BR112019021223A2

BR112019021223A2 - variante de glucoamilase, métodos para aumentar a atividade de hidrólise de amido em bruto de uma glucoamilase e para produzir uma variante de glucoamilase, composição, uso de uma variante de glucoamilase, processos para produzir um produto de fermentação e para produzir um produto de xarope, polinucleotídeo codificando a variante de glucoamilase, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, e, célula hospedeira.

Info

Publication number: BR112019021223A2
Application number: BR112019021223A
Authority: BR
Inventors: Ayabe Keiichi; Tsutsumi Noriko; Namoto Tomoko; Kang Zhengfang
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2020-04-28
Also published as: US20200131491A1; EP3610027A1; CN110651048A; WO2018191215A1; US11279921B2; MX2019011900A; CA3057896A1

Abstract

a presente invenção se relaciona com variantes de glucoamilase tendo um aumento na atividade de amido em bruto em comparação com a glucoamilase divulgada como seq id no: 2, compreendendo uma ou mais modificações no domínio catalítico e/ou uma ou mais modificações no domínio de ligação ao amido selecionadas de: a) pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro de: v18m, t43k, n112l, t116r, a117q, g120s, a271f, y295w, q318y; e/ou (b) introdução de pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro, substituições selecionadas do grupo: s458c, s458scgg, s458sggc, a493v, a518k, e520q, n527m, s540k,r, s(g)546p, t(v)549w, n503r, n539r + i541y + t543v + a545s + s546gcgv + g547s + s548t + t549a. a presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando as variantes; construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de uso das variantes.

Description

VARIANTE DE GLUCOAMILASE, MÉTODOS PARA AUMENTAR A ATIVIDADE DE HIDRÓLISE DE AMIDO EM BRUTO DE UMA GLUCOAMILASE E PARA PRODUZIR UMA VARIANTE DE GLUCOAMILASE, COMPOSIÇÃO, USO DE UMA VARIANTE DE GLUCOAMILASE, PROCESSOS PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO E PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE XAROPE, POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO A VARIANTE DE GLUCOAMILASE, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, E, CÉLULA HOSPEDEIRA

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Área da Invenção [002] A presente invenção se relaciona com variantes de glucoamilase, polinucleotídeos codificando as variantes, métodos de produção das variantes e métodos de uso das variantes. É também descrito aqui o uso de variantes de glucoamilase da invenção para conversão de amido para produzir produtos de fermentação, tais como etanol, e xaropes, tais como glucose. A invenção se relaciona também com uma composição compreendendo uma variante de glucoamilase da invenção.

Descrição da técnica relacionada [003] A glucoamilase (1,4-alfa-D-glucana gluco-hidrolase, EC 3.2.1.3) é uma enzima, que catalisa a liberação de D-glucose a partir das extremidades não redutoras de amido ou moléculas de oligo- ou polissacarídeo relacionadas. As glucoamilases são produzidas por vários fungos filamentosos e levedura, com aquelas de Aspergillus sendo comercialmente as mais importantes.

[004] Comercialmente, as glucoamilases são usadas para converter

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2/108 material contendo amido, que já está parcialmente hidrolisado por uma alfaamilase, em glucose. A glucose pode ser depois diretamente ou indiretamente convertida em um produto de fermentação usando um organismo fermentador. Exemplos de produtos de fermentação comerciais incluem álcoois (p.ex., etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol); ácidos orgânicos (p.ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-Dglucônico); cetonas (p.ex., acetona); aminoácidos (p.ex., ácido glutâmico); gases (p.ex., H2 e CO2) e compostos mais complexos, incluindo, por exemplo, antibióticos (p.ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p.ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); hormônios e outros compostos que são difíceis de produzir sinteticamente. Processos de fermentação são também comumente usados nas indústrias de álcool consumível (p.ex., cerveja e vinho), lacticínios (p.ex., na produção de iogurte e queijo).

[005] O produto final pode ser também xarope. Por exemplo, o produto final pode ser glucose, mas pode ser também convertido, p.ex., por glucose isomerase em frutose ou uma mistura composta quase igualmente por glucose e frutose. Esta mistura, ou uma mistura adicionalmente enriquecida com frutose, é o xarope de milho rico em frutose (HFCS) o mais comumente usado comercializado em todo o mundo.

[006] E um objetivo da presente invenção proporcionar polipeptídeos tendo atividade de glucoamilase e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos e que proporcionam um elevado rendimento em processos de produção de produtos de fermentação, tais como processos de produção de etanol.

[007] WO 2011/068803 divulga glucoamilases isoladas a partir do fungo Gloeophyllum, em particular, a partir de Gloeophyllum sepiarium e Gloeophyllum trabeum.

[008] A presente invenção proporciona variantes de glucoamilase

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3/108 com propriedades melhoradas em comparação com o seu genitor.

[009] WO 2014/177546, WO 2016/062875 e WO 2017/066255 divulgam variantes de glucoamilase de Gloeophyllum sp. tendo termoestabilidade aumentada e atividade específica aumentada.

[0010] Em particular é desejável proporcionar variantes de glucoamilase que tenham tanto uma boa termoestabilidade como uma elevada atividade hidrolítica na direção de amido em bruto (amido não gelatinizado). SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0011] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se relaciona com variantes de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2 ou 1-454 de SEQ ID NO: 4, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-462 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 463-556 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende adicionalmente uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ T116R+ N539R+ 1541Y+ T543V+

A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+

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4/108

I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N539R+ 1541Y+

T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ Q318Y+ S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ G120S+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+

N527M T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+

S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ N539R+ 1541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+

N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+

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5/108

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W + A518K+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+

T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+

N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+

N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

S95P+	T116R+	A121P+	Y295W+	A518K+	N527M+
T(V)549W;
V18M+	T43K+	S95P+	A121P+	Q318Y+	A518K+

T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A518K+

T549W;

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6/108

S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W;

S95P+	G120S+	A121P+	Y295W+	A518K+	N527M+
T(V)549W;
S95P+	N112L+	A121P+	Y295W+	A518K+	N527M+

T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ A271F+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540K;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540R;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SGGC+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

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S95P + A121P + Y295W + S458SCGG + N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A; em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0012] Em um segundo aspecto, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante compreende as modificações selecionadas de:

(i) substituição dos aminoácidos 463-556 do domínio de ligação ao amido de SEQ ID NO: 2 pelos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (ii) introdução das seguintes substituições e inserções: N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A usando SEQ ID NO: 2 para numeração;

em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%.

[0013] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 4, em que a variante compreende as modificações

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8/108 de introdução das seguintes substituições e inserções: N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A usando SEQ ID NO: 2 para numeração; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 4 é pelo menos 15%.

[0014] Em um quarto aspecto, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante compreende as modificações selecionadas de:

(i) substituição dos aminoácidos 463-556 do domínio de ligação ao amido de SEQ ID NO: 2 pelos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (ii) introdução das substituições G459C + N527M + T(V)549W usando SEQ ID NO: 2 para numeração; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%.

[0015] Em um quinto aspecto, a presente invenção se relaciona com um método para aumento da atividade de hidrólise de amido em brito de uma glucoamilase compreendendo os passos de:

(a) proporcionar uma glucoamilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos consistindo nos aminoácidos 1

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454 de SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 455-462 de SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e uma terceira sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 463-556 de SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (b) introdução de uma combinação de substituições selecionadas de pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro de: V18M, T43K, N112L, T116R, A117Q, G120S, A271F, Y295W, Q318Y; e/ou (c) introdução de pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro, substituições selecionadas do grupo: S458C, S458SCGG, S458SGGC, A493V, A518K, E520Q, N527M, S540K,R, S(G)546P, T(V)549W, N503R, N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A.

[0016] Em um sexto aspecto, a presente invenção se relaciona com um método para aumento da atividade de hidrólise de amido em brito de uma glucoamilase compreendendo os passos de:

(a) proporcionar uma glucoamilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos consistindo nos aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e uma terceira sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (b) introdução de uma combinação de substituições selecionadas de, pelo menos, uma de: V18M, T43K, T116R, G120S, Y295W, Q318Y;e/ou (c) introdução de uma de 3 opções: i) N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A; ii) N539R +

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I541Y + T543V + A545S + S546PCGV + G547S + S548T +

T549A; iii), pelo menos, três substituições selecionadas do grupo: S458SCGG, N527M, T(V)549W e N503R.

[0017] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando as variantes da invenção; construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção das variantes.

[0018] A presente invenção se relaciona adicionalmente com composições compreendendo uma variante de glucoamilase da invenção.

[0019] Em outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um uso da variante de glucoamilase para produção de um xarope ou um produto de fermentação.

[0020] Ainda em aspectos adicionais, a presente invenção se relaciona com um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de:

(a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa amilase;

(b) sacarificação do material liquefeito; e (c) fermentação com um organismo fermentador;

em que o passo (b) é levado a cabo usando, pelo menos, uma variante de glucoamilase da invenção.

[0021] Em um aspecto adicional, a presente invenção se relaciona com um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, compreendendo os passos de:

(a) sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido; e (b) fermentação com um organismo fermentador, em que o passo (a) é levado a cabo usando, pelo menos, uma variante de

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11/108 glucoamilase da invenção.

[0022] Em aspectos adicionais, a invenção se relaciona com um processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, compreendendo os passos de:

(a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa amilase;

(b) sacarificação do material liquefeito na presença de uma variante de glucoamilase variante da invenção.

[0023] Em outra modalidade, a invenção se relaciona com um processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, compreendendo o passo de sacarificação do material contendo amido na presença de uma variante de glucoamilase da invenção, a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do material contendo amido. DEFINIÇÕES [0024] Glucoamilase: O termo “glucoamilase” (1,4-alfa-D-glucana gluco-hidrolase, EC 3.2.1.3) é definido como uma enzima, que catalisa a liberação de D-glucose a partir das extremidades não redutoras de amido ou moléculas de oligo- e polissacarídeos relacionadas. Para propósitos da presente invenção, a atividade de glucoamilase é determinada de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos aqui. A Unidade de Glucoamilase (AGU) é definida como a quantidade de enzima, que hidrolisa 1 micromole de maltose por minuto sob as condições padrão 37°C, pH 4,3, substrato: maltose a 23,2 rnM, tampão: acetato a 0,1 M, tempo de reação 5 minutos.

[0025] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar os polipeptídeos tendo sequências de

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12/108 aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0026] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA, processada, madura, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA processado maduro. [0027] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são, geralmente, determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.

[0028] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) ou estranha (z.e., de um gene diferente) em relação ao polinucleotídeo codificando a variante ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de própeptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle com a região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.

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13/108 [0029] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer passo envolvido na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação póstranslacional e secreção.

[0030] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligada a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0031] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de glucoamilase.

[0032] Condições de estringência elevada: O termo “condições de estringência elevada” significa, para sondas de, pelo menos, 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes durante 15 minutos cada usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 65°C.

[0033] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0034] Propriedade melhorada: O termo “propriedade melhorada” significa uma característica associada a uma variante que é melhorada em

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14/108 comparação com o genitor. Tais propriedades melhoradas incluem, mas não estão limitadas a, atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada e termoestabilidade aumentada.

[0035] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que seja, pelo menos, parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0036] Condições de estringência baixa: O termo “condições de estringência baixa” significa, para sondas de, pelo menos, 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 25%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes durante 15 minutos cada usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 50°C.

[0037] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o

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15/108 polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 556 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 559 de SEQ ID NO: 4. E conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. [0038] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de glucoamilase. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 52 a 1719 de SEQ ID NO: 1. Os nucleotídeos 1 a 51 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal. Em outro aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 52 a 1728 de SEQ ID NO: 3. Os nucleotídeos 1 a 51 de SEQ ID NO: 3 codificam um peptídeo sinal.

[0039] Condições de estringência média: O termo “condições de estringência média” significa, para sondas de, pelo menos, 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação em 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes durante 15 minutos cada usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 55°C.

[0040] Condições de estringência média-elevada: O termo “condições de estringência média-elevada” significa, para sondas de, pelo menos, 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação em 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes durante 15 minutos cada usando 2XSSC, SDS a 0,2% a 60°C.

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16/108 [0041] Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[0042] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não podería de outro modo em natureza ou que é sintético, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0043] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0044] Genitor ou glucoamilase genitora: O termo “genitor” ou “glucoamilase genitora” significa qualquer polipeptídeo com atividade de glucoamilase ao qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção.

[0045] Atividade hidrolítica de amido em bruto: O termo “Atividade hidrolítica de amido em bruto” significa que a atividade hidrolítica foi medida a pH 4,0 e T = 32°C às condições divulgadas nos exemplos.

[0046] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.

[0047] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou

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17/108 posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento) [0048] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue:

(Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento Número Total de Intervalos no Alinhamento) [0049] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de glucoamilase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa reposicionamento do aminoácido ocupando uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 5%, p.ex., pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos

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30%, pelo menos 35%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% de aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com a glucoamilase do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

[0050] Condições de estringência muito elevada: O termo “condições de estringência muito elevada” significa, para sondas de, pelo menos, 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação em 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a 200 microgramas/mL e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada durante 15 minutos usando 2XSSC, SDS a 0,2% a 70°C.

[0051] Condições de estringência muito baixa: O termo “condições de estringência muito baixa” significa, para sondas com, pelo menos, 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42°C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e formamida a 25%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes durante 15 minutos cada usando 2XSSC, SDS a 0,2% a 45°C.

