CN102056936A - 从发酵液中回收不溶解酶和不溶解酶的制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了不去除微生物细胞或细胞碎片从微生物发酵液中回收和配制不溶解酶的方法。还提供了含有木溶解酶的颗粒制剂和液体制剂。

Description

从发酵液中回收不溶解酶和不溶解酶的制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年6月9日提交的美国临时申请号No.61/060,087的权益，所述申请通过参考以其全部并入本文。
技术领域
本发明涉及在存在微生物细胞或细胞碎片时从微生物发酵液中回收一种或多种目的酶的方法，以及从含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物制备的固体和液体制剂。
背景技术
从微生物发酵液中常规回收液体或固体产物形式的工业用酶通常包括几个加工步骤。最常规的回收方法包括顺序发生的四个相似步骤：去除微生物发酵液中非产物的不溶解成分；分离产物；纯化；和精炼(见例如Enzymes in Industry：Production and Applications(2007)WolfgangAehle，编，第三版，Wiley-VCH，页49；Bioseparations：Science andEngineering(2003)R.G.Harrison，页Todd，S.R.Rudge，D.P.Petrides，Oxford University Press，页32.)。例如，回收和配制细胞内产生的酶通常包括下列加工步骤：(1)细胞裂解；(2)预处理；(3)细胞分离；(4)浓缩；和(5)配制-(a)为了液体稳定性进行化学添加，然后是精细过滤；或(b)为了固体稳定性进行化学添加，然后是干燥。
细胞裂解通过破坏细胞壁从细胞中释放目的酶。细胞裂解可以通过下列方法进行：使细胞接触降解细胞壁的酶如溶菌酶，诱导发酵环境改变如改变pH、温度、溶解的氧浓度、葡萄糖浓度、盐浓度或其它添加剂的浓度而造成自发裂解，机械破坏细胞壁如匀浆化或这些方法的组合。对于在细胞外表达的酶(分泌进入培养基)，细胞裂解是可选的。(见例如Isolationand Purification of Proteins(2003)R.Hatti-Kaul和B.Mattiasson，编，Marcell Dekker，Inc.，页1-27.)。
细胞裂解后进行细胞分离步骤以产生含有目的酶的澄清溶液。通常，细胞分离包括离心和/或过滤从而去除在发酵过程中和/或发酵后产生的细胞碎片和任何不溶解的物质，和/或由于细胞裂解产生的细胞碎片和任何不溶解物质。适当的离心方法包括盘栈(disk stack)离心或沉降式离心(decanter centrifugation)。适当的过滤方法包括旋转真空过滤、通过板框式压滤机过滤或通过膜微滤器过滤。
使用离心进行细胞分离通常是在澄清度和物料通过量之间的折中方案。常见的做法是使用高通过量离心，然后经过高通过量过滤去除痕量悬浮固体，其量足以干扰随后加工步骤。如今实践中的大多数过滤方法需要使用加工助剂如硅藻土等和碳(PcT申请号WO01/87468)从而获得分离效率。硅藻土改善过滤处理的通过量和过滤澄清度。
从含有目的酶液体中物理性分离细胞或细胞碎片之前，通常进行预处理步骤。由于碎片的颗粒尺寸小和裂解的发酵液的粘稠性质，没有这样的步骤而分离细胞碎片通常是不经济的和耗时的。通常，预处理包括将絮凝剂引入裂解的或未裂解的发酵液中。聚合电解质作为增加从发酵液中去除细菌细胞的细胞絮凝方法受到更多的关注。Baran(1988)Colloids Surf.31：259-264；Bautista等人(1986)Biotechnol.Lett.8：315-318；Chenand Berg(1993)Chem.Eng.Sci.48：1775-1784；Cumming等人(1996)Biotechnol.Tech.4：55-60；Hustedt和Theelen(1989)DeChemaBiotechnology Conferences-VCH Veragsgesselschaft 3：1071-1075；Ramsden等人(1998)Biotechnol.Tech.12：599-603；Shan等人(1996)J.Biotechnol.49：173-178。
絮凝作用促进从含有目的酶的液体部分中去除细胞碎片。一些常用的絮凝剂包括聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵-丙烯酰胺共聚物(methacryloyloxyethyl trimethyl ammoniumchloride-acrylamide copolymer)。细胞碎片的絮凝是基于电荷的现象，需要低离子强度得以有效进行。因此，通常需要用水稀释发酵液而将细胞碎片絮凝。
取决于所需最终产物浓度和纯度，含有来自细胞分离步骤的目的酶的澄清液体可以达到配制需要而制备产品。但是，配制前通常需要进一步的加工从而增加酶的浓度。浓缩包括脱水，其通常通过超滤或对于热稳定的酶而言通过蒸发而实现。其它的浓缩方法包括沉淀、结晶和色谱。(见例如PCT申请号WO 91/09941)。由于涉及的成本，这些不是工业酶回收的常见做法。
如上面概括的，常规回收和配制酶包括多个步骤。每一个加入制造过程的步骤都降低总处理产率并以能源、时间和劳动力的形式增加了成本。
表达技术的进步已经能够获得相对高的发酵液中酶浓度(例如10-100g/l)的能力。在一些情况下，表达水平超过了目的酶的溶解力极限，并且在发酵的末尾，酶以沉淀或结晶的形式存在。当使用上述传统回收方法从发酵液中回收酶时，酶沉淀将在细胞分离步骤中与不溶解的细胞碎片和其它不溶解物质一起被同时去除。因此，回收的产率低。对该问题提出的一个解决方法包括在回收步骤后立即向过饱和酶溶液中加入多元醇以防止其沉淀(欧洲专利号EP1417301)。但是，这样的方法需要额外的原料消耗并向回收方法加入了额外步骤。不添加多元醇而回收不溶解酶的方法将是有利的。
含酶颗粒在几种工业中被掺入至产品中，上述工业包括去污剂、纺织加工、食品(例如烘烤)、动物饲料和燃料乙醇工业。这样的颗粒可以通过许多技术包括流化床喷涂、高剪切造粒法、挤压、滚圆、颗粒化(prilling)和喷雾干燥制备。
传统地，这样的含酶颗粒含有掺入颗粒前是可溶形式的酶，并且如果表达在微生物宿主中，是至少部分纯化的，从而去除微生物细胞和/或细胞裂解产生的细胞碎片。
在不溶解酶存在于微生物发酵液中的情况下，在回收前需要进行溶解。在一些情况下，这可以通过改变pH和/或温度或通过加入简单的盐而容易地实现。在其他情况下，加入多元醇或糖是必须的。溶解后，可以进行细胞分离。获得的澄清流(clarified stream)通常太稀以致不能用于配制。可以使用浓缩的步骤，通常用超滤。加入的糖将自由通过超滤膜并变成废物流(waste stream)。所得的浓缩物通常可以被配制进液体产品中。但是其并不总是适于颗粒化。因此，在颗粒化前去除糖是必须的。这可以通过渗滤实现，因此产生了更多的废物。由于加工步骤和废物处理，该方法的影响是显著增加了液体和固体产物的成本。本发明提供了另一种从这一发酵液中经济地产生产品的方式。
如今需要颗粒酶制剂，其中酶是不溶解的形式，并且其中不去除细胞和/或不溶解的细胞成分。
发明简述
本发明提供了用于回收和配制不溶解酶的方法以及含有如本文所述回收和配制的不溶解酶的组合物。
在一个方面，提供了一种用于从含有微生物细胞和/或来自微生物细胞的细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶的方法，其包括不去除微生物细胞和/或细胞碎片而从微生物发酵液中回收不溶解酶，因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。在一个具体实施方案中，提供了用于从微生物发酵液中回收不溶解酶的方法，其包括：(a)提供了含有微生物细胞和酶的微生物发酵液，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的；和(b)不去除微生物细胞和/或细胞碎片而回收微生物发酵液中的不溶解酶，因而制备了含有回收的不溶解酶的组合物，其中组合物含有微生物细胞和/或细胞碎片。在一些具体实施方案中，不溶解酶是有酶活性的(即酶在固体状态中是有催化活性的，或者具有催化潜能，并且当溶解在合适的溶剂中和在适当的发生催化的条件下变得有催化活性)。
在一些具体实施方案中，微生物发酵液通过选自下列的方法产生：将酶与含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液混合，其中酶不是微生物细胞产生的且其中酶在微生物发酵液中是不溶解的，或其中酶在微生物发酵液中是可溶的，并且方法另外包括通过加入沉淀剂使得至少一些酶不溶解；向含有用微生物细胞表达的可溶的酶的微生物发酵液中加入沉淀剂，因此引起至少一些酶变得不溶解；和在发酵培养基中的微生物细胞中表达酶，其中至少一些酶在发酵培养基中是不溶解的。
