MX2010013179A - Recuperacion de enzima insoluble a partir de caldo de fermentacion y formulacion de enzima insoluble. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para la recuperación y formulación de enzimas insolubles a partir de un caldo de fermentación microbiano, sin la remoción de células microbianas o restos celulares. Se proporcionan también formulaciones granuladas y líquidas que comprenden enzimas insolubles.

Description

ECUPERACION DE ENZIMA INSOLUBLE A PARTIR DE CALD FERMENTACION Y FORMULACION DE ENZIMA INSOLUBLE Campo de la invención La invención se refiere a métodos para r o más enzimas de interés a partir de un ntacion microbiano en presencia de células micro s de células, y a formulaciones sólidas y radas a partir de una composición que contien uble y células microbianas y/o restos c erados .

Antecedentes de la invención La recuperación convencional de enzimas a p de fermentación microbiano para usos industr s de productos líquidos o sólidos incluye típ s etapas de procesamiento. La mayoría de los lación de una enzima producida intracelularmente aímente las siguientes etapas de procesamien celular; (2) pretratamiento; (3) separación de concentración y (5) formulación - (a) adición estabilización de líquido, seguida por filtr o; o (b) adición química para estabilidad da por secado.

La lisis celular libera las enzimas de in células al romper las paredes celulares. L ar puede lograrse al poner en contacto las cél enzima que degrade paredes celulares tales c zima, al inducir cambios en ambiente de ferm S como una alteración en pH, temperatura, conce xígeno disuelto, concentración de glucosa, conce al o concentración de otros aditivos para caus tánea, mediante la ruptura mecánica de la pared ar incluye centrifugación y/o filtración, para s celulares y cualquier material insoluble p nte y/o después de la fermentación, y/o tado de la lisis celular. Los métodos de centri ados incluyen centrifugación en pila de d tador. Los métodos de filtración adecuados ación al vacío giratoria, filtración a través a de filtro de placa y armazón, o filtración a t crofiltro de membrana.

La separación celular usando centri ámente es un compromiso entre claridad y producc ica común usar centrifugación de alta producción er cantidades residuales de sólidos suspend dades suficientes para interferir con et samiento subsecuentes mediante filtración cción. La mayoría de los métodos de filtraci conómica y consume tiempo debido al pequeño ta cula de los restos y la naturaleza viscosa del ntación lisado. Comúnmente, el pretratamiento ntroducción de floculantes al caldo lisado o no lectrolitos han recibido mucha atención como u incrementar la floculación celular en la rem as bacterianas a partir de caldo de cultivo. ) Colloids Surf. 31:259-264; Bautista et al. chnol . Lett . 8:315-318; Chen and Berg (1993) Ch 48:1775-1784; Cumming et al. (1996) Biotechno -60; Hustedt and Theelen (1989) DeChema Biote rences - VCH Veragsgesselcschaft 3:1071-1075; Rat (1998) Biotechnol. Tech. 12:599-603; Shan et al iotechnol . 49 : 173-178.

La floculación facilita la remoción de lares de la porción líquida que contiene las en cto final deseadas, el líquido aclarado que cont as de interés provenientes de la etapa de se ar puede satisfacer los requerimientos para lacion produzca el producto. Sin embargo, proce onal se requiere comúnmente para increme ntración de enzima antes de la formulació ntración incluye deshidratación, la cual s amente por ultrafiltración o evaporación para les en calor. Otros métodos de concentración pitación, cristalización y cromatografía (véa lo solicitud de PCT No. WO 91/09941) . Estas icas comunes para la recuperación de enzimas in o al costo implicado.

Como se detalló arriba, la recupera lacion convencionales de enzimas incluye varias etapa añadida a un proceso de fabricación r eracion tradicional como el descrito arriba se erar la enzima del caldo de fermentació pitados de enzima serán removidos simultáneame s celulares insolubles y otro material insoluble tapa de separación de células. Como result miento de recuperación será bajo. Una esta a este problema incluye la adición de u iatamente después de una etapa de recuperació ión de enzima súper saturada para evi pitación. (patente europea No. EP1417301) . go, este proceso requiere costos de material adi rega una etapa adicional al proceso de recuperac o para recuperar enzima insoluble sin la adici l sería adecuado.

Los gránulos que contienen enzimas son inco roductos en varias industrias, incluyendo las in corporación en los gránulos , y si son expresada dero microbiano, se purifican al menos parcialme er células microbianas y/o restos celulares prod r de la lisis de las células.

En casos en los que la enzima insolub nte en el caldo microbiano, la solubiliza ere antes de la recuperación. En algunos cas lograrse fácilmente al cambiar el pH y/o tempe nte la adición de sales simples. En otros c on de polioles o azúcares es necesaria. Despu ilización, se puede llevar a cabo la separa as . La corriente aclarada resultante generaln iluida como para ser usada para formulación. Se de concentración, típicamente por ultrafiltrac r que se añadió pasará libremente la memb filtración y se volverá una corriente residu cto económicamente a partir de este caldo.

Existe la necesidad de formulaciones de ladas en las cuales la enzima esté en forma ins s cuales células y/o componentes celulares insol removidos .

Breve descripción de la invención La invención proporciona métodos p eración y formulación de enzimas insolub siciones que comprenden enzimas insolubles recup ladas como se describió en la presente.

En un aspecto, se proporciona un méto erar una enzima insoluble a partir de u biano que comprende células microbianas y/o ares de células microbianas, que comprende r a insoluble del calco microbiano sin remover las bianas y/o restos celulares, produciendo de est biano sin remover las células microbianas y/o ares, produciendo así una composición que c a insoluble recuperada, en donde la com ende células microbianas y/o restos celulare as modalidades, la enzima insoluble es enzimát a (es decir, la enzima es catalíticamente acti o sólido o tiene potencial catalítico y se íticamente activa cuando es solubilizada en un ado y bajo condiciones adecuadas para que oc isis) .

En algunas modalidades, el caldo microb ce mediante un método seleccionado de: mezc a con un caldo microbiano que comprenda bianas y/o restos celulares, en donde la enzim ce por las células microbianas y en donde la e uble en el caldo microbiano o en donde la e En algunas modalidades, la recuperación inc enos una operación de recuperación selecció icionamiento de caldo; lisis celular; homogene ltración y separación de sólidos-líquidos. En idades, la recuperación incluye dos o más operac eración seleccionadas de acondicionamiento de celular; homogeneizaci n; diafiltración y separ os y líquidos, llevadas a cabo en cualquier orde En algunas modalidades, la recuperación d uble comprender por lo menos parte de la fase allo microbiano- En algunas modalidades, la rem enos parte de la fase líquida del caldo mi ende concentrar los sólidos del caldo microbia as modalidades, concentrar el caldo microbiano c proceso de filtración de membrana selecció filatración, microfilracion, osmosis inv En algunas modalidades, el caldo microb ce al cultivar una célula microbiana que exp a en un medio de crecimiento bajo condiciones a la expresión de la enzima, en donde la en uble bajo las condiciones de crecimiento. E idades, el caldo microbiano se produce al cult a microbiana que expresa la enzima en un m miento bajo condiciones adecuadas para la expr zima, en donde la enzima es soluble bajo las con ecimiento, y en donde se añade un precipitante erar la enzima para hacer por lo menos una par a insoluble en el caldo microbiano. En idades, el precipitante se selecciona de ajuste e de temperatura, adición de sal, adición de on de base, adición de al menos alguna otra p ón de regulador de pH, adición de ar s .

En algunas modalidades, la composici ende enzima insoluble comprende células mic tas . En una modalidad, las células microbianas células microbianas vivas. En otra modalid as microbianas intactas son células microbianas tras modalidades, la composición que comprende uble recuperada comprende células microbianas li En algunas modalidades en las cuales la sada es insoluble en el caldo microbiano, el ende romper membranas de células microbian cir un lisado de células microbianas, antes o de cuperación de enzima insoluble. En otras modali cuales la enzima expresada es soluble en e biano, el método comprende romper membranas de bianas antes o después de la adición de un preci bianas. En una modalidad, la enzima que es c r a cabo la lisis de células microbianas es un ima. En otras modalidades, romper membranas d biana comprende un proceso de ruptura de memb a mecánico, tal como homogeneización. En idades, romper membranas de células mic ende un proceso de esfuerzo cortante mecáni ío, seleccionado de homogeneización; mezclado rzo cortante; extrusión por presión y bombeo rzo cortante. En algunas modalidades, el ende además homogeneizar el lisado de bianas para producir un lisado de células mic eneizado antes de o después de la recuperación d uble .

En algunas modalidades, el método comprend ltrar el lisado de células microbianas ante En algunas modalidades, las células microbi as fúngicas. En algunas modalidades, las cas son células de Trichoderma . En algunas moda élulas de Trichoderma son células de Trichoderma En algunas modalidades, por lo imadamente cualquiera de 10, 20, 30, 40, 50, 60, de la enzima es insoluble en el caldo microbian En algunas modalidades de los méto eración, la pureza de la enzima insoluble se in menos aproximadamente 10%.

En otro aspecto, la invención proporci sición producida de acuerdo con un método para r enzima insoluble a partir de un caldo microbiano ito en la presente, en donde la composición c a insoluble recuperada y células microbianas y/ ares. En una modalidad, la composición comprend ncias que disuelvan al enzima y/o al camb ciones físicas de tal manera que la enzima se o menos parcialmente, produciendo así una sol a soluble; y (c) remover los sólidos de la rada en la etapa (b) , produciendo así una sol a líquida aclarada.

En otro aspecto, la invención proporciona u elaborar un gránulo que contiene enzima, que c cir un gránulo que contiene enzima que compr sición que contiene enzima insoluble, por a insoluble recuperada, y células microbianas y/ ares. En una modalidad, el método compren rcionar una composición que comprende enzima in ejemplo, enzima insoluble recuperada, y bianas y/o restos celulares; y (b) producir un contiene enzima que comprende enzima insolubl er las células microbianas y/o restos ce ciendo de esta manera una composición que c a insoluble recuperada y células microbianas y/ ares, en donde por lo menos una parte de la e ublé en el caldo microbiano. En algunas modalid a es enzimáticamente activa en el gránulo (es d a es catalíticamente activa en el estado sólido cial catalítico y se vuelve catalíticamente o es solubilizada en un solvente adecuado iciones adecuadas para que ocurra la catálisis) .

En una modalidad, el gránulo que contiene e ce en un procesador de lecho fluido de a ior. En algunas modalidades, el gránulo que a se produce por un proceso de granulación sele rocesamiento en lecho fluido de aspersión s samiento con aparato de recubrimiento Wur idad, el método comprende además recubrir una ende una sal de barrera sobre la capa que a. En una modalidad, el método comprende rir una capa de recubrimiento exterior que comp ero y/o pigmento sobre la capa de sal de barrera.

En una modalidad, el método comprende recu de sal de barrera y/o una o más capas de recub un núcleo que contiene enzima que comprende uble, por ejemplo, enzima insoluble recupe as microbianas y/o restos celulares. En una mo núcleo que contiene enzima se produce i samiento en lecho de fluido de aspersión super modalidad, el núcleo que contiene enzima se nte granulación de alto esfuerzo cortante.

