BRPI0914982B1

BRPI0914982B1 - Métodos para produção de uma formulação granular contendo enzima e grãnulo contendo enzima

Info

Publication number: BRPI0914982B1
Application number: BRPI0914982-1A
Authority: BR
Inventors: Michael Bodo; Robert I. Christensen; Rajdeep S. Dhaliwal; Meng H. Heng
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2008-06-09
Filing date: 2009-06-09
Publication date: 2019-09-24
Also published as: CO6331343A2; RU2010154462A; WO2009152176A3; EP2285823B2; JP2014076053A; NZ589121A; AU2009257559A1; CN102056936A; CA2727443C; EP2285823B1; US20110189344A1; DK2285823T4; EP2285823A2; WO2009152176A2; BRPI0914982A2; MX2010013179A; US20160264956A1; KR20110028272A; CA2727443A1; US20130337531A1

Abstract

métodos para produção de uma formulação granular contendo enzima e grânulo contendo enzima a presente invenção refere-se a métodos 5 para recuperação e formulação de enzimas insolúveis a partir de um caldo de fermentação microbiana, sem a remoção de resíduos celulares. são também fornecidas formulações líquidas e granulares compreendendo enzimas insolúveis.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos para recuperar uma ou mais enzimas de interesse a partir de um caldo de fermentação microbiana na presença de células microbianas ou resíduos celulares, e formulações sólidas e líquidas preparadas a partir de uma composição contendo enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares.

Antecedentes

A recuperação convencional de enzimas a partir do caldo de fermentação microbiana para usos industriais em formas de produto líquido ou sólido tipicamente envolve diversas etapas de processamento. Processos de recuperação mais convencionais incluem quatro etapas similares que ocorrem sequencialmente: remoção de componentes insolúveis de não produto de caldo microbiano; isolamento de produtos; purificação; e polimento. (Veja, por exemplo, Enzymes in Industry: Production and Applications (2007) Wolfgang Aehle, ed., 3^a edição, Wiley-VCH, página 49; Bioseparations: Science and Engineering (2003) R.G. Harrison, P. Todd, S.R. Rudge, D.P. Petrides, Oxford University Press, página 32.) Por exemplo, a recuperação e formulação de uma enzima intracelularmente produzida geralmente incluem as seguintes etapas de processamento: (1) lise celular; (2) pré-tratamento;

(3) separação celular; (4) concentração; e (5) formulação - (a) adição química para estabilização líquida, seguido por filtragem de polimento; ou (b) adição química para estabilização sólida, seguida por secagem.

A lise celular libera a(s) enzima(s) de interesse a partir das células por rompimento das paredes celulares. A lise celular pode ser obtida

Petição 870170091441, de 27/11/2017, pág. 7/11 contatando-se as células com uma enzima que degrada as paredes celulares tal como lisoenzima, induzindo mudanças de ambiente de fermentação tal como alteração no pH, temperatura, concentração de oxigênio dissolvido, concentração de glicose, concentração de sal, ou concentração de outros aditivos para causar lise espontânea, por rompimento mecânico da parede celular tal como por homogeneização, ou por uma combinação destes métodos. Para a enzima extracelularmente expressa (secretada no meio de cultura), a lise celular é opcional. (Veja, por exemplo, Isolation and Purífication ofProteins (2003) R. Hatti-Kaul e B. Mattiasson, ed., Marcell Dekker, Inc., páginas 1 a 27).

Uma etapa de separação celular é empregada após a lise celular para produzir uma solução clarificada contendo a(s) enzima(s) de interesse. Tipicamente, a separação celular envolve centrifugação e/ou filtração, para remover os resíduos celulares e qualquer material insolúvel produzido durante e/ou após a fermentação, e/ou como um resultado de lise celular. Métodos de centrifugação adequados incluem centrifugação de decantador ou pilha de disco. Métodos de filtração adequados incluem filtração a vácuo giratória, filtração através de uma prensa filtrante placa-e-estrutura, ou filtração através de um microfiltro de membrana.

A separação celular usando centrifugação é frequentemente um compromisso entre clareza e produtividade. É prática comum usar centrifugação de produtividade elevada e em seguida remover as quantidades de traço de sólidos suspensos em quantidades suficientes para interferir com subsequentes etapas de processamento por meio de filtração de alta produtividade. A maioria dos métodos de filtração em prática atualmente requer o uso de auxiliares de processamento tal como terra diatomácea ou similar e carbono (Pedido de PCT n° WO01/87468) para obter eficiência de separação. A terra diatomácea melhora a produtividade do processo de filtração e clareza do filtrado.

Uma etapa de pré-tratamento é tipicamente empregada antes da separação física de células ou resíduos celulares do líquido contendo a(s) enzima(s) de interesse. A separação de resíduos celulares sem uma tal etapa é geralmente não econômico e demorada devido ao pequeno tamanho de partícula dos resíduos e natureza viscosa de caldo de fermentação lisado. Frequentemente, o pré-tratamento incluía introdução de floculante(s) ao caldo lisado ou não lisado. Os polieletrólitos receberam muita atenção como um método para realçar a floculação de célula na remoção de célula bacteriana a partir do caldo de fermentação. Baran (1988) Colloids Surf. 31:259-264; Bautista e outro, (1986) Biotechnol. Lett. 8:315-318; Chen e Berg (1993) Chem. Eng. Sei. 48:1775-1784; Cumming e outro, (1996) Biotechnol. Tech. 4:55-60; Hustedt e Theelen (1989) DeChema Biotechnology Conferences - VCH Veragsgesselschaft 3:1071-1075; Ramsden e outro, (1998) Biotechnol. Tech. 12:599-603; Shan e outro, (1996) J. Biotechnol. 49:173-178.

A floculação facilita a remoção de resíduos celulares da porção líquida contendo a(s) enzima(s) de interesse. Alguns floculantes comumente usados incluem polietilenoimina, cloreto de polidialildimetilamônio, e copolímero de acrilamida de cloreto de metacriloiloxietiltrimetilamônio. A floculação de resíduos celulares é um fenômeno com base em carga, requerendo baixa resistência iônica para eficácia. Como um resultado, a diluição do caldo de fermentação por água é geralmente requerido para flocular os resíduos celulares.

Dependendo da concentração e pureza do produto final desejadas, o líquido clarificado contendo a(s) enzima(s) de interesse da etapa de separação celular pode satisfazer os requisitos para a formulação para produzir o produto. Entretanto, outro processamento é frequentemente requerido para aumentar a concentração de enzima antes da formulação. A concentração envolve desidratação, que é tipicamente obtida por ultrafiltração ou evaporação para enzimas estáveis ao aquecimento. Outros métodos para concentração incluem precipitação, cristalização, e cromatografia. (Veja, por exemplo, Pedido de PCT n° WO 91/09941.) Estas não são práticas comuns para recuperação de enzima devido ao custo envolvido.

Como acima delineado, recuperação e formulação convencionais de enzimas incluem múltiplas etapas. Cada etapa adicionada a um pro cesso de fabricação diminui a produção de processo total e acrescenta custo na forma de energia, tempo, e mão-de-obra. Avanços na tecnologia de expressão resultaram na capacidade de obter concentrações de enzima relativamente elevadas (por exemplo, 10 a 100 g/l) no caldo de fermentação. Em alguns casos, o nível de expressão excede o limite de solubilidade de uma enzima de interesse, e a enzima está presente em uma forma precipitada ou cristalina no término da fermentação. Quando um processo de recuperação tradicional como acima descrito é usado para recuperar a enzima a partir do caldo de fermentação, a enzima que se precipita será removida simultaneamente com resíduos celulares insolúveis e outro material insolúvel durante a etapa de separação celular. Como um resultado, a recuperação produzida será baixa. Uma solução proposta para este problema inclui a adição de um poliol imediatamente após uma etapa de recuperação a uma solução de enzima supersaturada para prevenir sua precipitação. (Patente Européia n° EP1417301) Entretanto, um tal processo requer custos de material adicional e adiciona uma etapa extra ao processo de recuperação. Um método para a recuperação de enzima insolúvel sem a adição de um poliol seria vantajoso.

Os grânulos contendo enzima são incorporados nos produtos em diversas indústrias, incluindo indústrias de detergente, processamento têxtil, alimento (por exemplo, cozimento), alimentação de animal, e etanol combustível. Tais grânulos podem ser preparados por diversas tecnologias, incluindo revestimento por spray de leito fluidizado, granulação por cisalhamento elevado, extrusão, esferonização, pastilhamento, e secagem por spray.

Tradicionalmente, tais grânulos contendo enzima contêm enzimas que estão em forma solúvel antes da incorporação nos grânulos, e se expressos em um hospedeiro microbiano, são pelo menos parcialmente purificadas para remover células microbianas e/ou resíduos celulares produzidos a partir da lise das células.

Em casos onde a enzima insolúvel está presente no caldo microbiano, a solubilização é requerida antes da recuperação. Em alguns ca sos isto pode ser facilmente obtido alterando o pH e/ou temperatura ou por adição de sais simples. Em outros casos, a adição de polióis ou açúcares é necessária. A separação celular pode ser realizada subsequente à solubilização. A corrente clarificada resultante é geralmente bastante diluída para ser usada para formulação. Uma etapa de concentração, tipicamente por ultrafiltração, é usada. O açúcar que foi adicionado atravessará livremente a membrana de ultrafiltração e tornar-se-á uma corrente de excreção. O concentrado resultante pode geralmente ser formulado em produto líquido. Entretanto, ele não é sempre receptivo à granulação. Como um resultado, a remoção do açúcar antes da granulação não é necessária. Isto pode ser obtido por diafiltração, pela qual mais excreção é gerada. O impacto deste método é o aumento significante de custo tanto para os produtos líquidos quanto sólidos, por virtude das etapas de processamento e excreção disposal. Esta invenção fornece um meio alternativo de produzir o produto economicamente a partir de tal caldo.

Existe uma necessidade de formulações de enzima granulares em que a enzima está em forma insolúvel e em que as células e/ou componentes de célula insolúvel não são removidos.

Breve Sumário da Invenção

A invenção fornece métodos para recuperação e formulação de enzimas insolúveis, e composições compreendendo enzimas insolúveis recuperadas e formuladas como descrito aqui.

Em um aspecto, um método é fornecido para a recuperação de uma enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano que compreende células microbianas e/ou resíduos celulares de células microbianas, compreendendo recuperar a enzima insolúvel do caldo microbiano sem remover as células microbianas e/ou resíduos celulares, desse modo produzindo uma composição que contém enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares, em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel no caldo microbiano. Em uma modalidade, um método é fornecido para a recuperação de uma enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano, compreendendo: (a) suprimento de um caldo microbiano compreendendo células microbianas e uma enzima, em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel no caldo microbiano; e (b) recuperação de enzima insolúvel no caldo microbiano sem remover as células microbianas e/ou resíduos celulares, desse modo produzindo uma composição que contém enzima insolúvel recuperada, em que a composição compreende células microbianas e/ou resíduos celulares. Em algumas modalidades, a enzima insolúvel é enzimaticamente ativa (isto é, a enzima é cataliticamente ativa no estado sólido ou tem potencial catalítico e torna-se cataliticamente ativa quando solubilizada em um solvente apropriado e sob condições apropriadas para a catalise ocorrer).

Em algumas modalidades, o caldo microbiano é produzido por um método selecionado de: mistura de uma enzima com um caldo microbiano que compreende células microbianas e/ou resíduos celulares, em que a enzima não é produzida pelas células microbianas e em que a enzima é insolúvel no caldo microbiano ou em que a enzima é solúvel no caldo microbiano e o método também compreende tornar pelo menos um pouco da enzima insolúvel pela adição de um precipitante; adição de um precipitante a um caldo microbiano compreendendo uma enzima solúvel expressa pelas células microbianas, desse modo fazendo com que pelo menos um pouco da enzima torne-se insolúvel; e expressão de uma enzima nas células microbianas em um meio de fermentação, em que pelo menos um pouco da enzima in insolúvel no meio de fermentação.

Em algumas modalidades, a recuperação inclui pelo menos uma operação de recuperação selecionada de condicionamento de caldo; lise celular; homogeneização; diafiltração; e separação de sólido-líquido. Em algumas modalidades, a recuperação inclui duas ou mais operações de recuperação selecionadas de condicionamento de caldo; lise celular; homogeneização; diafiltração; e separação de sólido-líquido, realizadas em qualquer ordem.

Em algumas modalidades, a recuperação de enzima insolúvel compreende remover pelo menos parte da fase sólida do caldo microbiano. Em algumas modalidades, remover pelo menos parte da fase sólida do cal do microbiano compreende a concentração dos sólidos de caldo microbiano. Em algumas modalidades, a concentração do caldo microbiano compreende um processo de filtração de membrana selecionado de ultrafiltração, microfiltração, osmose reversa, e nanofiltração. Em algumas modalidades, a remoção de pelo menos parte da fase sólida do caldo microbiano, por exemplo, a concentração do caldo microbiano, compreende um processo selecionado de filtração a vácuo em cilindro rotatório, filtração por placa e estrutura, filtração por faixa, centrifugação, separação por ciclone, decantação, e evaporação.

Em algumas modalidades, a recuperação enzima insolúvel compreende diafiltração.

Em algumas modalidades, o caldo microbiano é produzido por desenvolvimento de uma célula microbiana que expressa a enzima em um meio de crescimento sob condições adequadas para expressão da enzima, em que a enzima é insolúvel sob as condições de crescimento. Em outras modalidades, o caldo microbiano é produzido por desenvolvimento de uma célula microbiana que expressa a enzima em um meio de crescimento sob condições adequadas para expressão da enzima, em que a enzima é solúvel sob as condições de crescimento, e em que um precipitante é adicionado antes da recuperação da enzima para tornar pelo menos um pouco da enzima insolúvel no caldo microbiano. Em algumas modalidades, o precipitante é selecionado a partir do ajuste de pH, ajuste de temperatura, adição de sal, adição de ácido, adição de base, adição de pelo menos uma outra proteína, adição de tampão, adição de areia de polieletrólito, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, enzima insolúvel é produzido por adição de um precipitante a um caldo microbiano compreendendo uma enzima solúvel, desse modo tornando pelo menos um pouco da enzima insolúvel no caldo microbiano, em que o precipitante s selecionado de ajuste de pH, ajuste de temperatura, adição de sal, adição de ácido, adição de base, adição de pelo menos uma outra proteína, adição de tampão, e adição de polieletrólito, ou uma combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, a composição que contém enzima insolúvel recuperada compreende células microbianas intactas. Em uma modalidade, as células microbianas intactas são células microbianas vivas. Em outra modalidade, as células microbianas intactas são células microbianas mortas. Em outras modalidades, a composição que contém enzima insolúvel recuperada compreende células microbianas lisadas.

Em algumas modalidades em que a enzima expressa é insolúvel no caldo microbiano, o método compreende o rompimento de membranas de célula microbiana para produzir um lisado de célula microbiana, antes ou após a recuperação de enzima insolúvel. Em outras modalidades em que a enzima expressa é solúvel no caldo microbiano, o método compreende o rompimento de membranas de célula microbiana antes ou após a adição de um precipitante, antes da recuperação da enzima precipitada.

Em alguma modalidade, o caldo microbiano compreendendo células microbianas e/ou resíduos celulares compreende um lisado de célula microbiana, produzido por rompimento das membranas de célula microbiana de células microbianas intactas.

Em algumas modalidades, o rompimento de membranas de célula microbiana compreende contatar a célula com uma enzima que é capaz de realizar a lise celular microbiana. Em uma modalidade, a enzima que é capaz de realizar a lise celular microbiana é uma enzima lisoenzima. Em outras modalidades, o rompimento de membranas de célula microbiana compreende um processo de rompimento de membrana celular mecânico, tal como homogeneização. Em algumas modalidades, o rompimento de membranas de célula microbiana compreende um processo de cisalhamento mecânico, por exemplo, selecionado de homogeneização; mistura por cisalhamento elevado; extrusão por pressão; e bombeamento por cisalhamento elevado. Em algumas modalidades, o método também compreende homogeneização do lisado de célula microbiana para produzir um lisado de célula microbiana homogeneizada antes ou após a recuperação da enzima insolúvel.

Em algumas modalidades, o método também compreende diafiltrar o lisado de célula microbiana antes ou após a recuperação da enzima insolúvel. Em algumas modalidades, o método também compreende homogeneizar e diafiltrar o lisado de célula microbiana antes ou depois de recuperar a enzima insolúvel.

Em algumas modalidades, as células microbianas são células bacterianas. Em algumas modalidades, as células bacterianas são células Bacillus. Em algumas modalidades, as células Bacillus são células Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis.

Em algumas modalidades, as células microbianas são células fúngicas. Em algumas modalidades, as células fúngicas são células Tríchoderma. Em algumas modalidades, as células Tríchoderma são células Tríchoderma reesei.

Em algumas modalidades, pelo menos cerca de qualquer de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% da enzima é insolúvel no caldo microbiano.

Em algumas modalidades dos métodos de recuperação, a pureza da enzima insolúvel é aumentada em pelo menos cerca de 10%.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição produzida de acordo com um método para a recuperação de uma enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano como descrito aqui, em que a composição compreende a enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares. Em uma modalidade, a composição também compreende pelo menos um ingrediente de formulação.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a produção de uma solução de enzima líquida clarificada, compreendendo: (a) suprimento de uma composição que contém enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares, por exemplo, produzida de acordo com um método para a recuperação de uma enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano, como descrito aqui; (b) solubilização de pelo menos parte da enzima insolúvel adicionando uma ou mais substâncias que dissolvem a enzima e/ou alterando as condições físicas, de modo que a enzima dissolva-se pelo menos parcialmente, desse modo produzindo uma solução de enzima solúvel; e (c) remover os sólidos da solução preparada na etapa (b), desse modo produzindo uma solução de enzima líquida clarificada.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de produzir um grânulo contendo enzima, compreendendo produzindo um grânulo contendo enzima que compreende uma composição que contém enzima insolúvel, por exemplo, enzima insolúvel recuperada, e células microbianas e/ou resíduos celulares. Em uma modalidade, o método compreende: (a) suprimento de uma composição que compreende enzima insolúvel, por exemplo, enzima insolúvel recuperada, e células microbianas e/ou resíduos celulares; e (b) produzindo um grânulo contendo enzima compreendendo enzima insolúvel. Em algumas modalidades, a composição que contém enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzida de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui para a recuperação de uma enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano. Em uma modalidade, uma composição que compreende enzima e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzida por um método compreendendo a recuperação de enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano compreendendo células microbianas e/ou resíduos celulares sem remover as células microbianas e/ou resíduos celulares, desse modo produzindo uma composição que contém enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares, em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel no caldo microbiano. Em algumas modalidades, a enzima é enzimaticamente ativa no grânulo (isto é, a enzima é cataliticamente ativa no estado sólido ou tem potencial catalítico e torna-se cataliticamente ativa quando solubilizada em um solvente apropriado e sob condições apropriadas para a catálise ocorrer).

Em uma modalidade, um grânulo contendo enzima é produzido in um processador de leito fluidizado de spray de topo. Em algumas modalidades, um grânulo contendo enzima é produzido por um processo de granulação selecionado de processamento de leito fluidizado de spray de topo; processo de revestidor Wurster de spray de base; granulação por cisalhamento elevado; extrusão; e revestimento de panela.

