BR112019020772A2 - processo de recuperação - Google Patents

Abstract

é divulgado um método para recuperar um produto de fermentação desejado de um caldo de fermentação, onde o produto desejado precipitou durante a fermentação.

Description

“PROCESSO DE RECUPERAÇÃO”

Referência à listagem de sequências [0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador. O formato legível por computador é incorporado no presente documento a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção se refere a um método melhorado para a solubilização de cristais de proteínas e/ou precipitado de proteína em um caldo de fermentação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003] O rendimento de fermentação de proteínas industriais, por exemplo enzimas como as proteases, aumentou dramaticamente nos últimos anos. Em muitos processos industriais, a concentração da proteína no caldo de fermentação é tão alta que uma parte significativa da proteína é encontrada na forma de cristais ou precipitados sólidos no final do processo de fermentação.

[0004] O documento WO93/13125 divulga um processo para produzir protease onde a protease é precipitada durante a fermentação por adição de um agente de precipitação ao meio de produção. Verificou-se que a protease precipitada durante a fermentação protege a protease contra proteólise.

[0005] Para muitos produtos de fermentação, é desejável que o microrganismo usado na fermentação seja removido do produto. Uma das primeiras etapas no processo de recuperação do produto é geralmente a remoção da biomassa celular do produto, por exemplo, por filtração ou centrifugação, removendo a biomassa celular sólida do líquido compreendendo o produto desejado. Esta etapa é frequentemente chamada de etapa de separação primária onde o microrganismo é separado da fração líquida, e a fração líquida pode ser processada subsequentemente com uma ou mais etapas a

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2/45 jusante, tal como ultrafiltração, estabilização, secagem por pulverização, granulação que eventualmente transformará o produto desejado na forma e concentração que se destina a este produto específico.

[0006] No entanto, se parte do produto desejado estiver presente na forma sólida após a fermentação, devem ser tomadas medidas adequadas para solubilizar o produto antes da biomassa ser removida da fração líquida compreendendo o produto.

[0007] O documento US 6,316,240 divulga um processo para a solubilização de enzimas precipitadas durante o processo de fermentação, onde o pH do caldo de cultura é ajustado para um pH entre 9,5 e 13,0. O processo é exemplificado com uma fermentação de amilase.

[0008] O documento EP 2 125 865 divulga um processo para solubilizar cristais de protease e/ou precipitado de protease em um caldo de fermentação compreendendo a diluição do caldo de fermentação a 1002000% (p/p); adição de um sal divalente; e ajuste do valor de pH do caldo de fermentação para um valor de pH abaixo de 5,5.

[0009] O documento EP 1 456 613 divulga um processo para colher partículas cristalinas, em particular alfa-amilase ou protease cristalina, a partir do caldo de fermentação, em que o caldo de fermentação é separado em uma fração de biomassa, uma fração alfa-amilase ou protease cristalina e uma fração sobrenadante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0010] A invenção proporciona um método para recuperar um produto desejado de um caldo de fermentação, onde o produto desejado está presente na forma de precipitado no caldo de fermentação, compreendendo o método:

a) uma primeira etapa de separação que separa o caldo de fermentação em uma primeira fase e uma segunda fase, em que a primeira fase compreende sobrenadante do caldo de fermentação

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3/45 e que pode compreender uma parte das células e detritos celulares do caldo de fermentação, e a segunda fase compreende o produto desejado na forma precipitada, células e detritos celulares; e

b) uma etapa de solubilização onde o produto desejado na forma precipitada é solubilizado.

[0011] Em uma modalidade preferida, o método compreende adicionalmente uma segunda etapa de separação onde o produto desejado solubilizado da etapa b) é separado das células e/ou detritos celulares.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS SEQUÊNCIAS [0012] SEQ ID NO: 1 : sequência de aminoácidos da protease de B. lentus (Savinase) [0013] SEQ ID NO: 2 : sequência de aminoácidos da protease de B. amyloliquefaciens (BPN') [0014] SEQ ID NO: 3: Subtilisina Carlsberg [0015] SEQ ID NO: 4: Protease de Bacillus sp. TY145, divulgada em WO 92/17577 [0016] SEQ ID NO: 5: Protease de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, divulgada em WO 88/03947 [0017] SEQ ID NO: 6: Protease de Pyrococcus furiosus, divulgada em US 6,358,726.

[0018] SEQ ID NO: 7: Alfa-amilase de Bacillus sp. divulgada em WO 2000/060060.

[0019] SEQ ID NO: 8: Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus SEQ ID NO: 9: Alfa-amilase de Bacillus licheniformis

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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0020] A Figura 1 mostra a dissolução da muramidase a partir do caldo de cultura (CB) ou da segunda fase de acordo com a invenção, refletindo os resultados das experiências no exemplo 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0021] A presente invenção se refere à separação primária de um caldo de fermentação onde parte do produto de fermentação desejado está presente na forma sólida tal como na forma cristalina ou amorfa. Não é importante para a presente invenção se o produto de fermentação desejado está na forma cristalina ou amorfa ou mesmo em uma mistura dessas formas, o que é importante é que uma parte significativa do produto desejado está na forma sólida e, portanto, a separação primária etapa não pode ser prontamente executada como um simples processo de separação sólido/líquido. A etapa de separação primária tem o objetivo de remover as células e detritos celulares do produto desejado.

[0022] A invenção se refere a um método para recuperar um produto de fermentação desejado a partir de um caldo de fermentação, em que o produto de fermentação está presente, pelo menos parcialmente, na forma insolúvel no caldo de fermentação, tal como na forma cristalina ou amorfa; compreendendo:

• uma primeira etapa de separação que separa o caldo de fermentação em uma primeira fase e em uma segunda fase, em que a primeira fase compreende líquido do caldo de fermentação e produto de fermentação desejado na forma solúvel; e a segunda fase compreende o produto de fermentação desejado na forma insolúvel, células e/ou detritos celulares; e • uma etapa de solubilização, em que o produto de fermentação desejado na segunda fase é solubilizado.

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5/45 [0023] Em algumas modalidades a invenção se refere a um método compreendendo adicionalmente uma segunda etapa de separação que separa a fase líquida compreendendo o produto de fermentação desejado solubilizado da biomassa sólida, opcionalmente após misturar a primeira fase solubilizada com parte ou toda a primeira fase da primeira etapa de separação.

[0024] A invenção é baseada na observação de que o caldo de fermentação parece conter alguns componentes que são prejudiciais para o processo de solubilização. Os dados parecem indicar que condições ótimas para alta solubilidade de proteínas, tais como enzimas, são condições com alta concentração de enzimas e baixa concentração de ions. No entanto, deve ser entendido que a invenção não está limitada por qualquer teoria particular. Verificou-se ser benéfico se a solubilização do produto desejado pudesse ocorrer na ausência de pelo menos parte da parte líquida do caldo de fermentação contendo a maioria destes componentes desvantajosos.

[0025] De acordo com a invenção, a fermentação se destina a significar o processo onde um ou mais microrganismos são cultivados em um fermentador em um meio de fermentação compreendendo todos os componentes necessários para o crescimento de um ou mais microrganismos que produzem um caldo de fermentação compreendendo um ou mais microrganismos, componentes de substrato consumidos e um ou mais produtos de fermentação desejados. Se o rendimento do produto de fermentação desejado for alto o suficiente, parte do produto de fermentação pode precipitar formando cristais ou precipitados amorfos no caldo de fermentação. Isto é bem conhecido na técnica e muitos processos de fermentação, microrganismos, componentes de meio foram divulgados na técnica. A invenção não é limitada pelo processo de fermentação particular desde que o processo de

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6/45 fermentação proporcione um caldo de fermentação compreendendo um produto de fermentação desejado pelo menos parcialmente na forma insolúvel no caldo de fermentação tal como na forma cristalina ou amorfa.

[0026] Os métodos para fermentar microrganismos para produzir um produto desejado, onde o produto desejado precipita durante a fermentação, foram descritos na técnica, por exemplo US 6,316,240, WO 03/050274, WO 93/13125 e EP2125865, e qualquer um destes métodos para fermentar os microrganismos pode ser usado em conjunto com os métodos da presente invenção.

[0027] O processo de fermentação pode ser qualquer processo de fermentação adequado proporcionando um caldo de fermentação compreendendo um produto de fermentação desejado pelo menos parcialmente na forma insolúvel, tal como uma fermentação descontínua, fermentação descontínua alimentada ou contínua.

[0028] A presente invenção pode ser útil para qualquer fermentação em escala industrial, por exemplo para qualquer fermentação com meios de cultura de pelo menos 50 litros, tal como pelo menos 500 litros, tal como pelo menos 5.000 litros, tal como pelo menos 50.000 litros.

