KR20150000876A - 발현 방법 - Google Patents

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빅토리아 스테펜
르네 샤를로트 아잇슈탯트
스테판 에버스
카를-하인츠 마우레르
요하네스 본가에르츠
헨드릭 헬무트
토마스 베버
티모티 오코넬
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Abstract

본 발명의 목표는 미생물 발효 공정에서 단백질의 산물 수율을 증가시키는 것이다. 상기 목표는 프로모터 및 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물을 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 종의 미생물 내로 도입시키고, 상기 발현 구축물에서 단백질을 발현시키는 방법에 의해 달성된다.

Description

발현 방법 {EXPRESSION METHOD}
본 발명은 생물공학, 특히 미생물 단백질 합성 분야에 속한다. 본 발명은 특히 유전자 변형 미생물에 의해 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 또한 이러한 방법에 사용되는 미생물을 제안한다. 본 발명은 추가로 단백질 생산을 위한 이러한 미생물의 용도에 관한 것이다.
가치있는 산물을 생산하는데 미생물이 사용될 수 있다. 가치있는 산물은, 예를 들어 저분자량 화합물, 예를 들어 식품 보충제 또는 제약상 유효한 화합물, 또는 단백질이며, 이들의 다양성 때문에 이들을 사용하는 많은 기술 분야가 그 결과로 존재한다. 첫 번째 경우에는, 해당 미생물의 대사 특성을 가치있는 산물을 생산하기 위해 활용 및/또는 변형시키며; 두 번째 경우에는, 관심 단백질의 유전자를 발현하는 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
대규모의 산업적, 생물공학적 생산을 위해, 해당 미생물은 그 미생물의 대사 특성에 따라 설정되는 발효기에서 배양된다. 배양 동안, 미생물은 공급된 기질을 대사하고 목적 산물을 형성하며, 이것은 발효가 완결된 후에 통상적으로 생산 유기체로부터 분리되어 발효기 브로쓰 및/또는 발효 배지로부터 정제 및/또는 농축된다. 단백질의 발효 생산 동안, 탄소원 (전형적으로, 글루코스) 외에도 복합 단백질-풍부 원료가 기질로서 전형적으로 사용된다. 단백질 생산은 따라서 기질 단백질에서 표적 단백질로의 생체변환에 해당한다. 이는 기질 단백질에서 개별 아미노산으로의 완전 가수분해를 요구하며, 이어서 이들은 표적 단백질의 생합성에 이용가능하다.
따라서 미생물의 발효와 관련하여, 발효기의 기술적 설계를 통한, 예를 들어 형성 속도 및 영양소 활용과 관련된 해당 균주의 최적화에서 해당 미생물 및/또는 발효 배지로부터의 가치있는 산물의 단리에 이르는 범위의 광범위한 선행 기술이 존재한다.
미생물 발효에서는 박테리아의 사용이 기본적으로 바람직하다. 박테리아는 짧은 세대 기간 및 배양 조건에 대한 적은 요구를 특징으로 한다. 그 결과, 비용 효율적인 배양 방법 및/또는 생산 방법이 확립될 수 있다. 추가로, 당업자는 발효 기술에서 박테리아에 대한 풍부한 경험을 갖고 있다. 그람-양성 박테리아를 사용하는 것이 바람직한데, 이는 이것이 생산될 단백질 (표적 단백질)을 이것을 둘러싸고 있는 배지 중으로 분비하기 때문이다.
통상적으로, 미생물 발효 동안 가능한 최고 산물 수율이 바람직하다. 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 91/02792는 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터의 유전자-조절 서열, 특히 바실루스 리케니포르미스 프로모터의 제어 하에 있는 최적화된 바실루스 리케니포르미스 균주에서의 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 알칼리성 프로테아제의 개선된 발효 생산을 개시한다.
선행 기술에서는 비슷하게 높거나 심지어 개선된 산물 수율을 얻을 수 있는 바실루스 리케니포르미스에 대한 대안적 생산 유기체가 만족스럽게 이용가능하지 않다. 또한, 높은 산물 수율을 허용하는 미생물 발효 방법이 매우 필요하다.
본 발명의 목적은 미생물 발효에서 특히 단백질의 높은 산물 수율을 얻는 것이다.
본 발명은 방법 단계
(a) 프로모터 및 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물의 미생물 내로의 도입;
(b)　미생물에서의 단백질의 발현
을 포함하며,
여기서 미생물은 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 종에 속하는 것인, 미생물에 의해 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 임의로 또한 추가의 방법 단계
(c) 미생물의 배양
을 포함한다.
따라서 본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 발효 방법이다.
놀랍게도, 이러한 방법에서의 바실루스 푸밀루스 종의 박테리아의 사용이 높은 산물 수율을 허용하며 이에 따라 유리한 것으로 밝혀졌다. 바실루스 푸밀루스를 생산 유기체로 사용하여 유리한, 특히 증가된 산물 수율을 얻는 것이 가능하다. 이와 관련하여 사용된 참조물은, 다수의 미생물 발효에 산업적으로 사용되는 선행 기술에서 확립된 생산 유기체인 바실루스 리케니포르미스이다.
따라서 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 미생물에서 단백질의 발현을 증가시키는 방법이다. 단백질의 증가된 발현은, 단지 바람직하게는 야생형의 바실루스 리케니포르미스 종의 박테리아가 사용된다는 사실에 의해서만 본 발명에 따른 방법과 상이한 비슷한 방법과 비교하여, 본 발명에 따른 방법의 결과로 더 많은 양의 단백질이 수득되는 경우에 존재한다. 이와 관련하여, 비교되는 방법은 둘 다 미생물에 대해 가능한 한 최적인 동일한 조건 하에 동시에 수행된다.
발현 구축물은 단백질이 미생물에서 발현될 수 있게 하는 핵산 서열이다. 이것은 유전 정보, 즉 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (유전자)을 포함한다. 핵산 서열의 발현은 이것의, 상기 서열에 의해 코딩되는 유전자 산물(들), 즉 1개 이상의 폴리펩티드 (단백질 또는 단백질들)로의 번역이다. 용어 폴리펩티드 및 단백질은 본원에서 동의어로 사용된다. 따라서 본 발명의 문맥에서, 발현은 유전 정보로부터의 리보핵산 (RNA) 및 단백질의 생합성을 지칭한다. 원칙적으로, 발현은 전사, 즉 유전자의 DNA (데옥시리보핵산) 서열에 의한 메신저 리보핵산 (mRNA)의 합성, 및 이것의 상응하는 폴리펩티드 쇄 (이것은 임의로 또한 번역후 변형될 수 있음)로의 번역을 포함한다. 따라서 단백질의 발현은 미생물에서 본 발명에 따라 존재하는 유전 정보로부터 단백질을 생합성하는 것을 말한다.
발현 구축물은 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열의 발현에 대한 제어 기능을 갖는 적어도 1개의 핵산 서열, 바람직하게는 DNA (소위 유전자-조절 서열)를 추가로 포함한다. 여기서 유전자-조절 서열은 미생물에서의 그의 존재가 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 전사 빈도에 영향을 주는, 바람직하게는 증가시키는 임의의 핵산 서열이다. 이것은 바람직하게는 프로모터 서열인데, 이는 이러한 서열이 핵산 서열의 발현에 필수적이기 때문이다. 그러나, 본 발명에 따른 발현 구축물은 또한 추가의 유전자-조절 서열, 예를 들어 1개 이상의 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 문맥에서, 발현 구축물은 유전자 및 프로모터의 적어도 1개의 기능 단위를 포함한다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 이것은 물리적 실체로서 존재할 수 있다.
적어도 1개의 프로모터의 존재가 본 발명에 따른 발현 구축물에 필수적이다. 따라서, 프로모터는 유전자의 조절 발현을 허용하는 DNA 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 프로모터 서열은 자연적으로 유전자의 구성성분이며, 종종 유전자의 5' 말단에, 이에 따라 RNA-코딩 영역 전에 위치한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발현 구축물 내의 프로모터 서열은 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 5' 상류에 위치한다. 프로모터의 가장 중요한 특성은, RNA 폴리머라제에 의한 유전자 전사의 개시를 매개하고 전사 인자로 지칭되는 적어도 1개의 DNA-결합 단백질 또는 폴리펩티드와의 특이적 상호작용이다. 여러 전사 인자 및/또는 추가의 단백질이 종종 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시에 관여한다. 따라서, 프로모터는 바람직하게는 프로모터 활성을 갖는 DNA 서열, 즉 유전자의 전사를 개시하기 위해 적어도 1개의 전사 인자가 적어도 일시적으로 그에 결합하는 DNA 서열이다. 프로모터의 강도는 발현 유전자의 전사 빈도를 통해, 즉 단위 시간당 생산되는 RNA 분자, 특히 mRNA 분자의 수를 통해 측정가능하다. 본 발명에 따른 발현 구축물의 프로모터는 미생물의 내인성 프로모터일 수 있다. 따라서, 이러한 프로모터 서열은 미생물에 자연적으로 존재한다. 다르게는, 본 발명에 따른 발현 구축물의 프로모터는 또한 재조합적으로 미생물 내로 도입되어 있을 수 있다. 동일한 내용이 본 발명에 따른 발현 구축물이 가질 수 있는 모든 추가의 유전자-조절 서열에 대해 사실이다. 본 발명에 따른 방법에 사용된 바와 같은 발현 구축물 내의 프로모터는, 발현 구축물 내의 단백질 (표적 단백질)을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 유발한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 프로모터가
(a) 서열 1에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(b) 서열 2에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(c) 서열 3에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(d) 서열 4에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열
로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법이다.