Em uma modalidade, o método compreende revestir uma camada contendo enzima compreendendo a composição que contém enzima in solúvel, por exemplo, enzima insolúvel recuperada, e células microbianas e/ou resíduos celulares em um núcleo no referido processador de leito fluidizado de spray de topo. O método opcionalmente inclui revestimento de uma camada de sal entre o núcleo e uma camada contendo enzima. Em uma modalidade, o método também compreende revestir uma camada compreendendo um sal de barreira sobre a referida camada contendo enzima. Em uma modalidade, o método também compreende o revestimento de uma camada de revestimento externo que compreende um polímero e/ou pigmento sobre a referida camada de sal de barreira.

Em uma modalidade, o método compreende o revestimento de uma camada de sal de barreira e/ou uma ou mais camadas de revestimento sobre um núcleo contendo enzima compreendendo enzima insolúvel, por exemplo, enzima insolúvel recuperada, e células microbianas e/ou resíduos celulares. Em uma modalidade, um núcleo contendo enzima é produzido por processamento de leito fluidizado de spray de topo. Em uma modalidade, um núcleo contendo enzima é produzido por granulação por cisalhamento elevado.

Em outro aspecto, a invenção fornece um grânulo contendo enzima compreendendo: um núcleo; opcionalmente, uma camada de sal revestida sobre o núcleo; e uma camada contendo enzima revestida sobre o núcleo, em que a referida camada contendo enzima revestida sobre o núcleo ou camada de sal, em que uma camada contendo enzima compreende uma composição que compreende enzima insolúvel, por exemplo, enzima insolúvel recuperada, e células microbianas e/ou resíduos celulares, produzida de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui. Em algumas modalidades, a composição que contém enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzida de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui para a recuperação de uma enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano. Em uma modalidade, a composição que compreende enzima e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzido por um método compreendendo a recuperação de enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano compreendendo células microbianas e/ou resíduos celulares sem remover as células microbianas e/ou resíduos celulares, desse modo produzindo uma composição que contém enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares, em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel no caldo microbiano. Em algumas modalidades, a enzima é enzimaticamente ativa no grânulo (isto é, a enzima é cataliticamente ativa no estado sólido ou tem potencial catalítico e torna-se cataliticamente ativa quando solubilizada em um solvente apropriado e sob condições apropriadas para a catálise ocorrer).

Em uma modalidade, o grânulo também compreende uma camada de sal de barreira revestida sobre a referida camada contendo enzima. Em uma modalidade, o grânulo também compreende uma camada de revestimento externo revestida sobre a referida camada de sal de barreira, em que a referida camada de revestimento externo compreende um polímero e/ou pigmento.

Em outro aspecto, a invenção fornece um grânulo contendo enzima compreendendo um núcleo contendo enzima e uma camada de sal de barreira e/ou uma ou mais camadas de revestimento circundando o núcleo, em que o núcleo compreende uma composição que contém enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares. Em algumas modalidades, a composição que contém enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzida de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui para a recuperação de uma enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano. Em uma modalidade, a composição que compreende enzima e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzido por um método compreendendo a recuperação de enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano compreendendo células microbianas e/ou resíduos celulares sem remover as células microbianas e/ou resíduos celulares, desse modo produzindo uma composição que contém enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares, em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel no caldo microbiano. Em algumas modalidades, a enzima é enzimaticamente ativa no grânulo (isto é, a enzima é cataliticamente ativa no estado sólido ou tem potencial catalítico e torna-se cataliticamente ativa quando solubilizada em um solvente apropriado e sob condições apropriadas para a catálise ocorrer).

Em uma modalidade, um núcleo contendo enzima é produzido por processamento de leito fluidizado de spray de topo. Em uma modalidade, um núcleo contendo enzima é produzido por granulação por cisalhamento elevado.

Em outro aspecto, a invenção fornece composições compreendendo qualquer um dos grânulos contendo enzima descrita aqui. Em uma modalidade, a composição é uma composição de detergente. Em outra modalidade, a composição é uma composição de processamento têxtil. Em outra modalidade, a composição é uma composição de alimentação de animal. Em outra modalidade, a composição é uma composição de alimento.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma formulação líquida contendo enzima que compreende uma composição que contém uma enzima insolúvel, por exemplo, enzima insolúvel recuperada, e células microbianas e/ou resíduos celulares. Em algumas modalidades, a composição que contém enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzida de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui para recuperar uma enzima insolúvel. Em uma modalidade, a composição que contém enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzida por um método compreendendo a recuperação de enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano sem remover as células microbianas e/ou resíduos celulares, desse modo produzindo uma composição que contém enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares, em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel no caldo microbiano. Em algumas modalidades, a enzima é enzimaticamente ativa na formulação líquida (isto é, a enzima é cataliticamente ativa ou tem potencial catalítico e torna-se cataliticamente ativa quando solubilizada em um solvente apropriado e sob condições apropriadas para a catálise ocorrer). Em algumas modalidades, uma formulação líquida contendo enzima também compreende um ou mais ingredientes de formulação selecionados de um poliol; um sal; um conservante; um tensoativo; e um antioxidante. Em algumas modalidades, a formulação líquida também compreende a poliol. Em algumas modalidades, a formulação líquida também compreende um sal. Em algumas modalidades, a formulação líquida também compreende um conservante. Em algumas modalidades, a formulação líquida também compreende um tensoativo.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para preparação de uma formulação líquida contendo enzima, compreendendo suspensão de uma composição que contém enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares, produzida de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui, em um líquido.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para preparação de uma formulação líquida contendo enzima, compreendendo: (a) suprimento de uma composição que contém células microbianas e insolúveis recuperadas e/ou resíduos celulares produzidos de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui; (b) e solubilização da enzima insolúvel na composição. Em uma modalidade, o método também compreende remover as células microbianas e/ou resíduos celulares após a etapa (b) e antes as etapa (c), desse modo produzindo uma formulação líquida clarificada.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra desempenho da atividade de aplicação de lavagem de grânulos contendo enzima preparada como descrito no exemplo 4 após armazenagem em detergente, como descrito no exemplo 13.

A figura 2 mostra a atividade enzimática de grânulos preparados nos exemplos 1, 2, 4, e 6 após armazenagem em detergente.

Descrição Detalhada

A invenção fornece métodos para a recuperação e formulação de enzimas insolúveis a partir do caldo de fermentação microbiano sem remover células microbianas ou resíduos celulares insolúveis lisados do caldo. A invenção também fornece formulações granulares e líquidas que contêm enzimas insolúveis e células microbianas e/ou resíduos celulares, por exemplo, recuperados de acordo com os métodos descritos aqui.

A prática da presente invenção empregará, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, e bioquímica, que estão dentro da experiência da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura, por exemplo, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook e outro, 1989); Qliqonucleotídeo Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Protocols in Molecular Bioloqy (F. M. Ausubel e outro, eds., 1994); PCR: The Polimerase Chain Reaction (Mullis e outro, eds., 1994); e Gene Transfer e Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990).

A menos que definido de outro modo aqui, todos os termos técnicos e específicos usados aqui têm os mesmo significados como comumente entendido por alguém versado na técnica a qual está invenção pertence. Singleton, e outro, Dictionary of Microbioloqy e Molecular Bioloqy, segunda edição, John Wiley e Sons, Nova Iorque (1994), e Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Bioloqy, Harper Perennial, NY (1991) provêem alguém de experiência com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta invenção. Quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou teste da presente invenção.

As faixas numéricas fornecidas aqui são inclusivas dos números definindo a faixa.

A menos que de outro modo indicado, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3' e sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino ao carbóxi, respectivamente.

Definições

Como usado aqui, o termo polinucleotídeo refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento e qualquer estrutura tridimensional e de filamento único ou múltiplos (por exemplo, filamento único, filamento duplo, triplo-helicoidal etc.), que contém desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou formas análogas ou modificadas de deoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, incluindo bases ou nucleotídeos análogos ou seus análogos. Porque o código genético é degenerado, mais do que um códon pode ser usado para codificar um aminoácido particular, e a presente invenção abrange polinucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácido particular. Qualquer tipo de nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo modificado pode ser usado, visto que o polinucleotídeo retém a funcionalidade desejada sob as condições de uso, incluindo modificações que aumentam a resistência à nuclease (por exemplo, deóxi, 2'-O-Me, fosforotioatos, etc.). Rótulos podem também ser incorporados para os propósitos de detecção ou captura, por exemplo, rótulos radioativos ou não radioativos ou âncoras, por exemplo, biotina. O termo polinucleotídeo também inclui ácidos nucleicos de peptídeos (PNA). Polinucleotídeos podem ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Os termos polinucleotídeo e ácido nucleico e oligonucleotídeo são usados aqui alternadamente. Polinucleotídeos da invenção podem conter RNA, DNA, ou ambos, e/ou formas modificadas e/ou análogos dos mesmos. Uma sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes de não nucleotídeo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem substituídos por grupos de ligação alternativa. Estes grupos de ligação alternativa incluem, porém não estão limitados às modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S (tioato), P(S)S (ditioato), (O)NR₂ (amidato), P(O)R, P(O)OR’, CO ou CH₂ (formacetal), em que cada R ou R’ é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação de éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo necessariamente serão idênticas. Polinucleotídeos podem ser lineares ou circulares ou compreenderem uma combinação de porções lineares e circulares.

Como usado aqui, polipeptídeo refere-se a qualquer composição compreendida de aminoácidos e reconhecida como uma proteína por aqueles versados na técnica. O código de uma letra ou três letras convencionais para resíduos de aminoácido é usado aqui. Os termos polipeptídeo e proteína são usados alternadamente aqui para referir-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados, e ele pode ser in terrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de rotulagem. Também incluídos na definição são, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um análogo (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

Como usado aqui, um vetor refere-se a uma sequência de polinucleotídeo designada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de células. Os vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de transporte, partículas de fago, plasmídeos, cassetes e similares.

Como usado aqui, o termo expressão refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na sequência de ácido nucleico de um gene. O processo inclui tanto transcrição e translação.

Como usado aqui, vetor de expressão refere-se a um contruto de DNA contendo uma sequência de codificação de DNA (por exemplo, sequência de gene) que é operavelmente ligada a uma ou mais sequência de controle adequadas capazes de realizar a expressão da sequência de codificação em um hospedeiro. Tais sequências de controle incluem um promoter para realizar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar tal transcrição, uma sequência codificando sítios de ligação de ribossoma de mRNA adequados, e sequências que controlam o término da transcrição e translação. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago, ou simplesmente uma inserção genômica potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar-se e funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode, em alguns casos, integrar-se no próprio genoma. O plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor de expressão. Entretanto, a invenção destina-se a incluir tais outras formas de vetores de expressão que cumprem funções equivalentes e que são, ou tornam-se, conhecidos na técnica.

Um promotor refere-se a uma sequência reguladora que está envolvida na RNA polimerase de ligação para iniciar a transcrição de um gene. O promoter pode ser um promoter induzível ou um promoter constitutivo. Um exemplo não limitante de um promotor induzível pode ser usado na invenção é Tríchoderma reesei cbh1, que é um promotor induzível.

O termo operavelmente ligado refere-se à justaposição em que os elementos estão em uma disposição permitindo-os estarem funcionalmente relacionados. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a um sequência de codificação se ele controlar a transcrição da sequência de codificação.

Sob controle transcripcional é um termo bem entendido na técnica que indica que a transcrição de uma sequência de polinucleotídeo depende de seu estado de ser operavelmente ligado a um elemento que contribui para a iniciação de, ou promove a transcrição.

Sob controle transcripcional é um termo bem entendido na técnica que indica um processo regulador que ocorre após mRNA ter sido formado.

Um gene refere-se a um segmento de DNA que está envolvido na produção de polipeptídeo e inclui regiões precedentes e anteriores às regiões de codificação bem como sequências intermediárias (íntrons) entre individual os segmentos de codificação (éxons).

Como usado aqui, o termo célula hospedeira refere-se a uma célula ou linhagem celular em que um vetor de expressão recombinante para a produção de um polipeptídeo pode ser transfectada por expressão do polipeptídeo. As células hospedeiras incluem progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou em um complemento de DNA genômico total) à célula origem original devido à mutação natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas ou transformadas in vivo com um vetor de expressão. Célula hospedeira refere-se tanto às células quanto protoplastos criados a partir das células de uma linhagem fúngica filamentosa e particularmente uma linhagem Trichoderma s.p.

O termo recombinante quando usado em referência a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de uma proteína ou ácido nucleico heterólogo ou a alteração de um ácido nucleico nativo ou proteína, ou que a célula é derivada a partir de uma célula desse modo modificada. Desse modo, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinantes) da célula ou expressam genes nativos que são de outro modo anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos de modo algum.

Uma sequência de sinal refere-se a uma sequência de aminoácidos ligada à porção de terminal de N de uma proteína que facilita a secreção da forma madura da proteína a partir da célula. A forma madura da proteína extracelular necessita da sequência de sinal que é clivada durante o processo de secreção.

O termo marcador seletivo ou marcador selecionável referese a um gene capaz de expressão em uma célula hospedeira que provê facilidade de seleção daqueles hospedeiros contendo um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, porém não estão limitados às substâncias antimicrobianas (por exemplo, higromicina, bleomicina, ou cloranfenicol) e/ou genes que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional, sobre a célula hospedeira.

O termo derivado de abrange os termos originado a partir de, obtido a partir de, obtenível a partir de, isolado a partir de, e criado a partir de.

O termo fungos filamentosos refere-se a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina (Veja, Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, Nova Iorque). Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede celular composta de quitina, celulose, e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfologicamente, fisiologicamente, e geneticamente distintos das leveduras. O desenvolvimento vegetativo por fungos filamentosos é através do alongamento da hifa e catabolismo de carbônico é aeróbica obrigatória. Uma célula origem fúngica filamentosa aqui pode ser uma célula de uma espécie de, porém não limitada à Tríchoderma, (por exemplo, Tríchoderma reesei (anteriormente classificada como T. longibrachiatum e atualmente também conhecida como Hypocrea jecorina), Tríchoderma viride, Tríchoderma koningii, Tríchoderma harzianum); Penicillium sp., Humicola sp. (por exemplo, Humicola insolens e Humicola grisea); Chrysosporium sp. (por exemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exemplo, A. oryzae, A. niger, e A. awamori), Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., e Emerícella sp. (Veja também, Innis e outro, (1985) Sei. 228:21 -26).

Como usado aqui, o termo Tríchoderma ou Tríchoderma sp. refere-se a qualquer gênero fúngico anteriormente ou atualmente classificado como Tríchoderma.

O termo cultura refere-se ao desenvolvimento de uma população de células microbianas sob condições adequadas para desenvolvimento, em um meio líquido ou sólido.

O termo heterólogo em referência a um polinucleotídeo ou proteína refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína industrial comercialmente importante. Destina-se que o termo abranja proteínas que são codificadas por genes de ocorrência natural, genes mutados, e/ou genes sintéticos. O termo homólogo em referência a um polinucleotídeo ou proteína refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que ocorre naturalmente na célula hospedeira.

O termo introduzido no contexto de inserção de uma sequência de ácido nucleico em uma célula inclui transfecção, transformação, ou transdução e refere-se à incorporação de uma sequência de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica em que a sequência de ácido nucleico pode ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, cromossoma, plasmídeo, plastídeo, ou DNA mitocondrial), convertido em um replicon autônomo, ou transientemente expresso.

Como usado aqui, os termos transformado, estavelmente transformado, e transgênico referem-se a uma célula que tem uma se quência de ácido nucleico não nativo (por exemplo, heteróloga) integrada em seu genoma ou como um plasmídeo epissômico que é mantido através de múltiplas gerações.

Os termos isolado, e separado como usados aqui referem-se a um material (por exemplo, uma proteína, ácido nucleico, ou célula) que é removido de pelo menos um componente com o qual ele está naturalmente associado. Por exemplo, estes termos podem referir-se a um material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente os acompanham como encontrado em seu estado nativo, tal como, por exemplo, um sistema biológico intacto.

O termo recuperado como usado aqui refere-se à pelo menos separação parcial de uma enzima a partir de um ou mais componentes solúveis de um caldo microbiano e/ou pelo menos separação parcial de um ou mais solventes no caldo, por exemplo, água ou etanol. Uma enzima recuperada é frequentemente de pureza mais elevada do que antes do processo de recuperação. Entretanto, em algumas modalidades, uma enzima recuperada pode ser da mesma pureza ou mais baixa do que antes do processo de recuperação.

O termo proteína secretada refere-se a uma região de um polipeptídeo que é liberado de uma célula. Em algumas modalidades, a proteína secretada é a proteína que é liberada ou clivada de um polipeptídeo de fusão recombinante.

O termo secreção refere-se ao movimento seletivo de uma proteína através de uma membrana em uma célula hospedeira para o espaço extracelular e meios circundantes.

Como usado aqui o termo atividade específica significa uma unidade de enzima definida como o número de moles de substrato convertido em produto por uma preparação de uma enzima por unidade de tempo sob condições específicas. A atividade específica é expressa como unidades (U)/mg de proteína.

Como usado aqui, os termos composição de detergente e formulação de detergente são usados em referência às misturas que são destinadas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em algumas modalidades preferidas, o termo é usado em referência à lavagem de tecidos e/ou peças de roupas (por exemplo, detergentes de lavanderia). Em modalidades alternativas, o termo refere-se a outros detergentes, tais como aqueles para limpar placas, talheres, etc. (por exemplo, detergentes de lavagem de louça). Não se destina que a presente invenção seja limitada a qualquer formulação ou composição de detergente particular. De fato, se destina que além da enzima, o termo abrange detergentes que contêm tensoativos, transferase(s), enzimas hidrolíticas, óxido reductases, builders, agentes de alvejamento, ativadores de alvejamento, agentes de azulamento e tinturas fluorescentes, inibidores de aglutinação, agentes de mascaramento, ativadores de enzima, antioxidantes, e solubilizantes.

Como usado aqui, o termo desinfecção refere-se à remoção de contaminantes das superfícies, bem como a inibição morte de micróbios nas superfícies de itens. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer superfície, item, ou contaminante(s) ou micróbios particulares a serem removidos.

Caldo microbiano ou caldo de fermentação refere-se a um meio de crescimento em que as células microbianas (por exemplo, bacterianas ou fúngicas) são desenvolvidas e que é adequado para expressão de uma enzima como descrito aqui.

Uma enzima insolúvel refere-se a uma enzima que está presente em uma fase sólida. Uma enzima insolúvel separa-se (isto é, dividi-se) com uma fase sólida na separação de fases sólidas e líquidas, por exemplo, as fases sólidas e líquidas de um caldo microbiano. Entende-se que em um caldo microbiano total alguma enzima tipicamente também será encontrada na fase solúvel no meio além da enzima insolúvel que é parte da fase sólida. A enzima insolúvel pode ser ligada aos sólidos no caldo microbiano, de modo que sólidos de célula ou outros componentes sólidos possam ser precipitados ou cristalizados no caldo microbiano.