[0052] Glucoamilase de tipo selvagem: O termo glucoamilase de “tipo selvagem” significa uma glucoamilase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura ou fungo filamentoso encontrado na natureza. Em uma modalidade, a glucoamilase de tipo selvagem é derivada de Gloeophyllum sepiarium. Na presente divulgação, esta é também denotada Gs-AMG. Em outro aspecto, a glucoamilase de tipo selvagem é derivada de Gloeophyllum trabeum. Na presente divulgação, esta é também denotada Gt-AMG.

Convenções para a Designação de Variantes [0053] Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo

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19/108 divulgado em SEQ ID NO: 2 é usado para se determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra glucoamilase. A sequência de aminoácidos de outra glucoamilase é alinhada com o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 2 e, com base no alinhamento, o número de posição de aminoácidos correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo divulgado em SEQ ID NO: 2 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[0054] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra glucoamilase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 2T. 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.

[0055] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 tal que a comparação tradicional à base de sequências falhe em detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), outros algoritmos de comparação de sequências par a par podem ser usados. Pode ser

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20/108 alcançada maior sensibilidade na pesquisa baseada em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias (perfis) de polipeptídeos para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[0056] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e são descarregáveis. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatorial (Shindyalov e Boume, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 31/132 / 108 com uma estrutura de interesse de modo a descobrir possíveis homólogos estruturais (p.ex., Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0057] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita em baixo é adaptada para facilidade de referência. E empregue a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras aceite pela IUPAC.

[0058] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Conformemente, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0059] Deleções. Para uma deleção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Conformemente, a deleção de glicina na posição 195 é designada como “Glyl95*” ou “G195*”. Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Glyl95* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[0060] Inserções. Para uma inserção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Conformemente, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada Glyl95GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como “Glyl95GlyLysAla” ou “G195GKA”.

[0061] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de letras minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s)

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 32/132 / 108 inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria assim:

Genitor	Variante:
195	195 195a 195b
G	G - K - A

[0062] Alterações múltiplas. Variantes compreendendo múltiplas alterações são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Argl70Tyr+Glyl95Glu” ou “R170Y+G195E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[0063] Diferentes alterações. Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, p.ex., “Argl70Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyrl67Gly,Ala + Argl70Gly,Ala” designa as seguintes variantes:

Tyrl67Gly+Argl70Gly, Tyrl67Gly+Argl70Ala,

Tyrl67Ala+Argl70Gly, e Tyrl67Ala+Argl70Ala.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0064] A presente invenção se relaciona com variantes de glucoamilase tendo propriedades melhoradas em relação à glucoamilase genitora. Em uma modalidade particular, a glucoamilase genitora é uma glucoamilase derivada de Gloeophyllum sepiarium, tal como aquela divulgada aqui como SEQ ID NO: 2 ou de Gloeophyllum trabeum, como aquela divulgada aqui como SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade particular, a propriedade melhorada é selecionada de atividade de hidrólise de amido em bruto melhorada em comparação com a glucoamilase genitora divulgada em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o aumento na hidrólise de amido em bruto foi medido por desempenho de degradação de amido em bruto das variantes por liberação de glucose a partir de amido granular após incubação da variante de glucoamilase em combinação com uma alfa amilase fúngica (tal como aquela divulgada em SEQ ID NO: 6) a pH

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4,0, T = 32°C (para condições detalhadas ver exemplo 1). Em uma modalidade adicional, as variantes de acordo com a invenção têm termoestabilidade aumentada em comparação com a glucoamilase genitora divulgada em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

Variantes [0065] A presente invenção proporciona variantes de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada em relação à glucoamilase genitora de tipo selvagem. Em particular, a glucoamilase genitora é selecionada de uma glucoamilase obtida de Gloeophyllum sepiarium, tal como aquela divulgada aqui como SEQ ID NO: 2 ou de Gloeophyllum trabeum, como aquela divulgada aqui como SEQ ID NO: 4. As variantes de acordo com a invenção são proporcionadas por introdução de substituições/inserções no domínio catalítico e/ou no ligante e/ou domínio de ligação ao amido (SBD) como divulgado aqui usando SEQ ID NO: 2 para numeração. No caso de uma glucoamilase genitora diferente tal como, p.ex., SEQ ID NO: 4, a glucoamilase genitora é alinhada com a glucoamilase de SEQ ID NO: 2 e a posição correspondendo à posição de SEQ ID NO: 2 é identificada e modificada como divulgado aqui.

[0066] As substituições introduzidas no domínio catalítico são, em uma modalidade particular, selecionadas do grupo consistindo em: V18M, T43K, N112L, T116R, A117Q, G120S, A271F, Y295W, Q318Y; particularmente Y295W; T116R + Y295W; T43K + Y295W + Q318Y; V18M + T43K + Q318Y; V18M + T43K + T116R + Q318Y. As variantes podem adicionalmente compreender as substituições S95P + A121P. As substituições/inserções introduzidas no ligante e SBD são preferencialmente selecionadas do grupo: S458C, S458SCGG, S458SGGC, A493V, A518K, E520Q, N527M, S540K,R, S(G)546P, T(V)549W, N503R, N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A.

[0067] Mais especificamente, a presente invenção se relaciona com

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 34/132 / 108 uma variante de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2 ou 1-454 de SEQ ID NO: 4, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-462 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 463-556 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende adicionalmente uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ T116R+ N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ Q318Y+ S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 35/132 / 108

S95P+ A121P+ Y295W+ G120S+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ N539R+ 1541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W + A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 36/132 / 108

N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+

N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A518K+

T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W;

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 37/132 / 108

T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ A271F+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540K;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540R;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SGGC+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0068] Em outra modalidade, a invenção se relaciona com uma

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 38/132 / 108 variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ G120S+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M T(V)549W;

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 39/132 / 108

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ Τ549Α;

Τ43Κ+ S95P+ Α121Ρ+ Y295W+ Q318Y+ Ν527Μ+ T(V)549W+ N503R;

S95P + Α121Ρ + Y295W + N539R + Ι541Υ + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + Τ549Α; em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm, pelo menos, 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 30%, pelo menos 35%, tal como pelo menos 40%.

[0069] Particularmente, as variantes podem adicionalmente compreender as substituições G456S + P461S + E472Q + L481I + E489S + A493P + E520Q.

[0070] Em uma modalidade específica, a invenção se relaciona com variantes de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada da glucoamilase de SEQ ID NO: 2, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 40/132

30/108

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+

N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+

N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y + A518K+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ A271F+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 41/132

31/108

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540K;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540R;

S95P + A121P + Y295W + A518K + N527M; em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 5%.

[0071] Em uma modalidade específica adicional, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada da glucoamilase de SEQ ID NO: 2, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 42/132

32/108

N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 20%.

[0072] Em uma modalidade específica adicional, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 43/132 / 108 amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada da glucoamilase de SEQ ID NO: 2, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas de:

V18M + T43K + S95P + A121P + Q318Y + A518K + N527M + T549W; em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, particularmente pelo menos 20%.

[0073] Em outra modalidade específica, a invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 44/132

34/108

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;
S95P+	G120S+	A121P+	Y295W+	A518K+	N527M+
T(V)549W;
S95P+	N112L+	A121P+	Y295W+	A518K+	N527M+

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W + S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV + G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SGGC+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A; em que a numeração

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 45/132 / 108 das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 2%.

[0074] Em outra modalidade específica, a invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+

T(V)549W;

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 46/132

36/108

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T + T549A; em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 15%, tal como pelo menos 20%.

[0075] Em um aspecto adicional, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante compreende as modificações selecionadas de:

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 47/132 / 108

i) substituição dos aminoácidos 463-556 do domínio de ligação ao amido de SEQ ID NO: 2 pelos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou ii) introdução das seguintes substituições e inserções: N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A usando SEQ ID NO: 2 para numeração;

[0076] Em particular, as variantes podem adicionalmente compreender qualquer uma das substituições:

V18M, T43K, T116R, A271F, Y295W, Q318Y;

particularmente, Y295W; T116R + Y295W; T43K + Y295W + Q318Y; V18M + T43K + Q318Y; V18M + T43K + T116R + Q318Y.

[0077] Em um aspecto adicional, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 4, em que a variante compreende as modificações de introdução das seguintes substituições e inserções: N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A usando SEQ ID NO: 2 para numeração; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 4 é pelo menos 15%.

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 48/132

38/108 [0078] Em particular, as variantes podem adicionalmente compreender qualquer uma das substituições:

V18M, T43K, T116R, A271F, Y295W, Q318Y;

[0079] Em um aspecto adicional, a presente invenção se relaciona com uma variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante compreende as modificações selecionadas de:

i) substituição dos aminoácidos 463-556 do domínio de ligação ao amido de SEQ ID NO: 2 pelos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou ii) introdução das substituições G459C + N527M + T(V)549W usando SEQ ID NO: 2 para numeração; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%.

[0080] Em particular, as variantes podem adicionalmente compreender qualquer uma das substituições:

V18M, T43K, T116R, A271F, Y295W, Q318Y;

particularmente Y295W; T116R + Y295W; T43K + Y295W + Q318Y; V18M + T43K + Q318Y; V18M + T43K + T116R + Q318Y.

[0081] Preferencialmente, todas as variantes da invenção compreendem S95P + A121P.

[0082] Em um aspecto adicional, a invenção se relaciona com método

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 49/132

39/108 de aumento da atividade hidrolítica de amido em bruto de uma glucoamilase genitora por introdução de substituições/inserções no domínio catalítico e/ou no ligante e/ou domínio de ligação ao amido (SBD) como divulgado aqui usando SEQ ID NO: 2 para numeração. No caso de uma glucoamilase genitora diferente tal como, p.ex., SEQ ID NO: 4, a glucoamilase genitora é alinhada com a glucoamilase de SEQ ID NO: 2 e a posição correspondendo à posição de SEQ ID NO: 2 é identificada e modificada como divulgado aqui. [0083] Assim, em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um método para aumento da atividade de hidrólise de amido em brito de uma glucoamilase compreendendo os passos de:

(a) proporcionar uma glucoamilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos consistindo nos aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 455-462 de SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e uma terceira sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 463-556 de SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (b) introdução de uma combinação de substituições selecionadas de pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro de: V18M, T43K, N112L, T116R, A117Q, G120S, A271F, Y295W, Q318Y; e/ou (c) Introdução de pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro, substituições selecionadas do grupo: S458C, S458SCGG, S458SGGC, A493V, A518K, E520Q, N527M, S540K,R, S(G)546P, T(V)549W, N503R, N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A.

[0084] Preferencialmente, as substituições S95P + A121P são também introduzidas.

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40/108 [0085] Em uma modalidade adicional, a presente invenção se relaciona com um método para aumento da atividade de hidrólise de amido em brito de uma glucoamilase compreendendo os passos de:

(a) proporcionar de uma glucoamilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos consistindo nos aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e uma terceira sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (b) introdução de uma combinação de substituições selecionadas de pelo menos uma de: V18M, T43K, T116R, G120S, Y295W, Q318Y;e/ou (c) introdução de uma de 3 opções: i) N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A; ii) N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

iii) pelo menos três substituições selecionadas do grupo: S458SCGG, N527M, T(V)549W e N503R.

[0086] Preferencialmente, as substituições S95P + A121P são também introduzidas.

[0087] As variantes podem compreender adicionalmente uma ou mais alterações adicionais em uma ou mais (p.ex., várias) outras posições. Por exemplo, as variantes de acordo com a invenção podem ter pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

[0088] Em uma modalidade, o número de alterações é 1-20, p.ex., 110 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0089] As mudanças de aminoácidos podem ter uma natureza mínima,

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 51/132 / 108 isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões amino- ou carboxila-terminais, tais como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação. [0090] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

[0091] Altemativamente, as mudanças de aminoácidos têm uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ótimo e similares.

[0092] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 52/132 / 108 molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de glucoamilase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0093] Em uma modalidade, as variantes têm atividade de amido em bruto melhorada em comparação com a glucoamilase genitora. Em uma modalidade, a variante tem atividade específica melhorada em comparação com a enzima genitora.

[0094] Em uma modalidade, a variante tem termoestabilidade aumentada em comparação com a enzima genitora.

Glucoamilase Genitora [0095] Em uma modalidade, a glucoamilase genitora é derivada de Gloeophyllum, particularmente Gloeophyllum sepiarium. A glucoamilase genitora pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência elevada com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) o complemento de comprimento total de (i); ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 53/132 / 108 [0096] Em um aspecto, o genitor tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de glucoamilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do genitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

[0097] Em outro aspecto, o genitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0098] Em outro aspecto, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência elevada, ou condições de estringência muito elevada, com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) ou o complemento de comprimento total de (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0099] Em uma modalidade, a glucoamilase genitora é derivada de Gloeophyllum, particularmente Gloeophyllum trabeum. A glucoamilase genitora pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência elevada com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, ou (ii) o complemento de comprimento total de (i); ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3.

[00100] [0100] Em um aspecto, o genitor tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%,

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 54/132 / 108 pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de glucoamilase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do genitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4.

[00101] Em outro aspecto, o genitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[00102] Em outro aspecto, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência elevada, ou condições de estringência muito elevada, com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, (ii) ou o complemento de comprimento total de (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00103] Em outra modalidade, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.

