TW530088B - System for expressing hyperthermostable protein - Google Patents

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530088 五、發明説明（ 基A領域 本發明係、關於一種可作爲工業 .:!-丨^ MW! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 酶、编满誇疋、廿 κ超耐熱性蛋白 編碼孩蛋白酶（基因，以及該酶之 組背景 μ工心製法。 :白酶係-種可切斷蛋白質中之肽鍵的酵素，目前已於 =作植物1微生財發現爲數極多之此類酵素。其用途 物 馬研九用試樂與醫藥品外，亦及於清潔劑之添加 食品加工、利用逆反應之化學合成反應等工業領域， 可說是產業上極其重要之酵素。鑑於工業領域中所使用之 蛋白酶必須具有極高之物理、化學上安定性，因此較佳係 使用耐熱性的酵素。由於芽胞桿菌屬（5ac///w)細菌所生產 的蛋白酶顯示比例甚高之耐熱性，故目前在產業上所用之 蛋白酶中，佔有主流地位。然而，業界中對於性能更優異 之酵素仍有其需求，許多技藝人士乃嘗試由可在高溫中繁 殖的微生物，例如好熱性芽胞桿菌屬細菌或超好熱菌中獲 取酵素。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 例如’超好熱菌中之一種——Pyrococcus furiosus --即已 知可生產蛋白酶[Appl. Environ.Microbiol.，第56卷，第 1992-1998 頁（1990) ; FEMS Microbiol. Letters，第 71 卷， 第 17-20 頁（1990) ; J. Gen. Microbiol.，第 137 卷，第 1 193-1 199 頁（1990)] 〇 此外，亦有報告指出：屬於火球菌屬（i^rococ^ws)之超好 熱菌一-K〇D 1株（P少rococcws sp. strain KOD1)，可生產硫基 蛋白酶（半胱胺酸蛋白酶）[Appl. Environ.Microbiol.，第60 -4- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2) 卷，第4559-4566頁（1994)]。而在同樣亦屬於超好熱菌屬 之熱球菌屬'葡萄棲熱菌屬 (Staphylothermus)、熱類菌餍（Thermobacteriodes)等細菌方 面’也已知可生產蛋白酶[Appl· Microbiol. Bjotechnol第 34 卷，第 715-719 頁（1991)]。 前述各種衍生自超好熱菌之蛋白酶具有極高之熱安定 性，是以虽待能將之利用於與現在所使甩的耐熱性蛋白酶 不同的領域、或是用於到目前爲止尚未被考慮到的蛋白酶 用途中。 然而，生產這些酵素的微生物皆僅於高溫條件下才能繁 殖，例如必須在9(M 〇〇中培養。此 種高溫下的培養操作在能源成本方商也十分不利。再者， &些超好熱菌的蛋白酶生產量，比起使用至今的微生物蛋 白酶要低上許多。如此，由超好熱菌所衍生之蛋白酶，在 其工業製法上尚有許多問題。 方面，將目標酵素基因予以分離，並將之導入易於 5之宿主微生物中’再以基因工程方式進料素生產的 =必目前仍被廣泛地使用著。不過，導入宿主後之基因， 因··兮m斤希冀〈效率表現。其主要原因-般認爲是 :宿=基因的gc含量及密碼子的使用頻度， 同所致。從而，爲獲得合乎使用目的之酵素 王座里將導入基因、私ρ、丄、士 實有其必要。值王中之表現方法予以最適化， 發明目^) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A4規格（210x 297公釐） 530088 A?

1 了解決前述之課題，本發明之目的係在於提供 料之超好熱菌之蛋㈣、分離出編碼該超好* 囷蛋白酶之基因，並提供一種利用該基因進行之 ^ 蛋白酶的基因工程製法。 对^ 爱复概要 =好熱菌所生產之蛋自酶巾，由其胺基酸序列 :硯察，一般認爲有_種係屬於被稱爲枯草桿菌-=unsin)型之檢性絲胺酸蛋白酶者。若將此㈣^ 桿菌=如在蛋白質基因工程生產十被廣泛使用的枯草芽丧 干鹵（叫體内時，該酵素之生產董將 枯草芽胞桿菌原本所生產的蛋白質。 、、、 好發明人之深入研究後發現：如在欲使其表現之考 、’、、菌蛋白酶基因上游處，安插一段編碼枯 蛋 酸东， ），#改變其切斷點周邊之胺基 故序列，即可使目標基因在枯草芽 現。此外，本發明亦發現：在作爲目m中二…表 ::=，即便令該等對於酵素活性表現而言並非必要 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 叫：-1 ^-----·! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 、_叮 發生缺失，仍可見到其酵素表現量得到改善。本發 明由此而完成。 贺 ::兹對於本發明做—概説：本發明之第i發明，係— /、序列表中序列編號1所示胺基酸序列的㈣性^ 酶’以及-#具有在序列錢1:心胺基 數個胺基酸發生缺失、置換、插入或附加 = 序列、且具耐熱性蛋白酶活性之蛋白晦。 … __ _6、 本紙張尺度適用i^i^i^cNS} 530088 五、發明説明（4) 性之第2發明，係一種編碼第1發明之耐-因。卜 以及可與該基因雜交之对熱性蛋白酶基 生3發明，係—種用於以基因工程方法製造衍 w:、固〈耐熱性蛋白酶的基因，其特徵在於係編碼 下式I所7F <胺基酸序列： SIG-Ala-Gly-Gly-Asn-PRO m L式:列，_表由枯草桿菌蛋白酶所衍生之信號肽的胺基 甘’ PRO則表欲表現之蛋白質的胺基酸序列] =sm較佳爲序列表中序列編號3所示之胺基酸序列， 佳則爲衍生自超好熱菌之耐熱性蛋白酶，特佳爲 ‘自/wr/〇iM之蛋白酶的胺基酸序列。 本發明之第4發明係關於一種蛋白質之基因工程製法， 徵Si含培養經導入第3發明之基因的枯草桿菌屬 '鹵再由，、培養物採取目摞蛋白質等步驟。 本發明之第5發明係一種用於基因工程方法製造蛋 =中之質體，其特徵在於該質體内插入第3發明之基 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在含有本發明所揭示之蛋白酶且存在於自然界之蛋白質 万面’除了編碼該酶之基因的各種同質異形體及變異體 外，亦可經由其所生成之备A1 风义蛋白貝於活體内或精製過程中之 修飾反應等，對其胺基酸序列中之！或數個胺基酸引發缺 失、插入、附加及置換等變異；更甚者亦不限於此，目前 亦已知有與未發生變異之蛋白質展現同等生理及生物學 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公楚） 530088 A? B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（5) =性者之存在。同樣地’在人爲操作方面，亦可將前述之 變異導入蛋白質之胺基酸序列中，此時更可製作出更爲多 樣化之變異體。例如，目前已知將人類間白素2(il_2)之胺 基酸序列中的半胱胺酸殘基置換爲絲胺酸後所得之多 肽’其仍能保持間白素2之活性[Seienee，第224卷，i43i 頁（1984)]。如此，彼等具有本發明所揭示胺基酸序列中之 匕或數個胺基酸奋生缺失、插入、附加或置換所得之胺基 酸序列，且與本發明之蛋白酶擁有同等活性之蛋白酶者， 亦屬於本發明之範嗜。 本説明書中所稱「會與（某基因）雜交之基因」，係指1 有類似於某基因之鹼基序列的基因。此種具有類似於某基 因之鹼基序列的基因，其所編碼之蛋白質的胺基酸序列以 及这蛋白質所具有的機能，也與之類似的可能桎極高。基 因的鹼基序列類似程度，可視兩個基因或者其中一部份於 嚴，的條件下是否會彼此形成雜交體（即是否會發生雜交） 而得知—利用适個方法即可找到所欲之基因；此等基因 ，細碼二蛋白質與某基因所編碼蛋白質具有同樣的機 ^換3<,可將本發明之基因或其之一部分作爲探針， 以習知之方法進行雜交，即可找到具有類似於本發明基因 之鹼基序列的基因。雜交作用可依例如1989年口—小卜、. 只7 )(夕.八一 a 一 .今求予卜"-發行，T. Maniatis 等人编輯，M〇lecularClonmg:ALab〇rat〇ryManual2nd 以 中所在l万法進行。$ 一步纟體言之，例如，可以下述條 件來進行雜交：將固定有DNA之薄膜，於含有〇.5%sds、 本紙張尺麟财酬家標準（CNS ) A4規格(210X2977^^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I衣 訂 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 蛋白酶TCES及枯草桿菌蛋白 蛋白酶TCES及枯草桿菌蛋白 蛋白酶TCES及枯草桿菌蛋白 A? -B7 五、發明説明（6) 0.1%牛血清白蛋白（BSA)、 〇 ι%聚乙晞吡咯啶酮、 0.1 /oFicoll 4〇〇 ’ 及 〇 01%改質鮭精子 D難之 係表〇_15MNaC1、0.〇15M檸檬酸納、pH7)中，在5crc下 與知針同恤B 12_2〇小時。溫育終了後，從在含有 0.5o/〇SDS 之 2xSSC Φ π π 丁、 中及37 C下炙沖洗開始，至SSC濃度 成爲0.1χ之範圍内、或至溫度成爲5〇u範圍内，變化 條件直到可將來自被固定之DNA的信號與背景區別時 爲止，在此段期間内沖洗該薄膜。 此外’亦可不用雜叉法，而改以基因增幅法代之：此增 幅法係以本發明基因之鹼基序列的一部份作爲引子。^ 如，可利用PCR法。至於由此所得之基因是否編碼具有所 奴機π(蛋白質，則可將所得之基因利用適當宿主及表現 系統令其表現，再分析所獲之蛋白質的活性而得知。 圖式簡要説明 圖1所π爲質體PSTC3之限制酶舆圖。 圖2所示爲蛋白酶PFUS、蛋白酶TCES及枯草桿菌蛋白 酶之胺基酸序列的比較圖。

圖3所示爲蛋白酶PFUS 酶之胺基酸序列的比較圖， 圖4所示爲蛋白酶pF1js 酶之胺基酸序列的比較圖 圖5所示爲蛋白酶pfus 酶之胺基酸序列的比較圖 圖6所示爲質體pSNP丨之限制酶舆圖 9- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公楚 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁；}

530088 A? B7 五、發明説明（7) 圖7所示爲質體pPSl之限制酶舆圖。 圖8所示爲質體pNAPSi之限制酶舆圖。 本發明之詳細説明 本發明之超耐熱性蛋白酶，可爲衍生自各種超好敖菌的 蛋白酶。例如，W095/34645號公報即就 furiosus及cehr所衍生之蛋白酶有所揭示。 由P少r〇c〇CCw/z^〇iSwDSM3638所衍生之蛋白酶基因， 係由該菌株之基因組DNA庫，以耐熱性之蛋白酶活性爲指 標而分離出者。含有該基因之質體命名爲 9 而經該質體轉形之大腸桿菌麗09則命；=爲 JM109/pTPR12，其自平成 6 年 5 月 24 日（原 寄存日）起，依布達佩斯條約寄存於日本國茨城縣◦〈比市 東〗丁目1番3號之通產省工業技術院生命工學工業技術 研究所，寄存編號爲FERM BP-5103。 以下’本説明書中將稱此蛋白酶爲蛋白酶PFUL。蛋白 酶PFUL爲具有極高之熱安定性的一種蛋白酶，即使於％ °C下也、能展現蛋白酶活性。 前述插入質體pTPR12之i^ococc心而DNA片段的 鹼基序列已然測知。茲將質體pTPR12之插入DNA片段 中，由2個Dral位點所夾之約4.8kb部分的鹼基序列示於 序列表中之序列編號5。由該鹼基序列所推得之基因產物 的胺基酸序列，則列於序列表中之序列編號6。亦即，序 列编號6所示之胺基酸序列即爲前述蛋白酶PFIjl之胺基 酸序列。如該序列所示，此蛋·白酶PFUL係由1398個胺基 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A? ___ - B7 五、發明説明（8) 殘基所構成，爲分子量超過15萬之高分子量蛋白酶。 如將前述序列表中序列编號_6所示之蛋白酶pFUL的胺 基酸序列與已知之微生物蛋白酶的胺基酸序列相比較，即 可知蛋白酶PFUL的前半部胺基酸序列和以枯草桿菌蛋白 酶爲代表的一種鹼性絲胺酸蛋白酶[Pr〇tein Engineeri^， 第4卷，第719_737頁（1991)]之間存在著相同性，特別是 在對於蛋白酶之觸媒活性而言極爲重要的4個胺基酸殘基 周邊’存在著非常高的相同性。 如上所述，由於在超好熱菌戶所生產 的蛋白酶PFUL之胺基酸序列中，已知其保存著與常溫菌 所生蛋白酶共通存在的區域，則由此將更可期待在 户7〜介门·“Μ以外的超好熱菌所生產的同種蛋白酶 中，也會存在有此等區域。 *例如，蛋白酶PFUL之胺基酸序列中與枯草桿菌蛋白酶 ^具有南相同性之區域，利用蛋白酶pFUL基因中編碼此 區域4驗基序列作爲基礎而合成寡核苷酸PRCmF、pR〇_ 」 PR〇 及PRQ-4R，將此等寡核嘗酸加以組合後作 爲引子，再以各種超好熱菌的染色體DNA爲模版，進行 PCR反應，由此即可篩選出超耐熱性蛋白酶基因。序列表 中序列編號7、8、9及10分別列出寡核苷酸PRCMF、 PROM、PRO-2I^PRCK4R 的鹼基序列。 作爲本發明足蛋白酶所以衍生的超好熱菌來源者，可包 =屬於火球菌屬、熱球菌屬、 * 3棲熱菌屬⑻印、熱類菌屬 __ -11 - i纸張尺度 目家標$ ( CNS) — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A? ________ 五、發明説明（9) 心乃等細菌。其中，屬於熱球菌屬之細菌， 可用例如77;er則coccw cAr DSM2476，此菌株可由F〆 7千工·甘、么小 > 夕· 7才y · $夕口才小力、二又y夕· 々^卜· 7工小夕小千二々卜> GmbH購得。以 7V^moc〇ccw DSM2476之染色體DNA作爲模版，用 前述寡核甞酸？11〇-^與PR〇_2Fi組合體，或用pR〇 2R 及PRO-4R之組合體作爲引子，在進行pCR時如發現有特 異的DNA片段增幅現象，即可知有蛋白酶基因之存在。此 外，將此等DNA片段插入適當的質體載體而作成重組質體 後以雙脱氧法來分析所插入之DNA片段的鹼基序列，即 可推知該片&上所編碼之胺基酸序列。其結果爲：此等DNa 片段上所編碼之胺基酸序列，確實與蛋白酶pFUL及各種 微生物所衍生之鹼性絲胺酸蛋白酶的胺基酸序列具有相 同性；前逑之PCR增幅DNA片段的確是以蛋白酶基因爲 模版所增幅而得者。 接著，用前述之寡核甞酸或由上述PCR方法所得之增幅 DNA片段作爲探針，對超好熱菌之基因庫進行篩選，即可 得到超耐熱牲蛋白酶基因，例如所生 產之超耐熱性蛋白酶基因。 舉例而言，將77^rm_ccw ce/erDSM2476之染色體DNA 以限制酶SaU3AI部分消化所得之DNA片段，與几GEiyM】 載體（二口 /方社製）連接後，以活體外包裝（packagmg)方 2於λ噬菌體粒子中進行包裝，再針對所得之基因庫，用 前述PCR所得之增幅DNA作爲探針，進行噬斑雜交^丨叫此 -12- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I衣· 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 Α7 __- Β7 五、發明説明（1〇) hybridization)，即可得到含有目標基因之噬菌體/選殖株。 對如此所得之噬菌體選殖株中所含之DNA片段進行解 析的結杲，顯示在約1 9kb之SacI片段上有蛋白酶基因之 存在；而從其驗基序列之檢定結果，可知此片段缺少蛋白 酶基因之5端區域。此5’端區域可由利用序列匣（cassette) 或序列If引子之PCR方法來取得（寶酒造基因工程製品指 南，1994-1995年版，第250-251頁）。如此·一來，即可得 到含蓋質體PTC56中所欠缺之超耐熱性蛋白酶基因5»端區 域的DNA片段，而可進一步由此二DNA片段的驗基序列 得知ce/er所衍生的超耐熱性蛋白酶基因的 全邵驗基序列。 兹將存在於所得鹼基序列中之可讀框架(opeil reading frame)的鹼基序列，以及由該驗基序列所推知之胺基酸序 列’分別列於序列表之序列編號丨丨及序列編號12。由此， 在確知編碼α/π所衍生之超耐熱性蛋白酶 之基因的鹼基序列及其胺基酸序列後，茲將該酶命名爲蛋 白酶TCES。 將前述的2個DNA片段予以重組，再構成蛋白酶tcES 基因之全部序列，以此即可構築出由其再構成所得之表現 質體；然而當利用大腸桿菌作爲宿主時，卻會得到被導入 目的表現質體之轉形細胞，而此即係技藝人士所預期的ν 該基因在菌體内所生成之表現·產物之所以對大腸桿菌有 害或者致死之原因。此時，一般認爲，可用例如枯草芽胞 才千訇作爲宿主，再令蛋白酶於細胞外分泌表現，並確認其 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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活性。 枯草芽胞桿菌可用枯草芽胞桿菌DB104 ，此菌株係