Solubilização ou solubiliza-se como usado aqui se refere à remoção de condições ou substâncias que causam a precipitação de uma enzima ou mantêm a enzima em uma forma insolúvel, ou mudança de condições físicas (por exemplo, mudança na temperatura; mistura; sonicação) ou adição de substâncias de solubilização (por exemplo, solventes de solubilização, por exemplo, água; polióis; sais; ácido; bases; tensoativos) que torna a enzima solúvel em insolúvel.

Purificando ou purificação de uma enzima insolúvel refere-se ao refinamento de uma enzima de interesse removendo parcialmente ou totalmente os componentes que não são de interesse, por exemplo, componentes líquidos de um caldo microbiano que não são de interesse. Uma composição contendo enzima purificada contém uma quantidade inferior de um ou mais componentes do que a mistura da qual a enzima foi purificada.

A pureza de enzima em uma amostra pode ser calculada dividindo-se a atividade de enzima pela quantidade total de sólidos secos. Os sólidos é uma avaliação de todos os materiais presentes após o líquido ter sido removido. Os sólidos secos podem incluir, entre outras coisas, proteína, sal, carboidrato, metabólitos, ácido nucleico, lipídeos, células, resíduos celulares, e meios de fermentação gastos. A pureza de enzima pode ser expressa como uma relação em relação a um ou mais dos componentes dos sólidos secos.

Resíduos celulares referem-se às paredes celulares e outros componentes celulares insolúveis que são liberados após o rompimento da membrana celular, isto é, após lise de células microbianas.

Condicionamento de caldo refere-se ao pré-tratamento de um caldo de fermentação microbiana designado para melhorar as propriedades de manipulação de caldo subsequente. O condicionamento de caldo altera a composição química e/ou física e/ou propriedades reológicas do caldo para facilitar seu uso nos processos de formulação e/ou recuperação a jusante. O condicionamento de caldo pode incluir um ou mais tratamentos tal como modificação de pH, tratamento por aquecimento, resfriamento, adição de aditivos (por exemplo, cálcio, sal(s), floculante(s), agente(s) de redução, ativador(s) de enzima, inibidor(s) de enzima, e/ou tensoativo(s)), mistura, e/ou manutenção controlada (por exemplo, 0,5 a 200 horas) do caldo sem outro tratamento.

ATCC refere-se à American Type Culture Collection localizada em Manassas, Va. 20108 (www.atcc.org).

NRRL refere-se à Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research (e anteriormente conhecido como USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoria, III.

Um, uma e o, a incluem referências de plural a menos que o texto claramente dite de outro modo.

Métodos de Recuperação

A invenção fornece um método para a recuperação de uma enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano (isto é, um meio de fermentação microbiana em que células que expressam a enzima foram desenvolvidas), sem remoção de células ou resíduos celulares do caldo. Recuperação da enzima insolúvel inclui separação da enzima insolúvel parcialmente ou substancialmente e completamente dos componentes solúveis do caldo microbiano, isto é, separação da enzima insolúvel de pelo menos uma porção dos componentes solúveis do caldo microbiano. Os processos de recuperação descritos aqui convertem caldo de fermentação contendo uma ou mais enzimas insolúveis de interesse em enzima(s) recuperada(s) de interesse que pode ser formulada para uso sem a remoção de células ou resíduos celulares.

Em uma modalidade, o método inclui o suprimento de um caldo microbiano em que células microbianas que expressam a enzima foram desenvolvidas e em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel, e a remoção da enzima insolúvel sem remover as células, desse modo produzindo uma composição que inclui enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares. Em outra modalidade, a enzima expressa é solúvel no caldo microbiano e pelo menos um pouco da enzima é tornada insolúvel por adição de um ou mais precipitantes. Em outra modalidade, a enzima não é expressa pelas células microbianas, porém é adicionada a um caldo microbiano em que células microbianas foram desenvolvidas. A enzima adicionada ao caldo microbiano pode ser solúvel e tornar-se insolúvel por adição de uma ou mais precipitantes. As células microbianas podem ser lisadas antes ou após a recuperação da enzima insolúvel, produzindo resíduos celulares insolúveis.

Em algumas modalidades, um caldo microbiano contendo uma enzima insolúvel ou expressa solúvel é combinado com uma composição contendo uma enzima solúvel ou insolúvel externamente produzida. Um ou mais precipitantes são adicionados para tomar pelo menos algumas das enzimas (a enzima expressa pelas células microbianas que produziram o caldo microbiano e/ou a enzima que foi adicionada ao caldo microbiano) insolúveis.

Em algumas modalidades, a enzima solúvel pode ser correvestida com a enzima insolúvel quando pelo menos parte da fase sólida é removida do caldo microbiano.

Geralmente, a enzima insolúvel recuperada está presente como um corpo de inclusão.

Em algumas modalidades, dois ou mais caldos microbianos de fermentações microbianas separadas são combinados, e uma ou mais enzimas insolúveis são recuperadas a partir dos caldos microbianos combinados.

Nos métodos da invenção, a enzima insolúvel é enzimaticamente ativa, isto é, capaz de catalisar uma reação enzimática. A enzima insolúvel tem potencial catalítico, isto é, a enzima é cataliticamente ativa na forma insolúvel e/ou após solubilização em um solvente e sob condições adequadas para a atividade catalítica ocorrer. Em uma modalidade, a enzima insolúvel é cataliticamente ativa tanto na forma insolúvel quanto após a solubilização. Em uma modalidade, a enzima insolúvel é inativa na forma insolúvel e torna-se cataliticamente ativa após a solubilização.

Em várias modalidades, qualquer de pelo menos cerca de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, ou 10% da enzima é insolúvel no caldo microbiano antes da recuperação da enzima insolúvel. Em algumas modalidades, a pureza da enzima insolúvel é aumentada em pelo menos cerca de 10% após a recuperação da enzima insolúvel.

A recuperação de enzima insolúvel no caldo microbiano contendo células microbianas e/ou resíduos celulares pode incluir, por exemplo, concentração e/ou diafiltração. O caldo microbiano contendo enzima insolúvel pode ser concentrado para remover pelo menos parte da porção solúvel do caldo, desse modo aumentando a concentração da enzima insolúvel no caldo, por uma ou mais técnicas que são bem conhecidas na técnica, incluindo, porém não limitadas aos processos de membrana (por exemplo, ultrafiltração, microfiltração, nanofiltração), centrifugação, e evaporação. Alternativamente, ou em conjunção com concentração, diafiltração pode ser empregada para substituir pelo menos parte da porção solúvel do caldo microbiano, tipicamente usando um processo de membrana para diafiltrar o caldo microbiano contra água.

Nos métodos da invenção, células microbianas são desenvolvidas em um meio de crescimento sob condições adequadas para expressão de uma enzima de interesse, desse modo produzindo um caldo microbiano contendo a enzima de interesse. Por exemplo, a enzima de interesse pode ser expressa em uma célula hospedeira a partir de um vetor de expressão. A enzima de interesse pode ser secretada no meio de crescimento ou pode ser expressa intracelularmente e não secretada.

Uma enzima que é secretada no meio de crescimento pode ser naturalmente insolúvel no meio de crescimento sob as condições usadas para o desenvolvimento das células, ou insolubilidade da enzima pode ser induzida adicionando um precipitante antes da recuperação da enzima. Exemplos de precipitantes incluem, porém não estão limitados a sais (por exemplo, NaCI, NaSO₄, sulfato de amônio, sulfato de magnésio, concentração de cerca de 0,1 a cerca de 50% (peso/volume)), polieletrólitos (por exemplo, alginato, carboximetilcelulose, ácido poliacrílico, ácido tânico, polifosfato), e alteração na temperatura ou pH, ou uma combinação dos mesmos. (Veja, por exemplo, Isolation and Purification of Proteínas (2003) R. Hatti-Kaul e B. Mattiasson, ed., Marcei Dekker, Inc., páginas 225 a 275; Bioseparations: Science and Engineeríng (2003) R.G. Harrison, P. Todd, S.R. Rudge, D.P. Petrides, páginas 243 a 271; Protein Purification: Principies and

Practice (1994) R.K. Scopes, Springer, páginas 71 a 101.; Protein Purification Process Engineeríng (1994) R.G. Harrison, ed., Marcei Dekker Inc., Differential Precipitação of Proteins, páginas 115 a 208.)

Enzimas solúveis podem também ser tornadas insolúveis por interações de afinidade, por exemplo, interações de substrato-enzima ou interações de inibidor-enzima, por exemplo, por contato com uma resina de afinidade.

Uma enzima que é expressa intracelularmente e não secretada pode ser liberada através de lises celulares. A enzima liberada pode ser naturalmente insolúvel sob condições no meio de crescimento no qual ela é liberada, ou a insolubilidade pode ser induzida pela adição de um precipitante antes da recuperação da enzima como acima descrito.

Células microbianas que podem ser usadas para expressar uma enzima de interesse como descrito aqui podem ser eucarióticas ou procarióticas, por exemplo, um micro-organismo fúngico ou bacteriano. Exemplos de micro-organismos eucarióticos que podem ser usados incluem, porém não estão limitados a Trichoderma sp., Hypocrea sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Hansenula sp., e Fusarium sp. Exemplos de micro-organismos procarióticos que podem ser usados incluem, porém não estão limitados a Bacillus sp., Streptomyces sp., Pantoea sp., Escherichia sp., e Pseudomonas sp.

Qualquer enzima que é expressa em uma forma insolúvel ou que é expressa em forma solúvel e pode ser tornada insolúvel, por exemplo, pela adição de um precipitante, pode ser recuperada de acordo com os métodos descritos aqui, e opcionalmente formulada em uma formulação granular ou líquida como descrito aqui. Em algumas modalidades, a enzima é uma hidrolase, por exemplo, uma protease (bacteriana (por exemplo, uma subtilisina) ou fúngica; ácida, neutra, ou alcalina), uma amilase (alfa ou beta), uma lipase, ou uma celulase. Em algumas modalidades, a enzima é uma subtilisina, por exemplo, como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 4.760.025, Patente de EP n° 130 756, ou Pedido de PCT n° WO 91/06637. Em algumas modalidades, a enzima é uma alfa-amilase como descrito no

Pedido de PCT n° WO08/112459. Em algumas modalidades, a enzima é uma celulase, por exemplo, Multifect L250® ou Puradax®, comercialmente disponível de Genencor, Division of Danisco US, Inc. Em algumas modalidades, a enzima é uma oxidase, uma oxigenase, uma transferase, uma desidratase, uma reductase, uma hemicelulase, uma peroxidase, uma fosfolipase, uma esterase, uma cutinase, uma pectinase, uma ceratinase, uma lipoxigenase, uma ligninase, uma pululanase, uma tanase, uma pentosanase, uma malanase, uma β-glicanase, uma arabinosidase, uma hialuronidase, uma condroitinase, uma lacase, uma catalase, uma isomerase, uma pectato liase, ou uma mananase, ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a enzima é uma fitase. Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima perhidrolase, tal como, por exemplo, uma enzima como descrito no Pedido de PCT n° WO 05/056782.

Nos métodos de recuperação descritos aqui, uma composição que inclui enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzida. Em algumas modalidades, a composição inclui células microbianas intactas. Em uma modalidade, as células microbianas intactas são células microbianas vivas. Em uma modalidade, as células microbianas intactas são células microbianas mortas. (Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.801.034, que descreve um método para matar as células sem lise por ajuste do pH de uma mistura de fermentação para um valor igual ou menor do que cerca de duas unidades de pH abaixo do pK_a do ácido orgânico compatível usando um ácido mineral, e adicionando uma quantidade suficiente de um ácido orgânico e/ou sal de ácido orgânico compatível à mistura para realizar uma morte celular substancialmente completa).

Em algumas modalidades, a composição inclui células microbianas lisadas, isto é, resíduos celulares produzidos por lise das células microbianas. Em uma modalidade, o método inclui o rompimento de membranas de célula microbiana para produzir um lisado de célula microbiana antes da recuperação da insolúvel proteína. No caso de uma enzima que é solúvel no caldo microbiano e para qual a insolubilidade é induzida por adição de um ou mais precipitantes, o rompimento das membranas celulares microbi anas podem ocorrer antes ou após a adição do(s) precipitante(s). Em algumas modalidades, o rompimento das membranas celulares é obtido contatando as células com uma enzima que é capaz de lise celular microbiana, por exemplo, uma lisoenzima de enzima. Em uma modalidade, células que foram lisadas com uma enzima que é capaz de lise celular microbiana são também homogeneizadas para produzir um lisado de célula microbiana homogeneizada. Em outras modalidades, o rompimento das membranas celulares é obtido por homogeneização mecânica.

Uma composição contendo enzima compreendendo uma ou mais enzimas insolúveis e células microbianas e/ou resíduos celulares, preparada como descrito aqui, pode ser formulada em uma formulação granular ou líquida.

Formulações Granulares

Baixo empoeiramento, grânulos de enzima estáveis podem ser produzidos a partir do caldo microbiano contendo enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares. Em algumas modalidades, o caldo microbiano contendo enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzido de acordo com qualquer um dos métodos de recuperação acima descritos. Grânulos de enzima podem ser produzidos por métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, em um revestidor de leito fluidizado de spray de topo, em um revestidor Wurter de spray de base, ou por granulação em cilindro (por exemplo, granulação por cisalhamento elevado) extrusão, ou revestimento de panela.

A invenção fornece um método de produzir um grânulo contendo enzima, compreendendo o suprimento de uma composição que contém enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares, produzida, por exemplo, por meio de um método de recuperação como acima descrito, e produzindo um grânulo contendo enzima que inclui a composição, em que a enzima insolúvel no grânulo é enzimaticamente ativa, isto é, capaz de atividade enzimática quando contatada por um substrato para a enzima sob condições que são adequados para a atividade catalítica ocorrer. A enzima é cataliticamente ativa na forma insolúvel e/ou quando solubilizada em um solvente, na presença de substrato e sob condições adequadas para a catálise enzimática ocorrer, por exemplo, em uma aplicação de uso para um grânulo contendo enzimas. Em uma modalidade, a enzima é cataliticamente ativa tanto na forma insolúvel quanto após a solubilização. Em uma modalidade, a enzima é cataliticamente inativa na forma insolúvel e torna-se cataliticamente ativa após a solubilização.

Em uma modalidade, um grânulo contendo enzima é produzido em um processador de leito fluidizado de spray de topo. Em uma modalidade, uma camada contendo enzima que inclui a composição contendo enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares, como acima descrito, é revestida em um núcleo no processador de leito fluidizado de spray de topo. Opcionalmente, o grânulo pode conter uma camada de sal entre o núcleo e uma camada contendo enzima. O sal pode ser selecionado de, por exemplo, sulfato de sódio, citrato de sódio, sulfato de magnésio, sulfato de potássio, e sulfato de amônio, ou uma mistura dos mesmos. Uma ou mais outras camadas podem ser revestidas sobre uma camada contendo enzima. Por exemplo, uma camada de sal de barreira pode ser revestida sobre uma camada contendo enzima. Em algumas modalidades, uma ou mais camadas de revestimento externo podem ser revestidas sobre uma camada contendo enzima, ou sobre uma camada de sal de barreira que é revestida sobre uma camada contendo enzima. Camada(s) de revestimento externo pode conter, por exemplo, polímero(s) e/ou pigmento(s).

Em algumas modalidades, uma composição que compreende uma enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares, como acima descrito, é incorporada em um núcleo, e uma ou mais camadas são revestidas sobre um núcleo contendo enzima. Por exemplo, uma camada de sal de barreira pode ser revestida sobre um núcleo contendo enzima. Em algumas modalidades, uma ou mais camadas de revestimento externo podem ser revestidas sobre um núcleo contendo enzima, ou sobre uma camada de sal de barreira que é revestida sobre um núcleo contendo enzima. Camada(s) de revestimento externo pode conter, por exemplo, polímero(s) e/ou pigmento(s).

Em algumas modalidades, um grânulo contendo uma enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares é produzido por Granulação em cilindro, tal como granulação por cisalhamento elevado. Um tal grânulo contém um núcleo contendo enzima (contendo a enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares) e uma ou mais camadas de revestimento sobre o núcleo. Tais camadas de revestimento podem incluir, porém não estão limitadas a um polímero, por exemplo, polietileno glicol ou álcool polivinílico, um pigmento tal como dióxido de titânio, ou glicerol.

Os grânulos da invenção podem também incluir outros componentes tais como, porém não limitados a plastificantes, cargas, e lubrificantes.

A invenção fornece grânulos contendo enzima compreendendo um núcleo e uma composição contendo enzima em uma camada circundando o núcleo ou incorporada no núcleo, e opcionalmente uma ou mais camadas adicionais. Uma composição contendo enzima contém uma enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares microbianos, por exemplo, produzida como acima descrito. A enzima insolúvel é enzimaticamente ativa no grânulo, isto é, capaz de atividade enzimática quando contatada por um substrato para a enzima sob condições que são adequados para a atividade catalítica ocorrer. A enzima solúvel em uma composição contendo células microbianas e/ou resíduos celulares (por exemplo, caldo microbiano com solúvel enzima e células e/ou resíduos celulares) pode também ser formulada na formulação granular como descrito aqui.

Os grânulos da invenção exibem baixo empoeiramento, por exemplo, menos do que 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 2, 1, ou 0,5 mg/almofada, como avaliado pelo teste de atrito Heubach. Os grânulos são estáveis quando armazenados sob umidade de ambiente e condições de temperatura, porém solúveis ou dispersíveis no contato com água a fim de liberar a enzima quando em uso.

Pequenos grânulos sem revestimentos protetores geram uma significante quantidade de pó durante as operações de transporte pneumático e carregamento, tanto em uma usina de fabricação de grânulo de enzima quanto na usina de fabricação do cliente. A poeira pode ser tanto um problema higiênico quanto um problema de fabricação, desse modo ele deve ser minimizado tanto quanto possível. Diversos estudos clínicos foram desenvolvidos para avaliar a resistência mecânica ao atrito e formação de po5 eira de diferentes formulações de enzima granulares. Estes incluem o teste de atrito Heubach e o teste de elutriação. O teste Heubach submete as partículas a esmagamento definido e forças de fluidização usando pás giratórias para rolar bolas de aço através de um leito de grânulos contidos de uma câmara cilíndrica e simultaneamente filtrando uma corrente de ar através do 10 leito para tirar qualquer poeira que é gerada. A poeira gerada é extraída por através de um tubo e depositada em uma almofada filtrante fora da câmara Heubach. O peso ou componente ativo da poeira coletada é referido como uma poeira de Heubach. No teste de elutriação, os grânulos são colocados em uma frita de vidro dentro de um tubo de vidro alto e fluidizados com uma 15 corrente de ar seco constante durante um período de tempo fixo. Uma descrição dos princípios, operações e limitações dos testes de elutriação de poeira e Heubach pode ser encontrada, por exemplo, em Enzymes In Detergency ed. Jan H. van Ee., Capítulo 15, páginas 310 a 312, (Marcei Dekker, Inc. Nova Iorque (1997) e referências citadas ali. O teste de poeira Heu20 bach é também descrito nas Patentes dos Estados Unidos n— 5.324.649,

5.879.920, e 7.108.821.

