CN111876435A

CN111876435A - 一种海洋嗜热胶原蛋白酶a69及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111876435A
Application number: CN202010759625.1A
Authority: CN
Inventors: 张玉忠; 程俊慧; 陈秀兰; 宋晓妍; 张晓玉
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明涉及一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69及其编码基因与应用。一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；上述编码基因表达的海洋嗜热胶原蛋白酶A69，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明中的海洋嗜热胶原蛋白酶A69具有在高温条件下保持高活性的特点，以及良好的热稳定性，其最适酶活温度为60℃，在60℃保温90min仍可以保留55～60％的酶活。同时能够降解不溶性胶原蛋白，产生低分子量胶原蛋白多肽和寡肽，从而制备胶原蛋白肽，用于食品、医药保健、化妆品等领域。

Description

一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69及其编码基因与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

胶原蛋白广泛存在于动物的骨、肌腱、韧带和皮肤等实质器官。牛骨骼中主要有机成分是胶原蛋白，作为肉牛产业的副产物之一，我国牛骨产量非常大，因此，来源于牛骨的胶原蛋白也数量巨大，可作为生产胶原蛋白肽的优质原料。

胶原蛋白肽被广泛应用于医药、化妆品、保健食品等领域。虽然我国胶原蛋白肽的用量和生产量都很大，但是我国胶原蛋白肽的生产厂家都是购买国外公司的商品化蛋白酶用于制备胶原蛋白肽，缺乏自主研发的胶原蛋白肽生产用酶。

2018年，在我国发布的第一个有关胶原蛋白肽的国家标准(GB31645-2018)中，对胶原蛋白肽的定义是：以富含胶原蛋白的新鲜动物组织(包括皮、骨、筋、腱、鳞等)为原料，经提取、水解、精制生产的，相对分子量低于10000Da的产品，主要理化指标是：相对分子量低于10000Da的胶原蛋白肽所占比例≥90％。在通过酶解法制备胶原蛋白肽的过程中，主要的核心技术是获取高度底物专一性的胶原蛋白酶。到目前为止，我国用于制备胶原蛋白肽的工具酶主要为商业化的蛋白酶，主要有三类：植物性蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶)、细菌性蛋白酶(枯草杆菌的碱性蛋白酶、中性蛋白酶)、动物蛋白酶(胰酶、胶原酶)。例如中国专利文献CN110923283A公开了一种用微生物对鳗鱼骨发酵制备功能性多肽的方法，将鳗鱼鱼骨首先用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行初步酶解，形成小分子蛋白，然后接入苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对用鳗鱼骨制备的培养基进行发酵，将发酵产物取液相进行喷雾干燥制得功能性多肽。但是这些蛋白酶制剂的底物专一性差，在用以制备胶原蛋白肽产品时存在以下几个问题：第一，胶原蛋白酶解过程中，过多的释放游离氨基酸，使得胶原蛋白肽的得率较低，造成资源的巨大浪费；第二，商业化的蛋白酶热稳定性较差，在温度较高的环境下易失活，且较容易污染杂菌使得降解性能下降。

由于缺乏用于制备牛骨胶原蛋白肽的有效工具酶，所以目前我国以牛骨胶原蛋白为原料的胶原蛋白肽开发尚处于空白，有待开发具有我国自主知识产权的高效胶原蛋白酶用于牛骨胶原蛋白肽的生产。因此，我国急需研制能够相对专一性酶解胶原蛋白肽链的特定位点，同时耐高温的胶原蛋白酶，用于制备游离氨基酸少的胶原蛋白肽。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69及其编码基因与应用。

本发明技术方案如下：

一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69，由上述编码基因编码，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组质粒载体，该重组质粒载体包含有上述海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因。

一种重组细胞，该重组细胞包含有上述海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因。

上述海洋嗜热胶原蛋白酶A69和/或海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因在胶原蛋白降解及胶原蛋白肽制备中的应用。