대안적 실시양태에서, 프로모터는 상기 기재된 바와 같은 핵산 서열을 갖는다.
이러한 프로모터 서열을 사용한 본 발명에 따른 방법에서 단백질의 특히 높은 산물 수율을 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌다.
바람직하게는, 프로모터는 서열 1에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 프로모터이며, 상기 프로모터는 이것에 의해 발현되는 유전자의, 적어도 서열 1에 따른 프로모터의 전사 빈도에 상응하는 전사 빈도를 유발한다. 다르게는, 프로모터는 서열 2에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 프로모터이며, 상기 프로모터는 이것에 의해 발현되는 유전자의, 적어도 서열 2에 따른 프로모터의 전사 빈도에 상응하는 전사 빈도를 유발한다.
추가의 대안적 실시양태에 따르면, 프로모터는 서열 3에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 프로모터이며, 상기 프로모터는 이것에 의해 발현되는 유전자의, 적어도 서열 3에 따른 프로모터의 전사 빈도에 상응하는 전사 빈도를 유발한다.
또 다른 대안적 실시양태에 따르면, 프로모터는 서열 4에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 프로모터이며, 상기 프로모터는 이것에 의해 발현되는 유전자의, 적어도 서열 4에 따른 프로모터의 전사 빈도에 상응하는 전사 빈도를 유발한다.
추가의 대안적 실시양태에서, 프로모터는 상기 기재된 바와 같은 핵산 서열을 갖는다.
핵산 또는 아미노산 서열의 동일성은 서열 비교에 의해 결정된다. 이러한 비교는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에서 유사한 서열을 서로에 대해 할당함으로써 이루어진다. 상기 서열 비교는 바람직하게는 선행 기술에서 확립되어 있고 관례적으로 이용되는 BLAST 알고리즘에 기반하여 이루어지며 (예를 들어, 문헌 [altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, 및 Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pp. 3389-3402] 참조), 원칙적으로 핵산 또는 아미노산 서열에서 유사한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열을 서로에 대해 할당함으로써 수행된다. 표로 나타낸 해당 위치의 할당은 정렬로 지칭된다. 선행 기술에서 이용가능한 추가의 알고리즘은 FASTA 알고리즘이다. 서열 비교 (정렬), 특히 다중 서열 비교는 통상적으로 컴퓨터 프로그램을 이용하여 생성된다. 빈번하게 이용되는 것은, 예를 들어 클러스탈(Clustal) 시리즈 (예를 들어, 문헌 [Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500] 참조), T-커피(T-Coffee) (예를 들어, 문헌 [Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217] 참조) 또는 이들 프로그램 또는 알고리즘에 기반한 프로그램이다. 본 발명의 문맥에서, 서열 비교 및 정렬은 바람직하게는 컴퓨터 프로그램 벡터 NTI(Vector NTI)® 스위트 10.3 (인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation), 미국 캘리포니아주 칼스배드 패러데이 애비뉴 1600)을 사용하고 미리 정의된 표준 (디폴트) 파라미터를 사용하여 생성된다.
이러한 비교는 비교되는 서열들의 서로에 대한 유사성을 밝혀낸다. 이는 통상적으로 동일성 퍼센트, 즉 정렬시 동일한 위치 또는 서로 상응하는 위치 상에서의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 라디칼의 비율로 제공된다. 보다 넓게 정의된 용어 상동성은 아미노산 서열에 대한 보존된 아미노산 치환, 즉 유사한 특성을 갖는 아미노산을 감안하는데, 이는 이들이 대부분의 경우에 단백질 내에서 유사한 활성 또는 기능을 발휘하기 때문이다. 따라서, 비교되는 서열들의 유사성은 상동성 퍼센트 또는 유사성 퍼센트로 제공될 수도 있다. 동일성 및/또는 상동성 값은 전체 폴리펩티드 또는 유전자에 걸쳐, 또는 단지 개별 영역에 걸쳐 제공될 수 있다. 이에 따라, 상이한 핵산 또는 아미노산 서열들의 상동성이거나 또는 동일한 영역은 서열에서의 합동성에 의해 규정된다. 이들은 종종 동일하거나 또는 유사한 기능을 갖는다. 이들은 소형일 수 있고, 단지 수 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산만을 포함할 수 있다. 이러한 소형 영역은 종종 단백질의 전체 활성에 필수적인 기능을 발휘한다. 따라서, 서열 합동성을 단지 개별적인, 아마도 소형의 영역에만 관련시키는 것이 유용할 수 있다. 그러나 달리 언급되지 않는 한, 본원에서의 동일성 및 상동성 값은 각 경우에 언급된 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이를 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, 단백질의 경우에, 특히 효소의 경우에, 및 이들 중에서도 특히 프로테아제의 경우에, 상기 값은 또한 각 경우에 숙성 (성숙) 단백질을 지칭한다. 따라서 달리 나타내지 않는 한, 비록 연관 유전자가 번역 후에 숙성 형태로 추가로 프로세싱되는 미성숙 형태를 코딩하더라도, 단백질에 대한 서열 뷰는 항상 숙성된, 완전히 프로세싱된 단백질에 대한 것이다.
본 발명에 따른 방법에서 미생물 내로 도입되는 발현 구축물은 또한 단백질을 코딩한다. 따라서, 이것은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 원칙적으로는, 단백질로 번역될 수 있는 어떠한 목적 핵산 서열도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 여기서, 이것은 본 발명에 따른 방법의 도움으로 생산되는 단백질 (표적 단백질)이다. 바람직하게는, 이것은 효소, 보다 바람직하게는 하기 기재된 바와 같은 효소이다.
본 발명에 따른 핵산 및 발현 구축물은 핵산을 변형시키기 위한 그 자체로 공지된 방법을 통해 생성될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 관련 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Fritsch, Sambrook and Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989]에 제시되어 있고, 생물공학 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법의 예는, 임의로 분자 생물학 및/또는 화학 또는 생화학에서의 추가의 표준 방법들과 조합된 화학적 합성 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)이다.
본 발명은 단백질, 특히 효소의 재조합 생산에 특히 적합하다. 이를 위해, 발현 구축물은 바람직하게는 형질전환에 의해 미생물 내로 삽입된다. 이와 관련하여, 특정한 발현 구축물 또는 그의 일부의 혼입은 바람직하게는 벡터, 특히 발현 벡터를 통해 일어난다. 그러나, 완성된 발현 구축물이 단지 미생물 내에서만 형성되도록 하는 방식으로 발현 구축물의 단지 일부만을, 바람직하게는 적어도 단백질을 코딩하는 핵산을 미생물 내로 도입시키는 것도 또한 가능하다. 이는, 예를 들어 내인성 프로모터가 단백질에 대한 유전자의 발현에 사용되도록, 예를 들어 숙주 세포에서의 단백질에 대한 유전자가 이미 존재하는 유전 요소, 예컨대 염색체, 염색체 DNA 또는 다른 벡터 내로 삽입될 수 있게 하는 벡터에 의해 일어날 수 있다. 용어 도입은 발현 구축물이 전부 미생물 내로 도입, 바람직하게는 형질전환될 가능성을 포함하지만, 또한 발현 구축물의 단지 일부만이, 특히 바람직하게는 단백질을 코딩하는 핵산이 미생물 내로 도입, 바람직하게는 형질전환되고 완전한 발현 구축물은 단지 미생물 내에서만 형성될 가능성도 포함한다. 그러나, 본 발명의 문맥에서, 발현 구축물의 적어도 일부는 항상 미생물 내로 도입된다.
벡터는 생물공학 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 특히 박테리아에서 사용되는 경우에, 이것은 특정 플라스미드, 즉 원형 유전 요소이다. 본 발명의 문맥에서, 발현 구축물은 바람직하게는 벡터 내로 클로닝된다. 벡터는, 예를 들어 박테리아 플라스미드, 바이러스 또는 박테리오파지로부터 유래된 것들, 또는 매우 다양한 기원의 요소들을 갖는 주로 합성인 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있다. 각 경우에 존재하는 추가의 유전 요소는, 벡터가 미생물 내에서 여러 세대에 걸쳐 안정한 단위로서 확립되게 할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 이들이 개별 단위로서 염색체외에 확립되는지 또는 염색체 DNA 내로 통합되는지의 여부는 여기서 중요하지 않다. 다수의 시스템들 중 어느 것이 선택될지는 개별 경우에 따라 달라진다. 결정적인 인자는, 예를 들어 달성가능한 카피 수, 특히 항생제 내성을 비롯한 이용가능한 선택 시스템, 또는 벡터를 흡수할 수 있는 미생물의 배양가능성일 수 있다.
발현 벡터는 추가로 배양 조건의 변화, 예컨대 예를 들어 세포 밀도 또는 특정 화합물의 첨가에 의해 조절가능할 수 있다. 이러한 화합물의 한 예는 박테리아 락토스 오페론 (lac 오페론)의 활성화제로 사용되는 갈락토스 유도체 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 것인 방법이다.