[0029] O produto de fermentação pode ser qualquer produto produzido por microrganismos que se acumulam no caldo de fermentação. O produto de fermentação pode ser metabolites primários, metabolites secundários, proteínas, vitaminas, hormonas e carboidratos. O produto de fermentação é preferencialmente selecionado entre proteínas, tais como enzimas. O produto de fermentação pode mesmo ser uma mistura de duas ou mais enzimas desejadas, por exemplo uma mistura compreendendo todas as enzimas necessárias para degradar a celulose em açúcares de baixo peso molecular, tais como glicose e celobiose.

[0030] Em uma modalidade, o produto de fermentação compreende uma enzima selecionada do grupo de classes de enzima consistindo

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7/45 em oxirredutases (EC 1), transferases (EC 2), hidrolases (EC 3), liases (EC

4), isomerases (EC 5) e ligases (EC 6).

[0031] Em outra modalidade a enzima é uma enzima com uma atividade selecionada do grupo de atividades enzimáticas consistindo em aminopeptidase, amilase, amiloglicosidase, mananase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, glicosiltransferase ciclodextrina, desoxirribonuclease, esterase, galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, glicose oxidase, glicosidase, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, liase, manosidase, oxidase, pectinase, peroxidase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, protease, ribonuclease, transferase, transglutaminase, lisozima, muramidase ou xilanase.

[0032] Preferencialmente, o produto de fermentação é uma protease ou uma alfa-amilase.

[0033] Proteases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana, fúngica, vegetal, viral ou animal, por exemplo, origem vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferencial. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Pode ser uma protease alcalina, tal como uma serina protease ou uma metaloprotease. Uma serina protease pode ser por exemplo da família S1, como tripsina, ou da família S8 como subtilisina. Uma protease das metaloproteases pode por exemplo ser uma termolisina da, por exemplo, família M4 ou outra metaloprotease tal como aquelas das famílias M5, M7 ou M8.

[0034] O termo subtilases se refere a um subgrupo de serina proteases de acordo com Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 e Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. As serina proteases são um subgrupo de proteases caracterizadas por terem uma serina no sítio ativo, que forma um aduto covalente com o substrato. As subtilases podem ser divididas em 6 subdivisões, isto é, a família das Subtilisinas, a família das

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Termitases, a família da Proteinase K, a família das Peptidases lantibióticas, a família das Quexinas e a família das Pirolisinas.

[0035] Exemplos de subtilases são aquelas derivadas de Bacillus tais como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus e Bacillus gibsonii descritas em US7262042 e W009/021867, e subtilisina lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN’, subtilisina 309, subtilisina 147e subtilisina 168 descritas em WO89/06279 e protease PD138 descrita em (WO93/18140). Outras proteases úteis podem ser aquelas descritas em WO92/175177, W001/016285, W002/026024 e W002/016547. Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina) e a protease de Fusarium descrita nos documentos W089/06270, WO94/25583 e W005/040372, e as quimiotripsina proteases derivadas de Cellumonas descritas em W005/052161 e W005/052146.

[0036] Uma protease preferencial adicional é a protease alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, como descrito por exemplo no documento WO95/23221, e suas variantes que são descritas nos documentos WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 e EP1921148, [0037] Exemplos de metaloproteases são a metaloprotease neutra como descrita em WO07/044993 (Genencor Int.) tais como aquelas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens.

[0038] Em algumas modalidades, os produtos de fermentação de acordo com a invenção incluem proteases tais como Savinase, BPN', Subtilisina Carlsberg, TY145, 10R e variantes de uma delas tendo alterações, tais como substituições, inserções ou deleções de aminoácidos, nas posições de aminoácidos em 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0039] Em algumas modalidades, o produto de fermentação de acordo com a invenção é uma protease com pelo menos 60% de identidade de sequência, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo

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9/45 menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% , pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:

6.

[0040] O produto de fermentação pode ser uma alfa-amilase ou uma glucoamilase e pode ter origem bacteriana ou fúngica. Mutantes manipulados de proteína estão incluídos. Amilases incluem, por exemplo, alfaamilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita em mais detalhe em GB 1,296,839.

[0041 ] As amilases adequadas incluem amilases que têm a SEQ ID NO: 2 no documento WO 95/10603 ou variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3. Variantes preferenciais são descritas nos documentos WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 e SEQ ID NO: 4 do documento WO 99/019467, tais como variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391,408, e 444.

[0042] Diferentes amilases adequadas incluem amilases que têm SEQ ID NO: 6 do documento WO 02/010355 ou suas variantes que têm 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6. As variantes preferenciais da SEQ ID NO: 6 são aqueles tendo uma deleção nas posições 181 e 182 e uma substituição na posição 193.

[0043] Outras amilases que são adequadas são alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 6 do documento WO 2006/066594 e os resíduos 36-483 da alfa-amilase de B. licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 no documento WO 2006/066594 ou suas variantes que têm 90% de identidade de sequência. As variantes preferenciais dessa alfa-amilase híbrida são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou

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10/45 uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, 1201, A209 e Q264. Variantes mais preferenciais da alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 6 do documento WO 2006/066594 e os resíduos 36-483 de SEQ ID NO: 4 são aqueles que têm as substituições:

M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; ou

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q2 64S.

[0044] Amilases adicionais que são adequadas são amilases que têm a SEQ ID NO: 6 do documento WO 99/019467 ou suas variantes que têm 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6. As variantes preferenciais da SEQ ID NO: 6 são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 e K269. Amilases particularmente preferenciais são aquelas tendo deleção nas posições R181 e G182, ou posições H183 e G184.

[0045] As amilases adicionais que podem ser usadas são aquelas que têm SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 de WO 96/023873 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7. Variantes preferidas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 e 476, usando SEQ ID 2 de WO 96/023873 para numeração. Variantes mais preferenciais são aquelas tendo uma deleção em duas posições selecionadas de 181,182, 183 e 184, tal como 181 e 182, 182 e 183, ou posições 183 e 184. As variantes de amilase mais preferidas de

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SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas que têm uma deleção nas posições 183 e 184 e uma substituição em uma ou mais das posições 140, 195, 206, 243, 260, 304 e 476.

[0046] Outras amilases que podem ser usadas são amilases que têm a SEQ ID NO: 2 do documento WO 08/153815, SEQ ID NO: 10 do documento WO 01/66712 ou suas variantes que têm 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2 do documento WO 08/153815 ou 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 10 do documento WO 01/66712. As variantes preferenciais da SEQ ID NO: 10 do documento WO 01/66712 são aqueles tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 176, 177, 178, 179, 190, 201,207, 211 e 264.

[0047] As amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 2 do documento WO 09/061380 ou variantes que têm 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2. As variantes preferenciais da SEQ ID NO: 2 são aqueles tendo uma truncação do terminal C e/ou uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 e G475. As variantes mais preferenciais da SEQ ID NO: 2 são aquelas que têm uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E e G475K e/ou deleção na posição R180 e/ou S181 ou de T182 e/ou G183. As variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas que têm as substituições:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; ou

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S125A+N128C+T1311+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K em que as variantes são truncadas em C-terminal e opcionalmente compreendem, ainda, uma substituição na posição 243 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181.

[0048] As amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 1 do documento WO13184577 ou variantes que têm 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. As variantes preferenciais da SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: K176, R178, G179, T180, G181, E187, N192, M199, I203, S241, R458, T459, D460, G476 e G477. As variantes mais preferenciais da SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: K176L, E187P, N192FYH, M199L, I203YF, S241QADN, R458N, T459S, D460T, G476K e G477K e/ou deleção na posição R178 e/ou S179 ou de T180 e/ou G181. As variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm as substituições:

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K em que as variantes opcionalmente compreendem ainda uma substituição na posição 241 e/ou uma deleção na posição 178 e/ou posição 179.

[0049] As amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 1 do documento WO10104675 ou variantes que têm 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. As variantes preferenciais da SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: N21, D97, V128 K177, R179, S180,1181, G182, M200, L204, E242, G477 e G478. As variantes mais preferenciais da SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: N21D, D97N, V128I K177L, M200L, L204YF, E242QA, G477K e G478K e/ou deleção na posição R179 e/ou S180

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13/45 ou de 1181 e/ou G182. As variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm as substituições:

N21D+D97N+V128I em que as variantes opcionalmente compreendem ainda uma substituição na posição 200 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181.