本发明的技术特点：

本发明首先测定了喜温地芽胞杆菌Anoxybacillus caldiproteolyticus1A02591的全基因组和分泌组，通过基因测序获得该菌的全基因组并确定了蛋白酶A69为A.caldiproteolyticus1A02591所分泌的胞外蛋白酶。利用A.caldiproteolyticus1A02591全基因组注释过的蛋白质数据库搜库分析确定了蛋白酶A69的氨基酸序列，进一步获得其编码基因序列。编码嗜热胶原蛋白酶A69的核苷酸序列共1650bp，编码550个氨基酸残基。利用CDD分析软件对其氨基酸序列进行分析表明，该酶包含信号肽、前导肽和催化结构域三部分。嗜胶原蛋白酶A69属于金属蛋白酶M4家族，是M4家族少有的胶原蛋白酶。根据其基因序列设计引物并利用PCR技术从喜温地芽胞杆菌A.caldiproteolyticus 1A02591的基因组DNA中克隆了胶原蛋白酶A69的基因并在大肠杆菌中进行异源表达，获得了胶原蛋白酶A69的重组表达菌株。培养重组表达菌株并分离纯化获得胶原蛋白A69。对纯化的胶原蛋白酶A69进行性质测定，结果表明该酶对胶原蛋白特别是牛骨胶原蛋白具有很强的降解活性，其最适酶解温度为65℃，表明A69是M4家族的一种嗜热胶原蛋白酶。对胶原蛋白酶A69酶解牛骨胶原蛋白后的产物进行理化性质分析，发现其酶解产物中游离氨基酸含量很低，肽得率很高，且产生的胶原蛋白肽分子量分布于小于10000Da的各个分子量范围，可用于制备不同的胶原蛋白肽产品。

有益效果：

1、本发明所述的海洋嗜热胶原蛋白酶A69相较于传统工业用酶，能够在高温条件下保持高活性，并且具有良好的热稳定性，其最适酶活温度为60℃，在60℃保温90min仍可以保留55～60％的酶活。

2、本发明所述的海洋嗜热胶原蛋白酶A69可降解不溶性胶原蛋白，特别对牛骨来源的胶原蛋白有很强的降解能力，酶解效率高，可以有效的减少酶的用量，降低酶的使用成本。

3、本发明所述的海洋嗜热胶原蛋白酶A69的生产和使用条件简单，高温条件下使用能够有效地避免杂菌污染，降低能耗，适合工业大规模生产。

4.本发明根据海洋细菌嗜热胶原蛋白酶A69的特点，设计最佳降解条件，使其能够高效降解牛骨胶原蛋白等物质，酶解产物中游离氨基酸含量很低，肽得率很高。产生的胶原蛋白肽分子量分布于小于10000Da的各个分子量范围，从而使其降解产物胶原蛋白肽在食品、医药保健、化妆品等高附加值领域中具有巨大的应用潜力。

附图说明：

图1异源表达纯化后的海洋嗜热胶原蛋白酶A69的SDS-PAGE电泳图；

图中：M：蛋白质分子量标准品(marker)；A69：纯化后的海洋嗜热胶原蛋白酶A69；

图2海洋嗜热胶原蛋白酶A69的最适酶活温度曲线图；

图中，横坐标为温度，纵坐标为相对活性；

图3海洋嗜热胶原蛋白酶A69的热稳定性曲线图；

图中，横坐标为时间，纵坐标为相对活性；

图4海洋嗜热胶原蛋白酶A69的最适pH曲线图；

图中，横坐标为pH，纵坐标为相对活性；

图5不同浓度海洋嗜热胶原蛋白酶A69酶液降解牛骨胶原蛋白的直观图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中喜温地芽胞杆菌A.caldiproteolyticus 1A02591保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，地址：中国厦门自然资源部第三海洋研究所，保藏号MCCC NO:1A02591。

2216E液体培养基：0.5wt％蛋白胨，0.1wt％酵母粉，人工海水配制，pH 8.0。

淡水LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制，pH8.0。

LB固体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制，pH 8.0。

实施例1：海洋嗜热胶原蛋白酶A69编码基因的克隆及重组质粒载体的构建

1、A.caldiproteolyticus 1A02591基因组DNA的提取

喜温地芽胞杆菌A.caldiproteolyticus 1A02591基因组DNA的提取参照百泰克公司基因组提取试剂盒说明书进行，具体步骤如下：

(1)将喜温地芽胞杆菌A.caldiproteolyticus 1A02591接种于2216E液体培养基，在55℃培养12h，取1mL喜温地芽胞杆菌A.caldiproteolyticus 1A02591菌液，10000rpm离心30sec,弃上清，收集菌体；