在一些具体实施方案中，回收包括至少一种选自下列的回收操作：发酵液预处理(conditioning)、细胞裂解、匀浆化、渗滤或固体-液体分离。在一些具体实施方案中，回收包括两种或两种以上选自下列的回收操作：发酵液预处理、细胞裂解、匀浆化、渗滤或固体-液体分离，以任何顺序进行。
在一些具体实施方案中，回收不溶解酶包括去除至少部分微生物发酵液的液相。在一些具体实施方案中，去除至少部分微生物发酵液的液相包括浓缩微生物发酵液固体。在一些具体实施方案中，浓缩微生物发酵液包括选自超滤、微量过滤、反向渗透或纳米过滤的膜过滤方法。在一些具体实施方案中，去除至少部分微生物发酵液的液相，例如浓缩微生物发酵液包括选自滚筒真空过滤、板框过滤、带过滤、离心、旋风分离、滗析或蒸发的方法。
在一些具体实施方案中，回收不溶解酶包括渗滤。
在一些具体实施方案中，微生物发酵液通过在适于表达酶的条件下在生长培养基中表达酶的微生物的生长而产生，其中酶在所述生长条件下是不溶解的。在其他的具体实施方案中，微生物发酵液通过在适于表达酶的条件下在生长培养基中表达酶的微生物的生长而产生，其中酶在所述生长条件下是可溶的，并且其中在回收酶之前加入沉淀剂从而使得至少一些酶在微生物发酵液中不溶解。在一些具体实施方案中，沉淀剂选自调整pH、调整温度、加入盐、加入酸、加入碱、加入至少一种其他蛋白质、加入缓冲液、加入聚合电解质或其组合。在一个具体实施方案中，不溶解酶通过向含有可溶的酶的微生物发酵液中加入沉淀剂，因而使得至少一些酶在微生物发酵液中不溶解而制备，其中沉淀剂选自调整pH、调整温度、加入盐、加入酸、加入碱、加入至少一种其他蛋白质、加入缓冲液、加入聚合电解质或其组合。
在一些具体实施方案中，组合物含有回收的含有完整微生物细胞的不溶解酶。在一个具体实施方案中，完整微生物细胞是活的微生物细胞。在另一个具体实施方案中，完整的微生物细胞是死的微生物细胞。在其他的具体实施方案中，组合物含有回收的含有裂解的微生物细胞的不溶解酶。
在一些具体实施方案中，其中表达的酶在微生物发酵液中是不溶解的，所述方法包括在回收不溶解酶之前或之后破坏微生物细胞膜，从而产生微生物细胞裂解液。在其他的具体实施方案中，其中表达的酶在微生物发酵液中是可溶的，所述方法包括在回收被沉淀的酶之前，在加入沉淀剂之前或之后破坏微生物的细胞膜。
在一些具体实施方案中，含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液含有微生物细胞裂解液，其通过破坏完整微生物细胞的微生物细胞膜产生。
在一些具体实施方案中，破坏微生物细胞膜包括用能够引起微生物细胞裂解的酶与细胞接触。在一些具体实施方案中，能够引起微生物细胞裂解的酶是溶菌酶。在其他的具体实施方案中，破坏微生物细胞膜包括机械细胞膜破坏方法，如匀浆化。在一些具体实施方案中，破坏微生物细胞膜包括机械剪切方法，例如选自匀浆化、高剪切混合、压力挤压或高剪切泵送。在一些具体实施方案中，所述方法另外包括将微生物细胞裂解液匀浆，从而在回收不溶解酶之前或之后产生匀浆的微生物细胞裂解液。
在一些具体实施方案中，方法另外包括在回收不溶解酶之前或之后将微生物细胞裂解液渗滤。在一些具体实施方案中，方法另外包括在回收不溶解酶之前或之后将微生物细胞裂解液匀浆和渗滤。
在一些具体实施方案中，微生物细胞是细菌细胞。在一些具体实施方案中，细菌细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞。在一些具体实施方案中，所述芽孢杆菌属细胞是枯草杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞。
在一些具体实施方案中，微生物细胞是真菌细胞。在一些具体实施方案中，真菌细胞是木霉属(Trichoderma)细胞。在一些具体实施方案中，木霉属细胞是瑞氏木霉(Trichoderma reesei)细胞。
在一些具体实施方案中，至少约任意10、20、30、40、50、60、70、80或90％的酶在微生物发酵液中是不溶解的。
在回收方法的一些具体实施方案中，不溶解酶的纯度增加至少约10％。
在另一个方面，本发明提供了根据如本文所述从微生物发酵液中回收不溶解酶的方法产生的组合物，其中所述组合物含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。在一个具体实施方案中，组合物另外含有至少一种制剂成分。
在另一个方面，本发明提供了用于产生澄清液体酶溶液的方法，其包括：(a)提供含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其根据例如如本文所述的从微生物发酵液中回收不溶解酶的方法产生；(b)通过加入一种或多种溶解酶的物质而溶解至少部分不溶解酶，和/或通过改变物理条件以使酶溶解至少一部分，因而制备了可溶的酶溶液；和(c)从步骤(b)中制备的溶液中去除固体，因而制备了澄清的液体酶溶液。
在另一个方面，本发明提供了制备含酶颗粒的方法，其包括产生含有组合物的含酶颗粒，所述组合物含有不溶解酶例如回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。在一个具体实施方案中，方法包括(a)提供含有不溶解酶例如回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，和(b)产生含有不溶解酶的含酶颗粒。在一些具体实施方案中，含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物是根据本文所述的从微生物发酵液中回收不溶解酶的任何方法制备的。在一个具体实施方案中，含有酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物是通过以下方法制备的，所述方法包括不去除微生物细胞和/或细胞碎片从含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶，因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。在一些具体实施方案中，酶在颗粒中有酶活性(即酶在固体状态中有催化活性，或具有催化潜力，当溶于适当的溶剂中和在适当的发生催化的条件下变得有催化活性)。
在一个具体实施方案中，含酶颗粒是在顶喷流化床处理器中制备的。在一些具体实施方案中，含酶颗粒是通过选自顶喷流化床加工、底喷沃斯特涂布机加工(bottom spray Wurster coater processing)、高剪切颗粒化、挤压或锅包衣的颗粒化方法制备的。
在一个具体实施方案中，方法包括将含有组合物的含酶层在所述顶喷流化床处理器中涂布在核心上，所述组合物含有不溶解酶例如回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。所述方法任选地包括在核心和含酶层之间涂布盐层。在一个具体实施方案中，方法另外包括在所述含酶层上涂布含有屏障盐(barrier salt)的层。在一个具体实施方案中，方法另外包括在所述屏障盐层上涂布含有聚合物和/或色素的外涂层。
在一个具体实施方案中，方法包括在含有不溶解酶例如回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的含酶核心上涂布屏障盐层和/或一个或多个涂层。在一个具体所述方案中，含酶核心是通过顶喷流化床处理器制备的。在一个具体实施方案中，含酶核心是通过高剪切颗粒化制备的。
在另一个方面，本发明提供了含有核心，任选地涂布在核心上的盐层和涂布在核心上的含酶层的含酶颗粒，其中将所述含酶层涂布在核心或盐层上，其中含酶层含有根据本文所述任何方法制备的含有不溶解酶例如回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物。在一些具体实施方案中，含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物是根据任何本文所述的用于从微生物发酵液中回收不溶解酶的方法制备的。在一个具体实施方案中，含有酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物是通过以下方法制备的：所述方法不去除微生物细胞和/或细胞碎片，从含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶，因而制备了含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。在一些具体实施方案中，酶在颗粒中有酶活性(即酶在固体状态中有催化活性，或具有催化潜力以及当溶于适当溶剂中和在适当的发生催化的条件下变得有催化活性)。
在一个具体实施方案中，颗粒另计含有涂布在所述含酶层上的屏障盐层。在一个具体实施方案中，颗粒另外含有涂布在所述屏障盐层上的外涂层，其中所述外涂层含有聚合物和/或色素。