En otro aspecto, la invención proporc lo que contiene enzima que comprende: un as microbianas y/o restos celulares se pro do con cualquiera de los métodos descritos nte para la recuperación de una enzima inso r de un caldo microbiano. En una modali sición que comprende enzima y células microbia s celulares se produce mediante un método que c erar enzima insoluble de un caldo microbi ende células microbianas y/o restos celular er las células microbianas y/o restos ce ciendo de esta manera una composición que c a insoluble recuperada y células microbianas y/ ares, en donde por lo menos una parte de la e uble en el caldo microbiano. En algunas modalid a es enzimáticamente activa en el gránulo (es d a es catalíticamente activa en el estado sólido cial catalítico y se vuelve catalíticamente lo que contiene enzima que comprende un núc ene enzima y una capa de sal de barrera y/o un de recubrimiento que rodean el núcleo, en d o comprende una composición que comprende uble y células microbianas y/o restos celular as modalidades, la composición que comprende uble y células microbianas y/o restos célul ce de acuerdo con cualquiera de los métodos desc resente para la recuperación de una enzima ins r de un caldo microbiano. En una modali sición que comprende enzima y células microbi s celulares se produce mediante un método que c erar la enzima insoluble de un caldo microbi ende células microbianas y/o restos celula er las células microbianas y/o restos ce ciendo de esta manera una composición que c ce mediante procesamiento en lecho fluido de a ior. En una modalidad, el núcleo que contiene e ce mediante granulación de alto esfuerzo cortante En otro aspecto, la invención pro siciones que comprenden cualquiera de los grán enen enzimas descritos en la presente, idad, la composición es una composición deterge modalidad, la composición es una composici samiento de textiles. En otra modalidad, la com na composición de alimento para animales. idad, la composición es una composición alimenti En otro aspecto, la invención proporci lación líquida que contiene enzimas que compr sición que comprende una enzima insoluble, por a insoluble recuperada y células microbianas y/ ares. En algunas modalidades, la composic erada y células microbianas y/o restos celula por lo menos una parte de la enzima es insolub microbiano. En algunas modalidades, la en áticamente activa en la formulación líquida (e enzima es catalíticamente activa o tiene p ítico y se vuelve catalíticamente activa cu ilizada en un solvente adecuado y bajo con adas para que ocurra la catálisis) . En idades, la formulación líquida que contiene ende además uno o más ingredientes de for cionados de un poliol; una sal; un conserva e tensioactivo y un antioxidante. En idades, la formulación líquida comprende ad l . En algunas modalidades, la formulación ende además una sal. En algunas modalida lación líquida comprende además un conservad preparar una formulación líquida que contiene omprende: (a) proporcionar una composición que c a insoluble recuperada y células microbianas y/ ares producidos de acuerdo con cualquiera de los itos en la presente; (b) y solubilizar la uble en la composición. En una modalidad, el ende además remover células microbianas y/o ares después de la etapa (b) y antes de la et ciendo así una formulación líquida aclarada.

Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra un rendimiento de acti aeion de lavado de gránulos que contienen rados como se describió en el ejemplo 4 des enamiento en detergente, como se describe en el La figura 2 muestra la estabilidad enzim ares, por ejemplo, recuperadas de acuerdo os descritos en la presente.

La práctica de la presente invención empl que se indique lo contrario, técnicas convenció gía molecular (incluyendo técnicas recombi biología, biología celular y bioquímica, las dentro de la capacidad de la técnica. Estas xplican completamente en la literatura, por ular Cloning: A Laboratory Manual , segunda rook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis ed. , 1984; Current Protocols in Molecular Bio usubel et al., eds . , 1994); PCR: The Polymera ion (Mullís et al., eds., 1994); y Gene Tran ssion: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990) .

A menos que se defina de otra manera nte, todos los términos técnicos y científico a presente puede usarse en la práctica o prueb nte invención.

Las escalas numéricas proporcionadas en la nclusivas de los números que definen la escala.

A menos que se indique lo contrario, los icos están escritos de izquierda a dere tación de 5 ' a 3' y las secuencias de aminoácid tas de izquierda a derecha en orientación xi , respectivamente.

Definiciones Según se usa en la presente, el nucleótido" se refiere a una forma polimé ótidos de cualquier longitud y cualquier es mensional y de una sola o de varias hebras (por na sola hebra, doble hebra, triple hélice, et s contienen desoxirribonucleótidos , ribonucleót condiciones de uso, incluyendo modificació menten la resistencia a nucleasa (por ejemplo, Me, fosforotioatos , etc.). También se pueden in dores para los propósitos de detección o capt ío, marcadores radioactivos o no radioactivos o ejemplo, biotina. El término polinucleótido én ácidos nucleicos péptidos (PNA) . Los polinuc n ser de origen natural o no de origen natura nos "polinucleótido" y "ácido nuclei onucleótido" se usan indistintamente en la p olinucleótidos de la invención pueden contener bos, y/o formas modificadas y/o análogos de los secuencia de nucleótidos puede ser interrump nentes que no sean nucleótidos. Uno o más en diéster pueden ser reemplazados por grupos de nativos. Estos grupos de enlace alternativos i ombinación de porciones lineales y circulares.

Según se usa en la presente, "polipépt re a cualquier composición que comprende amino ocida como una proteína por aquellos experto ca. Se usa en la presente el código convenciona de tres letras para los residuos de aminoácid nos "polipéptido" y "proteína" se usan indisti a presente para referirse a polímeros de aminoá uier longitud. El polímero puede ser l icado, puede comprender aminoácidos modificados interrumpido por no aminoácidos. Los términos én un polímero de aminoácido que ha sido mo almente o por intervención; por ejemplo, form es de disulfuro, glicosilación, lipidación, acet rilación o cualquier otra manipulación o modif omo conjugación con un componente marcador. Ta es y similares.

Según se usa en la presente, el término "ex efiere al proceso mediante el cual un polipép cido con base en la secuencia de ácido nucleic El proceso incluye tanto transcripción como tra Según se usa en la presente, "vector de ex efiere a una construcción de ADN que conti ncía de codificación de ADN (por ejemplo, s a) que está enlazada operablemente a una ncías de control adecuadas capaces de llevar a sión de la secuencia de codificación en un ho secuencia se controla incluyendo un promotor par o transcripción, una secuencia operadora opció olar esta transcripción, una secuencia que codif s de unión a ribosoma de ARNm adecuados y secuen olan la terminación de transcripción y traducci idas en la técnica.

Un "promotor" se refiere a una secuencia re stá implicada en la unión a ARN polimerasa para ranscripción de un gen. El promotor puede tor inducible o un promotor constitutivo. Un ej ativo de un promotor inducible que puede usars ción es Trichoderma reesei cbhl, el cual es un ible .

El término "enlazado operablemente" se refi posición en la que los elementos están sición que les permite ser relacionados funcion ejemplo, un promotor está enlazado operablement ncia de codificación si controla la transcripci ncía de codificación.

"Bajo control de transcripción" es un térm dido en la técnica que indica que la transcri secuencias de intervención (intrones) entre segm icación individuales (exones) .

Según se usa en la presente, el término dera" se refiere a una célula o línea celular en ector de expresión recombinante para la producci éptido puede ser transfectado para la exprés éptido. Las células hospederas incluyen progeni a hospedera individual, y la progenie p ariamente ser completamente idéntica (en morfolo emento de ADN genómico total) a la célula pro inal debido a mutación natural, accidental o del célula hospedera incluye células transfec formadas in vivo con un vector de expresión. dera" se refiere tanto a células como a prot os a partir de las células de una cepa entosa y particularmente una cepa de Trichoderma nativos que de otra manera son expresados anorm presados o no expresados en absoluto.

Una "secuencia de señal" se refiere a una s inoácidos unida a la porción N-terminal de una facilita la secreción de la forma madura de la pr ir de la célula. La forma madura de la celular carece de la secuencia de señal que es te el proceso de secreción.

El término "marcador selectivo" o " cionable" se refiere a un gen capaz de la expr célula hospedera que permite la facilidad de sele líos hospederos que contengan un ácido nucleico ducido. Ejemplos de marcadores seleccionables no están limitados a sustancias antimicrobia lo, higromicina, bleomicina o cloranfenicol ) y confieran una ventaja metabólica, tal como una os polisacáridos complejos. Los hongos filamen presente invención son morfológica, fisioló icamente distintos de las levaduras. El cre ativo por hongos filamentosos es mediante alar y catabolismo de carbono es obligatoriamente a célula progenitora fúngica filamentosa en la ser una célula de una especie de, pero no lim oderma (por ejemplo, Trichoderma reesei (cía amente como T. longibrachiatum y actualmente én como Hypocrea jecorina) , Trichoderma oderma koningii , Trichoderma harzianum) ; Pen Humicola sp . (por ejemplo, Humicola insolens y a) ; Chrysosporium sp. (por ejemplo, C. luckn ladium sp., Aspergillus sp . (por ejemplo, A . or y A. awamori) , Fusarium sp . , Neurospora sp . , y Emericella sp. (véase también, Innis et al., ucleótido o proteína se refiere a un polinucle ína que no ocurre naturalmente en una célula ho algunas modalidades, la proteína es una trial comercialmente importante. Se intenta no abarque proteínas que sean codificadas por n natural, genes mutados y/o genes sintético no "homólogo" en referencia a un polinucle ína se refiere a un polinucleótido o proteína qu aímente en la célula hospedera.

El término "introducida" en el contexto de secuencia de ácido nucleico en una célula sfección" , "transformación" o "transducción" re a la incorporación de una secuencia de ácido una célula eucariótica o procariótica en d ncia de ácido nucleico puede ser incorporad a de la célula (por ejemplo, cromosoma, p presente se refieren a un material (por ejem ína, ácido nucleico o célula) que es retirado de un componente con el cual está asociado natur ejemplo, estos términos pueden referirse a un sté sustancial o esencialmente libre de compone lmente lo acompañen como se encuentra en su o tales como, por ejemplo, un sistema biológico El término "recuperada" según se usa en la fiere a la separación por lo menos parcial de un o o más componentes solubles de un caldo microb eños la separación parcial de uno o más solvent , por ejemplo, agua o etanol . Una enzima re mente es de pureza más alta que antes del pr eración. Sin embargo, en algunas modalidad a recuperada puede tener la misma o más baja pu del proceso de recuperación.

Según se usa en la presente el término "a ífica" significa una unidad enzimática definida o de moles de substrato convertido en producto ración de enzimas por unidad de tiempo bajo con íficas. La actividad específica se expré des (U) /mg de proteína.

Según se usa · en la presente, los osición detergente" y "formulación detergente" ferencia a mezclas que están diseñadas para usar grabado para la limpieza de objetos sucios. En Üdades preferidas, el término se usa en refe o de telas y/o prendas (por ejemplo, "deterg dería") . En modalidades alternativas, el té re a otros detergentes, tales como aquellos usa platos, cubiertos, etc. (por ejemplo, "detergen o de vajillas") . No se intenta que la Según se usa en la presente, el nfectar" se refiere a la remoción de contamin superficies, así como a la inhibición o elimin bios sobre las superficies de artículos. No se la presente invención sea limitada a ninguna sup ulo o contaminante o microbio particular q ido .

"Caldo microbiano" o "caldo de fermenta re a un medio de crecimiento en el cual bianas (por ejemplo, bacterianas y fúngic ivadas y el cual es adecuado para la expresión a como se describe en la presente.

Una "enzima insoluble" se refiere a una en presente en una fase sólida. Una enzima inso a (es decir, se divide) con una fase sólida de eparación de fases sólida y líquida, por ejemp nte se refiere a la remoción de condiciones o su causan la precipitación de una enzima o que man zima en una forma insoluble, o a cambiar las con as (por ejemplo, cambio de temperatura; icación) o la adición de sustancias de solubi ejemplo, solventes de solubilización, por ejempl les; sales; ácidos; bases; agentes tensioacti a la enzima insoluble soluble.

"Purificar" o "purificación" de una uble se refiere a la refinación de una enzima de mover parcial o completamente componentes que no és, por ejemplo, componentes líquidos de u biano que no sean de interés. Una composic ene enzima purificada contiene una cantidad más más componentes que la mezcla de la cual se pur a . os secos.

"Restos celulares" se refiere a paredes cel componentes celulares insolubles que son l és de la ruptura de la membrana celular, es és de la lisis de células microbianas.

"Acondicionamiento de caldo" se refiere miento de un caldo de fermentación microbiano mejorar las propiedades de manejo del cuentes . El acondicionamiento del caldo ca sición química y/o propiedades físicas y/o re caldo para facilitar su uso en procesos de recu formulación corriente abajo. El acondicionami puede incluir uno o más tratamientos tal icación del pH, tratamiento con calor, enfri on de aditivos (por ejemplo, calcio, sales, floc es reductores, activadores de enzimas, inhibi a, III.

"Un", "uno" , "una", "el" y "la" encias plurales a menos que el contexto claramen ntrario.

Métodos de recuperación La invención proporciona un método para r enzima insoluble de un caldo microbiano (es de de fermentación microbiano en el cual célu san enzima han sido cultivadas) , sin la remo as o restos celulares del caldo. La recuperaci a insoluble incluye separar la enzima insoluble manera sustancialmente completa de los com les del caldo microbiano, es decir, separar l uble de por lo menos una porción de los com les del caldo microbiano. Los procesos de recu itos en la presente convierten caldo de fermenta bianas y/o restos celulares recuperados. . idad, la enzima expresada es soluble en e biano y por lo menos una parte de la enzima uble mediante la adición de uno o más precipitan modalidad, la enzima no es expresada por las bianas sino que es añadida a un caldo microbia se han cultivado las células microbianas. L da al caldo microbiano puede ser insoluble o p le o hacerse insoluble mediante la adición de u pitantes. Las células microbianas pueden ser o después de la recuperación de la enzima in ciendo resto celular insoluble.

