Primern NPF-4 und mutRR bzw. eines DNA-Fragments von etwa 0,6 kb mit den Primern mutFR und NPM-1 wurde beobachtet.
Die Primer wurden von den zwei PCR-Reaktionsgemischen unter Verwendung von SUPREC-02 (Takara Shuzo) zur Herstellung amplifizierter DNA-Fragmente entfernt. Ein LA-PCR-Reaktionsgemisch, das diese zwei amplifizierten DNA-Fragmente aber nicht die Primer oder LA-Taq enthielt, wurde hergestellt, 10 Minuten bei 94°C Hitzedenaturiert, innerhalb von 30 Minuten auf 30°C abgekühlt und dann 15 Minuten bei 30°C zur Bildung eines Heterokomplexes inkubiert. Danach wurde LA-Taq (Takara Shuzo) zu dem Reaktionsgemisch für eine Reaktion bei 72°C für 30 Minuten zugegeben. Die Primer NPF-4 und NPM-1 wurden dann zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, das dann 25 Reaktionszyklen bei 94°C für 30 Sekunden-55°C für 1 Minute-68°C für 3 Minuten unterworfen wurde. Amplifizierung eines DNA-Fragments von etwa 2,4 kb wurde in dem Reaktionsgemisch beobachtet.
Das DNA-Fragment von etwa 2,4 kb wurde mit BamHI und SphI (beide vom Takara Shuzo) verdaut. Das Fragment wurde mit dem Plasmid pSNP1, das zur Entfernung des gesamten Gens der Protease PFUS mit BamHI und SphI verdaut worden ist, gemischt und ligiert und dann in Bacillus subtilis DB 104 eingeführt. Plasmide wurden von erhaltenen Kanamycin-resistenten Transformanten präpariert. Ein Plasmid, in das nur ein Molekül des Fragments von etwa 2,4 kb insertiert wurde, wurde ausgewählt und als das Plasmid pPS1 bezeichnet. Mit diesem Plasmid pPS1 transformiertes Bacillus subtilis DB104 wurde als Bacillus subtilis DB104/pPS1 bezeichnet.
Die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pPS1 ist in 7 gezeigt.
(3) Amplifizierung eines DNA-Fragments für die Promotor-Signalpeptid-kodierende Region des Gens von Subtilisin E
Primer zum Erhalten der Promotor-Signalpeptid-kodierenden Region des Gens von Subtilisin E wurden synthetisiert. Zuerst wurde der Primer SUB4 basierend auf der Basensequenz der Promotor-Region des Gens von Subtilisin E wie beschrieben in J. Bacteriol., 171:2657-2665 (1989) synthetisiert, der mit der Sequenz upstream dieser Region hybridisiert und eine EcoRI-Schnittstelle enthält (die Basensequenz des Primers SUB4 ist in der SEQ ID NO:17 des Sequenzprotokolls gezeigt). Der Primer BmR1, der eine BamHI-Schnittstelle direkt downstream der Signalpeptid-kodierenden Region einfügen kann, wurde basierend auf der Basensequenz des Gens von Subtilisin E wie beschrieben in J. Bacteriol., 158:411-418 (1984) synthetisiert (die Basensequenz des Primers BmR1 ist in der SEQ ID NO:18 des Sequenzprotokolls gezeigt).
Ein PCR-Reaktionsgemisch, das das Plasmid pKWZ, das das Gen von Subtilisin E wie beschrieben in J. Bacteriol., 171:2657-2665 enthält, als Template und die Primer SUB4 und BmR1 enthält, wurde hergestellt und 30 Reaktionszyklen von 94°C für 30 Sekunden-55°C für 1 Minute-68°C für 2 Minuten unterworfen. Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde einer Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und die Amplifikation eines DNA-Fragments von etwa 0,3 kb wurde beobachtet.
(4) Herstellung des Protease-Expressionsplasmids pNAPS1
Das DNA-Fragment von etwa 0,3 kb wie vorstehend beschrieben wurde mit EcoRI (Takara Shuzo) und BamHI verdaut, mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Plasmid pPS1, das mit EcoRI und BamHI verdaut wurde, gemischt und ligiert und dann in Bacillus subtilis DB 104 eingeführt. Von den erhaltenen Kanamycin-resistenten Transformanten wurden Plasmide präpariert. Ein Plasmid, in das nur ein Molekül des Fragments von etwa 0,3 kb insertiert war, wurde ausgewählt und als das Plasmid pNAPS1 bezeichnet. Mit dem Plasmid pNAPS1 transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wurde als Bacillus subtilis DB 104/pNAPS1 bezeichnet.