이와 관련하여, 자연적으로 존재하지 않는다는 것은 단백질이 미생물의 내인성 단백질 또는 효소가 아니라는 것을 의미한다. 따라서, 단백질은 미생물에서 야생형 형태의 미생물의 염색체 DNA의 일부인 핵산 서열에 의해 발현될 수 없다. 따라서, 각 경우에 단백질 및/또는 이것을 코딩하는 핵산 서열은 미생물의 야생형 형태에 존재하지 않고/거나, 미생물의 야생형 형태로부터 단리될 수 없다. 바람직하게는, 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 단백질 또는 이것을 코딩하는 핵산 서열은 미생물에 단백질 또는 이것을 코딩하는 핵산 서열이 풍부해지도록 유전자-기술 방법의 도움으로 미생물에 특이적으로 도입되어 있다. 그러나, 단백질은 물론 또 다른 미생물에는 자연적으로 존재할 수 있다 - 오직 본 발명의 방법에 사용된 미생물만이 검토대상으로 적절하다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 방법은 단백질이 효소, 특히 산성 셀룰라제, 알파-아밀라제, 알파-아세토데카르복실라제, 아미노펩티다제, 아밀라제, 아라바나제, 베타-글루카나제, 베타-글루코시다제, 베타-만노시다제, 카라기나제, 카르보히드라제, 카탈라제, 셀로비오스-옥시다제, 셀룰라제, 키모신, 엔도-1,3-베타-글루카나제, 엔도-1,3(4)-베타-글루카나제, 엔도-1,4-베타-크실라나제, 엔도펩티다제, 에스테라제, 엑소펩티다제, G4-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 글리코리파제, 헤미셀룰라제, 락카제, 리파제, 리소포스포리파제, 말토게닉 아밀라제, 만난아제, 중성 프로테아제, 뉴클레아제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 펙테이트 리아제, 펙티나제, 펙틴 에스테라제, 펜토사나제, 퍼히드롤라제, 포스포리파제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 프로테아제, 프로테이나제, 풀루라나제, 레넷 효소, 람노갈락투로나제, 서브틸리신, 탄나제, 트랜스퍼라제, 트랜스글루타미나제, 크산타나제, 크실라나제, 크실로글루카나제 또는 그의 혼합물인 방법이다. 매우 특히 바람직하게는, 단백질은 프로테아제이다. 본 발명에 따른 방법의 특히 유리한 실시양태에서, 생산되는 프로테아제 (= 표적 프로테아제)는 동시에 미생물에 대한 단백질 기질의 가수분해에도 또한 관여하며, 유리하게는 기질 단백질의 보다 개선된 소화를 유발할 수 있다. 따라서, 이어서 미생물에 대해 개선된 영양소 조건이 이용가능하다.
예를 들어, 유리하게는 본 발명에 따른 방법을 이용하여 하기 명시된 효소를 생산하는 것이 가능하다.
프로테아제 중에서는, 서브틸리신이 바람직하다. 그의 예는 서브틸리신 BPN' 및 칼스버그(Carlsberg), 프로테아제 PB92, 서브틸리신 147 및 309, 바실루스 렌투스로부터의 알칼리성 프로테아제, 서브틸리신 DY, 및 서브틸라제에 할당되지만 좁은 의미에서는 더 이상 서브틸리신에 할당되지 않는 효소인 써미타제, 프로테이나제 K 및 프로테아제 TW3 및 TW7이다. 서브틸리신 칼스버그는 노보자임스 A/S (Novozymes A/S, 덴마크 바그스배르드)로부터 상표명 알칼라제(Alcalase)® 하에 추가 개발된 형태로 입수가능하다. 서브틸리신 147 및 309는 상표명 에스페라제(Esperase)® 또는 사비나제(Savinase)® 하에 노보자임스에 의해 시판되고 있다. 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 프로테아제로부터 유래된 것은 명칭 BLAP® 하에 등록된 프로테아제 변이체이다. 추가의 바람직한 프로테아제는 또한, 예를 들어 명칭 PUR 하에 등록된 효소이다. 추가의 프로테아제는 또한 노보자임스로부터 상표명 듀라짐(Durazym)®, 렐라제(Relase)®, 에버라제(Everlase)®, 나피짐(Nafizym)®, 나탈라제(Natalase)®, 칸나제(Kannase)® 및 오보자임(Ovozyme)® 하에 입수가능한 효소, 제넨코르/다니스코(Genencor/Danisco)로부터 상표명 퓨라펙트(Purafect)®, 퓨라펙트® OxP, 퓨라펙트® 프라임(Prime), 엑셀라제(Excellase)® 및 프로페라제(Properase)® 하에 입수가능한 것들, 어드밴스드 바이오케미칼스 리미티드(Advanced Biochemicals Ltd., 인도 테인)로부터 상표명 프로토솔(Protosol)® 하에 입수가능한 것, 우시 스나이더 바이오프로덕츠 리미티드(Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., 중국)로부터 상표명 우시(Wuxi)® 하에 입수가능한 것, 아마노 파마슈티칼스 리미티드(Amano Pharmaceuticals Ltd., 일본 나고야)로부터 상표명 프로레더(Proleather)® 및 프로테아제 P® 하에 입수가능한 것들, 및 카오 코포레이션(Kao Corp., 일본 도쿄)으로부터 명칭 프로테이나제 K-16 하에 입수가능한 것이다. 국제 특허 출원 WO2008/086916 및 WO2007/131656에 개시되어 있는 바실루스 기브소니이(Bacillus gibsonii) 및 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제들도 또한 바람직하다.
아밀라제의 예는 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 α-아밀라제, 특히 또한 세제 또는 세정제에 사용하기 위해 개선시킨 이들의 추가 개발물이다. 바실루스 리케니포르미스로부터의 효소는 명칭 테르마밀(Termamyl)® 하에 노보자임스로부터, 및 명칭 퓨라스타(Purastar)®ST 하에 다니스코/제넨코르로부터 입수가능하다. 상기 α-아밀라제의 추가 개발 제품은 상표명 듀라밀(Duramyl)® 및 테르마밀®울트라 하에 노보자임스으로부터, 명칭 퓨라스타®OxAm 하에 다니스코/제넨코르로부터, 및 케이스타제(Keistase)®로서 다이와 세이코 인크.(Daiwa Seiko Inc., 일본 도쿄)로부터 입수가능하다. 바실루스 아밀로리퀘파시엔스로부터의 α-아밀라제는 명칭 BAN® 하에 노보자임스에 의해 시판되고 있으며, 바실루스 스테아로써모필루스로부터의 α-아밀라제의 유도된 변이체도 마찬가지로 노보자임스로부터 명칭 BSG® 및 노바밀(Novamyl)® 하에 시판되고 있다. 추가로, 바실루스 종 A 7-7 (DSM 12368)로부터의 α-아밀라제 및 바실루스 아가라드헤렌스(Bacillus agaradherens) (DSM 9948)로부터의 시클로덱스트린-글루카노트랜스퍼라제 (CGTase)가 언급된다. 모든 명시된 분자의 융합 산물을 사용하는 것도 마찬가지로 가능하다. 추가로, 노보자임스로부터 상표명 푼가밀(Fungamyl)® 하에 입수가능한 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 및 에이. 오리자에(A. oryzae)로부터의 α-아밀라제의 추가 개발물이 적합하다. 추가의 유리한 상업적 제품은, 예를 들어 다니스코/제넨코르로부터의 아밀라제 파워라제(Powerase)® 및 아밀라제 아밀라제-LT®, 스테인자임(Stainzyme)® 및 스테인자임 플러스® (후자는 노보자임스로부터의 것)이다. 점 돌연변이에 의해 입수가능한 이들 효소의 변이체도 또한 본 발명에 따라 생산될 수 있다. 추가의 바람직한 아밀라제는 국제 공개 명세서 WO 00/60060, WO 03/002711, WO 03/054177 및 WO 07/079938 (그의 개시내용이 따라서 명백히 참조되고/거나, 이와 관련된 그의 개시내용이 따라서 명백히 본 특허 출원에 포함됨)에 개시되어 있다. 본 발명에 따라 제조되는 아밀라제는 또한 바람직하게는 α-아밀라제이다.
리파제 또는 큐티나제의 예는 본래 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) (써모미세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus))로부터 입수가능한 리파제, 또는 추가 개발된 것, 특히 아미노산 치환 D96L을 갖는 것이다. 이들은, 예를 들어 상표명 리포라제(Lipolase)®, 리포라제®울트라, 리포프라임(LipoPrime)®, 리포자임(Lipozyme)® 및 리펙스(Lipex)® 하에 노보자임스에 의해 시판된다. 추가로, 예를 들어 본래 푸사리움 솔라니 피시(Fusarium solani pisi) 및 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)로부터 단리되어 온 큐티나제를 제조하는 것이 가능하다. 다니스코/제넨코르로부터, 예를 들어 시작 효소가 본래 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) 및 푸사리움 솔라니이(Fusarium solanii)로부터 단리되어 온 리파제 또는 큐티나제가 제조될 수 있다. 추가의 중요한 상업적 제품은 본래 기스트-브로카데스(Gist-Brocades) (중간에 다니스코/제넨코르)에 의해 시판된 제제 M1 리파제® 및 리포맥스(Lipomax)® 및 명칭 리파제 MY-30®, 리파제 OF® 및 리파제 PL® 하에 메이토 산교 KK(Meito Sangyo KK, 일본)에 의해 시판된 효소, 뿐만 아니라 다니스코/제넨코르로부터의 제품 루마패스트(Lumafast)®이다.