在另一个方面，本发明提供了含有含酶核心和屏障盐层和/或一个或多个包围核心的涂层的含酶颗粒，其中核心包含含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物。在一些具体实施方案中，含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物是根据任何本文所述的从微生物发酵液中回收不溶解酶的方法制备的。在一个具体实施方案中，含有酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物是通过以下方法制备的：所述方法不去除微生物细胞和/或细胞碎片，从含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶，因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。在一些具体实施方案中，酶在颗粒中有酶活性(即酶在固体状态中有催化活性，或具有催化潜力以及当溶于适当的溶剂时和在适当的发生催化的条件下变得有催化活性)。
在一个具体实施方案中，含酶核心是通过顶喷流化床加工制备的。在一个具体实施方案中，含酶核心是通过高剪切颗粒化制备的。
在另一个方面，本发明提供了含有任何本文所述的含酶颗粒的组合物。在一个具体实施方案中，组合物是去污剂组合物。在另一个具体实施方案中，组合物是纺织品加工组合物。在另一个具体实施方案中，组合物是动物饲料组合物。在另一个具体实施方案中，组合物是食品组合物。
在另一个方面，本发明提供了含有组合物的含酶液体制剂，所述组合物含有不溶解酶例如回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。在一些具体实施方案中，含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物是根据任何本文所述的回收不溶解酶的方法制备的。在一个具体实施方案中，含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物是通过以下方法制备的：所述方法包括不去除微生物细胞和/或细胞碎片从微生物发酵液中回收不溶解酶，因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。在一些具体实施方案中，酶在液体制剂中有酶活性(即酶有催化活性或具有催化潜力以及当溶于适当的溶剂时和在适当的发生催化的条件下变得有催化活性)。在一些具体实施方案中，含酶液体制剂另外含有一种或多种选自多元醇、盐、防腐剂、表面活性剂或抗氧化剂的制剂成分。在一些具体实施方案中，液体制剂另外含有多元醇。在一些具体实施方案中，液体制剂另外含有盐。在一些具体实施方案中，液体制剂另外含有防腐剂。在一些具体实施方案中，液体制剂另外含有表面活性剂。
在另一个方面，本发明提供了用于制备含酶液体制剂的方法，其包括在液体中悬浮根据任何本文所述方法制备的、含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物。
在另一个方面，本发明提供了用于制备含酶液体制剂的方法，其包括(a)提供根据任何本文所述的方法制备的含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物；(b)和溶解组合物中的不溶解酶。在一个具体实施方案中，方法另外包括在步骤(b)之后和在步骤(c)之前去除微生物细胞和/或细胞碎片，因而制备了澄清的液体制剂。
附图简述
图1显示了在储存于去污剂后如实施例4中所述制备的含酶颗粒的洗涤应用活性性能(如实施例13中所述)。
图2显示了在储存于去污剂后在实施例1、2、4和6中制备的颗粒的酶稳定性。
发明详述
本发明提供了不从发酵液中去除微生物细胞或裂解的不溶解细胞碎片而从微生物发酵液中回收和配制不溶解酶的方法。本发明还提供了例如根据本文所述的方法回收的、含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的颗粒制剂和液体制剂。
本发明的实践将应用(除非另外指明)常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的技术，所述技术在本领域的技术之内。这样的技术在文献例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编，1984；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，eds.，1994)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人，eds.，1994)；和Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(Kriegler，1990)中有完整的解释。
除非在本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的技术人员通常理解的相同意思。Singleton，等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第二版，John Wileyand Sons，New York(1994)，和Hale & Markham，The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本发明使用的许多术语的综合字典。与本文所述的那些相似或等同的任何方法和物质可以用于本发明的实践或测试。
本文提供的数值范围包括限定范围的数值。
除非另外指明，分别地，核酸从左至右以5’至3’的方向书写，氨基酸序列从左至右以氨基至羧基的方向书写。
定义
如本文使用的，术语“多核苷酸”是指任何长度和任何三维结构和单链或多链的(例如单链的、双链的、三螺旋的等)核苷酸的聚合物形式，其含有脱氧核糖核酸、核糖核酸和/或脱氧核糖核酸或核糖核酸的类似物或经修饰的形式，包括经修饰的核苷酸或碱基或其类似物。因为遗传密码是简并性的，多于一个的密码子可以用于编码特定的氨基酸，并且本发明包括编码特定氨基酸序列的多核苷酸。可以使用任何类型的经修饰的核苷酸或核苷酸类似物，只要多核苷酸在使用条件下保留了所需的功能性，所述修饰包括增加核酸酶抗性的修饰(例如脱氧、2′-O--Me、磷硫酰等)。还可以为了检测或捕获的目的掺入标记，例如放射性或非放射性标记或锚例如生物素。术语多核苷酸还包括肽核酸(PNA)。多核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。术语“多核苷酸”和“核酸”和“寡核苷酸”在本文可以交换使用。本发明的多核苷酸可以含有RNA、DNA或两者，和/或其经修饰的形式和/或类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。一个或多个磷酸二酯键可以被另外的连接基团替代。这些另外的连接基团包括但不限于这样的实例，其中磷酸盐被P(O)S(“硫代(thioate)”)、P(S)S(“二硫代(dithioate)”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R，P(O)OR’CO或CH2(“甲基化(formacetal)”)替换，其中每个R或R’独立地是H或取代的或非取代的烷基(1-20C)任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。不需要多核苷酸中所有的键是相同的。多核苷酸可以是线性的或环状的或含有线性和环状部分的组合。
如本文使用的，“多肽”是指任何含有氨基酸并被本领域技术人员认为是蛋白质的组合物。本文使用常规的一个字母或三个字母的氨基酸残基密码。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以交换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，其可以含有经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。所述术语还包括已经经天然的修饰或被干预的修饰，例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记成分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及其他本领域已知的修饰。
如本文使用的，“载体”是指被设计为将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
如本文使用的，术语“表达”是指过程，通过该过程根据基因的核酸序列可以制备多肽。所述过程包括转录和翻译。