(2)向步骤(1)制得的菌体中加入200μL缓冲液RB重悬洗涤细胞，10000rpm离心30sec，弃上清后将细胞震荡或者吹打重悬于200μL缓冲液RB中，得重悬液；

(3)向步骤(2)制得的重悬液中加入200μL结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇充分混匀，再加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，70℃放置10min；

(4)冷却后加入100μL的异丙醇，剧烈颠倒轻摇充分混匀，得含有絮状沉淀的溶液；

(5)将步骤(4)含有絮状沉淀的溶液加入吸附柱AC中，10000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液；

(6)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30sec，弃废液；

(7)加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心30sec，弃废液；

(8)加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30sec，弃废液；

(9)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，除去漂洗液；

(10)取出吸附柱AC置于离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中预热)，室温放置3～5min，12000rpm离心1min；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到DNA置于4℃冰箱保存。

2、胶原蛋白酶A69氨基酸序列和编码基因核苷酸序列的鉴定

喜温地芽胞杆菌A.caldiproteolyticus 1A02591的全基因组测序由上海美吉生物公司完成。

通过基因测序获得全基因组后，利用A.caldiproteolyticus 1A02591全基因组注释过的蛋白质数据库搜库分析确定了胶原蛋白酶A69的氨基酸序列，进一步获得其编码基因序列，确定了胶原蛋白酶A69为A.caldiproteolyticus 1A02591所分泌的胞外蛋白酶。编码胶原蛋白酶A69的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，共1650bp；氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，共550个氨基酸残基。利用CDD分析软件对其氨基酸序列进行分析表明，该酶包含信号肽、前导肽和催化结构域三部分，胶原蛋白酶A69属于金属蛋白酶M4家族，是M4家族少有的胶原蛋白酶。

3、胶原蛋白酶A69重组质粒载体的构建

3.1引物的设计与合成

根据基因组测序得到的M4家族胶原蛋白酶A69基因序列信息，设计如下两条引物：

F:5’-AAGAAGGAGATATACATATGAAAAGGAAAATGAAAATGAA-3’

R:5’-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCACCCCTACCGCATCAA-3’

引物由华大基因合成。

3.2、利用PCR进行基因序列扩增及产物回收

(1)以F和R为引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增体系(50μL)如下：

(2)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果获得一条约1650bp的DNA片段，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增出的DNA片段，得到胶原蛋白酶A69的编码基因A69。

3.3、重组质粒载体的构建

(1)DNA片段与克隆载体连接

将回收的DNA片段连接到TaKaRa公司的pET-22b载体上，连接反应体系如下：

载体pET-22b(+) 1μL

DNA片段 1μL

Solution I 0.5μL

盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上瞬时离心2sec，把样品集中在管底，50℃连接15min。

(2)将表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中

具体的步骤为：按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态，将连接液加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，静置冰浴30min；42℃热激90s；快速转至冰浴10min；加入500μL液体LB培养基，37℃水浴1h；离心后用约100μL重悬菌体涂布至含有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的淡水LB固体平板上，37℃过夜培养。

将转化子送青岛擎科生物有限公司进行测序验证，获得异源表达A69的重组质粒载体。

实施例2：海洋嗜热胶原蛋白酶A69的异源表达及分离纯化

1、胶原蛋白酶A69在E.coli BL21(DE3)中的异源表达

将构建好的重组质粒载体按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中，将其涂布在含有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的淡水LB固体平板上过夜培养，挑选重组菌株。将挑选的重组菌株接种至含有终浓度100μg/mL氨苄青霉素的淡水LB液体培养基中，在37℃，180rpm/min条件下培养至OD600＝0.6～0.8时，转入温度18℃，转速110rpm/min的摇床，加入0.5mM IPTG，诱导12h，得到重组菌株。