Die Restriktionsenzym-Karte des Plasmids pNAPS1 ist in 8 gezeigt.
(5) Herstellung des Plasmids pSNP2
Der Primer SUB17R zur Einführung einer BamHI-Schnittstelle upstream der Signalpeptid-kodierenden Region des Gens von Subtilisin E in dem vorstehend genannten Plasmid pNAPS1 wurde synthetisiert (die Basensequenz des Primers SUB17R ist in der SEQ ID NO:23 des Sequenzprotokolls gezeigt). Ein PCR-Reaktionsgemisch, das das Plasmid pNAPS1 als Template und die Primer SUB17R und SUB4 enthält, wurde hergestellt und 25 Rektionszyklen von 94°C für 30 Sekunden-55°C für 1 Minute-72°C für 1 Minute unterworfen. Das amplifizierte DNA-Fragment von etwa 0,21 kb wurde mit EcoRI und BamHI zum Erhalten eines DNA-Fragments von etwa 0,2 kb verdaut, das den Promotor und die SD-Sequenz des Gens von Subtilisin E enthält. Dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pNAPS1, das mit EcoRI und BamHI verdaut worden war, gemischt und ligiert. Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformierung von Bacillus subtilis DB 104 verwendet. Von erhaltenen Kanamycin-resistenten Transformanten wurden Plasmide präpariert. Ein Plasmid, in das das DNA-Fragment von etwa 0,2 kb insertiert war, wurde ausgewählt und als das Plasmid pSNP2 bezeichnet.
(6) Bildung eines mutierten Plasmids, das eine Protease stark exprimiert
Die Primer SPOF0 und SPOR0 zum Ersetzen der Sequenz, die den Aminosäurerest Ser (Basensequenz: TCC) an der Verbindung zwischen der Signalpeptid-kodierenden Region des Gens von Subtilisin E in dem Plasmid pNAPS1 und dem Initiationscodon des Gens der Protease PFUS kodiert, mit einer Sequenz für zwei zufällige Aminosäurereste, wurden synthetisiert (die Basensequenzen der Primer SPOF0 und SPOR0 sind in den SEQ ID NOs: 24 bzw. 25 des Sequenzprotokolls gezeigt). Der Primer SUB3 zum Einführen einer BamHI-Schnittstelle direkt upstream der Signalpeptid-kodierenden Region im Gen von Subtilisin E im Plasmid pNAPS1 und der Primer NPR-10, der eine SpeI-Schnittstelle in der Protease PFUS-kodierenden Region enthält, wurden synthetisiert (die Basensequenzen der Primer SUB3 und NPR-10 sind in den SEQ ID NOs: 26 bzw. 27 des Sequenzprotokolls gezeigt).
PCR-Reaktionsgemische, von denen jedes das Plasmid pNAPS1 als Template und eine Kombination der Primer SPOF0 und NPR-10 oder eine Kombination der Primer SUB3 und SPOR0 enthielt, wurden hergestellt und 20 Reaktionszyklen von 94°C für 30 Sekunden-50°C für 1 Minute-72°C für 1 Minute unterworfen. Die in den zwei Reaktionsgemischen amplifizierten DNA-Fragmente von etwa 0,13 kb und etwa 0,35 kb wurden zusammengemischt, 10 Minuten bei 94°C denaturiert und schrittweise auf 37°C zum Bilden eines Heteroduplexes abgekühlt. Von den Heteroduplexen wurde dann eine doppelsträngige DNA mittels Taq-Polymerase (Takara Shuzo) gebildet. Ein PCR-Reaktionsgemisch, das die so erhaltene doppelsträngige DNA als Template und die Primer SUB3 und NPR-10 enthielt, wurde hergestellt und 25 Reaktionszyklen von 94°C für 30 Sekunden-50°C für 1 Minute-72°C für 1 Minute unterworfen. Ein DNA-Fragment, das durch Verdau des amplifizierten DNA-Fragments von etwa 0,43 kb mit BamHI und SpeI (Takara Shuzo) erhalten wurde, wurde mit dem Plasmid pSNP2, das mit BamHI und SpeI verdaut worden war, gemischt und ligiert. Das Reaktionsgemisch wurde zum Transformieren von Bacillus subtilis DB 104 verwendet.