Núcleo

O núcleo é o núcleo interno do grânulo. Núcleos adequados para uso na presente invenção são preferivelmente de um material altamente 25 hidratável (isto é, um material que é facilmente dispersível ou solúvel em água). O material de núcleo deve dispersar-se na água (desintegrar-se quando hidratado) ou solubilizar-se na água entrando em uma solução aquosa real. Argilas (bentonita, caulim), nonpareils e amido de batata aglomerado são considerados dispersíveis. Nonpareils são partículas esféricas que 30 consistem em um cristal semente que se formou sobre e em torno, em uma forma esférica, ligando camadas de pó e soluto ao cristal semente em um aparato de revestimento. Nonpareils são tipicamente feitos a partir de uma combinação de um açúcar tal como sacarose, e um pó tal como amido de milho. Núcleos adequados também incluem materiais de cristal semente que incluem sementes de cristais de sacarose, cloreto de sódio ou sulfato de sódio, e outros sais inorgânicos que podem ser construídos com sulfato de amônio, sulfato de sódio, sulfato de potássio e similares.

Grânulos compostos de sais inorgânicos e/ou açúcares e/ou pequenas moléculas orgânicas podem ser usados como os núcleos da presente invenção. Ingredientes solúveis em água adequados para incorporação nos núcleos incluem: cloreto de sódio, sulfato de amônio, sulfato de sódio, ureia, ácido cítrico, sacarose, lactose e similares. Ingredientes solúveis em água podem ser combinados com ingredientes dispersíveis em água. Os núcleos da presente invenção podem também compreender um ou mais dos seguintes: ingredientes ativos, polímeros, cargas, plastificantes, materiais fibrosos, extensores e outros compostos conhecidos para serem usados nos núcleos. Polímeros adequados incluem - álcool polivinílico (PVA), polietileno glicol, óxido de polietileno, e polivinil pirrolidina. O PVA pode ser PVA parcialmente hidrolisado (70 a 90%); intermediavelmente hidrolisado (90 a 98%); totalmente hidrolisado (98 a 99%); super-hidrolisado (99 a 100%), ou uma mistura dos mesmos, com um grau baixo a elevado de viscosidade.

O núcleo de um grânulo contendo enzima como descrito aqui pode consistir em um ou mais sais inorgânicos ou um cristal de sacarose. Em algumas modalidades, o núcleo consiste em sulfato de sódio, citrato de sódio, cloreto de sódio, sulfato de cálcio, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o núcleo consiste em sulfato de sódio.

Cargas adequadas úteis nos núcleos incluem materiais inertes usados para adicionar volume e reduzir custo, ou usadas para o propósito de ajuste da atividade de enzima pretendida no grânulo acabado. Exemplos de tais cargas incluem, porém não estão limitados a agentes solúveis em água tais como ureia, sais, açúcares e agentes dispersíveis em água tais como argilas, talco, silicatos, carboximetilcelulose e amidos.

Plastificantes adequados úteis nos núcleos da presente invenção são solventes não voláteis adicionados a um polímero para reduzir sua temperatura de transição de vidro, desse modo reduzindo a fragilidade e realçando a deformabilidade. Tipicamente, os plastificantes são compostos orgânicos de baixo peso molecular e são altamente específicos para o polímero a ser plastificado. Exemplos incluem, porém não estão limitados a açúcares (tal como, glicose, frutose e sacarose), álcoois de açúcar (tal como, sorbitol, xilitol e maltitol) polióis (álcoois poliídricos, por exemplo, álcoois com muitos grupos de radical de hidroxila tal como glicerol, etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol), compostos orgânicos de baixo peso molecular polares, tal como ureia, ou outros plastificantes conhecidos tal como dibutila ou dimetilftalato, ou água.

Materiais fibrosos adequados úteis nos núcleos da presente invenção incluem materiais que têm resistência à tração elevada e que podem ser formados em filamentos finos tendo um diâmetro de 1 a 50 mícrons e um comprimento igual a pelo menos quatro diâmetros. Materiais fibrosos típicos incluem, porém não estão limitados às fibras de celulose, fibras de vidro, fibras de metal, fibras de borracha, azlon (fabricado a partir de proteínas de ocorrência natural em milho, amendoins e leite) e polímero sintético. Sintéticos incluem Rayon , Nylon , acrílico, poliéster, olefina, Saran , Spandex® e Vinal®. Tipicamente fibras de celulose têm um comprimento de fibra médio de 160 mícrons com um diâmetro de cerca de 30 mícrons.

Os núcleos podem ser fabricados por uma variedade de técnicas de granulação bem conhecidas na técnica incluindo: cristalização, precipitação, revestimento de panela, revestimento de leito fluidizado, atomização giratória, extrusão, esferonização, granulação em cilindro e aglomerização por cisalhamento elevado.

Em uma modalidade da presente invenção, o núcleo é um nopareil solúvel ou dispersível em água (açúcar ou sal como acima descrito) que opcionalmente pode também ser revestido ou construído a partir do cristal semente (nonpareil) usando polivinilálcool (PVA) sozinho ou em combinação com agentes antiaglomeração tal como dióxido de titânio, talco, ou plastificantes tal como sacarose ou polióis. O nível de PVA no revestimento do nonpareil pode representar de cerca de 0,5% a 20% do peso do nonpareil revestido.

Em geral, o núcleo incluindo qualquer ingrediente ativo incorporado nele é uma partícula sensível ao impacto. Entretanto, a invenção não está limitada pelo tipo de núcleo, e numerosas patentes e publicações descrevem núcleos que podem ser usados na invenção e referência é feita a USP 5.879.920; USP 4.689.287 e WO 00/24877.

Enzimas

Uma ou mais enzimas insolúveis podem ser usadas no baixo empoeiramento, grânulos de enzima estáveis da presente invenção. Uma composição contendo enzima compreendendo uma ou mais enzimas insolúveis e células microbianas e/ou resíduos celulares, preparada como acima descrito, é incorporada nos grânulos descritos aqui.

Em algumas modalidades, a enzima é uma hidrolase, por exemplo, uma protease (bacteriana (por exemplo, uma subtilisina) ou fúngica; ácida, neutra, ou alcalina), uma amilase (alfa ou beta), uma lipase, ou uma celulase. Em algumas modalidades, uma enzima é uma subtilisina, por exemplo, como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 4.760.025, Patente de EP n° 130 756, ou Pedido de PCT n° WO 91/06637. Em algumas modalidades, uma enzima é uma alfa-amilase como descrito no Pedido de PCT n° WO08/112459. Em algumas modalidades, a enzima é uma celulase, por exemplo, Multifect L250® ou Puradax®, comercialmente disponível de Genencor, Division of Danisco US, Inc. Em algumas modalidades, a enzima é uma oxidase, uma oxigenase, uma transferase, uma desidratase, uma reductase, uma hemicelulase, uma peroxidase, uma fosfolipase, uma esterase, uma cutinase, uma pectinase, uma ceratinase, uma lipoxigenase, uma ligninase, uma pululanase, uma tanase, uma pentosanase, uma malanase, uma β-glicanase, uma arabinosidase, uma hialuronidase, uma condroitinase, uma lacase, uma catalase, uma isomerase, uma pectato liase, ou uma mananase, ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a enzima é uma fitase. Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima perhidrolase, tal como, por exemplo, uma enzima como descrito no Pedido de PCT n° WO 05/056782. Em algumas modalidades, a enzima é capaz de hidrolisar um substrato (por exemplo, uma estaína).

Em um aspecto, uma ou mais enzimas insolúveis em uma composição que contém células microbianas e/ou resíduos celulares são incorporado no núcleo do grânulo. Em outro aspecto preferido uma ou mais enzimas em uma composição que contém células microbianas e/ou resíduos celulares são colocadas em camada em torno de um núcleo. Quando colocadas em camada em torno do núcleo, a camada compreendendo a enzima pode adicionalmente incluir um aglutinante tal como um polímero, por exemplo, um polímero de vinila tal como álcool polivinílico (PVA).

Uma camada compreendendo a enzima pode também opcionalmente compreender um ou mais outros componentes além da composição contendo enzima. Tais componentes de não enzima incluem, porém não estão limitados a polímero (por exemplo, álcool polivinílico, polietileno glicol), açúcares (por exemplo, sacarose (sucrose), sacarose (saccharose), glicose, frutose, galactose, maltodextrina), amidos (por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de tapioca, amido de batata, amido quimicamente ou fisicamente modificado), dextrinas, agentes antiespuma (por exemplo, poliois de poliéter tal como Foamblast 882 (Emerald Foam Control), Erol DF 204K (Ouvrie PMC), DG436 (ODG Industries, Inc.), KFO 880 (ΚΑΒΟ Chemicals, Inc.)), álcoois de açúcar (por exemplo, sorbitol, maltitol, lactitol, xilitol), tensoativos (por exemplo, alcohol ethoxilatos tal como Neodol 23-6.5 (Shell Chemical LP, Houston, TX) e Lutensol TO65 (BASF)), e agentes antirredeposição (por exemplo, polietileno glicol poliésteres tal como Repel-o-Tex SRP6 (Rhodia, Inc.), Texcare SRN-100 ou SRN-170 (Clariant GmbH, Sorez100(ISP Corp.)).

Um agente antiespuma é um composto que é usado para prevênir ou dispersar a espuma. Estes podem também ser referidos como agentes desespumantes, ou desespumação. Estes compostos são substâncias tensoativas que diminuem a elasticidade da superfície de líquidos e previnem a formação de espuma metaestável. A espuma se dispersa como um resultado da tendência para atingir o equilíbrio entre a elasticidade da superfície do líquido e das substâncias tensoativas. (Vardar-Sukan (1991) RecentAdv. Biotechnol. 113-146). Antiespumas úteis nos grânulos descritos aqui são geralmente adequados para uso em um bioprocesso. Agentes antiespuma adequados incluem, porém não estão limitados às gorduras, óleos, ceras, ésteres ou ácidos alifáticos, álcoois, sulfatos, sulfonatos, ácidos graxos, sabões, compostos nitrogenosos, fosfatos, poliglicóis, sulfetos, tio compostos, siloxanos e compostos halogenados e inorgânicos. (Ghildyal (1988) Adv. Appl. Microbiol. (1988) 33:173-222). Em algumas modalidades, óleos, ácidos graxos, ésteres, poliglicóis e siloxanos são úteis. Em algumas modalidades, o agente antiespuma é copolímero de óxido de etileno óxido de propileno. Em uma modalidade, o copolímero de óxido de propileno óxido tem um peso molecular aproximado de 2200 (por exemplo, disponível como Mazu® de Mazer Chemicals, Inc.).

Os grânulos da invenção podem incluir entre 0,01% a 50% ou 75% por peso de sólidos de enzima (enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares, produzida como acima descrito). Em várias modalidades, um grânulo pode compreender qualquer de pelo menos cerca de 0,5, 5,10, 20, 30 ou 40% de sólidos de enzima por peso . Uma camada compreendendo os sólidos de enzima, incluindo quaisquer aglutinantes e outros componentes nela, pode compreender entre cerca de 0,2% a 70% ou 80% por peso do grânulo.

Em algumas modalidades, uma camada contendo enzima tendo uma viscosidade menor do que 20 centipoises facilita a granulação livre de aglomeração.

Camadas de Revestimento

Os grânulos da presente invenção podem também compreender uma ou mais outras camadas de revestimento. As camadas de revestimento podem exercer qualquer de diversas funções dependendo do uso final do grânulo. Por exemplo, os revestimentos podem tornar o ingrediente ativo, particularmente enzimas, resistente à oxidação por alvejamento, ou camadas de revestimento podem realizar a taxa desejável de dissolução na introdução do grânulo em um meio aquoso, ou fornecer uma barreira contra a umidade de ambiente a fim de realçar a estabilidade de armazenagem do grânulo e reduzir a possibilidade de desenvolvimento microbiano no grânulo.

Em uma modalidade da presente invenção, a camada de revestimento compreende um ou mais polímero(s) e, opcionalmente, um pigmento com baixo teor de resíduo ou outros excipientes tal como lubrificantes. Tais excipientes são conhecidos por aqueles versados na técnica. Além disso, agentes de revestimento podem ser usados em conjunção com outros agentes ativos de categorias iguais ou diferentes.

Polímeros adequados incluem PVA e/ou PVP ou misturas de ambos. Se o PVA for usado, ele poderá ser PVA parcialmente hidrolisado, totalmente hidrolisado ou intermediariamente hidrolisado tendo graus baixos a elevados de viscosidade (preferivelmente e parcialmente PVA hidrolisado tendo baixa viscosidade). Outros polímeros de vinila que podem ser úteis incluem acetato de polivinila e polivinil pirrolidona. Copolímeros úteis incluem, por exemplo, copolímero de PVA-metilmetacrilato. Outros polímeros tal como PEG podem também ser usados na camada externa. Testas outras camadas de revestimento podem também compreender um ou mais dos seguintes: plastificantes, pigmentos, lubrificantes tal como tensoativos ou agentes antiestáticos e, opcionalmente, enzimas adicionais. Plastificantes adequados úteis nas camadas de revestimento da presente invenção são aqueles acima descritos. Pigmentos adequados úteis nas camadas de revestimento da presente invenção incluem, porém não estão limitadas a branqueadores finamente divididos tal como dióxido de titânio ou carbonato de cálcio, ou pigmentos coloridos, ou uma combinação dos mesmos. Preferivelmente tais pigmentos são pigmentos com baixo teor de resíduo na dissolução.

Como usado aqui lubrificantes significa qualquer agente que reduz a fricção da superfície, lubrifica a superfície do grânulo, diminui a eletricidade estática ou reduz a friabilidade dos grânulos. Os lubrificantes podem também desempenhar um papel relacionado na melhora do processo de revestimento, reduzindo a aderência de aglutinantes no revestimento. Desse modo, os lubrificantes podem funcionar como agentes antiaglomeração e agentes umectantes.

Agentes de lubrificação adequados incluem, porém não estão limitadas a tensoativos (iônicos, não iônicos ou aniônicos), ácidos graxos, agentes antiestático e agentes antipoeira. Preferivelmente o lubrificante é um tensoativo, e mais preferivelmente é um tensoativo com base em álcool tal como um álcool linear, primário de um alcano ou alqueno de comprimento de cadeia de 9 a 15 átomos de carbono ou um etoxilato ou etoxissulfato derivado dos mesmos. Tais tensoativos são comercialmente disponíveis como a linha de produto de Neodol® de Shell International Petroleum Company. Outros lubrificantes adequados incluem, porém não estão limitados a agentes antiestáticos tal como StaticGuard®, Downey®, Triton X100 ou 120 e similares, agentes antipoeira tal como Teflon® e similares, ou outros lubrificantes conhecidos por aqueles versados na técnica.

Outras camadas intermediárias, tais como aglutinantes, agentes de estruturação, e camadas de barreira podem ser incluídas. Materiais de barreira adequados incluem, por exemplo, sais inorgânicos, açúcares, ou sais ou ácidos orgânicos. Agentes de estruturação podem ser polissacarídeos ou polipeptídeos. Agentes de estruturação preferidos incluem amido, amido modificado, carragenina, celulose, celulose modificada, goma arábica, goma de guar, goma de acácia, goma xantana, goma de feijão alfarrobeira, quitosana, gelatina, colágeno, caseína, ácido poliaspártico e ácido poliglutâmico. Preferivelmente, o agente de estruturação tem baixa alergenicidade. Uma combinação de dois ou mais agentes de estruturação pode ser usadanos grânulos da presente invenção. Aglutinantes incluem, porém não estão limitados a açúcares e álcoois de açúcar. Açúcares adequados incluem, porém não estão limitados à sacarose, glicose, frutose, rafinose, trehalose, lactose e maltose. Álcoois adequados de açúcar incluem sorbitol, manitol e inositol.

Camada de Barreira

Em algumas modalidades, a camada de barreira é revestida sobre a camada de enzima ou sobre um núcleo contendo enzima em um grânulo contendo enzima como descrito aqui. Em algumas modalidades, a camada de barreira contém um ou mais sais, por exemplo, sulfato de sódio, citrato de sódio, sulfato de magnésio, sulfato de potássio, e/ou sulfato de amônio. Em algumas modalidades, a camada de barreira compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em sulfato de sódio. Em algumas modalidades, a camada de barreira contém um açúcar (por exemplo, sacarose), um polissacarídeo (por exemplo, amido), ou uma combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, a camada de barreira é hidratada. O termo hidratada significa que o material de barreira contém água em uma forma livre ou ligada, ou uma combinação das duas. A água de hidratação pode ser adicionada durante ou após o processo de revestimento. O grau de hidratação será uma função do próprio material e as condições de temperatura, umidade e secagem sob os quais ela é aplicada.

Atividade de água moderada ou alta significa tendo a atividade de água de pelo menos cerca de 0,25, 0,30, ou 0,35. A atividade de água referida aqui é aquela do próprio grânulo uma vez que ele tem o material de barreira, porém sem nenhum outro revestimento sobre ele. Outros revestimentos podem mascarar medição precisa da atividade de água do material de barreira como uma camada distinta.

Sem desejar ser ligada pela teoria, espera-se que materiais com a atividade de água maior do que 0,25 terão uma força motriz reduzida para captar água sob condições de armazenagem em que a umidade relativa é maior do que 25%. A maioria dos climas tem umidades relativas acima de 25%. Muitos detergentes têm atividades de água na faixa de cerca de 0,3 a 0,4. Se a atividade de água do grânulo é realmente mais alta do que aquela do detergente circundante ou clima de armazenagem, a força motriz para captação de água pelo grânulo deve ser eliminada, e de fato a água pode ser abandonada pelo grânulo para seus circundantes. Mesmo se a atividade de água do grânulo fosse menor do que aquela do detergente ou a correspondente umidade relativa, a água presente na camada de barreira agiria como um escudo limitando a quantidade de água sendo captada pelo grânulo e afetando o núcleo da proteína.

No caso de hidratos de sal, o material hidratado é um hidrato de sal cristalino com águas ligadas de cristalização. O hidrato deve ser escolhí do e aplicado de uma maneira de modo que o grânulo revestido resultante terá uma atividade de água em excesso de 0,25, ou tão alta quanto possível ao mesmo tempo que também retendo o grânulo que é seco ao toque. Aplicando um hidrato de sal, ou qualquer outro material de barreira hidratado adequado, de uma tal maneira que, se elimine qualquer força motriz para outra captação de água pelo grânulo. Como uma importante consequência, a força motriz para transporte de substâncias que pode ser prejudicial para atividade de enzima, tal como perborato ou ânion de peróxido, é removida. Sem água como um veículo, estas substâncias são menos provavelmente para penetrar um núcleo de enzima. Dados empíricos demonstram que a atividade de enzima no grânulo é substancialmente realçada revestindo um núcleo de enzima com hidratos de sal estáveis.

Exemplos de sais adequados para produção de uma camada de barreira hidratada incluem hepta-hidrato de sulfato de magnésio, heptahidrato de sulfato de zinco, penta-hidrato de sulfato de cobre, hepta-hidrato dibásico de fosfato de sódio, hexa-hidrato de nitrato de magnésio, decahidrato de borato de sódio, di-hidrato de citrato de sódio e tetra-hidrato de acetato de magnésio.

Camada de Revestimento Externa

Em algumas modalidades, uma enzima contendo grânulo compreende uma camada de revestimento externo. Em uma modalidade, a camada de revestimento externo é revestida sobre uma camada de enzima. Em algumas modalidades, uma camada de revestimento externo é revestida sobre uma ou mais camadas de revestimento intermediárias. Em uma modalidade, a camada de revestimento externa é revestida sobre a camada de barreira, que é revestida sobre a camada de enzima ou sobre um núcleo contendo enzima.