[00104] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[00105] O genitor pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Os polipeptídeos de fusão podem ser

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 55/132 / 108 também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00106] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[00107] O genitor pode ser uma glucoamilase fúngica. Por exemplo, o genitor pode ser uma glucoamilase de Gloeophyllum.

[00108] Em outro aspecto, o genitor é um Gloeophyllum trabeum ou Gloeophyllum sepiarium.

[00109] Em outro aspecto, o genitor é uma glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium (Gs AMG), p.ex., a glucoamilase de SEQ ID NO: 2 ou uma glucoamilase de Gloeophyllum trabeum (Gt AMG), p.ex., a glucoamilase de SEQ ID NO: 4.

[00110] As estirpes destas espécies são prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[00111] O genitor pode ser identificado e obtido de outras fontes

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 56/132 / 108 incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando um genitor pode ser depois obtido por triagem similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um genitor com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Preparação de Variantes [00112] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção de genes sintética, construção de genes semis sintética, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

[00113] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (p.ex., várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo codificando o genitor.

[00114] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores de oligonucleotídeos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codificando o genitor e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Usualmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades coesivas do plasmídeo e a inserção se liguem umas às outras. Ver, p.ex., Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 57/132 / 108 al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[00115] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Publicação do Pedido de Patente dos E.U.A. No. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[00116] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítiodirigida na presente invenção. Existem vários estojos comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.

[00117] A construção de genes sintética implica síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo concebida para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de genes pode ser realizada utilizando um número de técnicas, tais como a tecnologia à base de microchip em múltiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados mediante chips microfluídicos fotoprogramáveis.

[00118] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tais como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 1083210837; Patente dos E.U.A. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese dirigida a regiões (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00119] Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de rastreamento automatizados, de elevada produtividade para detectar atividade de polipeptídeos mutagenizados,

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 58/132 / 108 clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[00120] A construção de genes semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção de genes sintética e/ou mutagênese sítio-dirigida e/ou mutagênese aleatória e/ou embaralhamento. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos de polinucleotídeos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítioespecíficos, enquanto ainda outras regiões podem estar sujeitas à amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. As subsequências de polinucleotídeos podem ser depois embaralhadas.

Polinucleotídeos [00121] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando uma variante da presente invenção.

Construtos de Ácido Nucleico [00122] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle. Em uma modalidade particular, pelo menos uma sequência de controle é heteróloga em relação ao polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Assim, o construto de ácido nucleico não seria encontrado na natureza.

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 59/132 / 108 [00123] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[00124] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos em relação à célula hospedeira.

[00125] Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase

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IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene de alfa-amilase neutro de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene de alfa-amilase neutro de Aspergillus niger no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados e híbridos.

[00126] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[00127] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00128] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00129] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[00130] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas

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51/108 filamentosas são obtidos dos genes da TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00131] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência codificante da variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[00132] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00133] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica a variante. Altemativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante do peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija a variante expressa para a via secretora de uma célula hospedeira.

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52/108 [00134] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00135] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um própolipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do própolipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode, p.ex., ser obtida a partir dos genes da lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00136] Onde estiverem presentes sequências de peptídeo sinal e própeptídeo, a sequência de pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N da variante e a sequência de peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência de pró-peptídeo.

[00137] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor de TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação de genes. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da di

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 63/132 / 108 hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando a variante estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.

Vetores de Expressão [00138] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção, um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando a variante em tais locais. Altemativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[00139] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa resultar em expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00140] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar autorreplicação.

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Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no qual foi integrado. Além do mais pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transposon.

[00141] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos e similares.

[00142] São preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae.

[00143] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[00144] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para dirigir a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização específica, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências em relação à sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 65/132 / 108 com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00145] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediador da replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00146] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 microns, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00147] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMAI e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). Ο isolamento do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[00148] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de, pelo menos, uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultura das células na presença do agente selecionável apropriado.

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56/108 [00149] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras [00150] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene codificando a variante e sua fonte.

[00151] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, p.ex., um eucariótico.

[00152] A célula hospedeira pode ser um eucariótico, tal como uma célula fúngica. “Fungos” como usados aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definidos por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8^a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[00153] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como usada aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode variar no

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 67/132 / 108 futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deverá definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[00154] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica .

[00155] Em uma modalidade particular, a célula de levedura hospedeira expressando as variantes de glucoamilase da invenção é usada em um processo da invenção para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, mais particularmente a célula hospedeira é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

[00156] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas das subdivisões Eumycota e Oomycota (como definidos por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[00157] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix,

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Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[00158] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

Métodos de Produção [00159] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultura de uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperação da variante.

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59/108 [00160] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultura em frasco agitado ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizada em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. A cultura ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente a partir do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada a partir de lisados celulares.

[00161] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

[00162] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterem variantes substancialmente puras.

[00163] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é

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60/108 usada como uma fonte da variante.

Composições [00164] A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo uma variante de glucoamilase da presente invenção. Preferencialmente, a composição compreende também um transportador e/ou um excipiente. Mais preferencialmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo “enriquecido” indica que a atividade de glucoamilase da composição foi aumentada, p.ex., com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1. Preferencialmente, as composições são formuladas para proporcionarem características desejáveis tais como fraca cor, fraco odor e estabilidade no armazenamento aceitável.

[00165] A composição pode compreender uma variante de glucoamilase da presente invenção como o principal componente enzimático, p.ex., uma composição monocomponente. Altemativamente, a composição pode compreender atividades enzimáticas múltiplas, tais como uma aminopeptidase, alfa-amilase, isoamilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, pululanase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

[00166] Em uma modalidade particular, a composição compreende uma alfa-amilase e a variante de glucoamilase de acordo com a invenção. Em outra modalidade, a composição compreende uma isoamilase e a variante de glucoamilase de acordo com a invenção. Em outra modalidade, a composição compreende uma alfa-amilase, uma isoamilase e a variante de glucoamilase de acordo com a invenção.

[00167] Em outro aspecto, a composição compreende a variante de

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 71/132 / 108 glucoamilase da invenção combinada com uma pululanase. Em outro aspecto, a composição compreende a variante de glucoamilase da invenção combinada com uma pululanase e uma isoamilase. Em outro aspecto, a composição compreende a variante de glucoamilase da invenção combinada com uma pululanase e uma alfa-amilase.

[00168] Em uma modalidade particular, a composição compreende adicionalmente uma protease.

[00169] Adicionalmente a uma variante de glucoamilase de acordo com a invenção, a composição pode compreender adicionalmente uma alfaamilase. Particularmente, a alfa-amilase é uma alfa-amilase fúngica ácida. Uma alfa-amilase estável ácida fúngica é uma alfa-amilase que tem atividade na gama de pH de 3,0 a 7,0 e, preferencialmente, na gama de pH de 3,5 a 6,5, incluindo atividade a um pH de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0.

[00170] Preferencialmente, a alfa-amilase fúngica ácida é derivada do gênero Aspergillus, especialmente uma estirpe de A. terreus, A. niger, A. oryzae, A. awamori, A. fumigatus ou Aspergillus kawachii ou do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhizomucor pusillus ou do gênero Meripilus, preferencialmente uma estirpe de Meripilus giganteus.

[00171] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada de uma estirpe do gênero Rhizomucor, preferencialmente uma estirpe de Rhizomucor pusillus, tal como aquela mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 2013/006756, tal como um híbrido de alfa-amilase de Rhizomucor pusillus tendo um ligante de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido, tal como aquele mostrado em SEQ ID NO: 5 aqui ou uma sua variante.

[00172] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo consistindo em:

(i) uma alfa-amilase compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5;

(ii) uma alfa-amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60%, pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 75%,

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62/108 pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

[00173] Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma variante da alfaamilase mostrada em SEQ ID NO: 5 que tem pelo menos uma das seguintes substituições ou combinações de substituições: D165M; Y141W; Y141R; K136F; K192R; P224A; P224R; S123H + Y141W; G20S + Y141W; A76G + Y141W; G128D + Y141W; G128D + D143N; P219C + Y141W; N142D + D143N; Y141W + K192R; Y141W + D143N; Y141W + N383R; Y141W + P219C + A265C; Y141W + N142D + D143N; Y141W + K192R + V410A; G128D + Y141W + D143N; Y141W + D143N + P219C; Y141W + D143N + K192R; G128D + D143N + K192R; Y141W + D143N + K192R + P219C; G128D + Y141W + D143N + K192R; ou G128D + Y141W + D143N + K192R + P219C (Usando SEQ ID NO: 5 para numeração).

[00174] Em uma modalidade, a alfa-amilase é derivada de um Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente divulgado como SEQ ID NO: 5, tendo preferencialmente uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, preferencialmente G128D + D143N (usando SEQ ID NO: 5 para numeração), e em que a variante de alfa-amilase tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 73/132 / 108 [00175] Em uma modalidade, a razão entre glucoamilase e alfa-amilase presente e/ou adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação pode estar preferencialmente na gama de 500:1 a 1:1, tal como de 250:1 a 1:1, tal como de 100:1 a 1: 1, tal como de 100: 2 a 100:50, tal como de 100:3 a 100:70.

[00176] As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00177] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais do polipeptídeo e composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

[00178] As composições acima são adequadas para uso em processos de liquefação, sacarificação e/ou fermentação, preferencialmente na conversão de amido, especialmente para produção de xarope e produtos de fermentação, tais como etanol.

[00179] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições de polipeptídeo da presente invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

Métodos de uso da variante de glucoamilase da invenção - Aplicações Industriais [00180] As variantes de glucoamilase da presente invenção possuem propriedades valiosas permitindo que uma variedade de aplicações industriais. Em particular, as variantes de glucoamilase podem ser usadas na produção de

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64/108 etanol e processos de conversão de amido.

[00181] As variantes de glucoamilase podem ser usadas para processos de amido, em particular, conversão de amido. São também contempladas composições para propósitos de conversão de amido, que podem para além da glucoamilase da invenção compreender também uma alfa-amilase, uma pululanase e/ou uma protease.

[00182] Adicionalmente, as glucoamilases da invenção são particularmente úteis na produção de adoçantes e etanol (ver, p.ex., Patente dos E.U.A. No. 5,231,017, que é deste modo incorporada por referência), tal como etanol combustível, potável e industrial, a partir de amido ou grãos inteiros.

[00183] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um uso da glucoamilase de acordo com a invenção para produção de um xarope e/ou produto de fermentação a partir de um material contendo amido. O material de amido pode em uma modalidade ser gelatinizado. Em outra modalidade, o material de amido não é gelatinizado.

Processamento de Amido [00184] O amido nativo consiste em grânulos microscópicos, que são insolúveis em água à temperatura ambiente. Quando a pasta fluida de amido aquosa é aquecida, os grânulos incham e eventualmente rompem, dispersando as moléculas de amido na solução. A temperaturas até cerca de 50°C a 75°C, o inchaço pode ser reversível. No entanto, com temperaturas mais elevadas começa um inchaço irreversível chamado “gelatinização”. Durante este processo de “gelatinização” existe um aumento dramático na viscosidade. O amido granular a ser processado pode ser uma qualidade de amido altamente refinada, preferencialmente, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5% puro ou pode ser um material contendo amido mais em bruto compreendendo grãos inteiros (p.ex., moídos) incluindo frações diferentes de amido tais como resíduos germinativos e fibras. A

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 75/132 / 108 matéria-prima, tal como grãos inteiros, pode ser reduzida no tamanho das partículas, p.ex., por moagem, de modo a abrir a estrutura e permitir processamento adicional. Na moagem a seco, os grãos inteiros são moídos e usados. A moagem a úmido dá uma boa separação de gérmen e farinha (grânulos de amido e proteína) e é frequentemente aplicada em localizações onde o hidrolisado de amido é usado na produção de, p.ex., xaropes. A moagem tanto a seco como a úmido é bem conhecida na técnica de processamento do amido e pode ser usada em um processo da invenção. Métodos para redução do tamanho das partículas do material contendo amido são conhecidos dos peritos na técnica.

[00185] Como o nível de sólidos é 30-40% em um processo industrial típico, o amido tem de ser diluído ou “liquefeito” tal que possa ser adequadamente processado. Esta redução na viscosidade é, principalmente, alcançada por degradação enzimática na prática comercial corrente.

[00186] A liquefação é levada a cabo na presença de uma alfa-amilase, preferencialmente uma alfa-amilase bacteriana e/ou alfa-amilase fúngica ácida. Em uma modalidade, uma fitase está também presente durante a liquefação. Em uma modalidade, enzimas redutoras da viscosidade tais como uma xilanase e/ou beta-glucanase estão também presentes durante a liquefação.

[00187] Durante a liquefação, o amido de cadeia longa é degradado em unidades mais curtas ramificadas e lineares (maltodextrinas) por uma alfaamilase. A liquefação pode ser levada a cabo como um processo de pasta fluida a quente em três passos. A pasta fluida é aquecida até entre 60-95°C (p.ex., 70-90°C, tal como 77-86°C, 80-85°C, 83-85°C) e uma alfa-amilase é adicionada para iniciar a liquefação (diluição).