如本文使用的，“表达载体”是指含有DNA编码序列(例如基因序列)的DNA构建体，所述编码序列与一个或多个合适的能够在宿主中引起编码序列表达的控制序列有效相连。这样的控制序列包括引起转录的启动子、可选的控制这一转录的操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦被转染进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组而复制和起作用，或可以在某些情况下，整合进入基因组本身。质粒是最常使用的表达载体的形式。但是，本发明预期包括其他形式的起等同作用的表达载体和在本领域中是已知的或将成为已知的表达载体。
“启动子”是指涉及结合RNA聚合酶从而起始基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可以用于本发明的诱导型启动子的非限制性例子是瑞氏木霉cbh1，其是诱导型启动子。
术语“有效连接”是指邻近，其中元件处于允许它们是功能上相关的排列中。例如，如果启动子控制编码序列的转录，其与编码序列有效连接。
“在转录控制下”是本领域中熟知的术语，表明多核苷酸序列的转录取决于其与对转录的起始作出贡献的或促进转录的元件有效连接。
“在翻译控制下”是本领域中熟知的术语，其表明mRNA形成后发生的调控过程。
“基因”是指涉及产生多肽的DNA区段并包括编码区之前和之后的区域以及单个编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
如本文使用的，术语“宿主细胞”是指其中可以转染用于产生多肽的重组表达载体从而表达多肽的细胞或细胞系。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且由于天然突变、偶然突变或人为突变，后代可以不必与原始的亲代细胞完全一样(在形态学中或在总基因组DNA互补物中)。宿主细胞包括用表达载体在体内转染或转化的细胞。“宿主细胞”是指细胞和由丝状真菌菌株且特别是木霉属菌株的细胞产生的原生质体。
术语“重组”当用于指细胞、核酸、蛋白质或载体时表明细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质被修饰，或者细胞源自经如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达了不在细胞的天然(非重组)形式中发现的基因，或表达了若非如此则是异常表达的、低表达的或完全不表达的天然基因。
“信号序列”是指与蛋白质的N末端部分结合的氨基酸序列，其促进成熟形式的蛋白质从细胞中的分泌。细胞外蛋白质的成熟形式缺乏信号序列，其在分泌过程中被切掉。
术语“选择性标记”或“可选择的标记“是指能够在宿主细胞中表达的基因，其允许容易地选择那些含有被引入核酸或载体的宿主。可选择的标记的例子包括但不限于抗微生物物质(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或给予宿主细胞代谢优势如营养优势的基因。
术语“源自”包括术语“起源于”、“获自”“可获自”、“从...分离”和“从...产生”。
术语“丝状真菌”是指所有丝状形式的真菌亚门(subdivisionEumycotina)(见Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York)。这些真菌的特征是具有由甲壳质、纤维素和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝。本发明的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上与酵母不同。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行且碳代谢是专性需氧的。本文的丝状真菌亲代细胞可以是(但不限于)下列物种的细胞：木霉属(例如瑞氏木霉(先前被归类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，现在还称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum))、青霉属(Penicillium sp.)腐质霉属(Humlcola sp.)(例如特异腐质霉(Humicola insolens)和灰色腐质霉(Humicola grisea)、金孢子菌属(Chrysosporium sp.)(例如C.lucknowense)、胶枝霉属(Gliocladium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori))、镰刀菌属(Fusarium sp.)、脉胞菌属(Neurospora sp.)、肉座菌属(Hypocreasp.)和裸孢壳属(Emericella sp.)(还见Innis等人，(1985)Sci.228：21-26)。
如本文使用的，术语“木霉属(Trichoderma)”或“木霉属(Trichodermasp.)”是指任何先前或现在被归类为木霉属的真菌属。
术语“培养”是指在适当的生长条件下使微生物细胞群体在液体或固体培养基中生长。
提及多核苷酸或蛋白质的术语“异源的”是指在宿主细胞中不是天然出现的多核苷酸或蛋白质。在一些具体实施方案中，蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。预期该术语包括天然存在的基因、突变的基因和/或合成的基因所编码的蛋白质。提及多核苷酸或蛋白质的术语“同源的”是指在宿主细胞中天然出现的多核苷酸或蛋白质。
在将核酸序列插入细胞的上下文中术语“引入的”包括“转染”、“转化”或“转导”并且是指将核酸序列掺入真核细胞或原核细胞，其中核酸序列可以整合进入细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转换成自主复制子或被瞬时表达。
如本文使用的，术语“经转化的”“稳定转化的”和“转基因的”是指具有非天然(例如异源)核酸序列的细胞，所述序列整合进入细胞基因组中或作为多代中维持的附加体质粒。
如本文使用的术语“分离的”和“分离的”是指从至少一个与其天然伴随的成分中分离的物质(例如蛋白质、核酸或细胞)。例如这些术语可以指物质，所述物质基本上或本质上没有在其天然状态中正常伴随其的成分，如例如完整的生物系统。
本文使用的术语“回收的”是指从微生物发酵液的一个或多个可溶成分中至少部分分离酶，和/或从发酵液例如水或乙醇中的一个或多个溶剂中至少部分分离。回收的酶通常比回收方法前具有更高的纯度。但是在一些具体实施方案中，与回收方法前相比，回收的酶可以具有相同的纯度或更低的纯度。
术语“分泌的蛋白质”是指从细胞中释放的多肽区域。在一些具体实施方案中，分泌的蛋白质是从重组融合多肽中释放或切除的蛋白质。
术语“分泌”是指蛋白质穿过宿主细胞膜来到细胞外空间和周围介质的选择性运动。
如本文使用的术语“比活性”意思是酶单位，其定义为在特定条件下每单位时间由酶制品转化成产物的底物摩尔数。比活性表达为单位(U)/mg蛋白质。
如本文使用的术语“去污剂组合物”和“去污剂制剂”用于指预期用于清洗脏物品的洗涤介质中的混合物。在一些优选的具体实施方案中，术语用于指洗涤织物和/或衣服(例如“洗衣去污剂”)。在另外的具体实施方案中，术语指其他去污剂，如那些用于清洗盘碟、刀叉餐具等的去污剂(例如“洗碗盘去污剂”)。不预期本发明限制于任何特定的去污剂制剂或组合物。事实上，预期除了酶以外，术语包括含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、增洁剂(builders)、漂白剂、漂白激活剂、上蓝剂(bluingagents)和荧光染料、结块抑制剂、遮蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和助溶剂的去污剂。
如本文使用的，术语“消毒”是指从表面去除污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。不预期本发明限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。
“微生物培养液”或“发酵液”是指生长培养基，其中生长了微生物细胞(例如细菌或真菌)且其适于表达如本文所述的酶。
“不溶解酶”是指存在于固相中的酶。在分离固相和液相例如微生物发酵液的固相和液相时，不溶解酶与固相一起分离(即分开)。应理解的是在全部微生物发酵液中，除了是固相一部分的不溶解酶外，一些酶通常还在培养基的可溶相中找到。不溶解酶可以结合至微生物发酵液中的固体上，如细胞固体或其它固体成分或可以在微生物发酵液中沉淀或结晶。
如本文使用的“溶解”或“溶解”是指去除造成酶沉淀或使酶维持在不溶解形式的条件或物质，或改变物理条件(例如改变温度、混合、超声处理)或加入使不溶解酶可溶的溶解物质(例如增溶溶剂，例如水、多元醇、盐、酸、碱、表面活性剂)。
“纯化”或“纯化”不溶解酶是指通过部分或完全去除非目的成分，例如微生物发酵液中的非目的液体成分而精制目的酶。纯化的含酶组合物含有与混合物(从中纯化酶)相比，较少量的一种或多种成分。
