CN115927223A - 源于杂色云芝菌菌株的漆酶 - Google Patents

Abstract

提供了源于杂色云芝菌菌株的漆酶。本发明涉及多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽。与现有漆酶相比，本发明的多肽表现出更高的苯并[a]芘去除效果。

Description

源于杂色云芝菌菌株的漆酶

技术领域

本发明涉及酶领域，具体涉及一种源于杂色云芝菌(Trametes versicolor)菌株的漆酶。

背景技术

石油污染土地的修复方法包括物理修复法、化学修复法和生物修复法。其中生物修复法是近年来发展较快的一项技术，进入2000年以来相关科研报道快速增长。

生物修复法通过生物(包括植物、动物、微生物)的代谢活动来吸收、转化、降解土壤中的有机污染，其中微生物被认为是自然环境中有机污染物去除的主要途径。进一步的研究发现微生物(包括细菌和真菌)中的氧化还原酶，如漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、细胞色素P450单加氧酶等，具有降解多环芳烃等有机污染物的潜力。与基于生物代谢活动的修复相比，酶法修复具有对pH/温度/有毒物质的更好耐受性，当然也存在着应用成本较高、目标底物范围较窄等缺点。

目前此领域研究基本处于实验室开发验证阶段，主要集中在多环芳烃降解相关新酶(特别是漆酶)的筛选、酶的增效减成本技术开发(酶固定化以提高长效性，利用市政污泥生产漆酶，筛选介体提高酶的应用效果等)及相关机理的研究上，酶在卤代烃类污染物去除领域研究较少。

国内的大学或者科研院所在这一领域研究较多，如Lin,X.G.从枯草芽孢杆菌中克隆获得了具有更高氧化还原电位且对外源铜离子需求较低的漆酶分子(Zeng,J.,et al.,Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons using Bacillus subtilis CotAwith high laccase activity and copper independence.CHEMOSPHERE,2016.148:p.1-7)；Luo,Y M证实真菌来源的漆酶可以快速转化某些多环芳烃，显示出脱毒及土壤修复的潜力(Wu,Y.,et al.,Potential role of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)oxidation by fungal laccase in the remediation of an aged contaminatedsoil.SOIL BIOLOGY&BIOCHEMISTRY,2008.40(3):p.789-796)；此外，国内外的研究团队在微生物或者酶的固定化方面也有比较深入的研究，如使用携带漆酶的静电纺纤维膜用于污水中多环芳烃的去除(Dai,Y.,et al.,Laccase-carrying electrospun fibrousmembrane for the removal of polycyclic aromatic hydrocarbons fromcontaminated water.SEPARATION AND PURIFICATION TECHNOLOGY,2013.104:p.1-8)，锰过氧化物酶的固定化(Acevedo,F.,et al.,Degradation of polycyclic aromatichydrocarbons by free and nanoclay-immobilized manganese peroxidase fromAnthracophyllum discolor.CHEMOSPHERE,2010.80(3):p.271-278)。各种微生物及其复合制剂，如酵母、细菌共培养，细菌、白腐菌共培养等在有机污染物污染土壤修复及相应的酶学研究也比较多(Liu,B.,etal.,Bacteria-white-rot fungi joint remediation ofpetroleum-contaminated soil based on sustained-release of laccase.RSCADVANCES,2017.7(62):p.39075-39081；Wang,C.,et al.,Enzyme activities duringdegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by white rot fungusPhanerochaete chrysosporium in soils.CHEMOSPHERE,2009.77(6):p.733-738)。

目前已有一些商业化的酶制剂用以污水或者污泥的处理。如瑞典Pharem公司利用复合酶高效处理医药废水。诺维信公司在废水和污泥处理领域深耕多年，已经成功开发上市了一些列酶制剂产品，如catalase用以电子行业废水处理，

用于市政污泥脱水提升等等。但是，酶制剂在场地土壤生物修复中还较少应用，有待进一步研究。

本申请获得了降解有机污染物的基因序列，并选择真菌表达系统对此基因进行了表达，获得了具有高活力和对多环芳烃高降解能力的漆酶。

发明内容

本发明部分基于本发明人发现了具有多环芳烃高降解能力的多肽的实情。发明人发现现有漆酶多环芳烃去除率不到40％；与现有云芝漆酶相比，本发明的多肽以更高的去除率去除多环芳烃(例如苯并[a]芘)。

在一方面，本发明提供了多肽，所述多肽包含：

(1)SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽；

(2)与SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、或至少100％序列同一性的变体氨基酸序列；或者