[0050] Outras amilases adequadas são a alfa-amilase que têm a SEQ ID NO: 12 em WO01/66712 ou uma variante que tem pelo menos 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 12. Variantes de amilases preferenciais são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições de SEQ ID NO: 12 em WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Amilases preferenciais particulares incluem variantes que têm uma deleção de D183 e G184 e que têm as substituições R118K, N195F, R320K e R458K, e uma variante que tem adicionalmente substituições em uma ou mais posições selecionadas do grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 e A339, com mais preferência uma variante que tem adicionalmente substituições em todas essas posições.

[0051] Outros exemplos são variantes de amilase tais como aquelas descritas nos documentos WO2011/098531, W02013/001078 e WO2013/001087.

[0052] Em algumas modalidades, o produto de fermentação de acordo com a invenção é uma amilase com pelo menos 60% de identidade de sequência, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% , pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9.

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14/45 [0053] O produto de fermentação pode ser obtido de um microrganismo. O microrganismo pode ser um organismo que naturalmente produz o produto de fermentação ou pode ser gerado usando tecnologia de DNA recombinante onde um gene que codifica o produto de fermentação desejado está operacionalmente ligado com sequências de controle adequadas tais como promotor, terminador etc., adequadas para expressar o gene em o organismo hospedeiro pretendido, e inserido em um organismo hospedeiro adequado.

[0054] O microrganismo pode ser um procarioto ou um eucarioto.

[0055] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias gram-positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias gram-negativas incluem, mas sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[0056] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus altitudinis, Bacillus amyloliquefaciens, B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[0057] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

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15/45 [0058] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[0059] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplasto (consultar, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (consultar, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (consultar, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751) ou conjugação (consultar, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (consultar, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (consultar, por exemplo,, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (consultar, por exemplo, , Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praga) 49: 399-405), conjugação (consultar, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) ou transdução (consultar, por exemplo, Burke etal., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (consultar, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (consultar, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (consultar, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32:1295-1297), transformação de protoplastos (consultar, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (consultar, por exemplo,, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804),

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16/45 ou conjugação (consultar, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para a introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[0060] A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, de inseto, vegetal ou fúngica.

[0061] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, como usado no presente documento, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et a!., Em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8- edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[0062] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, como usado no presente documento, inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena e levedura pertencendo aFungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode variar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deverá definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0063] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[0064] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas das subdivisões Eumycota e Oomycota (como definidos por Hawksworth et a!., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por

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17/45 uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetative é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetative por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentative.

[0065] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[0066] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila,

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Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[0067] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida perse. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474 e Christensen et al., 1988, Bio/TechnologyG: 1419-1422. Métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier etal., 1989, Gene 78:147156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito etal., 1983, J. Bacteriol. 153:163; e Hinnen etal., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Pré-tratamento [0068] Antes do método de separação, de acordo com a invenção, o caldo de fermentação pode ser submetido a uma ou mais etapas de pré-tratamento, tais como diluição, ajuste de pH e/ou temperatura, adição de estabilizadores capazes de impedir o crescimento adicional do microrganismo, adição de inibidores capazes de reduzir a atividade de protease e desse modo limitar a degradação devido à atividade proteolítica.

[0069] O pré-tratamento pode também compreender um passo de lise, por exemplo tratar o caldo com agentes químicos de lise, tais como uma ou mais enzimas de degradação da parede celular, por exemplo lisozima(s). Os métodos de lise preferidos incluem a adição de lisozima e/ou

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19/45 enzimas de hidrólise para solubilizar material em suspensão como células ou matérias-primas de fermentação residual.

Primeira etapa de separação [0070] O caldo de fermentação compreendendo um produto de fermentação desejado pelo menos parcialmente na forma sólida é de acordo com a invenção separado em pelo menos duas frações em uma primeira etapa de separação, uma primeira fração compreendendo uma parte líquida do caldo de fermentação compreendendo o produto desejado na forma solúvel assim como outros solúveis, tais como sais e nutrientes solúveis remanescentes, e pode compreender células e detritos celulares; e uma segunda fração compreendendo o produto desejado na forma sólida, células, detritos celulares e outro material insolúvel. A primeira fase gerada na primeira etapa de separação pode também ser denominada centrado primário ou filtrado. A segunda fase também pode ser chamada de pasta fluida ou fase de lama.

[0071] A primeira fração e a segunda fração podem compreender parte líquida do caldo de fermentação, células e detritos celulares e o produto desejado na forma sólida, mas as razões são completamente diferentes.

[0072] A primeira fração compreende pelo menos 60% da parte líquida do caldo de fermentação, por exemplo pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 80% do caldo de fermentação, enquanto a segunda fração compreende o restante.

[0073] A segunda fração compreende pelo menos 60% do produto desejado na forma sólida, preferencialmente pelo menos 65%, preferencialmente pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, e mais preferencialmente pelo menos 90%.

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20/45 [0074] As células e detritos celulares são divididos entre a primeira e a segunda fase e a razão depende da tecnologia de separação específica usada na primeira etapa de separação.

[0075] A primeira etapa de separação é basicamente uma etapa de separação onde os sólidos são totalmente ou parcialmente separados do líquido e a primeira etapa de separação pode portanto ser realizada usando qualquer técnica conhecida na especialidade para separar sólidos de uma fase líquida. A primeira etapa de separação pode ser feita usando filtração, decantação ou centrifugação ou qualquer combinação destas, e a separação pode ser feita por lotes ou continuamente.

[0076] Dependendo da tecnologia de separação selecionada usada na primeira etapa de separação, pode ser benéfico adicionar um ou mais produtos químicos para auxiliar a separação antes da separação. Por exemplo, um ou mais floculantes podem ser adicionados antes do primeiro processo de separação como conhecido na técnica. O tipo e a quantidade dos floculantes são selecionados com base nas propriedades do caldo de fermentação específico selecionado e serão tipicamente determinados usando experimentação de direcionamento simples. Isto é conhecido na técnica e a seleção do tipo e quantidade de um ou mais floculantes para facilitar a separação está completamente dentro das habilidades do perito na especialidade. Por exemplo, os métodos divulgados no documento WO 2004/001054 podem ser usados de acordo com a presente invenção. Etapa de solubilização.

[0077] A etapa de solubilização onde o produto desejado na segunda fase é solubilizado pode ser realizada em qualquer método conhecido para solubilizar produtos sólidos, tipicamente envolvendo diluição com água ou um meio aquoso, adicionando produtos químicos que melhoram a solubilização e/ou ajustando o pH.

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21/45 [0078] A técnica anterior descreve métodos para solubilização de proteínas, em particular proteínas na forma sólida, por exemplo no documento EP 2125865; US 3,316,240 e WO 93/13125 e estes métodos são também utilizáveis de acordo com a presente invenção.

[0079] Em uma modalidade, a etapa de solubilização é realizada por diluição da segunda fase com água ou um meio aquoso, opcionalmente adicionando um químico que promove a solubilização e reduzindo o pH.

[0080] Nesta modalidade, a solubilização pode ser feita por diluição da segunda fase compreendendo o produto desejado na forma sólida 100-2000% (p/p) com base na quantidade da segunda fase, ajustando o pH a um valor de pH abaixo de 6,0, tal como abaixo 5,5, tal como abaixo de 5,0, tal como abaixo de 4,5; adicionando um químico promotor de solubilização e mistura, em que o produto desejado é solubilizado. A segunda fase compreendendo o produto desejado na forma sólida é diluída a 100-2000% (p/p), preferencialmente a 100-1500% (p/p), mais preferencialmente a 100-1000% (p/p) e mais preferencialmente a 200-700% (p/p).

[0081] O químico promovendo a solubilização pode ser qualquer químico promovendo o processo de solubilização, por exemplo, um sal divalente, isto é, qualquer sal compreendendo um íon metálico divalente e solúvel na fase de lama; tipicamente, um sal de Cálcio, Magnésio, sal Férrico, de Zinco compreendendo um ânion selecionado entre fosfates, sulfato, nitrato, acetato, cloreto. Os sais de cálcio ou magnésio são preferidos. O produto químico promotor da solubilização pode ser adicionado a uma concentração de 0,01 -5% (p/p) com base na segunda fase diluída, preferencialmente 0,01 1% (p/p), mais preferencialmente na gama de 0,1-0,5% (p/p).

[0082] O meio de diluição será tipicamente água ou um meio aquoso, tal como um ultrafiltrado permeado ou um condensado de uma etapa de evaporação reciclada de outro processo realizado no mesmo local, tal como em uma etapa subsequente no processo de recuperação do produto.