2、胶原蛋白酶A69的分离纯化

在6000rpm/min的条件下离心10min，收集6L的重组菌株发酵液中的菌体。用预冷的Lysis buffer(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，在4℃，1000bar条件下进行压力破碎三遍直至菌液澄清，将破碎后的菌液11000rpm/min离心1h后收集上清液，得到粗酶液。用Lysis buffer预先平衡Ni-NT柱，加入粗酶液直至全部流过亲和柱后，用Lysisbuffer冲洗亲和柱，去除未结合的杂蛋白。然后用Wash buffer(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,15mM咪唑，pH 8.0)冲洗，去除非特异性结合的蛋白，最后用Elution buffer(50mM Tris-HCl，100mM NaCl,250mM咪唑，pH 8.0)将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱产物。将收集的样品用超滤管浓缩至2mL，利用Superdex 75凝胶过滤层析柱进一步分离纯化，用分子筛缓冲液(10mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 8.0)洗脱，即最终纯化的胶原蛋白酶A69。

将得到纯化后的胶原蛋白酶A69进行SDS-PAGE电泳检测纯度，电泳结果如图1所示。

由图1可知，本次异源表达获得了海洋嗜热胶原蛋白酶A69纯酶。

实施例3：海洋嗜热胶原蛋白酶A69的性质测定

1、最适酶活温度

在50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲体系中，分别在10、20、30、40、50、60、70、80、90、100℃，测定A69以牛骨I型胶原蛋白为底物的胶原蛋白酶活。

胶原蛋白酶酶活的测定方法：称取10mg牛骨I型胶原蛋白底物，加入1mL用pH 7.0，50mM Tris-HCl缓冲液稀释500倍的酶液，60℃振荡反应1h后，13000rpm离心10min。取20μL上清液加入100μL茚三酮-柠檬酸钠混合液，沸水显色20min，冷却后加入500μL 50％的正丙醇溶液，混匀后取200μL反应液测定600nm处吸光值。以亮氨酸为标准品用相同方法显色后制定标准曲线。酶活力单位定义为每小时催化底物生成1μmol亮氨酸所需要的酶量。

酶活性最高时对应的温度即该酶的最适酶活温度，以该处的酶活性作为100％，其他温度下的酶活与之相比求得相对活性，结果如图2。

由图2可知，该酶的最适酶活温度为60℃，说明蛋白酶A69是一种嗜热胶原蛋白酶。

2、蛋白酶的温度稳定性

将酶液用50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液稀释至500倍后，分别在60℃、70℃和80℃保温90min，以牛骨胶原蛋白作为底物按照步骤1的方法测定残留酶活。用未经过保温处理的酶液测得的活性作为100％，以保温后测得的酶活占初始酶活的百分比表示该条件下的残余酶活，结果如图3。

由图3可知，该酶在60℃保温90min残余酶活为59％，说明嗜热蛋白酶A69具有良好的热稳定性。

3、最适酶活pH

将酶液分别用pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的Britton-Robinson缓冲液将酶液稀释到合适倍数，按照1中的方法在60℃(最适酶活温度)下测定A69在上述不同pH缓冲条件下的胶原蛋白酶酶活，结果如图4。

由图4可知，该酶的最适酶活pH为7。

实施例4：海洋嗜热胶原蛋白酶A69对牛骨胶原蛋白的降解作用及胶原蛋白肽的制备

1、将嗜热胶原蛋白酶A69用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液分别配成酶浓度为10U/mL、5.0U/mL、2.5U/mL、1.5U/mL的酶液；

2、将10mg牛骨胶原蛋白分别加入1mL步骤1中配制的酶液，对照组加入等量的Tris-HCl缓冲液。在55℃，180rpm/min的水浴摇床中反应2小时。不同浓度嗜热胶原蛋白酶A69酶液降解牛骨胶原蛋白的直观图如图5所示。

由图5可知，添加了胶原蛋白酶A69的实验组中牛骨胶原蛋白很明显被降解，说明嗜热胶原蛋白酶A69能够有效地降解牛骨胶原蛋白，当酶浓度为2.5U/mL以上时牛骨胶原蛋白即基本完全被降解，因此可知嗜热胶原蛋白酶A69对牛骨胶原蛋白具有极高的降解活性，并且最低有效酶浓度为2.5U/mL。