[00188] A pasta fluida pode em uma modalidade ser cozida com jato a entre 95-140°C, p.ex., 105-125°C, durante cerca de 1-15 minutos, p.ex., cerca de 3-10 minutos, especialmente em tomo de 5 minutos. A pasta fluida é

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 76/132 / 108 depois resfriada até 60-95°C e mais alfa-amilase é adicionada para se obter a hidrólise final (liquefação secundária). O processo de cozimento com jato é levado a cabo a pH 4,5-6,5, tipicamente a um pH entre 5 e 6. A alfa-amilase pode ser adicionada como uma dose única, p.ex., antes do cozimento com jato.

[00189] O processo de liquefação é levado a cabo a entre 70-95°C, tal como 80-90°C, tal como em torno de 85°C, durante cerca de 10 minutos a 5 horas, tipicamente durante 1-2 horas. O pH é entre 4 e 7, tal como entre 5,5 e 6,2. De modo a assegurar estabilidade enzimática ótima sob estas condições, cálcio pode ser opcionalmente adicionado (para proporcionar 1-60 ppm de íons de cálcio livres, tal como cerca de 40 ppm de íons de cálcio livres). Após tal tratamento, o amido liquefeito terá tipicamente um “equivalente de dextrose” (DE) de 10-15.

[00190] Geralmente, a liquefação e condições de liquefação são bem conhecidas na técnica.

[00191] A sacarificação pode ser levada a cabo usando condições bem conhecidas na técnica com uma enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular uma glucoamilase, ou uma beta-amilase e opcionalmente uma enzima desramificadora, tal como uma isoamilase ou uma pululanase. Por exemplo, o passo de sacarificação completa pode durar de cerca de 24 a cerca de 72 horas. No entanto é comum fazer uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65°C, tipicamente cerca de 60°C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a uma temperatura na gama de 20-75°C, p.ex., 25-65°C e 4070°C, tipicamente em tomo de 60°C, e a um pH entre cerca de 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5.

[00192] Os passos de sacarificação e fermentação podem ser levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente. Em uma modalidade,

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 77/132 / 108 sacarificação e fermentação são realizadas simultaneamente (referidas como “SSF”). No entanto é comum realizar um passo de pré-sacarificação durante cerca de 30 minutos a 2 horas (p.ex., 30 a 90 minutos) a uma temperatura de 30 a 65°C, tipicamente em tomo de 60°C que é seguido por uma sacarificação completa durante a fermentação referido como sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O pH é usualmente entre 4,2-4,8, p.ex., pH 4,5. Em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), não existe etapa de retenção para a sacarificação, ao invés, a levedura e enzimas são adicionadas em conjunto.

[00193] Em um processo de sacarificação típico, as maltodextrinas produzidas durante a liquefação são convertidas em dextrose por adição de uma glucoamilase e opcionalmente uma enzima desramificadora, tal como uma isoamilase (Patente dos E.U.A. No. 4.335.208) ou uma pululanase. A temperatura é diminuída até 60°C, antes da adição da glucoamilase e enzima desramificadora. O processo de sacarificação procede durante 24-72 horas. Antes da adição das enzimas de sacarificação, o pH é reduzido até abaixo de 4,5, enquanto se mantém uma temperatura elevada (acima de 95°C), para inativar a alfa-amilase de liquefação. Este processo reduz a formação de oligossacarídeo curto chamado “precursores de panose”, que não podem ser hidrolisados apropriadamente pela enzima desramificadora. Normalmente, cerca de 0,2-0,5% do produto de sacarificação é a panose de trissacarídeo ramificada (Glc pal-6Glc pal-4Glc), que não pode ser degradada por uma pululanase. Se a amilase ativa da liquefação permanecer presente durante a sacarificação (z.e., sem desnaturação), a quantidade de panose pode ser tão elevada quanto 1-2%, o que é altamente indesejável uma vez que diminui o rendimento da sacarificação significativamente.

[00194] Outros produtos de fermentação podem ser fermentados a condições e temperaturas bem conhecidas dos peritos na técnica, adequadas para o organismo fermentador em questão.

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 78/132 / 108 [00195] O produto de fermentação pode ser recuperado por métodos bem conhecidos na técnica, p.ex., por destilação.

[00196] Em uma modalidade particular, o processo da invenção compreende adicionalmente, antes da conversão de um material contendo amido em açúcares/dextrinas, os passos de:

(x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido; e (y) formação de uma pasta fluida compreendendo o material contendo amido e água.

[00197] Em uma modalidade, o material contendo amido é moído para reduzir o tamanho das partículas. Em uma modalidade, o tamanho das partículas é reduzido até entre 0,05-3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm, ou tal que pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% do material contendo amido se encaixe através de um crivo com uma peneira de 0,05-3,0 mm, preferencialmente peneira de 0,1-0,5 mm.

[00198] A pasta fluida aquosa pode conter de 10-55% em peso de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% em peso de sólidos secos (DS), mais preferencialmente 30-40% em peso de sólidos secos (DS) de material contendo amido.

[00199] Processos de conversão de amido convencionais, tais como processos de liquefação e sacarificação, são descritos, p.ex., na Patente dos E.U.A. No. 3,912,590, EP 252730 e EP 063909, que são incorporadas aqui por referência.

[00200] Em uma modalidade, o processo de conversão degradando amido até componentes de carboidratos de peso molecular mais baixo tais como açúcares ou substituintes de gordura inclui um passo de desramificação. [00201] No caso de conversão de amido em um açúcar, o amido é despolimerizado. Um tal processo de despolimerização consiste em, p.ex., um passo de pré-tratamento e dois ou três processos de processo consecutivos,

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i.e., um processo de liquefação, um processo de sacarificação e, dependendo do produto final desejado, um processo de isomerização opcional.

[00202] Quando o produto de açúcar final desejado é, p.ex., xarope rico em frutose, o xarope de dextrose pode ser convertido em frutose. Após o processo de sacarificação, o pH é aumentado até um valor na gama de 6-8, p.ex., pH 7,5, e o cálcio é removido por permuta iônica. O xarope de dextrose é depois convertido em xarope rico em frutose usando, p.ex., uma glucose isomerase imobilizada.

Produção de Produtos de Fermentação [00203] Açúcares fermentáveis (p.ex., dextrinas, monossacarídeos, particularmente glucose) são produzidos a partir de sacarificação enzimática. Estes açúcares fermentáveis podem ser adicionalmente purificados e/ou convertidos em produtos de açúcar úteis. Adicionalmente, os açúcares podem ser usados como uma matéria-prima de fermentação em um processo de fermentação microbiana para produção de produtos finais, tais como álcool (p.ex., etanol e butanol), ácidos orgânicos (p.ex., ácido succínico, 3-HP e ácido láctico), álcoois de açúcar (p.ex., glicerol), intermediários de ácido ascórbico (p.ex., gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e ácido 2-ceto-L-gulônico), aminoácidos (p.ex., lisina), proteínas (p.ex., anticorpos e seus fragmentos).

[00204] Em uma modalidade, os açúcares fermentáveis obtidos durante os passos de processo de liquefação são usados para produzir álcool e particularmente etanol. Em produção de etanol é comumente usado um processo SSF em que as enzimas de sacarificação e organismos fermentadores (p.ex., levedura) são adicionados em conjunto e depois levados a cabo a uma temperatura de 30-40°C.

[00205] O organismo usado na fermentação dependerá do produto final desejado. Tipicamente, se etanol for o produto final desejado, será usada levedura como o organismo fermentador. Em algumas modalidades

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70/108 preferenciais, o microrganismo produtor de etanol é uma levedura e especificamente Saccharomyces tal como estirpes de S. cerevisiae (Patente dos E.U.A. No. 4,316,956). Uma variedade de S. cerevisiae está comercialmente disponível e estas incluem mas não estão limitadas a FALI (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialities), RED STAR (Lesaffre) e levedura de álcool Angel (Angel Yeast Company, China). A quantidade de levedura iniciadora empregue nos métodos é uma quantidade eficaz para produzir uma quantidade comercialmente significativa de etanol em uma quantidade de tempo adequado (p.ex., para produzir pelo menos 10% de etanol a partir de um substrato tendo entre 25-40% de DS em menos do que 72 horas). As células de levedura são, geralmente, fornecidas em quantidades de cerca de 10⁴ a cerca de 10¹² e, preferencialmente, de cerca de 10⁷ a cerca de IO¹⁰ contagens de leveduras viáveis por mL de caldo de fermentação. Após levedura ser adicionada à massa é tipicamente sujeita a fermentação durante cerca de 2496 horas, p.ex., 35-60 horas. A temperatura é entre cerca de 26-34°C, tipicamente a cerca de 32°C, e o pH é de pH 3-6, p.ex., em torno de pH 4-5. [00206] A fermentação pode incluir, adicionalmente a um microrganismo fermentador (p.ex., levedura), nutrientes e enzimas adicionais, incluindo fitases. O uso de levedura em fermentação é bem conhecido na técnica.

[00207] Em modalidades adicionais, o uso de microrganismos fermentadores apropriados, como é conhecido na técnica, pode resultar em produto final de fermentação incluindo, p.ex., glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto -D-gluconato, ácido 2-ceto-Lgulônico, ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos e seus derivados. Mais especificamente, quando o ácido láctico é o produto final desejado, uma Lactobacillus sp. (L. casei) pode ser usada; quando o glicerol ou 1,3propanodiol são os produtos finais desejados, E. coli pode ser usada; e,

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71/108 quando o 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e ácido 2-ceto-Lgulônico são os produtos finais desejados, Pantoea citrea pode ser usada como o microrganismo fermentador. A lista enumerada acima são somente exemplos e um perito na técnica estará ciente de um número de microrganismos fermentadores que podem ser usados para se obter um produto final desejado.

Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido não gelatinizado [00208] A invenção se relaciona também com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido sem gelatinização (z.e., sem cozimento) do material contendo amido (frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bruto”). O produto de fermentação, tal como etanol, pode ser produzido sem liquefazer a pasta fluida aquosa contendo o material contendo amido e água. Em uma modalidade, um processo da invenção inclui sacarificação de material contendo amido (p.ex., moído), p.ex., amido granular, abaixo da temperatura de gelatinização inicial, preferencialmente na presença de alfaamilase e/ou enzima(s) geradora(s) de fonte de carboidratos, p.ex., uma glucoamilase, para produzir açúcares que podem ser fermentados no produto de fermentação por um organismo fermentador adequado. Em esta modalidade, o produto de fermentação desejado, p.ex., etanol, é produzido a partir de grãos de cereal, não gelatinizados (z.e., não cozidos), preferencialmente moídos, tais como milho.

[00209] Conformemente, em um aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo sacarificação e fermentação simultâneas de material contendo amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos e um organismo fermentador a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido. A

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72/ 108 sacarificação e a fermentação podem ser também separadas. Assim, em outro aspecto, a invenção se relaciona com processos de produção de produtos de fermentação, compreendendo os seguintes passos:

(i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial; e (ii) fermentação usando um organismo fermentador;

em que o passo (i) é levado a cabo usando pelo menos uma variante de glucoamilase da invenção.

[00210] Em uma modalidade, uma alfa amilase é adicionada no passo (i). Em outra modalidade, os passos (i) e (ii) são realizados simultaneamente.

[00211] Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol e o organismo fermentador é uma levedura, particularmente uma Saccharomyces sp., mais particularmente uma Saccharomyces cerevisiae. Uma Saccharomyces cerevisiae pode em uma modalidade adicional expressar uma glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase de Gloeophyllum sp., mais preferencialmente uma glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, o mais preferencialmente a glucoamilase divulgada como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 aqui. Em uma modalidade particular, uma glucoamilase variante da invenção, particularmente GSA202, é adicionada/presente durante a sacarificação e a Saccharomyces cerevisiae está expressando a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2 ou uma glucoamilase tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 2.