Em algumas modalidades, a camada de revestimento externo inclui um ou mais polímeros. Polímeros adequados incluem, porém não estão limitados a álcool polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona (PVP), acetato de polivinila, copolimero de PVA-metilmetacrilato, copolimero de PVP-PVA, derivados de celulose tal como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidro xicelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose, hidroxipropil celulose, polietileno glicol, óxido de polietileno, quitosana, goma arábica, xantana, carragenina, polímeros de látex, e polímero entérico.

Em algumas modalidades, a camada de revestimento externo inclui PVA. PVAs adequados para incorporação na camada de revestimento externo incluem parcialmente PVAs hidrolisados, totalmente hidrolisados, e intermediariamente hidrolisados tendo de baixo a altos graus de viscosidade. (Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.324.649.) Em uma modalidade, a camada de revestimento externo inclui PVA parcialmente hidrolisado tendo baixa viscosidade.

Em algumas modalidades, a camada de revestimento externo inclui um ou mais pigmentos. Exemplos não limitantes de pigmentos adequados incluem branqueadores finamente divididos, tal como dióxido de titânio ou carbonato de cálcio, sulfato de cálcio, talco, ou pigmentos coloridos ou corantes. Tipicamente, tais pigmentos são pigmentos de baixo teor de resíduo em dissolução. Além de polímeros e/ou pigmentos, a camada de revestimento externo podem também incluir um ou mais agentes plastificantes, extensores, lubrificantes, tensoativos, e antirredeposição.

Plastificantes adequados incluem, porém não estão limitados a polióis (por exemplo, açúcares, álcoois de açúcar, polietileno glicois (PEGs), glicol, propileno glicol), ureia, trietilcitrato, dibutila ou dimetilftalato, ou água.

Extensores adequados incluem, porém não estão limitados a açúcares (por exemplo, sacarose ou hidrolisados de amido, tal como maltodextrina ou sólidos de xarope de milho), argilas (por exemplo, caulim ou bentonita), e talco. Um extensor é uma substância (geralmente menor custo) adicionada à outra substância (geralmente maior custo e maior performance) para modificar ou dilui-la.

Lubrificantes adequados incluem, porém não estão limitados a tensoativos noniônicos (por exemplo, Neodol, Lutensol TO 65), álcoois de sebo, ácidos graxos, sais de ácido graxo (por exemplo, estearato de magnésio), e ésteres de ácido graxo.

Tensoativos adequados incluem, porém não estão limitados a etoxilatos de álcool tal como Neodol 23-6.5 e Lutensol TO65.

Agentes antirredeposição adequados incluem, porém não estão limitados a poliésteres de polietileno glicol tal como Repel-o-Tex SRP6, Texcare SRN-100 ou SRN-170, e Sorex-100.

Outros Ingredientes Auxiliares

Ingredientes auxiliares podem ser adicionados aos grânulos da presente invenção incluindo, porém não limitado a: sais metálicos, solubilizantes, ativadores, antioxidantes, corantes, inibidores, aglutinantes, fragrâncias, agentes de proteção de enzima/recuperadores tais como sulfato de amônio, citrato de amônio, ureia, cloridrato de guanidina, carbonato de guanidina, sulfonato de guanidina, dióxido de tioureia, monetianolamina, dietanolamina, trietanolamina, aminoácidos tais como glicina, glutamato de sódio e similares, proteínas tais como albumina de soro bovina, caseína e similares, etc., tensoativos, incluindo tensoativos aniônicos, tensoativos anfolíticos, tensoativos noniônicos, tensoativos catiônicos e sais de cadeia longa de ácido graxo, builders, álcalis ou eletrólitos inorgânicos, agentes de alvejamento, agentes de azulamento e tintas fluorescentes, e inibidores de aglutinação. Tensoativos são descritos, por exemplo, no Pedido PCT PCT/US92/00384, que é incorporado aqui por referência.

Matrizes de Grânulos

Em uma modalidade, o grânulo inclui uma proteína matriz que inclui uma composição contendo uma enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares misturados juntos com uma combinação de um açúcar ou álcool de açúcar e um agente de estruturação. (Veja, por exemplo, EP1037968B1). Opcionalmente, a camada de barreira pode ser colocada em camadas sobre uma matriz contendo enzima ou um material de barreira pode ser incluído em uma matriz contendo enzima. Também, opcionalmente, um revestimento pode ser aplicado sobre uma partícula semente, uma enzima matriz circundando a partícula semente, e/ou a camada de barreira. Em algumas modalidades, o agente de estruturação é um polissacarídeo ou um polipeptídeo. A matriz pode ser homogênea em todo o núcleo ou pode ser colocada em camadas sobre uma partícula semente. Pode existir uma ou mais camadas entre a partícula semente e a matriz ou a matriz e a camada de barreira, por exemplo, um revestimento tal como álcool polivinílico (PVA). Um grânulo matriz pode ser produzido, por exemplo, em um processador de leito fluidizado de spray de topo.

Partículas sementes são partículas inertes em que uma matriz de enzima que pode ser colocada em camadas pode ser composta de sais inorgânicos, açúcares, álcoois de açúcar, pequenas moléculas orgânicas tal como sais ou ácidos orgânicos, minerais tal como argilas ou silicatos ou uma combinação de dois ou mais destes. Ingredientes solúveis adequados para incorporação nas partículas sementes incluem: cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de amônio, sulfato de sódio, sesquicarbonato de sódio, ureia, ácido cítrico, citrato, sorbitol, manitol, oleato, sacarose, lactose e similares. Ingredientes solúveis podem ser combinados com ingredientes dispersíveis tais como talco, caulim ou bentonita. Partículas sementes podem ser fabricadas por uma variedade de técnicas de granulação incluindo: cristalização, precipitação, revestimento de panela, revestimento de leito fluidizado, aglomeração de leito fluido, atomização giratória, extrusão, pastilhamento, esferonização, granulação em cilindro e aglomeração de cisalhamento elevado. Nos grânulos da presente invenção, se uma partícula semente for usada em seguida a taxa de partículas sementes para grânulos será 1:1.

Açúcares adequados incluem açúcares tais como sacarose, glicose, frutose, rafinose, trealose, lactose e maltose. Álcoois adequados de açúcar incluem sorbitol, manitol e inositol. A taxa de açúcar ou álcool de açúcar para agente de estruturação na matriz é preferivelmente 0,1-90% por peso da matriz de proteína. O açúcar ou álcool de açúcar na matriz pode ser açúcar ou álcool de açúcar adicionado à proteína ou pode ser a partir do caldo de fermentação em que a proteína está presente.

O agente de estruturação pode ser um polissacarídeo ou um polipeptídeo. Estas classes de compostos têm as propriedades desejáveis simultaneamente de alto peso molecular e alta solubilidade de água. Sem desejar ser ligado pela teoria, acredita-se que o alto peso molecular do agente de estruturação contribui com duas importantes propriedades que uma matriz de açúcar ou álcool de açúcar sozinha não teriam: (1) fornecer coesão e resistência à partícula, reduzir enormemente a tendência da partícula para virar pó; e (2) servir como uma barreira de difusão para água e pequenas moléculas em virtude da formação uma rede de polímero ou gaiola através de toda a estrutura matriz. Isto enormemente melhora a estabilidade do grânulo.

Agentes de estruturação preferidos incluem amido, amido modificado, carragenina, celulose, celulose modificada, goma arábica, goma guar, goma acácia, goma xantana, goma de feijão locustre, quitosana, gelatina, colageno, caseína, ácido poliaspártico e ácido poliglutâmico. Preferivelmente, o agente de estruturação tem baixa arlegenicidade. Uma combinação de dois ou mais agentes de estruturação pode ser usada nos grânulos da presente invenção.

Uma matriz contendo enzima pode também conter um ou mais polímeros sintéticos ou outros excipientes como conhecido por aqueles versados na técnica. Polímeros sintéticos adequados incluem óxido de polietileno, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, polietileno glicol e óxido de polietileno / óxido de polipropileno. A matriz pode também ainda conter agentes plastificantes e antiaglomeração. Plastificantes adequados úteis na presente invenção incluem polióis tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol (PEG), ureia, ou outros conhecidos plastificantes tais como trietilcitrato, dibutila ou dimetilftalato ou água. Agentes antiaglomeração adequados incluem materiais finos insolúveis ou moderadamente solúveis tais como talco, T1O2, argilas, sílica amorfa, estearato de magnésio, ácido esteárico e carbonato de cálcio.

Os grânulos matrizes podem também conter uma camada de barreira. A camada de barreira é usada para retardar ou prevenir a difusão de substâncias que podem adversamente afetar a proteína ou enzima na matriz. A camada de barreira é preparada de um material de barreira e pode ser revestida sobre o núcleo de proteína ou o material de barreira pode ser incluído no núcleo de proteína. Materiais de barreira adequados incluem, por exemplo, sais inorgânicos ou sais ou ácidos orgânicos. A matriz sem a pro46 teína pode também ser usada como uma camada de barreira.

Os grânulos matrizes podem também conter uma ou mais camadas de revestimento. Por exemplo, tais camadas de revestimento podem ser uma ou mais camadas de revestimento intermediárias ou tais camadas de revestimento podem ser uma ou mais camadas externas de revestimento ou uma combinação das mesmas. Camadas de revestimento podem exercer qualquer de diversas funções em uma composição de grânulo, dependendo do uso final do grânulo de enzima. Por exemplo, revestimentos podem render uma enzima resistente à oxidação por alvejamento, realizar as taxas desejáveis de dissolução na introdução do grânulo em um meio aquoso, ou fornecer uma barreira contra a umidade ambiente a fim de realçar a estabilidade de armazenagem da enzima e reduzir a possibilidade de desenvolvimento microbiano no grânulo.

Revestimentos adequados incluem polímeros formadores de película solúveis em água ou dispersíveis em água tais como álcool polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona (PVP), derivados de celulose tais como metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, hidroxicelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose, hidroxipropil celulose, polietileno glicol, óxido de polietileno, goma arábica, xantana, carragenina, quitosana, polímeros de látex, e revestimentos entéricos. Além disso, agentes de revestimento podem ser usados em conjunção com outros agentes ativos das mesmas ou diferentes categorias.

PVAs adequados para incorporação na(s) camada(s) de revestimento^) do grânulo incluem PVAs parcialmente hidrolisados, totalmente hidrolisados e intermediariamente hidrolisados tendo de baixo a altos graus de viscosidade. Preferivelmente, a camada de revestimento externo compreende PVA parcialmente hidrolisado tendo baixa viscosidade. Outros polímeros de vinila que podem ser úteis incluem acetato de polivinila e polivinil pirrolidona. Copolímeros úteis incluem, por exemplo, copolímero de PVAmetilmetacrilato e copolímero de PVP-PVA. As camadas de revestimento podem também conter um ou mais dos seguintes: plastificantes, extensores, lubrificantes, pigmentos, e opcionalmente mais enzimas. Plastificantes adequados úteis nas camadas de revestimento da presente invenção são plasti ficantes incluindo, por exemplo, polióis tais como açúcares, álcoois de açúcar, ou polietileno glicois (PEGs), ureia, glicol, propileno glicol ou outros conhecidos plastificantes tais como trietilcitrato, dibutila ou dimetilftalato ou água. Pigmentos adequados úteis nas camadas de revestimento da presente invenção incluem, porém não estão limitados a branqueadores finamente divididos tal como dióxido de titânio ou carbonato de cálcio ou pigmentos coloridos e corantes ou uma combinação dos mesmos. Preferivelmente tais pigmentos são pigmentos de baixo teor de resíduo em dissolução. Extensores adequados incluem açúcares tal como sacarose ou hidrolisados de amido tais como maltodextrina e sólidos de xarope de milho, argilas tais como caulim e bentonita e talco. Lubrificantes adequados incluem tensoativos noniônicos tais como Neodol, álcoois de sebo, ácidos graxos, sais de ácido graxo tais como estearato de magnésio e ésteres de ácido graxo.

Formulações Líquidas

A invenção fornece formulações líquidas contendo enzima que compreendem uma enzima insolúvel em uma composição com células microbianas e/ou resíduos celulares, por exemplo, recuperadas como acima descrito. A enzima é enzimaticamente ativa ou tem potencial catalítico, isto é, é capaz de atividade catalítica em um ensaio ou aplicação de uso em um solvente apropriado e condições para atividade catalítica ocorrer, na formulação líquida. Em várias modalidades, a formulação líquida pode compreender ingredientes de formulação (substâncias estabilizantes) que estabilizam, isto é, mantêm as propriedades físicas e bioquímicas do produto durante armazenagem, incluindo, porém não limitados aos seguintes: um ou mais polióis, um ou mais sais, uma ou mais substâncias preservativas, ou um ou mais sais de tampão (e ácido ou base para ajuste de pH), um ou mais tensoativos, um ou mais aminoácidos, um ou mais antioxidantes ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a formulação líquida compreende um ou mais polióis, por exemplo, glicose, sacarose, sorbitol, glicerol, lactose, dextrose, propileno glicol, concentração de cerca de 1 a cerca de 50% (peso/volume). Em algumas modalidades, a formulação líquida compreende um ou mais sais, por exemplo, NaCI, CaCL, Na2SO₄, formiato de sódio, citrato de sódio, glutamato de monossódio, cloreto de cálcio, concentração de cerca de 0,1 a cerca de 50% (peso/volume). Em algumas modalidades, a formulação líquida compreende um ou mais agentes preservativos, por exemplo, benzoato de sódio, propionato de sódio, sorbato de potássio, parabeno, concentração de cerca de 0,1 a cerca de 5% (peso/volume). Em algumas modalidades, a formulação líquida compreende um ou mais sais de tampão, por exemplo, acetato de sódio, citrato de sódio, MES, HEPES, concentração de 0,1 a cerca de 20% (peso/volume). Um ácido (por exemplo, um ácido fraco, tal como ácido acético ou ácido fórmico, ou um ácido forte, tal como HCI ou H2SO4) ou uma base (por exemplo, NaOH ou KOH) pode ser usado para ajuste de pH. Para uma referência descrevendo formulações líquidas geralmente, veja Isolation and Purification of Proteins (2003) R. Hatti-Kaul e B. Mattiasson, ed., Marcell Dekker, Inc., páginas 549-604.

A invenção também fornece métodos para preparação de formulações líquidas que compreendem uma enzima insolúvel, por exemplo, recuperada como acima descrito, em uma composição com células microbianas e/ou resíduos celulares, em que a enzima é enzimaticamente ativa na formulação líquida. Em uma modalidade, o método compreende suprimento de uma composição que compreende uma enzima insolúvel, por exemplo, recuperada como acima descrito, e células microbianas e/ou resíduos celulares, parcialmente ou totalmente solubilizando a enzima insolúvel, por exemplo, combinando uma composição com um ou mais ingredientes de formulação como acima descrito, por exemplo, um ou mais poliol, um ou mais sal, uma ou mais substância preservativa, e/ou um ou mais sal de tampão, opcionalmente em um líquido, tipicamente água, desse modo produzindo a formulação líquida. Em uma modalidade, o método compreende suprimento de uma composição que compreende uma enzima insolúvel e células microbianas e/ou resíduos celulares, por exemplo, recuperados como acima descrito, solubilizando a enzima insolúvel, por exemplo, combinando uma composição com um ou mais ingredientes de formulação como acima descrito, por exemplo, um ou mais poliol, um ou mais sal, uma ou mais substância preservativa, e/ou um ou mais sal de tampão, com a composição que contém enzima insolúvel recuperada e células microbianas e/ou resíduos celulares, opcionalmente em um líquido, tipicamente água, e clarificando a composição contendo enzima solúvel removendo células microbianas e/ou resíduos celulares, por exemplo, por filtração, tal como filtração de membrana, e/ou centrifugação, desse modo produzindo uma formulação líquida clarificada.

Composições

A invenção fornece composições contendo grânulos contendo enzima ou formulações líquidas como acima descrito. Além de um grânulo contendo enzimas ou formulações líquidas, as composições contêm componentes adequados para uso dos grânulos ou formulações líquidas em particular aplicações de uso, tal como purificando (por exemplo, detergentes), processamento têxtil, aplicações em alimentação animal, fermentação, cozimento, alimento, ou bebidas.

Composições de Limpeza

Em algumas modalidades, grânulos contendo enzima ou formulações líquidas como descrito aqui são incorporados em uma composição de limpeza, tal como um detergente, por exemplo, para uso de lavanderia ou lavagem de louça, para fornecer desempenho de limpeza e/ou benefícios de limpeza. Enzimas adequadas para inclusão em uma composição de limpeza incluem, porém não estão limitadas às hemicelulases, peroxidases, proteases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, ceratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, β-glicanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacases, perhidrolases, e amilases, ou misturas das mesmas. Uma combinação típica é um coquetel de enzimas convencionais aplicáveis tipo protease, lipase, cutinase e/ou celulase em conjunção com amilase.

Materiais auxiliares podem também ser incluídos em uma composição de limpeza, por exemplo, para assistir ou realçar o desempenho de limpeza, para tratamento do substrato ser limpo, ou para modificar as estéti cas de uma composição de limpeza como é o caso com perfumes, colorantes, corantes ou similares. Entende-se que tais auxiliares são além de um grânulo contendo enzimas como descrito aqui. A natureza precisa destes componentes adicionais e níveis de incorporação destes dependerá da forma física da composição e a natureza da operação de limpeza para a qual deve ser usada. Materiais auxiliares adequados incluem, porém não estão limitados a tensoativos, builders, agentes de quelação, agentes inibidores de transferência de corante, auxiliares de deposição, dispersantes, estabilizadores de enzima, materiais catalíticos, ativadores de alvejamento, fomentadores de alvejamento, perácidos pré-formados, agentes de dispersão poliméricos, agentes antirredeposição/remoção de sujeira de argila, abrilhantadores, supressores de espuma de sabão, corantes, perfumes, agentes elastificantes de estrutura, amaciantes de tecido, veículos, hidrótropos, auxiliares de processamento e/ou pigmentos. Além da descrição abaixo, exemplos adequados de tais outros auxiliares e níveis de uso são descritos nas Patentes dos Estados Unidos n°^s 5.576.282, 6.306.812, e 6.326.348.

Em algumas modalidades, a composição de limpeza não contém fosfato. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente de lavagem de louça contendo não-fosfato. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é um detergente de lavanderia contendo nãofosfato. Em algumas modalidades, a composição de limpeza contendo nãofosfato contém uma carga de não-fosfato, por exemplo, citrato.

Tensoativos - Uma composição de limpeza como descrito aqui pode compreender um sistema tensoativo ou surfactante em que o surfactante pode ser selecionado de tensoativos noniônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolíticos, tensoativos zwitteriônico, tensoativos noniônicos semipolares, e misturas dos mesmos. Um tensoativo está tipicamente presente em um nível de cerca de 0,1% a cerca de 60%, cerca de 1 % a cerca de 50% ou cerca de 5% a cerca de 40% por peso da composição de limpeza objeto.

Builders - Uma composição de limpeza como descrito aqui pode compreender um ou mais builder detergente ou sistema builder. Quando um builder é usado, a composição de limpeza objeto tipicamente compreenderá pelo menos cerca de 1%, cerca de 3% a cerca de 60%, ou cerca de 5% a cerca de 40% de builder por peso da composição de limpeza objeto.