셀룰라제 (엔도글루카나제, EG)의 예는 상표명 셀루자임(Celluzyme)® 하에 노보자임스에 의해 공급되는 진균 서열의 엔도글루카나제(EG)-풍부 셀룰라제 제제, 또는 그의 추가 개발물을 포함한다. 마찬가지로 노보자임스로부터 입수가능한 제품 엔돌라제(Endolase)® 및 케어자임(Carezyme)®은 휴미콜라 인솔렌스 DSM 1800으로부터의 50 kD-EG 또는 43 kD-EG에 기반한 것이다. 제조될 수 있는 상기 회사로부터의 추가의 상업적 제품은 셀루소프트(Cellusoft)®, 레노자임(Renozyme)® 및 셀루클린(Celluclean)®이다. 추가로, 예를 들어 상표명 에코스톤(Ecostone)® 및 바이오터치(Biotouch)® 하에 AB 엔자임즈(AB Enzymes, 핀란드)로부터 입수가능한 셀룰라제를 제조하는 것이 가능하며, 이들은 적어도 부분적으로 멜라노카르푸스(Melanocarpus)로부터의 20 kD-EG에 기반한 것이다. AB 엔자임즈로부터의 추가의 셀룰라제는 에코나제(Econase)® 및 에코펄프(Ecopulp)®이다. 추가의 적합한 셀룰라제는 바실루스 종 CBS 670.93 및 CBS 669.93으로부터의 것이며, 여기서 바실루스 종 CBS 670.93으로부터의 것은 상표명 퓨라닥스(Puradax)® 하에 다니스코/제넨코르로부터 입수가능하다. 제조될 수 있는 다니스코/제넨코르로부터의 추가의 상업적 제품은 "제넨코르 세제 셀룰라제 L" 및 인디에이지(IndiAge)®뉴트라(Neutra)이다.
점 돌연변이의 결과로 수득가능한 이들 효소의 변이체도 또한 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 특히 바람직한 셀룰라제는 국제 공개 명세서 WO 98/12307에 개시되어 있는 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris) 셀룰라제 변이체, 국제 공개 명세서 WO 97/14804에 개시되어 있는 멜라노카르푸스, 특히 멜라노카르푸스 알보미세스(Melanocarpus albomyces)로부터의 셀룰라제, 유럽 특허 출원 EP 1 305 432에 개시되어 있는 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei)로부터의 EGIII 유형의 셀룰라제, 및 그로부터 수득가능한 변이체, 특히 유럽 특허 출원 EP 1240525 및 EP 1305432에 개시되어 있는 것들, 뿐만 아니라 국제 공개 명세서 WO 1992006165, WO 96/29397 및 WO 02/099091에 개시되어 있는 셀룰라제들이다. 그의 각각의 개시내용은 따라서 명백히 참조되고/거나, 이와 관련된 그의 개시내용은 따라서 본 특허 출원에 명백히 포함된다.
또한, 용어 헤미셀룰라제 하에 그룹화되는 추가의 효소가 제조될 수 있다. 이들은, 예를 들어 만난아제, 크산탄리아제, 크산타나제, 펙틴리아제 (= 펙티나제), 펙틴 에스테라제, 펙테이트 리아제, 크실로글루카나제, 크실라나제, 풀루라나제 및 β-글루카나제를 포함한다. 이와 관련하여 적합한 효소는, 예를 들어 노보자임스로부터 명칭 가마나제(Gamanase)®, 펙티넥스 AR(Pektinex AR)® 및 펙타웨이(Pectaway)® 하에, AB 엔자임즈로부터 명칭 로하펙(Rohapec)® B1L 하에, 또는 디버사 코포레이션(Diversa Corp., 미국 캘리포니아주 샌디에고)으로부터 명칭 피롤라제(Pyrolase)® 하에 입수가능하다. 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 수득되는 β-글루카나제는 노보자임스로부터 명칭 세레플로(Cereflo)® 하에 입수가능하다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 헤미셀룰라제는, 예를 들어 노보자임스로부터 상표명 만나웨이(Mannaway)® 또는 제넨코르로부터 퓨라브라이트(Purabrite)® 하에 시판되고 있는 만난아제이다.
추가로, 옥시도리덕타제, 예를 들어 옥시다제, 옥시게나제, 카탈라제, 퍼옥시다제, 예컨대 할로-, 클로로-, 브로모-, 리그닌-, 글루코스 또는 망가니즈 퍼옥시다제, 디옥시게나제 또는 락카제 (페놀 옥시다제, 폴리페놀 옥시다제)도 또한 제조될 수 있다. 언급하기에 적합한 상업적 제품은 노보자임스로부터의 데닐라이트(Denilite)® 1 및 2이다. 추가의 효소는 국제 특허 출원 WO 98/45398, WO 2005/056782, WO 2004/058961 및 WO 2005/124012에 개시되어 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 방법은 미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395인 방법이다. 상기 균주는 DSMZ (DSMZ - 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 독일 38124 브라운슈바이크 이노펜슈트라쎄 7 B)에 2001년 3월 1일에 기탁되었고, DSMZ에 의해 바실루스 푸밀루스 균주 (DSM ID 01-197)로 확인된 바 있다. 본 특허 출원에서의 실시예가 보여주는 바와 같이, 미생물 발효에서 상기 균주로 매우 우수한 산물 수율이 달성된다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 균주는 유전자 변형된다. 유전자 변형의 결과로, 산물 수율이 유리하게 보다 증가되거나 또는 산물의 특성이 유리하게 변형된다. 산물은 여기서 발효 배지 중에 존재하는 발현된 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 이것의 냄새가 감소되거나, 이것의 색상이 감쇠되고/거나 산물이 투명해지거나 (즉, 덜 흐림), 또는 이것의 밀도가 감소된다. 이와 관련하여 유전자 변형은 방법 단계 (a)에 따른 발현 구축물의 도입을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 바실루스 푸밀루스 종의 미생물은 이미, 구체적으로 방법 단계 (a)에 따른 발현 구축물이 미생물에 도입되기 전에 유전자 변형되어 있다. 바람직하게는, 유전자 변형의 존재는 바실루스 푸밀루스 야생형, 특히 바실루스 푸밀루스 DSM 14395와 비교하여 확인된다. 이와 관련하여 예상되는 유전자 변형은 치환, 삽입 및/또는 결실이다. 유리하게는, 유전자 변형은 미생물 내의 유전자의 기능적 변화, 예를 들어 기능적 탈활성화를 유발한다. 유전자의 기능적 변화, 예를 들어 기능적 탈활성화는 이어서 결과적으로 단백질의 증가 및/또는 개선된 생산, 및 이에 따른 개선된 산물 수율 및/또는 하나 이상의 개선된 특성을 갖는 산물의 수득을 유발한다. 기능적 탈활성화는 이 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물(들)이 더 이상 형성되지 않거나 또는 생물학적으로 불활성인 형태로 형성되어 이것이 더 이상 미생물에서 그의 기능(들)을 발휘할 수 없다는 의미로 이해되어야 한다. 이와 관련하여, 유전자의 기능적 탈활성화는 특히 또한 이것을 대안적 유전자에 의해 완전히 또는 부분적으로 대체함으로써 일어날 수 있다. 이어서, 상기 대안적 유전자가 본래 존재하는 유전자 대신에 발현될 수 있다. 따라서, 본래 존재하는 유전자는 기능적으로 탈활성화되었고; 대신에, 대안적 유전자가 발현되어 그 결과 기능적 변화가 유발된다. 대안적 유전자는 본래의 유전자와 관련된 유전자일 수 있거나 (본래의 유전자에 대한 50% 초과의 동일성), 또는 본래의 유전자와 관련되지 않은 유전자일 수 있다 (본래의 유전자에 대한 50% 이하의 동일성). 예를 들어, 대안적 유전자는 삽입에 의해 본래의 유전자의 코딩 서열에 도입될 수 있다. 그 결과, 본래의 유전자는 기능적으로 탈활성화되고, 대신에 대안적 유전자가 발현된다. 유전자 변형은 유전자 산물을 코딩하는 서열에 존재할 수도 있고, 그렇지 않으면 유전자에 속하는 유전자-조절 서열에 존재할 수도 있다.
본 발명에 따라 사용되는 미생물은, 예를 들어 배양 조건에 대한 그의 요구와 관련하여 변형될 수 있거나, 그의 이동성 거동과 관련하여 변형될 수 있거나, 그의 포자형성 능력과 관련하여 변형될 수 있거나, 특정 대사 경로와 관련하여 - 예를 들어 발효 동안 악취의 형성을 억제하기 위해 - 변형될 수 있거나, 그렇지 않으면 다른 또는 추가의 선택 마커를 가질 수 있다.
이와 관련하여 유전자 변형가능한 것은, 공개문헌 [Gioia et al., PLoS ONE, 9: e928 (2007)]에 개시되어 있는 바실루스 푸밀루스 게놈에 동등물이 존재하는, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 바실루스 푸밀루스 균주 내의 모든 유전자이다. 상기 공개문헌은 최초의 완전히 서열분석된 바실루스 푸밀루스 게놈을 기재한다. 본 참고문헌은 명백히 참조되고, 이는 본 특허 출원의 개시 내용에 포함된다.