[00212] Em uma modalidade, a protease está também presente. A protease pode ser qualquer protease fúngica ácida ou metaloprotease. O produto de fermentação, p.ex., etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, p.ex., por destilação. Tipicamente, amilase(s), tais como glucoamilase(s) e/ou outras enzimas geradas de fonte de carboidratos, e/ou alfa-amilase(s), está(estão) presente(s) durante a fermentação. Exemplos de glucoamilases e outras enzimas geradoras de fonte de carboidratos incluem

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 83/132 / 108 glucoamilases hidrolisantes de amido em bruto. Exemplos de alfa-amilase(s) incluem alfa-amilases ácidas tais como alfa-amilases fúngicas ácidas. Exemplos de organismos fermentadores incluem levedura, p.ex., uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae. Em uma modalidade preferencial, a levedura está expressando a variante de glucoamilase da invenção. O termo “temperatura de gelatinização inicial” significa a temperatura mais baixa à qual a gelatinização do amido começa. Em geral, o amido aquecido em água começa a gelatinizar entre cerca de 50°C e 75°C; a temperatura exata da gelatinização depende do amido específico e pode ser prontamente determinada pelo especialista. Assim, a temperatura de gelatinização inicial pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie de planta bem como com as condições de crescimento. No contexto desta invenção, a temperatura de gelatinização inicial de um dado material contendo amido pode ser determinada como a temperatura à qual a birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de amido usando o método descrito por Gorinstein e Lii, 1992, Starch/Stãrke 44 (12): 461-466. Antes do início do processo pode ser preparada uma pasta fluida de material contendo amido, tal como amido granular, tendo 10-55% p/p de sólidos secos (DS), preferencialmente 25-45% p/p de sólidos secos, mais preferencialmente 3040% p/p de sólidos secos de material contendo amido. A pasta fluida pode incluir água e/ou águas do processo, tais como vinhaça (contracorrente), água do purificador, condensado ou destilado do evaporador, água descarregada dos lados da destilação ou água do processo de outras instalações de produtos de fermentação. Porque o processo da invenção é levado a cabo abaixo da temperatura de gelatinização inicial e, logo, não tem lugar nenhum aumento significativo da viscosidade, se desejado, podem ser usados elevados níveis de vinhaça. Em uma modalidade, a pasta fluida aquosa contém de cerca de 1 a cerca de 70% por vol., preferencialmente 15-60% por vol., especialmente de cerca de 30 a 50% por vol. de água e/ou águas do processo, tais como vinhaça

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 84/132 / 108 (contracorrente), água do purificador, condensado ou destilado do evaporador, água descarregada dos lados da destilação ou água do processo de outras instalações de produtos de fermentação ou suas combinações ou similares. O material contendo amido pode ser preparado por redução do tamanho das partículas, preferencialmente por moagem a seco ou úmida, até 0,05 a 3,0 mm, preferencialmente 0,1-0,5 mm. Após ser sujeito a um processo da invenção, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou preferencialmente pelo menos 99% dos sólidos secos no material contendo amido são convertidos em um hidrolisado de amido solúvel. Um processo em este aspecto da invenção é conduzido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial, o que significa que a temperatura reside tipicamente na gama entre 30-75°C, preferencialmente entre 45-60°C. Em uma modalidade, o processo levado a uma temperatura de 25°C a 40°C, tal como de 28°C a 35°C, tal como de 30°C a 34°C, preferencialmente em tomo de 32°C. Em uma modalidade, o processo é levado a cabo tal que o nível de açúcar, tal como nível de glucose, seja mantido a um nível baixo, tal como abaixo de 6% p/p, tal como abaixo de cerca de 3% p/p, tal como abaixo 2% p/p, tal como abaixo de cerca de 1% p/p, tal como abaixo de cerca de 0,5% p/p ou abaixo de 0,25% p/p, tal como abaixo de cerca de 0,1% p/p. Tais níveis baixos de açúcar podem ser alcançados por emprego simples de quantidades ajustadas de enzima e organismo fermentador. Um perito na técnica pode facilmente determinar que doses/quantidades de enzima e organismo fermentador usar. As quantidades empregues de enzima e organismo fermentador podem ser também selecionadas para se manterem baixas concentrações de maltose no caldo de fermentação. Por exemplo, o nível de maltose pode ser mantido abaixo de cerca de 0,5% p/p, tal como abaixo de cerca de 0,2% p/p. O processo da

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 85/132 / 108 invenção pode ser levado a cabo a um pH de cerca de 3 a 7, preferencialmente de pH 3,5 a 6 ou, mais preferencialmente, de pH 4 a 5. Em uma modalidade, a fermentação dura durante 6 a 120 horas, em particular, 24 a 96 horas.

Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado [00213] Em este aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido, processo esse que inclui um passo de liquefação e passos de sacarificação e fermentação sequencialmente ou simultaneamente realizadas. Consequentemente, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de:

(a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfaamilase;

(b) sacarificação do material liquefeito obtido no passo (a);

(c) fermentação usando um organismo fermentador;

em que o passo (b) é levado a cabo na presença de uma glucoamilase da invenção.

[00214] Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol e o organismo fermentador é uma levedura, particularmente uma Saccharomyces sp., mais particularmente uma Saccharomyces cerevisiae. Uma Saccharomyces cerevisiae pode em uma modalidade adicional expressar uma glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase de Gloeophyllum sp., mais preferencialmente uma glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, o mais preferencialmente a glucoamilase divulgada como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 aqui. Em uma modalidade particular, uma glucoamilase variante da invenção, particularmente GSA202, é adicionada/presente durante a sacarificação e a Saccharomyces cerevisiae está expressando a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2 ou uma

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 86/132 / 108 glucoamilase tendo, pelo menos, 90% de identidade com SEQ ID NO: 2. [00215] Em uma modalidade, uma protease, tal como uma protease fúngica ácida ou uma metaloprotease, é adicionada antes da, durante a e/ou após a liquefação. Em uma modalidade, a metaloprotease é derivada de uma estirpe de Thermoascus, p.ex., uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC No. 0670. Em outra modalidade, a protease é uma protease bacteriana, particularmente uma protease derivada de uma estirpe de Pyrococcus, mais particularmente de Pyrococcus furiosus divulgada em US 6,358,726.

[00216] Uma glucoamilase pode ser adicionada. Em uma modalidade, a glucoamilase adicional derivada de uma estirpe de Aspergillus, p.ex., Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, uma estirpe de Talaromyces, especialmente Talaromyces emersonii; ou uma estirpe de Athelia, especialmente Athelia rolfsii; uma estirpe de Trametes, p.ex., Trametes cingulata; ou uma sua mistura. O passo de sacarificação (b) e o passo de fermentação (c) podem ser levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente. Uma pululanase e/ou protease podem ser adicionadas durante a sacarificação e/ou fermentação quando o processo é levado a cabo como um processo de sacarificação e fermentação sequenciais e antes da ou durante a fermentação quando os passos (b) e (c) são levados a cabo simultaneamente (processo SSF). A pululanase e/ou protease podem ser também vantajosamente adicionadas antes da liquefação (tratamento préliquefação), i.e., antes do ou durante o passo (a) e/ou após a liquefação (tratamento pós-liquefação), i.e., após o passo (a). A pululanase é o mais vantajosamente adicionada antes da ou durante a liquefação, i.e., antes do ou durante o passo (a). O produto de fermentação, tal como especialmente etanol, pode ser opcionalmente recuperado após fermentação, p.ex., por destilação. O organismo fermentador é preferencialmente levedura, preferencialmente uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae. Em uma modalidade preferencial, a

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 87/132 / 108 levedura está expressando a variante de glucoamilase da invenção. Em uma modalidade particular, o processo da invenção compreende adicionalmente, antes do passo (a), os passos de:

x) redução do tamanho das partículas do material contendo amido, preferencialmente por moagem (p.ex., usando um moinho de martelos);

y) formação de uma pasta fluida compreendendo o material contendo amido e água.

[00217] Em uma modalidade, o tamanho das partículas é mais pequeno do que uma peneira # 7, p.ex., uma peneira # 6. Uma peneira # 7 é usualmente usada em processos da técnica prévia convencionais. A pasta fluida aquosa pode conter de 10-55, p.ex., 25-45 e 30-40, % p/p de sólidos secos (DS) de material contendo amido. A pasta fluida é aquecida até acima da temperatura de gelatinização e uma variante de alfa-amilase pode ser adicionada para iniciar a liquefação (diluição). A pasta fluida pode em uma modalidade ser cozida a jato para gelatinizar adicionalmente a pasta fluida antes de ser sujeita a alfa-amilase no passo (a). A liquefação pode em uma modalidade ser levada a cabo como um processo de pasta fluida quente em três passos. A pasta fluida é aquecida até entre 60-95°C, preferencialmente, entre 70-90°C, tal como preferencialmente entre 80-85°C a um pH 4-6, preferencialmente 4,55,5, e variante de alfa-amilase, opcionalmente em conjunto com uma pululanase e/ou protease, preferencialmente metaloprotease, são adicionadas para iniciar a liquefação (diluição). Em uma modalidade, a pasta fluida pode ser depois cozida com jato a uma temperatura entre 95-140°C, preferencialmente 100-135°C, tal como 105-125°C, durante cerca de 1-15 minutos, preferencialmente durante cerca de 3-10 minutos, especialmente em tomo de cerca de 5 minutos. A pasta fluida é resfriada até 60-95°C e mais alfa-amilase e opcionalmente pululanase e/ou protease, preferencialmente metaloprotease, é(são) adicionada(s) para finalizar a hidrolise (liquefação

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 88/132 / 108 secundária). O processo de liquefação é usualmente levado a cabo a pH 4,0-6, em particular, a um pH de 4,5 a 5,5. O passo de sacarificação (b) pode ser levado a cabo usando condições bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um passo de sacarificação completa pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas, no entanto, é comum fazer somente uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65°C, tipicamente cerca de 60°C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (processo SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a temperaturas de 20-75°C, preferencialmente de 40-70°C, tipicamente em tomo de 60°C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5. O processo mais amplamente usado para produzir um produto de fermentação, especialmente etanol, é um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), no qual não existe etapa de retenção para a sacarificação, significando que um organismo fermentador, tal como levedura, e enzima(s), podem ser adicionados em conjunto. O SSF pode ser tipicamente levado a cabo a uma temperatura de 25°C a 40°C, tal como de 28°C a 35°C, tal como de 30°C a 34°C, preferencialmente em tomo de cerca de 32°C. Em uma modalidade, a fermentação dura durante 6 a 120 horas, em particular, 24 a 96 horas. Materiais Contendo Amido [00218] Qualquer material de partida contendo amido adequado pode ser usado em um processo da presente invenção. O material de partida é, geralmente, selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de materiais de partida contendo amido, adequados para uso nos processos da presente invenção, incluem cevada, feijões, mandioca, cereais, milho, sorgo, ervilhas, batatas, arroz, centeio, sagu, milho-zaburro, batatasdoces, tapioca, trigo e grãos inteiros, ou qualquer sua mistura. O material contendo amido pode ser também um tipo ceroso ou não ceroso de milho e cevada. Em uma modalidade, o material contendo amido é milho. Em uma

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 89/132 / 108 modalidade, o material contendo amido é trigo.

Produtos de Fermentação [00219] O termo “produto de fermentação” significa um produto produzido por um método ou processo incluindo fermentação usando um organismo fermentador. Os produtos de fermentação incluem álcoois (p.ex., etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (p.ex., ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucônico); cetonas (p.ex., acetona); aminoácidos (p.ex., ácido glutâmico); gases (p.ex., H2 e CO2); antibióticos (p.ex., penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (p.ex., riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol, p.ex., etanol combustível; etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (p.ex., cerveja e vinho), indústria dos lacticínios (p.ex., produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Em uma modalidade, o produto de fermentação é etanol.

[00220] A invenção é adicionalmente divulgada nos seguintes parágrafos numerados:

[1]. Uma variante de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1-454 de SEQ ID NO: 2 ou 1-454 de SEQ ID NO: 4, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-462 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 463-556 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende

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80/108 adicionalmente uma substituição em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N539R+

I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ T116R+ N539R+ 1541Y+ T543V+

A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+

I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+

S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+

N527M+ T(V)549W+ N503R;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N539R+ 1541Y+

T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ Q318Y+ S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+

N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ G120S+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+

N527M T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+

S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ N539R+ 1541Y+ T543V+

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A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+

N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W + A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+

N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

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	V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+
T549W;	T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W; S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+
T(V)549W;	V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+
T(V)549W;	T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+
T549W;	V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A518K+
T549W;	S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W; S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W; S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W; S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W; S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W; V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+
T549W;	T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W; S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+
T(V)549W;	S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+
T(V)549W;	V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

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S95P+ A121P+ Y295W+ S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ A271F+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540K;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540R;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SGGC+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

[00221] [2]. A variante de glucoamilase do parágrafo 1, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1-454 de SEQ ID NO: 2, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

S95P+ A121P+ Y295W+ T116R+ N539R+ 1541Y+ T543V+

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A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ G120S+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+

N527M T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ N539R+ 1541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 30%, pelo menos 35%, tal

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 95/132 / 108 como pelo menos 40%.

[00222] [3]. A variante de glucoamilase do parágrafo 2, compreendendo adicionalmente as substituições G456S + P461S + E472Q + L481I + E489S + A493P + E520Q.

[00223] [4]. A variante de glucoamilase do parágrafo 1, em que a variante é derivada da glucoamilase de SEQ ID NO: 2, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W + A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 96/132 / 108

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y + A518K+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W; V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ A271F+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540K;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540R;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é, pelo menos, 5%.

[00224] [5]. A variante de glucoamilase do parágrafo 4, em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+

N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 97/132 / 108

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A518K+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W; S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é, pelo menos, 20%.

[00225] [6]. A variante de glucoamilase do parágrafo 1, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1-454 de SEQ ID NO: 2, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende uma substituição em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em:

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 98/132 / 108

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W + S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV + G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SGGC+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+ N539R+ I541Y+

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 99/132 / 108

T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é, pelo menos, 2%.

[00226] [7]. A variante de glucoamilase do parágrafo 6, em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 100/132

90/108

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

[00227] [8]. Uma variante de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante compreende as modificações selecionadas de:

[00228] [9]. Uma variante de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 4, em que a variante compreende as modificações de introdução das seguintes substituições e inserções: N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A usando

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 101/132 / 108

SEQ ID NO: 2 para numeração; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 4 é pelo menos 15%.

[00229] [10]. Uma variante de glucoamilase, tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante compreende as modificações selecionadas de:

[00230] [11]. A variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 8-10, compreendendo adicionalmente qualquer uma das substituições:

[00231] V18M, T43K, T116R, A271F, Y295W, Q318Y;

[00232] [12]. A variante de glucoamilase do parágrafo 11, compreendendo adicionalmente S95P + A121P.

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 102/132

92/108 [00233] [13]. A variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-12, em que o número de substituições ou inserções é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições ou inserções.