(3)SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的变体氨基酸序列，其在成熟多肽的一个或多个(或几个，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9)个位置处包含取代、缺失和/或插入；

其中所述多肽具有漆酶活性或者多肽是漆酶。

在一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在一个实施方案中，由SEQ ID NO:2的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸24至527。

在一个实施方案中，多肽是从杂色云芝菌分离的并且能降解多环芳烃。

在一个实施方案中，多肽降解多环芳烃的能力是成熟多肽降解多环芳烃的能力的50％以上，例如60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％。

在一个实施方案中，多环芳烃包括非稠环型多环芳烃和/或稠环型多环芳烃。

在一个实施方案中，多环芳烃包括苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。

在另一个方面，本发明提供了多核苷酸，其编码根据本文所述的多肽。在一个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了核酸构建体，所述核酸构建体包含本文所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，所述一个或多个控制序列指导多肽在重组宿主细胞中的产生。

在另一个方面，本发明提供了表达载体，所述表达载体包含本文所述的多核苷酸或本文所述的核酸构建体。

在另一个方面，本发明提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的多核苷酸、本文所述的核酸构建体或本文所述的表达载体。

在另一个方面，本发明提供了产生多肽的方法，所述方法包括：

a)在适合于表达多肽的条件下培养本文所述的宿主细胞；和

b)回收所述多肽。

在另一个方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸、本文所述的核酸构建体、本文所述的表达载体和/或本文所述的宿主细胞。在一个实施方案中，组合物可以包含木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和/或细胞色素P450单加氧酶。

在另一个方面，本发明提供了本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸、本文所述的核酸构建体、本文所述的表达载体和/或本文所述的宿主细胞和/或本文所述的组合物用于降解多环芳烃的用途。

在一个实施方案中，多环芳烃在土壤或污水中。

在一个实施方案中，多环芳烃包括非稠环型多环芳烃和/或稠环型多环芳烃。

在一个实施方案中，多环芳烃包括苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。

在又一个方面，本发明提供了修复含多环芳烃的土壤、污泥、或污水的方法，其包括对土壤或污水应用本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸、本文所述的核酸构建体、本文所述的表达载体和/或本文所述的宿主细胞和/或本文所述的组合物。

在一个实施方案中，方法还包括生物修复、物理修复和/或化学修复的步骤。

在一个实施方案中，多环芳烃包括非稠环型多环芳烃和/或稠环型多环芳烃。

在一个实施方案中，多环芳烃包括苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。

本发明的有益效果包括本发明的多肽以更高的去除率去除多环芳烃(例如苯并[a]芘)，有利于在诸如土壤、污水或污泥等的人类生存环境中的生物修复方法。

具体实施方式

定义

术语“漆酶”是指如酶命名法定义的EC 1.10.3.2类中的酶。

术语“多环芳烃”是指含两个或两个以上苯环的芳烃。多环芳烃可以包括非稠环型多环芳烃，其中包括联苯及联多苯和多苯代脂肪烃，以及稠环型多环芳烃。在本文中，多环芳烃包括苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。

术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。

术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的组分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。本领域技术人员显而易见，本文披露的多肽优选地为经分离形式。

术语“成熟多肽”意指在N末端加工(例如，信号肽的去除)后处于其成熟形式的多肽。

在本领域中已知的是，宿主细胞可以生产由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以生产不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有漆酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

亲本或亲本漆酶：术语“亲本”或“亲本漆酶”意指进行改变以产生本发明的漆酶变体的漆酶。所述亲本漆酶可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

术语“变体”意指具有漆酶活性的、在一个或多个位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。

多肽

本发明提供了多肽，其具有漆酶活性或者为漆酶。本文所述的多肽可以具有降解多环芳烃的能力。本文所述的多肽的降解多环芳烃的能力可以是SEQ ID NO:2的成熟多肽的降解多环芳烃的能力的50％以上，例如60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％。

SEQ ID NO:2

本文所述的多肽可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽。本文所述的多肽也可以包含该成熟多肽的变体序列。例如，变体序列可以包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.3％、或至少99.5％序列同一性的变体氨基酸序列；或者SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽或SEQID NO:2的氨基酸序列的变体氨基酸序列，其在成熟多肽的一个或多个位置处包含变化，诸如取代、缺失和/或插入。这些变体序列具有漆酶活性，或者降解多环芳烃的能力。多个可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51个。

多肽可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。多肽可以由SEQ ID NO:2的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。在本文中，成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸24至527。