Erhaltene Kanamycin-resistente Transformanten wurden auf Magermilchplatten (LB-Agarmedium zur Hochtemperatur-Kultivierung mit 10 μg/ml Kanamycin und 1% Magermilch) zur Bildung von Kolonien überimpft. Danach wurden die Platten bei 70°C inkubiert und die durch die entsprechenden Transformanten exprimierten Protease-Aktivitäten wurden basierend auf dem Grad des Abbaus der Magermilch um die Kolonien untersucht. Als ein Ergebnis wurde ein Klon isoliert, der eine besonders hohe Aktivität aufwies, und ein Plasmid, das als das Plasmid pSP0124 bezeichnet wurde, wurde von diesem Klon präpariert. Mit diesem Plasmid transformiertes Bacillus subtilis DB104 wurde als Bacillus subtilis DB104/pSPO124 bezeichnet. Die Basensequenz des Plasmids pSP0124 wurde analysiert und es wurde herausgefunden, dass die Basensequenz, die Ser in dem Plasmid pNAPS1 kodiert, durch die Basensequenz GGGAAT ausgetauscht wurde, d.h. dass ein Protein kodiert wurde, indem Ser durch die beiden Aminosäurereste Gly-Asn ausgetauscht worden war. Zusätzlich zeigte sich, dass das Pro (CCA) entsprechende 25. Codon ab dem Initiationscodon des Gens der Protease PFUS in ein Leu (CTA)-kodierendes Codon gleichzeitig mit der vorstehend beschriebenen Mutation geändert wurde.
(7) Herstellung des Protease-Expressionsplasmids pNAPSΔC
Ein Terminationscodon wurde auf der C-terminalen Seite des 544. Aminosäurerestes ab dem Initiationscodon des Gens der Protease PFUS in dem Plasmid pNAPS1 zur Herstellung eines Plasmids eingeführt, das eine Protease exprimiert, der der Teil downstream dieser Stelle fehlt. Der Primer NPR544 wurde synthetisiert, der ein Terminationscodon (Basensequenz: TGA) an der C-terminalen Seite des den 544. Aminosäurerest kodierenden Codons in das Gen einführt und eine SphI-Schnittstelle hat (die Basensequenz des Primers NPR544 ist in der SEQ ID NO:28 des Sequenzprotokolls gezeigt). Zusätzlich wurde der Primer NPFE81 basierend auf der Basensequenz des Teils upstream der NspV-Schnittstelle im Gen synthetisiert (die Basensequenz des Primers NPFE81 ist in der SEQ ID NO:29 des Sequenzprotokolls gezeigt).
Ein PCR-Reaktionsgemisch, das das Plasmid pNAPS1 als Template und die Primer NPFE81 und NPR544 enthielt, wurde hergestellt und 20 Reaktionszyklen von 94°C für 30 Sekunden-50°C für 1 Minute-72°C für 1 Minute unterworfen. Das amplifizierte DNA-Fragment von etwa 0,61 kb wurde mit NspV (Takara Shuzo) und SpeI zum Erhalt eines das Terminationscodon enthaltenden DNA-Fragments von etwa 0,13 kb verdaut. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem Plasmid pNAPS1, das mit den Restriktionsenzymen NspV und SphI verdaut worden war, gemischt und ligiert. Das Reaktionsgemisch wurde zum Transformieren von Bacillus subtilis DB 104 verwendet. Von den erhaltenen Kanamycin-resistenten Transformanten wurden Plasmide präpariert. Ein Plasmid, in das das DNA-Fragment von etwa 0,13 kb insertiert war, wurde ausgewählt und als das Plasmid pNAPSΔC bezeichnet. Mit dem Plasmid pNAPSΔC transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wurde als Bacillus subtilis DB104/pNAPSΔC bezeichnet.
(8) Herstellung des Protease-Expressionsplasmids pSPO124ΔC
Ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb, das durch Verdau des Plasmids pNAPSΔC mit NspV und SphI erhalten wurde, wurde isoliert und dann mit dem Plasmid pSP0124, das mit NspV und SphI verdaut worden war, vermischt und ligiert. Das Reaktionsgemisch wurde zum Transformieren von Bacillus subtilis DB 104 verwendet. Von den erhaltenen Kanamycin-resistenten Transformanten wurden Plasmide präpariert. Ein Plasmid, in das das DNA-Fragment von etwa 1,3 kb insertiert war, wurde ausgewählt und als das Plasmid pSPO124ΔC bezeichnet. Mit dem Plasmid pSPO124ΔC transformiertes Bacillus subtilis DB 104 wurde als Bacillus subtilis DB 104/pSPO124ΔC bezeichnet.