Gene，第83卷，第215-233頁（1989)所載之一種習知菌株。 而選殖載體可使用質體pUB 1 8-P43，此質體係力小力、9 — 大學的Sin-Lam Wong博士所惠予者。此外，該質體中含有 抗卡那黴素基因作爲.篩選標劑之用。 在質體載體PUB18-P43的P43啓動子下游插入蛋白酶 TCES基因後，將所構築而成的重組質體命名爲質體 pSTC3，而以該質體轉形之枯草芽胞桿菌DB1〇4則命名並 表不爲枯草牙胞才干囷DB104/pSTC3，其自平成7年12月1 日（原寄存日）起，依布達佩斯條約寄存於日本國茨城縣。 市東1 丁目1番3號之通產省工業技術院生命工學工 業技術研究所，寄存编號爲FErM ΒΡ-5635。 圖1所示即爲質體PSTC3之限制酶舆圖。圖中之粗實線 爲插入質體載體PUB18-P43的DNA片段。 培養前述的枯草芽胞桿菌DB104/PSTC3，並就培養之上 清液及菌體抽出物分析其蛋白酶活性，兩者皆可確認具有 耐熱性蛋白酶活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 、-口

由孩轉形細胞培養物所得之蛋白酶的粗酵素樣品，其主 要性質如下： (1)作用： 可分解赂蛋白、明膠，並生成短鏈多肽。 可水解丁二醯基白胺醯基白胺醯基_；^纈胺酸氺_酪 胺酸‘甲基薰草素-7*•醯胺（Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA)，並 -14- 本纸張尺度適用 規-格(2丨^^--~- 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12) 生成螢光物質（7-胺基-4-甲基薰草素）。 可水解丁二醯基-L-丙胺縫基-L«•丙胺驢基脯胺醯基-L-苯丙胺酸-L-對-硝基醯苯胺（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA)，並 生成黃色物質（對-硝基苯胺）。 (2) 最適溫度·· 在3 7-95 °C間顯示酵素活性，其蕞適溫度爲70-80 °C。 (3) 最適pH値： 在PH5.5-9間顯示酵素活性，其最適pH値爲pH7-8。 (4) 熱安定性： 於80 C下經3小時之處理後，仍能保持9〇%以上的_素 活性。 ， 將蛋白酶PFUL、蛋白酶TCES及枯草桿菌蛋白酶[枯草 桿菌蛋白酶 BPN'，Nucl· AcidsRes.第 1 卷，第 7911-7925 頁（1983)]之胺基酸序列，如錮2-5所示般，使其具有相同 性之區域並排，即可知蛋白酶PFUL不僅於其c端，且在 其具有相同性之區域間，亦存在有蛋白酶TCEs及枯草桿 菌蛋白酶中所沒有之序列。由此，〜〇c〇_細_中 除了蛋白酶P鼠外，亦有可能存在蛋白酶了⑽或枯草桿 %蛋白酶等等分子量較低的蛋白酶。 因此，當利用前述具有相同性區域蛴y i ^ 埤所何生而來的DNA探 Μλλ 、片 叮朱'備的染色體DNA作爲 標的’進行Southern雜交反應後，即 PFTTTl^r·'» 發現非屬蛋白酶 FUL基同之信號序列，而得知尚一 ^ ^ , J 種蛋白酶基因存在。 琢新頭蛋白酶基因可以下述方法予以分離· -15- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 530088 A7 B7 五、發明説明（13) 例如，先以適當的限制酶消化P少ro⑶ccz/s /wriosws之染 色體DNA後，再以之爲標的，由前述之Southern雜交反應， 即可取得含有編碼該新穎蛋白酶之基因的DNA片段。分析 此DNA片段之鹼基序列，以確認其是否編碼與上述蛋白酶 具有相同性之胺基酸序列；於該DNA片段不含全部目標基 因時，再以反向PCR法等，分離出不足之部分。 舉例言之、，用限制酶SacI及Spel(寶酒造社製）消化 之染色體DNA後，再以之進行Southern 雜交反應，在約0.6kb大小的片段中可辨認出信號序列之 存在。回收此大小之DNA片段，將之插入質體載體 pBluescriptSK(-)<^ 卜今夕 — y 社製）的 Spel-SacI位點之 間，再用所得之重組賢體轉形大腸桿菌JM109。由此轉形 細胞，以前述Southern雜交反應所用之同樣探針來進行選 殖雜交，即可取得含有目標片段之選殖系。保有所得之選 殖系的質體是否具有編碼蛋白酶之序列，可由質體中所插 入D N A片段之驗基序列的分析而加以確認。經此確認有蛋 白酶基因存在的質體，茲將之命名爲質體pSS3。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由插入於該質體pSS3之DNA片段的鹼基序列所推知之 胺基酸序列，與蛋白酶PFUL、蛋白酶TCES等序列間具有 相同性。如此，可由新獲得其之一部 份、並與蛋白酶PFUL基因相異之蛋白酶基因，茲將其產 物命名爲蛋白酶PFUS。至於编碼該蛋白酶之N端及C端 的區域，則可由反向PCR法獲得。 反向PCR所用之引子，可以前述質體pSS3中所含之插入 -16-本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 A? B7 五、發明説明（14) DNA片段的鹼基序列爲基礎製作而成。接著，將尸少rococcw /z/r/之染色體DNA用適當的限制酶加以消化後，針對 所生成之DN A片段進行分子内連接反應。以此反應液爲模 版，實施利用前述引子之PCR反應，即可得到與質體PSS3 中所含蛋白酶基因片段相連接之區域的DN A片段。分析如 此所得的DNA片段之鹼基序列，即可推知該區域所編碼之 酵素蛋白質的胺基酸序列，並可進一步製作出以 Pyrococcw 之染色體DNA爲模版、且可用以增幅 全部蛋白酶PFUS基因之引子。可設定出具有緊接蛋白酶 PFUS之起始密碼子正前方的鹼基序列，且在其51端可導入 BaniHI位點的引子NPF-4 ;以及具有與蛋白酶PFUS基因 之3’端邵分相互補之序列，且在其51端可導入Sph位點之 引子NPR-4。 茲將前述引子NPF-4及NPR-4的鹼基序列示於序列表中 之序列編號1 3及1 4。利用此2種引子，即可以尸少roc ο ccws /i/r/ww之染色體DNA爲模版，而增幅蛋白酶PFUS基因 之全長。 經濟部中央標準局員工消黄合作^印粟 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 與蛋白酶TCES相同，亦可用枯草芽胞桿菌爲宿主，而 令蛋白酶PFUS表現。用於表現蛋白酶PFUS之質體，可以 蛋白酶TCES的表現質體pSTC3爲基礎而加以構築。亦即， 先將用前述引子進行PCR所增幅而得、且含有全部蛋白酶 PFUS基因之DNA片段，與質體pSTC3上之蛋白酶TCES 基因互相置換，即可由此構築出用於表現蛋白酶PFUS之 質體。將如此構築之表現質體命名爲質體pSNPl，而以該 17' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7--B7 五、發明説明（15) 質體轉形之枯草芽胞桿菌DB丨〇4則命名並表示爲枯草芽胞 桿菌DB104/pSNPl，其自平成7年12月1曰（原寄存日）起， 依布達佩斯條約寄存於日本國茨城縣。〈比市東丨丁目i 番3號i通產省工業技術院生命工學工業技術研究所，寄 存編號爲FERM BP-5634。圖6所示即爲質體pSNPl之限 制酶舆圖。 編碼蛋白酶PFUS之基因的可讀框架（〇peil reading frame) 部分I驗基序列示於序列表中之序列编號丨5 ;而由該鹼基 序列所推知之蛋白酶pFUS胺基璇序列，則列於序列表中 之序列編號1ό 〇 培養前述的枯草芽胞桿菌DB104/pSNPl，並就培養液之 上清液及菌體抽出物分別分析其蛋白酶活性，兩者皆可確 認具有耐熱性之蛋白酶活性。換言之，在培養液之上清液 中分泌有所表現之蛋白酶PFUS之部分。 由孩轉形細胞培養物所得之蛋白酶，其主要性質如下： (1) 作用： 可分解酪蛋白、明膠，並生成短鏈多肽。 可水解丁 一酿基白胺醯基白胺醯基纈胺酸-L-路 胺故心甲基薰草素-7-醯胺（Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA)，並 生成螢光物質（7-胺基-4-甲基薰草素）。 可水解丁 一酿基-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基脯胺醯基-L-苯丙胺鉍-L-對-硝基醯苯胺（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA)，並 生成黃色物質（對-硝基苯胺）。 (2) 最適溫度： -18- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 A7- .B7 五、發明説明（16) 在40-1 10 °C間顯示酵素活性，其最適溫度爲80-95 °C。 (3) 最適pH値： 在pH5 -1 0間顯示酵素活性，其最適pH値爲pH6-8。 (4) 熱安定性： 於95 °C下經8小時之處理後，仍能保持90%以上的酵素 活性。 (5) pH安定性： 於pHtl 1、95 °C下經6小時之處理後，仍能保持95% 以上的酵素活性。 (6) 分子量 於SDS-PAGE上顯示約45kDa之分子量。 由與製備蛋白酶TCES基因及蛋白酶PFUS基因時相同之 7T ^ Pyrococcus furiosus 、 Thermococcus celer 以外 的超好熱菌中，取得與此等基因具有相同性之蛋白麟基 因。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 製備一段約1 kb的DNA片段，其編碼序列表中序列編號 6所示蛋白酶PFUL胺基酸序列之第323殘基至第650殘基 的這段序列，然後將之作爲探針，利用57叩 marinus OSM3639 瓦 Thermobacteroides proteoliticus 5265之染色體DNA進行基因組Southern雜交。其結果爲： 在利用經PstI(寶酒造社製）消化之少 染色體DNA時，可於約4.8kb之位置上發現信號（signal); 而在利用經 Xbal 消化之 厂 染色體DNA時，則可於約4.8kb之位置上發現信號 -19-本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 A? -B7 五、發明説明（17) ignaij 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由上，在 Staphylothermus marinus 及 Therm〇bacter〇ih 之染色體DNA上的確均存在有和蛋白酶 PFUL、蛋白酶PFXJS及蛋白酶丁⑽等基因具相同性之序 列。利用與分離及鑑定編碼蛋白酶PFUL、蛋白酶打仍及 蛋白酶TCES等基因時相同的方法，可自前述所檢出之 DNA片段，分離並㈣出存在於加脚，他她⑽/㈣ 及以以所心以以⑺“以中且編碼超耐熱性 酶之基时。 在欲以基、因工程方法大量製備蛋白質時，—般 非：用編碼目標蛋白質之基因本身所含之啓動子：而是以 在宿王體内能有效作用之啓動子較爲有利。因此 =C二及斤表現系統中所用之P43啓動子雖爲枯草 牙胞#囷所衍生者，但對此二 法展現充分之效果。 “酶的表現而T，卻無 /足而^了進—步提高其表現量，技藝人士即考慮利用 可於祜草芽胞捍菌中高度表: 白質之基因。作爲此等基因者，可 ^ =疋利用分泌蛋 外蛋白酶之其(?！ 粉酶等各種菌體 肽、，即可期待蛋白酶PFUS之表現量能有所提昇動子及u 耶即，將全長之蛋白酶pFU 框架爲一致之入* 以使兩基因之轉錄 ii 一 ^ # , ，♦，'連結於含有啓動子區域、且编@ 枯轉菌蛋白酶基因之信號肽區域之 ，且編碼 草桿菌蛋白酶基时動子之控制下二^可在枯 衣見王融合蛋白質形 本纸張尺度適用中國國家標準 -20-