Builders incluem, porém não estão limitados a sais de metal de álcali, amônio e alcanolamônio de polifosfatos, silicatos de metal de álcali, carbonatos de metal alcalino terroso e de álcali, builders de aluminosilicato, compostos de policarboxilato. Hidroxipolicarboxilatos de éter, copolímeros de anidrido maleico com etileno ou vinil metiléter, ácido 1,3,5-triidróxi benzeno-2, 4, 6-trisulfônico, e ácido carboximetiloxissuccínico, os vários sais de metal de álcali, amônio e amônio substituído de ácidos poliacéticos tal como ácido etilenodiamina tetra-acético e ácido nitrilotriacético, bem como policarboxilatos tais como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido benzeno 1,3,5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxissuccínico, e sais solúveis destes.

Agentes de Quelacão - Uma composição de limpeza como descrito aqui pode conter um ou mais agentes de quelação. Agentes de quelação adequados incluem, porém não estão limitados aos agentes de quelação de cobre, ferro e/ou manganês e misturas dos mesmos. Quando um agente de quelação é usado, a composição de limpeza pode compreender cerca de 0,1% a cerca de 15%, ou cerca de 3,0% a cerca de 10% de agente de quelação por peso da composição de limpeza objeto.

Auxiliar de Deposição - Uma composição de limpeza como descrito aqui pode conter a um ou mais auxiliar de deposição. Auxiliares de deposição adequados incluem, porém não estão limitados a polietileno glicol, polipropileno glicol, policarboxilato, polímeros de liberação de sujeira tais como ácido politeleftálico, e argilas tais como caolimita, montmorilonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita, e misturas dos mesmos.

Agentes inibidores de transferência de corante - Uma composição de limpeza como descrito aqui pode incluir um ou mais agente inibidor de transferência de corante. Agentes inibidores de transferência de corante poliméricos adequados incluem, porém não estão limitados a polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas, e polivinilimidazois, e misturas dos mesmos. Quando presente em uma composição de limpeza objeto, agente inibidor de transferência de corante pode estar presente em níveis de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,01% a cerca de 5%, ou cerca de 0,1% a cerca de 3% por peso da composição de limpeza.

Dispersantes - Uma composição de limpeza como descrito aqui pode conter um ou mais dispersante. Dispersantes orgânicos solúveis em água adequados incluem, porém não estão limitados aos ácidos homo- ou copoliméricos ou seus sais, em que o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais que dois átomos de carbono.

Estabilizantes de Enzima - Enzimas para uso em detergentes podem ser estabilizadas por várias técnicas. As enzimas empregadas aqui podem ser estabilizadas, por exemplo, pela presença de fontes solúveis em água de íons de cálcio e/ou magnésio nas composições finalizadas que fornecem tais íons para as enzimas.

Complexos de Metal Catalíticos - Uma composição de limpeza como descrito aqui pode incluir um ou mais complexo de metal catalítico. Um tipo de catalisador de alvejamento contendo metal é um sistema de catalisador compreendendo um cátion de metal de transição de atividade catalítica de alvejamento definida, tal como cátions de cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdeno, ou manganês, um cátion de metal auxiliar tendo pouca ou nenhuma atividade catalítca de alvejamento, tais como cátions de zinco ou alumínio, e um sequestrante tendo constantes de estabilidade definida para os cátions de metal auxiliar e catalítico, particularmente ácido etilenodiaminatetraacético, etilenodiaminatetra (ácido metilenofosfônico) e sais solúveis em água destes. Tais catalisadores são descritos em Patente dos Estados Unidos n° 4.430.243. Catalisadores contendo maganês úteis aqui são conhecidos, e são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.576.282. Catalisadores de alvejamento de cobalto úteis aqui são conhecidos, e são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos n°^s 5.597.936 e 5.595.967. Tais catalisadores de cobalto são facilmente pre parados por procedimentos conhecidos, tal como ensinado por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos n°^s 5.597.936 e U.S. 5.595.967.

As composições aqui podem também incluir um complexo de metal de transição de um ligante rígido macropolicíclico - abreviado como MRL. Como uma matéria prática, e não a título de limitação, as composições e processos de limpeza aqui podem ser ajustados para fornecer na ordem de pelo menos uma parte por cem milhões das espécies de MRL ativas no meio de lavagem aquoso, e frequentemente fornecerá cerca de 0,005 ppm a cerca de 25 ppm, cerca de 0,05 ppm a cerca de 10 ppm, ou cerca de 0,1 ppm a cerca de 5 ppm, do MRL no líquido de lavagem. Metais de transição adequados em um catalisador de alvejamento de metal de transição incluem manganês, ferro e cromo. Em uma modalidade, um MRL é um ligante ultra rígido que é em ponte cruzada, tal como 5,12-dietil1,5,8,12-tetraazabiciclo[6.6.2] hexadecano. MRLs de metal de transição adequados são facilmente preparados por procedimentos conhecidos, tal como ensinado por exemplo, no Pedido de PCT n° WO 00/332601 e Patente dos Estados Unidos n° 6.225.464.

As composições de limpeza descritas aqui podem ser usadas para limpar um sítio sobre uma superfície ou tecido. Tipicamente pelo menos uma porção do sítio é contatada com uma composição de limpeza como acima descrito, em forma pura ou diluída em um líquido de lavagem, e em seguida o sítio é opcionalmente lavado e/ou enxaguado. Lavagem inclui, porém não é limitada a, escovação, e agitação mecânica. Um tecido pode compreender a maior parte de qualquer tecido capaz de ser lavado em condições de uso do consumidor. As composições de limpeza descritas são tipicamente empregadas em concentrações de cerca de 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. Quando o solvente de lavagem é água, a temperatura de água tipicamente varia de cerca de 5°C a cerca de 90°C e, quando o sítio compreende um tecido, a relação de massa de água para tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.

Composições de Processamento Têxtil

Em algumas modalidades, grânulos contendo enzima ou formu lações líquidas como descrito aqui são incorporados em uma composição de processamento têxtil. Enzimas adequadas para inclusão em uma composição de processamento têxtil incluem, porém não estão limitadas a celulases, perhidrolases, poliesterases, amilases, catalases, pectinases, e lacases. Em algumas modalidades, uma composição de processamento têxtil pode também incluir um agente antirredeposição (por exemplo, Repel-O-Tex, Sorez 100 (ISP Corp.).

Composições de Alimentação de Animal

Em algumas modalidades, grânulos contendo enzima ou formulações líquidas como descrito aqui são incorporados em uma composição de alimentação de animal. Enzimas adequadas para inclusão em uma composição de alimento incluem enzimas celulolítica e/ou hemicelulolítica. Exemplos não limitantes de enzimas adequadas para incorporação em uma composição de alimento incluem fitases, xilanases, fosfatases, proteases, amilases, esterases, enzimas redox, lipases, transferases, celulases, fosfolipases, ligninases, e β-glicanases.

Os seguintes exemplos destinam-se a ilustrar, porém não limitar a invenção.

Exemplos

Exemplo 1

Preparação de Concentrado de Enzima e Formulação Granular a Partir do Caldo de Fermentação Contendo Enzima Parcialmente Precipitada Usando Processo de Recuperação Convencional

Preparação de Lisado Bacteriano

Bacillus licheniformis que recombinantemente expressa enzima α-amilase como descrito no Pedido de PCT n° WO08/112459 foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo continha enzima precipitada. Uma amostra do caldo foi centrifugado a 10,000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante resultante continha 10% da atividade de enzima total avaliada no caldo total antes da centrifugação. 90% da enzima foram insolúveis. A atividade alfa-amilase foi determinada como descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos n° 12/041.917.

Para lise celular, a temperatura do caldo foi ajustada para 40°C e 0,01% de (peso/peso) lisoenzima foi adicionado. O caldo foi mantido durante 48 horas, e em seguida diluído com 0,6 partes de água e imediatamente floculado com 4% de (peso/peso) polímero catiônico (C581, de Cytec Industries, Inc.). Terra diatomácea (FW12, de World Minerais) foi adicionada a 4% de (peso/peso) ao caldo floculado e filtrado através de um filtro a vácuo de extremidade morta equipado com almofada filtrante HR9000 revestida com massa diatomácea FW12. A produção de enzima no filtrado após separação celular foi de 6%.

O filtrado clarificado foi concentrado com um ultrafiltro equipado com uma membrana de ferimento espiral (KOCH Membrabe Systems) de polietersulfona (PES) de redução de peso molecular de 10k (MWCO)(. O concentrado final continha 11,5 g/l ou 1,15% (peso/volume) de a-amilase ativa e 27,04% (peso/peso) de substância sólida seca.

A produção total para este processo foi de 5% da atividade de enzima de partida no caldo total e a pureza foi de 4,3% (sólidos secos ativos/sólidos secos totais).

Formulação qranular

Uma composição granular foi preparada a partir de um concentrado de enzima como segue.

Spray 1: 513 gramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. A este, 2062 gramas de solução contendo 11,5 g/L de amilase ativa, 1,6% de talco (Nytal 400), 0,5% de álcool polivinílico (Erkol 5/88), 1,0% de antiespuma (Foamblast 882 de Emerald Performance Materiais), e 1,6% de amido de milho (Cargill Foods) foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue: Taxa de spray de solução 3,6 gpm (gramas por minuto), aumentando para 13,6 gpm durante 1,5 horas. Mantida a 13,6 gpm para o restante do experimento. Temperatura de entrada 69°C, aumentada para 72°C após 30 minutos

Temperatura de saída

Fluxo de ar de fluidização

Pressão de ar de atomização

Taxa de spray de solução

Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

Entre 43,9°C e 46,2°C

Entre 76,0 cfm (pés cúbico por minuto) e 81,4 cfm 2,10 kg/cm² (40psi) (libras por polegada quao drada), aumentando para 2,81 kg/cm durante 1,5 hora.

1043 gramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 1043 gramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1667 gramas de uma solução aquosa contendo 333 gramas de sulfato de sódio (20% de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima.

Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

8,3 gpm (gramas por minuto), aumentando para 19,2 gpm durante 15 minutos. Mantida a 19,2 gpm para o restante do experimento. 63°C, aumentada para 80°C após 15 minutos Entre 44,2°C e 47,8°C

Entre 79,5 cfm (pés cúbico por minuto) e 82,6 cfm

2,81 kg/cm²(40psi)

Pressão de ar de atomização

1363 gramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 1363 gramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1065 gramas de uma solução aquosa contendo 83 gramas (5% de composição de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), 83 gramas (5% de composição de grânulo) de dióxido de titânio (R902 de DuPont), e 25 gramas (1,5% de composição de grânulo) de Neodol (23 a 6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução 4,2 gpm (gramas por minuto), aumentando para 12,2 gpm durante 30 minutos. Mantida a 12,2 gpm para o restan57

Temperatura de entrada

Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

Pressão de ar de atomização te do experimento.

75°C, aumentada para 78°C após 30 minutos

Entre 46,0°C e 52,4°C

Entre 78,4 cfm (pés cúbico por minuto) e 81,2 cfm

2,81 kg/cm²(40psi)

1487 gramas de produto final foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analisados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 1,66 mg/almofada.

Exemplo 2

Preparação de Concentrado de Enzima e Formulação Granular a Partir do Caldo de Fermentação Contendo Enzima Parcialmente Precipitada por Dissolução do Precipitado Seguido por Processo de Recuperação Convencional Preparação de Concentrado de Enzima

Bacillus licheniformis que recombinantemente expressa enzima α-amilase como descrito no Pedido de PCT n° WO 08/112459 foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo continha enzima precipitada. Uma amostra do caldo foi centrifugado a 10.000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante resultante continha 5% da atividade de enzima total avaliada no caldo total antes da centrifugação. 95% da enzima ficaram insolúveis.

Para a lise celular, a temperatura do caldo foi ajustada para

40°C e 0,01% (peso/peso) de lisoenzima foi adicionado. O caldo foi mantido durante 1,5 hora. A temperatura foi em seguida aumentada para 60°C e mantida a 60°C durante uma hora. O caldo foi em seguida diluído com uma parte de água.

A enzima precipitada permaneceu insolúvel após a etapa de aquecimento e a diluição. O lisado foi em seguida incubada com mistura suave em temperatura ambiente durante 28 horas com 5% (peso/peso) de glicose e 3% (peso/peso) NaCI em pH 9 antes da separação celular. A maioria da atividade de α-amilase precipitada (84%) foi solubilizada.

O lisado foi em seguida floculado com 4% (peso/peso) de polímero catiônico (C581, de Cytec Industries, Inc.). Terra diatomácea (FW12, de World Minerais) foi adicionada em 4% (peso/peso) ao caldo floculado e filtrada através de um filtro de cilindro a vácuo giratório pré-revestido com massa diatomácea FW12. A produção de enzima no filtrado após separação celular foi de 87%.

O filtrado clarificado foi concentrado com um ultrafiltro equipado com uma membrana de ferimento espiral MWCO PES de 10K (KOCH Membrane Systems). O concentrado final continha 60 g/l ou 6% (peso/volume) de α-amilase ativa e 27% (peso/peso) de substância sólida seca.

A produção total para este processo foi de 84% da atividade de enzima de partida no caldo total e a pureza foi de 22% (sólidos secos ativos/sólidos secos totais). Entretanto, o concentrado continha glicose e NaCL A remoção destas substâncias adversamente impactaria no custo do processo.

Formulação Granular

Spray 1: 478 gramas de cristal de sacarose, com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 200 pm a 600 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. A este, 628 gramas de solução contendo 60,0 g/L de amilase ativa, 115 gramas (9,8% de composição de grânulo) de amido de milho (Cargill Foods) foram revestidos por spray nos cristais de sacarose. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	2,9 gpm (gramas por minuto), aumentando para 17,3 gpm durante 52 minutos. Mantida a 20,2 gpm para o restante do experimento.
Temperatura de entrada	Entre 71 °C e 74 °C durante o spray 1
Temperatura de saída	Entre 44,7°C e 48,5°C
Fluxo de ar de fluidização	Entre 83,5 cfm (pés cúbico por minuto) e 87,2 cfm
Pressão de ar de atomização	2,24 kg/cm²(32psi)(libras por polegada quadrada),

aumentando para 2,81 kg/cm² (40psi) durante 52 minutos.

700 gramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 700 gramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1308 gramas de uma solução aquosa contendo 120 gramas (10,2% de composição de grânulo) de sacarose (C&H Sugars), 120 gramas (10,2% de composição de grânulo) de amido de milho (Cargill Foods), 72 gramas (6,1% de composição de grânulo) de dióxido de titânio (R902 DuPont), e 15 gramas (1,3% de composição de grânulo) de Neodol (23 a 6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima.

Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	12,2 gpm (gramas por minuto), aumentando para 20,2 gpm durante 10 minutos. Mantida a 20,2 gpm para o restante do experimento.
Temperatura de entrada	74°C, aumentada para 82°C após 15 minutos
Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 46,3°C e 47,7°C Entre 85,0 cfm (pés cúbico por minuto) e 88,0 cfm
Pressão de ar de atomização	Entre 2,26 kg/cm² (35psi) e 2,53 kg/cm²(36psi)

988 gramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 988 gramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 586 gramas de uma solução aquosa contendo 29 gramas (2,5% de composição de grânulo) de hidróxi propil metilcelulose (HPMC E-15 Dow Chemicals), e 4 gramas (0,3% de composição de grânulo) de polietileno glicol 600 (Carbowax by Electron Microscopy Sciences) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima.

Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução

8,1 gpm (gramas por minuto), aumentando

para 15,6 gpm durante 45 minutos. Mantida a 15,6 gpm para o restante do experimento.

Temperatura de entrada

Temperatura de saída

Entre 75 °C e 82 °C

Entre 43,6°C e 50,3°C

Fluxo de ar de fluidização

Entre 85,0 cfm (pés cúbico por minuto) e

87,8 cfm

Pressão de ar de atomização 2,81 kg/cm (40psi)

1014 gramas de produto final foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analisados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 2,80 mg/almofada.

Exemplo 3

Preparação de Concentrado de Enzima e Formulação Granular de Lisado Celular Homogeneizado a Partir do Caldo de Fermentação Contendo Enzima Parcialmente Precipitada

Preparação de Lisado Celular Homogeneizado

Bacillus licheniformis que recombinantemente expressa enzima α-amilase como descrito no Pedido de PCT n° WO08/112459 foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo continha enzima precipitada. Uma amostra do caldo foi centrifugado a 10.000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante resultante continha 6% da atividade de enzima total avaliada no caldo total antes da centrifugação.

A lise celular foi realizada como descrito no exemplo 2. O lisado foi em seguida resfriado para 10°C e homogeneizado a 421,84 kg/cm (6000psi) em um homogeneizador Gaulin. A produção de enzima foi de 90%, e a pureza foi de 6% (sólidos secos ativos/sólidos secos totais).

Formulação Granular

Uma composição granular foi preparada a partir dos lisados homogeneizados como segue.

Spray 1: 17,64 quilogramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Deseret 60 e flui dizados. A este, 259,41 quilogramas de solução contendo 12,53 g/L de amilase ativa, 5,88 quilogramas (5% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400), 1,18 quilogramas (1,0% de composição de grânulo) de antiespuma (Foamblast 882 de Emerald Performance Materiais), 7,06 quilogramas (6% de composição de grânulo) de amido de milho (Cargill Foods), e 1,18 quilograma (1,0% de composição de grânulo) de Neodol (23 a 6,5 de Shell Chemicals) foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	50 gpm (gramas por minuto), aumentando para 500 gpm durante 3 horas. Mantida a 500 gpm para o restante do experimento.
Temperatura de entrada Temperatura de saída	Entre 73°C e 85°C Entre 42,7°C e 55,7°C

Fluxo de ar de fluidização Entre 800 cfm (pés cúbico por minuto) e 952 cfm

Pressão de ar de atomização 4,21 kg/cm (60psi) (libras por polegada quadrada), aumentando para 4,78 kg/cm² (68psi) durante 5 horas.

65,2 quilogramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 65.2 quilogramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Deseret 60 e fluidizados. 111,11 quilogramas de uma solução aquosa contendo 22,22 quilogramas de sulfato de sódio (20% de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	Entre 500 gpm (gramas por minuto) to 580 gpm durante spray 2 total.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	85°C Entre 48,3°Ce 54,1°C Entre 1109 cfm (pés cúbico por minuto) e 1234 cfm

Pressão de ar de atomização 4,92 kg/cm²(70psi) quilogramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 84,967 quilogramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Deseret 60 e fluidizados. 84.97 quilogramas de uma solução aquosa contendo 6,12 quilogramas (5,2% de composição de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), 6,12 quilogramas (5,2% de composição de grânulo) de dióxido de titânio (R902 de DuPont), 1,53 quilograma (1,3% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400) e 1,53 quilograma (1,3% de composição de grânulo) de Neodol (23 a 6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue: Taxa de spray de solução

Entre 310 gpm (gramas por minuto) a 400 gpm durante spray 3 total.