추가로, 하기 제공된 미생물의 게놈 중 하나 이상에 동등물이 존재하는, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 바실루스 푸밀루스 균주 내의 모든 유전자가 유전자 변형될 수 있다:
아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) K84, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 C58, 아그로박테리움 비티스(Agrobacterium vitis) S4, 아르코박터 부츨레리(Arcobacter butzleri) ED-1, 아르코박터 니트로피길리스(Arcobacter nitrofigilis) DSM 7299, 아르코박터 종 L, 아로마톨륨 아로마티쿰(Aromatoleum aromaticum) EbN1, 아르트로박터 아우레센스(Arthrobacter aurescens) TC1, 아르트로박터 클로로페놀리쿠스(Arthrobacter chlorophenolicus) A6, 아르트로박터 페난트레니보란스(Arthrobacter phenanthrenivorans) Sphe3, 아르트로박터 종 FB24, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 DSM 7, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 FZB42, 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis) 균주 Ames, 바실루스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus) 1942, 바실루스 셀룰로실리티쿠스(Bacillus cellulosilyticus) DSM 2522, 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 10987, 바실루스 세레우스 ATCC 14579, 바실루스 세레우스 B4264, 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii) KSM-K16, 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 36D1, 바실루스 시토톡시쿠스(Bacillus cytotoxicus) NVH 391-98, 바실루스 할로두란스(Bacillus halodurans) C-125, 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580, 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) DSM 319, 바실루스 슈도피르무스(Bacillus pseudofirmus) OF4, 바실루스 슈도미코이데스(Bacillus pseudomycoides) DSM 12442 (CON 엔트리 내에 305개 부분), 바실루스 푸밀루스 SAFR-032, 바실루스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens) MLS10, 바실루스 서브틸리스 BSn5, 바실루스 서브틸리스 아종 스피지제니(spizizenii) 균주 W23, 바실루스 서브틸리스 아종 스피지제니 TU-B-10, 바실루스 서브틸리스 아종 서브틸리스 RO-NN-1, 바실루스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) BMB1713, 바실루스 투린기엔시스 혈청형변이주 콘쿠키안(konkukian) 균주 97-27T, 바실루스 투린기엔시스 혈청형변이주 투린기엔시스 균주 T01001, 바실루스 투시아에(Bacillus tusciae) DSM 2912, 바실루스 웨이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis) KBAB4, 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) ATCC 15703, 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) 아종 락티스(lactis) V9, 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) PRL2010, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) UCC2003, 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium) Bd1, 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum) DJO10A, 비피도박테리움 론굼 NCC27051, 비피도박테리움 론굼 아종 인판티스(infantis) ATCC 15697, 브라디리조비움(Bradyrhizobium) 종 ORS 278, 브레비바실루스 브레비스(Brevibacillus brevis) NBRC 100599, 코리네박테리움 아우리무코숨(Corynebacterium aurimucosum) ATCC 700975, 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae) NCTC 13129, 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens) YS-314, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 R, 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium) K411, 코리네박테리움 크로펜스테티이(Corynebacterium kroppenstedtii) DSM 44385, 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis) FRC41, 코리네박테리움 레시스텐스(Corynebacterium resistens) DSM 45100, 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans) BR-AD22, 코리네박테리움 우레아리티쿰(Corynebacterium urealyticum) DSM 7109, 코리네박테리움 바리아빌레(Corynebacterium variabile) DSM 44702, 데술포비브리오 아에스포엔시스(Desulfovibrio aespoeensis) Aspo-2, 데술포비브리오 알라스켄시스(Desulfovibrio alaskensis) G20, 데술포비브리오 데술푸리칸스(Desulfovibrio desulfuricans) 아종 데술푸리칸스 균주 ATCC 27774, 데술포비브리오 마그네티쿠스(Desulfovibrio magneticus) RS-1, 데술포비브리오 살렉시겐스(Desulfovibrio salexigens) DSM 2638, 데술포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris) RCH1, 데술포비브리오 불가리스 균주 미야자키(Miyazaki) F, 데술푸로박테리움 써모리토트로품(Desulfurobacterium thermolithotrophum) DSM 11699, 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) KCTC 2190, 엔테로박터 아스부리아에(Enterobacter asburiae) LF7a, 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 아종 클로아카에 ATCC 13047, 엔테로박터 종 638, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 536, 에스케리키아 콜라이 APEC O1, 에스케리키아 콜라이 CFT073, 에스케리키아 콜라이 O103:H2 균주 12009, 에스케리키아 콜라이 SE11, 에스케리키아 콜라이 SE15-, 에스케리키아 페르구소니이(Escherichia fergusonii) ATCC 35469T 염색체, 에타놀리게넨스 하르비넨세(Ethanoligenens harbinense) YUAN-3, 유박테리움 실린드로이데스(Eubacterium cylindroides) T2-87 드래프트, 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens) ATCC 27750, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) KIST612, 유박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale) M104/1 드래프트, 유박테리움 시라에움(Eubacterium siraeum) 70/3 드래프트, 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum) 255-15, 엑시구오박테리움 종 AT1b, 플라보박테리아세아에 박테리움(Flavobacteriaceae bacterium) 3519-10, 플라보박테리움 브란키오필룸(Flavobacterium branchiophilum) FL-15, 플라보박테리움 존소니아에(Flavobacterium johnsoniae) UW101, 플라보박테리움 프시크로필룸(Flavobacterium psychrophilum) JIP02/86, 게오바실루스 카우스토필루스(Geobacillus kaustophilus) HTA426, 게오바실루스 종 C56-T3, 게오바실루스 종 WCH70, 게오바실루스 종 Y4.1MC1, 게오바실루스 종 Y412MC52, 게오바실루스 종 Y412MC61, 플라스미드 pGYMC6101, 게오바실루스 써모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) NG80-2, 게오바실루스 써모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius) C56-YS93, 게오박터 베미지엔시스(Geobacter bemidjiensis) Bem, 게오박터 로블레이이(Geobacter lovleyi) SZ, 게오박터 메탈리레두센스(Geobacter metallireducens) GS-15, 게오박터 종 FRC-32, 게오박터 종 M18, 게오박터 종 M21, 게오박터 술푸레두센스(Geobacter sulfurreducens) PCA, 게오박터 우라니이레두센스(Geobacter uraniireducens) Rf4, 글로에오박터 비올라세우스(Gloeobacter violaceus) PCC 74212, 글루콘아세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus) PAl 5, ATCC 49037, 글루콘아세토박터 크실리누스(Gluconacetobacter xylinus) NBRC 3288, 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) 621H, 히드로게노바쿨룸(Hydrogenobaculum) 종 Y04AAS1, 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 30SC, 락토바실루스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus) GRL 1112, 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis) ATCC 367, 락토바실루스 부크네리(Lactobacillus buchneri) NRRL B-30929, 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei) ATCC 334, 락토바실루스 카세이 BD-II, 락토바실루스 카세이 BL23, 락토바실루스 카세이 LC2W, 락토바실루스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) ST10, 락토바실루스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii) 아종 불가리쿠스(bulgaricus) ND02, 락토바실루스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum) CECT 5716, 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri) ATCC 33323, 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) H10, 락토바실루스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) NCC 533, 락토바실루스 케피라노파시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) ZW3, 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) WCFS1, 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri) SD2112, 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) GG, 락토바실루스 람노수스 GG ATCC 53103, 락토바실루스 루미니스(Lactobacillus ruminis) ATCC 27782, 락토바실루스 사케이(Lactobacillus sakei) 아종 사케이 23K, 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CECT 5713, 락토바실루스 산프란시센시스(Lactobacillus sanfranciscensis) TMW 1.1304, 만헤이미아 숙시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens) MBEL55E, 미코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus) 염색체, 미코박테리움 아프리카눔(Mycobacterium africanum) GM041182, 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 104, 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG 균주 도쿄(Tokyo) 172, 미코박테리움 카네티(Mycobacterium canettii) CIPT 140010059, 미코박테리움 길붐(Mycobacterium gilvum) PYR-GCK, 미코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) M, 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 균주 MC2 155, 미코박테리움 종 JDM601, 미코박테리움 종 JLS, 미코박테리움 종 KMS, 미코박테리움 종 MCS, 미코박테리움 종 Spyr1, 미코박테리움 반바알레니이(Mycobacterium vanbaalenii) PYR-1, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) NCGM2.S17, 슈도모나스 브라시카세아룸(Pseudomonas brassicacearum) 아종 브라시카세아룸 NFM421, 슈도모나스 엔토모필라(Pseudomonas entomophila) L48 염색체, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Pf-5, 슈도모나스 풀바(Pseudomonas fulva) 12-X, 슈도모나스 멘도시나 NK-01, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440+, 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) 병원체변종 파세올리콜라(phaseolicola) 1448A, 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri) DSM 4166, 슈도모나스 시린가에 병원체변종 시린가에 B728a+, 슈도모나스 시린가에 병원체변종 토마토(tomato) 균주 DC3000/, 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) K279a 균주 K279a, 스트렙토바실루스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis) DSM 12112, 스트렙토미세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) MA-4680, 스트렙토미세스 빙쳉겐시스(Streptomyces bingchenggensis) BCW-1, 스트렙토미세스 카틀레야(Streptomyces cattleya) NRRL 8057 주 염색체, 스트렙토미세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus) ATCC 27064, 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 스트렙토미세스 플라보그리세우스(Streptomyces flavogriseus) ATCC 33331, 스트렙토미세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 아종 그리세우스 NBRC 13350, 스트렙토미세스 스카비에이(Streptomyces scabiei) 87.22, 스트렙토미세스 종 SirexAA-E, 스트렙토미세스 베네주엘라에(Streptomyces venezuelae) ATCC 10712, 스트렙토미세스 비올라세우스니거(Streptomyces violaceusniger) Tu 4113, 술포바실루스 아시도필루스(Sulfobacillus acidophilus) TPY, 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca) YX, 써모토가 레틴가에(Thermotoga lettingae) TMO, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) MSB8, 써모토가 나프토필라(Thermotoga naphthophila) RKU-10, 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) DSM 4359, 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) RKU-1, 써모토가 종 RQ2, 써모비브리오 암모니피칸스(Thermovibrio ammonificans) HB-1, 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) HB27, 크산토모나스 알빌리네안스(Xanthomonas albilineans), 크산토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis) 병원체변종 시트루멜로(citrumelo) F1, 크산토모나스 악소노포디스 병원체변종 시트리(citri) 균주 306/, 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) 병원체변종 캄페스트리스 균주 8004, 크산토모나스 에우베시카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 크산토모나스 오리자에 병원체변종 오리자에.