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22/45 [0083] O pH do caldo de fermentação é nesta modalidade ajustado a um valor de pH abaixo de pH 6,0, preferencialmente abaixo de pH 5,5, em particular a um valor de pH abaixo de 5,0. O ajuste do pH pode ser feito antes, simultaneamente ou após a adição do sal divalente. O pH pode ser ajustado para um valor de pH entre 2,0 e 5,5; preferencialmente para um valor de pH entre 2,0 e 5,0; mais preferencialmente, para um valor de pH entre 3,0 e 5,0 e, em particular para um valor de pH entre 4,0 e 5,0. Deve notar-se que as etapas do processo da etapa de solubilização, a diluição e a adição de um sal divalente e o ajuste do pH podem ocorrer simultaneamente ou em qualquer ordem. Depois de adicionar o sal divalente e ajustar o pH, ocorrerá uma mistura. O tempo de mistura irá depender da temperatura escolhida e da morfologia do cristal e/ou estrutura da proteína em questão. Mais de 80% dos cristais e/ou precipitado e/ou produto desejado ligado a massa celular/insolúveis podem ser solubilizados de acordo com a presente invenção; preferencialmente mais de 85%; mais preferencialmente, mais de 90% e, em particular, mais de 95% dos cristais e/ou precipitado e/ou produto desejado ligado a massa celular/insolúveis podem ser solubilizados.

[0084] Em outra modalidade, a solubilização do produto desejado na segunda fase pode ser feita por diluição da segunda fase com água ou uma solução aquosa e ajustando o pH a um valor de pH elevado, preferencialmente a um valor de pH na gama de 9,5 a 13, como a gama de 10 a

13.

[0085] Ainda em outra modalidade, a solubilização ou o produto desejado na segunda fase é realizada por adição de uma solubilização melhorada por químicos do produto desejado. A solubilização melhorada por químicos é preferencialmente um poliol tal como um polietilenoglicol de baixo peso molecular, e os álcoois C2 a Ce tendo pelo menos dois grupos OH, preferencialmente com apenas dois grupos OH; especialmente preferidos são

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23/45 os polióis onde dois grupos OH estão presentes nos átomos de carbono adjacentes na cadeia e o álcool C2-C8 é alifático e tem uma cadeia de carbono linear. Os polióis preferidos incluem etilenoglicol, propilenoglicol, monopropilenoglicol, glicerol, os polietilenoglicóis de baixo peso molecular (cerca de 900 ou menos) e as suas misturas.

[0086] Em algumas modalidades, um tempo de residência prolongado é inserido depois de todos os ingredientes e ajustes terem sido adicionados de modo a permitir que ocorra a dissolução do produto desejado. Como outros processos químicos, a solubilização do produto desejado leva tempo e um período de residência pode ser benéfico para permitir que mais produto se dissolva. Em princípio, 0 tempo de residência pode ser prolongado até todo 0 produto desejado estar dissolvido, mas muitas vezes 0 produto solúvel é mais susceptível à degradação, por exemplo por proteases do caldo de fermentação em comparação com 0 produto precipitado, assim, na prática, 0 perito com frequência selecionará um tempo de residência relativamente curto para obter tanto quanto produto desejado em solução, mas evitando uma degradação excessiva do produto solúvel.

[0087] A residência pode tipicamente ser de até 12 horas, tal como na gama de 0-500 minutos, preferencialmente na gama de 15-300 minutos, mais preferido na gama de 30-90 minutos.

[0088] Após a etapa de solubilização, 0 produto desejado pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica, tais como etapas adicionais de separação, remoção de células e detritos celulares e outros sólidos da mistura, concentração, formulação, secagem, tal como secagem por pulverização, granulação, etc.

[0089] Em algumas aplicações, a mistura é submetida a uma etapa de lise após a etapa de solubilização, tal como 0 tratamento com um agente de lise químico, tal como uma enzima de degradação da parede celular, por exemplo, lisozima. Os métodos de lise preferidos incluem a adição

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24/45 de lisozima ou enzimas de hidrólise para solubilizar material em suspensão como células ou matérias-primas de fermentação residual.

[0090] O processo particular selecionado será determinado por vários fatores diferentes, tal como o uso pretendido do produto desejado, equipamento disponível e a quantidade de células e fragmentos celulares na segunda fase.

Segunda etapa de preparação [0091] Em uma modalidade preferida, o método da invenção compreende adicionalmente uma segunda etapa de separação removendo as células e detritos celulares da mistura compreendendo o produto desejado solubilizado.

[0092] Após a etapa de solubilização, a mistura é submetida à segunda etapa de separação, que é basicamente um processo de separação sólido/líquido que remove os sólidos, tais como células, detritos celulares e sólidos provenientes do substrato; da fração líquida compreendendo o produto desejado solubilizado. A segunda separação pode ser realizada usando qualquer equipamento e métodos conhecidos na técnica para separações sólido/líquido, tais como centrífugas, decantadores, filtração, etc.

[0093] Dependendo da tecnologia de separação selecionada usada na primeira etapa de separação, pode ser benéfico adicionar um ou mais produtos químicos para auxiliar a separação antes da separação. Por exemplo, um ou mais floculantes podem ser adicionados antes do primeiro processo de separação como conhecido na técnica. O tipo e a quantidade dos floculantes são selecionados com base nas propriedades do caldo de fermentação específico selecionado e serão tipicamente determinados usando experimentação de direcionamento simples. Isto é conhecido na técnica e a seleção do tipo e quantidade de um ou mais floculantes para facilitar a separação está completamente dentro das habilidades do perito na especialidade.

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25/45 [0094] Em uma modalidade preferida, parte ou toda a primeira fase da primeira separação é misturada com a mistura proveniente da etapa de solubilização. Deste modo, os dois fluxos são combinados e o produto desejado, a parte que estava em solução no caldo de fermentação e, consequentemente, contido na primeira fase da primeira etapa de separação, e a parte que foi precipitada no caldo de fermentação e consequentemente terminada na segunda fase da primeira etapa de separação, pode ser ainda mais purificado e processado em conjunto em operações posteriores a jusante.

[0095] Isto é particularmente benéfico para fermentações onde a primeira fase compreende uma quantidade significativa do produto desejado em solução. Misturando a primeira fase com a segunda fase solubilizada antes ou depois da segunda etapa de separação permitirá ao perito recuperar todo o produto desejado, a parte presente na forma sólida na segunda fase e a parte presente na solução na primeira fase, juntas em processos a jusante.

[0096] A mistura da primeira fase da primeira etapa de separação e o fluxo da etapa de solubilização compreendendo o produto desejado solubilizado pode ocorrer antes ou depois da segunda etapa de separação. Se a primeira separação é realizada de uma maneira onde a primeira fase compreende uma quantidade significativa de células e detritos celulares, é preferível adicionar a primeira fase à segunda fase solubilizada antes da segunda etapa de separação, para que todas as células e fragmentos celulares possam ser removidos na segunda etapa de separação. Se a primeira etapa de separação for realizada de uma maneira que a primeira fase não compreende ou apenas quantidades muito pequenas das células e detritos celulares; por exemplo menos de 1% da quantidade total; a primeira fase pode ser adicionada à segunda fase solubilizada quer antes ou depois da segunda etapa de separação.

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26/45 [0097] O perito apreciará que a temperatura pode influenciar o processo de várias maneiras; a temperatura pode influenciar a cinética de solubilização, por exemplo a solubilização prossegue mais rapidamente a uma temperatura mais alta; a temperatura também pode influenciar a estabilidade do produto desejado, por exemplo pode a estabilidade de um produto desejado diminuir quando a temperatura aumenta. Isso significa que, para um determinado processo de recuperação, o perito terá que otimizar a temperatura para obter o melhor processo de recuperação possível e adicionalmente significa que a temperatura ideal para um produto de fermentação pode não ser ideal para outro produto de fermentação. Tudo isso é do conhecimento do perito e pode ser feito usando experiências típicas de rotina. O processo da invenção é tipicamente realizado a uma temperatura na gama de 0-70 °C, por exemplo na gama de 10-50 °C, geralmente na gama de 1545 °C.

[0098] O método de acordo com a invenção tem o benefício comparado com os processos da técnica anterior, tal como o método divulgado na EP 2 125 865, de que o volume necessário para solubilizar o produto desejado é significativamente inferior. Sem querer ser limitado por qualquer teoria, acredita-se que isto é porque uma parte substancial dos sais presentes durante a fermentação onde a precipitação ocorreu foi removida com a primeira fase e está, portanto, ausente durante o processo de solubilização. Isto tem o benefício de que o consumo de água e/ou produtos químicos aumentando a solubilização é significativamente menor, o que tem um número significativo de benefícios adicionais em operações de escala de produção industrial, adicionalmente ao custo da água e produtos químicos aumentando a solubilização; tal como um volume reduzido de águas residuais que precisam ser tratadas e adicionalmente os custos de capacidade para lidar com grandes volumes, o equipamento para processamento posterior é reduzido

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27/45 porque os volumes que precisam ser tratados são significativamente menores.