85°C

Temperatura de entrada

Temperatura de saída

Fluxo de ar de fluidização

Entre 48,8°C e 56,8°C

Entre 1070 cfm (pés cúbico por minuto) e

1238 cfm

2

Pressão de ar de atomização Entre 4,92 kg/cm (70psi) e 5,34 kg/cm (76psi) 97,6 quilogramas de produto foram colhidos.

Spray 4: 97,6 quilogramas dos grânulos de enzima de spray 3 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Deseret 60 e fluidizados. 9,41 quilogramas de uma solução aquosa contendo 471 gramas (0,4% de composição de grânulo) de Neodol (23 a 6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima.

Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue: Taxa de spray de solução Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

295 gpm durante spray 4 total

85°C

Entre 47,1 °C e 51,1 °C

Entre 1126 cfm (pés cúbico por minuto) e 1220 cfm

Entre 4,56 kg/cm²(65psi) e 4,78 kg/cm²(68psi)

101,2 quilogramas de produto foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analiPressão de ar de atomização sados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 0,33 mg/almofada.

Exemplo 4

Preparação de Concentrado de Enzima e Formulação Granular de Lisado Celular Homogeneizado e Diafiltrado a Partir do Caldo de Fermentação Contendo Enzima Parcialmente Precipitada

Preparação de Lisado Celular Homogeneizado

Bacillus licheniformis gue recombinantemente expressa enzima α-amilase como descrito no Pedido de PCT n° WO08/112459 foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo continha enzima precipitada. Um lisado homogeneizado foi preparado como descrito no exemplo 3.

O lisado homogeneizado foi diafiltrado e concentrado com um ultrafiltro eguipado com uma membrana de ferimento espiral MWCO PES de 10K (KOCH Membrane Systems). O concentrado final continha 11 g/l ou 1,1% (peso/volume) de α-amilase ativa e 16,7% (peso/peso) de substância sólida seca.

O lisado homogeneizado foi diafiltrado usando água municipal. Diafiltração de volume constante foi realizada, isto é, mantendo o volume no tangue de alimentação contendo o lisado homogeneizado constante, adicionando água municipal para substituir o volume de permeado removido do sistema. A quantidade de água de diafiltração usada foi de 0,5x do lisado homogeneizado inicial. O lisado homogeneizado diafiltrado foi também concentrado para 16% (peso/peso) de sólidos secos. A pureza da preparação resultante foi de 9,3% (sólidos secos ativos/sólidos secos totais). A pureza foi de 1,25 vezes mais do que o lisado homogeneizado preparado no exemplo 3.

Formulação Granular

Uma composição granular foi preparada a partir do lisado homogeneizado e diafiltrado como segue.

Spray 1: 29,606 quilogramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 μηη, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Deseret 60 e fluidizados. A este, 170,79 quilogramas de solução contendo 14,2 g/L de amilase ativa, 5,88 quilogramas (5% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400), 1,18 quilogramas (1,0% de composição de grânulo) de antiespuma (Foamblast 882 de Emerald Performance Materiais), 11.77 quilogramas (10% de composição de grânulo) de amido de milho (Cargill Foods), e 1,18 quilograma (1,0% de composição de grânulo) de Neodol (23-6,5 de Shell Chemicals) foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	106 gpm (gramas por minuto), aumentando para 550 gpm durante 5 horas. Mantida a 550 gpm para o restante do experimento.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 80°C e 82,6°C Entre 51,0°Ce 60,9°C Entre 804 cfm (pés cúbico por minuto) e 1058 cfm

o

Pressão de ar de atomização 4,56 kg/cm (65psi) (libras por polegada quadrada), aumentando para 4,92 kg/cm²(70psi) durante 5 horas.

66,6 quilogramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 66,6 quilogramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Deseret 60 e fluidizados. 111.11 quilogramas de uma solução aquosa contendo 22,22 quilogramas de sulfato de sódio (20% de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	Entre 400 gpm (gramas por minuto) a 640 gpm durante spray 2 total.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 83,5°C e 85,6°C Entre 51,4°Ce 54,8°C Entre 1097 cfm (pés cúbico por minuto) e 1246 cfm

Pressão de ar de atomização 4,92 kg/cm²(70psi)

93,8 quilogramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 93,8 quilogramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Deseret 60 e fluidizados. 84,97 quilogramas de uma solução aquosa contendo 6,12 quilogramas (5,2% de composição de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), 6,12 quilogramas (5,2% de composição de grânulo) de dióxido de titânio (R902 de DuPont), 1,53 quilograma (1,3% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400) e 1,53 quilograma (1,3% de composição de grânulo) de Neodol (23-

6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	Entre 200 gpm (gramas por minuto) a 410 gpm durante o spray 3 total.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 79,6°C e 83,9°C Entre 55,9°C e 59,6°C Entre 1121 cfm (pés cúbico por minuto) e 1244 cfm

Pressão de ar de atomização Entre 4,92 kg/cm² (70psi) e 5,27 kg/cm (75psi)

108,4 quilogramas de produto foram colhidos.

Spray 4: 108,4 quilogramas dos grânulos de enzima de spray 3 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Deseret 60 e fluidizados. 9,41 quilogramas de uma solução aquosa contendo 471 gramas (0,4% de composição de grânulo) de Neodol (23-6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

250 gpm durante spray 4 total Entre 82,7°C e 82,9°C Entre 57,4°C e 59,7°C Entre 1157 cfm (pés cúbico por minuto) e 1299 cfm

o

Pressão de ar de atomização 4,92 kg/cm (70psi)

110,0 quilogramas de produto foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analisados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 0,15 mg/almofada.

Exemplo 5

Preparação de Concentrado de Enzima e Formulação Granular de Lisado Celular Diafiltrado a Partir do Caldo de Fermentação Contendo Enzima Parcialmente Precipitada

Preparação de Lisado Celular Diafiltrado

Bacillus licheniformis que recombinantemente expressa enzima α-amilase como descrito no Pedido de PCT n° WO08/112459 foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo continha enzima precipitada. As células foram lisadas como descrito no exemplo 2. O lisado foi diafiltrado usando água municipal como descrito no exemplo 4. O lisado diafiltrado foi também concentrado para 18,2% (peso/peso) de sólidos secos. A pureza da preparação resultante foi de 17% (sólidos secos ativos/sólidos secos totais). A pureza foi de 1,7 vezes mais do que o lisado homogeneizado preparado no exemplo 3.

Exemplo 6

Preparação de Lisado Celular Diafiltrado

Bacillus licheniformis que expressa enzima α-amilase como descrito no Pedido de PCT n° WO08/112459 foi fermentado como descrito no exemplo 1. O lisado foi diafiltrado e concentrado como no exemplo 5. A preparação resultante tinha uma enzima atividade de 2,14% e os sólidos secos foram de 17,2%.

Formulação granular

Uma composição granular foi preparada a partir do lisado diafiltrado como segue.

Spray 1: 691 gramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. A este, 1470 gramas de solução contendo 23,41 g/L de amilase ativa, 5% de talco (Nytal 400), 1,0% de antiespuma (Foamblast 882 de Emerald Performance Materiais), e 5% de amido de milho (Cargill Foods) foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	2,6 gpm (gramas por minuto), aumentando para 14,1 gpm durante 1,5 hora.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	69°C, aumentada para 72°C após 30 minutos Entre 44,9°C e 45,8°C Entre 78,6 cfm (pés cúbico por minuto) e 80,8 cfm

Pressão de ar de atomização 2,10 kg/cm²(30psi) (libras por polegada quao d rada), aumentando para 2,81 kg/cm (40psi) durante 1,5 hora.

1050 gramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 1050 gramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1667 gramas de uma solução aquosa contendo 333 gramas de sulfato de sódio (20% de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	Entre 15,6 gpm (gramas por minuto) e 17,4 gpm
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 78°C e 82°C Entre 46,0°C e 47,5°C Entre 78,6 cfm (pés cúbico por minuto) e 82,0 cfm

o

Pressão de ar de atomização 2,81 kg/cm (40psi)

1352 gramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 1352 gramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1127 gramas de uma solução aquosa contendo 88 gramas (5% de composição de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), 88 gramas (5% de composição de grânulo) de dióxido de titânio (R902 de DuPont), e 26 gramas (1,5% de composição de grânulo) de Neodol (23-6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	3.2 gpm (gramas por minuto), aumentando para 10,2 gpm durante 60 minutos. Mantida a 10.2 gpm para o restante do experimento.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	75°C, aumentada para 80°C após 10 minutos Entre 52,0°C e 53,7°C Entre 82,5 cfm (pés cúbico por minuto) e 83,1 cfm

Pressão de ar de atomização 2,81 kg/cm (40psi) 1535 gramas de produto final foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analisados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 1,50 mg/almofada.

Exemplo 7 Preparação de Concentrado de Caldo Bacteriano com Enzima Solúvel e Formulação Granular

Preparação de Concentrado de Enzima

Bacillus subtilis que expressa subtilisina protease foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo continha a maior parte de enzima subtilisina solúvel. O caldo foi centrifugado a 10.000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante resultante continha a atividade que foi a mesma como a atividade em uma amostra de caldo total. O caldo foi ajustada para pH 5,8±0,2, diluído com 1,5±0,2 parte de água municipal e imediatamente floculado com 8% C311 (Kemira). O caldo floculado foi filtrado através um filtro de tambor a vácuo giratório pré-revestido com terra diatomácea (FW12, de World Minerais). O filtrado clarificado foi con centrado com um ultrafiltro equipado com uma membrana de ferimento espiral MWCO PES de 10K (KOCH Membrane Systems). O concentrado final continha 57,23 g/L e 19.1% (peso/peso) de substância sólida seca. A atividade de subtilisina em um concentrado de enzima permaneceu solúvel antes da granulação, como determinada pelo sobrenadante (14.000 rpm, 4 minutos) atividade da concentrado de enzima, que foi a mesma como o concentrado de enzima total.

Formulação granular

Uma composição granular foi preparada a partir do concentrado da ultrafiltração como segue.

Spray 1: 643 gramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. A este, 593 gramas de solução contendo uma protease ativa, 0,7% de talco (Nytal 400), 0,9% de antiespuma (Foamblast 882 de Emerald Performance Materiais), e 0,5% de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução

Temperatura de entrada

3,5 gpm (gramas por minuto), aumentando para 9,0 gpm durante 1,5 hora.

57°C, aumentada para 86°C após uma hora e 15 minutos

Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

Entre 45,2°C e 48,9°C

Entre 72,4 cfm (pés cúbico por minuto) e 83,6 cfm

Pressão de ar de atomização 2,10 kg/cm² (30psi) (libras por polegada quadrada), aumentando para 2,60 kg/cm² (37psi) durante 30 minutos.

769 gramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 769 gramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 2001 gramas de uma solução aquosa contendo 400 gramas de sulfato de sódio (27,7 % de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Entre 10 gpm (gramas por minuto) e 17,5 gpm Entre 73°C e 76°C Entre 44,6°C e 45,7°C Entre 79,7 cfm (pés cúbico por minuto) e 81,4 cfm

Pressão de ar de atomização 2,81 kg/cm²(40psi)

1178 gramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 1178 gramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1127 gramas de uma solução aquosa contendo 78 gramas (5,4% de composição de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), 78 gramas (5,4% de composição de grânulo) de dióxido de titânio (R902 de DuPont), 20 gramas (1.35% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400) e 20 gramas (1,35% de composição de grânulo) de Neodol (23-6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	5.2 gpm (gramas por minuto), aumentando para 12,2 gpm durante 30 minutos. Mantida a 12.2 gpm para o restante do experimento.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	70°C, aumentada para 76°C após 15 minutos Entre 51,0°Ce 52,5°C Entre 80,7 cfm (pés cúbico por minuto) e 84,2 cfm

Pressão de ar de atomização

Entre 2,81 kg/cm² (40psi) e 2,96 kg/cm²(42psi)

1356 gramas de produto foram colhidos.

Spray 4: 1356 gramas dos grânulos de enzima de spray 3 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 67,0 gramas de uma solução aquosa contendo 3 gramas (0,22% de compo sição de grânulo) de Neodol (23-6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

17,0 gpm durante terminado spray 4 76°C Entre 44,0°C e 46,5°C Entre 80,8 cfm (pés cúbico por minuto) e 81,7 cfm

1359 gramas de produto final foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analisados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 1,03 mg/almofada.

Exemplo 8

Preparação de Concentrado de Enzima com Precipitados e Formulação

Granular

Preparação de Concentrado de Enzima com Enzima Precipitada

Sulfato de sódio foi adicionado na concentração 12% (peso/volume) ao concentrado de enzima final após ultrafiltração no exemplo 7 para induzir a precipitação. O concentrado com sulfato de sódio foi misturado a 10°C durante 18 horas. A suspensão resultante foi usada para granulação.

Formulação Granular

Uma composição granular foi preparada a partir de um concentrado de enzima contendo enzima precipitada como segue.

Spray 1: 500 gramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. A este, 999 gramas de solução contendo uma protease ativa, 0,7% de talco (Nytal 400), 0,9% de antiespuma (Foamblast 882 de Emerald Performance Materiais), e 0,5% de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução

Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

4,5 gpm (gramas por minuto), aumentando para 10,6 gpm durante 30 minutos Entre 69,0°C e 74,0°C

Entre 44,5°C e 47,1 °C

Entre 79,8 cfm (pés cúbico por minuto) e

82.2 cfm

Pressão de arde atomização 2,17 kg/cm (31 psi) (libras por polegada quadrada), aumentando para 2,81 kg/cm (40psi) durante 60 minutos.

Taxa de spray de solução

705 gramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 705 gramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1847 gramas de uma solução aquosa contendo 369 gramas de sulfato de sódio (27,7 % de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima.

Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Entre 15,2 gpm (gramas por minuto)

18,2 gpm Entre 70°C e 78°C

Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

Entre 42,9°Ce 45,1°C

Entre 80,2 cfm (pés cúbico por minuto)

81,2 cfm

Pressão de ar de atomização 2,81 kg/cm (40psi) 1061 gramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 1061 gramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1000 gramas de uma solução aquosa contendo 72 gramas (5,4% de composição de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), 72 gramas (5,4% de composição de grânulo) de dióxido de titânio (R902 de DuPont), 18 gramas (1.35% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400) e 18 gramas (1,35% de composição de grânulo) de Neodol (23-6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue: Taxa de spray de solução

3.8 gpm (gramas por minuto), aumentando para 9,9 gpm durante 60 minutos. Mantida a

9.9 gpm para o restante do experimento. 72°C, aumentada para 84°C após 15 minutos Entre 51,4°Ce 52,9°C

Entre 80,4 cfm (pés cúbico por minuto) e 82,3 cfm

Entre 2,81 kg/cm² (40psi) e 2,95 kg/cm (42psi)

1226 gramas de produto foram colhidos.

Spray 4: 1226 gramas dos grânulos de enzima de spray 3 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 62,0 gramas de uma solução aquosa contendo 3 gramas (0,22% de composição de grânulo) de Neodol (23-6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue: Taxa de spray de solução Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

Pressão de ar de atomização

17,0 gpm durante entire spray 4

69°C

Entre 41,4°Ce 42,3°C

Entre 80,8 cfm (pés cúbico por minuto) e

80,5 cfm

1228 gramas de produto final foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analisados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 2,50 mg/almofada.

Exemplo 9

Preparação de Caldo Bacteriano Lisado com Precipitados de Enzima e Formulação Granular

Preparação de Lisado de Caldo Bacteriano com Enzima Precipitada

Bacillus subtilis que expressa subtilisina protease como descrito no exemplo 7 foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica.

Após fermentação, o caldo continha a maior parte da enzima subtilisina solúvel. A lisoenzima foi adicionada ao caldo em uma concentração de 1% e mantida a 37°C durante 3 horas. O lisado resultante, contendo tanto a enzima solúvel quanto insolúvel, continha 57 g/mL de atividade e 18,23% de sólidos secos.

Formulação Granular

Uma composição granular foi preparada a partir do lisado com enzima precipitada como segue.

Spray 1: 585 gramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. A este, 993 gramas de solução contendo uma protease ativa, 0,7% de talco (Nytal 400), 0,9% de antiespuma (Foamblast 882 de Emerald Performance Materiais), e 0,5% de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue: Taxa de spray de solução

4,5 gpm (gramas por minuto), aumentando para 12.5 gpm durante duas horas

Entre 63°C e 70°C

Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

Pressão de ar de atomização

Entre 43,0°C e 47,5°C

Entre 79,8 cfm (pés cúbico por minuto) e 81,1 cfm o

2,17 kg/cm (31psi) (libras por polegada o quadrada), aumentando para 2,67 kg/cm (38psi) durante 30 minutos.

785 gramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 785 gramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 2001 gramas de uma solução aquosa contendo 400 gramas de sulfato de sódio (27,7% de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução

Temperatura de entrada

Temperatura de saída

Fluxo de ar de fluidização

Pressão de ar de atomização

Entre 15,2 gpm (gramas por minuto) e

21,2 gpm

Entre 65°C e 78°C

Entre 44,1°Ce 45,6°C

Entre 78,5 cfm (pés cúbico por minuto) e

81,6 cfm

Entre 2,74 kg/cm²(39psi) e 2,81 kg/cm²(40psi)

1168 gramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 1168 gramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 1083 gramas de uma solução aquosa contendo 78 gramas (5,4% de composição de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), 78 gramas (5,4% de composição de grânulo) de dióxido de titânio (R902 de DuPont), 20 gramas (1,35% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400) e 20 gramas (1,35% de composição de grânulo) de Neodol (23-6,5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução

3,0 gpm (gramas por minuto), aumentando para 8,0 gpm durante 60 minutos. Mantida a 8,0 gpm para o restante do experimento. 73°C, aumentada para 78°C após 30 minutos Entre 52,0°C e 52,9°C

Entre 80,3 cfm (pés cúbico por minuto) e 83,7 cfm

Entre 2,81 kg/cm² (40psi) e 2,95 kg/cm² (42psi) 1347 gramas de produto foram colhidos.

Spray 4'. 1347 gramas dos grânulos de enzima de spray 3 foram

Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização

Pressão de ar de atomização carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 67,0 gramas de uma solução aquosa contendo 3 gramas (0,22% de compo30 sição de grânulo) de Neodol (23-6.5 de Shell Chemicals) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução

Temperatura de entrada

Temperatura de saída

12,6 gpm durante spray 4 total

63°C

Entre 41,1°Ce 44,1°C

Fluxo de ar de fluidização Entre 80,9 cfm (pés cúbico por minuto) e

81,5 cfm

1349 gramas de produto final foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analisados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 1,4 mg/almofada.

Exemplo 10

Preparação de Concentrado de Caldo Fúnqico com Enzima Solúvel e Formulação Granular

Preparação de Caldo de Fermentação Fúnqico Concentrado com Enzima Solúvel

Tríchoderma reseei que expressa glucoamilase foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo continha a maior parte de enzima glico-amilase solúvel. A atividade de glicoamilase foi avaliada como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 7.262.041. As células foram removidas por microfiltração como descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos n° 2007/0246406. O caldo clarificado foi concentrado 10x usando uma membrana de ferimento espiral MWCO PES de 10K. Um concentrado de enzima foi armazenado a 10°C até ficar pronto para uso. Em armazenagem, precipitados formaram-se. Os precipitados foram removidos por centrifugação (10,000 g, 20 minutos, 10°C). O sobrenadante claro resultante foi usado para a preparação de uma composição granular como descrito abaixo.