[00234] [14]. Um método para aumento da atividade de hidrólise de amido em bruto de uma glucoamilase compreendendo os passos:

(a) proporcionar uma glucoamilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos consistindo nos aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 455-462 de SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e uma terceira sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 463-556 de SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (b) introdução de uma combinação de substituições selecionadas de, pelo menos, uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro de: V18M, T43K, N112L, T116R, A117Q, G120S, A271F, Y295W, Q318Y; e/ou (c) Introdução de pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro, substituições selecionadas do grupo: S458C, S458SCGG, S458SGGC, A493V, A518K, E520Q, N527M, S540K,R, S(G)546P, T(V)549W, N503R, N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A.

[00235] [15]. O método do parágrafo 14, compreendendo adicionalmente introdução das substituições S95P + A121P.

[00236] [16]. Um método para aumento da atividade de hidrólise de amido em bruto de uma glucoamilase compreendendo os passos:

(a) proporcionar uma glucoamilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos consistindo nos aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência de aminoácidos

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 103/132 / 108 selecionada dos aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e uma terceira sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (b) introdução de uma combinação de substituições selecionadas de pelo menos uma de: V18M, T43K, T116R, G120S, Y295W, Q318Y;e/ou (c) introdução de uma de 3 opções: i) N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A; ii) N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

[00237] [17]. O método do parágrafo 16, compreendendo adicionalmente introdução das substituições S95P + A121P.

[00238] [18]. Uma composição compreendendo a variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-13.

[00239] [19]. Um uso de uma variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-13 para produção de xarope e/ou um produto de fermentação.

[00240] [20]. Um processo de produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo os passos de:

(a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa amilase;

em que o passo (b) é levado a cabo usando, pelo menos, uma variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-13.

[00241] [21]. O processo do parágrafo 20, em que o passo (b) e o passo (c) são levados a cabo simultaneamente.

[00242] [22]. Um processo de produção de um produto de fermentação

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 104/132

94/108 a partir de material contendo amido, compreendendo os passos de:

(a) sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido; e (b) fermentação com um organismo fermentador, em que o passo (a) é levado a cabo usando, pelo menos, uma variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-13.

[00243] [23]. Um processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, compreendendo o passo de:

(a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa amilase;

(b) sacarificação do material liquefeito na presença de uma variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-13.

[00244] [24]. O processo de qualquer um dos parágrafos 20-22, em que o produto de fermentação é etanol.

[00245] [25]. O processo do parágrafo 24, em que a glucoamilase variante presente no passo de sacarificação é selecionada de uma variante de glucoamilase tendo atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada da glucoamilase de SEQ ID NO: 2, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas de: V18M + T43K + S95P + A121P + Q318Y + A518K + N527M + T549W; em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 105/132 / 108 pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, particularmente pelo menos 20%.

[00246] [26]. O processo de qualquer um dos parágrafos 20-22 e 24-

25, em que o organismo fermentador é selecionado de uma levedura, particularmente uma Saccharomyces, mais particularmente uma Saccharomyces cerevisiae.

[00247] [27]. O processo do parágrafo 26, em que a levedura expressa uma glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase de Gloeophyllum sp., mais preferencialmente uma glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, o mais preferencialmente a glucoamilase divulgada como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou uma glucoamilase tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

[00248] [28]. Um processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido, compreendendo o passo de sacarificação do material contendo amido na presença de uma variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-13, a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do material contendo amido.

[00249] [29]. Um polinucleotídeo codificando a variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-13.

[00250] [30]. Um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 29.

[00251] [31]. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 29.

[00252] [32]. Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 29, o construto de ácido nucleico do parágrafo 30 ou o vetor de expressão do parágrafo 31.

[00253] [33]. A célula hospedeira do parágrafo 32, em que a célula hospedeira é uma célula de levedura, particularmente uma Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae.

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 106/132 / 108 [00254] [34]. O processo de qualquer um dos parágrafos 20-22 e 24, em que a célula hospedeira do parágrafo 32 ou 33 é aplicada no passo de fermentação.

[00255] [35]. O processo de qualquer um dos parágrafos 20-22, em que uma alfa-amilase ácida fúngica está presente durante passo o passo de sacarificação.

[00256] [36]. O processo do parágrafo 35, em que a levedura expressa a alfa-amilase ácida fúngica.

[00257] [37]. O processo do parágrafo 35 ou 36, em que a alfa-amilase ácida fúngica é derivada de Rhizomucor ou Aspergillus, particularmente Rhizomucor pusillus, Aspergillus terreus ou Aspergillus fumigatus, particularmente a alfa-amilase selecionada de uma alfa-amilase derivada de Rhizomucor pusillus com um ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD), preferencialmente divulgado como SEQ ID NO: 5, tendo preferencialmente uma ou mais das seguintes substituições: G128D, D143N, preferencialmente G128D + D143N (usando SEQ ID NO: 5 para numeração), e em que a variante de alfa-amilase tem, pelo menos, 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100% de identidade com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5.

[00258] [38]. Um método de produção de uma variante de glucoamilase de qualquer um dos parágrafos 1-13, compreendendo:

(a) cultura da célula hospedeira do parágrafo 28 sob condições adequadas para expressão da variante; e

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 107/132 / 108 (b) recuperação opcional da variante.

A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos. EXEMPLOS

Ensaios para determinação da atividade de glucoamilase

Atividade de glucoamilase (AGU) [00259] A Unidade de Glucoamilase (AGU) é definida como a quantidade de enzima, que hidrolisa 1 micromole de maltose por minuto sob as condições padrão (37°C, pH 4,3, substrato: maltose a 100 mM, tampão: acetato a 0,1 M, tempo de reação 6 minutos como apresentado na incubação de glucoamilase em baixo), gerando deste modo glucose.

incubação de glucoamilase:
Substrato:	maltose a 100 mM
Tampão:	acetato a 0,1 M
pH:	4,30 ± 0,05
Temperatura de incubação:	37°C ± 1
Tempo de reação:	6 minutos
Gama de trabalho de enzimas:	0,5-4,0 AGU/mL

[00260] O princípio da análise é descrito por 3 passos de reação:

[00261] O passo 1 é uma reação enzimática:

[00262] A glucoamilase (AMG), EC 3.2.1.3 (exo-alfa-l,4-glucanagluco-hidrolase) hidrolisa maltose para formar alfa-D-glucose. Após incubação, a reação é parada com NaOH.

[00263] Os passos 2 e 3 resultam em uma reação de ponto final:

[00264] A glucose é fosforilada por ATP, em uma reação catalisada por hexocinase. A glucose-6-fosfato formada é oxidada em 6-fosfogluconato por glucose-6-fosfato desidrogenase. Em esta mesma reação, uma quantidade equimolar de NAD⁺ é reduzida em NADH com um aumento resultante na absorbância a 340 nm. Pode ser usado um sistema autoanalisador tal como

Analisador Konelab 30 (Thermo Fisher Scientific).

Reação de cor
Tris	aprox. 35 mM
ATP	0,7 mM
NAD⁺	0,7 mM
Mg²⁺	1,8 mM
Hexocinase	> 850 U/L
Glucose-6-P-DH	> 850 U/L

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PH	aprox. 7.8
Temperatura	37,0°C ± l,0°C
Tempo de reação	420 s
Comprimento de onda	340 nm

Reagentes para protocolos de ensaio:

[00265] Um estoque de tampão de acetato de sódio a 1 M foi preparado por dissolução de 44,4 g de acetato de sódio tri-hidratado (no. de cat. da Merck 61751805001730) e 37,5 mL de ácido acético (no. de cat. da Fisher 11007) em água Milli Q. O pH foi ajustado até 4,3 e o volume final do tampão foi constituído até 1000 mL. Este estoque de tampão foi armazenado a 4°C até ao uso. Uma solução de trabalho a 100 mM foi preparada por adição de 100 mL de estoque a 1 M a 900 mL de água Milli Q.

[00266] Uma solução de substrato de 4-nitrofenil-a-Dglucopiranosídeo (pNPG) a 0,1% foi recém-preparada por dissolução de 100 mg de 4-nitrofenil-a-D-glucopiranosídeo (no. de cat. da Sigma NI377) em 100 mL de tampão de acetato de sódio a 100 mM (pH 4,3).

[00267] Um estoque de Bórax a 0,1 M (tetraborato dissódico) foi preparado por dissolução de 38,1 g de bórax (no. de cat. da Fisher 27965) em 1000 mL de água Milli Q. Esta solução de paragem foi armazenada à temperatura ambiente até ao uso.

[00268] Uma solução de substrato de maltose a 1% foi recémpreparada por dissolução de 1 g de maltose (no. de cat. da Sigma M5885) em 100 mL de tampão de acetato de sódio a 100 mM (pH 4,3).

[00269] Um estoque de solução de acarbose a 1000 μΜ foi preparado por dissolução de 64,6 mg de acarbose (no. de cat. da Sigma A8980) em 100 mL de água Milli Q. Este estoque foi armazenado a 4°C até ao uso. Uma solução de trabalho a 5,6 μΜ foi preparada por adição de 336 pL de estoque a 1000 μΜ a 59,66 mL de água Milli Q.

Determinação da Atividade específica (SA):

[00270] O método de ensaio de acarbose foi usado para a determinação da atividade específica nos sobrenadantes de cultura. Este método usa uma

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 109/132 / 108 concentração conhecida de acarbose resultando em 50% de inibição da atividade de proteína. Os sobrenadantes de cultura foram normalizados quanto à sua atividade com base em um cálculo da atividade de Amiloglucosidase Relativa (RAG) e a inibição por concentração conhecida de acarbose foi determinada. A atividade residual resultante é depois usada para cálculo da atividade específica de amiloglucosidase em sobrenadantes de cultura. A atividade específica foi calculada usando a seguinte equação:

Vsa = Vm x (l-Va/Vdw)

Vm = A505 de uma variante de substrato de maltose

Va = A400 de uma variante com acarbose

Vdw = A400 de uma variante sem acarbose

Atividade de glucoamilase específica (SA) [00271] A atividade específica da proteína purificada foi determinada por ensaio AGU determinado por instrumento Konelab.

Atividade de Alfa-Amilase Ácida [00272] Quando usada de acordo com a presente invenção, a atividade de uma alfa-amilase ácida pode ser medida em AFAU (Unidades de Alfaamilase Fúngica Ácida) ou FAU-F.

Atividade de alfa-amilase ácida (AFAU) [00273] A atividade de alfa-amilase ácida pode ser medida em AFAU (Unidades de Alfa-amilase Fúngica Ácida), que são determinadas relativamente a um padrão enzimático. 1 AFAU é definido como a quantidade de enzima que degrada 5,260 mg de matéria seca de amido por hora sob as condições padrão mencionadas em baixo.

[00274] A alfa-amilase ácida, uma endo-alfa-amilase (1,4-alfa-Dglucana-glucano-hidrolase, E.C. 3.2.1.1), hidrolisa ligações alfa-1,4glucosídicas nas regiões internas da molécula de amido para formar dextrinas e oligossacarídeos com diferentes comprimentos de cadeia. A intensidade da cor formada com iodo é diretamente proporcional à concentração de amido. A

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100 / 108 atividade de amilase é determinada usando colorimetria reversa como uma redução na concentração de amido sob as condições analíticas especificadas.

AMIEO

IODO

Λ = 590 íiffi

ALá'A—amilase

---ς-----> DEXTRINAS + OLIGOSSACARIDEOS azul/violeta t = 23 seg. descoloração

Condições padrão/condições de reação:

Substrato:	Amido solúvel, aprox. 0,17 g/L
Tampão:	Citrato, aprox. 0,03 M
Iodo (I₂):	0,03 g/L
CaCl₂:	1,85 mM
pH:	2,50 ± 0,05
Temperatura de incubação:	40 °C
Tempo de reação:	23 segundos
Comprimento de onda:	590 nm
Concentração de enzima:	0,025 AFAU/mL
Gama de trabalho de enzimas:	0,01-0,04 AFAU/mL

[00275] Uma pasta EB-SM-0259.02/01 descrevendo este método analítico em mais detalhe está disponível mediante pedido à Novozymes A/S, Dinamarca, pasta essa que é deste modo incluída por referência.

Determinação de FAU-F [00276] FAU-F Unidades de Alfa-Amilase Fúngica (Fungamyl) é medida em relação a um padrão enzimático de uma força declarada.

Condições de reação
Temperatura	37°C
pH	7,15
Comprimento de onda	405 nm
Tempo de reação	5 min
Tempo de medição	2 min

[00277] Uma pasta (EB-SM-0216.02) descrevendo este método padrão em mais detalhe está disponível mediante pedido à Novozymes A/S, Dinamarca, pasta essa que é deste modo incluída por referência.

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Enzimas e combinações de enzimas [00278] Protease PfuS: Protease derivada de Pyrococcus furiosus mostrada em SEQ ID NO: 7.

[00279] Alfa-Amilase BE369 (AA369): Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus divulgada aqui como SEQ ID NO: 8 e adicionalmente tendo as mutações: 1181* +G182* + N193F + V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V truncada até 491 aminoácidos (usando SEQ ID NO: 8 para numeração).

[00280] Combinação de alfa-amilases A: Combinação compreendendo Alfa-amilase AA369 e protease PfuS (dosagem: 2,1 pg de EP/g de DS de AA369, 3,0 μg de EP/g de DS de PfuS, onde EP é proteína enzimática e DS é sólidos secos totais).

[00281] Alfa-amilase B: Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus divulgada aqui como SEQ ID NO: 8 e adicionalmente tendo as mutações: 1181* + G182* + N193F.