En algunas modalidades, un caldo microbi iene una enzima soluble o insoluble expresada se una composición que contiene una enzima so luble producida externamente. Uno o más precipit En algunas modalidades, dos o más bianos de fermentaciones microbianas separa nados, y una o más enzimas insolubles se recuper s microbianos combinados .

En los métodos de la invención, la enzima i nzimáticamente activa, es decir, capaz de catal ión enzimática. La enzima insoluble tiene p ítico, es decir, la enzima es catalíticamente a insoluble, y/o después de la solubilización nte y bajo condiciones adecuadas para que oc idad catalítica. En una modalidad, la enzima i atalíticamente activa tanto en forma insolub és de la solubilización. En una modalidad, l uble es inactiva en forma insoluble y se íticamente activa después de la solubilización.

En varias modalidades, cualquiera de por ltración. El caldo microbiano que contiene uble puede ser concentrado para remover por 1 de la porción soluble del caldo, incrementando a la concentración de la enzima insoluble en e nte una o más técnicas que se conocen bie ca, incluyendo pero no limitadas a procesos de ejemplo, ultrafiltración, microfil filtración) , centrifugación y evaporación, nativa, o en conjunto con concentración, diafi emplearse para reemplazar al menos parte de la le del caldo microbiano, usando típicamente un mbrana para diafiltrar el caldo microbiano contr En los métodos de la invención, células mic ultivan en un medio de crecimiento bajo con adas para la expresión de una enzima de ciendo así un caldo microbiano que contiene la e ir al añadir un precipitante antes de la recuper zima. Ejemplos de precipitantes incluyen, pero ados a sales (por ejemplo, NaCl , NaS04/ sul o, sulfato de magnesio, concentración de aproxim alrededor de 50% (p/v) ) , polielectrolitos (por ato, carboximetilcelulosa, ácido poliacrílico o, polifosfatos) , y alteración en temperatura combinación de los mismos. (Véase, por tion and Purification of Proteins (2003) R. G. H odd, S.R. Rudge, D.P. Petrides, pp. 243-271; ication: Principies and Practice (1994) R.K. ger, pp . 71-101; Protein Purification eering (1994) R.G. Harrison, ed. , arcel Dekk erential Precipitation of Proteins", pp . 115-208) Las enzimas solubles también pueden lubles mediante interacciones de afinidad, por a como se describió arriba.

Las células microbianas que se pueden us sar una enzima de interés como la descrita nte pueden ser eucarióticas o procariótic ío, un microorganismo fúngico o bacteriano. Eje organismos eucarióticos que se pueden usar i no están limitados a, Trichoderma sp., Hypoc gillus sp., Penicillium sp., Saccharomyce osaccharomyces sp . , Hansenula sp . , y Fusar íos de microorganismos procarióticos que se pue yen, pero no están limitados a, Bacill tomyces sp . , Pantoea sp., Escherichia sp. , y Pse Cualquier enzima que sea expresada en u uble o la cual sea expresada en forma soluble se insoluble, por ejemplo mediante la adició . No. 4,760,025, patente europea No. 130 756 o s T No. WO 91/06637. En algunas modalidades, la e lfa-amilasa como la descrita en la solicitud de 8/112459. En algunas modalidades, la enzima asa, por ejemplo, Multifect L250™ o Puradax™, di cialmente de Genencor, División of Danisco US, as modalidades, la enzima es una oxidasa, una ox transferasa, una deshidratasa , una reducta elulasa, una peroxidasa, una fosfolipasa, una e cutinasa, una pectinasa, una queratinas igenasa, una ligninasa, una pululanasa, una tann sanasa, una malanasa, una ß-glucanasa ionosidasa, una hialuronidasa, una condroitina a, una catalasa, una isomerasa, una pectato lias asa, o una combinación de las mismas. En lidades, la enzima es una fitasa. En idad, las células microbianas intactas son bianas muertas (véase, por ejemplo, patente de ,801,034, la cual describe un método para matar isis al ajustar el pH de una mezcla de fermenta igual a o menor que aproximadamente dos unidad o de la pKa del ácido orgánico compatible US mineral, y añadiendo una cantidad suficient orgánico y/o sal de ácido orgánico compatib a para llevar a cabo una eliminación de ncialmente completas) .

En algunas modalidades, la composición as microbianas lisadas, es decir, resto cido por la lisis de las células microbianas, idad, el método incluye romper membranas de bianas para producir un lisado de células mic de la recuperación de la proteína insoluble . es capaz de lisis de células microbian eneizadas más para producir un lisado de bianas homogeneizado . En otras modalidades, la s membranas celulares se logra mediante homogen ica .

Una composición que contiene enzimas que c más enzimas insolubles y células microbianas y/ ares, preparada como la descrita en la present larse en una formulación granulada o líquida.

Formulaciones granuladas Gránulos de enzima estables y de baja form pueden producirse a partir de caldo microbi nga enzima insoluble o células microbianas y/ ares. En algunas modalidades, el caldo microb ene enzima insoluble y células microbianas y/ ares se produce de acuerdo con cualquiera de los sición que contiene enzima insoluble y bianas y/o restos celulares, producida, por ejem de un método de recuperación como el descrito a cir un gránulo que contenga enzima que inc sición, en donde la enzima insoluble en el gr áticamente activa, es decir, capaz de a ática cuando es contactada por un substrato a bajo condiciones que sean adecuadas para qu idad catalítica. La enzima es catalíticamente a insoluble y/o cuando es solubilizada en un solv ncia de substrato y bajo condiciones adecuadas a la catálisis enzimática, por ejemplo, ación de uso para los gránulos que contienen a modalidad, la enzima es catalíticamente acti rma insoluble como después de la solubilización . lidad, la enzima es catalíticamente inactiva lo puede contener una capa de sal entre el núcl que contenga enzima. La sal se puede selecci ejemplo, sulfato de sodio, citrato de sodio, su sio, sulfato de potasio y sulfato de amonio, a de los mismos. Una o más capas adicionales pu iertas sobre la capa que contenga enzima. Por apa de sal de barrera puede ser recubierta sobre ontenga enzima. En algunas modalidades, una o m ecubrimiento exterior pueden ser recubiertas s que contenga enzima, o sobre una capa de sal de sea recubierta sobre la capa que contenga enzima ecubrimiento exteriores pueden contener, por eros y/o pigmentos.

En algunas modalidades, una composici ende una enzima insoluble y células microbia s celulares, como la descrita arriba, se incorpo a insoluble y células microbianas y/o restos c produce mediante granulación en tambor, t lación de alto esfuerzo cortante. Este gránulo úcleo que contiene enzima (que contiene la uble y células microbianas y/o restos celulares) capas de recubrimiento sobre el núcleo. Estas rimiento pueden incluir, pero no están limitad ero, por ejemplo, polietilenglicol o inílico, un pigmento tal como dióxido de ti rol .

Los gránulos de la invención también pueden nentes adicionales tales como pero no limi ificantes, cargas y lubricantes .

La invención proporciona gránulos que c as que comprenden un núcleo y una composic iene enzima en una capa que rodea el núcleo o inc bianas y/o restos celulares (por ejemplo, biano con enzima soluble y células y/o restos ce én puede formularse en una formulación granulada ibe en la presente.

Los gránulos de la invención exhiben baja f lvo, por ejemplo, menos de 50, 40, 30, 20, 10, 05 mg/almohadilla, según se mide por la pr ión de Heubach. Los gránulos son estables c enan bajo condiciones de humedad y temperatura ar solubles o dispersables después del contacto liberar así la enzima cuando estén en uso.

Gránulos pequeños sin recubrimientos pro an una cantidad significativa de polvo ciones de transporte y relleno neumáticas, tan a de fabricación de gránulos de enzima como en l abricación del cliente. El polvo puede ser nido dentro de una cámara cilindrica y f táneamente una corriente de aire a través del le ar cualquier polvo que se genere. El polvo gen ído al vacio a través de un tubo y depositado s adilla de filtro fuera de la cámara de Heubach. ponente activo del polvo recogido se conoce co eubach. En la prueba de elutriación, los grán os en una frita de vidrio dentro de un tubo d y fluidizados con una corriente de aire seco c te un periodo de tiempo fijo. Una discusión ipios, operación y limitaciones de las pru ción de polvo de Heubach y elutriación se trar por ejemplo, en "Enzymes In Detergency" ed. e., C. 15, pp. 310-312, (Marcel Dekker, Inc. Nu ) y referencias citadas ahí. La prueba de ch también se describe en las patentes de E.U. ?) , perlas y almidón de papa aglomerado se co rsables . Las perlas son partículas esféri sten en un cristal de semilla que ha sido cons deado en una forma esférica al aglutinar capas oluto al cristal de semilla en un apar rimiento. Las perlas se elaboran típicamente a composición de un azúcar tal como sucrosa, y como almidón de maíz. Los núcleos adecuados s materiales de cristal de semilla que ales de sucrosa, cloruro de sodio y semillas de dio, y otras sales inorgánicas que pueden acumul to de amonio, sulfato de sodio, sulfato de p lares .

Los gránulos compuestos de sales inorgán res y/o moléculas orgánicas pequeñas pueden usa núcleos de la presente invención. Los ingr eros adecuados incluyen - alcohol polivinílico tilenglicol , óxido de polietileno y p lidina. El PVA puede ser parcialmente hidroliz hidrolizado intermediamente (90-98%) ; compl lizado (98-99%); PVA súper hidrolizado (99-100%) a de los mismos, con un bajo a alto grado de vis El núcleo de un gránulo que contiene enzima ito en la presente puede consistir en una o m ánicas o un cristal de sucrosa. En algunas moda úcleo consiste en sulfato de sodio, citrato d ro de sodio, sulfato de calcio o una combinació s . En una modalidad, el núcleo consiste en su .

Las cargas adecuadas útiles en los núcleos íales inertes usados para añadir volumen o , o usados con el propósito de ajustar la a eformabilidad . Típicamente, los plastifican estos orgánicos de bajo peso molecular y son a íficos para el polímero que se esté plasti íos incluyen, pero no están limitados a, azúcare glucosa, fructosa y sucrosa) , alcoholes de s como sorbitol, xilitol y maltitol) polioles (a ídricos por ejemplo, alcoholes con muchos ales hidroxilo tales como glicerol, etile lenglicol o polietilenglicol ) , compuestos orgá peso molecular polares, tales como urea, ificantes conocidos tales como ftalato de. dib ilo, o agua.

Los materiales fibrosos adecuados útiles os de la presente invención incluyen materia n alta resistencia a la tracción y los cuale rse en filamentos finos que tengan un diámetro d mieras.

Los núcleos pueden fabricarse mediante una écnicas de granulación bien conocidas en la yendo: cristalización, precipitación, recubrimi íente, recubrimiento en lecho fluido, atoi oria, extrusión, esferonización, granulación en aeración de alto esfuerzo cortante.

En una modalidad de la presente invenc o es una perla soluble o dispersable en agua r o sal como se describió arriba) el cual p nalmente además recubierto por o acumulado a pa al de semilla (perla) usando alcohol poliviníli ea solo o en combinación con agentes anti-aglo como dióxido de titanio, talco, o plastificant sucrosa o polioles. El nivel de PVA en el recub a perla puede representar alrededor de 0.5% a los de enzima estables y de baja formación de resente invención. Una composición que contien comprende una o más enzimas insolubles y bianas y/o restos celulares, preparada como se d a, se incorpora en los gránulos descritos nte .

En algunas modalidades, la enzima es una hi ejemplo, una proteasa (bacteriana (por ejemp lisina) o fúngica; ácida, neutra o alcalin sa (alfa o beta) , una lipasa o una celulasa. En idades, la enzima es una subtilisina, por ejemp escrita en la patente de E.U.A. No. 4,760,025, ea No. 130 756, o solicitud de PCT No. WO 91/06 as modalidades, la enzima es una alfa-amilasa ita en la solicitud de PCT No. WO 08/112459. En idades, la enzima es una celulasa, por a, una catalasa, una isomerasa, una liasa pecta asa, o una combinación de las mismas. En idades, la enzima es una fitasa. En idades, la enzima es una enzima perhidrolasa, t ejemplo, una enzima como la descrita en la soli o. WO 05/056782. En algunas modalidades, la e de hidrolizar un substrato (por ejemplo, una ma En un aspecto, una o más enzimas insoluble sición que contiene células microbianas y/o ares se incorporan en el núcleo del gránulo. to preferido una o más enzimas en una composi ene células microbianas y/o restos celula tificadas alrededor de un núcleo. Cuan tificadas alrededor del núcleo, la capa que comp a puede incluir además un aglutinante tal ero, por ejemplo, un polímero de vinilo tal como ca, almidón de papa, almidón química o fís icado) , dextrinas, agentes anti-espuma (por les de poliéter tales como foamblast 882 (Emer ol), Erol DF 204K (Ouvrie PMC) , DG436 (ODG Ind , KFO 880 (KABO Chemicals, Inc.)), alcoholes d ejemplo, sorbitol, maltitol, lactitol, xilitol) , oactivos (por ejemplo, etoxilados de alcohol ta l 23-6.5 (Shell Chemical LP, Houston, TX) y (BASF) ) , y agentes anti-redeposición (por steres de polietilenglicol tales como Repel-o-ia, Inc.), Texcare SR -100 o SRN-170 (Claria -100 (ISP Corp. ) ) .