Formulação granular

Uma composição granular foi preparada a partir da enzima solúvel no caldo de fermentação fúngico como segue.

Spray 1: 466 gramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. A este, 512 gramas de solução contendo uma amilase ativa, 5% de amido de milho (Cargill Foods) e 1% de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	8,2 gpm (gramas por minuto), aumentando para 10,1 gpm durante 15 minutos. 10,1 gpm foram mantidos para o restante do experimento.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 71 °C e 77°C Entre 46,7°Ce 49,1°C Entre 75,3 cfm (pés cúbico por minuto) e 80,7 cfm

Pressão de ar de atomização 2,17 kg/cm² (31psi) (libras por polegada quao drada), aumentando para 2,88 kg/cm (41psi) durante 45 minutos.

615 gramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 615 gramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 2667 gramas de uma solução aquosa contendo 533 gramas de sulfato de sódio (40% de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	Entre 15,4 gpm (gramas por minuto) e 18,5 gpm
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 72°C e 78°C Entre 43,8°C e 45,7°C Entre 80,0 cfm (pés cúbico por minuto) e 81,8 cfm

Pressão de ar de atomização 2,67 kg/cm (38psi) 1113 gramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 1113 gramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 667 gramas de uma solução aquosa contendo 40 gramas (3% de composi78 ção de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol) e 80 gramas (6% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	4,6 gpm (gramas por minuto), aumentando para 11,0 gpm durante 60 minutos.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	68°C, aumentada para 82°C após 10 minutos Entre 44,2°C e 52,4°C Entre 82,3 cfm (pés cúbico por minuto) e 83,5 cfm

Pressão de ar de atomização 2,81 kg/cm²(40psi)

1221 gramas de produto final foram colhidos.

Exemplo 11

Preparação de Caldo Fúnqico com Precipitados de Enzima e Formulação

Granular

Trichoderma reseei que expressa glico-amilase como descrito no exemplo 10 foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo continha a maior parte de enzima glico-amilase solúvel. As células foram mortes sem lise como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 5.801.034. O precipitado obtido a partir da centrifugação de um concentrado de enzima de exemplo 10 foi adicionado ao caldo com as células mortas. O caldo resultante continha tanto enzima solúvel quanto insolúvel. O caldo contendo enzima exibiu 447 U/mL de atividade e 19,7% (peso/peso) de sólidos secos. A quantidade de precipitado presente foi determinada avaliando a atividade da amostra total, e o sobrenadante (14.000 rpm, 5 minutos). Os dados são sumariados na Tabela 1 abaixo. 90% da atividade estavam presentes no sobrenadante (como enzima solúvel) e 10% foram representados na forma precipitada.

TABELA 1

	Peso (g)	Atividade (GAU/ml)	Atividade total (x10³ GAU)
Caldo + Ppt	200	447,2	89,440
Sobrendante	181	445,9	80,708

Formulação Granular

Uma composição granular foi preparada a partir do caldo fúngico contendo enzima precipitada como segue.

Spray 1: 472 gramas de cristal de sulfato de sódio (Saltee), com uma faixa de tamanho de diâmetro de partícula de 150 pm a 350 pm, foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. A este, 494 gramas de solução contendo uma amilase ativa, 5% de amido de milho (Cargill Foods) e 1% de poli vinil álcool (5/88 de Erkol), foram revestidos por spray nos cristais de sulfato de sódio. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	8,2 gpm (gramas por minuto), aumentando para 10,8 gpm durante 10 minutos. 10,8 gpm foram mantidos para o restante do experimento.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 68°Ce 71 °C Entre 44,7°C e 46,5°C Entre 78,5 cfm (pés cúbico por minuto) e 79,4 cfm

Pressão de ar de atomização 2,32 kg/cm (33psi) (libras por polegada quadrada), aumentando para 2,81 kg/cm²(40psi) durante 20 minutos.

612 gramas de produto foram colhidos.

Spray 2: 612 gramas dos grânulos de enzima de spray 1 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 2667 gramas de uma solução aquosa contendo 533 gramas de sulfato de sódio (40% de composição de grânulo) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	Entre 17,2 gpm (gramas por minuto) e 23,4 gpm
Temperatura de Entrada Temperatura de Saída Fluxo de ar de fluidização	Entre 74°C e 82°C Entre 44,6°C e 45,5°C Entre 81,2 cfm (pés cúbico por minuto) e 81,9 cfm

ο

Pressão de ar de atomização 2,67 kg/cm (38psi) 1081 gramas de produto foram colhidos.

Spray 3: 1081 gramas dos grânulos de enzima de spray 2 foram carregados em um revestidor de leito fluidizado Vector FL-1 e fluidizados. 667 gramas de uma solução aquosa contendo 40 gramas (3% de composição de grânulo) de poli vinil álcool (5/88 de Erkol) e 80 gramas (6% de composição de grânulo) de talco (Nytal 400) foram em seguida revestidos por spray nos grânulos de enzima. Os parâmetros de revestimento por spray foram como segue:

Taxa de spray de solução	7,2 gpm (gramas por minuto), aumentando para 10,8 gpm durante 60 minutos.
Temperatura de entrada Temperatura de saída Fluxo de ar de fluidização	78°C, aumentada para 81 °C durante 60 minutos Entre 52,7°C e 53,1 °C Entre 83,2 cfm (pés cúbico por minuto) e 83,6 cfm
Pressão de ar de atomização	2,88 kg/cm²(41psi)

1190 gramas de produto final foram colhidos.

Usando o produto final atrito Heubach, os grânulos foram analisados quanto à poeira. O nível de poeira dos grânulos foi de 7,9 mg/almofada.

Exemplo 12

Estabilidade Enzimática no Detergente para Grânulos Preparados a Partir de Concentrado Contendo Componentes Celulares e Enzima Insolúvel

A estabilidade de grânulos de enzima preparados como descrito no exemplo 4 foi avaliada em várias bases de detergente: Calgonita 5-1, WFK com Citrato, WFK com fosfato, e Somat (Henkel). As bases de deter gente WFK são disponíveis de wfk Testgewebe GmbH (www.testgewebe.de). Os grânulos de enzima em detergente (2% em peso/peso) foram mantidos a 22°C em recipientes abertos. A atividade de enzima residual foi avaliada após armazenagem no tempo de 0, 5 semanas, 2 meses e 4 meses. Os dados são sumariados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Estabilidade de Grânulo de Enzima em Detergente

Base de Detergente	Dia 0	5 semanas	2 meses	4 meses
Calgonita 5-1	100%	98%	93%	96%
WFK com Citrato	100%	100%	94%	96%
WFK com Fosfato	100%	100%	96%	100%
Somat	100%	89%	89%	98%

Exemplo 13

Desempenho de Aplicação de Grânulos Preparados a Partir de Concentrado Contendo Componentes Celulares e Enzima insolúvel

O desempenho de lavagem de grânulos de enzima preparados como descrito no exemplo 4 foi avaliado antes e após a armazenagem em IEC A* contendo base de detergente alvejante. As amostras foram armazenadas em xícaras abertas durante uma semana a 37°C/70% de umidade relativa (RH). Testes de aplicação com grânulos frescos e detergente fresco e com grânulos armazenados em detergente durante uma semana foram realizados usando várias linhagens: CS-26 (amido de milho em algodão), CS-27 (amido de batata em algodão), CS-28 (amido de arroz em algodão), CS-29 (amido de tapioca em algodão), e EMPA-161 (amido em algodão). Teste de Lavagem

O teste de lavagem foi realizado em uma máguina de lavagem Miele Novotronic W822: programa NormalTAIgodão, temperatura 40°C, dureza da água 8,5 GH. Detergente: IEC A* com alvejante: dosagem 8 g/L (=136 g/lavagem), incluindo 0,15 g de Purafect 4000 E (disponível de Genencor Division of Danisco US Inc.) e 0,139 g de grânulos de exemplo 4. Avaliações de Desempenho

As avaliações foram feitas com um colorímetro Minolta CR300:

CIELAB L*ab Scale, D65 Standard llluminate, sem filtro de UV, base branca. A remoção de sujeira (SR) foi calculada usando a seguinte fórmula:

AEapós a lavagem - antes da lavagem __X 100 = %SR

AEamostra de tecido não manchada - antes da lavagem

Onde:

AE=sqrt((AL*)²+(Aa)²+(Ab)²)

Figura 1 mostra que o desempenho do teste dos grânulos de exemplo 4 permaneceu inalterado na armazenagem.

Exemplo 14

Estabilidade Enzimática Durante Armazenagem para Grânulos Preparados a Partir de Concentrado Contendo Componentes Celulares e Enzima insolúvel

Os grânulos de enzima preparados como descrito nos exemplos 7-9 foram avaliados quanto à estabilidade de armazenagem. As condições usadas foram de 37°C em câmara de umidade relativa a 70% com amostras colocadas em recipientes abertos. A atividade residual foi avaliada e calculada com base na atividade inicial. Os dados são sumariados na Tabela 3 abaixo.

TABELA 3

Tempo (dias)
Amostra	0	3	5	7	14
Exemplo #7 (grânulo de enzima insolúvel)	100%	96%	97%	100%	91%
Exemplo #8 (grânulo de enzima precipitada)	100%	108%	109%	108%	109%
Exemplo #9 (grânulo de lisado de enzima precipitada)	100%	96%	95%	99%	96%

Exemplo 15

Comparação de Propriedades de Procedimentos de Recuperação Descritos nos Exemplos 1 a 5

A atividade e pureza de α-amilase recuperada como descrito nos exemplos 1 a 5 acima é representada na tabela 4. A pureza da enzima foi calculada dividindo a atividade de enzima pela quantidade de sólidos se cos.

Tabela 4

Propriedades de Concentrado de Lisado de Enzima

Exemplo	Pureza de Enzima por Sólidos secos	Produção (%)	Resíduo relativo	Purificação com relação ao lisado inicial	Produção com relação ao Exemplo 1	Produção com relação ao Exemplo 1
1	4,3	5%	0	0,6	1,0	1,0
2	22,1	84%	3% (glicose)	2,1	16,8	5,1
4	9,3	86%	0	1,4	17,1	2,2
5	17,2	95%	0	1,7	19,0	4,0

Exemplo 16

Estabilidade Enzimática Durante a Armazenagem em Base Detergente com Alveiante para Grânulos Preparados a Partir do Concentrado Contendo Componente Celular e Enzima Insolúvel

Grânulos de enzima preparados como descrito nos exemplos 1, 2, 4 e 6 foram avaliados quanto à estabilidade de armazenagem na base de detergente IEC A* com pó alvejante. O detergente em pó IEC A* foi adquirido de WFK e não contém agentes de alvejamento. O seguinte sistema de alvejamento foi adicionado: 3% de TEAD, e 20% de perborato.2H2O. As condições de armazenagem usadas foram 37°C em câmara de umidade relativa a 70% com as amostras colocadas em recipientes de polipropileno abertos. A atividade residual foi avaliada e calculada com base na atividade inicial. Os dados são mostrados na figura 2.

Exemplo 17 Preparação de Solução de Enzima Clarificada a Partir do Caldo de Fermentação Contendo Cristais de Enzima

Todas as operações foram realizadas em temperatura ambiente. Material de Partida

Uma linhagem de Tríchoderma reesei planejada para expressar uma protease aspártica foi fermentada sob condições padrão conhecidas na técnica. Por exemplo, veja a Patente dos Estados Unidos n° 7.429.476. O pH do caldo de fermentação no tempo da colheitas foi de 4,62 e a enzima tinha formado cristais grandes com 98% da atividade total no spindown. Filtração 1 - Recuperação de Cristais de Protease

521 g de caldo de cultura foram misturados em um béquer com 63 g de auxiliar de filtração de terra diatomácea, Celatom FW-6. 302 g da mistura foram filtrados através de um filtro de membrana de náilon de 0,45 pm (Nalgene 154-0045). 155 g de filtrado e 146 g de massa filtrada e foram recuperados. 98% da atividade de enzima ficaram retidos na massa filtrada. O filtrado foi descartado.

Solubilização de Cristal

131 g da massa filtrada da etapa anterior foram transferidos em um béquer e misturados com 87 g de ácido sulfúrico a 50 mM. Após repousar durante 45 minutos em temperatura ambiente, a mistura teve um pH de

3,2 e um microscópio confirmou que todos os cristais de protease dissolveram-se.

Filtração 2 - Clarificação de Solução de Protease

184g da mistura de solubilização de cristal da etapa anterior foram filtrados no mesmo tipo de filtro usado na filtração 1. O filtrado foi removido dos sólidos sedimentados por perseguição com 50 g de água quando a superfície da massa parecer seca. 154 g de filtrados foram coletados e 80 g da massa filtrada foram descartados. O filtrado claro continha 88% da atividade de enzima de partida em um título que foi de 16% maior do que do caldo de partida.

Exemplo 18

Preparações de Formulação de Enzima Clarificada

Material de Partida: Caldo de Fermentação

Bacillus licheniformis que recombinantemente expressa enzima α-amilase foi fermentado usando técnicas bem conhecidas na técnica. Após fermentação, o caldo foi lisado usando 0,01% (peso/peso) de lisoenzima durante duas horas, seguido por tratamento por aquecimento a 60°C durante duas horas.

18.1 Preparação de Caldo Contendo Enzima Solúvel (Recuperação Convencional) g de material de partida foram centrifugados a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar a fase sólida da fase líquida. O sobrenadante continha 88% da atividade de enzima. A pureza por sólidos secos foi de 6%. A pureza por proteína total foi de 14%.

18.2 Preparação de Caldo Contendo Enzima insolúvel

Cristalização de Enzima a-amilase em Lisado g do material de partida foram usados. O pH do lisado foi ajustado para 5 usando 20% de ácido acético. O pH adjustado foi incubado em um agitador: 50°C e agitação de 80 rpm.

Centrifuqação #1 - Recuperação de Cristal de a-Amilase e Resíduos Celulares

Após 44 horas de incubação, 5 g de lisado foram centrifugados a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar a fase sólida da fase líquida. Solubilização de Cristais de a-Amilase

Os sólidos recuperados foram ressuspensos em água de torneira para alcançar o peso de lisado original de 5 g. 3 g de propileno glicol foram adicionados à suspensão. O pH foi ajustado para 6,5 usando 5% de NaOH e misturado por inversão em temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi em seguida incubada a 40°C durante duas horas. Centrifuqação #2 - Clarificação de Soluções de Amilase

A mistura de solubilização de cristal foi centrifugada a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar a fase sólida da fase líquida. O centrado resultante (sobrenadante líquido) foi também clarificado usando um filtro de seringa de 0,45 pm. A solução de amilase clara continha 85% da atividade encontrada no lisado inicial durante a cristalização. A pureza por sólidos secos foi de 42%. A pureza por proteína total foi de 34%.

18.3 Preparação de Caldo Contendo Enzima insolúvel Usando Floculação Floculação

10g/L de polímero catiônico C581 foram adicionados a 5 g de lisado contendo cristais de α-amilase dissolvidos de exemplo 18.2 e em seguida misturados suavemente por inversões manuais 10 vezes.

Centrifuqação #2 - Clarificação de Solução de Amilase

A mistura de solubilização de cristal floculado foi centrifugada a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar a fase sólida da fase líquida. O centrado claro contém 85% da atividade encontrada no lisado inicial usada para cristalização. A pureza por proteína total foi de 39%.

As purezas de soluções de α-amilase recuperadas como descrito nos exemplos 18.1, 18.2, e 18.3 são representadas na tabela 5. A pureza de enzima foi calculada dividindo a atividade de enzima pela quantidade de sólidos secos ou dividindo a concentração de proteína total.

Tabela 5: Propriedades de Solução de Enzima Clarificada

Exemplo	Pureza de en- Purificação zima por sólidos com relação secos ao exemplo 18.1	Pureza com Purificação enzima por com relação proteína ao exemplo total 18.1
18.1	6% 1.0	14% 1.0
18.2	42% 7.4	34% 2.4
18.3		39% 2.7

‘Excluindo a contribuição por propileno glicol

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em poucos detalhes por meio de ilustração e exemplos para propósitos de clareza de entendimento, ela será evidente para aqueles versados na técnica que certas mudanças e modificações podem ser praticadas sem afastar-se do espírito e escopo da invenção. Portanto, a descrição não deve ser construída como limitante do escopo da invenção.

Todas as publicações, patentes, e pedidos de patentes citados aqui são aqui incorporados aqui por referência em suas totalidades para todos os propósitos e na mesma extensão como se cada publicação, patente, ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado a ser desse modo incorporado por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de produção de uma formulação granular contendo enzima, caracterizado pelo fato de que compreende produzir um grânulo contendo enzima compreendendo uma composição que contém enzima insolúvel e/ou resíduos celulares, sendo que a referida composição que contém enzima insolúvel e/ou resíduos celulares é produzida por um método compreendendo a recuperação de enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano compreendendo resíduos celulares sem remover os resíduos celulares, desse modo produzindo uma composição que contém enzima insolúvel recuperada e/ou resíduos celulares, em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel no caldo microbiano.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um grânulo contendo enzima é produzido por um processo de granulação selecionado de processamento de leito fluidizado de spray de topo; processo de revestidor Wurster de spray de base; granulação por cisalhamento elevado; extrusão; e revestimento de panela.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende revestir uma camada contendo enzima compreendendo a referida enzima insolúvel e/ou resíduos celulares em um núcleo in um processador de leito fluidizado de spray de topo, em que o referido método opcionalmente compreende revestimento de uma camada de sal entre o referido núcleo e a referida camada contendo enzima.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreendendo ainda revestir uma camada que compreende um sal de barreira sobre a referida camada contendo enzima.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda revestir uma camada de revestimento externo que compreende um polímero e/ou pigmento sobre a referida camada de sal de barreira.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido grânulo contendo enzima é produzido por revestimento

Petição 870180127497, de 06/09/2018, pág. 4/10

2 de uma camada de sal de barreira e/ou uma ou mais camadas de revestimento sobre um núcleo contendo enzima que compreende a referida enzima insolúvel e/ou resíduos celulares.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido núcleo contendo enzima é produzido por processamento de leito fluidizado de spray de topo.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido núcleo contendo enzima é produzido por granulação por cisalhamento elevado.
9. Grânulo contendo enzima, caracterizado pelo fato de que compreende:

um núcleo;

opcionalmente, uma camada de sal revestindo o núcleo; e uma camada contendo enzima revestindo o núcleo ou camada de sal, em que a referida camada contendo enzima compreende uma composição que contém enzima insolúvel e/ou resíduos celulares.
10. Grânulo contendo enzima de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida composição que contém enzima insolúvel e/ou resíduos celulares é produzida por um método compreendendo a recuperação de enzima insolúvel a partir de um caldo microbiano compreendendo resíduos celulares sem remover os resíduos celulares, desse modo produzindo uma composição que contém enzima insolúvel recuperada e/ou resíduos celulares, em que pelo menos um pouco da enzima é insolúvel no caldo microbiano.
11. Grânulo contendo enzima de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma camada de sal de barreira revestindo a referida camada contendo enzima.
12. Grânulo contendo enzima de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma camada de revestimento externo revestindo a referida camada de sal de barreira, em que a referida camada de revestimento externo compreende um polímero e/ou pigmento.