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AT B7 五、發明説明（18) 式之蛋白酶PFUS。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明所用又枯草桿菌蛋白酶基因，可爲編碼枯草桿菌 蛋白酶Ei基因。枯草桿菌蛋白酶E之啓動子及信號肚， 可用在 J. BaCten〇L 第 171 卷，第 2657-2665 頁（1989)所载 之負pKWZ中插入枯草桿菌蛋白酶基因所得耆。該基因 之鹼基序列，在含有啓動子之5,上游區域方面，可見述於 前述文獻中；而在編碼枯草桿菌蛋白酶之區域方面，則可 見述於 J.Bactenol.第 158 卷，第 411 一418 頁（1984)。 以此等序列爲基礎，分別合成引子SUB4(用於在該基因 又啓動子序列上游處引入EcoRI位點），及引子BmR1 (用於 在編碼枯草桿菌蛋白酶E之信號肽的區域後方引入β&^Ηι 位點）。引子SUB4與BmRl之鹼基序列分別示於序列表中 之序列編號1 7及1 8。利用引子SUB4與BmRl，經由以質 體pKWZ爲模版之PCR反應，即可增幅含有編碼枯草桿菌 蛋白酶E之啓動子及信號肽之區域、約〇 3kb的dna片段。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 接續於該DNA片段下游處之蛋白酶PFUS基因，可依pcR 法，自P少〜coccw/wr/ww之染色體DNA中取得。用來雜 交於該基因5'端的引子，可爲前述之引子npf-4。而用來 雜交於3’端之引子，則可用引子ΝΡΜβ1，其係由該基因之 終止舍碼子下游的驗基序列所設計，並且具有$ p h I位點。 茲將引子NPM-1之序列示於序列表中之序列編號19。 另^一方面’當利用BamHI位點以將蛋白酶pfus基因接 續於前述之0.3kbDNA片段時，在該基因中所具有之一處 BamHI位點卻會成爲操作上之障礙。在將此位點以 -21 - 用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） 530088 A? B7 五、發明説明（19) PCR突變法除去時所用的引子mutRR及mutFR，可以、序列 表中序列編號1 5所示之蛋白酶PFUS基因的鹼基序列爲基 礎，而加以製作。兹將引子mutRR及mutFR之驗基序列分 別示於序列表中之序列編號20及2 1。而在利用此等引子 以除去BamHI位點時，由於在該位點所導入之鹼基置換反 應，使得該處所編碼之胺基酸，亦即序列表中序列編號16 所示之蛋白酶PFUS的胺基酸序列中第560位置之甘胺酸 將被取代爲纈胺酸。 利用此等引子，即可獲得蛋白酶PFUS基因，其可用於 接續編碼枯草桿菌蛋白酶E之啓動子及信號肽之區域。換 言之，以之染色體DNA爲模版，利用 引子mutRR與NPF-4及引子mutFR與NPM-1兩套引子對， 並使用之染色體DNA爲模版，進行2 種PCR反應。接著再將各PCR反應所增幅而得之DNA片 段加以混合，用所形成之異源雙股體作爲模版，以引子 NPF-4及NPM-1進行2次？011反應。如此，即可增幅約2.41^ 之全長蛋白酶PFUS基因，其内部不含BamHI位點。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將上述之PCR增幅DNA片段以BamHI及SphI消化，再 分離出所得之約2.4kb的DNA片段，並將其與前述質體 pSNPl中包含蛋白酶PFUS基因之BamHI-Sphl片段相互置 換。將如此構築而成之表現質體命名爲質體pPSl，而以該 質體轉形之枯草芽胞桿菌DB 1 04則命名爲枯草芽胞桿菌 DB104/pPSl。在培養該轉形細胞時，不論於培養液之上清 液及菌體抽出物方面，皆可發現與使用質體pSNP Γ時相同 -22-本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 A? -B7 五、發明説明（20) 的蛋备酶活性，可證實前、述的胺基酸置換並不會對酵素活 性造成影響。圖7所示即爲質體pPS 1之限制酶輿圖。 將前述包含編碼枯草桿菌蛋白酶E之啓動子及信號肽之 區域且大小約爲0.3kb之DNA片段，以EcoRI及BamHI予 以消化，再和前述質體pPSl中含有P43啓動子與核糖體結 合部位序列的EcoRI-BamHI片段相互置換。將如此構築而 成之表現質體命名爲質體pNAPSl，而以該質體轉形之枯 草芽胞桿菌 DB104則命名爲枯草芽胞桿菌 DB104/pNAPSl 。培養該轉形細胞，並分析其培養液之上 清液及菌體抽出物之蛋白酶活性，二者皆可證實具有耐熱 性之蛋白酶活性，且其表現量比起枯草芽胞桿菌 DB104/pSNPl更有所提昇。圖8所示即爲質體pNAPSl之 限制酶舆圖。 該轉形細胞所表現之蛋白酶，與前述枯草芽胞桿菌 DB104/pSNPl所表現者具有同等的酵素化學性質。此外， 如將該轉形細胞所表現之蛋白酶加以純化，並解析其N端 之胺基酸序列，即可得序列表中序列編號22所示之胺基酸 序列。該序列與序列表中序列編號1 5所示蛋白酶PFUS胺 基酸序列中第133-144號間之序列爲一致，顯示成熟型的 蛋白酶PFUS乃由此部分以下的多肽所構成之酵素。茲將 由此結果所推出之成熟型蛋白酶PFUS的胺基酸序列示於 序列表中之序列編號4。 枯草芽胞桿菌DB104/pNAPSl所生產之蛋白酶的量比起 枯草芽胞桿菌DB104/pSNPl(FERM BP-5634)雖有所提昇， -23- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A? -B7 五、發明説明（21) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 但技藝界仍期盼能更進一步提高其生產量。pNAPS 1中編 碼有枯草桿菌蛋白酶之信號肽與蛋白酶PFUS間之融合 肽，如改變其接續部分，並設法有效率地引發信號肽之除 去作用，如此即可期待蛋白酶之表現量能因而獲得增加。 在前述之質體pNAPS 1中，於序列表之序列編薄3所示枯 草桿菌蛋白酶E之信號肽的C端胺基酸（Ala)與蛋白酶 PFUS之N端胺基酸（Met)之間，插有由Ala-Gly-Ser3個胺 基酸所组成之肽。在質體pNAPS 1中編碼此肤的Γ>ΝΑ部分 上引入變異，再針對被導入所得變異質體的轉形細胞，分 析其蛋白酶生產能，即可得到蛋白酶表現量已獲提昇的轉 形細胞。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 首先，先就質體pNAPS 1上編碼枯草桿菌蛋白酶E -蛋 白酶PFUS之融合蛋白質之基因，將編碼前述3胺基酸肽 中之Ser部分，改變爲編碼任意2胺基酸之鹼基序列，而 調製出具有此種改變之變異質體。此類之變異質體可利用 PCR法加以製備。例如，將前述编碼Ser之密碼子（TCC) 部分置換爲任意6個鹼基，再用具有此序列之引子SPOFO 及SPORO(序列表中序列編號24及25分別列出引子SPOFO 及SPORO的鹼基序列），以及由其前後區域之鹼基序列所 製之引子SUB3與NPR-10(序列表中序列編號26及27分別 列出引子SUB3與NPR-10的鹼基序列）進行PCR，即可得 到在前述編碼Ser之密碼子（TCC)部分已被導入目的變異 之DNA片段。將此片段與質體pNAPSl上之對應區域相互 置換，則可獲得含有已被導入變異之蛋白酶基因的變異質 -24-本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂297公釐) 530088 A? B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（22) 體 一接著，將如此所得之變異質體導入適當宿主，例如枯 茅胞桿菌DB104，針對所得之轉形細胞分 量，即可取得表現量已獲提高之轉形細胞。蛋 义確涊，可將單離之轉形細胞予以個別培養， 養物中之活性而完成；而用含有基質之瓊脂培養基^進^ 培養時，也可能更容易篩選出表現量已獲上昇之轉形細 胞0 、 易言之’令導人前述變異質體之轉形細胞於含有脱脂奶 粉足瓊脂培養基上繁衍後，將此培養基於蛋白酶可 表現其活性之溫度下（例如7(rc)保溫。能表現蛋白酶之轉 形細胞，其菌落周邊的脱脂奶粉將會被分解而變爲透明 狀，由其區域之大小，即可估算出蛋白酶之表現量。 如此所得之較枯草芽胞桿菌DB〗〇4/pNApsi表現更高量 f白酶活性之轉形細胞，兹將其中一種命名爲枯草芽:桿 菌DBl04/PSPO124。由該轉形細胞中調製其所含有之質體 (該質體命名爲PS0124)，分析其鹼基序列之結果，可知^ 述編碼Ser之部分已變異爲GGGAAT，從而可知其編碼的 蛋白質中之Ser已變異爲Gly-Asn。 如此，在枯草桿菌蛋白酶之信號肽的後方配置由Ala· Gly-Gly-Asn四個胺基酸所組成之肽，在此情況下令其融合 於目的蛋白質之N端並使其表現，如此若以芽胞桿菌屬細 菌作爲值主，即可使其表現量有增加之可能。在芽胞桿菌 屬細菌所生產之枯草桿菌蛋白酶方面，除本發明所用之枯 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I衣· 530088 A7 -B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（23) 草桿菌蛋白酶E(衍生自枯草芽胞桿菌）外，尚知有由 如C///W⑽少所衍生之枯草桿菌蛋白酶 BPNl[Nucl. Acids Res.第 11 卷，第 7911_7925 頁（1983)]、 由…所衍生之枯草桿菌蛋白酶 Carlsberg[Nucl. AcidsRes.第 13 卷，第 8913-8926 頁（1985)] 等，其胺基酸序列雖有若干差異，然該等信號肽亦相當適 用於本發明。此外，本發明中調控表現之啓動子雖係使用 由枯草桿菌蛋白酶E所衍生之啓動子，但如不用此種啓動 子，亦可政用能於芽胞桿菌屬體内作用之各種啓動子。 再者，在所表現之蛋白質方面亦無任何限制，只要其基 因係可取得者，均能適用於本發明，而令其以基因工程方 法同量表現。至於是否能將本發明用來表現彼等由宿主以 外i生物所衍生t蛋白質，則可從與芽胞桿菌屬細菌在分 類學上有不同位置之的蛋白質也可被 冋里表現而證貫。本發明所揭示者，特別適用於與前述蛋 白酶PFUS構造相類似之蛋白酶、蛋白酶TcES及 StaPhyl〇thermus mari_ 反 Therm〇bacter〇心㈣㈣仙⑽ 所衍生之蛋白酶的基因工程生產。 蛋白酶PFUS若由與枯草桿菌蛋白酶間之相同性考量， 一般=爲其係以包含信號肽及前肽（propepHde)之前驅體 ^貝）式被表現，然後再經加工（processing)後成爲成熟 型酵素；或由前述蛋白酶PFUS成熟型酵素之N端胺基酸 序列分析結果，而諸爲該成熟型酵素係由序列表中序列编 號4所胺基酸序列構成之酵素。然而，精製後之成熟 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -----衣—

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-26- (210x 297公釐） 530088 ΔΤ A? -B7 五、發明説明（24) 型蛋白酶PFUS，其分子量約爲45kDa，比起由此胺基酸 序列計算而得者爲小。此現象暗示著：以前驅體形式被表 現的蛋白酶PFUS，其C端部分之肽也經過加工作用，而 轉換爲成熟型蛋白酶。 因此等加工作用而被除去的C端部位肽，如其對於酵素 活性或對於能使建構成酵素蛋白質正確構造的折疊作用 (folding)而言，並非絕對必要的話，那麼即使令基因中編 碼此邵分的區域有所缺失而加以表現，也可期待其蛋白酶 PFUS的表現量仍能獲#增加。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由前述枯草芽胞桿菌DB 1 04/pNAPS 1所得之成熟型蛋白 酶PFUS，可用例如質量分析裝置來精密測定其分子量。 從其分子量及先前即已確知之成熟型蛋白酶PFUS的N端 胺基酸序列，可知該蛋白酶即爲序列表中序列編號1 5所示 胺基酸序列之第133號（Ala)至第552號（Thr)所對應之多 肽。在前述質體pNAPSl上所含蛋白酶PFUS基因中，如於 其編碼第552號（即Thr)的部位附近導入終止密碼子，即可 構築出可表現蛋白酶PFUS(其中對酵素活性爲非必要之多 肽已經發生缺失）之質體。亦即，在質體pNAPSl上的蛋白 酶PFUS基因中，利用引子NPR544(其可在由其起始密碼 子起算，編碼第544號胺基酸（Ser)之密碼子的C端處導入 終止密碼子（TGA)，而序列表中序列編號28所列者即爲引 子NPR544之鹼基序列），及引子NPFE81(其具有前述基因 上NspV位點之上游區域的鹼基序列，而序列表中序列编 號29所列者即爲引子NPFE81之鹼基序列）來進行0CR反 -27- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 A/ -B7 經苯部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（25) 應，即可得到含有已導人目標終止密碼子之驗基序 DNA片段。然後，將此片段與質體pNAps }上之對應區 相互置換，即可得到含有已導入目的變異之蛋白酶基因的 變異質體。茲將該質體命名爲質體pNAps ，而經該質 體轉形之枯草芽胞桿菌DB1〇4則命名爲姑草芽‘二二 DB104/pNAPS AC。 固 孩轉形細胞可表現與蛋白酶PFUS具有同等性質之蛋白 酶活性，而其表現量則較枯草芽胞桿菌DB1〇4/pNApsi 高。 由上，質體pNAPS △ C所含之蛋白酶PFUS基因，確實包 含可充分表現該酵素活性之區域。茲將該質體内所含之編 碼蛋白酶PFUS之區域的鹼基序列，示於序列表中之序列 編號2。而茲鹼基序列所編碼的胺基酸序列則示於序列表 中序列編號1。 此外，在前述之質體PSP〇124上的蛋白酶PFUS方面， 亦可導入與質體pNAPS AC同樣的變異，而表現出c端肽 已欠失之蛋白酶PFUS。 易言之，前述之質體pNAPS A C在經NspV與SphI消化 後，將所得約13kb的DNA片段，與預先以NspV與SphI '/肖化過的質體pSPO 124予以混合，並進行連接反應，即可 構築出目“貧體。該質體茲命名爲質體pSp〇i24 AC，而 以該資體轉形之枯草芽胞桿菌DB 1 04則命名並表示爲枯草 芽胞桿菌DB104/pSPO124z\C，其自平成9年5月16日（原 寄存日）起，依布達佩斯條約寄存於日本國茨城縣〇 <以、、市 -28- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (5) pH安定性： 以=:、：C下經6小時之處理後，仍-保持㈣ (6) 分子量 於SDS-PAGE上顯示約4讣加之分子量。 如上所述，本發明確可提供具有極高之 及=。此外’本發明亦揭示一種可大量表現』= :…蛋白質表現系統。該表現系統除了本發 酶外，亦可用於各種蛋白質之基因工程製造上。 —以下兹舉若干實例以更詳細地説明本發明，但本發明之 範圍並非僅限於此等實例所述者。 f例1 (1 /"nww之染色體DNA的製備 將1%胰蛋白腺、〇.5%酵母抽出物、1%可溶性澱粉、 3.5%'：；十7 y > S固體十γ 9 y今术今卜y —社製）、 0.5%、：；十γ y y S液體十v y y今求亏卜y —社製）、 0.003%MgSO4、〇.〇〇l%NaC1、〇 _1%FeS〇4 · 7h2〇、 0.0001% CoS04 ^ 0.000!〇/〇 CaCl2 · 7H20 ^ 0.000!〇/〇 ZnS04、〇.lppm CuS04 ·5Η20、〇.lppm h3b〇3、〇 lppm KAL(S04)2、O.lppm Na2Mo〇4 · 2H2〇、〇.25ppm NiCl2 · 2出0所組成之培養基置入2升容量之培養基龜中，於i2〇 C下殺菌20分鐘後，通入氮氣以除去溶解之氧氣，再將前 述菌株接種於此培養基上，於95 °C下靜置培養16小時。 -30- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —

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530088 A? B7 五、發明説明（28) 培養終了後以離心收集菌體。

然後，將所得菌體懸浮於含有25%蔗糖之Tr[s HC1(PH8.0)4毫升中，於此懸浮液中添加2亳升之〇2m EDTA、〇·8耄升之落菌酶（5毫克/毫升），在20 X下保溫i 小時後’再加入24宅升之SET溶液（1 50mM NaCl、1 mM EDTA、20mM Tds_HCl、pH8.0)、4 毫升之 5% SDS、400 微升之蛋白酶K(10毫克/毫升），於37t下再保溫】小時。 進行酚-氣仿萃取，停止反應後，以乙醇沈澱之，得到約 3.2毫克之染色體DNA。 實例2 (1) 用於構築質體pNSPl之引子的合成 爲了合成可用於增幅全長之蛋白酶PFus基因的引子， 首先將含有該全部基因之質體pSNP1自枯草芽胞桿菌 DB104/PSNP1(FERM BP-5634)中分離出來，並檢定其必要 區域的驗基序列。以此驗基序列爲基礎，合成引子其 可在蛋白酶PFUS基因之起始密碼子的正前方導入BamHI 位點）以及引子NPM-1(其可雜交於該基因之3,側，並含有 SphI之辨識序列）。序列表中序列編號〗3及丨9分別列出引 子NPF-4及NPM-1的鹼基序列。 另外’則合成引子mutRR及mutFR，其可用於在蛋白酶 PFUS基因内邵除去位在起始密碼子後約1 7以下游處之

BamHI位點。序列’表中序列編號20及21分別列出引子 mutRR及mutFR的驗基序歹q 。 (2) 質體pPSl之製備 -31 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A? -B7 五、發明説明（29) 配置2組LA-PCR反應液，其含有作爲模版之 染色體DNA，或含有作爲引子之前述引子NPF-4 與mutRR的組合，或含有引子mutFR與NPM-1之組合，以 94 C 30秒—55°C 1分鐘—68°C 3分鐘爲1循環，分別進 行30循環之反應。在LA-PCR尾應液之配置方面，係利-用 LA P_CR Kit Ver.2(寶酒造社製）。用此反應液之部分進行瓊 脂糖電泳’在所用爲引子NPF-4與mutRR時，可增幅約1 8kb 之DNA片段；而所用爲引子mutFR與NPM-1時，則可增 幅約0.6kb之DNA片段。 由前述2種PCR反應液中，利用SUPREC-02(寶酒造社 製），調製已去除引子之增輻DN A片段。再製配含有此二 增幅DNA、但不含引子及LA Taq之LA-PCR反應液，於 94 °C下進行1 〇分鐘之熱變性反應，用3〇分鐘使其冷卻至 3〇 C後’於30 C下保溫15分鐘，使之形成異源雙股體。 接著在此反應液中加入引子NPF-4及NPM-1，以94 °C 30 秒-5 5 C 1分鐘一 6 8 °C 3分鐘爲1循環，進行2 5循環之 反應。在該反應液中可見約2.4kb之DNA片段之增幅。 將上述約2.4kb之DNA片段以BamHI及SphI(皆爲寶酒造 社製）消化，再將此片段與預先經BamHI及SphI消化以除 去全長之蛋白酶PFUS基因的質體pSNPl加以混合，並進 行連接反應後，將之導入枯草芽胞桿菌DB 1 04。由所得之 抗卡那黴素轉形細胞中調製質體，篩選出僅插入1分子之 前述約2.4kb片段之質體，並將之命名爲質體pPS1。另將 以該質體pPSl所轉形之枯草芽胞桿菌〇Β 104命名爲枯草 -32- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 茅胞样菌DB104/pPSl。 圖γ斤示即爲質體PPS1《限制酶舆圖。 (3)枯草桿菌蛋白酶基因之 。動子—信號肽區域之DNA Μ 段的增幅 κ ^ 合成可用於獲得枯草桿菌蛋 贫匄酶基因 <啓動子-信號月i £域的引子。首先參考J.Bactenol第m 頁（1989)所載之枯草桿菌 $ 2657-266. '^ . τ 干囷蛋合酶Ε基因之啓動子區域部分 的鹼基序列，合成可雜交於