Un "agente anti-espuma" es un compuesto qu prevenir o romper espuma. También se pueden desespumantes, o agentes desespumantes, estos son sustancias tensioactivas que red ticos, alcoholes, sulfatos, sulfonatos, ácidos es, compuestos nitrogenosos , fosfatos, polig ros, compuestos tío, siloxanos y compuestos hal rgánicos. (Ghildyal (1988) Adv. Appl. Microbiol 3-222) . En algunas modalidades, son útiles los s grasos, ésteres, poliglicoles y siloxanos. En idades, el agente anti -espuma es copolímero de no-óxido de propileno. En una modalidad, el co óxido de etileno-óxido de propileno tiene ular aproximado de 2200 (por ejemplo, disponit de Mazer Chemicals, Inc.).

Los gránulos de la invención pueden inclu a 50% o 75% en peso de sólidos de enzima ublé recuperada y células microbianas y/o ares, producidos como se describió arriba) . E lidades, un gránulo puede comprender cualquiera d Capas de recubrimiento Los gránulos de la presente invención ender además una o más de otras capas de recubr capas de recubrimiento pueden tener cualquier o de funciones dependiendo del uso final del ejemplo, los recubrimientos pueden hacer al ing o, particularmente enzimas, resistente a oxida ueo, o capas de recubrimiento pueden ocasi idad de disolución deseable después de la intr gránulo en un medio acuoso, o proporcionar una onal contra humedad ambiental para de esta mentar la estabilidad de almacenamiento del g ir la posibilidad de crecimiento microbiano de IO .

En una modalidad de la presente invención, recubrimiento comprende uno o más políme rencia PVA parcialmente hidrolizado que ten sidad) . Otros polímeros de vinilo que puede se yen acetato de vinilo y polivinilpirrolidona ímeros útiles incluyen, por ejemplo, copolímero rilato de metilo. Otros polímeros tales c én se pueden usar en la capa exterior. Estas rimiento adicionales pueden comprender además u os siguientes: plastificantes , pigmentos, lub como agentes tensioactivos o agentes anti-est nalmente, enzimas adicionales. Los plasti ados útiles en las capas de recubrimiento de la ción son aquellos descritos en la presente arri ntos adecuados útiles en las capas de recubrim resente invención incluyen, pero no están limi ueadores finamente divididos tales como áió ió o carbonato de calcio, o pigmentos coloreado cantes pueden servir como agentes anti -aglomer es humectantes.

Los agentes lubricantes adecuados incluyen, limitados a, agentes tensioactivos (iónicos, no iónicos) , ácidos grasos, agentes anti -estática y polvo. De preferencia lubricante es un oactivo, y muy preferiblemente es un agente tens e de alcohol tal como un alcohol primario o line o o alqueno de longitud de cadena de 9 a 15 á no o un etoxilado o derivado etoxisulfato del agentes tensioactivos están disponibles comerc la línea de producto Neodol de Shell Inter leum Company. Otros lubricantes adecuados i no están limitados a, agentes anti -estática ta cGuard™, Downey™, Tritón X100 ó 120 y similares, -polvo tales como Teflon™ y similares, guar, goma acacia, goma xantánica, goma de al sán, gelatina, colágeno, caseína, ácido poliasp poliglutámico . De preferencia, el age cturación tiene baja alerginicidad. Una combin o más agentes de estructuración se puede usar los de la presente invención. Los aglutinantes no están limitados a azúcares y alcoholes de azúcares adecuados incluyen pero no están limi sa, glucosa, fructosa, rafinosa, trehalosa, la sa. Los alcoholes de azúcar adecuados tol, manitol e inositol .

Capa de barrera En algunas modalidades, una capa de bar ierta sobre la capa de enzima o sobre un núc ene enzima en un gránulo que contiene enzima ito en la presente. En algunas modalidades, la tada. El término hidratada" significa que el rrera contiene agua en una forma libre o ligada nación de las dos. El agua de hidratacion pu da ya sea durante o después del proc rimiento. El grado de hidratacion será una fun o material y la temperatura, humedad y condici o bajo las cuales se aplique.

Actividad de agua "moderada o alta" signi una actividad de agua de por lo menos aproxim 0.30 ó 0.35. La actividad de agua mencionad nte es aquella del propio gránulo una vez que ial de barrera - pero sin recubrimientos adici iertos sobre éste. Los recubrimientos adi n ocultar la medición precisa del material de ial de barrera como una capa distinta.

Sin desear ser limitados por teoría, se es ción de agua por el gránulo debe ser eliminad agua puede ser dejada por el gránulo a sus alre so si la actividad de agua del gránulo es más ia del detergente o la humedad relativa correspo ua presente en la capa de barrera podría actuar o que limite la cantidad de agua que sea acumu ánulo y afecte el núcleo de proteína.

En el caso de sales hidratadas, el tado es una sal cristalina hidratada con a alización ligadas. El hidrato debe seleccio arse de tal manera que el gránulo recubierto re una actividad de agua de más de 0.25, o lo le mientras que se conserve un gránulo que sea . Al aplicar una sal hidratada o cualqui ial de barrera hidratado adecuado de esta ma na cualquier fuerza conductora para la a Ejemplos de sales adecuadas para la produ capa de barrera hidratada incluyen sulfato de hidratado, sulfato de zinc heptahidratado, sul pentahidratado, fosfato de sodio hidratado, nitrato de magnesio hexahidratado, b decahidratado, citrato de sodio dihidratado y gnesio tetrahidratado .

Capa de recubrimiento exterior En algunas modalidades, un gránulo que a comprende una capa de recubrimiento exterior, idad, la capa de recubrimiento exterior es re la capa de enzima. En algunas modalidades, una rimiento exterior es recubierta sobre una o más rimiento intermedias. En una modalidad, la rimiento exterior es recubierta sobre una ra, la cual es recubierta sobre la capa de tilenglicol , óxido de polietileno, quitosa ea, xantano, carragenano, polímeros de látex y ico .

En algunas modalidades, la capa de recub ior incluye PVA. Los PVAs adecuados p poración en la capa de recubrimiento exterior parcialmente hidrolizados , completamente hidrol mediamente hidrolizados que tienen bajos a alto iscosidad (véase, por ejemplo, patente de E. ,649). En una modalidad, la capa de recub ior incluye PVA parcialmente hidrolizado que ti sidad .

En algunas modalidades, la capa de recub ior incluye uno o más pigmentos. Ejem ativos de pigmentos adecuados incluyen blanq ente divididos, tales como dióxido de ti azúcar, polietilenglicoles (PEGs) , g lenglicol) , urea, citrato de trietilo, fta ilo o dimetilo, o agua.

Los extensores adecuados incluyen, pero ados a, azúcares (por ejemplo, sucrosa o hidroli on, tales como maltodextrina o sólidos de ja , arcillas (por ejemplo, caolín o bentonita) extensor" es una sustancia (generalmente de c ) añadida a otra sustancia (generalmente de c y rendimiento más alto) para modificarla o dilui Los lubricantes adecuados incluyen, pero ados a, agentes tensioactivos no iónicos (por l, Lutensol TO 65), alcoholes de cebo, ácidos de ácido graso (por ejemplo, estearato de mag es de ácidos grasos.

Los agentes tensioactivos adecuados incluy ados a: sales metálicas, solubilizadores , acti xidantes, colorantes, inhibidores, aglut ncias, agentes protectores de enzimas/depurador sulfato de amonio, citrato de amonio, urea, clo anidina, carbonato de guanidina, sulfonato de gu ido de tiourea, monoetianolamina, dietan anolamina, aminoácidos tales como glicina, glut y similares, proteínas tales como albúmina o, caseína y similares, etc., agentes tensio yendo agentes tensioactivos no aniónicos, ioactivos anfolíticos, agentes tensioactivos no es tensioactivos catiónicos y sales de ácidos g a larga, mej oradores de detergencia, álcalis trolitos inorgánicos, agentes blanqueadores, ag do y colorantes fluorescentes, e inhibid ación de torta. Los agentes tensioactivos se de ser recubierta sobre la matriz que contenga enz ial de barrera puede incluirse en la matriz que a. Asimismo, opcionalmente , se puede apl rimiento sobre una partícula de semilla, una m a que rodee la partícula de semilla y/o la ra. En algunas modalidades, el agente de estruc n polisacárido o un polipéptido. La matriz p énea a lo largo del núcleo o puede ser recubier artícula de semilla. Puede haber una o más cap rticula de semilla y la matriz o la matriz y la ra, por ejemplo, un recubrimiento tal como inílico (PVA) . Un gránulo de matriz puede pro ejemplo, en un procesador de lecho fluido de a ior .

Las partículas de semilla son partículas las cuales se puede estratificar la matriz de n combinarse con ingredientes dispersables tal , caolín o bentonita. Las partículas de semill abricadas mediante una variedad de técnicas de ranulación que incluyen: cristalización, precip rimiento en recipiente, recubrimiento en lecho eración en lecho fluido, atomización gi sión, formación de pellas, esferonización, gra mbor y aglomeración de alto esfuerzo cortante, los de la presente invención, si se usa una part ia entonces la relación de partículas de se los es 1:1.

Los azúcares adecuados incluyen azúcares ta sa, glucosa, fructosa, rafinosa, trehalosa, l sa. Los alcoholes de azúcar adecuados tol, manitol e inositol. La relación de ol de azúcar a agente de estructuración en la m e de estructuración contribuye dos pro tantes de las que una matriz de azúcar o alc r sola podría carecer: (1) proporcionar coh tencia a la partícula, reduciendo amplíam ncía de la partícula a la formación de polv endo como una capa de difusión a agua y m ñas en virtud de formar una red polimérica o w rgo de la estructura de matriz. Esto mejora amp tabilidad del gránulo.

Los agentes de estructuración que se p yen almidón, almidón modificado, carragenano, c osa modificada, goma arábiga, goma guar, goma xantánica, goma de algarrobo, quitosa, g eno, caseína, ácido poliaspártico y ácido poligl referencia, el agente de estructuración tie enicidad. Una combinación de dos o más age eración. Los plastificantes adecuados útiles nte invención incluyen polioles tales como g lenglicol, polietilenglicol (PEG) , urea, u ficantes conocidos tales como citrato de t to de dibutilo o dimetilo, o agua. Los agent eración adecuados incluyen materiales insolubles ientemente solubles tales como talco, Ti02, a e amorfa, estearato de magnesio, ácido este nato de calcio.

Los gránulos de matriz pueden contener ad de barrera. Se usa una capa de barrera para h o prevenir la difusión de sustancias que puedan samente la proteína o enzima en la matriz. La ra está constituida de un material de barrera recubierta sobre el núcleo de la proteína o el arrera puede ser incluido en el núcleo de la p uiera de un número de funciones en una compos los, dependiendo del uso final del gránulo de ejemplo, los recubrimientos pueden hacer a la tente a la oxidación por blanqueador, causa es deseables de disolución después de la intr gránulo en un medio acuoso, o proporcionar una a humedad ambiental para incrementar así la est macenamiento de la enzima y reducir la posibi imiento microbiano dentro del gránulo.

Los recubrimientos adecuados incluyen los p dores de película solubles en agua o dispers tales como alcohol polivinílico inilpirrolidona (PVP) , derivados de celulosa ta lcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxic celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilc etilenglicol , óxido de polietileno, goma parcialmente hidrolizado que tiene baja vis polímeros de vinilo que pueden ser útiles to de polivinilo y polivinilpirrolidona . imeros útiles incluyen, por ejemplo, copolímero rilato de metilo y copolímero de PVP-PVA. Las rimiento pueden contener además uno o más ientes: plastificantes , extensores, lubr ntos y opcionalmente enzimas adicionales, ificantes adecuados útiles en las capas de recub a presente invención son plastificantes que inclu lo, polioles tales como azúcares, alcoholes de tilenglicoles (PEGs) , urea, glicol, propilen plastificantes conocidos tales como cit ilo, ftalato de dibulo o dimetilo o agua. Los p ados útiles en las capas de recubrimiento de la ción incluyen, pero no están limitados a, blanq de ácido graso tales como estearato de mag es de ácido graso.