[0099] Além disso, a solubilização de um produto precipitado de acordo com a invenção pode também prosseguir mais rapidamente que a solubilização do mesmo produto usando um método de acordo com a técnica anterior, dando a vantagem de um maior rendimento usando o método de acordo com a invenção e consequentemente uma menor exigência para capacidade de retenção.

Operações subsequentes a jusante [0100] O produto desejado resultante pode ser adicionalmente isolado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o produto desejado pode ser recuperado por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitado a, filtração adicional, por exemplo, para remover quaisquer germes; ultrafiltração e microfiltração, centrifugação, extração, secagem por pulverização, evaporação, precipitação ou cristalização, hidrólise (por exemplo, lisozima ou outra) ou outra degradação mecânica em suspensão.

MODALIDADES PREFERENCIAIS [0101] A invenção pode ser também descrita pelas seguintes modalidades:

[0102] Modalidade 1: Um método para recuperar um produto desejado de um caldo de fermentação, onde o produto desejado está presente na forma de precipitado no caldo de fermentação, compreendendo o método as etapas de:

a) uma primeira etapa de separação que separa o caldo de fermentação em uma primeira fase e uma segunda fase, em que a primeira fase compreende sobrenadante, produto desejado na forma solúvel e, opcionalmente, células e detritos celulares, e a segunda fase compreende o produto desejado na forma de precipitado, células e detritos celulares; e

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b) uma etapa de solubilização onde o produto desejado na forma precipitada na segunda fase é solubilizado.

[0103] Modalidade 2. O método de acordo com a modalidade 1, compreendendo adicionalmente uma segunda etapa de separação onde o produto desejado solubilizado da etapa b) é separado das células e/ou detritos celulares.

[0104] Modalidade 3. O método de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a primeira fase compreende pelo menos 60% da parte líquida do caldo de fermentação, por exemplo pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, por exemplo pelo menos 90% do caldo de fermentação.

[0105] Modalidade 4. O método de acordo com qualquer das modalidades 1 a 3, em que a segunda fração compreende pelo menos 60% do produto desejado sob a forma sólida, preferencialmente pelo menos 65%, por exemplo pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 75%, por exemplo pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, e por exemplo pelo menos 99%.

[0106] Modalidade 5. O método de acordo com qualquer das modalidades 1 a 4, em que o produto desejado é selecionado entre os metabolites primários, secundários metabolites, proteínas, vitaminas, hormonas e carboidratos.

[0107] Modalidade 6. O método de acordo com a modalidade 5, em que o produto desejado compreende uma ou mais enzimas.

[0108] Modalidade 7. O método de acordo com a modalidade 6, em que a uma ou mais enzimas são selecionadas do grupo de classes de enzima consistindo em oxirredutases (EC 1), transferases (EC 2), hidrolases (EC 3), liases (EC 4), isomerases (EC 5) e ligases (EC 6).

[0109] Modalidade 8. O método, de acordo com a modalidade 7, em que a uma ou mais enzimas é/são selecionada(s) do grupo de atividades

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29/45 enzimáticas consistindo em aminopeptidase, amilase, amiloglicosidase, mananase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, glicosiltransferase ciclodextrina, desoxirribonuclease, esterase, galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, glicose oxidase, glicosidase, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, liase, manosidase, oxidase, pectinase, peroxidase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, protease, ribonuclease, transferase, transglutaminase, lisozima, muramidase ou xilanase.

[0110] Modalidade 9. O método de acordo com a modalidade 8, em que a uma ou mais enzimas são selecionadas entre proteases.

[0111] Modalidade 10. O método de acordo com a modalidade

9, em que as proteases são selecionadas entre subtilisinas.

[0112] Modalidade 11.0 método de acordo com a modalidade

10, em que as proteases são selecionadas entre proteases tendo pelo menos 80% de identidade de sequência, tal como pelo menos 85% de identidade de sequência, tal como pelo menos 95% de identidade de sequência, tal como pelo menos 96% de identidade de sequência, tal como pelo menos 97% de identidade de sequência, tal como pelo menos 98% de identidade de sequência, tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NO: 1- 6.

[0113] Modalidade 12. O método de acordo com a modalidade

11, em que a protease é uma variante de uma das proteases tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-6 e variantes de uma destas com alterações, tais como substituições, inserções ou deleções de aminoácidos, em posições de aminoácidos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0114] Modalidade 13. O método de acordo com a modalidade 8, em que a uma ou mais enzimas são selecionadas entre amilases.

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30/45 [0115] Modalidade 14. O método de acordo com a modalidade

13, em que as amilases são selecionadas entre alfa-amilases tendo pelo menos 80% de identidade de sequência, tal como pelo menos 85% de identidade de sequência, tal como pelo menos 95% de identidade de sequência, tal como pelo menos 96% de identidade de sequência, tal como pelo menos 97% de identidade de sequência, tal como pelo menos 98% de identidade de sequência, tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NO: 7-9.

[0116] Modalidade 15. O método de acordo com a modalidade

14, em que a alfa-amilase é uma variante de um dos polipeptideos tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7-9 e variantes de uma destas com alterações, tais como substituições, inserções ou deleções de aminoácidos, em posições de aminoácidos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0117] Modalidade 16. O método de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o produto desejado é obtido de um microrganismo.

[0118] Modalidade 17 O método de acordo com a modalidade

16, em que o microrganismo é um procarioto ou um eucarioto.

[0119] Modalidade 18. O método de acordo com a modalidade

17, em que o microrganismo é um procarioto selecionado entre Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[0120] Modalidade 19. O método de acordo com a modalidade

18, em que o microrganismo é uma célula de Bacillus selecionada entre: Bacillus alkalophilus, Bacillus altitudinis, Bacillus amyloliquefaciens, células de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus

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31/45 lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[0121] Modalidade 20. O método de acordo com a modalidade 17, em que o microrganismo é um eucarioto selecionado entre células de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[0122] Modalidade 21. O método de acordo com a modalidade 20, em que o microrganismo é selecionado entre: células de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium

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32/45 sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[0123] Modalidade 22. O método de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o caldo de fermentação foi fermentado em um fermentador com um volume de pelo menos 50 litros, tal como pelo menos 500 litros, tal como pelo menos 5.000 litros, tal como pelo menos 50.000 litros.

[0124] Modalidade 23. O método de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a primeira etapa de separação é realizada usando centrifugação ou filtração.

[0125] Modalidade 24. O método de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a etapa de solubilização compreende:

i. Diluir a segunda fase a 100-2000% (p/p) em água ou em um meio aquoso;

ii. adicionar um sal divalente; e iii. ajustar o pH para um valor de pH abaixo de 6,0.

[0126] Modalidade 25. O método de acordo com a modalidade 24, em que a segunda fase é diluída a 100-2000% (p/p), preferencialmente a 100-1500% (p/p), preferencialmente a 100-1000% (p/p) e mais preferencialmente a 200-700% (p/p).

[0127] Modalidade 26. O método de acordo com a modalidade 24 ou 25, em que a segunda fase é diluída com água, água da torneira, um ultrafiltrado permeado ou um condensado de uma etapa de evaporação.

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33/45 [0128] Modalidade 27. O método de acordo com qualquer das modalidades 24 a 26, em que o sal divalente é selecionado entre sais de Cálcio, Magnésio, Ferro e Zinco compreendendo um ânion selecionado entre fosfatos, sulfato, nitrato, acetato e cloreto.

[0129] Modalidade 28. O método de acordo com qualquer das modalidades 24 a 27, em que o sal bivalente é adicionado em uma quantidade de 0,01-5% (p/p) com base na segunda fase diluída, preferencialmente 0,01-1% (p/p) mais preferencialmente na gama de 0,1-0,5% (p/p).

[0130] Modalidade 29. O método de acordo com qualquer das modalidades 24 a 28, em que o pH é ajustado para um valor de pH abaixo de um valor de pH abaixo de pH 6,0, preferencialmente abaixo de pH 5,5, em particular para um valor de pH abaixo de 5,0. O ajuste do pH pode ser feito antes, simultaneamente ou após a adição do sal divalente. O pH pode ser ajustado para um valor de pH entre 2,0 e 5,5; preferencialmente para um valor de pH entre 2,0 e 5,0; mais preferencialmente, para um valor de pH entre 3,0 e 5,0 e, em particular para um valor de pH entre 4,0 e 5,0.