EXEMPLO 1. Variantes de acordo com a invenção tendo hidrólise de amido em bruto melhorada [00282] O desempenho de degradação de amido em bruto das variantes foi medido por liberação de glucose a partir de amido granular em combinação com uma alfa amilase fúngica divulgada aqui como SEQ ID NO: 6. A glucoamilase purificada foi diluída até 12,5 pg/mL por tampão de acetato a 50 mM (pH 4,0). Trinta microlitros de solução de enzima foram transferidos para poços de placa com poços profundos de 2,0 mL, e 270 pL de solução de substrato (amido em bruto a 0,2% disperso em tampão de acetato a 50 mM pH 4,0, CaCE a 1 mM, alfa amilase fúngica a 0,16 pg/mL divulgada aqui como SEQ ID NO: 6) foram adicionados para iniciar a reação. A solução de substrato foi agitada até imediatamente antes de ter sido adicionada. Após incubação a 32°C durante 120 min com agitação a 1200 rpm, amostras foram centrifugadas para agitar o grânulo de amido residual e a concentração de

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102 / 108 glucose de sobrenadante foi medida por mistura de alíquota de 20 uL com 200 uL de solução de detecção de glucose com base no método de glucose oxidase-peroxidase comercial (teste de Glucose C2, Wako Chemical. Co) na qual acarbose como um inibidor de glucoamilase havia sido dissolvida até 0,5 mM antes do uso. A absorvância a 505 nm foi medida e o desempenho relativo foi calculado.

Variantes da invenção

GSA	SA	RSH	RSH /mal	ligante	SBD	Mutação no núcleo	Mutação em SBD
GSA213	7,5	1,80	1,52	Gt	Gt	V18M, T43K, S95P, T116R, A121P, Q318Y	S(G)546P, alça2
GSA170	6,6	1,77	1,80	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W, T116R	S(G)546P, alça2
GSA168	7,2	1,68	1,67	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W, Q318Y	S(G)546P, alça2
GSA177	6,6	1,64	1,60	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, G120S, A121P, Y295W, Q318Y	alça2
GSA215	7,2	1,64	1,41	Gt	Gt	V18M, T43K, S95P, T116R, A121P, Q318Y	G459C, N527M, T(V)549W
GSA216	7,4	1,62	1,33	Gt	Gt	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	G459C, N527M, T(V)549W, N503 R
GSA212	7,9	1,62	1,32	Gt	Gt	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	S(G)546P, alça2
GSA175	7,3	1,61	1,47	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W, Q318Y	G459C, N527M, T(V)549W
GSA169	6,1	1,60	1,64	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W, G120S	S(G)546P, alça2
GSA214	7,5	1,59	1,34	Gt	Gt	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	G459C, N527M, T(V)549W
GSA165	6,2	1,58	1,53	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	S(G)546P, alça2
GSA167	7,1	1,56	1,52	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W, Q318Y	alça2
GSA138	6,2	1,53	1,65	Gt	Gt	S95P, T116R, A121P, Y295W	alça2
GSA201	7,2	1,47	1,27	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W, Q318Y	N527M, T(V)549W, N503R
GSA050	6,2	1,43	1,56	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	alça2
GSA233	6,9	1,43	1,28	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, A121P	A518K, N527M, T549W
GSA176	6,6	1,41	1,43	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, G120S, A121P, Y295W, Q318Y	A518K, N527M, T(V)549W
GSA188	7,4	1,41	1,19	Gs	Gs	Γ43Κ, S95P, A121P, Q318Y	A493V, A518K, N527M, T549W
GSA141	5,7	1,40	1,58	Gt	Gt	S95P, G120S, A121P, Y295W	alça2
GSA234	6,7	1,40	1,30	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, A121P, Y295W	A518K, N527M, T549W
GSA112	7,4	1,39	1,19	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W, Q318Y	N527M, T(V)549W
GSA198	7,5	1,39	1,13	Gs	Gs	Γ43Κ, S95P, A121P, Q318Y	N527M, T549W
GSA204	8,0	1,39	1,11	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	N527M, T549W
GSA100	6,2	1,36	1,49	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W, T116R	N527M, T(V)549W
GSA222	7,4	1,36	1,16	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, T116R, A121P, Q318Y	A493V, N527M, T549W
GSA205	7,9	1,36	1,04	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	A493V, N527M, T549W

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103 / 108

GSA166	7,0	1,35	1,44	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W, Q318Y	A518K, N527M, T(V)549W
GSA103	6,4	1,35	1,40	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W, A117Q	N527M, T(V)549W
GSA203	7,9	1,35	1,01	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	A493V, A518K, N527M, T549W
GSA186	7,6	1,34	1,15	Gs	Gs	Γ43Κ, S95P, A121P, Q318Y	A518K, N527M, T549W
GSA221	7,2	1,34	1,14	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, T116R, A121P, Q318Y	N527M, T549W
GSA199	7,5	1,34	1,09	Gs	Gs	Γ43Κ, S95P, A121P, Q318Y	A493V, N527M, T549W
GSA139	6,0	1,33	1,52	Gt	Gt	S95P, T116R, A121P, Y295W	A518K, N527M, T(V)549W
GSA219	7,7	1,33	1,10	Gt	Gt	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	A518K, T(V)549W
GSA182	7,2	1,32	1,12	Gs	Gs	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W, Q318Y	A518K, N527M, T549W
GSA220	7,0	1,31	1,17	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, T116R, A121P, Q318Y	A518K, T549W
GSA111	7,8	1,30	1,56	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W, Q318Y	N527M, T(V)549W
GSA102	6,2	1,28	1,36	Gt	Gt	S95P, G120S, A121P, Y295W	N527M, T(V)549W
GSA164	6,3	1,28	1,34	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	A518K, N527M, T(V)549W
GSA048	6,7	1,28	1,30	Gs	Gt	S95P, A121P, Y295W	N527M, T(V)549W
GSA099	6,9	1,28	1,25	Gt	Gt	S95P, N112L, A121P, Y295W	N527M, T(V)549W
GSA047	7,0	1,27	1,22	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	N527M, T(V)549W
GSA202	7,8	1,27	1,04	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	A518K, N527M, T549W
GSA196	7,2	1,26	1,09	Gs	Gs	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W, Q318Y	N527M, T549W
GSA142	5,8	1,25	1,44	Gt	Gt	S95P, G120S, A121P, Y295W	A518K, N527M, T(V)549W
GSA136	6,3	1,24	1,26	Gt	Gt	S95P, N112L, A121P, Y295W	A518K, N527M, T(V)549W
GSA218	7,6	1,24	1,04	Gs	Gs	V18M, T43K, S95P, A121P, Q318Y	A518K, T549W
GSA163	6,4	1,23	1,28	Gs	Gs	S95P, A121P, Y295W	A493V, A518K, E520Q, T549W
GSA183	6,2	1,22	1,27	Gs	Gs	S95P, A121P, Y295W	A518K, N527M, T549W
GSA051	6,4	1,22	1,26	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	A518K, T(V)549W
GSA046	6,9	1,21	1,24	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	A518K, N527M
GSA114	6,4	1,21	1,16	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	S458C, alça2
GSA197	6,4	1,17	1,19	Gs	Gs	S95P, A121P, Y295W	N527M, T549W
GSA049	7,1	1,16	1,11	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W
GSA081	6,5	1,09	1,14	Gs	Gs	S95P, A121P, A271F, Y295W	A518K, N527M, T549W
GSA131	6,5	1,08	1,09	Gs	Gs	S95P, A121P, Y295W	A493V
GSA132	6,4	1,06	1,04	Gs	Gs	S95P, A121P, Y295W	S540K
GSA133	6,6	1,05	1,07	Gs	Gs	S95P, A121P, Y295W	S540R
GSA078	6,6	1,05	1,05	Gs	Gs	S95P, A121P, Y295W	A518K, N527M
GSA117	6,5	1,04	1,16	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	G461C, alça2
GSA110	6,3	1,03	0,99	Gt	Gt	Γ43Κ, S95P, A121P, Y295W	N527M, T(V)549W
GSA115	6,4	1,02	1,09	Gt	Gt	S95P, A121P, Y295W	G459C, alça2

alça2 = N539R + I541Y + T543V + A545S + S546GCGV + G547S + S548T + T549A usando SEQ ID NO: 2 para numeração.

Exemplo 2: Avaliação do desempenho de Sacarificação e Fermentação Simultâneas (SSF) da variante GSA202 em combinação com uma levedura expressando glucoamilase

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104 / 108 [00283] Combinações de enzimas compreendendo glucoamilases da técnica prévia (glucoamilases de Talaromyces emersonii, T-AMG (SEQ ID NO: 9) e de Trametes cingulata, Tc-AMG (SEQ ID NO: 10), em combinações com uma alfa-amilase fúngica ácida denotada PE096 (SEQ ID NO: 6), foram usadas como as combinações de referência para avaliar o desempenho das combinações de enzimas similares contendo a variante de glucoamilase GSA202. Uma vez que GSA202 possui atividade de hidrólise de amido em bruto mais elevada do que as combinações de referência contendo tanto T-AMG como Tc-AMG, somente 40% de PE096 foi suplementada (uma redução de 60%) com GSA202. As combinações de enzimas e razões foram como mostradas na tabela em baixo. Em todas as combinações de referência contendo duas glucoamilases, da dose total de 0,36 AGU/g de DS, 0,290 AGU/g de DS foram derivadas de T-AMG e as outras 0,0670 AGU/g de DS foram derivadas de Tc-AMG. GSA202 é uma variante de glucoamilase de acordo com a invenção com base em SEQ ID NO: 2 aqui tendo as substituições como divulgado no Exemplo 1. A alfa-amilase PE096 é uma alfa-amilase de Rhizomucor pusillus variante com ligante de glucoamilase de Aspergillus niger e domínio de ligação ao amido (SBD) e é divulgada em SEQ ID NO: 6.

Z AGU X

Dc.se de '3A total ( ·)χ de (g) x conteúdos de sólidos secos (%DS)xlOOQ , _T · z

Tabela 1: Tratamento enzimático em SSF de duas pastas vegetais industriais

Combinação de enzimas	Glucoamilase (GA)	Dose de GA Total (AGU/g de DS)	Alfa-amilase	Dose (FAU-F/g de DS)
1	T-AMG + Tc-AMG	0,36	PE096	0,0057
2	GSA202	0,36	PE096	0,00225
3	T-AMG + Tc-AMG	0,36	PE096	0,0171
4	GSA202	0,36	PE096	0,00675

[00284] Estas 4 combinações foram avaliadas em um SFF usando duas pastas vegetais de milho industriais liquefeitas representando tanto a combinação de Alfa-amilase A (Pasta 1) tanto Alfa-amilase B (Pasta 2). Estas pastas foram suplementadas com 3 ppm de penicilina. A quantidade de ureia

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105 / 108 adicionada à Pasta 1 e Pasta 2 foi 400 ppm e 1000 ppm, respectivamente. Ambas as pastas vegetais foram ajustadas até pH 5,1 usando H2SO4 a 40% antes da distribuição da pasta em frascos. Aproximadamente 55 g (55 ± 0,03) de pasta foram adicionados a cada frasco Erlenmeyer Descartável Corning de 125 mL que tinha um buraco de 0,048 na tampa para ventilação. Cada frasco foi doseado com enzimas de acordo com a Tabela 1 e levedura expressando glucoamilase à dose de 5 x 10⁶ células/g de DS. A levedura expressando glucoamilase expressa a glucoamilase de tipo selvagem divulgada aqui como SEQ ID NO: 2 e é similar à estirpe de levedura descrita em similar a yMHCT471 como descrito em PCT/US2017/063159. Água foi adicionada a cada frasco tal que o volume adicional total de enzimas e água foi igual ao longo de cada amostra em cada tipo de pasta. Para se preparar a levedura antes da dosagem, 150 uL de cultura de estoque de glicerol foram inoculados em 50 mL de meio YPD a 6% (extrato de levedura a 1% (p/v), peptona a 2% (p/v) e dextrose a 6% (p/v)) em um frasco Erlenmeyer de 125 mL. O frasco foi incubado durante a noite a 33°C durante aproximadamente 16 hrs enquanto se agitava a 130 rpm. Depois, a levedura foi coletada por centrifugação a 3500 xg durante 10 minutos. O pélete de levedura foi lavado duas vezes em água desionizada por ressuspensão do pélete em 45 mL de água desionizada seguida por centrifugação. Após duas lavagens, o pélete foi ressuspenso em ~45 mL de água e o título de levedura foi determinado usando NucleoCounter YC-100 da Chemometec de acordo com a instrução do fabricante.

[00285] Os frascos foram incubados durante um total de 54 hrs a 32°C enquanto se agitava a 120 rpm. Foram coletadas amostras às 6, 24, 48 e 54 hrs. Em cada ponto temporal, as amostras foram preparadas para HPLC por remoção de aproximadamente 4 gramas de amostra de fermentação e sua mistura com 40 uL de H2SO4 a 40%. A mistura foi centrifugada durante 10

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106 / 108 minutos a 3500 x g, e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de náilon da Whatman de 0,2 uM. As amostras filtradas foram analisadas em um HPLC série 1100/1200 da Agilent com software Chemstattion. As amostras foram separadas em coluna de Exclusão iônica Bio-Rad HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) com um cartucho de guarda H catiônico. A fase móvel, H2SO4 a 5 mM, foi operada a 0,8 mL/min a 65°C e a temperatura de detector RI foi definida a 55°C. O método quantifica vários analitos usando padrões de calibração (calibração de 4 pontos com zero forçado) para dextrinas (DP4⁺), maltotriose (DP3), maltose (DP2), glucose (DPI), frutose, ácido acético, ácido láctico, glicerol e etanol. Os resultados de HPLC em etanol, glicerol, DP3 (maltotriose), DP2 (maltose) são mostrados na Tabela 2 e Tabela 3.