本文所述的多肽可以是从杂色云芝菌分离的。

本文所述的多肽可以是经分离，即，多肽为如上文所定义的经“分离”形式或处于以上所定义的经“分离”环境中。

多核苷酸

本文还提供了编码本文所述的多肽的多核苷酸，优选地多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1：

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可用多种方式操纵多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是获得自以下的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988，Gene[基因]69:301-315)，天蓝链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)、连同tac启动子(DeBoer等人,1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。另外的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白]”，Gilbert等人,1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94；以及Sambrook等人,1989，同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已用来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其变体、截短型、以及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。

酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992,同上)描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其提高该基因的表达。

合适的mRNA稳定子区的实例从以下基因中获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的5'末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从以下的基因中获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可以含有对编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的信号肽从以下的基因中获得：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶或多肽原(或在一些情况下被称为酶原)。多肽原一般是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。

还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是使基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以生产重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以使编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。而且，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、niaA(亚硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等同物。优选的用于在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。

选择性标记可以是如WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选地含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与相对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。而且，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高多肽的生产。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数量，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接上述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的生产。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组生产中有用的任何细胞，例如，原核生物或真核生物。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)以及马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau以及Davidoff-Abelson,1971，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或者接合(参见例如Koehler和Thorne,1987，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶状微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或者接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。本文中的植物细胞不包括可再生成植株的植物细胞。动物细胞也不包括可产生动物体的细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。

真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌纲(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌一般的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。

该丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、大角间座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的工艺以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序在EP 238023和Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]81:1470-1474、以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

生产方法

本发明还涉及生产本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于生产该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式生产该多肽；以及任选地(b)回收该多肽。

本发明还涉及生产本发明的多肽的重组方法，这些方法包括(a)在有益于生产该多肽的条件下培养能够表达该多肽的本发明的重组宿主细胞；以及任选地(b)回收该多肽。

本发明的一个实施方案涉及一种生产多肽的方法，其中该多肽是本文所述的成熟多肽(SEQ ID NO:2的成熟多肽)，该方法包括(a)在有助于生产该多肽的条件下培养能够表达多肽的重组宿主细胞；以及任选地(b)回收该多肽。

宿主细胞是在合适的使用本领域已知的方法生产多肽的营养培养基中培养的。例如，可通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的介质中并且在使多肽表达和/或分离的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规程序，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一个方面，回收包含多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法、和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。

在替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。另一种选择是使用多肽表达为多肽来源的上清液。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物，特别是生物修复(例如土壤或污水用)用组合物。

这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和/或细胞色素P450单加氧酶。

用途和方法

本文提供了组合物用于降解多环芳烃的用途。多环芳烃可以是在土壤或污水或污泥中的多环芳烃。多环芳烃包括非稠环型多环芳烃和/或稠环型多环芳烃。例如，多环芳烃包括但不限于苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。

本文提供了修复含多环芳烃的土壤或污水或污泥的方法，其包括对土壤或污水或污泥应用本文所述的多肽、本文所述的多核苷酸、本文所述的核酸构建体、本文所述的表达载体、本文所述的宿主细胞和/或本文所述的组合物。方法还可以包括生物修复、物理修复和/或化学修复的步骤。方法还可以包括别的生物修复的步骤，例如利用植物的生物修复步骤。多环芳烃包括非稠环型多环芳烃和/或稠环型多环芳烃。例如，多环芳烃包括但不限于苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。

实施例

通过以下实施例进一步描述本发明，所述实施例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实施例1：漆酶的候选基因的筛选

白腐菌的鉴定

本实施例中供试的白腐菌(长白山地区采集分离)先在PDA培养基上培养5d，然后收集菌丝，使用真菌基因组DNA提取试剂盒(BioFlux)提取DNA，随后用真菌通用引物(ITS4/5，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC；ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)通过PCR扩增(PCR扩增条件：95℃5min，95℃45s,55℃45s,72℃1min,35个循环，72℃延伸7min)其ITS区，该菌株为杂色云芝菌。

ITS区扩增序列：

白腐菌的基因组分析

收集培养好的杂色云芝菌菌丝，送到安升达(原金唯智)公司进行二代基因组测序(Illumina)。测序数据经质量评估后进行基因组组装分析：使用Velvet(v1..2.10),SSPACE(v3.0)和GapFiller(v1-10)进行基因组组装；使用Prodigal(v3.02)进行编码基因预测；使用BLAST(V2.2.31)比对NCBI NR数据库、Pfam数据库等进行基因功能注释；使用SingalP进行信号肽即分泌蛋白预测。经分析得到全长基因组44785457bp(约40Mb)，编码基因共17234个，编码漆酶的候选基因7个。根据苯并芘诱导条件下，候选基因在蛋白质组中的表达趋势，选出漆酶SRP33，其DNA和蛋白质信息如表1所示。。