样品中酶的“纯度”可以通过用酶活性除以干固体的总量而计算。干固体是去除液体后所有存在物质的量度。干固体可以包括(其中)蛋白质、盐、碳水化合物、代谢产物、核酸、脂质、细胞、细胞碎片和用过的发酵培养基。酶的纯度可以表示为与一种或多种干固体成分相关的比例。
“细胞碎片”是指细胞壁和其他在破坏细胞膜后即在微生物细胞裂解后释放的不溶解的细胞成分。
“发酵液预处理(Broth conditioning)”是指预处理微生物发酵液，用以改善随后的发酵液处理性质。发酵液预处理改变了发酵液的化学组成和/或物理和/或流变学性质，从而促进其用于下游回收和/或配制的程序。发酵液预处理可以包括一种或多种处理如pH改变、热处理、冷却、加入添加剂(例如钙、盐、絮凝剂、还原剂、酶的激活剂、酶的抑制剂和/或表面活性剂)、混合和/或不进行进一步处理而定时保持(例如0.5至200小时)发酵液。
“ATCC”是指位于马纳萨斯，弗吉尼亚州20108的美国典型培养物保藏中心(www.atcc.org)。
“NRRL”是指美国北方农业研究所培养物保藏中心(先前称为USDA北方地区研究实验室)，皮奥里亚，伊利诺伊州。
“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文中明确指明不是。
回收的方法
本发明提供了不从发酵液中去除细胞或细胞碎片而从微生物发酵液(即微生物发酵液培养基，其中生长表达酶的细胞)中回收不溶解酶的方法。回收不溶解酶包括从微生物发酵液的可溶成分中部分地或基本上完全分离不溶解酶，即从至少部分微生物发酵液的可溶成分中分离不溶解酶。本文所述的回收过程不去除细胞或细胞碎片，将含有一种或多种目的不溶解酶的发酵液转化成为回收的可以配制使用的目的酶。
在一个具体实施方案中，方法包括提供微生物发酵液，其中表达酶的微生物细胞已经生长，且其中至少一些酶是不溶解的，以及不去除细胞而回收不溶解酶，因而制备了包括回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物。在另一个具体实施方案中，表达的酶在微生物发酵液中是可溶的，且至少一些酶通过加入一种或多种沉淀剂变得不溶解。在另一个具体实施方案中，酶不是微生物细胞表达的，但是被加入至生长微生物细胞的微生物发酵液中。加入微生物发酵液中的酶可以是不溶解的，或可以是可溶的，而通过加入一种或多种沉淀剂变得不溶解。可以在回收不溶解酶之前或之后裂解微生物细胞，产生不溶解的细胞碎片。
在一些具体实施方案中，含有表达的可溶或不溶解酶的微生物发酵液与含有外部产生的可溶或不溶解酶的组合物结合。加入一种或多种沉淀剂使得至少一种酶(由产生微生物发酵液的微生物细胞表达的酶和/或加入微生物发酵液中的酶)不溶解。
在一些具体实施方案中，当将至少部分液相从微生物发酵液中去除时，可溶的酶可以与不溶解酶共回收。
通常，回收的不溶解酶作为包涵体存在。
在一些具体实施方案中，将两个或两个以上来自独立的微生物发酵物的微生物发酵液结合，从结合的微生物发酵液中回收一种或多种不溶解酶。
在本发明的方法中，不溶解酶有酶活性，即能够催化酶反应。不溶解酶具有催化潜力，即酶在不溶解形式中和/或在溶剂中溶解后以及在适合发生催化活性的条件下有催化活性。在一个具体实施方案中，不溶解酶在不溶解形式中和在溶解后都有催化活性。在一个具体实施方案中，不溶解酶在不溶解形式中无活性且在溶解后变得有催化活性。
在多种具体实施方案中，在回收不溶解酶之前，任何至少约90、80、70、60、50、40、30、20或10％的酶在微生物发酵液中是不溶解的。在一些具体实施方案中，在回收不溶解酶之后，不溶解酶的纯度增加至少约10％。
回收含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液中的不溶解酶可以包括例如浓缩和/或渗滤。含有不溶解酶的微生物发酵液可以被浓缩以去除至少部分发酵液的可溶部分，因而增加了发酵液中不溶解酶的浓度，所述浓缩通过一种或多种本领域中熟知的技术，包括但不限于膜方法(例如超滤、微量过滤、纳米过滤)、离心和蒸发进行。单独地，或与浓缩相结合，可以进行渗滤从而替换至少部分微生物发酵液的可溶部分，通常通过使用膜方法从而将微生物发酵液对水渗滤。
在本发明的方法中，微生物细胞在适于表达目的酶的条件下生长在生长培养基中，因而制备了含有目的酶的微生物发酵液。例如，目的酶可以从宿主细胞中的表达载体中表达。目的酶可以分泌至生长培养基中或可以在细胞内表达而不分泌。
在用于细胞生长的条件下，分泌至生长培养基中的酶可以是天然不溶解的，或可以在回收酶之前通过加入沉淀剂诱导酶的不溶性。沉淀剂的例子包括但不限于盐(例如NaCl、NaSO4、硫酸铵、硫酸镁、浓度约0.1至约50％(w/v))、聚合电解质(例如藻酸盐、羧甲基纤维素、聚丙烯酸、鞣酸、多磷酸盐)，和改变温度或pH，或其组合(见例如Isolation andPurification of Proteins(2003)R.Hatti-Kaul和B.Mattiasson，编，Marcel Dekker，Inc.，页225-275；Bioseparations：Science andEngineering(2003)R.G.Harrison，页Todd，S.R.Rudge，D.P.Petrides，页243-271；Protein Purification：Principles and Practice(1994)R.K.Scopes，Springer，页71-101.；Protein Purification ProcessEngineering(1994)R.G.Harrison，编，Marcel Dekker Inc.，“Differential Precipitation of Proteins，”页115-208)。
可溶的酶还可以通过亲和相互作用例如底物-酶相互作用或抑制剂-酶相互作用，通过例如与亲和树脂接触变得不溶解。
表达在细胞内且不分泌的酶可以通过细胞的裂解而释放。释放的酶可以在其被释放的生长培养基中的条件下是天然不溶解的，或在回收上述的酶之前，可以通过加入沉淀剂诱导不溶解性。
可以用于表达本文所述的目的酶的微生物细胞可以是真核的或原核的例如真菌或细菌微生物。可以使用的真核微生物的例子包括但不限于木霉属、肉座菌属、曲霉属、青霉属、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomycessp.)、汉森酵母属(Hansenula sp.)和镰刀菌属。原核微生物的例子可以包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)、埃希氏杆菌属(Escherichia sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
任何以不溶解形式表达的或以可溶的形式表达的且可以变得不溶解(例如通过加入沉淀剂)的酶均可以根据本文所述的方法回收，任选地配制为本文所述的颗粒或液体制剂。在一些具体实施方案中，酶是水解酶，例如(细菌(例如枯草杆菌蛋白酶)或真菌的、酸性、中性或碱性)蛋白酶、淀粉酶(α或β)、脂酶或纤维素酶。在一些具体实施方案中，酶是枯草杆菌蛋白酶，例如如美国专利号4,760,025、欧洲专利号130 756或PCT申请号WO 91/06637中所述的。在一些具体实施方案中，酶是α-淀粉酶如PCT申请号WO08/112459中所述。在一些具体实施方案中，酶是纤维素酶，例如Multifect L250TM或PuradaxTM，其可以从Genencor，Division ofDanisco US，Inc.商购获得。在一些具体实施方案中，酶是氧化酶、加氧酶、转移酶、脱水酶、还原酶、半纤维素酶、过氧化物酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、脂肪氧合酶(lipoxygenase)、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦芽聚糖酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、过氧化氢酶、异构酶、果胶酸裂合酶或甘露聚糖酶，或其组合。在一些具体实施方案中，酶是植酸酶。在一些具体实施方案中，酶是过水解酶(perhydrolase)，如例如PCT申请号WO 05/056782中所述的酶。
在本文所述的回收方法中，制备了包括不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物。在一些具体实施方案中，所述组合物包括完整的微生物细胞。在一个具体实施方案中，完整的微生物细胞是活的微生物细胞。在一个具体实施方案中，完整的微生物细胞是死的微生物细胞(见例如美国专利号5,801,034，其描述了不裂解而杀死细胞的方法，其通过使用无机酸将发酵混合物的pH调整至等于或小于相容性有机酸的pKa约两个pH单位以下的值，以及向混合物中加入足够量的相容性有机酸和/或有机酸盐从而引起基本上完全杀死细胞)。