[0131] Modalidade 30. O método de acordo com qualquer das modalidades 1 a 23, em que a etapa de solubilização é feita por diluição da segunda fase com água ou uma solução aquosa e ajustando o pH para um valor de pH acima de 9,5, tal como a um valor de pH na gama de 9,5 a 13, por exemplo para um valor de pH no intervalo de 10 a 13.

[0132] Modalidade 31. O método de acordo com qualquer das modalidades 1 a 23, em que a etapa de solubilização é feita por adição de um produto químico que melhora a solubilização do produto desejado.

[0133] Modalidade 32. O método de acordo com a modalidade 31, em que o químico que melhora a solubilização do produto desejado é um poliol tal como um polietilenoglicol de baixo peso molecular ou os álcoois C2 a Ce tendo pelo menos dois grupos OH, preferencialmente com apenas dois grupos OH; especialmente preferidos são os polióis onde dois grupos OH

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34/45 estão presentes nos átomos de carbono adjacentes na cadeia e o álcool C2Ce é alifático e tem uma cadeia de carbono linear.

[0134] Modalidade 33. O método da modalidade 32, em que a solubilização melhorada por químicos do produto desejado é selecionada entre etilenoglicol, propilenoglicol, monopropileno, glicerol, polietilenoglicol com um peso molecular inferior a 900 Da e suas misturas.

[0135] Modalidade 34. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 33, onde a primeira etapa de separação é realizada por centrifugação ou filtração.

[0136] Modalidade 35. O método de acordo com a modalidade 34, em que a etapa de separação é realizada por filtração usando um filtro de Tambor.

[0137] Modalidade 36. O método de acordo com a modalidade 34, em que a separação é realizada por centrifugação usando uma centrífuga contínua, um decantador centrífugo, etc.

[0138] Modalidade 37. O método de acordo com qualquer das modalidades 34 a 36, onde um floculante é adicionado antes da separação.

[0139] Modalidade 38. O método de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, onde a primeira fase da primeira etapa de separação é parcialmente ou completamente adicionada à segunda fase solubilizada.

[0140] Modalidade 39. O método de acordo com a modalidade 38, onde a primeira fase da primeira etapa de separação é parcialmente ou completamente adicionada à corrente solubilizada da etapa b) antes da segunda etapa de separação.

[0141] Modalidade 40. O método de acordo com qualquer das modalidades anteriores, compreendendo uma etapa de pré-tratamento antes da primeira etapa de separação selecionada entre: diluição; ajuste do pH

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35/45 e/ou temperatura, adição de um ou mais estabilizadores, adição de um ou mais inibidores de protease.

[0142] Modalidade 41. O método de acordo com qualquer das modalidades anteriores, compreendendo uma ou mais das operações a jusante depois da segunda etapa de separação, selecionadas entre: ultrafiltração, evaporação, concentração, estabilização, cristalização, secagem por pulverização e granulação.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos [0143] Caldos de fermentação para os exemplos abaixo foram fornecidos pela Novozymes A/S, Kalundborg, Dinamarca. Os caldos de fermentação foram preparados por inoculação de uma cepa de Bacillus licheniformis transformada com um gene que codifica a protease desejada operacionalmente ligada a um promotor e sequências reguladoras para expressar o referido gene; em um fermentador industrial em um processo de fermentação descontínuo alimentado. O processo de fermentação foi terminado na concentração do produto desejado e o produto desejado estava presente na forma precipitada naquele momento. Por inspeção visual usando um microscópio pode-se ver claramente que o caldo de fermentação compreende material cristalino em adição a outros sólidos incluindo células e detritos celulares.

[0144] Nos exemplos abaixo, a quantidade de produto solubilizado é definida como a razão do produto detectado no sobrenadante de uma amostra que foi submetida a uma Força Centrífuga Relativa de 2333 durante 5 minutos, e a quantidade de produto detectada em uma amostra não centrifugada.

[0145] A dissolução completa é definida como ocorrendo quando a concentração do produto sobrenadante está dentro da incerteza de medição da concentração medida em uma amostra não centrifugada. Esse valor

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36/45 pode ser medido diretamente ou calculado por extrapolação de várias medições.

[0146] O nível de diluição do caldo de fermentação nos exemplos dados é usado para reduzir a concentração de componentes que são prejudiciais para a solubilidade. O critério para o nível de diluição usado nesses exemplos é que ele é alto o suficiente para solubilizar todo o produto, mas não em excesso, para minimizar o uso de água e os volumes do processo.

[0147] O tempo de residência para a dissolução dado nestes exemplos é definido por conveniência de processo ou experimental e não assegura necessariamente a dissolução completa.

Exemplo 1 - Recuperação de Savinase [0148] Um caldo de fermentação de uma fermentação industrial produzindo a protease tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (Savinase) foi usado neste exemplo.

A - Recuperação de acordo com o estado da técnica [0149] O caldo de fermentação possuindo o produto enzimático cristalizado foi diluído 10 vezes com água (9 L de água adicionada por kg de caldo de fermentação). Foi adicionado Poli Cloreto de Alumínio e CaCk a 34% (p/p) (25 ml_ e 70 ml_ por kg de caldo de fermentação respectivamente) e o pH da solução foi ajustado a pH 4,2-4,6 usando ácido acético. A mistura recebeu um tempo de residência de 90 minutos a 41 °C, pelo que mais de 80% dos cristais produto foram dissolvidos. O volume total foi um pouco mais de 10 vezes o volume inicial do caldo de fermentação.

[0150] Esta solução foi então processada por um método padrão de separação primária: floculação por polímeros catiônicos e aniônicos e centrifugação para separar os sólidos do líquido contendo o produto dissolvido.

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37/45 [0151 ] A parte líquida foi então processada adicionalmente a jusante em uma série de etapas para a purificação do produto final de acordo com as especificações da empresa.

B - Recuperação de acordo com a invenção [0152] O caldo de fermentação contendo o produto enzimático cristalizado foi diluído 3 vezes com água (2 kg de água adicionada por kg de caldo de fermentação) e separado de acordo com a invenção por centrifugação em uma primeira fase (fase líquida) contendo algumas células e detritos e uma segunda fase (pasta fluida) contendo quase toda a enzima cristalizada e algumas células e detritos. A separação foi realizada usando uma centrífuga projetada sob medida de acordo com o descrito em US 8889395B2. A primeira e a segunda fases foram coletadas separadamente. Aproximadamente 0,75 kg da segunda fase e 2,25 kg da primeira fase foram produzidos por kg de caldo de fermentação.

[0153] A segunda fase contendo quase todo o produto cristalizado foi então diluída 12-13 vezes (11-12 kg de água por kg de segunda fase). Foi adicionado Poli Cloreto de Alumínio e CaCk a 34% (p/p) (2,3 ml_ e 23 ml_ por kg de segunda fase respectivamente) e a solução foi ajustada para pH a pH 4,2-4,6 usando ácido acético. A mistura recebeu um tempo de residência de 90 minutos a 41 °C, pelo que mais de 80% dos cristais foram dissolvidos.

[0154] A primeira fase da primeira separação foi então adicionada à segunda fase diluída e solubilizada, terminando com um volume total de apenas um pouco mais de 8 vezes o volume inicial do caldo de cultura. Isto demonstra claramente o consumo de água e volumes de processo reduzidos usando o método de acordo com a invenção.

[0155] Esta solução foi então processada por um método padrão de separação primária: floculação por polímeros catiônicos e aniônicos e

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38/45 centrifugação para separar os sólidos do líquido contendo o produto dissolvido.

[0156] A parte líquida foi então processada adicionalmente a jusante em uma série de etapas para a purificação do produto final de acordo com as especificações da empresa.

Exemplo 2 - Variante de Savinase [0157] Um caldo de fermentação de uma fermentação industrial produzindo uma variante do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 com as substituições: Y176A +R170S+A194P foi usado neste exemplo. O produto precipitou e os cristais eram abundantes no caldo de fermentação.

A - Recuperação de acordo com o estado da técnica.

[0158] O caldo de fermentação possuindo a enzima cristalizada foi diluído 14 vezes com água (13 kg de água adicionada por kg de caldo de fermentação). Foi adicionado Poli Cloreto de Alumínio e CaCk a 34% (p/p) (25 mL e 80 mL por kg de caldo de fermentação respectivamente) e a solução foi ajustada para pH a pH 4,2-4,6 usando ácido acético. A mistura recebeu um tempo de residência de 90 minutos a 42 °C, pelo que mais de 70% dos cristais produto foram dissolvidos. O volume total foi um pouco mais de 14 vezes o volume inicial do caldo de fermentação.