Formulaciones líquidas La invención proporciona formulaciones líqu enen enzimas que comprenden una enzima insolubl sición con células microbianas y/o restos celula ío, recuperada como se describió arriba. La e áticamente activa o tiene potencial catalít , es capaz de actividad catalítica en un e ación de uso en un solvente y condiciones adecua ocurra actividad catalítica, en la formulación varias modalidades, la formulación líquida ender ingredientes de formulación (su ilizadoras) que "estabilicen", es decir, mante edades físicas y bioquímicas del producto enamiento, incluyendo pero no limitadas lación líquida comprende una o más sales, por , CaCl2, Na2S0 / formiato de sodio, citrato de mato monosódico, cloruro de calcio, concentra imadamente 0.1 a alrededor de 50% (p/v) . En idades, la formulación líquida comprende uno es conservadores, por ejemplo, benzoato de onato de sodio, sorbato de potasio, p ntración de aproximadamente 0.1 a alrededor de 5 lgunas modalidades, la formulación líquida compr sales reguladoras de pH, por ejemplo, acetato d to de sodio, MES, HEPES, concentración de edor de 20% (p/v) * Un ácido (por ejemplo, , tal como ácido acético o ácido fórmico, o e, tal como HCl o H2S04) o una base (por ejemplo puede usarse para ajuste de pH. Para una refere ibe formulaciones líquidas véase generalmente l uble, por ejemplo, recuperada como se describió lulas microbianas y/o restos celulares, sol al o completamente la enzima insoluble, por eje nar la composición con uno o más ingredie lación como los descritos arriba, por ejemplo, u les, una o más sales, una o más sustancias conse una o más sales reguladores de pH, opcionalment do, típicamente agua, produciendo así una for da. En una modalidad, el método comprende prop composición que comprende una enzima insoluble y bianas y/o restos celulares, por ejemplo, re se describió arriba, solubilizar la enzima in ejemplo, combinar la composición con uno dientes de formulación como los descritos arr lo, uno o más polioles, una o más sales, un ncias conservadoras y/o una o más sales regula enen gránulos que contienen enzima o formu das como las descritas arriba. Además de los gr laciones líquidas que contienen enzima siciones contienen componentes adecuados para e gránulos o en formulaciones liquidas en aplicac particulares, tales como aplicaciones de limpi ío, detergentes), procesamiento de textiles, animales, fermentación, repostería, alimentic as .

Composiciones de limpieza En algunas modalidades, los gránu laciones líquidas que contienen enzimas c itos en la presente se incorporan en una compos ieza, tal como un detergente, por ejemplo, para dería o lavado de vajillas, para prop imiento de limpieza y/o beneficios de limpiez ncionales tales como proteasa, lipasa, cutin asa en conjunto con amilasa.

Materiales auxiliares también pueden incl omposición de limpieza, por ejemplo, para a mentar en el rendimiento de limpieza, p miento del substrato que será limpiado o para m tética de la composición de limpieza como es el mes, colorantes, tintes o similares. Se enti auxiliares son además de los gránulos que c as como los descritos en la presente. La na sa de estos componentes adicionales, y los ni poración de los mismos, dependerán de la forma f mposición y de la naturaleza de la operación de la cual se vaya a usar. Los materiales au ados incluyen, pero no están limitados a, oactivos, mej oradores de detergencia, agentes qu nuación, ejemplos adecuados de otros de estos au S niveles de uso se describen en las patentes d 5,576,282, 6,306,812 y 6,326,348.

En algunas modalidades, la composición de ntiene fosfato. En algunas modalidades, la com impieza es un detergente para lavado de vajilla ene fosfato. En algunas modalidades, la compos eza es un detergente de lavandería que no to. En algunas modalidades, la composición de o contiene fosfato contiene un mej orador de dét o es fosfato, por ejemplo, citrato.

Agentes tensioactivos - Una composición de la descrita en la presente puede comprender u ioactivo o sistema tensioactivo, en donde el ioactivo puede seleccionarse de agentes tensioac os, agentes tensioactivos aniónicos, S mej oradores de detergencia o sistemas mejorad gencia. Cuando se usa un mej orador de deterge nte composición de. limpieza comprenderá típica alrededor de 1%, aproximadamente 3% a alrededor roximadamente 5% a alrededor de 40% de mejor gencia en peso de la presente composición de limp Los mej oradores de detergencia incluyen, limitados a, las sales de metal alcalino, a olamonio de polifosfatos , silicatos de metal a natos alcalinotérreos y de metal alcalino, mej detergencia de aluminosilicato, compuest arboxilato, hidroxipolicarboxilatos de éter, cop hídrido maleico con etileno o éter vinil metílic -trihidroxibencen-2 , 4 , 6 -trisulfónico y ximetiloxisuccínico, las diferentes sales d ino, amonio y amonio sustituido de ácidos poli no están limitados a, agentes quelantes de co neso y mezclas de los mismos. Cuando se usa u nte, la composición de limpieza puede co edor de 0.1% a aproximadamente 15%, o alrededor roximadamente 10% de agente quelante en peso nte composición de limpieza .

Auxiliar de deposición - Una composi eza como la descrita en la presente puede conten auxiliares de deposición. Los auxiliares de de ados incluyen, pero no están limita tilenglicol , polipropilenglicol , policarb eros de liberación de suciedades tales com eleftálico y arcillas tales como ca orilonita, atapulgita, ilita, bentonita, halo as de las mismas.

Agentes inhibidores de transferencia de co colorante puede estar presente a nive imadamente 0.0001% a alrededor de 10%, aproxim a alrededor de 5%, o aproximadamente 0.1% a a en peso de la composición de limpieza.

Dispersantes - Una composición de limpieza ita en la presente puede contener uno rsantes. Los dispersantes orgánicos hidro ados incluyen, pero no están limitados a, los o co-poliméricos o sus sales, en los cuales arboxílico comprende por lo menos dos r xilo separados unos de otros por no más de dos á no .

Estabilizadores de enzimas - Las enzim e en detergentes pueden ser estabilizadas s técnicas. Las enzimas empleadas en la present estabilizadas, por ejemplo, por la presencia de obre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molí neso, un catión de metal auxiliar que tenga mu na actividad catalítica de blanqueo, tales como inc o aluminio y un secuestrante que tenga const ilidad definidas para los cationes metálicos cat auxiliares, particularmente etilendiaminotetraacético, ndiaminotetra (metilenfosfónico) y sales hidrosol ismos. Estos catalizadores se describen en la .U.A. No. 4,430,243. Los catalizadores que c neso útiles en la presente se conocen y se de ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,576,28 izadores de blanqueo de cobalto útiles en la pre en, y se describen, por ejemplo, en las pat . Nos. 5,597,936 y 5,595,967. Estos cataliza to se preparan fácilmente mediante proced o acuoso, y comúnmente proporcionarán alrededor a aproximadamente 25 ppm, alrededor de 0.05 imadamente 10 ppm o alrededor de 0.1 imadamente 5 ppm, del MRL en el licor de lavad es de transición adecuados en un catalizador de etales de transición incluyen manganeso, hierro a modalidad, un MRL es un ligando ultra-rígido q es cruzados, tal como 5 , 12-dietil-l azabiciclo [6.6.2] hexadecano . Los MRLs de met ición adecuados se preparan fácilmente dimientos conocidos, tales como los enseña lo en la solicitud de PCT No. WO 00/332601 y pa . No. 6,225,464.

Las composiciones de limpieza descritas nte pueden usarse para limpiar un sitio ficie o tela. Típicamente al menos una porción vado es agua, la temperatura del agua varía típ rededor de 5°C a aproximadamente 90°C y, cuando ende una tela, la relación de masa de agua a amente de alrededor de 1:1 a aproximadamente 30: Composiciones de procesamiento de textiles En algunas modalidades, las formu ladas o líquidas que contienen enzimas c itas en la presente se incorporan en una compos samiento de textiles. Las enzimas adecuadas sión en una composición de procesamiento de yen, pero no están limitadas a, ce drolasas, poliesterasas , amilasas, catalasas, pe casas. En algunas modalidades, una composi samiento de textiles también puede incluir u -redeposición (por ejemplo, Repel-O-Tex, Sorez .) . asas, fosfatasas, proteasas, amilasas, es sas, esterasas, enzimas redox, lipasas, trans asas, fosfblipasas , ligninasas, y ß-glucanasas .

Los siguientes ejemplos están diseñad rar, pero no limitar, la invención.

E emplos Ejemplo 1 aración de concentrado de enzimas y formulación g partir de caldo de fermentación que contiene enz cialmente precipitadas usando un proceso de recup convencional Preparación de Usado bacteriano Bacillus licheniformis que binantemente enzima ot-amilasa como se describ itud de PCT No. WO08/112459 fue fermentado Ícas bien conocidas en la técnica. Después se mantuvo durante 48 horas, y luego se diluyó s de agua e inmediatamente se floculó con 4% ( ero catiónico (C581, de Cytec Industries, Inc ó tierra diatomácea (FW12, de World Minerals) a ldo floculado y se filtró a través de un filtro tremo muerto equipado con una almohadilla de fi R9000 recubierta con una torta diatomácea FW miento de enzima en el filtrado después de la se s células fue de 6%.

El filtrado aclarado se concentró filtro equipado con una membrana devanada en es tersulfona (PES) con un límite de peso molecula 10K (KOCH Membrane Systems) . El concentrad nía 11.5 g/1 o 1.15% (p/v) de oc-amilasa activa ) de materia seca sólida.

El rendimiento total para este proceso fue se le añadieron 2062 gramos de solución que g/L de amilasa activa, 1.6% de talco (Nytal 400 lcohol polivinílico (Erkol 5/88), 1.0% de ant blast 882 de Emerald Performance Materials) , y on de maíz (Cargill Foods) se recubrió por a los cristales de sulfato de sodio. Los parám timiento por aspersión fueron los siguientes: índice de aspersión de solución 3.6 gpm (gr o) , incrementándose a 13.6 gpm durante 1.5 hor vo a 13.6 gpm para el resto del experimento.

Temperatura de entrada 69°C, incrementada és de 30 minutos.

Temperatura de salida entre 43.9°C y 46.2°C.

Flujo de aire de fluidización entre 36 y 3 egundo (76.0 cfm (pies cúbicos por minuto) y 81.

Presión de aire de atomización 2.10 kg/cm2 Los parámetros de recubrimiento por a n los siguientes: índice de aspersión de solución 8.3 gpm (gr o) , incrementándose a 19.2 gpm durante 15 nido a 19.2 gpm durante el resto del experimento.

Temperatura de entrada 63 °C, incrementada és de 15 minutos Temperatura de salida entre 44_2°C y 47.8°C.

Flujo de aire de fluidización entre 37.4 s por segundo (79.5 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización 2.8 kg/cm2 (4 Se recuperaron 1363 gramos de producto.

Aspersión 3 : 1363 gramos de los gránulos d la aspersión 2 fueron cargados en un apa rimiento de lecho fluido Vector FL-1 y se fluidi o) , incrementándose a 12.2 gpm durante 30 nidos a 12.2 gpm durante el resto del experiment Temperatura de entrada 75 °C, incrementada és de 30 minutos.

Temperatura de salida entre 46.0°C y 52.4°C.

Flujo de aire de fluidización entre 36.9 S por segundo (78.4 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización 2.8 kg/cm2 (4 Se recuperaron 1487 gramos de producto final Usando la prueba de atrición de Heuba los fueron analizados para formación de polvo. lvo en los gránulos fue de 1.66 mg/almohadilla.

Ejemplo 2 aración de concentrado de enzima y formulación gr a partir de caldo de fermentación que contiene en brenadante resultante que contenía 5% de la acti a total medida en el caldo entero antes ifugación. 95% de la enzima fue insoluble.

Para la lisis de células, la temperatura d ustó a 40°C y se añadieron 0.01% (p/p) de lisoz se mantuvo durante 1.5 horas . La tempera mentó después a 60°C y se mantuvo a 60°C durante ldo se diluyó después con 1 parte de agua.