在一些具体实施方案中，组合物包括裂解的微生物细胞，即通过裂解微生物细胞产生的细胞碎片。在一个具体实施方案中，方法包括在回收不溶解蛋白质之前，破坏微生物细胞膜从而产生微生物细胞裂解液。在酶在微生物发酵液中是可溶的且通过加入一种或多种沉淀剂诱导酶的不溶解性的情况中，微生物细胞膜的破坏可以发生在沉淀剂加入之前或之后。在一些具体实施方案中，细胞膜的破坏是通过将细胞与能够裂解微生物细胞的酶例如溶菌酶接触而实现的。在一个具体实施方案中，用能够裂解微生物细胞的酶裂解的细胞进一步被匀浆从而产生匀浆化的微生物细胞裂解液。在其他的具体实施方案中，细胞膜的破坏是通过机械匀浆化实现的。
含有一种或多种不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的含酶组合物(如本文所述制备)可以被配制在颗粒制剂或液体制剂中。
颗粒制剂
可以从含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液中制备低粉尘、稳定的酶颗粒。在一些具体实施方案中，含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液是根据任何上述回收方法制备的。酶颗粒可以通过本领域熟知的方法例如在顶喷流化床涂布机中，在底喷沃斯特涂布机中或通过滚筒颗粒化(例如高剪切颗粒化)挤压或锅包衣制备。
本发明提供了制备含酶颗粒的方法，其包括提供含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，所述组合物通过例如上述的回收方法制备，以及制备包括组合物的含酶颗粒，其中颗粒中的不溶解酶有酶活性，即在适于发生催化活性的条件下接触酶的底物时能够有酶活性。酶在不溶解形式中和/或当溶于溶剂中，在存在底物时以及在适于发生酶催化(例如在含酶颗粒使用的应用中)的条件下有催化活性。在一个具体实施方案中，酶在不溶解形式中和在溶解后都有催化活性。在一个具体实施方案中，酶在不溶解形式中没有催化活性且溶解后变得有催化活性。
在一个具体实施方案中，含酶颗粒在顶喷流化床处理器中制备。在一个具体实施方案中，在顶喷流化床处理器中将上述包括含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物的含酶层涂布在核心上。任选地，颗粒可以在核心和含酶层之间含有盐层。盐层可以选自例如硫酸钠、柠檬酸钠、硫酸镁、硫酸钾或硫酸铵，或其混合物。可以将另外的一层或多层涂布在含酶层上。例如，可以将屏障盐层涂布在含酶层上。在一些具体实施方案中，可以将一个或多个外涂层涂布在含酶层上，或涂布在含酶层上的屏障层上。外涂层可以含有例如聚合物和/或色素。
在一些具体实施方案中，上述含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物被掺入核心，且将多一层涂布在含酶核心上。例如可以将屏障层涂布在含酶核心上。在一些具体实施方案中，可以将一个或多个外涂层涂布在含酶核心上，或涂布在含酶核心上的屏障盐层上。外涂层可以含有例如聚合物和/或色素。
在一些具体实施方案中，含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的颗粒通过滚筒颗粒化如高剪切颗粒化制备。这样的颗粒含有含酶核心(含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片)和一个或多个核心上的涂层。这样的涂层可以包括但不限于聚合物例如聚乙二醇或聚乙烯醇、色素如二氧化钛或丙三醇。
本发明的颗粒可以还包括另外的成分如但不限于增塑剂、填充剂和润滑剂。
本发明提供含有核心和在包围核心的层中或掺入核心中的含酶组合物，以及可选地一个或多个另外的层的含酶颗粒。含酶组合物含有例如如上述制备的不溶解酶和微生物细胞和/或微生物细胞碎片。不溶解酶在颗粒中有酶活性，即在适于发生催化活性的条件下用酶的底物接触时能够有酶活性。在含有微生物细胞和/或细胞碎片的组合物(例如具有可溶的酶和细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液)中的可溶的酶也可以配制在本文所述的颗粒制剂中。
本发明的颗粒显示低粉尘，例如在通过Heubach磨损试验测定的50、40、30、20、10、5、4、2、1或0.5mg/垫以下。当储存在环境湿度和温度条件下时颗粒是稳定的，但是当接触水时是可溶的或可分散的，以便当使用时释放酶。
在酶颗粒制造厂和客户制造厂中(customer’s manufacturing plant)，无保护层的小颗粒在气力转运和填充操作中产生大量粉尘。粉尘可以是卫生问题和制造问题，所以必须将其尽可能最小化。开发了几个工业试验从而测定对磨损的机械抗性和不同颗粒酶制剂的粉尘形成。这些包括Heubach磨损试验和淘洗试验。Heubach试验通过使用旋转桨从而使钢球在圆筒状腔室内所含有的颗粒床上滚动，并且同时将空气流滤过该床从而脱去任何产生的粉尘，而使颗粒经受限定的挤压和流化外力。产生的粉尘通过管子用真空抽走并沉积在Heubach腔室外的过滤垫上。收集的粉尘的重量或活性成分称为Heubach粉尘。在淘洗试验中，颗粒被置于高玻璃管内的玻璃熔块上并在固定的时间内用恒定的干气流流化。对Heubach和淘洗粉尘试验的原理、操作和局限性的讨论可以在例如“Enzymes InDetergency”编Jan H.van Ee.，Ch.15，页310-312，(Marcel Dekker，Inc.New York(1997)和其中引用的参考文献中找到。Heubach粉尘试验还在美国专利号5,324,649，5,879,920，和7,108,821中有描述。
核心
核心是颗粒的内核。本发明适于使用的核心优选是可以高度水合的物质(即在水中容易分散或可溶的物质)。核心物质进入真正的水溶液时应该分散在水中(当水合时分解)或溶于水。粘土(皂土、高岭土)、糖粒(nonpareil)和结块的马铃薯淀粉被认为是可分散的。糖粒是由晶种组成的球形颗粒，所述晶种通过将粉末和溶质层在涂布设备中结合至晶种而堆叠制成球形。糖粒通常由糖如蔗糖和粉末如玉米淀粉的组合制成。合适的核心还包括晶种物质，其包括蔗糖结晶、氯化钠或硫酸钠晶种和其他可以与硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾等堆叠的无机盐。
由无机盐和/或糖和/或有机小分子组成的颗粒可以用作本发明的核心。用于掺入核心的合适的水溶性成分包括：氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、尿素、柠檬酸、蔗糖、乳糖等。水溶性成分可以与水分散成分结合。本发明的核心可以还含有一种或多种下列物质：活性成分、聚合物、填充剂、增塑剂、纤维状物质、增充剂和其他已知用于核心的化合物。合适的聚合物包括-聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇、聚氧化乙烷和聚乙烯吡咯烷。PVA可以是部分水解(70-90％)、中等水解(90-98％)、完全水解(98-99％)、超级水解(99-100％)的PVA或其混合物，具有低至高程度的粘度。
如本文所述的含酶颗粒的核心可以由一种或多种无机盐或蔗糖结晶组成。在一些具体实施方案中，核心由硫酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、硫酸钙或其组合组成。在一个具体实施方案中，核心由硫酸钠组成。
核心中有用的合适填充剂包括用于增加体积并减少成本的惰性物质，或用于调节完成的颗粒中预期酶活性目的的惰性物质。这样的填充剂的例子包括但不限于水溶剂如尿素、盐、糖和水分散剂如粘土、滑石、硅酸盐、羧甲基纤维素和淀粉。
本发明核心中有用的合适的增塑剂是加入聚合物从而降低其玻璃转化温度，因而降低脆性并增强可变形性的不挥发溶剂。通常，增塑剂是低分子量的有机化合物并对需要增塑的聚合物是高度特异性的。例子包括但不限于糖(如葡萄糖、果糖和蔗糖)、糖醇(如山梨糖醇、木糖醇和麦芽糖醇)多元醇(多元醇例如具有许多羟基基团的醇如丙三醇、乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)、极性低分子量有机化合物如尿素，或其他已知的增塑剂如邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二甲酯或水。
本发明核心中有用的合适的纤维状物质包括具有高抗张强度且可以形成具有1至50微米直径和长度等于至少4倍直径的细丝的物质。通常的纤维状物质包括但不限于：纤维素、玻璃纤维、金属纤维、橡胶纤维、人造蛋白质纤维(从玉米、花生和奶中天然存在的蛋白质中制造)和合成聚合物纤维。合成品包括
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丙烯酸、聚酯、烯烃(olefin)、
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和
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通常纤维素纤维具有160微米的平均纤维长度和约30微米的直径。