又於落£域义上游處' 且含有EcoR 位點 < 引子SUB4(岸歹丨|矣由鱼χτ 吐 I斤幻表中序列編號丨7所示引 ^UB4之驗基序列）°然後再參考J. BaCteriQL帛158卷， 弟411-418頁（1984)所載之枯草桿菌蛋白酶E基因的驗基 序列，合成可於信號肽之正後方導入Bamm位點之引子

BmRl (序列表中序列編號〗8所示即爲引子細以之鹼基序 列）。 用含有 J BaCten〇1.第 171 卷，第 2657-2665 頁（1 989)所 載 < 枯草桿菌蛋白酶E基因之質體pKWZ爲模版，製備含 有前述引子SUB4、BmRl之PCR反應液，以94。〇 3〇秒— 5 5 C 1分|里—6 8 C 2分鐘爲1循環，進行3 〇循環之反應。 用此反應液之部分來進行瓊脂糖電泳，在該反應液中可見 約0.3kb之DNA片段之增幅。 (4)蛋白酶表現質體pNAPSl之構築 將上述約〇.3kb之DNA片段以EcoRl(寶酒造社製）及 BamHI消化，再將此片段與實例3所述、預先經EcoRI及 BamHI消化過之質體ppsi加以混合，並進行連接反應後， -33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公漦） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 A? B7 五、發明説明（31) 將之導入枯草芽胞桿菌DB1 〇4。由所得之抗卡那黴素轉形 細胞中調製質體，篩選出僅插入1分子之前述約〇.3kb片 段之質體，並將之命名爲質體pNAPSl 。另將以該質體 pNAPSl所轉形.之枯草芽胞桿菌DB104命名爲枯草芽胞桿 菌 DB104/pNAPSl。 圖8所示即爲質體pNAPS 1之限制酶舆圖。 (5) 質體pSNP2之構築 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 合成可在前述質體pNAPSl中編碼枯草桿菌蛋白酶E之 信號肽的區域上游處導入BamHI位點之引子SUB17R(序列 表中序列編號23所示即爲引子SUB 17R之鹼基序列）。配 置含有該引子與前述引子SUB4 ，以及作爲模版之質體 pNAPSl 的 PCR 反應液，以 94 °C 30 秒一55 °C 1 分鐘一 72 °C 1分鐘爲1循環，進行25循環之反應。將增幅所得之約 0.21kb之DNA片段以EcoRI及BamHI消化，得到含有枯草 桿菌蛋白酶E之啓動子與SD序列、大小約爲〇.2kb之DNA 片段。將此片段與預先經EcoRI及BamHI消化過之質體 pNAPSl加以混合並進行連接反應，用所得反應液來轉形 枯草茅胞；f干囷DB104。由所得之抗卡那徽素轉形細胞調製 質體，篩選出插有前述約0.2kb的DNA片段之質體，將之 命名爲質體pSNP2。 (6) 可高度表現蛋白酶之變異質體之製備 首先合成可用來將前述質體pNAPSl中的枯草桿菌蛋白 酶E信號肽與蛋白酶PFUS之起始密碼子相接部位的胺基 酸Ser(鹼基序列TTCC)以任2個胺基酸加以取代之質體 -34 -本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A? B7 五、發明説明（32) SPOFO及SPORO(序列表中序列編號24及25分別列出引子 SPOFO及SPORO的鹼基序歹)。此夕卜，亦合成可在質體 pNAPS 1中編碼枯草桿菌蛋白酶E信號肽之區域正前方導 入BamHI位點的引子SUB3 ，以及含有編碼蛋白酶PFUS 區域中之Spel位點的引子NPR-10(序列表中序列编號26及 27分別列出引子SUB3及NPR-10的鹼基序列）。 用質體pNAPS 1爲模版，調製含有前述引子SPOFO與 NPR-10之PCR反應液及含有前述引子SUB3與SPORO的 PCR反應液，以94 °C 30秒—50 °C 1分鐘—72 °C 1分鐘爲 1循環，進行20循環之反應。將分別由兩反應液增幅而得 之0.13kb與0.3 5kbDNA片段加以混合，於94 °C下進行熱 變性1 0分鐘後，緩緩冷卻至37 °C，使之形成異源雙股體， 再用Taq聚合酶（寶酒造社製）由此異源雙股體製備雙鏈 DNA。以所得2股DNA爲模版，製備含有前述引子SUB3 及引子NPR-10之PCJI反應液，以94 °C 30秒—50 °C 1分 鐘-72 °C 1分鐘爲1循環，進行25循環之反應。將增幅 所得之約0.43kb之DNA片段以BamHI及Spel(寶酒造社製） 消化，將所得DNA片段與預先經BamHI及Spel消化過之 前述質體pSNP2加以混合並進行連接反應，用所得反應液 來轉形枯草芽胞桿菌DB 104。 將所得之抗卡那黴素轉形細胞接種於脱脂奶粉培養基 (含有1Q微克/毫克卡那黴素、1%脱脂奶粉之LB高溫培養 用培養基）上，使之形成菌落後，將培養m於70 °C下保溫， 再由菌落周邊的脱脂奶粉分解狀態測定各轉形細胞所表 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 訂 4 530088 A? -B7 五、發明説明（33) 現之蛋白酶活性。最後將所檢測出具有特高活性的一個菌 落加以分離，並由此調製質體，將之命名爲質體PSP〇124。 另將以該質體轉形之枯草芽胞桿菌DB 1 04命名爲枯草芽胞 桿菌DB104/pSPO124。分析質體pSP0124之鹼基序列的結 果，可知在原質體pNAPS 1中編碼前述Ser的驗基序列已 被置換爲GGGAAT，其所編碼之蛋白質成爲Ser已變異爲 Gly-Asn二胺基酸之蛋白質。另外，在此變異之同時，亦 可發現由蛋白酶PFUS起始密碼子起算的第25個、對應於 Pro之密碼子（CCA)也變爲編碼Leu者（CTA)。 (7)蛋白酶表現質體pNAPS AC之構築 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 構築一種可表現蛋白酶之質體，其係在前述質體pNAPS 1 中由蛋白酶PFUS基因之起始密碼子起算的第544號胺基 酸之C端側導入終止密碼子，並使該部位以下的序列皆發 生缺失而得者。先合成可在前述基因上編碼第544號胺基 酸之密碼子的C端處導入終止密碼子（鹼基序列TGA)，且 具有SphI位點的引子NPR544(序列表中序列編號28所列 者即爲引子NPR544之鹼基序列再由前述基因上Nsp V 位點之上游區域的鹼基序列爲基礎，合成引子NPFE81(序 列表中序列編號29所列者即爲引子NPFE81之鹼基序 列）。 用寶體pNAPSl爲模版，調製含有前述引子NPFE81與 NPR544之PCR反應液，以94 Ό 30秒—50 °C 1分鐘-72 C 1分鐘爲1循環，進行2 0循環之反應。將增幅所得之約 0.61kb之DNA片段以NspV(寶酒造社製）及SphI消化，得 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7- B7 五、發明説明（Μ) 到含終止密碼子之約0.13kb的DNA片段。將此DNA片段 與預先經限制酶NspV及SphI消化過之質體pNAPSl加以 混合並進行連接反應，用此反應液來轉形枯草芽胞桿菌 DB 104。由所得之抗卡那黴素之轉形細胞中調製質體，篩 選出插入前述約0.1 3kbDNA片段之質體，並將之命名爲質 體pNAPS △ C。另將以該質體pNAPS △ C所轉形之枯草芽 胞桿菌DB104命名爲枯草芽胞桿菌DB104/pNAPS △<：。 (8)蛋白酶表現質體PSP0124 A C之構築 將前述質體pNAPS △ C以NspV及SphI消化後所得之約 1.3kb的DNA片段予以分離，再把此片段與預先經NspV 及SphI消化過之質體PSP〇124加以混合並進行連接反應。 用此反應液來轉形枯草芽胞样菌DB 104。由所得之抗卡那 黴素之轉形細胞中調製質體，篩選出插入前述約13kbDNA 片段之質體，並將之命名爲質體pSPO 124 AC。另將以該 質體pSP0124 AC所轉形之枯萆芽胞桿菌DB104命名爲枯 草茅胞桿菌 DB104/pSPO124 AC。 實例3 (1)經含有蛋白酶PFUS基因之質體轉形之枯草芽胞桿菌的 培養與粗酵素液之製備 將實例2所得之枯草芽胞桿菌DB104/pNAPSl(即導入含 有蛋白酶PFUS基因之質體pNAPSl的枯草芽胞桿菌DB 104) 於含有10微克/毫升卡那黴素的LB培養基（胰蛋白腺10克 /升、—酵母抽出物5克/升、NaCl 5克/升，pH7.2)2升中， 於3 7 °C下培養24小時。將培養液離心後得到培養上清液 -37- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A?- -B7 ______五、發明説明（35) (樣品1-S)及菌體。 將所得菌體懸浮於100微升之5〇mMTris-HCl(pH7,5)，再 加入2毫克溶菌酶（Sigma製）後，於37 °C下消化45分鐘。 消化後之試料再經95 °C下加熱處理1 〇分鐘後，離心之並 收集上清液，製成_無細胞萃取液（樣品1-L)。 接著，由含有前述質體pSP0124之枯草芽胞桿菌 D与104/pSPO124、含有前述質體pNAps ac之枯草芽胞桿 菌DB104/pNAPS AC，或含有pSP0124 ac之枯草芽胞桿 菌DB104/pSPO124 AC，依上遠相同的方法，製備培養液 上清及無細胞萃取液，並將枯草芽胞桿菌DBl〇4/pSP0124 的培養上清液名爲124-S、無細胞萃取液名爲124-L ;枯 草芽胞桿菌DB104/PNAPS △(：的培養上清液名爲AC-S、 鹆細胞萃取液名爲AC-L ;枯草芽胞桿菌DB104/pSPO124 AC的培養上清液名爲丨24 ^c-s、無細胞萃取液名爲124 △ C-L。利用此等樣品測定蛋白酶之活性，並分析各樣品 中所含蛋白酶之濃度。 (2)蛋白酶生產能之比較 蛋白酶PFUS之活性測定，係以Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p_ NA(Sigma製）爲基質，對於由酵素水解反應所生成之對-硝 基苯胺進行分光學上之測定而完成。亦即，先將欲測定其 酵素活性之酵素樣品予以適度稀釋，在此試料溶液5〇微升 中加入 ImM 之 Suc-Aia-Ala-Pro-Phe-p-NA 溶液（l〇〇mN 磷酸 緩衝液，ρΗ7·0)50微升，於95。(：下使其反應3〇分鐘。使 其冰冷以停止反應，測定405奈米之吸光度，求出對-硝基 -38- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 530088 五、發明説明（36) 苯胺之生成量。以在95。〇下 -硝基茉脖^祕主 刀鐘内可生成1微莫耳對 硕基本酵素量作爲1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 性爲A虑，n 酵素。再用所得之酵素活 二基礎：蛋白酶_之每蛋白質重量比9 Ϊ量笔克，錢將培養上清液中與菌體内所表現之酵素蛋白 卞只彳3⑴所製〈各酵素樣品的蛋白酶活性，並將由 〃測疋 果所算出之各轉形細胞每 膽生產量列於表丨。 爹履中蛋白酶 枯草芽胞桿菌DBU)4/pSP0124中，如與枯草芽胞桿菌 dbi，〇4/州APS1比較，可知其菌體内的蛋白酶生產量 /加爲2.4倍。另外，在枯草芽胞桿菌db、i △ C万面，其培養液上清部分可見有2 4倍的蛋白酶叩卩§生 產量增加現象，而菌體内則生產量之增加情形爲2 2倍。 至於在枯草芽胞桿菌DB104/pSPO124 AC方面，其培養液 上清部分的蛋白酶PFUS生產量則增加爲2倍，而菌體内 則增加2.4倍。此外，平均每菌體之生產量也有增加。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如將培養液上清部分及菌體内的蛋白酶PFUS生產量之 合計値，與枯草芽胞-桿菌DB 1 04/pNAPS 1之生產量値比 較’可知枯草芽胞桿菌DB104/pSPOl24 、枯草芽胞桿菌 DB104/PNAPS AC 及枯草芽胞桿菌 DB104/pSPO124 AC 分 別增加爲2.1倍、2·1倍及2.2倍。 表1 蛋白酶PFUS之生產量（每升培養液，單位爲毫克） 39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 530088 A7 _ B7 五、發明説明（37) 轉形細胞（質體） 培養液上清 菌體 培卷适孩賴 pNAPSl 15.1 12.5 —叹十囷® —_27.6 PSP0124 13.1 45.4 pNAPS AC 35.5 28.1 -------J Ο · PSP0124 AC 30.5 30.1 ----y J . O ___60.6 實例4 (1)成熟型蛋白酶PFUS之精製酵素樣品之製備 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 將實例2所得之、經導人本發明超耐熱性蛋白酶基因之 枯草芽胞桿菌DB104、枯草芽胞桿菌DBl〇4/pNApsl及枯 草芽胞桿菌DB1〇47PSP0124 △(：，分別接種於含有1〇微克 /毫升卡那黴素之LB培養基5毫升的試管中，於37。〇下震 盪培養7小時。準備含有1〇微克/毫升卡那黴素之τΜ培養 基500毫升（大豆粉5克/升、聚蛋白腺1〇克/升、肉抽出物 5克/升、酵母抽出物2克/升、葡萄糖1〇克/升、FeS(^ · 7H20 10 毫克/升、MnS〇4 · 4h2〇 1〇 亳克 /升、ZnS〇4 · 7Η2〇1毫克/升，pH7.0)於5升容量之三角瓶中，接種前述 培養液5毫升，於30 Ό下震盪培養3日。將所得培養液以 超音波處理後，於95 Ό下加熱處理30分鐘，離心後回收 其上清邵分。在上清液中加入硫酸銨使成25%飽和，再將 其經離心後所得之上清液加入事先用含2 5 %飽和硫酸銨之 25mMTns-鱗酸緩衝液（ρΗ7·6)平衡過之Macro-Prep MethylHIC(二彳才今7卜社製）管柱中。以同樣的緩衝液沖 洗凝膠後，用含有40%乙醇之25mMTnS-鹽酸緩衝液（pH7.6) 逐步沖提’藉以沖提出吸著於管柱上之蛋白酶pFUS。將 -40 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7-B7 五、發明説明（38) 所得之含有蛋白酶PFUS的分液實施凝膠過濾（其係用先經 含有20%乙腈之0.05%三氟乙酸平衡過的NAP-25管柱 (Pharmacia社製）），在修飾蛋白酶PFUS的同時亦進行脱 氯，即得精製之蛋白酶PFUS樣品。茲將枯草芽胞样菌 DB104/pNAPSl所得樣品命名爲NAPS-1，而枯草芽胞桿菌 D3B104/pSP〇124 AC 所得者則命名爲 SPO-124 AC。 用0.1 %SDS-10%聚丙烯醯胺凝膠，對前述2種精製酵素 樣品實施電泳，再以科麥西氏亮藍-R-250進行染色，可見 精製酵素樣品NAPS-1 、SPCM24AC兩者皆展現單一條 帶，其推定分子量共約45kDa。 (2) 成熟型蛋白酶PFUS之N端的胺基酸序列分析 用G1000A蛋白質定序儀（二二—· b 7卜· /< 7力一卜'社 製）以Edman法分析前述精製酵素樣品NAPS-1、SPO-124 △ C的N端胺基酸序列。茲將此2種精製酵素樣品的N端 胺基酸序列一同列於序列表中之序列編號22。該序列與序 列表中序列編號1 5所示之蛋白酶PFUS的胺基酸序列中第 133至第144號序列爲一致，顯示NAPS-1、SPO-124 △ C 二者實係由此部分以下之多肽所構成的酵素。 (3) 成熟型蛋白酶PFUS之質量分析 用API300四極二程質量分析裝置（/、—牛y —工yl/Y — —·寸4工v夕只社製）分析精製酵素樣品NAPS-1 、 SPO-124 A C之質量分析。NAPS-1之分子量經測定爲 43,744Da，顯示枯草芽胞桿菌DB104/pNAPSl所生產之成 熟型蛋白酶PFUS實係序列表中序列編號1 5所示蛋白酶 -41 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 A? B7 五、發明説明（39) PFUS之胺基酸序列中自第in號之Ala至第552號之Thr 爲止之多肽所構成之酵素。此外，SPO-124 △ C之分子量 經測定爲42,906Da，顯示枯草芽胞桿菌DB104/pSPOl24 △ C所生產之成熟型蛋白酶PFUS實係序列表中序列編號1 5 所示蛋白酶PFUS之胺基酸序列中自第133號之Ala至第 544號之Ser爲止之多肽（亦即序列表中序列编號2所示之 胺基酸序列）所構成之酵素。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一準 f標 一家 國 國 一中 用 適 尺 張 紙 i本 42 釐 公 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4() 序列表 序列編號：1 序列長度：4 1 2 序列類型：胺基酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··肽 序列：