Beispiel 3
(1) Kultivieren von mit einem das Gen der Protease PFUS enthaltenden Plasmids transformiertem Bacillus subtilis und Herstellen einer ungereinigten Enzymlösung
Bacillus subtilis DB104/pNAPS1, welches Bacillus subtilis DB104 ist, in das das das Gen der Protease PFUS enthaltene Plasmid pNAPS1 wie beschrieben in Beispiel 2 eingefügt wurde, wurde 24 Stunden bei 37°C in 2 ml LB-Medium (Trypton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7,2) mit 10 μg/ml Kanamycin kultiviert. Die Kultur wurde zum Erhalten eines Kulturüberstandes (Präparat 1-S) und von Zellen zentrifugiert.
Die Zellen wurden in 100 μl 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 aufgenommen und 45 Minuten bei 37°C nach Zugabe von 2 mg Lysozym (Sigma) verdaut. Die verdaute Probe wurde 10 Minuten bei 95°C Hitze-behandelt und dann wurde ein Überstand durch Zentrifugation zum Erhalten eines zellfreien Extrakts (Präparat 1-L) gesammelt.
In ähnlicher Weise wurden Kulturüberstände und zellfreie Extrakte von das Plasmid pSP0124 enthaltendem Bacillus subtilis DB104/pSPO124, das Plasmid pNAPSΔC enthaltendem Bacillus subtilis DB104/pNAPSΔC oder das Plasmid pSPO124ΔC enthaltendem Bacillus subtilis DB104/pSPO124ΔC erhalten. Der Kulturüberstand und der zellfreie Extrakt von Bacillus subtilis DB104/pSPO124 wurden als 124-S bzw. 124-L bezeichnet. Der Kulturüberstand und der zellfreie Extrakt von Bacillus subtilis DB104/pNAPSΔC wurden als ΔC-S bzw. ΔC-L bezeichnet. Der Kulturüberstand und der zellfreie Extrakt von Bacillus subtilis DB 104/pSPO124ΔC wurden als 124ΔC-S bzw. 124ΔC-L bezeichnet. Protease-Aktivitäten wurden mit diesen Präparaten bestimmt und die Konzentration der in jedem Präparat enthaltenen Protease wurde bestimmt.
(2) Vergleich der Protease-Produktivitäten
Die Aktivität der Protease PFUS wurde durch spektroskopisches Messen der Menge an p-Nitroanilin bestimmt, das in einer enzymatischen Hydrolysereaktion unter Verwendung von Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA (Sigma) als Substrat gebildet wurde. Kurz zusammengefasst wurde ein auf seine enzymatische Aktivität zu messendes Enzympräparat geeignet verdünnt. 50 μl 1 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA-Lösung in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, wurden zu 50 μl der verdünnten Probenlösung gegeben. Dann erfolgte die Reaktion für 30 Minuten bei 95°C. Nach Beendigung der Rektion durch Abkühlen auf Eis wurde die Absorption bei 405 nm zum Berechnen der Menge an gebildetem p-Nitroanilin gemessen. Eine Unit des Enzyms wurde als die Menge des Enzyms definiert, die 1 μmol p-Nitroanilin pro 1 Minute bei 95°C bildete. Die Menge des in dem Kulturüberstand oder den Zellen exprimierten Enzymproteins wurde basierend auf der gemessenen enzymatischen Aktivität unter der Annahme berechnet, dass die spezifische Aktivität bei 9,5 Units/mg Protein der Protease PFUS liegt.
Die Protease-Aktivität von jedem im Beispiel 3-(1) hergestellten Enzympräparat wurde gemessen. Die aus den Messungen berechnete Produktivität an Protease PFUS pro 1 l Kultur jedes Transformanten ist in Tabelle 1 gezeigt.