[0159] Esta solução foi então processada por um método padrão de separação primária: floculação por polímeros catiônicos e aniônicos e centrifugação para separar os sólidos do líquido contendo o produto dissolvido.

[0160] A parte líquida foi então processada adicionalmente a jusante em uma série de etapas para a purificação do produto final de acordo com as especificações da empresa.

B - Recuperação de acordo com a invenção.

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39/45 [0161] O caldo de fermentação contendo o produto enzimático cristalizado foi diluído 3 vezes com água (2 kg de água adicionada por kg de caldo de fermentação) e separado de acordo com a invenção por centrifugação em uma primeira fase (fase líquida) contendo algumas células e detritos e uma segunda fase (pasta fluida) contendo quase toda a enzima cristalizada e algumas células e detritos. A separação foi realizada usando uma centrífuga projetada sob medida de acordo com o descrito em US 8889395B2. Aproximadamente 0,5 kg da segunda fase e 2 kg da primeira fase foram produzidos por kg de caldo de fermentação.

[0162] A segunda fase contendo quase todo o produto cristalizado foi então diluída 14 vezes (13 kg de água por kg de segunda fase). Foi adicionado Poli Cloreto de Alumínio e CaCI2 a 34% (p/p) (11,4 ml_ e 11 ml_ por kg de segunda fase) e a solução foi ajustada para pH a pH 4,2-4,6 usando ácido acético. A mistura recebeu um tempo de residência de 90 minutos a 42 oC, pelo que mais de 70% dos cristais foram dissolvidos.

[0163] O volume total foi apenas um pouco mais de 7 vezes o volume inicial do caldo de cultura e demonstra claramente o consumo de água e volumes de processo reduzidos usando o método de acordo com a invenção.

[0164] Esta solução foi então processada por um método padrão de separação primária: floculação por polímeros catiônicos e aniônicos e centrifugação para separar os sólidos do líquido contendo o produto dissolvido.

[0165] A parte líquida foi então processada adicionalmente a jusante em uma série de etapas para a purificação do produto final de acordo com as especificações da empresa.

Exemplo 3 - Recuperação de Savinase através de filtração em tambor.

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40/45 [0166] Um caldo de fermentação de uma fermentação industrial produzindo a protease tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (Savinase) foi usado neste exemplo.

A - recuperação de acordo com o estado da técnica [0167] Neste exemplo, o caldo de fermentação contendo produto enzimático cristalizado foi diluído 10 vezes com água da torneira (9 kg de água adicionada por kg de caldo de fermentação) e depois ajustado com 60 mL de solução de CaCÍ2 a 34% (p/p) e 50 mL de Poli Cloreto de Alumínio por kg caldo de fermentação. O pH foi ajustado para pH 4,5 usando ácido acético. A mistura recebeu um tempo de residência de 90 minutos a 42 °C, pelo que mais de 80% dos cristais foram dissolvidos. O volume total foi um pouco mais de 10 vezes o volume inicial do caldo de fermentação.

B - recuperação de acordo com a invenção [0168] O caldo de fermentação contendo produto enzimático cristalizado foi diluído 3 vezes com água da torneira (2 kg de água adicionada por kg de caldo de fermentação) e depois ajustado com 20,0 mL de Poli Cloreto de Alumínio por kg de caldo de fermentação e o pH foi ajustado para pH

4,5 usando ácido acético. Foram adicionados 200 mL de polímero policatiônico por kg de caldo fermentado para auxiliar a separação por filtração em tambor em uma primeira fase contendo material solubilizado e uma segunda fase contendo toda a enzima cristalizada, células e detritos. A primeira e a segunda fases foram coletadas em tanque de retenção separado. Aproximadamente 1 kg da segunda fase e 2 kg da primeira fase foram produzidos por kg de caldo de fermentação.

[0169] A segunda fase contendo quase todo o produto cristalizado, células e detritos celulares foi então diluída 3 vezes com água da torneira (2 kg de água por kg de segunda fase). Uma solução de CaCk (34 % (p/p)) foi adicionada (18 mL por kg de segunda fase) e o pH foi ajustado para

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41/45 pH 4,5 usando ácido acético. A mistura foi deixada em repouso durante 60 minutos, pelo que mais de 80% dos cristais foram dissolvidos.

[0170] A primeira fase da primeira separação foi então adicionada à segunda fase diluída e solubilizada, terminando com um volume total de pouco mais de 5 vezes o volume inicial do caldo de fermentação e demonstrando claramente o consumo reduzido de água e volumes de processo usando o método de acordo com a invenção.

Exemplo 4 - Recuperação de amilase por centrifugação.

[0171] Um caldo de fermentação de uma fermentação industrial produzindo uma variante de amilase preparada no Exemplo 8 de WO 2001/066721 foi usado neste exemplo.

A - recuperação de acordo com o estado da técnica [0172] Neste exemplo, o caldo de fermentação contendo produto enzimático cristalizado foi diluído 20 vezes com água da torneira (19 kg de água adicionada por kg de caldo de fermentação) e depois ajustado com 95 mL de solução de CaCk a 34% (p/p) e 30 mL de Poli Cloreto de Alumínio por kg caldo de fermentação. O pH foi ajustado para pH 5,0 usando ácido acético. A mistura recebeu um tempo de residência de 20 minutos a 50 °C, pelo que mais de 85% dos cristais foram dissolvidos. O volume total foi um pouco mais de 20 vezes o volume inicial do caldo de fermentação.

B - recuperação de acordo com a invenção [0173] O caldo de fermentação contendo o produto enzimático cristalizado foi centrifugado durante 5 min a 2666 RCF. A metade superior do volume contendo biomassa e menos de 5% do produto enzimático foi removido e descartado. A fração inferior remanescente contendo mais de 95% do produto enzimático foi diluída 30 vezes com água da torneira (o equivalente a 29 kg de água adicionada por kg de fração inferior) e depois ajustada com 70 mL de solução de CaCk a 34% (p/p) e 30,0 mL de Poli Cloreto de Alumínio por kg de caldo de fermentação e o pH foi ajustado para pH 5,0

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42/45 usando ácido acético. A mistura recebeu um tempo de residência de 20 minutos a 50 °C, pelo que mais de 90% dos cristais foram dissolvidos. O volume total foi um pouco mais de 15 vezes o volume inicial do caldo de fermentação, demonstrando claramente o consumo de água e volumes de processo reduzidos usando o método de acordo com a invenção.

Exemplo 5 - Recuperação de Muramidase à base de fungos [0174] Caldos de fermentação para este exemplo foram fornecidos pela Instalação piloto, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca. O caldo de fermentação foi preparado inoculando uma cepa fúngica ((Trichoderma reesei) transformada com um gene que codifica a muramidase (SEQ ID NO: 4 em WO 2013/076253) operacionalmente ligado a um promotor e sequências reguladoras para expressar o referido gene; em um fermentador grande em escala piloto em um processo de fermentação descontínuo alimentado. Por inspeção visual usando um microscópio pode-se ver claramente que o caldo de fermentação compreende material cristalino em adição a outros sólidos incluindo células e detritos celulares.

[0175] A quantidade de produto solubilizado é neste exemplo definida como a razão do produto detectado no sobrenadante de uma amostra que foi submetida a uma Força Centrífuga Relativa de 2333 durante 5 minutos, e a quantidade de produto detectada em uma amostra não centrifugada.

[0176] A dissolução completa é definida como ocorrendo quando a concentração do produto sobrenadante está dentro da incerteza de medição da concentração medida em uma amostra não centrifugada. Esse valor pode ser medido diretamente ou calculado por extrapolação de várias medições.

[0177] O nível de diluição do caldo de fermentação nos exemplos dados é usado para reduzir a concentração de componentes que são prejudiciais para a solubilidade. O critério para o nível de diluição usado nesses exemplos é que ele é alto o suficiente para solubilizar todo o produto,

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43/45 mas não em excesso, para minimizar o uso de água e os volumes do processo.

[0178] O tempo de residência para a dissolução dado nestes exemplos é definido por conveniência de processo ou experimental e não assegura necessariamente a dissolução completa.

A - Recuperação de acordo com o estado da técnica [0179] O caldo de fermentação possuindo a enzima cristalizada foi diluído 7 vezes com água do processo (6 kg de água adicionada por kg de caldo de fermentação). Foi adicionado Poli Cloreto de Alumínio (15 mL por kg de caldo de fermentação) e a solução foi ajustada para pH usando ácido fosfórico. A mistura recebeu um tempo de residência de 120 minutos a 25 oC, pelo que mais de 75% dos cristais produto foram dissolvidos. O volume total foi um pouco mais de 7 vezes o volume inicial do caldo de fermentação.