表1：漆酶SRP33的蛋白质和DNA信息

	全长	信号肽	成熟肽
				DNA	1..1584	1..69	70..1581
蛋白质	1..527	1..23	24..527

SRP33全长的DNA编码序列：SEQ ID NO:1

SRP33全长蛋白序列：SEQ ID NO:2

SRP33成熟蛋白的DNA编码序列：SEQ ID NO:3

SRP33成熟蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO:4

实施例2：SRP33漆酶的克隆、纯化和活性测定

SRP33漆酶在米曲霉菌株Cols1300(Cols1300是诺维信公司自有菌株，其构建方法及基因型见US2019225988 A1)里进行重组表达，SEQ ID NO:1是编码SRP33的DNA序列，针对表达宿主米曲霉进行了密码子优化设计，DNA由金唯智公司(Azenta Life Sciences，Suzhou,China)合成。编码SRP33的DNA通过原生质体转化(US2019/0225988A1)，整合在Cols1300的基因组中，由NA2-TPI启动子以及AMG终止子调控表达。转化子经PCR扩增以及Sanger测序确认编码序列正确插入。转化子的表达筛选在3ml的液体培养基中进行，将转化子接种到Dap4C+0.2mM CuSO₄中，30℃，150rpm，培养4天。通过ABTS方法测定(100ul上清+60ul 3mM ABTS，pH5.5，30℃，15min，在405nm读数)有明显的漆酶活性，SDS-PAGE凝胶电泳检测显示上清中有重组蛋白条带约90kDa，确认SRP33在Cols1300里成功表达。

将确认表达的转化子接种在斜面上，37℃培养4～5天，待斜面上长满孢子，将孢子悬浮于10ml的培养基并接种到1600ml的Dap4C+0.2mM CuSO4中(4个2L摇瓶，每摇瓶400ml)，30℃，80rpm，培养4天。然后将培养上清通过Rapid-Flow Bottle Top Filter 0.2um aPESmembrane(ThermoFisher Scientific,Cat#597-4520)过滤去除孢子，上清液用于SRP33重组蛋白的纯化。

蛋白纯化

首先准备缓冲液系统，以20mM Tis-HCI，pH7.0的缓冲液为洗脱液，洗脱液中加入2M硫酸铵为平衡液。培养上清液经过离心后，加入硫酸铵使得最终体系电导为200mS/cm，过滤后注入经平衡液处理的层析柱(HiTrap Butyl HP,Cytiva)。平衡液冲洗三个柱体积，设置40个柱体积梯度利用洗脱液进行洗脱，之后继续冲洗4个柱体积。收集到的透过液和洗脱组分进行SDS-PAGE和活性分析。

含有漆酶活性的组分混合后利用Sephadex G25(Cytiva)柱子进行脱盐，以20mMTris-HCI pH7为缓冲系统，经过脱盐处理后收集到的酶液进行第二步纯化。此次层析用的缓冲系统为pH8.0的20mM Tris-HCI，层析柱为Capto HiRes Q，以含有1M NaCI的20mMTris-HCI pH8.0为洗脱液，洗脱梯度为20个柱体积，透过液和洗脱组分进行SDS-PAGE和活性分析，含有酶活的洗脱组分混合后浓缩并且利用透析方法把缓冲液替换为20mM Tris-HCI pH7.0，之后测定酶浓度。

蛋白质浓度采用Quant-iT Protein Assay Kit试剂盒(Invitrogen)方法测定。

酶活测试

漆酶酶活(LAMU)单位定义为在确定条件下每分钟转化1uM丁香醛连氮(该物质为漆酶典型的底物)所需要的酶量。具体测试如下：

以Sigma的来自曲霉(Aspergillus.sp)的漆酶(SAE0050)为标品，稀释不同的浓度进行测试：96孔板内，反应体系含有145ul 25mM Tris-HCI,pH7.5,0.05％ Triton X-100,18ul 0.22mM丁香醛连氮，15ul酶液，板子放入酶标仪，震荡20秒，每30秒读取540nm的吸收值，持续5分钟，反应温度控制在30℃。计算其中5个点的Vmax值(milli-unit/min)，以Vmax与蛋白含量绘制酶活标准曲线。所测样品按照同样条件进行测试，根据计算出的Vmax值在标曲上读取对应的活力值。

此酶在pH5.0和pH7.0条件下测定到的相对于SAE0050的比活分别为42711和3277LAMU每克蛋白。丁香醛连氮为漆酶典型的底物，结合序列比对，确认SRP33是漆酶。