核心可以通过各种本领域中熟知的颗粒化技术制造，包括：结晶、沉淀、锅包衣、流化床涂布、旋转雾化、挤压、滚圆、滚筒颗粒化和高剪切结块。
在本发明的一个具体实施方案中，核心是水溶性的或可分散的糖粒(上述的糖或盐)，其可以任选地单独使用聚乙烯醇(PVA)或与抗结块剂如二氧化钛、滑石或增塑剂如蔗糖或多元醇组合的聚乙烯醇进一步涂布，或从晶种(糖粒)开始堆叠。在糖粒涂层中的PVA水平可以占约0.5％至20％的涂布的糖粒的重量。
总之，包括任何其中掺入活性成分的核心是对撞击敏感(impact-sensitive)的颗粒。但是本发明不受核心类型的限制，且许多专利和公开物描述了可以用于本发明的核心，且对USP 5,879,920、USP4,689,287和WO 00/24877做出了参考。
酶
一种或多种不溶解酶可以用于本发明的低粉尘、稳定的酶颗粒中。将含有一种或多种不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的含酶组合物(如上述制备)掺入本文所述的颗粒中。
在一些具体实施方案中，酶是水解酶，例如(细菌(例如枯草杆菌蛋白酶)或真菌的；酸性，中性或碱性)蛋白酶、淀粉酶(α或β)、脂酶或纤维素酶。在一些具体实施方案中，酶是枯草杆菌蛋白酶，例如如美国专利号4,760,025、欧洲专利号130 756或PCT申请号WO 91/06637中所述的。在一些具体实施方案中，酶是PCT申请号WO08/112459中所述的α-淀粉酶。在一些具体实施方案中，酶是纤维素酶，例如Multifect L250TM或PuradaxTM，其可以从Genencor，Division of Danisco US，Inc.商售获得。在一些具体实施方案中，酶是氧化酶、加氧酶、转移酶、脱氢酶、还原酶、半纤维素酶、过氧化物酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、脂肪氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦芽聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、过氧化氢酶、异构酶、果胶酸裂合酶或甘露聚糖酶，或其组合。在一些具体实施方案中，酶是植酸酶。在一些具体实施方案中，酶是过水解酶(perhydrolase)，如例如PCT申请号WO 05/056782中所述的酶。在一些具体实施方案中，酶能够水解底物(例如污迹)。
在一个方面，将含有微生物细胞和/或细胞碎片的组合物中的一种或多种不溶解酶掺入颗粒的核心中。在另一个优选的方面，将含有微生物细胞和/或细胞碎片的组合物中的一种或多种酶在核心的周围涂层。当在核心周围涂层时，含有酶的层可以另外包括粘合剂如聚合物，例如烯类聚合物如聚乙烯醇(PVA)。
含有酶的层可以另外可选地含有除了含酶组合物以外的一种或多种其他的成分。这样的非酶成分包括但不限于聚合物(例如聚乙烯醇、聚乙二醇)、糖(例如蔗糖、蔗糖(saccharose)、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖糊精)、淀粉(例如玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、经化学或物理修饰的淀粉)、糊精、消泡剂(例如聚醚多元醇如Foamblast 882(Emerald FoamControl)、Ero1 DF 204K(Ouvrie PMC)、DG436(ODG Industries，Inc.)、KFO 880(KABO Chemicals，Inc.))、糖醇(例如山梨糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇)、表面活性剂(例如醇乙氧基化物(alcohol ethoxylate)如Neodol 23-6.5(Shell Chemical LP，Houston，TX)和Lutensol TO65(BASF))和抗再沉淀剂(例如聚乙二醇聚酯如Repel-o-Tex SRP6(Rhodia，Inc.)、Texcare SRN-100或SRN-170(Clariant GmbH，Sorez-100(ISPCorp.))。
“消泡剂”是用于防止或破裂泡沫的化合物。这些还可以称为去沫剂或去泡剂。这些化合物是降低液体表面弹性并防止亚稳定泡沫形成的表面活性物质。泡沫的破裂是由于液体表面弹性和表面活性物质之间获得平衡的倾向造成的(Vardar-Sukan(1991)Recent Adv.Biotechnol.113-146)。在本文所述的颗粒中有用的消泡剂通常适用于生物工艺。合适的消泡剂包括但不限于脂肪、油、蜡、脂肪酸或酯、醇、硫酸盐、磺酸盐、脂肪酸、皂、含氮化合物、磷酸盐、聚乙二醇、硫化物、硫代化合物、硅氧烷和卤代的和无机的化合物(Ghildyal(1988)Adv.Appl.Microbiol.(1988)33：173-222)。在一些具体实施方案中，油、脂肪酸、酯类、聚乙二醇和硅氧烷是有用的。在一些具体实施方案中，消泡剂是环氧乙烷环氧丙烷共聚物。在一些具体实施方案中，该环氧乙烷环氧丙烷共聚物具有约2200的分子量(例如从MazerChemicals，Inc.作为MazuTM可获得)。
本发明的颗粒可以包括0.01重量％至50重量％或75重量％之间的酶固体(如上述制备的回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片)。在各种具体实施方案中，颗粒可以任意地含有至少约0.5、5、10、20、30或40重量％的酶固体。含有酶固体包括任何粘合剂和其他其中成分的层可以组成颗粒的约0.2重量％至70重量％或80重量％。
在一些具体实施方案中，具有粘度在20厘泊以下的含酶层促进无结块的颗粒化。
涂层
本发明的颗粒可以还含有一个或多个其它的涂层。涂层可以发挥许多功能中的任意一种，取决于颗粒的最终用途。例如，涂层可以使得活性成分，特别是酶对漂白引起的氧化有抗性，或者涂层可以在将颗粒引入水性介质中时带来想要的溶解速率，或提供另外的对抗环境湿度的屏障从而增加颗粒的储存稳定性并减少颗粒内微生物生长的可能性。
在本发明的具体实施方案中，涂层含有一种或多种聚合物和任选地低残渣色素或其它的辅料如润滑剂。这样的辅料对于本领域技术人员是已知的。另外，涂层可以与其它相同或不同范畴的活性剂结合使用。
合适的聚合物包括PVA和/或PVP或两者的混合物。如果使用了PVA，其可以是具有低至高程度粘度的部分水解的、完全水解的或中度水解的PVA(优选部分水解具有低粘度的PVA)。其它可以有用的烯类聚合物包括聚醋酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮。有用的共聚物包括例如PVA-甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)共聚物。其它的聚合物如PEG还可以用于外层。这些另外的涂层可以另外含有一种或多种下列成分：增塑剂、色素、润滑剂如表面活性剂或抗静电剂和任选地另外的酶。在本发明的涂层中有用的合适的增塑剂是那些本文上面公开的增塑剂。在本发明的涂层中有用的合适的色素包括但不限于精细分割的增白剂如二氧化钛或碳酸钙，或有色的色素或其组合物。优选这样的色素在溶解时是低残渣的色素。
如本文使用的“润滑剂”意思是任何减小表面摩擦、润滑颗粒表面、降低静电或减小颗粒脆性的试剂。润滑剂还可以通过减小涂层中粘合剂的粘度在改善涂层方法中起相关的作用。因此，润滑剂可以作为抗结块剂和润湿剂。
合适的润滑剂包括但不限于表面活性剂(离子的、非离子的或阴离子的)、脂肪酸、抗静电剂和抗尘剂。优选地润滑剂是表面活性剂，最优选地是基于醇的表面活性剂如线性的9至15个碳原子链长的烷烃或其烯烃的伯醇，或乙氧基化物或乙氧基硫酸酯衍生物。这样的表面活性剂可以从ShellInternational Petroleum Company作为
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产品系列商售获得。其它合适的润滑剂包括但不限于抗静电剂如StaticGuardTM、DowneyTM、TritonX100或120等、抗尘剂如TeflonTM等或其它对于本领域技术人员是已知的润滑剂。
可以包括其它中间层如粘合剂、结构剂和屏障层。合适的屏障物质包括例如无机盐、糖或有机酸或盐。结构剂可以是多糖或多肽。优选的结构剂包括淀粉、变性淀粉、角叉菜胶、纤维素、变性纤维素、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶、黄原胶、刺槐豆胶、壳聚糖、明胶、胶原、酪蛋白、聚天冬氨酸和聚谷氨酸。优选地，结构剂具有低致敏性。一种或多种结构剂的组合可以用于本发明的颗粒中。粘合剂包括但不限于糖和糖醇。合适的糖包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、棉子糖、海藻糖、乳糖和麦芽糖。合适的糖醇包括山梨糖醇、甘露糖醇和肌醇。