Im Bacillus subtilis DB 104/pSPO124 erhöhte sich die Produktivität an Protease PFUS in den Zellen um 3,6-fach verglichen mit der von Bacillus subtilis DB104/pNAPS1. In Bacillus subtilis DB104/pNAPSΔC erhöhte sich die Produktivität an Protease PFUS im Zellüberstand um 2,4-fach bzw. in den Zellen um 2,2-fach. Auch in Bacillus subtilis DB104/pSPO124ΔC erhöhte sich die Produktivität an Protease PFUS im Kulturüberstand um 2-fach bzw. in den Zellen um 2,4-fach. Die Produktivität pro Zelle erhöhte sich auch.
Die Gesamtmenge an im Zellüberstand und den Zellen hergestellter Protease PFUS erhöhte sich um 2,1-fach bei Bacillus subtilis DB 104/pSPO124, um 2,1-fach bei Bacillus subtilis DB104/pNAPSΔC bzw. um 2,2-fach bei Bacillus subtilis DB104/pSPO124ΔC verglichen zu der von Bacillus subtilis DB104/pNAPS1. Tabelle 1 Die Produktivität an Protease PFUS (mg/l der Kultur)
Beispiel 4
(1) Herstellen von gereinigtem Enzympräparat der ausgereiften Protease PFUS
Bacillus subtilis DB104/pNAPS1 und Bacillus subtilis DB104/pSPO124ΔC, die beide Bacillus subtilis DB 104 sind, in die das Gen der erfindungsgemäßen hyperthermostabilen Protease wie beschrieben in Beispiel 2 eingeführt wurde, wurden getrennt voneinander in 5 ml LB-Medium mit 10 μg/ml Kanamycin überimpft und unter Schütteln 7 Stunden bei 37°C kultiviert. Die 5 ml-Kulturen wurden in 500 ml TM-Medium (Sojabohnenpulver 5 g/l, Polypepton 10 g/l, Fleischextrakt 5 g/l, Hefeextrakt 2 g/l, Glucose 10 g/l, FeSO₄·7H₂O 10 mg/l, MnSO₄·4H₂O 10 mg/l, ZnSO₄·7H₂O 1 mg/l, pH 7,0) mit 10 μg/ml Kanamycin in 5 1-Erlenmeyerkolben überimpft und unter Schütteln 3 Tage bei 30°C kultiviert. Die erhaltenen Kulturen wurden mit Ultraschall aufgeschlossen, 30 Minuten bei 95°C Hitze-behandelt und dann zum Sammeln des Überstands zentrifugiert. Zu den Überständen wurde Ammoniumsulfat bis 25% Sättigung gegeben. Die durch nachfolgende Zentrifugation erhaltenen Überstände wurden dann auf Micro-Prep Methyl-HIC-Säulen (Bio-Rad) aufgetragen, die mit 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) mit 25% gesättigtem Ammoniumsulfat äquilibriert waren. Nach Waschen des Gels mit dem gleichen Puffer wurde die an die Säulen adsorbierte Protease PFUS durch schrittweise Elution unter Verwendung von 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) mit 40% Ethanol eluiert. Die so erhaltenen, die Protease PFUS enthaltenen Fraktionen wurden einer Gelfiltration unter Verwendung von NAP-25-Säulen (Pharmacia), äquilibriert mit 0,05% Trifluoressigsäure mit 20% Acetonitril, unterworfen und während Denaturieren der Protease PFUS entsalzt. Dann wurden gereinigte Präparate der Protease PFUS erhalten. Die von Bacillus subtilis DB104/pNAPS1 und Bacillus subtilis DB 104/pSPO124ΔC erhaltenen Präparate wurden als NAPS-1 bzw. SPO-124ΔC bezeichnet.
Eine Elektrophorese von beiden gereinigten Enzympräparaten auf einem 0,1% SDS-10% Polyacrylamidgel mit nachfolgender Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 zeigte einzelne Banden für die beiden gereinigten Enzympräparate NAPS-1 und SPO-124ΔC mit einem abgeschätzten Molekulargewicht von etwa 45 kDa.