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala 5 10 15

Thr Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr lie 20 25 30

Gly lie lie Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gin 35 40 45

Gly Lys Val lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr 50 55 60

Pro Tyr Asp Asp His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala 65 70 75

Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala 80 85 90

Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly 95 100 105

Ser Gly Ser lie Ser Thr lie He Lys Gly Val Glu Trp Ala Val 110 115 120

Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly lie Lys Val lie Asn Leu Ser Leu 125 130 135

Gly Ser Ser Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala * -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 .B7 五、發明説明（41) • 140 145 150

Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala 155 160 165

Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr lie Gly *Ser Pro Ala Ala 170 175 180

Ala Ser Lys Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Val 185 190 195 lie Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu 200 205 210 f Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp lie lie Ala Ala Arg 215 220 225

Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gin Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr 230 235 240 ;

Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly lie ； 245 250 255

Ala Ala Leu Leu Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys 260 265 270

Val Lys Thr Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Lys Pro Asp 275 280 285

Glu lie Ala Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr 290 295 300

Lys Ala lie Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly 305 310 315

Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val lie Ser 、 ” 320 325 330

Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn 335 340 345

Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val :44- 本纸張尺度適用中國國家-標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A? B7 五、發明説明（ 350 355 360

Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr 365 370 375

Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr lie Lys Val Val Ser Tyr 380 385 390

Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser 395 ' 400 405

Leu Ser Gin Pro Gly Ser Ser 410 序列编號：2 序列長度·· 1236 序列類型··核酸 鏈數：雙鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：基因組DNA 起 >原：Pyrococcus furiosns 株名：DSM3638 序列：· GCAGAATTAG AAGGACTGGA TGAGTCTGCA GCTCAAGTTA TGGCAACTTA CGTTTGGAAC 60 TTGGGATATG ATGGTTCTGG AATCACAATA GGAATAATTG ACACTGGAAT TGACGCTTCT 120 CATCCAGATC TCCAAGGAAA AGTAATTGGG TGGGTAGATT TTGTCAATGG TAGGAGTTAT 180 CCATACGATG ACCATGGACA TGGAACTCAT GTAGCTTCAA TAGCAGCTGG TACTGGAGCA 240 GCAAGTAATG GCAAGTACAA GGGAATGGCT CCAGGAGCTA AGCTGGCGGG AATTAAGGTT 300 CTAGGTGCCG ATGGTTCTGG AAGCATATCT ACTATAATTA AGGGAGTTGA GTGGGCCGTT 360 GATAACAAAG ATAAGTACGG AATTAAGGTC ATTAATCTTT CTCTTGGTTC AAGCCAGAGC 420 TCAGATGGTA CTGACGCTCT AAGTCAGGCT GTTAATGCAG CGTGGGATGC TGGATTAGTT 480 GTTGTGGnG CCGCTGGAAA CAGTGGACCT AACAAGTATA CAATCGGTTC TCCAGCAGCT 540 ^ -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 A7 -B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43) GCAAGCAAAG TTAHACAGT TGGAGCCGTT GACAAGTATG ATGHATAAC AAGCTTCTCA 600 AGCAGAGGGC CAACTGCAGA CGGCAGGCTT AAGCCTGAGG TTGTTGCTCC AGGAAACTGG 660 ATAAnGCTG CCAGAGCAAG TGGAACTAGC ATGGGTCAAC CAATTAATGA CTATTACACA 720 GCAGCTCCTG GGACATCAAT GGCAACTCCT CACGTAGCTG GTATTGCAGC CCTCTTGCTC 780 CAAGCACACC CGAGCTGGAC TCCAGACAAA GTAAAAACAG CCCTCATAGA AACTGCTGAT 840 ATCGTAAAGC CAGATGAAAT AGCCGATATA GCCTACGGTG CAGGTAGGGT TAATGCATAC 900 AAGGCTATAA ACTACGATAA CTATGCAAAG CTAGTGTTCA CTGGATATGT TGCCAACAAA 960 GGCAGCCAAA CTCACCAGTT CGTTATTAGC GGAGCTTCGT TCGTAACTGC CACATTATAC 1020 TGGGACAATG CCAATAGCGA CCTTGATCTT TACCTCTACG ATCCCAATGG AAACCAGGTT 1080 GACTACTCTT ACACCGCCTA CTATGGATTC GAAAAGGTTG GHATTACAA CCCAACTGAT 1140 GGAACATGGA CAATTAAGGT TGTAAGCTAC AGCGGAAGTG CAAACTATCA AGTAGATGTG 1200 GTAAGTGATG GTTCCCTTTC ACAGCCTGGA AGTTCA ' · 1236 序列編號：3 序列長度：29 _ 序列類型：胺基酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：肽 序列： Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp lie Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr 5 10 15 Leu lie Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gin Ala 20 25 序列編號：4 序列長度：522 序列類型：胺基酸 -46- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） "" (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4.

、1T

530088 A7 -B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（44 ) 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··肽 序列特徵：第428號之Xaa爲Gly或Val 序列： Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala 5 10 15 Thr Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr lie 20 25 30 Gly lie lie Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gin 35 40 45 Gly Lys Val lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr 50 55 60 Pro Tyr Asp Asp His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser He Ala I 65 70 75 Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala 80 85 90 Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly 95 100 105 Ser Gly Ser lie Ser Thr lie lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val 110 115 120 Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly lie Lys Val lie Asn Leu Ser Leu 125 130 135 Gly Ser Ser Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala 140 145 150 Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala 155 160 165 -47 - 本纸張尺度適用中賴家^準（CNS ) A4規格（21GX 297公楚) ： ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 聚·

、1T

530088 A7 -B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（45 ) • 170 175 180 Ala Ser Lys Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Yal 185 190 195 lie Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu 200 205 210 Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp He lie Ala Ala Arg 215· 220 225 Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gin Pro He Asn Asp Tyr Tyr Thr 230 235 240 Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Yal Ala Gly lie 245 250 255 Ala Ala Leu Leu Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys · 260 265 270 Val Lys Thr Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Lys Pro Asp 275 280 285 Glu He Ala Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr 290 295 300 Lys Ala lie Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly 305 310 315 Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val lie Ser 320 325 330 Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn 335 340 345 Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val \ 350 355 360· Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr 365 370 375 Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr He Lys Val Val Ser Tyr -48 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -#衣.

、1T 丨善· 本紙?^尺度適用中國國家標準（〇奶）六4規格（21〇、乂 297公楚） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A7 ______B7 五、發明説明（46 )

Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr He Gly Ser Pro Ala Ala 380 385 390

Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser 395 400 405

Leu Ser.Gin Pro Gly Ser Ser Pro Ser Pro Gin Pro Glu Pro Thr ' 410 415 420

Val Asp Ala Lys Thr Phe Gin Xaa Ser Asp His Tyr Tyr Tyr Asp 425 430 435

Arg Ser Asp Thr Phe Thr Met Thr Val Asn Ser Gly Ala Thr Lys 440 445 450 lie Thr Gly Asp Leu Val Phe Asp Thr Ser Tyr His Asp Leu Asp 455 460 465

Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gin Lys Leu Val Asp Arg Ser Glu 470 475 480

Ser Pro Asn Ser Tyr Glu His Val Glu Tyr Leu Thr Pro Ala Pro 485 490 495

Gly Thr Trp Tyr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Tyr Thr Tyr Gly Trp 500 505 510

Ala Tyr Tyr Glu Leu Thr Ala Lys Val Tyr Tyr Gly 515 520 序列編號：5 序列長度·· 4765 序列類型：核酸 鏈數：雙鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：基因組DNA 起〉原:Pyrococcus furiosus 株名：DSM3638 / -49 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29J公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A 7 ____ . B7 五、發明説明（47) 序列： TTTAAATTAT AAGATATAAT CACTCCGAGT GATGAGTAAG ATACATCATT ACAGTCCCAA 60 AATGTTTATA ATTGGAACGC AGTGAATATA CAAAATGAAT ATAACCTCGG AGGTGACTGT 120 AGAATGAATA AGAAGGGACT TACTGTGCTA TTTATAGCGA TAATGCTCCT nCAGTAGTT 180 *. · CCAGTGCACT TTGTGTCCGC AGAAACACCA CCGGTTAGTT CAGAAAATTC AACAACTTCT 240 ATACTCCCTA.ACCAACAAGT TGTGACAAAA GAAGTTTCAC AAGCGGCGCT TAATGCTATA 300 ATGAAAGGAC AACCCAACAT GGnCTTATA ATCAAGACTA AGGAAGGCAA ACTTGAAGAG 360 GCAAAAACCG AGCTTGAAAA GCTAGGTGCA GAGATTCTTG ACGAAAATAG AGnCTTAAC 420 ATGTTGCTAG TTAAGATTAA GCCTGAGAAA GTTAAAGAGC TCAACTATAT CTCATCTCTT 480 GAAAAAGCCT GGCTTAACAG AGAAGTTAAG CTnCCCCTC CAAnGTCGA AAAGGACGTC 540 AAGACTAAGG AGCCCTCCCT AGAACCAAAA ATGTATAACA GCACCTGGGT AATTAATGCT 600 CTCCAGTTCA TCCAGGAAn TGGATATGAT GGTAGTGGTG nGHGnGC AGTACTTGAC 660 ACGGGAGHG ATCCGAACCA TCCTTTCTTG AGCATAACTC CAGATGGACG CAGGAAAAH 720 ATAGAATGGA AGGATTTTAC AGACGAGGGA nCGTGGATA CATCAHCAG CTTTAGCAAG 780 GTTGTAAATG GGACTCTTAT AATTAACACA ACAHCCAAG TGGCCTCAGG TCTCACGCTG 840 AATGAATCGA CAGGACTTAT GGAATACGH GTTAAGACTG TTTACGTGAG CAATGTGACC 900 ATTGGAAATA TCACTTCTGC TAATGGCATC TATCACTTCG GCCTGCTCCC AGAAAGATAC 960 HCGACTTAA ACTTCGATGG TGATCAAGAG GACTTCTATC CTGTCTTATT AGTTAACTCC 1020 ACTGGCAATG GTTATGACAT TGCATATGTG GATACTGACC HGACTACGA CTTCACCGAC 1080 GAAGTTCCAC TTGGCCAGTA CAACGTTACT TATGATGTTG CTGTTTTTAG CTACTACTAC 1140 GGTCCTCTCA ACTACGTGCT TGCAGAAATA GATCCTAACG GAGAATATGC AGTATTTGGG 1200 TGGGATGGTC ACGGTCACGG AACTCACGTA GCTGGAACTG nGCTGGm CGACAGCAAC 1260 AATGATGCTT GGGAnGGCT CAGTATGTAC TCTGGTGAAT GGGAAGTGTT CTCAAGACTC 1320 TATGGTTGGG AHATACGM CGTTACCACA GACACCGTGC AGGGTGTTGC TCCAGGTGCC 1380 CAAATAATGG CAATAAGAGT TCTTAGGAGT GATGGACGGG GTAGCATGTG·GGATATTATA 1440 GAAGGTATGA CATACGCAGC AACCCATGGT GCAGACGTTA TAAGCATGAG TCTCGGTGGA 1500 AATGCTCCAT ACTTAGATGG TACTGATCCA GAAAGCGTTG CTGTGGATGA GCTTACCGAA 1560 AAGTACGGTG TTGTAHCGT AATAGCTGCA GGAAATGAAG GTCCTGGCAT TAACATCGTT 1620 / - 50- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（48) • GGAAGTCCTG GTGHGCAAC AAAGGCAATA ACTGnGGAG CTGCTGCAGT GCCCAHAAC 168( GTTGGAGTTT ATGTTTCCCA AGCACTTGGA TATCCTGATT ACTATGGATT CTATTACTTC 174( CCCGCCTACA CAMCGHAG AATAGCATTC HCTCAAGCA GAGGGCCGAG AATAGATGGT 180C GAAATAAAAC CCAATGTAGT GGCTCCAGGT TACGGAAm ACTCATCCCT GCCGATGTGG 186C ATTGGCGGAG CTGACTTCAT GTCTGGAACT TCGATGGCTA CTCCACATGT CAGCGGTGTC 192C GHGCACTCC TCATAAGCGG GGCAAAGGCC GAGGGAATAT ACTACAATCC AGATATAATT 198C .AAGAAGGHC HGAGAGCGG TGCAACCTGG CTTGAGGGAG ATCCATATAC TGGGCAGAAG 204C TACACTGAGC TTGACCAAGG TCATGGTCTT GTTAACGm CCAAGTCCTG GGAAATCCTT 210C AAGGCTATAA ACGGGACCAC TCTCCCAATT GTTGATCACT GGGCAGACAA GTCCTACAGC 216C GACITTGCGG AGTACTTGGG TGTGGACGTT ATAAGAGGTC TCTACGCAAG GAACTCTATA 222C CCTGACATTG TCGAGTGGCA CAnAAGTAC GTAGGGGACA CGGAGTACAG AACTTTTGAG 228C ATCTATGCAA CTGAGCCATG GATTAAGCCT mGTCAGTG GAAGTGTAAT TCTAGAGAAC 234C AATACCGAGT TTGTCCTTAG GGTGAAATAT GATGTAGAGG GTCTTGAGCC AGGTCTCTAT 240C GHGGAAGGA TAATCATTGA TGATCCAACA ACGCCAGTTA TTGAAGACGA GATCTTGAAC 246C ACAATTGTTA TTCCCGAGAA GTTCACTCCT GAGAACAAH ACACCCTCAC CTGGTATGAT 252C ATTAATGGTC CAGAAATGGT GACTCACCAC nCTTCACTG TGCCTGAGGG AGTGGACGTT 258C CTCTACGCGA TGACCACATA CTGGGACTAC GGTCTGTACA GACCAGATGG AATGTTTGTG 264C TTCCCATACC AGCTAGAm TCTTCCCGCT GCAGTCTCAA ATCCAATGCC TGGAAACTGG 270C GAGCTAGTAT GGACTGGATT TAACTTTGCA CCCCTCTATG AGTCGGGCTT CCTTGTAAGG 276C ATTTACGGAG TAGAGATAAC TCCAAGCGTT TGGTACATTA ACAGGACATA CCTTGACACT 282C AACACTGAAT TCTCAAHGA ATTCAATATT ACTAACATCT ATGCCCCAAT TMTGCAACT 288C CTAATCCCCA TTGGCCTTGG AACCTACAAT GCGAGCGTTG AAAGCGHGG TGATGGAGAG 294C TTCTTCATM AGGGCATTGA AGTTCCTGAA GGCACCGCAG AGTTGMGAT TAGGATAGGC 300〔 AACCCAAGTG TTCCGAATTC AGATCTAGAC HGTACCTTT ATGACAGTM AGGCAATTTA 306( 、 GTGGCCTTAG ATGGAAACCC AACAGCAGAA GAAGAGGTTG TAGTTGAGTA TCCTAAGCCT 312( GGAGTTTATT CAATAGTAGT ACATGGTTAC AGCGTCAGGG ACGAAAATGG TAATCCAACG 318( ACAACCACCT HGACTTAGT TGHCAAATG ACCCTTGATA ATGGAAACAT AAAGCTTGAC 324( AAAGACTCGA TTATTCTTGG AAGCAATGAA AGCGTAGTTG TAACTGCAAA CATAACAATT 330( -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（49 ) GATAGAGATC ATCCTACAGG AGTATACTCT GGTATCATAG AGATTAGAGA TAATGAGGTC 3360 TACCAGGATA CAAATACTTC AAHGCGAAA ATACCCATAA CTTTGGTAAT TGACAAGGCG 3420 GACTTTGCCG HGGTCTCAC ACCAGCAGAG GGAGTACTTG GAGAGGCTAG AMHACACT 3480 CTAATTG'TAA AGCATGCCCT AACACTAGAG CCTGTGCCAA ATGCTACAGT GATTATAGGA 3540 AACTACACCT ACCTCACAGA CGAAAACGGT ACAGTGACAT TCACGTATGC TCCAACTAAG 3600 TTAGGCAGTG ATGAAATCAC AGTCATAGTT AAGAAAGAGA ACTTCAACAC ATTAGAGAAG 3660 .ACCTTCCAAA TCACAGTATC AGAGCCTGAA ATAACTGAAG AGGACATAAA TGAGCCCAAG 3720 CTTGCAATGT CATCACCAGA AGCAAATGCT ACCATAGTAT CAGTTGAGAT GGAGAGTGAG 3780 GGTGGCGTTA AAAAGACAGT GACAGTGGAA ATAACTATAA ACGGAACCGC TAATGAGACT 3840 ΟΟΑΑΟΑΑΤλΟ TGGTTCCTGT TCCTAAGAAG GCCGAAAACA TCGAGGTAAG TGGAGACCAC 3900 GTAATnCCT ATAGTATAGA GGAAGGAGAG TACGCCAAGT ACGTTATAAT TACAGTGAAG 3960 TTTGCATCAC CTGTAACAGT AACTGTTACT TACACTATCT ATGCTGGCCC AAGAGTCTCA 4020 ATCTTGACAC HAACHCCT TGGCTACTCA TGGTACAGAC TATATTCACA GAAGTTTGAC 4080 GAAHGTACC AAAAGGCCCT TGAATTGGGA GTGGACAACG AGACATTAGC TmGCCCTC 4140 AGCTACCATG AAAAAGCCAA AGAGTACTAC GAAAAGGCCC HGAGCTTAG CGAGGGTAAC 4200 ATAATCCAAT ACCTTGGAGA CATAAGACTA HACCTCCAT TAAGACAGGC ATACATCAAT 4260 GAAATGAAGG CAGTTAAGAT ACTGGAAAAG GCCATAGAAG AATTAGAGGG TGAAGAGTAA 4320 TCTCCMTTT TTCCCACTTT TTCTTTTATA ACATTCCAAG CCTTTTCTTA GCTTCTTCGC 4380 TCAHCTATC AGGAGTCCAT GGAGGATCAA AGGTAAGTTC AACCTCCACA TCTCTTACTC 4440 CTGGGATHC GAGTACTTTC TCCTCTACAG CTCTAAGAAG CCAGAGAGTT AAAGGACACC 4500 CAGGAGTTGT CATTGTCATC TTTATATATA CCGTTTTGTC AGGATTAATC TTTAGCTCAT 4560 AAAHAATCC AAGGTTTACA ACATCCATCC CAATTTCTGG GTCGATAACC TCCTTTAGCT 4620 TTTCCAGAAT CATTTCTTCA GTMTTTCAA GGTTCTCATC TTTGGTTTCT CTCACAAACC 4680 CAATTTCAAC CTGCCTGATA CCTTCTAACT CCCTAAGCTT GTTATATATC TCCAAAAGAG 4740 TGGCATCATC AATTTTCTCT TTAAA 4765 序列編號：6 序列長度：1398 ，/ -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A7 _ _ . B7 五、發明説明（5〇) 序列類型：胺基酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 ' 序列種類：肽 序列：