[00286] As combinações contendo GSA202 exibiram consistentemente rendimento de etanol mais elevado em relação à glucoamilase T-AMG/TcAMG de referência. Isto é verdadeiro com três tipos diferentes de combinações de GA (Ultra T, Excel T e Achieve T) e ao longo de dois tipos diferentes de pastas vegetais. O aumento em etanol com GSA202 varia de 0,1% a 1,28%.

Tabela 2: Nível de etanol após SSF em duas pastas vegetais durante 54 Hrs

Combinação de enzimas	Nível de etanol (% p/v)	Aumento no rendimento de etanol (Em relação à GA de referência)
Pasta 1	Pasta 2	Pasta 1	Pasta 2
1	13,8865	14,5545	0,00%	0,00%
2	13,9685	14,6530	0,59%	0,68%
3	13,8560	14,6330	0,00%	0,00%
4	14,0340	14,6475	1,28%	0,10%

[00287] Adicionalmente ao aumento de etanol, outro benefício visto com GSA202 é um nível de acúmulo mais baixo de glicerol em relação às glucoamilases de referência. Isto pode sugerir que a levedura estava menos estressada quando GSA202 foi usada em SSF. Outras propriedades desejáveis foram observadas com GSA202 tais como nível mais baixo de DP3, DP2 e ácido acético.

Tabela 3: Resultados de HPLC de analitos selecionados de interesse após SSF

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107 / 108 em duas pastas vegetais durante 54 hrs

Combinação de enzimas	Glicerol (% p/v)	Nível de DP3 (% p/v)	Nível de DP2 (% p/v)	Nível de Ácido Acético (% p/v)
Pasta 1	Pasta 2	Pasta 1	Pasta 2	Pasta 1	Pasta 2	Pasta 1	Pasta 2
1	0,9545	1,5370	0,1195	0,1290	0,0890	0,1515	0,0875	0,0710
2	0,8825	1,5195	0,0975	0,1075	0,0635	0,1160	0,0470	0,0805
3	0,9410	1,5510	0,1210	0,1355	0,0870	0,1645	0,0650	0,1035
4	0,8910	1,5000	0,1005	0,1070	0,0645	0,1100	0,0490	0,0480

Exemplo 3: Desempenho de Sacarificação e Fermentação simultâneas (SSF) da variante GSA202 com uma levedura comercial, Ethanol Red [00288] Um estudo similar ao Exemplo 2 foi conduzido para comparar o desempenho de SSF de glucoamilases de referência e GA contendo GSA202 com levedura Ethanol Red. Em todas as combinações de referência contendo duas glucoamilases (T/Tc), da dose total de 0,6 AGU/g de DS, 0,483 AGU/g de DS foram derivadas de T-AMG e as outras 0,117 AGU/g de DS foram derivadas de Tc-AMG. Todas as enzimas usadas na Tabela 4 foram descritas no Exemplo 2.

Tabela 4. Dosagem de enzimas em SSF após liquefação

Combinação de enzimas	Glucoamilase (GA)	Dose de GA Total (AGU/g de DS)	Alfa-amilase	Dose (FAU-F/g de DS)
1	T-AMG + Tc-AMG	0,60	PE096	0,0057
2	GSA202	0,609	PE096	0,00225
3	T-AMG + Tc-AMG	0,60	PE096	0,0171
4	GSA202	0,609	PE096	0,00675

[00289] As 4 combinações foram avaliadas em um SFF usando duas pastas vegetais de milho industriais liquefeitas representando a combinação de Alfa-amilase A (Pasta 1 & Pasta 2). Estas pastas foram suplementadas com 3 ppm de penicilina. A quantidade de ureia adicionada às pastas foi 400 ppm. Todas as pastas vegetais foram ajustadas até pH 5,1 usando H2SO4 a 40% antes da distribuição da pasta em frascos. Aproximadamente 60 g (55 ± 0,03) de pasta foram adicionados a cada frasco Erlenmeyer Descartável Corning de 125 mL que tinha um buraco de 0,048 na tampa para ventilação. Cada frasco foi doseado com enzimas de acordo com a Tabela 4 e levedura Ethanol Red foi doseado a 0,066 g de levedura Ethanol Red (após uma re-hidratação durante 30 minutos a 32 °C; 2,2 g de levedura seca em 40 mL de água). Agua foi adicionada a cada frasco tal que o volume adicional total de enzimas e

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108 / 108 água foi igual ao longo de cada amostra em cada tipo de pasta.

[00290] Os frascos foram incubados durante um total de 54 hrs a 32°C enquanto se agitava a 120 rpm. Foram coletadas amostras às 6, 24, 48 e 54 hrs. Uma amostra do material de partida de cada pasta foi também preparada para análise de HPLC para se determinar o tempo zero de cada pasta vegetal. Em cada ponto temporal, as amostras foram preparadas e analisadas por método de HPLC como descrito no Exemplo 1. Os resultados de HPLC em etanol, glicerol, DP2 (maltose) e ácido acético (acetato) são mostrados na Tabela 5 e Tabela 6.

[00291] As combinações contendo GSA202 exibiram rendimento de etanol mais elevado em relação à glucoamilase T-AMG/Tc-AMG de referência. O aumento em etanol com GSA202 é mostrado na Tabela 5 em baixo.

Tabela 5: Nível de etanol após SSF em três pastas vegetais durante 54 Hrs

Combinações de enzimas	Nível de etanol (% p/v)	Aumento no rendimento de etanol (Em relação à GA de referência)
Pasta 1	Pasta 2		Pasta 1	Pasta 2
1	13,416	14,267		0,00%	0,00%
2	13,494	14,370		0,58%	0,72%
3	13,433	14,290		0,00%	0,00%
4	13,537	14,331		0,77%	0,29%

[00292] Adicionalmente ao aumento de etanol, outro benefício visto com GSA202 é um nível de acúmulo mais baixo de glicerol em relação às GAs de referência. Outras propriedades desejáveis foram maioritariamente observadas com GSA202 tais como nível mais baixo de DP2 e ácido acético.

Tabela 6: Resultados de HPLC de analitos selecionados de interesse após SSF

em três pastas vegetais durante 5^Z	-Hrs
Combinações de enzimas	Glicerol (% p/v)	Nível de DP2 (% p/v)	Nível de Ácido Acético (% p/v)
	Pasta 1	Pasta 2		Pasta 1	Pasta 2	Pasta 1	Pasta 2
1	1,120	1,823		0,101	0,152	0.093	0,135
2	1,009	1,726		0,079	0,133	0.063	0,112
3	1,111	1,840		0,099	0,154	0.077	0,146
4	1,025	1,750		0,092	0,152	0,073	0,108

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Variante de glucoamilase, caracterizada pelo fato de que tem atividade hidrolítica de amido em bruto aumentada a pH = 4,0, T = 32°C, em comparação com a glucoamilase divulgada em SEQ ID NO: 2, em que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1-454 de SEQ ID NO: 2 ou 1-454 de SEQ ID NO: 4, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-462 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 463-556 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende adicionalmente uma substituição em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ T116R+ N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ Q318Y+ S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+

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2/12

N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ G120S+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+

N527M T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+

S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ N539R+ 1541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+

N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W + A518K+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+

T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

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3/n

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+

T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W; V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+

T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A518K+

T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T549W;

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4/12

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W; S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+

T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ A271F+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540K;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540R;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SGGC+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

em que a numeração das posições corresponde às posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2; e em que as variantes têm pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

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5/12

2. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1-454 de SEQ ID NO: 2, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ T116R+ N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ G120S+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ S458SCGG+ N527M T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

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6/n

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W+ N503R;

S95P+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 30%, pelo menos 35%, tal como pelo menos 40%.

3. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante é derivada da glucoamilase de SEQ ID NO: 2, e em que a variante compreende uma combinação de substituições específicas selecionadas do grupo consistindo em:

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Y295W + A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ A518K+

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7 /12

N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A493V+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ T116R+ A121P+ Q318Y + A518K+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T549W;

V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V+ A518K+ E520Q+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ A271F+ Y295W+ A518K+ N527M+ T549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A493V;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540K;

S95P+ A121P+ Y295W+ S540R;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 5%.

4. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante é derivada de uma glucoamilase tendo um domínio catalítico compreendendo os aminoácidos 1-454 de SEQ ID NO: 2, um ligante compreendendo os aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e um domínio de ligação ao amido compreendendo os aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4, e em que a variante compreende uma substituição

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 126/132
8/12 em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em:

T43K+ S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ TI 16R+ N527M+ T(V)549W;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+ A518K+ N527M+

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A117Q+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ T116R+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W; V18M+ T43K+ S95P+ A121P+ Q318Y+ A518K+

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ Q318Y+N527M+ T(V)549W;

S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W; S95P+ G120S+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+ T(V)549W; S95P+ N112L+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M+

T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ A518K+ N527M;

S95P+ A121P+ Y295W + S458C+ N539R+ I541Y+ T543V+

A545S+ S546GCGV + G547S+ S548T+ T549A;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SGGC+ N539R+ I541Y+

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 127/132
9/n

T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

T43K+ S95P+ A121P+ Y295W+ N527M+ T(V)549W;

S95P+ A121P+ Y295W+ S458SCGG+ N539R+ I541Y+

T543V+ A545S+

S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A;

e em que o aumento na atividade hidrolítica de amido em bruto em comparação com SEQ ID NO: 2 é pelo menos 2%.

5. Variante de glucoamilase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o número de substituições ou inserções é 1-20, p.ex., 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições ou inserções.

6. Método para aumentar a atividade de hidrólise de amido em bruto de uma glucoamilase, caracterizado pelo fato de que compreende os passos:

(a) proporcionar uma glucoamilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos consistindo nos aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 455-462 de SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e uma terceira sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 463-556 de SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (b) introdução de uma combinação de substituições selecionadas de pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro de: V18M, T43K, N112L, T116R, A117Q, G120S, A271F, Y295W, Q318Y; e/ou (c) Introdução de pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro, substituições selecionadas do grupo: S458C, S458SCGG,

Petição 870190101355, de 09/10/2019, pág. 128/132
10/12

S458SGGC, A493V, A518K, E520Q, N527M, S540K,R, S(G)546P, T(V)549W, N503R, N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A.

7. Método para aumentar a atividade de hidrólise de amido em bruto de uma glucoamilase, caracterizado pelo fato de que compreende os passos:

(a) proporcionar uma glucoamilase híbrida compreendendo uma primeira sequência de aminoácidos consistindo nos aminoácidos 1454 de SEQ ID NO: 2, uma segunda sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 455-465 de SEQ ID NO: 4 e uma terceira sequência de aminoácidos selecionada dos aminoácidos 466-559 de SEQ ID NO: 4; e/ou (b) introdução de uma combinação de substituições selecionadas de pelo menos uma de: V18M, T43K, T116R, G120S, Y295W, Q318Y;e/ou (c) introdução de uma de 3 opções: i) N539R+ I541Y+ T543V+ A545S+ S546GCGV+ G547S+ S548T+ T549A; ii) N539R+ 1541Y+ T543V+ A545S+ S546PCGV+ G547S+ S548T+ T549A; iii) pelo menos três substituições selecionadas do grupo: S458SCGG, N527M, T(V)549W e N503R.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a variante de glucoamilase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

9. Uso de uma variante de glucoamilase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para produção de xarope e/ou um produto de fermentação.

10. Processo para produzir um produto de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreende os passos de:

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11 / 12 (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa amilase;

(b) sacarificação do material liquefeito; e (c) fermentação com um organismo fermentador;

em que o passo (b) é levado a cabo usando pelo menos uma variante de glucoamilase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o passo (b) e o passo (c) são levados a cabo simultaneamente.
12. Processo para produzir um produto de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreende os passos de:

(a) sacarificação de material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido; e (b) fermentação com um organismo fermentador, em que o passo (a) é levado a cabo usando, pelo menos, uma variante de glucoamilase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
13. Processo para produzir um produto de xarope a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreende o passo de:

(a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa amilase;

(b) sacarificação do material liquefeito na presença de uma variante de glucoamilase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações

10 a 12, caracterizado pelo fato de que o organismo fermentador é

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12/12 selecionado de uma levedura, particularmente uma Saccharomyces, mais particularmente uma Saccharomyces cerevisiae.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a levedura expressa uma glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase de Gloeophyllum sp., mais preferencialmente uma glucoamilase de Gloeophyllum sepiarium ou Gloeophyllum trabeum, o mais preferencialmente a glucoamilase divulgada como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou uma glucoamilase tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
16. Polinucleotídeo codificando a variante de glucoamilase, caracterizado pelo fato de ser como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
17. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 16.
18. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 16.
19. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 16, o construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 17, ou o vetor de expressão como definido na reivindicação 18.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira como definida na reivindicação 19 é aplicada no passo de fermentação.
21. Método para produzir uma variante de glucoamilase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 19, sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperação opcional da variante.