3、将10mg牛骨胶原蛋白分别加入1mL 2.5U/mL的酶液，对照组加入等量的Tris-HCl缓冲液。在转速为180rpm/min，温度分别为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃条件下反应2h。然后通过离心以及对沉淀进行烘干计算酶解率。结果如表1所示。

表1不同温度下蛋白酶A69对牛骨胶原蛋白的酶解率

由表1可知，当温度为65℃时嗜热胶原蛋白酶A69对牛骨胶原蛋白的酶解效率最高，酶解率达到98.75％。

4、根据优化的最适酶解温度和酶浓度，在65℃，180rpm/min的条件下，用2.5U/mL酶液降解牛骨胶原蛋白2h，然后经13000rpm/min离心15min，上清液即为制得的胶原蛋白肽。

综上所述，嗜热胶原蛋白酶A69具有在高温条件下保持高活性的特点，其降解牛骨胶原蛋白的最佳作用温度为65℃，属于嗜热胶原蛋白酶，并且具有降解不溶性胶原蛋白的能力。该酶在55℃以上的温度条件下，依然能保持高效的胶原蛋白降解能力，能够将90％以上的底物胶原蛋白降解。因此嗜热胶原蛋白酶A69适用于高温情况下的胶原蛋白的降解及胶原蛋白肽制备，并且制备得到的胶原蛋白肽在生物医学、皮革加工及食品加工工业中具有很大的应用潜力。

实施例5：海洋胶原蛋白酶A69制备胶原蛋白肽的理化性质分析

1、游离氨基酸测定：取实施例4中的胶原蛋白肽配制的溶液1mL与磺基水杨酸水溶液(4％，w/v)1mL混匀后，25℃静置30min，12000rpm离心15min去除沉淀。酶解上清液经0.22μm的水系滤器过滤后，即可用于游离氨基酸分析。

2、全水解氨基酸测定：取实施例4中的胶原蛋白肽配制的溶液与HCl溶液(6M)按1:1(v/v)混匀后，于110℃高温条件下水解22h，然后于真空条件下使HCl完全挥发。干燥的样品用双蒸水重新溶解。酶解上清液经0.22μm的水系滤器过滤后，上清即可用于全水解氨基酸分析。其中，羟脯氨酸(Hyp)和羟赖氨酸(Hyl)的含量利用HPLC的方法检测。

全水解氨基酸的量减去游离氨基酸的量，即可得到胶原蛋白肽含量。结果如表2所示。

表2 A69对牛骨胶原蛋白酶解液中游离氨基酸及全水解氨基酸的组成

由表2可知，利用本发明提供的嗜热胶原蛋白酶A69酶解牛骨胶原蛋白酶解液中游离氨基酸和总氨基酸含量分别为3.123g/100g及88.850g/100g，胶原蛋白肽含量高，达到80％以上。因此嗜热胶原蛋白酶A69酶解牛骨胶原蛋白能够获得低游离氨基酸含量，高胶原蛋白肽含量的酶解产物。这有利于其在食品和医药等工业领域的应用。

3、将实施例4中的胶原蛋白肽用流动相(乙腈：蒸馏水：TFA＝45：55：0.1)配制成5.0mg/mL的溶液，混合均匀，待样品充分溶解后，用0.22μm的滤器过滤后进行HPLC分析，酶解液中胶原蛋白肽的分子量分布如表3所示。

表3蛋白酶A69酶解牛骨胶原蛋白产物肽段分子量分布

由表3可知，利用本发明提供的嗜热胶原蛋白酶A69酶解牛骨胶原蛋白酶解液中胶原蛋白肽分子量分布于小于10000Da的各个分子量范围，使其用于制备不同的胶原蛋白肽产品，从而应用于食品、医药保健、化妆品等各个领域。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> 喜温地芽胞杆菌Anoxybacillus caldiproteolyticus