Met Asn Lys Lys Gly Leu Thr Val Leu Phe lie Ala lie Met Leu 5 10 15

Leu Ser Yal Val Pro Val His Phe Val Ser Ala Glu Thr Pro Pro 20 25 30

Val Ser Ser Glu Asn Ser Thr Thr Ser lie Leu Pro Asn Gin Gin 35 40 45

Val Val Thr Lys Glu Val Ser Gin Ala Ala Leu Asn Ala lie Met 50 55 60

Lys Gly Gin Pro Asn Met Val Leu lie lie Lys Thr Lys Glu Gly 65 70 75

Lys Leu Glu Glu Ala Lys Thr Glu Leu Glu Lys Leu Gly Ala Glu 80 85 90 lie Leu Asp Glu Asn Arg Val Leu Asn Met Leu Leu Val Lys He 95 100 105

Lys Pro Glu Lys Yal Lys Glu Leu Asn Tyr lie Ser Ser Leu Glu 110 115 120

Lys Ala Trp Leu Asn Arg Glu Val Lys Leu Ser Pro Pro lie Val 125 130 135

Glu Lys Asp Val Lys Thr Lys Glu Pro Ser Leu Glu Pro Lys Met 140 145 150

Tyr Asn Ser Thr Trp Val lie Asn Ala Leu Gin Phe lie Gin Glu 155 160 165

Phe Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Val Val Val Ala Yal Leu Asp Thr -53- 本纸張尺度適用中國國（CNS ) A4規格（210X 297公釐) ~一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

•530088 五、發明説明（51 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A? B7 170 175 180

Gly Val Asp Pro Asn His Pro Phe Leu Ser lie Thr Pro Asp Gly 185 190 195

Arg Arg Lys lie lie Glu Trp Lys Asp Phe Thr Asp Glu Gly Phe 200 205 210

Val Asp Thr Ser Phe Ser Phe Ser Lys Val Val Asn Gly Thr Leu 215 220 225 lie lie Asn Thr Thr Phe Gin Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asn 230 235 240

Glu Ser Thr Gly Leu Met Glu Tyr Val Val Lys Thr Val Tyr Val 245 250 255

Ser Asn Val Thr lie Gly Asn lie Thr Ser Ala Asn Gly He Tyr 260 265 270

His Phe Gly Leu Leu Pro Glu Arg Tyr.Phe Asp Leu Asn Phe Asp .275 280 285

Gly Asp Gin Glu Asp Phe Tyr Pro Val Leu Leu Val Asn Ser Thr 290 295 300

Gly Asn Gly Tyr Asp lie Ala Tyr Val Asp Thr Asp Leu Asp Tyr ' 305 310 315

Asp Phe Thr Asp Glu Val Pro Leu Gly Gin Tyr Asn Val Thr Tyr 320 325 330

Asp Val Ala Val Phe Ser Tyr Tyr Tyr Gly Pro Leu Asn Tyr Val 335 340 345

Leu Ala Glu lie Asp Pro Asn Gly Glu Tyr Ala Val Phe Gly Trp \ 350 355 360

Asp Gly His Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Gly 365 370 375

Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Ala Trp Asp Trp Leu Ser Met Tyr Ser -54 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 . A 7 -B7 — — 五、發明説明（） . 380 385 390

Gly Glu Trp Glu Val Phe Ser Arg Leu Tyr Gly Trp Asp Tyr Thr 395 400 405

Asn Val Thr Thr Asp Thr Val Gin Gly Val Ala Pro.Gly Ala Gin * 410 415 420 lie Met Ala He Arg Val Leu Arg Ser Asp Gly Arg Gly Ser Met 425 430 435

Trp Asp lie lie Glu Gly Met Thr Tyr Ala Ala Thr His Gly Ala 440 445 450

Asp Val lie Ser Met Ser Leu Gly Gly Asn Ala Pro Tyr Leu Asp 455 460 465

Gly Thr Asp Pro Glu Ser Val Ala Val Asp Glu Leu Thr Glu Lys 470 , 475 480

Tyr Gly Val Val Phe Val He Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Gly 485 490 495 lie Asn lie Val Gly Ser Pro Gly Val Ala Thr Lys Ala lie Thr 500 505 510

Val Gly Ala Ala Ala Val Pro He Asn Val Gly Val Tyr Val Ser 515 520 525

Gin Ala Leu Gly Tyr Pro Asp Tyr Tyr Gly Phe Tyr Tyr Phe Pro 530 535 540

Ala Tyr Thr Asn Val Arg lie Ala Phe Phe Ser Ser Arg Gly Pro 545 550 555

Arg lie Asp Gly Glu lie Lys Pro Asn Val Val Ala Pro Gly Tyr 560 565 570

Gly lie Tyr Ser Ser Leu Pro Met Trp lie Gly Gly Ala Asp Phe 575 580 585

Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Val ' -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（53 ) • 590 595 600

Ala Leu Leu lie Ser Gly Ala Lys Ala Glu Gly lie Tyr Tyr Asn 605 610 615

Pro Asp lie lie Lys Lys Val Leu Glu Ser Gly Ala Thr Trp Leu 620 625 · 630

Glu Gly Asp Pro Tyr Thr Gly Gin Lys Tyr Thr Glu Leu Asp Gin 635 640 645

Gly His Gly Leu Val Asn Val Thr Lys Ser Trp Glu lie Leu Lys 650 . 655 660

Ala lie Asn Gly Thr Thr Leu Pro lie Val Asp His Trp Ala Asp 665 670 675

Lys Ser Tyr Ser Asp Phe Ala Glu Tyr Leu Gly Val Asp Val lie · 680 685 690

Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Asn Ser lie Pro Asp lie Val Glu Trp 695 700 705

His He Lys Tyr Val Gly Asp Thr Glu Tyr Arg Thr Phe Glu lie 710 715 720

Tyr Ala Thr Glu Pro Trp He Lys Pro Phe Val Ser Gly Ser Val 725 730 735 lie Leu Glu Asn Asn Thr Glu Phe Val Leu Arg Val Lys Tyr Asp 740 745 750

Val Glu Gly Leu Glu Pro Gly Leu Tyr Val Gly Arg lie lie lie 755 760 765

Asp Asp Pro Thr Thr Pro Val lie Glu Asp Glu lie Leu Asn Thr 770 775 780 lie Val lie Pro Glu Lys Phe Thr Pro Glu Asn Asn Tyr Thr Leu 785 790 795

Thr Trp Tyr Asp lie Asn Gly Pro Glu Met Val Thr His His Phe f -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 A? B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（54 ) 800 805 810

Phe Thr Val Pro Glu Gly Yal Asp Val Leu Tyr Ala Met Thr Thr 815 820 825

Tyr Trp Asp Tyr Gly Leu Tyr Arg Pro Asp Gly Met Phe Val Phe 830 835 840

Pro Tyr Gin Leu Asp Tyr Leu Pro Ala Ala Val Ser Asn Pro Met 845 850 855

Pro Gly Asn Trp Glu Leu Val Trp Thr Gly Phe Asn Phe Ala Pro 860 865 870

Leu Tyr Glu Ser Gly Phe Leu Val Arg lie Tyr Gly Val Glu lie 875 880 885

Thr Pro Ser Val Trp Tyr lie Asn Arg Thr Tyr Leu Asp Thr Asn 890 895 900

Thr Glu Phe Ser lie Glu Phe Asn He Thr Asn lie Tyr Ala Pro 905 910 915

He Asn Ala Thr Leu lie Pro lie Gly Leu Gly Thr Tyr Asn Ala 920 925 930

Ser Val Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Phe Phe lie Lys Gly lie 935 940 945

Glu Val Pro Glu Gly Thr Ala Glu Leu Lys lie Arg lie Gly Asn 950 955 960

Pro Ser Val Pro Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Ser 965 970 975

Lys Gly Asn Leu Val Ala Leu Asp Gly Asn Pro Thr Ala Glu Glu 980 985 990

Glu Val Val Val Glu Tyr Pro Lys Pro Gly Val Tyr Ser lie Val 995 1000 1005

Val His Gly Tyr Ser Val Arg Asp Glu Asn Gly Asn Pro Thr Thr -57 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公瀣） ▼ 衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 · A7 B7 五、發明説明（55 ) • 1010 1015 · 1020

Thr Thr Phe Asp Leu Val Val Gin Met Thr Leu Asp Asn Gly Asn 1025 1030 1035 lie Lys Leu Asp Lys Asp Ser lie lie Leu Gly Ser Asn Glu Ser ' 1040 1045 1050

Val Val Val Thr Ala Asn lie Thr lie Asp Arg Asp His Pro Thr 1055 1060 1065

Gly Val Tyr Ser Gly lie lie Glu lie Arg Asp Asn Glu Val Tyr 1070 1075 1080

Gin Asp Thr Asn Thr Ser lie Ala Lys He Pro lie Thr Leu Val 1085 1090 1095 lie Asp Lys Ala Asp Phe Ala Val Gly Leu Thr Pro Ala Glu Gly 1100 , 1105 1110

Val Leu Gly Glu Ala Arg Asn Tyr Thr Leu He Val Lys His Ala 1115 1120 1125

Leu Thr Leu Glu Pro Val Pro Asn Ala Thr Val lie lie Gly Asn 1130 1135 1140

Tyr Thr Tyr Leu Thr Asp Glu Asn Gly Thr Val Thr Phe Thr Tyr 1145 1150 1155

Ala Pro Thr Lys Leu Gly Ser Asp Glu lie' Thr Val lie Val Lys 1160 1165 1170

Lys Glu Asn Phe Asn Thr Leu Glu Lys Thr Phe Gin lie Thr Val 1175 1180 1185

Ser Glu Pro Glu He Thr Glu Glu Asp He Asn Glu Pro Lys Leu 1190 1195 1200

Ala Met Ser Ser Pro Glu Ala Asn Ala Thr He Val Ser Val Glu 1205 1210 1215

Met Glu Ser Glu Gly Gly Val Lys Lys Thr Val Thr Val Glu He ,’ -58- ’ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A 7 B7 五、發明説明（56 ) 1220 1225 1230

Thr lie Asn Gly Thr Ala Asn Glu Thr Ala Thr lie Val Val Pro 1235 1240 1245

Val Pro Lys Lys Ala Glu Asn He Glu Val Ser Gly Asp His Val 1250 1255 1260 lie Ser Tyr Ser lie Glu Glu Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Val lie 1265 1270 1275