(2) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz der ausgereiften Protease PFUS
N-terminale Aminosäuresequenzen der gereinigten Enzympräparate NAPS-1 und SPO-124ΔC wurden durch ein automatisiertes Edman-Verfahren unter Verwendung eines G 1000A-Proteinsequenzers (Hewlett-Packard) analysiert. Beide N-terminalen Aminosäuresequenzen der zwei gereinigten Enzympräparate waren wie in der SEQ ID NO:22 des Sequenzprotokolls gezeigt. Diese Sequenz stimmt mit der Sequenz N-terminate Aminosäuresequenzen der gereinigten Enzympräparate NAPS-1 und SPO-124ΔC wurden durch ein automatisiertes Edman-Verfahren unter Verwendung eines G 1000A-Proteinsequenzers (Hewlett-Packard) analysiert. Beide N-terminalen Aminosäuresequenzen der zwei gereinigten Enzympräparate waren wie in der SEQ ID NO:22 des Sequenzprotokolls gezeigt. Diese Sequenz stimmt mit der Sequenz von Position 133 bis Position 144 der Aminosäuresequenz der Protease PFUS wie in der SEQ ID NO:15 des Sequenzprotokolls gezeigt überein. Dies zeigt, dass sowohl NAPS-1 als auch SPO-124ΔC Enzyme sind, die aus einem von diesem Teil startenden Polypeptid bestehen.
(3) Massenspektrometrische Analyse der ausgereiften Protease PFUS
Eine massenspektrometrische Analyse der gereinigten Enzympräparate NAPS-1 und SPO-124ΔC wurde unter Verwendung eines API300-Quadrupoldreifachmassenspektrometers (Perkin-Elmer Sciex) durchgeführt. Basierend auf dem abgeschätzten Molekulargewicht von NAPS-1, 43 744 Da, wurde gezeigt, dass die durch Bacillus subtilis DB104/pNAPS1 hergestellte ausgereifte Protease PFUS ein Enzym ist, das aus einem Polypeptid von Ala an Position 133 bis Thr an Position 552 der Aminosäuresequenz der Protease PFUS wie in der SEQ ID NO:15 des Sequenzprotokolls gezeigt besteht. Des Weiteren wurde basierend auf dem abgeschätzten Molekulargewicht von SPO-124ΔC, 42 906 Da gezeigt, dass die durch Bacillus subtilis DB104/pSPO124ΔC hergestellte ausgereifte Protease PFUS ein Enzym ist, das aus einem Polypeptid von Ala an Position 133 bis Ser an Position 544 der Aminosäuresequenz der Protease PFUS wie in der SEQ ID NO:15 des Sequenzprotokolls gezeigt, d.h. die Aminosäuresequenz wie in der SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls gezeigt, besteht. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protease, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, in der ein oder mehrere Aminosäurereste von dem C-Terminus der in SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Aminosäuresequenz deletiert ist/sind und die eine thermostabile Protease-Aktivität besitzt.
Protease nach Anspruch 1, die aus der in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Aminosäuresequenz besteht.
Gen, das für ein Protein kodiert, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, in der ein oder mehrere Aminosäurereste von dem C-Terminus der in SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Aminosäuresequenz deletiert ist/sind und das eine thermostabile Protease-Aktivität besitzt.
Protease-Gen nach Anspruch 3, das für die in SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls wiedergegebene Aminosäuresequenz kodiert.
Protease-Gen nach Anspruch 4, die aus der in SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Basensequenz besteht.
Protease-Gen, das mit dem Protease-Gen nach Anspruch 5 hybridisiert, unter Bedingungen, die durch 6×SSC, das 0,5% SDS, 0,1% bovines Serumalbumin (BSA), 0,1% Polyvinylpyrorridon, 0,1% Ficoll 400, 0,01% denaturierte Lachsspermien-DNA enthält, bei 50°C definiert sind und das für ein Protein mit einer thermostabilen Protease-Aktivität kodiert.
Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die durch Formel I wiedergegeben ist: SIG-Ala-Gly-Gly-Asn-PRO [I], worin SIG eine Aminosäuresequenz eines Signalpeptids wiedergibt, das von einem Subtilisin abgeleitet ist und PRO die Aminosäuresequenz der Protease nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Plasmidvektor, umfassend das Gen nach Anspruch 7.
Plasmidvektor nach Anspruch 8, der pSPO124ΔC (FERM BP-6294) ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend das Kultivieren eines Bakteriums des Genus Bacillus, in welches der Plasmidvektor nach Anspruch 8 oder 9 eingeführt ist, und Isolieren des Proteins von Interesse aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 10, wobei das Bakterium des Genus Bacillus Bacillus subtilis ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 10, wobei ein Plasmid pSP0124 Δ C (FERM BP-6294) in das Bakterium des Genus Bacillus eingeführt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 12, umfassend das Kultivieren von Bacillus subtilis DB 104/pSPO124 Δ C FERM BP-6294 und das Isolieren des Proteins von Interesse aus der Kultur.