인용된 공개문헌 외에도, 변형가능한 유전자, 특히 그의 서열은 공개적으로 접근가능한 데이터베이스, 예를 들어 http://www.genome.jp/kegg 하에 KEGG (유전자 및 게놈의 교토 백과사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)) 데이터베이스에서 또는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 하에 NCBI (미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information), 미국 메릴랜드주 20894 베데스다 록빌 파이크 8600 미국 국립 의학 도서관)의 데이터베이스에서도 또한 입수가능하다. KEGG 데이터베이스는 "교토 대학교 생물정보학 센터" 및 "도쿄 대학교 인간 게놈 센터"의 가네히사(Kanehisa) 등의 실험실에 의해 1995년부터 개발되어 왔다. 개별 유전자 외에도, 이들 데이터베이스는 또한 다양한 미생물의 전체 게놈 또는 게놈 중 대부분의 정보 및 서열을 포함한다.
본 특허 출원의 문맥에서 유전적 동등물은 첫째로 본 발명에 따라 사용되는 바실루스 푸밀루스 균주의 유전자와 기오이아(Gioia) 등에 의해 공개된 바실루스 푸밀루스 균주의 유전자 및/또는 상기 제공된 미생물의 유전자 사이의 가능한 가장 높은 서열 상동성에 있어서 주목할 만하다. 둘째로, 유전적 동등물은 유사한 유형의 기능에 있어서 주목할 만한데, 즉 본 발명에 따라 사용되는 바실루스 푸밀루스 균주와 기오이아 등에 의해 공개된 바실루스 푸밀루스 균주 및/또는 상기 제공된 미생물의 서로 상응하는 유전자는 각각의 미생물에서 유사한 유형의 기능을 갖는다.
상기 유전자 및/또는 게놈 정보로, 서열 비교를 참조하여 본 발명에 따른 방법에 사용되는 바실루스 푸밀루스 균주 내의 각각의 유전자를 확인하는 것이 가능하다. 기오이아 등에 의해 공개된 바실루스 푸밀루스 균주의 게놈 및/또는 상기 제공된 미생물의 게놈으로부터의 유전자 정보, 특히 서열 정보에 기반하여, 당업자는 서열 비교 및/또는 분자 생물학 표준 방법론에 의해, 유전자 변형되고 이어서 본 발명에 따른 방법에 사용되는 바실루스 푸밀루스 균주의 게놈에서 가장 높은 서열 일치를 갖는 핵산 서열을 확인할 수 있다. 유사한 유형의 기능, 즉 기능적 동등성의 확인은, 각 경우에 서열 비교에 기반하여 비교되는 유전자를 동일한 방식으로 변형 (바람직하게는 기능적으로 탈활성화)시키고, 동일한 유형의 변형, 특히 표현형의 변형이 미생물 둘 다에서 발생하는지의 여부를 관찰하는 각각의 미생물을 사용한 비교 실험에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 기오이아 등에 의해 공개된 바실루스 푸밀루스 균주 및/또는 상기 제공된 미생물에서의 해당 유전자의 변형, 특히 기능적 탈활성화가 대사 활성, 이동성 또는 포자형성 거동의 변화와 연관되고, 본 발명에 따라 사용되고 변형되는 바실루스 푸밀루스 균주에서 상응하는 변화가 관찰되는 경우에, 이는 정확한 할당의 확인으로 간주된다. 상응하는 방법은 유전학, 특히 미생물의 유전학 분야에서 표준이며, 당업자에게 널리 공지되어 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 미생물은 포자형성-억제된다. 이는 바람직하게는, 그의 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 유전적 동등물을 기능적으로 탈활성화시킴으로써, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 유전적 동등물 또는 그의 일부를 결실시킴으로써 달성된다. 상기 방식으로 포자형성-억제된 바실루스 푸밀루스 균주로, 본 발명에 따른 방법에서 특히 높은 산물 수율이 달성되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 미생물은 통상의 방식으로, 예를 들어 불연속적 또는 연속적 시스템에서 배양 및 발효될 수 있다. 첫 번째 경우에, 적합한 영양 배지에 미생물을 접종하고, 실험적으로 결정되는 기간 후에 배지로부터 단백질을 수확한다. 연속 발효는 비교적 장기간에 걸쳐 세포가 부분적으로 사멸하기도 하지만 또한 다시 증식하기도 하며 동시에 형성된 단백질이 배지로부터 제거될 수 있는 흐름 평형의 달성을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 발효 방법이다. 발효 방법은 선행 기술로부터 그 자체로 공지되어 있고, 실제 대규모 산업적 생산 단계를 구성하며, 통상적으로는 생산된 단백질의 적합한 정제 방법이 후속된다. 단백질을 생산하기 위한 본 발명에 따른 방법에 기반한 모든 발효 방법은 본 발명에 따른 방법의 실시양태를 구성한다.
발효가 공급 전략을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 방법이 특히 고려된다. 여기서는, 배양을 진행시킴으로써 고갈되는 배지 구성성분이 공급된다. 그 결과, 세포 밀도 뿐만 아니라 세포 매스 또는 건조 질량 둘 다에서 상당한 증가가 달성될 수 있다. 추가로, 발효는 또한 바람직하지 않은 대사 산물이 각 경우에 적합한 완충제 또는 반대이온을 첨가함으로써 여과되거나 또는 중화되도록 설계될 수 있다.
생산된 단백질은 발효 배지로부터 수확될 수 있다. 이러한 발효 방법은 미생물로부터의 단백질의 단리, 즉 세포 매스 (건조 질량)로부터의 산물 제조보다 바람직하다. 이는, 예를 들어 미생물이 발효 배지 중으로 단백질을 분비하도록 하는 적합한 분비 마커 및/또는 메카니즘 및/또는 수송 시스템의 제공에 의해 달성될 수 있다. 분비 없는 단백질의 단리는 다르게는 숙주 세포로부터 일어날 수 있는데, 즉 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올을 사용한 침전 또는 크로마토그래피 정제에 의한 세포 매스로부터의 그의 정제이다.
본 발명은 하기 방법 단계:
(a) 프로모터 및 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물의 미생물 내로의 도입;
(b)　미생물에서의 단백질의 발현
을 포함하며,
여기서 미생물은 바실루스 푸밀루스 종에 속하는 것인 방법에 의해 수득가능한 미생물을 추가로 제공한다.
이에 따라, 이들은 본 발명에 따른 방법의 대상일 수 있는 모든 미생물이다. 본 발명에 따른 방법에 대해 기재되어 있는 모든 중요한 사실, 요지 및 실시양태가 또한 본 발명의 대상에 적용될 수 있다. 따라서, 이러한 관점에서, 해당 관점에서의 개시내용은 이 개시내용이 본 발명에 따른 미생물에도 또한 적용된다는 암시와 함께 명백히 참조된다.
본 발명에 따른 미생물의 특히 바람직한 실시양태는
(a) 프로모터가
(i) 서열 1에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(ii) 서열 2에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(iii) 서열 3에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(iv) 서열 4에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열
로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하고/거나,
(b)　단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않고/거나,
(c)　단백질이 효소, 특히 산성 셀룰라제, 알파-아밀라제, 알파-아세토데카르복실라제, 아미노펩티다제, 아밀라제, 아라바나제, 베타-글루카나제, 베타-글루코시다제, 베타-만노시다제, 카라기나제, 카르보히드라제, 카탈라제, 셀로비오스-옥시다제, 셀룰라제, 키모신, 엔도-1,3-베타-글루카나제, 엔도-1,3(4)-베타-글루카나제, 엔도-1,4-베타-크실라나제, 엔도펩티다제, 에스테라제, 엑소펩티다제, G4-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 글리코리파제, 헤미셀룰라제, 락카제, 리파제, 리소포스포리파제, 말토게닉 아밀라제, 만난아제, 중성 프로테아제, 뉴클레아제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 펙테이트 리아제, 펙티나제, 펙틴 에스테라제, 펜토사나제, 퍼히드롤라제, 포스포리파제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 프로테아제, 프로테이나제, 풀루라나제, 레넷 효소, 람노갈락투로나제, 서브틸리신, 탄나제, 트랜스퍼라제, 트랜스글루타미나제, 크산타나제, 크실라나제, 크실로글루카나제, 바람직하게는 프로테아제 또는 알파-아밀라제, 또는 그의 혼합물이고/거나,
(d)　미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395이고/거나,
(e)　미생물이 바람직하게는 유전자 spoIV (yqfD)의 변형의 결과로, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 일부의 결실의 결과로 포자형성-억제되고/거나,
(f)　미생물이 유전자 변형된 것인,
미생물이다.
본 발명에 따른 미생물의 매우 특히 바람직한 실시양태는
(a) 프로모터가
(i) 서열 1에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(ii) 서열 2에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열
로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하고/거나,
(b)　단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않고/거나,
(c)　단백질이 프로테아제, 바람직하게는 서브틸리신, 또는 알파-아밀라제이고/거나,
(d)　미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395이고/거나,
(e)　미생물이 바람직하게는 유전자 spoIV (yqfD)의 변형의 결과로, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 일부의 결실의 결과로 포자형성-억제되고/거나,
(f)　미생물이 유전자 변형된 것인,
미생물이다.
본 발명에 따른 미생물의 추가의 매우 특히 바람직한 실시양태는
(a) 프로모터가
(i) 서열 1에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(ii) 서열 2에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(iii) 서열 3에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열;
(iv) 서열 4에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열
로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하고/거나,
(b)　단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않고/거나,
(c)　단백질이 알파-아밀라제이고/거나,
(d)　미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395이고/거나,
(e)　미생물이 바람직하게는 유전자 spoIV (yqfD)의 변형의 결과로, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 일부의 결실의 결과로 포자형성-억제되고/거나,
(f)　미생물이 유전자 변형된 것인,
미생물이다.