La enzima precipitada permaneció insoluble a etapa de calor y la dilución. El lisado s és con mezclado suave a temperatura ambiente du con 5% (p/p) de glucosa y 3% (p/p) de NaCl a pH a separación celular. La mayoría de la acti sa precipitada (84%) fue solubilizada .

El lisado se floculó después con 4% (p ero catiónico (C581, de Cytec Industries, Inc de materia sólida seca.

El rendimiento total para este proceso fue a actividad enzimática inicial en caldo ente a fue de 22% (sólidos secos activos/sólido es) . Sin embargo, el concentrado contenía gi La remoción de estas sustancias podría samente el costo del proceso.

Formulación granulada Se preparó una composición granulada a pa ntrado de enzima como sigue.

Aspersión 1; 478 gramos de cristales de na escala de tamaño de diámetro de partícula de µt?, se cargaron en un aparato de recubrimiento Vector Fl-1 y se fluidificaron. A esto, rjaron sobre los cristales de sucrosa 628 gr ción que contenía 60.0 g/L de amilasa activa, 11 Flujo de aire de fluidización entre 39. s por segundo (83.5 cfm (pies cúbicos por minuto) Presión de aire de atomización 2.2 kg/cm as por pulgada cuadrada), incrementándose a 2. si) durante 52 minutos. 700 gramos de producto fueron recuperados.

Aspersión 2; 700 gramos de los gránulos d la aspersión 1 fueron cargados en un apa rimiento de lecho fluido Vector FL-1 y flui és se asperjaron sobre los gránulos de enzi s de una solución acuosa que contenía 120 gramo omposición del gránulo) de sucrosa (C6H Sugar s (10.2% de composición del gránulo) de almidón ilí Foods), 72 gramos (6.1% de composición del ióxido de titanio (R902 DuPont) , y 15 gramos Temperatura de salida entre 46.3°C y 47.7°C.

Flujo de aire de fluidización entre 40 s por segundo (85.0 cfm (pies cúbicos por minuto) Presión de aire de atomización entre 2.46 2 (35 psi y 36 psi) .

Se recuperaron 988 gramos de producto.

Aspersión 3 ; 988 gramos de los gránulos d la aspersión 2 fueron cargados en un apa rimiento de lecho fluido Vector FL-1 y flui és se recubrieron por aspersión sobre los grá a 586 gramos de una solución acuosa que cont s (2.5% de composición del gránul xipropilmetilcelulosa (HP C E-15 Dow Chemical s (0.3% de composición del gránulo) de polietil (Carbowax por Electron Microscopy Sciences) .

Presión de aire de atomización 2.8 kg/cm2 (4 Se recuperaron 1014 gramos de producto final Usando la prueba de atrición de Heuba IOS se analizaron para polvo. El nivel de polv los fue de 2.80 mg/almohadilla .

Ejemplo 3 aración de concentrado de enzima y formulación gr partir de lisado de células homogeneizado de cal rmentación que contiene enzima parcialmente preci Preparación de lisado de células homogeneíz Bacillus licheniformis que binantemente enzima a-amilasa como se describ itud de PCT No. O08/112459 se fermentó usando conocidas en la técnica. Después de la fermenta contenía enzima precipitada. Una muestra del Formulación granulada Se preparó una composición granulada a pa o homogeneizado como sigue.

Aspersión 1: 17.64 kilogramos de crist to de sodio (Saltee) , con una escala de ta tro de partícula de 150 µp? a 350 µp?, se carg to de recubrimiento de lecho fluido Deseret ificó. A esto, se recubrieron por aspersión s ales de sulfato de sodio, 259.41 kilogramos de ontenía 12.53 g/L de amilasa activa, 5.88 kilogr a composición granulada) de talco (Nytal 400 ramos (1.0% de composición del gránulo) de ant blast 882 de Emerald Performance Materials) ramos (6% de composición del gránulo) de almidón ilí Foods) y 1.18 kilogramos (1.0% de composi lo) de Neodol (23-6.5 de Shell Chemicals) .

Presión de aire de atomización 4.21 kg/cm2 as por pulgada cuadrada), incrementándose a 4.7 psi) durante 5 horas, se recuperaron 65.2 kilog cto .

Aspersión 2; 65.2 kilogramos de los grá a de la aspersión 1 se cargaron en un apa rimiento de lecho fluido Deseret 60 y se fluidi és se recubrieron por aspersión sobre los grá a 111.11 kilogramos de una solución acuosa que kilogramos de sulfato de sodio (20% de composi lo) . Los parámetros de recubrimiento por a n los siguientes: Velocidad de aspersión de solución entre os por minuto) a 580 gpm para la aspersión 2 com Temperatura de entrada 85 °C.

Temperatura de salida entre 48.3°C y 54.1°C. a 84.97 kilogramos de una solución acuosa que kilogramos (5.2% de composición del gránulo) de inílico (5/88 de Erkol) , 6.12 kilogramos ( sición del gránulo) de dióxido de titanio ( t) , 1.53 kilogramos (1.3% de composición del grá (Nytal 400) y 1.53 kilogramos (1.3% de composi IO) de Neodol (23-6.5 de Shell Chemicals), etros de recubrimiento por aspersión fue ientes : Velocidad de aspersión de solución entre os por minuto) a 400 gpm durante la aspe eta .

Temperatura de entrada 85 °C.

Temperatura de salida entre 48.8°C y 56.8°C. Flujo de aire de fluidización entre 503 S por segundo (1070 cfm (pies cúbicos por minuto ramos (0.4% de composición del gránulo) de Neo e Shell Chemicals) .

Los parámetros de recubrimiento por a n los siguientes: Velocidad de aspersión de solución 295 gpm persión 4 completa.

Temperatura de entrada 85 °C.

Temperatura de salida entre 47.1°C y 51.1°C. Flujo de aire de fluidización entre 530 s por segundo (1126 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización entre 4.56 2 (65 psi y 68 psi) .

Se recuperaron 101.2 kilogramos de producto.

Usando la prueba de atrición de Heuba los fueron analizados para polvo. El nivel de itud de patente No. WO08/112459 fue fermentad cas bien conocidas en la técnica. Después ntación, el caldo contenía enzima precipitad o homogeneizado se preparó como se describió lo 3.

El lisado homogeneizado fue diafilt ntrado con un ultrafiltro equipado con una t ada en espiral 10K MWCO PES (KOCH Membrane Systei ntrado final contenía 11 g/1 o 1.1% (p/v) de a a y 16.7% (p/p) de materia sólida seca.

El lisado homogeneizado fue diafiltrado usa ipal . Se llevó a cabo la diafiltración en ante, es decir, al mantener el volumen en el t ntación que contenía el lisado homogeneizado co endo agua municipal para reemplazar el volumen de ido del sistema. La cantidad total de o homogeneizado y diafiltrado como sigue.

Aspersión 1: 29.606 kilogramos de crist to de sodio (Saltee) , con una escala de ta tro de partícula de 150 µp a 350 µt?, se cargar to de recubrimiento de lecho fluido Deseret ificaron. A esto, 170.79 kilogramos de soluc nía 14.2 g/L de amilasa activa, 5.88 kilogramos composición granulada) de talco (Nytal 400) ramos (1.0% de composición del gránulo) de ant blast 882 de Emerald Performance Materials) ramos (10% de composición del gránulo) de al (Cargill Foods) y 1.18 kilogramos (1.0% de com gránulo) de Neodol (23-6.5 de Shell Chemicals) iertos por aspersión sobre los cristales de su . Los parámetros de recubrimiento por aspersió iguientes: as por pulgada cuadrada) , incrementándose a 4. si) durante 5 horas.

Se recuperaron 66.6 kilogramos de producto.

Aspersión 2: 66.6 kilogramos de los grá a de la aspersión 1 se cargaron en un apa rimiento de lecho fluido Deseret 60 y se fluidi és se recubrieron por aspersión sobre los grá a 111.11 kilogramos de una solución acuosa que kilogramos de sulfato de sodio (20% de composi lo) . Los parámetros de recubrimiento por a n los siguientes: Velocidad de aspersión de solución entre os por minuto) a 640 gpm durante la aspe eta .

Temperatura de entrada entre 83.5°C y 85.6° Temperatura de salida entre 51.4°C y 54.8°C. a 84.97 kilogramos de una solución acuosa que kilogramos (5.2% de composición del gránulo) de inílico (5/88 de Erkol) , 6.12 kilogramos ( sición del gránulo) de dióxido de titanio ( t) , 1.53 kilogramos (1.3% de composición del grá (Nytal 400) y 1.53 kilogramos (1.3% de composi IO) de Neodol (23-6.5 de Shell Chemicals) , etros de recubrimiento por aspersión fue ientes : Velocidad de aspersión de solución entre nos por minuto) a 410 gpm durante la aspe eta.

Temperatura de entrada entre 79.6°C y 83.9° Temperatura de salida entre 55.9°C y 59.6°C. Flujo de aire de fluidización entre 527 S por segundo (1121 cfm (pies cúbicos por minuto ramos (0.4% de composición del gránulo) de Neo e Shell Chemicals) .

Los parámetros de recubrimiento por a n los siguientes: Velocidad de aspersión de solución 250 gpm persión 4 completa.

Temperatura de entrada entre 82.7°C y 82.9° Temperatura de salida entre 57.4°C y 59.7°C.

Flujo de aire de fluidización entre 544 s por segundo (1157 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización 4.9 kg/cm2 (7 Se recuperaron 110.0 kilogramos de producto. Usando la prueba de atrición de Heuba IOS fueron analizados para polvo. El nivel de ránulos fue de 0.15 mg/almohadilla . contenía enzima precipitada. Las células as como se describió en el ejemplo 2. El li ltrado usando agua de la llave como se describí lo 4. El lisado diafiltrado se concentró más ) de sólidos secos. La pureza de la pre itante fue de 17% (sólidos secos activos/sólid ies) . La pureza fue 1.7 veces más alta que la de eneizado preparado en el ejemplo 3.

Ejemplo 6 aración de concentrado de enzimas y formulación g partir del lisado de células diafiltrado de cal rmentacion que contiene enzima precipitada parcia Preparación del lisado de células diafiltra Bacillus licheniformis que expresa enzima el descrito en la solicitud de PCT No. O08/1 ento como se describió en el ejemplo 1. El li rimiento de lecho fluido Vector Fl-1 y se fluidi o, 1470 gramos de solución que contenía 23.41 sa activa, 5% de talco (Nytal 400), 1.0% de ant blast 882 de Emerald Performance Materials) , on de maíz (Cargill Foods) se recubrieron por a los cristales de sulfato de sodio. Los parám rimiento por aspersión fueron los siguientes: Velocidad de aspersión de solución 2.6 gpm inuto), incrementándose a 14.1 gpm durante 1.5 n Temperatura de entrada 6 °C, incrementados és de 30 minutos.

Temperatura de salida entre 44.9°C y 45.8°C.

Flujo de aire de fluidización entre 37 y 3 egundo (78.6 cfm (pies cúbicos por minuto) y 80.

Presión de aire de atomización 2.1 kg/cm as por pulgada cuadrada), incrementándose a 2. entes : Velocidad de aspersión de solución entre 1 os por minuto) y 17.4 gpm.

Temperatura de entrada entre 78°C y 82 °C.

Temperatura de salida entre 46.0°C y 47.5°C.

Flujo de aire de fluidización entre 37 s por segundo (78.6 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización 2.8 kg/cm2 (4 Se recuperaron 1352 gramos de producto.

Aspersión 3 : 1352 gramos de los gránulos d aspersión 2 se cargaron en un aparato de recub echo fluido Vector FL-1 y se fluidificaron. De rieron por aspersión sobre los gránulos de enz s de una solución acuosa que contenía 88 gramo sición del gránulo) de alcohol polivinílico ( és de 10 minutos.

Temperatura de salida entre 52.0°C y 53.7°C.

Flujo de aire de fluidización entre 38.8 s por segundo (82.5 cfm (pies cúbicos por minuto) Presión de aire de atomización 2.8 kg/cm2 (4 Se recuperaron 1535 gramos de producto final Usando la prueba de atrición de Heuba los fueron analizados para polvo. El nivel de ránulos fue de 1.50 mg/almohadilla .

Ejemplo 7 paración de concentrado de caldo bacteriano con soluble y formulación granulada Preparación de concentrado de enzimas Bacillus subtilis que expresa subtilisina ermentó usando técnicas bien conocidas en la als) . El filtrado aclarado se concentró filtro equipado con una membrana devanada en es on un peso de 10K MWCO (KOCH Membrane System ntrado final contenía 57.23 g/L y 19.1% (p/p) de a seca. La actividad subtilisina en el concen as permaneció soluble antes de la granulación, mina por la actividad de sobrenadante (14,000 os) del concentrado de enzimas, el cual tuvo idad que el concentrado de enzima entero.