[0180] Esta solução foi então processada por um método padrão de separação primária: floculação por polímeros catiônicos e aniônicos e centrifugação para separar os sólidos do líquido contendo o produto dissolvido.

[0181 ] A parte líquida foi então processada adicionalmente a jusante em uma série de etapas para a purificação do produto final de acordo com as especificações da empresa.

B - recuperação de acordo com a invenção [0182] O caldo de fermentação contendo o produto enzimático cristalizado foi diluído 2,5 vezes com água do processo (1,5 kg de água adicionada por kg de caldo de fermentação) e separado de acordo com a invenção por centrifugação em uma primeira fase (fase líquida) contendo algumas células e detritos e uma segunda fase (pasta fluida) contendo quase toda a enzima cristalizada e algumas células e detritos. A separação foi realizada usando uma centrífuga automática SB7 (Westfalia). A primeira e a segunda

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44/45 fases foram coletadas separadamente. Aproximadamente 0,55 kg da segunda fase e 1,95 kg da primeira fase foram produzidos por kg de caldo de fermentação.

[0183] A segunda fase contendo quase todo o produto cristalizado foi então tratada exatamente pelo mesmo método que o caldo de cultura normal; diluída 7 vezes (6 kg de água do processo por kg de segunda fase). Foi adicionado Poli Cloreto de Alumínio (15 ml_ por kg de segunda fase) e a solução foi ajustada para pH usando ácido fosfórico. Esta mistura recebeu apenas um tempo de residência de 60 minutos a 25 oC, pelo que mais de 85% dos cristais foram dissolvidos.

[0184] A primeira fase da primeira separação foi então adicionada à segunda fase diluída e solubilizada, terminando com um volume total de aproximadamente 6 vezes o volume inicial do caldo de cultura. Isto demonstra um consumo reduzido de água e volumes de processo, bem como um tempo de dissolução mais curto (maior rendimento do produto dissolvido) usando o método de acordo com a invenção.

[0185] Esta solução foi então processada por um método padrão de separação primária: floculação por polímeros catiônicos e aniônicos e centrifugação para separar os sólidos do líquido contendo o produto dissolvido.

[0186] A parte líquida foi então processada adicionalmente a jusante em uma série de etapas para a purificação do produto final de acordo com as especificações da empresa.

[0187] As curvas de dissolução para o caldo de cultura (CB) de acordo com a parte A e a pasta fluida encontrada na segunda fase de acordo com a parte B são mostrados na figura 1, e mostrado claramente que a dissolução prosseguiu mais rapidamente usando o método de acordo com a presente invenção, em comparação com o método tradicional. A figura também mostra que uma dissolução mais elevada foi obtida após 60 minutos de

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45/45 acordo com a invenção comparada com após 120 minutos usando o procedimento da técnica anterior.

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para recuperar um produto desejado de um caldo de fermentação, onde o produto desejado está presente na forma de precipitado no caldo de fermentação, o método compreendendo as etapas de:

   a) uma primeira etapa de separação que separa o caldo de fermentação em uma primeira fase e uma segunda fase, em que a primeira fase compreende sobrenadante, o produto desejado na forma solúvel e, opcionalmente, células e detritos celulares, e a segunda fase compreende o produto desejado na forma de precipitado, células e detritos celulares; e

   b) uma etapa de solubilização onde o produto desejado na forma precipitada na segunda fase é solubilizado.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente uma segunda etapa de separação onde o produto desejado solubilizado da etapa b) é separado das células e/ou detritos celulares.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a primeira fase compreende pelo menos 60% da parte líquida do caldo de fermentação, por exemplo pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 80% do caldo de fermentação.
4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1,2 ou 3, em que a segunda fração compreende pelo menos 60% do produto desejado sob a forma sólida, preferencialmente pelo menos 65%, por exemplo pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 75%, por exemplo pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85% e por exemplo pelo menos 99% do produto desejado sob a forma sólida.
5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1,2, 3 ou 4, em que o produto desejado compreende uma ou mais enzimas.

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6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que a uma ou mais enzimas é/são selecionada(s) do grupo de atividades enzimáticas consistindo em aminopeptidase, amilase, amiloglicosidase, mananase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, glicosiltransferase ciclodextrina, desoxirribonuclease, esterase, galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, glicose oxidase, glicosidase, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, liase, manosidase, oxidase, pectinase, peroxidase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, protease, ribonuclease, transferase, transglutaminase, lisozima, muramidase ou xilanase.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a uma ou mais enzimas são selecionadas entre proteases tendo pelo menos 80% de identidade de sequência, tal como pelo menos 85% de identidade de sequência, tal como pelo menos 95% de identidade de sequência, tal como pelo menos 96% de identidade de sequência, tal como pelo menos 97% de identidade de sequência, tal como pelo menos 98% de identidade de sequência, tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NO: 1- 6.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a uma ou mais enzimas são selecionadas entre amilases tendo pelo menos 80% de identidade de sequência, tal como pelo menos 85% de identidade de sequência, tal como pelo menos 95% de identidade de sequência, tal como pelo menos 96% de identidade de sequência, tal como pelo menos 97% de identidade de sequência, tal como pelo menos 98% de identidade de sequência, tal como pelo menos 99% de identidade de sequência com uma de SEQ ID NO: 7-9.
9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o produto desejado é obtido de um microrganismo.

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10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que o microrganismo é um procarioto selecionado entre Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que o microrganismo é uma célula de Bacillus selecionada entre: células de Bacillus alkalophilus, Bacillus altitudinis, Bacillus amyloliquefaciens, B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que o microrganismo é um eucarioto selecionado entre células de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que o microrganismo é selecionado entre: células de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus

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    4/6 japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.
14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12 ou 13, em que a primeira etapa de separação é realizada usando centrifugação ou filtração.
15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, em que a etapa de solubilização compreende:

    i. Diluir a segunda fase a 100-2000% (p/p) em água ou em um meio aquoso;

    ii. adicionar um sal divalente; e iii. ajustar o pH para um valor de pH abaixo de 6,0.

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16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a segunda fase é diluída a 100-2000% (p/p), preferencialmente a 100-1500% (p/p), preferencialmente a 100-1000% (p/p) e mais preferencialmente a 200700% (p/p).
17. 17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, em que o sal divalente é selecionado entre sais de Cálcio, Magnésio, Ferro e Zinco compreendendo um ânion selecionado entre fosfates, sulfato, nitrato, acetato e cloreto e é adicionado em uma quantidade de 0,01 - 5% (p/p) com base na segunda fase diluída, preferencialmente 0,01 1% (p/p), mais preferencialmente na gama de 0,1-0,5% (p/p).
18. 18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16 ou 17, em que o pH é ajustado para um valor de pH abaixo de um valor de pH abaixo de pH 6,0, preferencialmente abaixo de pH 5,5, em particular para um valor de pH abaixo de 5,0. O ajuste do pH pode ser feito antes, simultaneamente ou após a adição do sal divalente. O pH pode ser ajustado para um valor de pH entre 2,0 e 5,5; preferencialmente para um valor de pH entre 2,0 e 5,0; mais preferencialmente, para um valor de pH entre 3,0 e 5,0 e em particular para um valor de pH entre 4,0 e 5,0.
19. 19. Método, de acordo qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, em que a etapa de solubilização é feita por diluição da segunda fase com água ou uma solução aquosa e ajustando o pH para um valor de pH acima de 9,5, tal como a um valor de pH na gama de 9,5 a 13, por exemplo para um valor de pH no intervalo de 10 a 13.
20. 20. Método, de acordo qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, em que a etapa de solubilização é feita por adição de um produto químico que melhora a solubilização do produto desejado.

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21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que o químico que melhora a solubilização do produto desejado é um poliol tal como um polietilenoglicol de baixo peso molecular ou os álcoois C2 a Ce tendo pelo menos dois grupos OH, preferencialmente com apenas dois grupos OH; especialmente preferidos são os polióis onde dois grupos OH estão presentes nos átomos de carbono adjacentes na cadeia e 0 álcool C2Ce é alifático e tem uma cadeia de carbono linear.
22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

    1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, onde a primeira fase da primeira etapa de separação é parcialmente ou completamente adicionada à segunda fase solubilizada.
23. 23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, compreendendo uma etapa de pré-tratamento antes da primeira etapa de separação selecionada entre: diluição; ajuste do pH e/ou temperatura, adição de um ou mais estabilizadores, adição de um ou mais inibidores de protease.
24. 24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

    1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 ou 23, compreendendo uma ou mais das operações a jusante depois da segunda etapa de separação, selecionadas entre: ultrafiltração, evaporação, concentração, estabilização, cristalização, secagem por pulverização e granulação.