가장 고도로 특히 바람직한 본 발명에 따른 미생물의 실시양태는
(a) 프로모터가 서열 3에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하고/거나,
(b)　단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않고/거나,
(c)　단백질이 알파-아밀라제이고/거나,
(d)　미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395이고/거나,
(e)　미생물이 바람직하게는 유전자 spoIV (yqfD)의 변형에 의해, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 일부의 결실에 의해 포자형성-억제되고/거나,
(f)　미생물이 유전자 변형된 것인,
미생물이다.
가장 고도로 특히 바람직한 본 발명에 따른 미생물의 추가 실시양태는
(a) 프로모터가 서열 1에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하고/거나,
(b)　단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않고/거나,
(c)　단백질이 알파-아밀라제이고/거나,
(d)　미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395이고/거나,
(e)　미생물이 바람직하게는 유전자 spoIV (yqfD)의 변형의 결과로, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 일부의 결실의 결과로 포자형성-억제되고/거나,
(f)　미생물이 유전자 변형된 것인,
미생물이다.
가장 고도로 특히 바람직한 본 발명에 따른 미생물의 실시양태는
(a) 프로모터가 서열 2에 제공된 핵산 서열과 적어도 80%, 점점 더 바람직하게는 적어도 81.0%, 82.0%, 83.0%, 84.0%, 85.0%, 86.0%, 87.0%, 88.0%, 89.0%, 90.0%, 91.0%, 92.0%, 93.0%, 94.0%, 95.0%, 96.0%, 97.0%, 98.0%, 99.0%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 매우 특히 바람직하게는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하고/거나,
(b)　단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않고/거나,
(c)　단백질이 알파-아밀라제이고/거나,
(d)　미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395이고/거나,
(e)　미생물이 바람직하게는 유전자 spoIV (yqfD)의 변형의 결과로, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 일부의 결실의 결과로 포자형성-억제되고/거나,
(f)　미생물이 유전자 변형된 것인,
미생물이다.
본 발명에 따른 미생물은 유리하게는 단백질을 생산하기 위해 본 발명에 따른 방법에 사용된다. 따라서, 본 발명은 이에 따라 단백질, 특히 효소를 생산하기 위한 본 발명에 따른 미생물의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명에 따른 방법 또는 미생물에 대해 기재되어 있는 모든 중요한 사실, 요지 및 실시양태가 또한 본 발명의 대상에 적용될 수 있다. 따라서, 이러한 관점에서, 해당 관점에서의 개시내용은 이 개시내용이 본 발명에 따른 용도에도 또한 적용된다는 암시와 함께 명백히 참조된다.
실시예
모든 분자 생물학 작업 단계는, 예를 들어 매뉴얼 [Fritsch, Sambrook and Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989]에 제공된 바와 같은 표준 방법, 또는 유사 관련 연구를 따른다. 효소, 키트 및 기기는 각각의 제조업체로부터의 지침서에 따라 사용하였다.
실시예 1:
바실루스 푸밀루스 및 바실루스 리케니포르미스를 사용한 프로테아제 (표적 단백질)의 발효 생산의 비교
각 경우에 프로테아제 (표적 단백질)를 코딩하는 유전자 뿐만 아니라 기능적 프로모터를 포함하는 하기 제공된 바와 같은 3종의 상이한 발현 플라스미드를 바실루스 리케니포르미스 균주 뿐만 아니라 바실루스 푸밀루스 균주 둘 다에 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 발효적 프로테아제 생산에 사용하였다. 사용된 바실루스 리케니포르미스 균주는 국제 특허 출원 WO 91/02792에 개시되어 있다. 사용된 바실루스 푸밀루스 균주는 유전자 spoIV (yqfD)가 결실에 의해 기능적으로 탈활성화되어 있는 바실루스 푸밀루스 DSM 14395였다. 사용된 프로모터는 서열 1 및 서열 2에 따른 핵산 서열이었다. 프로모터는 각 경우에 각각의 발현 플라스미드에서 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 상류에 배열된다. 하기 플라스미드를 사용하였다 (표 1):
표 1:
Figure pct00001
각각의 미생물 내로의 발현 플라스미드의 형질전환 후, 생성된 생산 균주를 2 리터 실험실 발효기에서의 표준 발효 방법 (48시간의 배양 시간)에 사용하고, 생성된 프로테아제 활성을 기질 suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드 (AAPF)로부터의 발색단 파라-니트로아닐린 (pNA)의 방출을 통해 결정하였다. 프로테아제는 기질을 절단하여 pNA를 방출시킨다. pNA의 방출은 410 nm에서의 흡광도 증가를 유발하며, 그의 시간 경과에 따른 진행은 효소 활성의 척도이다 (문헌 [Del Mar et al., 1979] 참조). 측정은 25℃의 온도, pH 8.6 및 410 nm의 파장에서 수행하였다. 측정 시간은 5분이고 측정 간격은 20초 내지 60초였다.
바실루스 리케니포르미스와 비교하여, 생산 유기체로서의 바실루스 푸밀루스에 의한 수율은 상당히 증가하였다 (표 2 참조). 제공된 값은 각 경우에 수득된 바실루스 리케니포르미스에 대한 프로테아제 활성 (이를 100%로 규정함)에 기반한, 바실루스 푸밀루스에 대해 측정된 상대적 프로테아제 활성이다.
표 2:
Figure pct00002
실시예 2:
본 실시예에서는, 바실루스 푸밀루스에서의 프로테아제 (표적 단백질)의 발효 생산을 다양한 프로모터를 포함하는 발현 구축물로 연구하였다. 발현 플라스미드 1 및 3을 실시예 1에 기재된 바와 같이 서열 1 및 서열 2에 따른 프로모터와 함께 사용하였다. 사용된 추가의 발현 플라스미드 (대조군)는 바실루스 푸밀루스로부터의 프로모터 대신에 국제 특허 출원 WO 91/02792에 개시되어 있는 바실루스 리케니포르미스 프로모터 ("ATCC 53926 알칼리성 프로테아제 유전자의 프로모터"; WO 91/02792 실시예 5, 6 및 도 27 참조)를 사용하였다는 사실로 인해 플라스미드 1 및 3과 상이한 발현 플라스미드였다. 사용된 바실루스 푸밀루스 균주는 실시예 1에서와 같이 유전자 spoIV (yqfD)가 결실에 의해 기능적으로 탈활성화되어 있는 바실루스 푸밀루스 DSM 14395였다.
상기 균주를 명시된 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 생성된 생산 균주를 2 리터 실험실 발효기에서의 표준 발효 방법에 사용하고, 생성된 프로테아제 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 기질 suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드 (AAPF)로부터의 발색단 파라-니트로아닐린 (pNA)의 방출을 통해 결정하였다. 대조 균주와 비교하여, 플라스미드 1 및 3에 의한 수율은 상당히 증가하였다 (표 3 참조). 언급된 값은 대조 균주에 대한 프로테아제 활성 (이를 100%로 규정함)에 기반한, 플라스미드 1 및 3을 포함하는 균주에 대해 측정된 상대적 프로테아제 활성이다.
표 3:
Figure pct00003
실시예 3:
각 경우에 아밀라제 (표적 단백질)를 코딩하는 유전자 및 기능적 프로모터를 포함하는 하기 제공된 바와 같은 2종의 상이한 발현 플라스미드를 바실루스 리케니포르미스 균주 및 또한 바실루스 푸밀루스 균주 둘 다 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 발효적 아밀라제 생산에 사용하였다. 사용된 바실루스 리케니포르미스 균주는 국제 특허 출원 WO 91/02792에 개시되어 있다. 사용된 바실루스 푸밀루스 균주는 유전자 spoIV (yqfD)가 결실에 의해 기능적으로 탈활성화되어 있는 바실루스 푸밀루스 DSM 14395였다. 사용된 프로모터는 서열 3 및 서열 4에 따른 핵산 서열 (문헌 [Palva,I., Pettersson,R.F., Kalkkinen,N., Lehtovaara,P., Sarvas,M., Soderlund,H., Takkinen,K. and Kaariainen,L. "Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal signal peptide region of the alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens"; Gene 15 (1), 43-51 (1981)]에 개시된 바와 같은 바실루스 아밀로리퀘파시엔스로부터의 아밀라제 프로모터)이었다. 프로모터는 각 경우에 각각의 발현 플라스미드에서 아밀라제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 상류에 배열된다. 하기 플라스미드를 사용하였다 (표 4):
표 4:
Figure pct00004
각각의 미생물 내로의 발현 플라스미드의 형질전환 후, 생성된 생산 균주를 2 리터 실험실 발효기에서의 표준 발효 방법 (48시간의 배양 시간)에 사용하고, 생성된 아밀라제 활성을 결정하였다.
녹말분해 활성을 TAU 단위로 결정하기 위해, 말단 글루코스 단위가 벤질리덴 기에 의해 차단되어 있는 변형된 p-니트로페닐말토헵타오시드를 사용하였는데; 이것은 아밀라제에 의해 절단되어 유리 p-니트로페닐 올리고사카라이드를 생성하며, 이것은 그의 일부에 대해 보조 효소 글루코아밀라제 및 알파-글루코시다제에 의해 글루코스 및 p-니트로페놀로 전환된다. 따라서, 방출된 p-니트로페놀의 양은 아밀라제 활성에 비례한다. 측정은, 예를 들어 애보트(Abbott, 미국 일리노이주 애보트 파크)로부터의 퀵-스타트(Quick-Start)® 시험 키트로 수행하였다. 광도계에 의해 블랭크 값에 대한 시험 배치에서의 흡광도 증가 (405 nm)를 37℃에서 3분에 걸쳐 검출하였다. 보정은 공지된 활성의 효소 표준물 (예를 들어, 2900 TAU/g를 갖는 제넨코르로부터의 맥사밀(Maxamyl)®/퓨라스타® 2900)을 통해 수행하였다. 평가는 표준물의 효소 농도에 대한 분당 흡광도 차이 dE (405 nm)를 플롯팅함으로써 수행하였다.