Formulación granulada Se preparó una formulación granulada a pa ntrado de ultraflitación como sigue.

Aspersión 1; 643 gramos de cristales de su (Saltee) , con una escala de tamaño de diá cula de 150 µp? a 350 µp? fue cargada en un ap rimiento de lecho fluido Vector Fl-1 y fluidiz Temperatura de entrada 57 °C, incrementado és de 1 hora a 15 minutos.

Temperatura de salida entre 45.2°C y 48.9°C.

Flujo de aire de fluidización entre 34.1 s por segundo (72.4 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización 2.1 kg/cm2 as por pulgada cuadrada), incrementándose a 2. si) durante 30 minutos.

Se recuperaron 769 gramos de producto.

Aspersión 2: 769 gramos de los gránulos d a aspersión 1 se cargaron en un aparato de recub echo fluido Vector FL-1 y se fluidificaron. De rieron por aspersión sobre los gránulos de enz s de una solución acuosa que contenía 400 g to de sodio (27.7% de composición del gránulo Presión de aire de atomización 2.8 kg/cm2 (4 Se recuperaron 1178 gramos de producto.

Aspersión 3; 1178 gramos de los gránulos d aspersión 2 se cargaron en un aparato de recub echo fluido Vector FL-1 y se fluidificaron. De rieron sobre los gránulos de enzima 1127 gramos ión acuosa que contenía 78 gramos (5.4% de com gránulo) de alcohol polivinílico (5/88 de Erk s (5.4% de composición del gránulo) de dio: io (R902 de DuPont) , 20 gramos (1.35% de composi IO) de talco (Nytal 400) y 20 gramos (1 sición del gránulo) de Neodol (23-6.5 d cals) . Los parámetros de recubrimiento por a n los siguientes.

Velocidad de aspersión de solución 5.2 gpm minuto), incrementándose a 12.2 gpm durante 30 Se recuperaron 1356 gramos de producto.

Aspersión 4: 1356 gramos de los gránulos d la aspersión 3 fueron cargados en un apa rimiento de lecho fluido Vector FL-1 y flui és se recubrieron por aspersión sobre los grá a 67.0 gramos de una solución acuosa que co s (0.22% de composición del gránulo) de Neodol hell Chemicals) . Los parámetros de recubrimi sión fueron los siguientes: Velocidad de aspersión de solución 17.0 gpm persión 4 completa.

Temperatura de entrada a 76 °C.

Temperatura de salida entre 44.0°C y 46.5°C.

Flujo de aire de fluidización entre 38 y 38. egundo (80.8 cfm (pies cúbicos por minuto) y 81.7 c Se recuperaron 1359 gramos de producto fina (p/v) al concentrado de enzimas final después filtración en el ejemplo 7 para inducir precip ncentrado con sulfato de sodio se mezcló a 10 °C ras. La suspensión resultante se usó para granul Formulación granulada Se preparó una composición granulada a par ntrado de enzima que contenía enzima precipita .

Aspersión 1: 500 gramos de cristales de su (Saltee) , con una escala de tamaño de diám cula de 150 µt? a 350 µt?,, se cargaron en un ap rimiento de lecho fluido Vector FL-1 y se fluidi o, 999 gramos de solución que contenía una a, 0.7% de talco (Nytal 400), 0.9% de ant blast 882 de Emerald Performance Materials) y ol polivinílico (5/88 de Erkol) se recubrie Presión de aire de atomización 2.17 kg/cm2 as por pulgada cuadrada), incrementándose a 2. si) durante 60 minutos.

Se recuperaron 705 gramos de producto.

Aspersión 2: 705 gramos de los gránulos d aspersión 1 se cargaron en un aparato de recub echo fluido Vector FL-1 y se fluidificaron. De rieron por aspersión sobre los gránulos de enz S de una solución acuosa que contenía 369 gr to de sodio (27.7% de composición del gránulo) .

Los parámetros de recubrimiento por a n los siguientes: Velocidad de aspersión de solución entre os por minuto) y 18.2 gpm.

Temperatura de entrada entre 70°C y 78°C. rieron por aspersión sobre los gránulos de enz s de una solución acuosa que contenía 72 gramos sición del gránulo) de alcohol polivinílico ( ) , 72 gramos (5.4% de composición del grán do de titanio (R902 de DuPont) , 18 gramos (1 sición del gránulo) de talco (Nytal 400) y 18 % de composición del gránulo) de Neodol (23-6.5 cals) . Los parámetros de recubrimiento de a ? los siguientes: Velocidad de aspersión de solución 3.8 gpm minuto), incrementándose a 9.9 gpm durante 60 nidos a 9.9 gpm durante el resto del experimento.

Temperatura de entrada 72 °C, incrementada és de 15 minutos.

Temperatura de salida entre 51.4°C y 52.9°C.

Flujo de aire de fluidización entre 37.8 a 62.0 gramos de una solución acuosa que con s (0.22% de composición del granulo) de Neodol hell Chemicals) . Los parámetros de recubrimie sión fueron los siguientes: Velocidad de aspersión de solución 17.0 gpm persión 4 completa.

Temperatura de entrada 69°C.

Temperatura de salida entre 41.4°C y 42.3°C. Flujo de aire de fluidización entre 38 s por segundo (80.8 cfm (pies cúbicos por minuto Se recuperaron 1228 gramos de producto final Usando la prueba de atrición de Heuba IOS se analizaron para polvo. El nivel de polv IOS fue de 2.50 mg/almohadilla .

Ejemplo 9 ntración de 1% y se mantuvo a 37 °C durante 3 ho o resultante, que contenía enzima tanto solub uble, contenía 57 g/ml de actividad y 18.23% de .

Formulación granulada Se preparó una composición granulada a pa o con enzima precipitada como sigue .

Aspersión 1; 585 gramos de cristales de su (Saltee) , con una escala de tamaño de dián ícula de 150 µp? a 350 µp?, se cargaron en un ap rimiento de lecho fluido Vector Fl-1 y se fluidi to, 993 gramos de solución que contenía una a, 0.7% de talco (Nytal 400), 0.9% de ant blast 882 de Emerald Performance Materials) y ol polivinílico (5/88 de Erkol) , se recubrie rsión sobre los cristales de sulfato de sodi Presión de aire de atomización 2.1 kg/cm2 as por pulgada cuadrada), incrementándose a 2. si) durante 30 minutos.

Se recuperaron 785 gramos de producto.

Aspersión 2: 785 gramos de los gránulos d a aspersión 1 se cargaron en un aparato de recub echo fluido Vector FL-1 y se fluidificaron. De rieron por aspersión sobre los gránulos de enz S de una solución acuosa que contenía 400 g to de sodio (27.7% de la composición del gránul etros de recubrimiento por aspersión fue entes : Velocidad de aspersión de solución entre os por minuto) y 21.2 gpm.

Temperatura de entrada entre 65°C y 78°C.

Temperatura de salida entre 44.1°C y 45.6°C. rieron por aspersión sobre los gránulos de enz s de una solución acuosa que contenía 78 gramos sición del gránulo) de alcohol polivinílico ( ) , 78 gramos (5.4% de la composición del grá do de titanio (R902 de DuPont) , 20 gramos {1.35 sición del gránulo) de talco (Nytal 400) y 2 % de la composición del gránulo) de Neodol (2 Chemicals) . Los parámetros de recubrimie sión fueron los siguientes: Velocidad de aspersión de solución 3.0 gpm minuto), incrementándose a 8.0 gpm durante 60 nidos a 8.0 gpm durante el resto del experimento.

Temperatura de entrada 73 °C, incrementado és de 30 minutos.

Temperatura de salida entre 52.0°C y 52.9°C.

Flujo de aire de fluidización entre 80.3 c omposición del gránulo) de Neodol (23-6.5 d cals) . Los parámetros de recubrimiento por a n los siguientes: Velocidad de aspersión de solución 12.6 gpm persión 4 completa.

Temperatura de entrada 63 °C.

Temperatura de salida entre 41.1°C y 44.1°C. Flujo de aire de fluidización entre 38.1 s por segundo (80.9 cfm (pies cúbicos por minuto Se recuperaron 1349 gramos de producto final Usando la prueba de atrición de Heuba IOS fueron analizados para polvo. El nivel de ránulos fue de 1.4 mg/almohadilla .

Ejemplo 10 reparación de concentrado de caldo fúngico con en ibe en la solicitud de patente de E.U. 0246406. El caldo aclarado se concentró lOx us ana devanada en espiral PES con un MWCO de 1 ntrado de enzimas se almacenó a 10 °C hasta que e para usar. Después del almacenamiento, se pitados. Los precipitados fueron removid ifugación (10,000 g, 20 minutos, 10°C) . El sobr resultante se usó para la preparación sición granulada como la descrita a continuación.

Formulación granulada Se preparó una composición granulada a part a soluble en caldo de fermentación fúngico como Aspersión 1: 466 gramos de cristales de su (Saltee) , con una escala de tamaño de diám cula de 150 µ?? a 350 µt?, se cargaron en un ap rimiento de lecho fluido Vector FL-1 y se fluidi Temperatura de salida entre 46.7°C y 49.1°C.

Flujo de aire de fluidización entre 35. s por segundo (75.3 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización 2.1 kg/cm2 as por pulgada cuadrada) , incrementándose a 2. si) durante 45 minutos.

Se recuperaron 615 gramos de producto.

Aspersión 2 : 615 gramos de gránulos de enzit sión 1 se cargaron en un aparato de recubrim fluido Vector FL-1 y se fluidificaron. Des rieron por aspersión sobre los gránulos de enz s de una solución acuosa que contenía 533 g to de sodio (40% de la composición del gránulo etros de recubrimiento por aspersión fue ientes : Aspersión 3 : 1113 gramos de gránulos de e aspersión 2 fueron cargados en un apar rimiento de lecho fluido Vector FL-1 ificaron. Después se recubrieron por aspersió gránulos de enzima 667 gramos de una solución contenía 40 gramos (3% de composición del grá ol polivinílico (5/88 de Erkol) y 80 gramos sición del gránulo) de talco (Nytal 400) . etros de recubrimiento por aspersión fue ientes : Velocidad de aspersión de solución 4 os por minuto), incrementándose a 11.0 gpm du tOS .

Temperatura de entrada 68 °C, incrementada és de 10 minutos.

Temperatura de salida entre 44.2°C y 52.4°C.

Ejemplo 11 eparación de caldo fúngico con precipitados de en formulación granulada Trichoderma reseei que expresa gluco-amil escribió en el ejemplo 10 se fermentó usando conocidas en la técnica. Después de la fermenta contenía principalmente enzima gluco-amilasa células fueron eliminadas sin lisis como se des atente de E.U.A. No. 5,801,034. El precipitado a centrifugación del concentrado de enzimas del e añadió al caldo con células eliminadas. E tante contenía enzima tanto soluble como insolu que contenía enzima exhibió 447 u/mL de act (p/p) de sólidos secos. La cantidad de pre nte se determinó al medir la actividad de la leta, y el sobrenadante (14,000rpm, 5 minutos) lacion granulada Se preparó una composición granulada a pa fúngico que contenía enzima precipitada como si Aspersión 1: 472 gramos de cristales de su (Saltee) , con una escala de tamaño de diám cula de 150 µp? a 350 im, se cargaron en un ap rimiento de lecho fluido Vector FL-1 y se fluidi to, 494 gramos de solución que contenía una a, 5% de almidón de maíz (Cargill Foods) y 1% de inílico (5/88 de Erkol) , fueron recubiert sión sobre los cristales de sulfato de sodi etros de recubrimiento por aspersión fue entes : Velocidad de aspersión de solución 8.2 gpm minuto), incrementándose a 10.8 gpm durante 10 ntuvieron 10.8 gpm durante el resto del experime Aspersión 2; 612 gramos de los gránulos d aspersión se cargaron en 1 aparato de recubrim fluido Vector FL-1 y se fluidificaron. Des rieron por aspersión sobre los gránulos de enz s de una solución acuosa que contenía 533 gr to de sodio (40% de la composición del gránulo etros de recubrimiento de aspersión fuer entes : Velocidad de aspersión de solución entre os por minuto) y 23.4 gpm.

Temperatura de entrada entre 74 °C y 82 °C.

Temperatura de salida entre 44.6°C y 45.5°C.