He Thr Val Lys Phe Ala Ser Pro Val Thr Val Thr Val Thr Tyr 1280 1285 1290

Thr lie Tyr Ala Gly Pro Arg Val Ser lie Leu Thr Leu Asn Phe 1295 1300 1305

Leu Gly Tyr Ser Trp Tyr Arg Leu Tyr Ser Gin Lys Phe Asp Glu 1310 1315 1320

Leu Tyr Gin Lys Ala Leu Glu Leu Gly Val Asp Asn Glu Thr Leu 1325 1330 1335

Ala Leu Ala Leu Ser Tyr His Glu Lys Ala Lys Glu Tyr Tyr Glu , 1340 1345 1350

Lys Ala Leu Glu Leu Ser Glu Gly Asn lie He Gin Tyr Leu Gly 1355 1360 1365

Asp He Arg Leu Leu Pro Pro Leu Arg Gin Ala Tyr lie Asn Glu 1370 1375 1380

Met Lys Ala Val Lys He Leu Glu Lys Ala lie Glu Glu Leu Glu 1385 1390 1395

Gly Glu.Glu 序列编號：7 序列長度·· 35 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 ' -59-: 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A7 B7 五、發明説明（57 ) 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： 、 GGWWSDRRTG nRRHGTHGC DGTDMTYGAC ACBGG 35 序列编號：8 序列長度：32 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： KSTCACGGAA CTCACGTDGC BGGHACDGH GC 32 序列编號：9 序列長度：33 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··其他核酸（合成DNA) 序列： ASCMGCAACH GTKCCVGCHA CGTGAGTTCC GTG 33 序列编號：1 0 序列長度：34 序列類型：核酸 -60- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A? B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 五、發明説明（58 ) 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA)、 序列： CHCCGSYVAC RTGBGGAGWD GCCATBGAVG TDCC 34 序列編號：1 1 序列長度：1977 序列類型··核酸 鍵數：雙鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··基因組DNA 起 >原·· Pyrococcus furiosus 株名：DSM2476 序列、 ATGAAGAGGT TAGGTGCTGT GGTGCTGGCA CTGGTGCTCG TGGGTCTTCT GGCCGGAACG 60 GCCCTTGCGG CACCCGTAAA ACCGGHGTC AGGAACAACG CGGHCAGCA GAAGAACTAC 120 GGACTGCTGA CCCCGGGACT GTTCAAGAAA GTCCAGAGGA TGAACTGGAA CCAGGAAGTG 180 GACACCGTCA TAATGHCGG GAGCTACGGA GACAGGGACA GGGCGGTTAA GGTACTGAGG 240 CTCATGGGCG CCCAGGTCAA GTACTCCTAC AAGATAATCC CTGCTGTCGC GGTTAAAATA 300 AAGGCCAGGG ACCTTCTGCT GATCGCGGGC ATGATAGACA CGGGTTACTT CGGTAACACA 360 AGGGTCTCGG GCATAAAGTT CATACAGGAG GATTACAAGG TTCAGGTTGA CGACGCCACT 420 TCCGTCTCCC AGATAGGGGC CGATACCGTC TGGAACTCCC TCGGCTACGA CGGAAGCGGT 480 GTGGTGGnG CCATCGTCGA TACGGGTATA GACGCGAACC ACCCCGATCT*GAAGGGCAAG 540 1 GTCATAGGCT GGTACGACGC CGTCAACGGC AGGTCGACCC CCTACGATGA CCAGGGACAC 600 GGAACCCACG HGCGGGTAT CGHGCCGGA ACCGGCAGCG TTAACTCCCA GTACATAGGC 660 GTCGCCCCCG GCGCGAAGCT CGTCGGCGTC AAGGTTCTCG GTGCCGACGG TTCGGGAAGC 720 ^ -61- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（59 J . GTCTCCACCA TCATCGCGGG TGnGACTGG GTCGTCCAGA ACAAGGACAA GTACGGGATA 780 AGGGTCATCA ACCTCTCCCT CGGCTCCTCC CAGAGCTCCG ACGGAACCGA CTCCCTCAGT 840 CAGGCCGTCA ACAACGCCTG GGACGCCGGT ATAGTAGTCT GCGTCGCCGC CGGCAACAGC 900 GGGCCGAACA CCTACACCGT CGGCTCACCC GCCGCCGCGA GCAAGGTCAT AACCGTCGGT 960 GCAGHGACA GCAACGACAA CATCGCCAGC HCTCCAGCA GGGGACCGAC CGCGGACGGA 1020 AGGCTCAAGC CGGAAGTCGT CGCCCCCGGC GTTGACATCA TAGCCCCGCG CGCCAGCGGA 1080 ACCAGCATGG GCACCCCGAT AAACGACTAC TACACCAAGG CCTCTGGAAC CAGCATGGCC 1140 ACCCCGCACG TTTCGGGCGT TGGCGCGCTC ATCCTCCAGG CCCACCCGAG CTGGACCCCG 1200 GACAAGGTGA AGACCGCCCT CATCGAGACC GCCGACATAG TCGCCCCCAA GGAGATAGCG 1260 GACATCGCCT ACGGTGCGGG TAGGGTGAAC GTCTACAAGG CCATCAAGTA CGACGACTAC 1320 GCCAAGCTCA CCTTCACCGG CTCCGTCGCC GACAAGGGAA GCGCCACCCA CACCTTCGAC 1380 GTCAGCGGCG CCACCHCGT GACCGCCACC CTCTACTGGG ACACGGGCTC GAGCGACATC 1440 GACCTCTACC TCTACGACCC CAACGGGAAC GAGGHGACT ACTCCTACAC CGCCTACTAC 1500 GGCTTCGAGA AGGTCGGCTA CTACAACCCG ACCGCCGGAA CCTGGACGGT CAAGGTCGTC 1560 AGCTACAAGG GCGCGGCGAA CTACCAGGTC GACGTCGTCA GCGACGGGAG CCTCAGCCAG 1620 TCCGGCGGCG GCAACCCGAA TCCAAACCCC AACCCGAACC CAACCCCGAC CACCGACACC 1680 CAGACCTTCA CCGGTTCCGT TAACGACTAC TGGGACACCA GCGACACCTT CACCATGAAC 1740 GTCAACAGCG GTGCCACCAA GATAACCGGT GACCTGACCT TCGATACTTC CTACAACGAC 1800 CTCGACCTCT ACCTCTACGA CCCCAACGGC AACCTCGTTG ACAGGTCCAC GTCGAGCAAC 1860 AGCTACGAGC ACGTCGAGTA CGCCAACCCC GCCCCGGGAA CCTGGACGTT CCTCGTCTAC 1920 GCCTACAGCA CCTACGGCTG GGCGGACTAC CAGCTCAAGG CCGTCGTCTA CTACGGG 1977 序列编號^ 1 2 序列長度：659 序列類型：胺基酸 鱗數：單鏈 典樸結構：直鏈狀 序列種類：肽 序列：

Met Lys Arg Leu Gly Ala Val Val Leu Ala Leu Val Leu Val Gly . -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 · 五、發明説明（60 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 5 10 15

Leu Leu Ala Gly Thr Ala Leu Ala Ala Pro Yal Lys Pro Val Val 20 25 30

Arg Asn Asn Ala Val Gin Gin Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Thr Pro * 35 40 45

Gly Leu Phe Lys Lys Val Gin Arg Met Asn Trp Asn Gin Glu Val 50 55 60

Asp Thr Val He Met Phe Gly Ser Tyr Gly Asp Arg Asp Arg Ala 65 - 70 75

Val Lys Val Leu Arg Leu Met Gly Ala Gin Val Lys Tyr Ser Tyr t 80 85 90

Lys lie lie Pro Ala Val Ala Val Lys lie Lys Ala Arg Asp Leu 95 . 100 105

Leu Leu lie Ala Gly Met lie Asp Thr Gly Tyr Phe Gly Asn Thr 110 115 120

Arg Val Ser Gly lie Lys Phe lie Gin Glu Asp Tyr Lys Val Gin 125 130 135

Val Asp Asp Ala Thr Ser Val Ser Gin lie Gly Ala Asp Thr Val 140 145 150

Trp Asn Ser Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Val Val Val Ala lie 155 160 165

Val Asp Thr Gly lie,Asp Ala Asn His Pro Asp Leu Lys Gly Lys 170 175 180

Val lie Gly Trp Tyr Asp Ala Val Asn Gly Arg Ser Thr Pro Tyr \ 185 190 195·

Asp Asp Gin Gly His Gly Thr His Val Ala Gly lie Val Ala Gly 200 205 210

Thr Gly Ser Val Asn Ser Gin Tyr lie Gly Val Ala Pro Gly Ala -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇:<297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 A7 B7 五、發明説明（61 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 215 220 225 Lys Leu Val Gly Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser 230 235 240 Val Ser Thr He He Ala Gly Val Asp Trp Val Val Gin Asn Lys ' 245 250 255 Asp Lys Tyr Gly lie Arg Val lie Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser 260 265 270 Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ser Leu Ser Gin Ala Val Asn Asn 275 280 285 Ala Trp Asp Ala Gly lie Val Val Cys Val Ala Ala Gly Asn Ser 290 295 300 Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys 305 , 310 315 Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Asp Asn He Ala Ser 320 325 330 Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Lys Pro Glu 335 340 345 Val Val Ala Pro Gly Val Asp He He Ala Pro Arg Ala Ser Gly 350 355 360 Thr Ser Met Gly Thr Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr Lys Ala Ser 365 370 375 Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Gly Ala Leu 380 385 390 He Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys Thr \ 395 400 405 . Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Ala Pro Lys Glu lie Ala 410 415 420 Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Val Tyr Lys Ala lie -64 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ψ 訂

530088 · A7 B7 五、發明説明（62 425 430 435

Lys Tyr Asp Asp Tyr Ala Lys Leu Thr Phe Thr Gly Ser Val Ala 440 445 450

Asp Lys Gly Ser Ala Thr His Thr Phe Asp Val Ser Gly Ala Thr ' 455 460 465

Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Thr Gly Ser Ser Asp lie 470 475 480

Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Glu Val Asp Tyr Ser 485 490 · 495

Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro 500 505 510

Thr Ala Gly Thr Trp Thr Val Lys Val Val Ser Tyr Lys Gly Ala · 515 . 520 525

Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gin 530 535 540

Ser Gly Gly Gly Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Thr 545 550 555

Pro Thr Thr Asp Thr Gin Thr Phe Thr Gly Ser Val Asn Asp Tyr 560 565 570

Trp Asp Thr Ser Asp Thr Phe Thr Met Asn Val Asn Ser Gly Ala 575 580 585 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Thr Lys lie Thr Gly Asp Leu Thr Phe Asp Thr Ser Tyr Asn Asp 590 - 595 600

Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Leu Val Asp Arg \ · 605 610 615

Ser Thr Ser Ser Asn Ser Tyr Glu His Val Glu Tyr Ala Asn Pro .620 625 630

Ala Pro Gly Thr Trp Thr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Ser Thr Tyr -65 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（63) 635 640 645

Gly Trp Ala Asp Tyr Gin Leu Lys Ala Val Val Tyr Tyr Gly 650 655 序列编號^ 1 3 序列長度：28 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··其他核酸（合成DNA) 序列： AGAGGGATCC ATGAAGGGGC TGAAAGCT * 28 序列編號：14 序列長度：28 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： AGAGGCATGC GCTCTAGACT CTGGGAGAGT 28

序列编號：15 序列長度：1962 序列類型：核酸 鏈數：雙鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：基因組DNA 〆 * -66- 本紙張尺度適用中國囪家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 530088 A 7 _ B7 五、發明説明（64) 起〉原：Pyrococcus furiosns 株名·· DSM3638 序列： ATGAAGGGGC TGAAAGCTCT CATATTAGTG ATTTTAGTTC TAGGTTTGGT AGTAGGGAGC 60 GTAGCGGCAG CTCCAGAGAA GAAAGHGAA CAAGTAAGAA ATGTTGAGAA GAACTATGGT 120 CTGCTAACGC CAGGACTGTT CAGAAAAATT CAAAAATTGA ATCCTAACGA GGAAATCAGC 180 ACAGTAATTG TATTTGAMA CCATAGGGAA AAAGAAATTG CAGTAAGAGT 丁CTTGAGTTA 240 ATGGGTGCAA AAGmGGTA TGTGTACCAT ATTATACCCG CAATAGCTGC CGATCTTAAG 300 GTTAGAGACT TACTAGTCAT CTCAGGTTTA ACAGGGGGTA AAGCTAAGCT TTCAGGTGTT 360 AGGTTTATCC AGGAAGACTA CAAAGTTACA GTHCAGCAG AATTAGAAGG ACTGGATGAG 420 TCTGCAGCTC AAGTTATGGC AACTTACGTT TGGAACTTGG GATATGATGG TTCTGGAATC 480 ACAATAGGAA TkKnGKCkC TGGAATTGAC *GCTTCTCATC CAGATCTCCA AGGAAAAGTA 540 ATTGGGTGGG TAGATTTTGT CAATGGTAGG AGmTCCAT ACGATGACCA TGGACATGGA 600 ACTCATGTAG CTTCAATAGC AGCTGGTACT GGAGCAGCAA GTAATGGCAA GTACAAGGGA 660 ATGGCTCCAG GAGCTAAGCT GGCGGGAATT AAGGTTCTAG GTGCCGATGG TTCTGGAAGC 720 ATATCTACTA TAATTAAGGG AGTTGAGTGG GCCGHGATA ACAAAGATAA GTACGGAATT 780 AAGGTCAHA ATCTTTCTCT TGGTTCAAGC CAGAGCTCAG ATGGTACTGA CGCTCTAAGT 840 CAGGCTGTTA ATGCAGCGTG GGATGCTGGA TTAGTTGTTG TGGHGCCGC TGGAAACAGT 900 GGACCTAACA AGTATACAAT CGGTTCTCCA GCAGCTGCAA GCAAAGTTAT TACAGTTGGA 960 GCCGTTGACA AGTATGATGT TATAACAAGC TTCTCAAGCA GAGGGCCAAC TGCAGACGGC 1020 AGGCTTAAGC CTGAGGTTGT TGCTCCAGGA AACTGGATM HGCTGCCAG AGCAAGTGGA 1080 ACTAGCATGG GTCAACCAAT TAATGACTAT TACACAGCAG CTCCTGGGAC ATCAATGGCA 1140 ACTCCTCACG TAGCTGGTAT TGCAGCCCTC TTGCTCCAAG CACACCCGAG CTGGACTCCA 1200 GACAAAGTAA AAACAGCCCT CATAGAAACT GCTGATATCG TAAAGCCAGA TGAAATAGCC 1260 GATATAGCCT ACGGTGCAGG TAGGGTTAAT GCATACAAGG CTATAAACTA CGATAACTAT 1320 GCAAAGCTAG TGTTCACTGG ATATGTTGCC AACAAAGGCA GCCAAACTCA CCAGTTCGTT 1380 ATTAGCGGAG CHCGHCGT AACTGCCACA TTATACTGGG ACAATGCCAA TAGCGACCTT 1440 ✓ 丨 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（65) GATCTTTACC TCTACGATCC CAATGGAAAC CAGGHGACT ACTCTTACAC CGCCTACTAT 1500 GGAHCGAAA AGGTTGGTTA mCAACCCA ACTGATGGAA CATGGACAAT TAAGGTTGTA 1560 AGCTACAGCG GAAGTGCAAA CTATCAAGTA GATGTGGTAA GTGATGGTTC CCTTTCACAG 1620 CCTGGAAGTT CACCATCTCC ACAACCAGAA CCAACAGTAG ACGCAAAGAC GTTCCAAGGA 1680 TCCGATCACT ACTACTATGA CAGGAGCGAC ACCTTTACAA TGACCGTTAA CTCTGGGGCT 1740 ACAAAGAm CTGGAGACCT AGTGTTTGAC ACAAGCTACC ATGATCTTGA CCTTTACCTC 1800 TACGATCCTA ACCAGAAGCT TGTAGATAGA TCGGAGAGTC CCAACAGCTA CGAACACGTA 1860 GAATACTTAA CCCCCGCCCC AGGAACCTGG TACTTCCTAG TATATGCCTA CTACACTTAC 1920 GGTTGGGCTT ACTACGAGCT GACGGCTAAA GTTTATTATG GC 1962 序列编號‘：1 6 序列長度：654 序列類型：胺基酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀1 序列種類：肽 序列：

Met Lys Gly Leu Lys Ala Leu lie Leu Val lie Leu Val Leu Gly 5 10 15

Leu Val Val Gly Ser Val Ala Ala Ala Pro Glu Lys Lys Yal Glu 20 25 30

Gin Yal Arg Asn Val Glu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Thr Pro Gly 35 40 45

Leu Phe Arg Lys lie Gin Lys Leu Asn Pro Asn Glu Glu lie Ser 50 55 60

Thr Val lie Val Phe Glu Asn His Arg Glu Lys Glu lie Ala Val 65 70 75

Arg Val Leu Glu Leu Met Gly Ala Lys Val Arg Tyr Val Tyr His 80 85 90 -68 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公漦） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 lie Ala Ala Asp Leu Lys Val Arg Asp Leu Leu 95 100 105