표 5는 플라스미드 4 (서열 3에 따른 프로모터)를 사용하여 수득된 바실루스 리케니포르미스에 대한 아밀라제 활성 (이를 100%로 규정함)에 기반한, 바실루스 푸밀루스에 대해 측정된 상대적 아밀라제 활성을 제공한다.
표 5:
Figure pct00005
놀랍게도, 비. 푸밀루스 (자연적으로는 어떠한 그 자체의 아밀라제도 생산하지 않음)에서 서열 3에 따른 프로모터가 이종 발현되는 아밀라제의 매우 높은 수율을 달성하기에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
실시예 4:
본 실시예에서는, 바실루스 푸밀루스에서의 아밀라제 (표적 단백질)의 발효 생산을 다양한 프로모터를 포함하는 발현 구축물로 연구하였다. 발현 플라스미드 4, 6 및 7을 실시예 3에 기재된 바와 같이 서열 3, 1 및 서열 2에 따른 프로모터와 함께 사용하였다. 사용된 바실루스 푸밀루스 균주는 실시예 1에서와 같이 유전자 spoIV (yqfD)가 결실에 의해 기능적으로 탈활성화되어 있는 바실루스 푸밀루스 DSM 14395였다. 상기 균주를 명시된 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 생성된 생산 균주를 2 리터 실험실 발효기에서의 표준 발효 방법에 사용하고, 생성된 아밀라제 활성을 실시예 3에 기재된 바와 같이 결정하였다.
표 6은 플라스미드 4를 포함하는 비. 푸밀루스에 대한 아밀라제 활성 (이를 100%로 규정함)에 기반한, 플라스미드 4, 6 및 7을 포함하는 상기 언급된 비. 푸밀루스 균주에 대해 측정된 상대적 아밀라제 활성을 제공한다.
이미 비. 푸밀루스에서의 이종 아밀라제 발현에 특히 적합한 플라스미드 4와 비교하여 (표 5 참조), 플라스미드 7로 유사하게 높은 수율이 달성되었고, 플라스미드 6으로 훨씬 더 개선된 아밀라제 수율이 달성되었다 (표 6 참조).
표 6:
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Henkel AG & Co. KGaA <120> Expressionsverfahren <130> PT031193 PCT <150> DE 102012201297.4 <151> 2012-01-31 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 555 <212> DNA <213> Bacillus pumilus <400> 1 cagcgtgtag acaaaccttc gcattcgttg tcaggtctgc gcgccggtgc tcacgaatgt 60 caaattcgct ccgcgccagt gctcggcctt cctagacttc aaaggttttc tatcacgctg 120 aaaagaagac aaagtgctaa aataaagatc attttagcac tttgtcaaca atctggaacc 180 tgttatataa acaggttctt ttaaatgaca aaaacaatga taaaataata tttttttata 240 tcgaaattcg aaatagctgc tagacgtttc tacctatttt aaggcttttc gggtatcgaa 300 tatttctccg ataatggatc ataagaaaaa tagcatactt cctttttaat agataatcgc 360 tgaaacagta gaataaacat attttaccac tatttccaag tgacttaatt ccccaatttt 420 cgctaggact ttcacaaaaa ttcaggtcta ctcttatttg cctacttccc ttaaactgaa 480 tatacagaat aatcaaacgt ctcattctta tagactacgg atgattattc tgaaataaga 540 aaaaagggat gtgga 555 <210> 2 <211> 197 <212> DNA <213> Bacillus pumilus <400> 2 taacaagaga aaggccgcca attaggcggt ttttcctttt cattaagaaa ggtgagatcg 60 atagaataaa agttggaaag atacaaaaca cctaatttaa aaatgaaata ttttgtaaaa 120 aataagaata ttctctcatt tactccaata tgaaacaatc gtatgatttt tgatatagga 180 cataaaggag gaatatg 197 <210> 3 <211> 225 <212> DNA <213> Bacillus lichenformis <400> 3 tcgggacctc tttccctgcc aggctgaagc ggtctattca tactttcgaa ctgaacattt 60 ttctaaaaca gttattaata accaaaaaat tttaaattgg tcctccaaaa aaataggcct 120 accatataat tcattttttt tctataataa attaacagaa taattggaat agattatatt 180 atccttctat ttaaattatt ctgaataaag aggaggagag tgatc 225 <210> 4 <211> 217 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 4 attgagcctt tgatgactga tgatttggct gaagaagtgg atcgattgtt tgagaaaaga 60 agaagaccat aaaaatacct tgtctgtcat cagacagggt attttttatg ctgtccagac 120 tgtccgctgt gtaaaaataa ggaataaagg ggggttgtta ttattttact gatatgtaaa 180 atataatttg tataagaaaa tgagagggag agtgatc 217

Claims (10)

  1. 방법 단계
    (a) 프로모터 및 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물의 미생물 내로의 도입;
    (b)　미생물에서의 단백질의 발현
    을 포함하며,
    여기서 미생물은 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 종에 속하는 것인, 미생물에 의해 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터가
    (a) 서열 1에 제공된 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열;
    (b)　서열 2에 제공된 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열;
    (c)　서열 3에 제공된 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열;
    (d)　서열 4에 제공된 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열
    로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 효소, 특히 산성 셀룰라제, 알파-아밀라제, 알파-아세토데카르복실라제, 아미노펩티다제, 아밀라제, 아라바나제, 베타-글루카나제, 베타-글루코시다제, 베타-만노시다제, 카라기나제, 카르보히드라제, 카탈라제, 셀로비오스-옥시다제, 셀룰라제, 키모신, 엔도-1,3-베타-글루카나제, 엔도-1,3(4)-베타-글루카나제, 엔도-1,4-베타-크실라나제, 엔도펩티다제, 에스테라제, 엑소펩티다제, G4-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 글리코리파제, 헤미셀룰라제, 락카제, 리파제, 리소포스포리파제, 말토게닉 아밀라제, 만난아제, 중성 프로테아제, 뉴클레아제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 펙테이트 리아제, 펙티나제, 펙틴 에스테라제, 펜토사나제, 퍼히드롤라제, 포스포리파제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 프로테아제, 프로테이나제, 풀루라나제, 레넷 효소, 람노갈락투로나제, 서브틸리신, 탄나제, 트랜스퍼라제, 트랜스글루타미나제, 크산타나제, 크실라나제, 크실로글루카나제 또는 그의 혼합물, 특히 바람직하게는 알파-아밀라제 및/또는 프로테아제인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 유전자 변형된 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 바람직하게는 유전자 spoIV (yqfD)의 변형의 결과로, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 일부의 결실의 결과로 포자형성-억제된 것인 방법.
  8. 방법 단계
    (a) 프로모터 및 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물의 미생물 내로의 도입;
    (b)　미생물에서의 단백질의 발현
    을 포함하며,
    여기서 미생물은 바실루스 푸밀루스 종에 속하는 것인 방법에 의해 수득가능한 미생물.
  9. 제8항에 있어서,
    (a) 프로모터가
    (i) 서열 1에 제공된 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열;
    (ii)　서열 2에 제공된 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열;
    (iii)　서열 3에 제공된 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열;
    (iv)　서열 4에 제공된 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열
    로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하고/거나,
    (b)　단백질이 미생물에 자연적으로 존재하지 않고/거나,
    (c)　단백질이 효소, 특히 산성 셀룰라제, 알파-아밀라제, 알파-아세토데카르복실라제, 아미노펩티다제, 아밀라제, 아라바나제, 베타-글루카나제, 베타-글루코시다제, 베타-만노시다제, 카라기나제, 카르보히드라제, 카탈라제, 셀로비오스-옥시다제, 셀룰라제, 키모신, 엔도-1,3-베타-글루카나제, 엔도-1,3(4)-베타-글루카나제, 엔도-1,4-베타-크실라나제, 엔도펩티다제, 에스테라제, 엑소펩티다제, G4-아밀라제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 글리코리파제, 헤미셀룰라제, 락카제, 리파제, 리소포스포리파제, 말토게닉 아밀라제, 만난아제, 중성 프로테아제, 뉴클레아제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 펙테이트 리아제, 펙티나제, 펙틴 에스테라제, 펜토사나제, 퍼히드롤라제, 포스포리파제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 프로테아제, 프로테이나제, 풀루라나제, 레넷 효소, 람노갈락투로나제, 서브틸리신, 탄나제, 트랜스퍼라제, 트랜스글루타미나제, 크산타나제, 크실라나제, 크실로글루카나제, 특히 프로테아제 또는 알파-아밀라제, 또는 그의 혼합물이고/거나,
    (d)　미생물이 바실루스 푸밀루스 DSM 14395이고/거나,
    (e)　미생물이 바람직하게는 유전자 spoIV (yqfD)의 변형의 결과로, 특히 유전자 spoIV (yqfD) 또는 그의 일부의 결실의 결과로 포자형성-억제되고/거나,
    (f)　미생물이 유전자 변형된 것인,
    미생물.
  10. 단백질, 특히 효소를 생산하기 위한 제8항 또는 제9항에 따른 미생물의 용도.
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