<400> 1

atgaaaagga aaatgaaaat gaaattagca tcgtttggtc ttgcagcagg actagcggcc 60

caagtatttt taccttacaa tgcgctggct tcaacggaac acgttacatg gaaccaacaa 120

tttcaaaccc ctcaattcat ctccggtgat ctgctgaaag tgaatggcac atccccagaa 180

gaactcgtct atcaatatgt tgaaaaaaac gaaaacaagt ttaaatttca tgaaaacgct 240

aaggatactc tacaattgaa agaaaagaaa aatgataacc ttggttttac gtttatgcgc 300

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ttaaaaagcg ggaagaaatt gagtgagaaa caagcgcgtg acattgctga aaaagattta 480

gtggcaaatg taacaaagga agtaccggaa tatgaacagg gaaaagacac cgagtttgtt 540

gtttatgtca atggggacga ggcttcttta gcgtacgttg tcaatttaaa ctttttaact 600

cctgaaccag gaaactggct gtatatcatt gatgccgtag acggaaaaat tttaaataaa 660

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tactactatt tacaagataa tacgcgtgga aatgggattt tcacgtatga tgcgaaatac 840

cgtacgacat tgccgggaag cttatgggca gatgcagata accaattttt tgcgagctat 900

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agccaaggct ataataacgc attttggaac ggttcgcaaa tggtgtatgg cgatggtgat 1080

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<212> PRT

<213> 喜温地芽胞杆菌Anoxybacillus caldiproteolyticus

<400> 2

Met Lys Arg Lys Met Lys Met Lys Leu Ala Ser Phe Gly Leu Ala Ala

1 5 10 15

Gly Leu Ala Ala Gln Val Phe Leu Pro Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Thr

20 25 30

Glu His Val Thr Trp Asn Gln Gln Phe Gln Thr Pro Gln Phe Ile Ser

35 40 45

Gly Asp Leu Leu Lys Val Asn Gly Thr Ser Pro Glu Glu Leu Val Tyr

50 55 60

Gln Tyr Val Glu Lys Asn Glu Asn Lys Phe Lys Phe His Glu Asn Ala

65 70 75 80

Lys Asp Thr Leu Gln Leu Lys Glu Lys Lys Asn Asp Asn Leu Gly Phe

85 90 95

Thr Phe Met Arg Phe Gln Gln Thr Tyr Lys Gly Ile Pro Val Phe Gly

100 105 110

Ala Val Val Thr Ala His Val Lys Asp Gly Thr Leu Thr Ala Leu Ser

115 120 125

Gly Thr Leu Ile Pro Asn Leu Asp Thr Lys Gly Ser Leu Lys Ser Gly

130 135 140

Lys Lys Leu Ser Glu Lys Gln Ala Arg Asp Ile Ala Glu Lys Asp Leu

145 150 155 160

Val Ala Asn Val Thr Lys Glu Val Pro Glu Tyr Glu Gln Gly Lys Asp

165 170 175

Thr Glu Phe Val Val Tyr Val Asn Gly Asp Glu Ala Ser Leu Ala Tyr

180 185 190

Val Val Asn Leu Asn Phe Leu Thr Pro Glu Pro Gly Asn Trp Leu Tyr

195 200 205

Ile Ile Asp Ala Val Asp Gly Lys Ile Leu Asn Lys Phe Asn Gln Leu

210 215 220

Asp Ala Ala Lys Pro Gly Asp Val Lys Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr

225 230 235 240

Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr

245 250 255

Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly

260 265 270

Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu

275 280 285

Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala

290 295 300

Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn

305 310 315 320

Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser

325 330 335

Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser

340 345 350

Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser

355 360 365

Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp

370 375 380

Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn Glu

385 390 395 400

Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala Asn Lys

405 410 415

Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro Gly Ile Ser

420 425 430

Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys Tyr Gly Asp Pro

435 440 445

Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln Asp Asn Gly Gly Val

450 455 460

His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala Ala Tyr Leu Ile Ser Gln

465 470 475 480

Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys

485 490 495

Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr

500 505 510

Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp

515 520 525

Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe

530 535 540

Asp Ala Val Gly Val Lys

545 550

Claims

1.一种海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的编码基因表达的海洋嗜热胶原蛋白酶A69，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组质粒载体，其特征在于，该重组质粒载体包含有权利要求1所述海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因。

4.一种重组细胞，其特征在于，该重组细胞包含有权利要求1所述海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因。

5.权利要求2所述海洋嗜热胶原蛋白酶A69和/或权利要求1所述海洋嗜热胶原蛋白酶A69的编码基因在胶原蛋白降解和胶原蛋白肽制备中的应用。