Val lie Ser Gly Leu Thr Gly Gly Lys Ala Lys Leu Ser Gly Val 110 115 120

Arg Phe lie Gin Glu Asp Tyr Lys Val Thr Val Ser Ala Glu Leu 125 130 135

Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala Thr Tyr Val 140 145 150

Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly He Thr lie Gly He lie 155 160 165

Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gin Gly Lys Val 170 175 180 lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp 185 190 195

Asp His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala Ala Gly Thr 200 205 210

Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala 215 220 225

Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser 230 235 240 lie Ser Thr lie lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys 245 250 255

Asp Lys Tyr Gly lie Lys Val lie Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser 260 265 270

Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala Val Asn Ala 275 280 285

Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser 290 295 300 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4.規格（210XM7公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（67)

Gly Pro Asn Lys Tyr Thr lie Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys 305 310 315

Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Val lie Thr Ser 320 325 330

Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Lys Pro Glu 335 340 345

Val Val Ala Pro Gly Asn Trp lie lie Ala Ala Arg Ala Ser Gly 350 355 360

Thr Ser Met Gly Gin Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr Ala Ala Pro 365 370 375

Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly lie Ala Ala Leu 380 ’385 390 ·

Leu Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys Thr 395 400 405

Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Lys Pro Asp Glu lie Ala 410 415 420

Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala lie 425 430 435

Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala 440 445 450

Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val lie Ser Gly Ala Ser 455 460 465

Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu 470 475 480

Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val Asp Tyr Ser 485 490 495

Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro 500 505 510 -70- 本纸張尺度適用中國國家；^ (〇^)^&(2丨〇>< 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（68) Thr Asp Gly Thr Trp Thr lie Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser 515 520 525 Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gin 530 535 540 Pro Gly Ser Ser Pro Ser Pro Gin Pro Glu Pro Thr Val Asp Ala 545 550 555 Lys Thr Phe Gin Gly Ser Asp His Tyr Tyr Tyr Asp Arg Ser Asp 560 565 570 Thr Phe Thr Met Thr Val Asn Ser Gly Ala Thr Lys lie Thr Gly 575 580 585 Asp Leu Val Phe Asp Thr Ser Tyr His Asp Leu Asp Leu Tyr Leu 590 595 600 Tyr Asp Pro Asn Gin Lys Leu Val Asp Arg Ser Glu Ser Pro Asn 605 610 615 Ser Tyr Glu His Val Glu Tyr Leu Thr Pro Ala Pro Gly Thr Trp . 620 625 630 Tyr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Tyr Thr Tyr Gly Trp Ala Tyr Tyr 635 640 645 Glu Leu Thr Ala Lys Val Tyr Tyr Gly 650 序列编號：1 7 序列長度：25 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： -71 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，#衣 訂_

530088 A7 B7 五、發明説明（69) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 TCTGAATTCG TTCTTTTCTG TATGG 25 序列編號：1 8 序列長度：20 序列類型··核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： TGTACTGCTG GATCCGGCAG 20 序列编號·· 1 9 序列長度：25 序列類型··核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： AGAGGCATGC GTATCCATCA GATTTTTGAG 30 序列编號：20 序列長度：20 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··其他核酸（合成DNA) -72- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·#裝· 訂 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 530088 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（70) 序列： AGTGAACGGA TACTTGGAAC 20 序列编號：21 序列長度：20 序列類型··核酸 鏈數··單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··其他核酸（合成DNA) 序列： GTTCCAAGTA TCCGTTCACT 20 序列编號：22 序列長度：12 序列類型：胺基酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··肽 序列： Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin 5 10 序列編號：23 序列長度：24 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 -73 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁

、1T 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（71) 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： TCATGGATCC ACCCTCTCCT TTTA 24 序列编號：24 序列長度：2 6 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GTCTGCGCAG GCTGCCGGAN NNNNNATGAA GGGGCTGAAA GCTCTC 26 序列編號：25 序列長度：29 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鍵狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： GAGAGCTTTC AGCCCCTTCA TNNNNNNTCC GGCAGCCTGC GCAGACATG 29 序列编號：26 序列長度：27 序列類型：核酸 鏈數··單鏈 -74- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁

、1T 530088 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（72) 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列：. AGAGGGGGAT CCGTGAGAAG CAAAAAA 27 序列編號：27 序列長度：20 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓撲結構：直鏈狀 序列種類··其他核酸（合成DNA) 序列： GATGACTAGT AAGTCTCTAA 20 序列编號：28 序列長度：20 序列類型：核酸 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類：其他核酸（合成DNA) 序列： AAGCCTGAGG TTGTTGCTCC 20 序列編號：29 序列長度：29 序列類型··核酸 -75- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

530088 A7 B7 五、發明説明（73) 鏈數：單鏈 拓樸結構：直鏈狀 序列種類··其他核酸（合成DNA) 序列： GGGCATGCTC ATGAACTTCC AGGCTGTGA 29 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 衣·

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

1. 530088 A8 第087109161號專利申請案 bs 中文申請專利範圍替換本(92年2月）D8

   公告本 六、申請專利範圍 1. 一種耐熱性蛋白酶，其係由自序列表中序列編號4所示胺 基酸序列之C末端發生1個以上，110個以下胺基酸之缺 失之胺基酸序列所構成，且具有耐熱性之蛋白酶活性，該 序列編號4之胺基酸序列如下： Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Yal Met Ala 5 10 15 丁hr Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr lie 20 25 30 Gly He'He Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gin • 暑 35 40 45 Gly Lys Val lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr 50 55 ·· 60 Pro Tyr Asp Asp His Gly His Gly Thr His Yal Ala Ser He Ala , 65 70 75 Ala *Gly Thr Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala 80 85 90 Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly 95 100 105 Ser Gly Ser lie Ser Thr lie lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val 110 115 120 Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly lie Lys Val lie Asn Leu Ser Leu .125 130 135 Gly Ser Ser Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala .140 145 150 Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala 155 160 - 165 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 530088 8 8 8 8 A BCD 夂、申請專利範圍 170 175 180 Ala Ser Lys Val He Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Yal 185 190 195 He Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu 200 * 205 210 ! Lys Pro Glu Yal Yal Ala Pro Gly Asn Trp lie lie Ala Ala Arg 215· 220 225 Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gin Pro He Asn Asp Tyr Tyr Thr .. 230 , 235 ' 240 Ala Ala，Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly lie 245 ' 250 255 Ala Ala Leu Leu Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys 260 265 270 Yal Lys Thr Ala Leu He Glu Thr Ala Asp lie Val lys Pro Asp 275 280 285 Glu He Ala Asp He Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Yal Asn Ala Tyr --- 290 295 300 Lys Ala He Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly 305 310 ^ 315 Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val lie Ser 320 325 330 ;Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn 335 340 345 Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val 350 355 360 Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr 365 370 . 375 Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr lie Lys Yal Yal Ser Tyr -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 530088 8 8 8 8 A B c D $、申請專利範圍 Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr lie Gly Ser Pro Ala Ala 380 385 390 Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Yal Ser Asp Gly Ser 395 400 405 Leu Ser.Gin Pro .Gly Ser Ser Pro Ser Pro Gin Pro Glu Pro Thr * 410 415 420 Val Asp Ala Lys Thr Phe Gin Xaa Ser Αέρ His Tyr Tyr Tyr Asp 425 430 435 Arg Ser Asp Thr Phe Thr Met Thr Yal Asn Ser Gly Ala Thr Lys 440 445 450 lie Thr Gly Asp Leu Val Phe Asp Thr Ser Tyr His Asp Leu Asp 455 460 465 Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gin L*ys Leu Yal Asp Arg Ser Glu 470 s 475 480 Ser Pro Asn Ser Tyr Glu His Yal Glu Tyr Leu Thr Pro Ala Pro t 485 490 495 Gly Thr Trp Tyr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Tyr Thr Tyr Gly Trp -· · 500 505 510 Ala Tyr Tyr Glu Leu Thr Ala Lys Val Tyr Tyr Gly 515 520 。 2.根據申請專利範圍第1項之耐熱性蛋白酶，其係由序列表 中序列編號1所示之胺基酸序列所構成，該序列編號1 之胺基酸序列如下： Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala 5 10 ' 15 inr Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr lie 20 25 30 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 8 8 8 8 A B CD 530088 々、申請專利範圍 Gly lie lie Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gin 35 40 45 Gly Lys Val lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr 50 55 60" 1 Pro Tyr Asp Asp His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala 65. 70 75 Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala 80 85 90 Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly He Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly 95 100 105 Ser Gly Ser lie Ser Thr lie lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val 110 '115 120 Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly He Lys Val lie Asn Leu Ser Leu _ 125 130 135 Gly Ser Ser Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala _ · 140 145 150 Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Yal Val Val Val Ala Ala 155 160· 165 Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr lie Gly .Ser Pro Ala Ala * 170 175 180 ;Ala Ser Lys Yal lie Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Val 185 190 195 lie Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu 200 205 210 Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp lie lie Ala Ala Arg . * 215 220 225 Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gin Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr 230 , 235 240 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規择(210X297公釐) 8 8 8 8 ABC D 530088 六、申請專利範圍 Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Yal Ala Gly lie —* 245 250 255 Ala Ala Leu Leu Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys 260 265 270 Val Lys Thr Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp He Val Lys Pro Asp . 275 280 285 Glu lie Ala Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr 290 295 300 Lys Ala He Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Yal ?he Thr Gly -， 305 310 315 Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Fbe Val lie Ser \ 320 325 330 Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Aso Asn Ala Asn 335 340 345 Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val i 350 355 360 Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr 365 370 375 Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr lie Lys Val Val Ser Tyr ' 380 * 385 · 390 Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gin Yal Asp Val Val Ser Asp Gly Ser 395 ' · 400 405 Leu Ser Gin Pro Gly Ser Ser 410 〇 3. —種編碼耐熱性蛋白酶蛋白質之核酸序列，其中該蛋白質 係由自序列表中序列編號4所示胺基酸序列之C末端發 生1個以上，1 1 0個以下胺基酸之缺失的胺基酸序列所構 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 六、申請專利範圍 成，且具有耐熱性蛋白酶之活性，該序列編4之胺基酸序 列如申請專利範圍第1項所示。 4. 根據申請專利範圍第3項之核酸序列，其係編碼序列如序 列編號1所示之胺基酸序列，該序列編號1之胺基酸序列 如申請專利範圍第2項所示。 5. 根據申請專利範圍第4項之核酸序列，其係由如下示序列 表中序列編號2所示之鹼基序列所構成， GCAGAATTA'G AAGGACTGGA TGAGTCTGCA GCTCAAGHA TGGCAACTTA CGTTTGGAAC 60 TTGGGATATG ATGGnCTGG AATCACAATA GGAATAATTG ACACTGGAAT TGACGCTTCT 120 CATCCAGATC TCCAAGGAAA AGTAAHGGG TGGGTAGAn TTGTCMTGG TAGGAGTTAT 180· CCATACGATG ACCATGGACA TGGAACTCAT GTAGCTTCAA TAGCAGCTGG TACTGGAGCA 240 GCAAGTAATG GCMGTACAA GGGAATGGCT CCAGGAGCTA AGCTGGCGGG AATTAAGGTT 300 CTAGGTGqCG ATGGTTCTGG AAGCATATCT ΑΟΤΑΤΑΑπΑ AGGGAGHGA GTGGGCCGTT 360 GATAACAMG ATAAGTACGG AAnAAGGTC AnAATCTTT CTCTTGGnC AAGCCAGAGC 420 TCAGATGGTA CTGACGCTCT AAGTCAGGCT GTTAATGCAG CGTGGGATGC TGGAnAGTT 480 GTTGTGGnG CCGCTGGAAA CAGTGGACCT AACAAGTATA CAATCGGHC TCCAGCAGCT 540 GCAAGCAAAG HAHACAGT TGGAGCCGH GACAAGTATG ATGHATAAC AAGCTTCTCA 600 AGCAGAGGGC CAACTGCAGA CGGCAGGCTT AAGCCTGAGG nGHGCTCC AGGAAACTGG 660 ATAAHGCTG CCAGAGCAAG TGGAACTAGC ATGGGTCAAC CAATTAATGA CTAmCACA 720 GCAGCTCCTG GGACATCAAT GGCAACTCCT CACGTAGCTG GTATTGCAGC CCTCTTGCTC 780 CAAGCACACC CGAGCTGGAC TCCAGACAAA GTAAAMCAG CCCTCATAGA AACTGCTGAT 840 ATCGTAAAGC CAGATGAAAT AGCCGATATA GCCTACGGTG CAGGTAGGGT TAATGCATAC 900 AAGGCTATAA ACTACGATAA CTATGCAMG CTAGTGTTCA CTGGATATGT TGCCAACAAA 960 GGCAGCCAM CTCACCAGTT CGmnAGC GGAGCTTCGT TCGTAACTGC CACAmTAC 1020 TGGGACAATG CCAATAGCGA CCTTGATCTT*TACCTCTACG ATCCCAATGG AMCCAGGTT 1080 GACTACTCTT ACACCGCCTA CTATGGATTC GAAAAGGHG GmmCAA CCCAACTGAT 1140 •6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 530088 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍 GCAACATGGA CMTTAAGGT TGTAAGCTAC AGCGGAAGTG CAAACTATCA AGTAGATGTG 1200 GTAAGTGATG GnCCCTTTC ACAGCCTGGA *AGTTCA . 1236 ο 6. —種編碼耐熱性蛋白酶之核酸序列，其可於嚴苛條件 (stringent conditio η)下，與根據申請專利範圍第5項之核 酸序列進行雜交反應，且具有耐熱性蛋白酶之活性，其 中該嚴苛條件為：將固定有DNA之薄膜，於含有 0.5%803、0.1%牛血清白蛋白（33八）、0.1%聚乙烯吡咯啶 酮、〇♦ l%Ficoll 400，及0.01%改質鮭魚精子DNA之 6xSSC(lxSSC 係表 0.15MNaCn、0.015M 擰檬酸鈉、pH7) 中，在50°C下與探針一同溫育12-20小時。 7· —種編碼下式[I]所表胺基酸序列之核酸序列： SIG-Ala-Gly-Gly-Asn-PRO [I] [式中，SIG為序列表中序列編號3所示之胺基酸序列， 該序列編號3之胺基酸序列如下： Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp lie Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr -.. 5 10 15 Leu lie Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn· Met···Ser-Ala-Gin Ala 20 25 且其中PRO係包含根據申請專利範圍第i或2項之耐熱性 蛋白酶之胺基酸序列]。 8·根據申請專利範圍第7項之核酸序列，其係包含於選自 pSP0124 及 pSP0124Z\C 之質體(CCRC 94021 1 )中。 9·根據申請專利範圍第7項之核酸序列，其中PRO係包含 根據申請專利範圍第2項之耐熱性蛋白酶之胺基酸序 本紙張尺度適用中國國家標準(CNs) A4規格(210 X 297公釐） 530088

   六、申請專利範圍 列。 ία —種耐熱性蛋白酶蛋白質之製造方法，其特徵在於包含 下列步驟：培養經導入根據申請專利範圍第7_9項中任 一項之核酸序列後的芽胞桿菌屬細菌，再由該 培養物中採取目標蛋白質。 11.根據申請專利範圍第丨〇項之製造方法，其中芽胞桿菌屬 細菌為枯草芽胞桿菌。 12·根據申請專利範圍第10項之製造方法，其中根據申請專 利範圍第7-9項中任一項之核酸序列係經由質體載體導 入芽胞捍菌屬細菌。 13.根據申請專利範圍第12項之製造方法，其中係將選自 pSP〇 124 及 pSPO 124 △(：之質體（CCRC 94021 1 )導入芽 胞样菌屬細菌。 14根據申請專利範圍第13項之製造方法，其特徵在於包含 下列步騾：培養枯草芽胞样菌DB104/pSPO124AC FERM P-16227，再由該培養物中採取目標蛋白質。 本紙張尺度適财®國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)