Flujo de aire de fluidización entre 38.2 s por segundo (81.2 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización 2.6 kg/cm2 (3 etros de recubrimiento por aspersión fue entes : Velocidad de recubrimiento de aspersión de gpm (gramos por minuto) , incrementándose a 1 te 60 minutos.

Temperatura de entrada 78°C, incrementados te 60 minutos.

Temperatura de salida entre 52.7°C y 53.1°C.

Flujo de aire de fluidización entre 39.1 s por segundo (83.2 cfm (pies cúbicos por minuto Presión de aire de atomización 2.8 kg/cm2 (4 Se recuperaron 1190 gramos de producto fina Usando la prueba de atrición de Heuba IOS se analizaron para polvo. El nivel de polv IOS fue de 7.9 mg/almohadilla . p/p) se mantuvieron a 22 °C en recipientes cerra idad enzimática residual se midió desp enamiento en tiempo 0, 5 semanas, 2 meses y atos se resumen en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2 Estabilidad de gránulo de enzima en detergente Ejemplo 13 imiento de aplicación de granulos preparados a p enados en detergente durante 1 semana se llevaro o varias manchas: CS-26 (almidón de maíz en a (almidón de papa en algodón) , CS-28 (almidón godón) , CS-29 (almidón de tapioca en algodón) y dón en algodón) .

Prueba de lavado La prueba de lavado se llevó a cabo en una ora Miele Novotronic W822: programa "Normal" /"A ratura 40°C, dureza de agua 8.5 GH. Detergente lanqueador: dosis 8 g/L (=136 g/lavado) , incluye Purafect 4000 E (disponible de Genencor Divi eo US Inc.) y 0.139 g de gránulos del ejemplo 4.

Mediciones de rendimiento Las mediciones se hicieron con un col lta CR300: CIELAB L*ab Scale, D65 de ilu dar, sin filtro UV, fondo blanco. La remo Ejemplo 14 a estabilidad enzimatica durante almacenamiento ánulos preparados a partir de concentrado que con componentes celulares y enzima insoluble Los gránulos de enzima preparados como se d l ejemplo 7-9 fueron evaluados para estabilid enamiento. Las condiciones usadas fueron 37°C a de 70% de humedad relativa con muestras pu ientes abiertos. La actividad residual se mid ló con base en la actividad inicial. Los en en la siguiente tabla 3.

Tabla 3 Tiempo (días) Muestra 0 3 6 7 jemplo #7 (granulo de enzima 100% 96% 97% 100% soluble) jemplo #8 (gránulo de enzima 100% 106% 109% 106% precipitada) Tabla 4 Propiedades del concentrado de lisado de enzima Ejemplo 16 abilidad enzimática durante almacenamiento en bas rgente con blanqueador para gránulos preparados concentrado que contiene componentes celulares y ecipientes de polipropileno abiertos. La a ual se midió y se calculó con base en la a al . Los datos se muestran en la figura 2.

Ejemplo 17 aración de solución de enzima aclarada a partir d de fermentación que contiene cristales de enzi Todas las operaciones se llevaron a ratura ambiente .

Material de partida Una cepa de Tricohderma reesei diseña sar una proteasa aspártica se fermentó bajo con dares conocidas en la técnica. Por ejemplo te de E.U.A. No. 7,429,476. El pH del C ntación en el momento de la recuperación fue d nzima había formado cristales grandes con 98 idad total en la centrifugación. rtado .

Solubilización del cristal 131 g De la torta de filtración de l ior se transfirieron a un vaso de precipitad aron con 87 g de 50 m de ácido sulfúrico. De ar durante 45 minutos a temperatura ambiente, l un pH de 3.2 y un microscopio confirmó que t ales de proteasa se habían disuelto.

Filtración 2 - Aclaración de solución de pr 184 g De la mezcla de solubilización de c etapa anterior se filtraron en el mismo tipo d l usado en la filtración 1. El filtrado se des ólidos sedimentados al enjuagar con 50 g de agu perficie de la torta se sentía seca. Se recogi filtrado y 80 g de torta de filtración rtados . El filtrado claro contenía 88% de la a ntación, el caldo se liso usando 0.01% ( ima, durante 2 horas, seguido por tratamiento c C durante 2 horas. 18.1 Preparación de caldo que contiene le (recuperación convencional) 5 g De material de partida se centrifu 0 rpm durante 10 minutos para separar la fase s fase líquida. El sobrenadante contenía 88% idad enzimática. La pureza por sólidos secos fu reza por proteína total fue de 14%. 18.2 Preparación de caldo que contiene uble Cristalización de enzima oc-amilasa en Usad Se usaron 40 g del material de partida. E o se ajustó a 5 usando 20% de ácido acético. ado se incubó en un agitador: 50 °C y 80 Se añadieron a la suspensión 3 g de propilengli ajustó a 6.5 usando 5% de NaOH y se mezclaron t sión a temperatura ambiente durante 18 horas. L cubó después a 40°C durante 2 horas.

Centrifugación #2 - Aclaración de soluci sa La mezcla de solubilización de crista ifugada a 14,000 rpm durante 10 minutos para se sólida de la fase líquida. El centrado re enadante líquido) se aclaró más usando un fi ga de 0.45 µt?. La solución de amilasa clara e la actividad encontrada en lisado inicial us alización. La pureza por sólidos secos fue de a por proteína total fue de 34%. 18*3 Preparación de caldo que contenía uble usando floculación sólida de la fase líquida. El concentrad ene 85% de la actividad encontrada en el lisado para cristalización. La pureza por proteína t %.

Las purezas de las soluciones de ot eradas como se describió en los ejemplos 18.1, se presentan en la tabla 5. La pureza de la e ló al dividir la actividad de la enzima e dad total de sólidos secos o al dividir e ntración de proteína total.

Tabla 5 Propiedades de la solución de enzima aclarada emplo Pureza de Purificación Pureza de Purifica enzima por relativa al enzima por relativa sólidos ejemplo 18.1 proteína ejemplo secos total 8.1 6% 1.0 14% 1.0 8.2 42%+ 7.4 34% 2.4 ción .

Todas las publicaciones, patentes y solici te citadas en la presente se incorporan en la pr a de referencia en sus totalidades para to sitos y al mismo grado que si cada publicación, licitud de patente individual estuviera espec idualmente indicada como estando incorporada a por referencia.

Se hace constar que con relación a esta f método conocido por la solicitante para llev ica la citada invención, es el que resulta cia nte descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. Un método para recuperar una enzima ins r de un caldo microbiano que comprende bianas y/o restos celulares de células micr terizado porque comprende recuperar enzima insol microbiano sin remover las células microbia s celulares, produciendo de esta manera una com comprende enzima insoluble recuperada y bianas y/o restos celulares, en donde por lo m de la enzima es insoluble en el caldo microbian 2. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el caldo microbiano se nte un método seleccionado de: bianas, causando de esta manera que por lo me de la enzima se vuelva insoluble; y expresar una enzima en células microbiana de fermentación, en donde por lo menos una par a es insoluble en el medio de fermentación. 3. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque la recuperación comprende una operación de recuperación seleccion icionamiento de caldo; lisis celular; homogene ltración y separación de sólidos-líquidos, en donde cuando la recuperación comprende q de las operaciones de recuperación son llevadas operaciones de recuperación se pueden llevar a uier orden. 4. El método de conformidad con la reivin racterizado porque la recuperación comprende rem iltración . 7. El método de conformidad con la reivin racterizado porque remover por lo menos parte de da del caldo microbiano comprende un cionado de filtración al vacío en tambor gi ación en placa y armazón, filtración en ifugación, separación por ciclón, decan ración. 8. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque la enzima insoluble se pr r un precipitante a un caldo microbiano que c enzima soluble, haciendo de esta manera a por parte de la enzima insoluble en el caldo microb el precipitante se selecciona de ajuste de pH emperatura, adición de sal, adición de ácido, ad , adición de por lo menos otra proteína, adi racterizado porque las células microbianas inta as microbianas muertas. 12. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el caldo microbiano que c as microbianas y/o restos celulares comprende u élulas microbianas, en donde el lisado de bianas se produce al romper membranas de bianas . 13. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque comprende además romper memb as microbianas de las células microbianas intac cir un lisado de células microbianas que comp a insoluble recuperada. 14. El método de conformidad con la reivin 13, caracterizado porque romper membranas de biana comprende poner en contacto células mic " ado por alto esfuerzo cortante; extrusión a p o de alto esfuerzo cortante. 17. El método de conformidad con la reivin 13, caracterizado porque comprende además homo isado de células microbianas para producir un l ias microbianas homogeneizado . 18. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque comprende además diafil o de células microbianas. 19. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque las células microbianas son rianas . 20. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células bacterianas son acillus . 21. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células de Trichode as de Trichoderma reesei . 25. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque por lo menos alrededor de 10 a es insoluble en el caldo microbiano. 26. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque la pureza de la enzima inso menta en al menos aproximadamente 10% en compara reza de la enzima insoluble antes de la recupera 27. Una composición que se produce con el m rmidad con la reivindicación 1, caracterizada ende enzima insoluble y células microbianas y/ ares recuperados. 28. La composición de conformidad indicación 27, caracterizada porque comprende ad ños un ingrediente de formulación. (c) remover los sólidos de la solución prep do con la etapa (b) , produciendo de esta ma ión de enzimas líquida aclarada. 30. Un método para elaborar una fori lada que contiene enzimas, caracterizado ende producir un gránulo que contiene enzi ende una composición que comprende enzima ins as microbianas y/o restos celulares. 31. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la composición que comprend uble y células microbianas y/o restos célul ce mediante un método que comprende recupera luble de un caldo microbiano que comprende bianas y/o restos celulares sin remover las bianas y/o restos celulares, produciendo de est composición que comprende enzima insoluble recu sión y recubrimiento en recipiente. 33. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque comprende recubrir una c ene enzima que comprende la enzima insoluble y bianas y/o restos celulares sobre un núcleo sador de lecho fluido de aspersión superior, en o comprende opcionalmente recubrir una capa de s cleo y la capa que contiene enzima. 34. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque comprende además recubrir comprende una sal de barrera sobre la capa que a . 35. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque comprende además recubrir ecubrimiento exterior que comprende un polím nto sobre la capa de sal de barrera. J 148 sión superior. 38. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el núcleo que contiene e ce mediante granulación de alto esfuerzo cortant 39. Un gránulo que contiene enzima, carac e comprende : un núcleo; opcionalmente, una capa de sal recubierta o; y una capa que contiene enzima recubierta o o capa de sal, en donde la capa que contien ende una composición que comprende enzima ins as microbianas y/o restos celulares. 40. El gránulo que contiene enzima de con la reivindicación 39, caracterizado porque la com comprende enzima insoluble y células microbia la reivindicación 39, caracterizado porque c s una capa de sal de barrera recubierta sobre ontiene enzima. 42. El gránulo que contiene enzima de con la reivindicación 39, caracterizado porque c s una capa de recubrimiento exterior recubierto de sal de barrera, en donde la capa de recub ior comprende un polímero y/o pigmento. 43. Un gránulo que contiene enzima carac e comprende un núcleo que contiene enzima y una de barrera y/o una o más capas de recubrimie n el núcleo, en donde el núcleo compre sición que comprende enzima insoluble y bianas y/o restos celulares. 44. El gránulo que contiene enzima de con a reivindicación 43, caracterizado porque la com 45. El gránulo que contiene enzima de con la reivindicación 43, caracterizado porque el nú ene enzima se produce mediante procesamiento en o por aspersión superior. 46. El gránulo que contiene enzima de con la reivindicación 43, caracterizado porque el nú iene enzima se produce mediante granulación rzo cortante. 47. Una composición detergente caracterizad ende el gránulo que contiene enzima de conform uiera de las reivindicaciones 39 a 46. 48. Una composición para el procesami iles, caracterizada porque comprende el grán iene enzima de conformidad con cualquiera ndicaciones 39 a 46. 49. Una composición de alimento para a ares . 52. La formulación líquida de conformidad ndicación 51, caracterizada porque la composic ende enzima insoluble y células microbianas y/ ares se produce mediante un método que c erar enzima insoluble de un caldo microbiano sin células microbianas y/o restos celulares, produc manera una composición que comprende enzima i erada y células microbianas y/o restos c lul por lo menos una parte de la enzima es insolub microbiano. 53. La formulación líquida de conformidad indicación 51, caracterizada porque comprende ad S ingredientes de formulación seleccionados de un sal; un conservador; un agente tensioactiv xidante .