实施例3：漆酶SRP33对多环芳烃的降解作用。

为了评价酶在土壤修复中的表现，发明人选择苯并[a]芘作为多环芳烃的代表性底物以测定酶反应效果。酶反应条件如下：在10毫升玻璃管中，总溶液体积为2毫升，其中含有20微克漆酶(漆酶是SRP33，或来自于Sigma-Aldrich的云芝漆酶(货号38429)作为对照1，或来自于诺维信的商品化漆酶样品NS29056作为对照2)，50微摩尔苯并[a]芘，1微摩尔1-羟基苯并三唑(HBT)，1％吐温80，10％乙腈，50毫摩尔pH 5Tris-HCl缓冲液。同时，包括具有与上述相同设置但没有酶的空白对照组。在37℃下在密闭的试管中孵育24小时后，对于每个反应管，收集0.5毫升反应溶液并与0.5毫升乙腈混合，然后用0.45微米滤纸过滤，然后用UPLC分析。

将Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1x100毫米，粒径1.7微米)进行UPLC，以分离50℃下的反应溶液，恒定流速为0.4毫升/分钟，流动相为0.1％甲酸(A)/0.1％甲酸+乙腈(B)(线性梯度洗脱10分钟：0分钟，60％A+40％ B；1.5分钟，60％ A+40％ B；8.5分钟，100％B；10分钟，60％ A+40％ B)。苯并[a]芘定量在254纳米波长下下进行。测定苯并[a]芘的保留时间约为7.0分钟。用标准曲线计算苯并[a]芘的浓度，相对去除率通过以下公式估计：([BaP_测试样]-[BaP_空白对照样])/[BaP_空白对照样]。实验平行样品数如表2所示。实验结果如下表2所示。目前商用的漆酶，苯并[a]芘去除率在20％-40％之间，出乎意料地，本发明人发现SRP33表现出更高的苯并[a]芘去除效果(高达80％)。

表2：苯并[a]芘去除率

本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (9)

1.多肽，所述多肽包含：

(1)SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽；

(2)与SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、或至少100％序列同一性的变体氨基酸序列；或者

(3)SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的变体氨基酸序列，其在成熟多肽的一个或多个(几个)位置处包含取代、缺失和/或插入；

其中所述多肽具有漆酶活性或者多肽是漆酶；

优选地，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:2的氨基酸序列、SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的成熟多肽、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；

优选地，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸24至527；

优选地，多肽是从杂色云芝菌分离的并且能降解多环芳烃；

优选地，多肽降解多环芳烃的能力是所述成熟多肽降解多环芳烃的能力的50％以上，例如60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、或200％；

优选地，多环芳烃包括非稠环型多环芳烃和/或稠环型多环芳烃；

优选地，多环芳烃包括苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。

2.多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的多肽，优选地多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

3.核酸构建体，所述核酸构建体包含根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，所述一个或多个控制序列指导多肽在重组宿主细胞中的产生。

4.表达载体，所述表达载体包含根据权利要求2所述的多核苷酸或根据权利要求3所述的核酸构建体。

5.宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求2所述的多核苷酸、根据权利要求3所述的核酸构建体或根据权利要求4所述的表达载体。

6.产生多肽的方法，所述方法包括：

a)在适合于表达多肽的条件下培养根据权利要求5所述的宿主细胞；和

b)回收所述多肽。

7.组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求2所述的多核苷酸、根据权利要求3所述的核酸构建体、根据权利要求4所述的表达载体和/或根据权利要求5所述的宿主细胞，并且任选地包含木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和/或细胞色素P450单加氧酶。

8.根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求2所述的多核苷酸、根据权利要求3所述的核酸构建体、根据权利要求4所述的表达载体、根据权利要求5所述的宿主细胞和/或根据权利要求7所述的组合物用于降解多环芳烃的用途；

优选地，多环芳烃是在土壤、污泥或污水中的多环芳烃；

优选地，多环芳烃包括非稠环型多环芳烃和/或稠环型多环芳烃；

优选地，多环芳烃包括苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。

9.修复含多环芳烃的土壤、污泥或污水的方法，其包括对土壤、污泥或污水应用根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求2所述的多核苷酸、根据权利要求3所述的核酸构建体、根据权利要求4所述的表达载体、根据权利要求5所述的宿主细胞和/或根据权利要求7所述的组合物；

优选地，方法还包括生物修复、物理修复和/或化学修复的步骤；

优选地，多环芳烃包括非稠环型多环芳烃和/或稠环型多环芳烃；

优选地，多环芳烃包括苯并(a)芘、萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、

苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、茚苯(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,n)蒽和/或苯并(g,h,i)苝。