屏障层
在一些具体实施方案中，屏障层涂布在本文所述含酶颗粒中的酶层上或含酶核心上。在一些具体实施方案中，屏障层含有一种或多种盐，例如硫酸钠、柠檬酸钠、硫酸镁、硫酸钾和/或硫酸铵。在一些具体实施方案中，屏障层含有硫酸钠，由硫酸钠组成或基本上由硫酸钠组成。在一些具体实施方案中，屏障层含有糖(例如蔗糖)、多糖(例如淀粉)或其组合。
在一些具体实施方案中，屏障层是含水的。术语“含水的”意思是屏障物质含有游离形式或结合形式的水或两者的组合。水合的水可以在涂层过程中或涂层过程后加入。水合的程度是物质本身和温度、湿度和其应用的干燥条件的函数。
“中等或高”水活度意思是具有至少约0.25、0.30或0.35的水活度。本文所谓的水活度是一旦颗粒具有屏障物质，但是没有另外的涂层涂布在其上时颗粒本身的水活度。另外的涂层可以掩蔽作为不同层的屏障物质水活度的准确测定。
不希望被理论所束缚，预期具有水活度大于0.25的物质将在其中相对湿度大于25％的储存条件下具有降低的吸水驱动力。大多数天气有25％以上的相对湿度。许多去污剂具有约0.3至0.4范围的水活度。如果颗粒的水活度事实上高于周围的去污剂或储存天气的相对湿度，颗粒吸水的驱动力会被消除，事实上颗粒可以向其周围放出水。即使颗粒的水活度低于去污剂或周围的相对湿度，存在于屏障层中的水可以作为屏障而限制颗粒吸水的量及其对蛋白质核心的影响。
在盐的水合物的情况下，含水的物质是具有结晶的结合水的晶状盐水合物。应该以这样的方式选择并应用水合物：所述方式使得所获得的涂布的颗粒具有超过0.25的水活度，或尽可能高，而仍然保持触觉上是干燥的颗粒。通过以这样的方式应用盐的水合物或任何其它合适的含水屏障物质，人们可以消除任何颗粒进一步吸水的驱动力。作为重要的结果，转运可以对酶活性是有害的物质如过硼酸盐或过氧化物阴离子的驱动力被去除了。没有作为载体的水，这些物质不太可能穿透酶核心。经验数据证实颗粒中的酶活性通过用稳定的盐的水合物涂布酶核心而大幅增强了。
制备含水屏障层的合适的盐的例子包括七水合硫酸镁、七水合硫酸锌、五水合硫酸铜、七水合磷酸氢二钠、七水合硝酸镁、十水合硼酸钠、二水合柠檬酸钠和四水合醋酸镁。
外涂层
在一些具体实施方案中，含有颗粒的酶含有外涂层。在一个具体实施方案中，外涂层涂布在酶层上。在一些具体实施方案中，外涂层涂布在一个或多个中间涂层上。在一些具体实施方案中，外涂层涂布在屏障层上，所述屏障层涂布在酶层上或含酶核心上。
在一些具体实施方案中，外涂层包括一种或多种聚合物。合适的聚合物包括但不限于聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚醋酸乙烯酯、PVA-甲基丙烯酸甲酯共聚物、PVP-PVA共聚物、纤维素衍生物如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇、聚氧化乙烯、壳聚糖、阿拉伯胶、黄原胶、角叉菜胶、乳胶聚合物和肠溶聚合物。
在一些具体实施方案中，外涂层包括PVA。合适的用于掺入外涂层的PVA包括具有低至高程度粘度的部分水解的、完全水解的和中等水解的PVA(见例如美国专利号5,324,649)，在一个具体实施方案中，外涂层包括具有低粘度的部分水解的PVA。
在一些具体实施方案中，外涂层包括一种或多种色素。合适的色素的非限制性例子包括精细分割的增白剂如二氧化钛或碳酸钙、硫酸钙、滑石或有色的色素或染料。通常这样的色素在溶解时是低残渣色素。除了聚合物和/或色素，外涂层还包括一种或多种增塑剂、增充剂、润滑剂、表面活性剂和抗再沉淀剂。
合适的增塑剂包括但不限于多元醇(例如糖、糖醇、聚乙二醇(PEG)、乙二醇、丙二醇)。尿素、柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二甲酯或水。
合适的增充剂包括但不限于糖(例如蔗糖或淀粉水解产物，如麦芽糖糊精或玉米糖浆固体)、粘土(例如高岭土或皂土)和滑石。“增充剂”是加入另一个物质(通常是高成本和高性能的)中而修饰其或将其稀释的物质(通常是低成本的)。
合适的润滑剂包括但不限于非离子表面活性剂(例如Neodol，LutensolTO 6)、动物脂醇、脂肪酸、脂肪酸盐(例如硬脂酸镁)和脂肪酸酯。
合适的表面活性剂包括但不限于醇乙氧基化物如Neodol 23-6.5和Lutensol TO65。
合适的抗再沉淀剂包括但不限于聚乙二醇聚酯如Repel-o-Tex SRP6、Texcare SRN-100或SRN-170和Sorex-100。
其他辅助成分
可以将辅助成分加入本发明的颗粒中，包括但不限于：金属盐、增溶剂、激活剂、抗氧化剂、染料、抑制剂、粘合剂、芳香剂、酶的保护剂/净化剂如硫酸铵、柠檬酸铵、尿素、盐酸胍、碳酸胍、磺酸胍、二氧化硫脲、单乙醇胺(monethyanolamine)、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基酸如甘氨酸、谷氨酸钠等，蛋白质如牛血清白蛋白、酪蛋白等、表面活性剂包括阴离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和长链脂肪酸盐、增洁剂、碱或无机电解质、漂白剂、上蓝剂和荧光染料和结块抑制剂。表面活性剂在例如PCT申请号PCT/US92/00384中有描述通过参考并入本文。
基质颗粒
在一个具体实施方案中，颗粒包括含有组合物的蛋白质“基质”，所述组合物含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片，与糖或糖醇和结构剂的组合混合在一起(见例如EP1037968B1)。可选地，屏障层可以涂布在含酶基质上或屏障物质可以包括在含酶基质中。并且任选地，涂层可以应用在种子颗粒、包围种子颗粒的酶基质和/或屏障层上。在一些具体实施方案中，结构剂是多糖或多肽。基质可以在整个核心中是同质的或可以在种子颗粒上涂层。在种子颗粒和基质之间或基质和屏障层之间可以有一层或多层，例如聚乙烯醇(PVA)的涂层。基质颗粒可以在例如顶喷流化床处理器中制备。
种子颗粒是惰性颗粒，其上的可以涂层的酶基质可以由下列组成：无机盐、糖、糖醇、有机小分子如有机酸或盐、矿物质如粘土或硅酸盐或其两种或两种以上的组合。用于掺入种子颗粒的合适的可溶性成分包括：氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、二碳酸三钠、尿素、柠檬酸、柠檬酸盐、山梨糖醇、甘露糖醇、油酸、蔗糖、乳糖等。可溶性成分可以与可分散成分如滑石、高岭土或皂土结合。种子颗粒可以通过各种颗粒化技术制造，所述技术包括：结晶、沉淀、锅包衣、流化床涂层、流化床结块、旋转雾化、挤压、颗粒化(prilling)、滚圆、滚筒颗粒化和高剪切结块。在本发明的颗粒中，如果使用了种子颗粒，那么种子粒与颗粒的比例为1∶1。
合适的糖包括如蔗糖、葡萄糖、果糖、棉子糖、海藻糖、乳糖和麦芽糖的糖。合适的糖醇包括山梨糖醇、甘露糖醇和肌醇。糖或糖醇与基质中结构剂的比例优选为蛋白质基质的0.1-90重量％。基质中的糖或糖醇可以是加入蛋白质中的糖或糖醇或可以来自其中存在该蛋白质的发酵液。
结构剂可以是多糖或多肽。这些类型的化合物具有同时期望的高分子量和高水溶性的性质。不希望被理论所束缚，相信高分子量的结构剂贡献了两个重要的性质，其为单独的糖或糖醇基质所缺少的：(1)给颗粒提供了内聚力和强度，极大的降低了颗粒粉尘化的倾向，和(2)由于在整个基质结构中形成聚合物网络或“笼子”，作为水和小分子的扩散屏障。这极大地改善了颗粒的稳定性。
优选的结构剂包括淀粉、变性淀粉、角叉菜胶、纤维素、变性纤维素、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶(acacia gum)、黄原胶、刺槐豆胶、壳聚糖、明胶、胶原、酪蛋白、聚天冬氨酸和聚谷氨酸。优选地，结构剂具有低致敏性。两种或两种以上结构剂的组合可以用于本发明的颗粒中。
含酶基质可以另外含有本领域技术人员已知的一种或多种合成聚合物或其他的辅料。合适的合成聚合物包括聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和聚氧化乙烯/聚氧化丙烯。基质还可以另外含有增塑剂和抗凝剂。在本发明中有用的合适增塑剂包括多元醇如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇(PEG)、尿素或其他已知的增塑剂如柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二甲酯或水。合适的抗凝剂包括精细的不溶解或微溶的物质如滑石、TiO2、粘土、无定形二氧化硅、硬脂酸镁、硬脂酸和碳酸钙。
基质颗粒可以另外含有屏障层。使用屏障层从而减慢或防止可以对蛋白质或酶产生不利影响的物质扩散进入基质。屏障层由屏障物质制成，且可以涂布在蛋白质核心上或者可以将屏障物质包括在蛋白质核心中。合适的屏障物质包括例如无机盐或有机酸或盐。没有蛋白质的基质也可以用作屏障层。
基质颗粒还可以含有一个或多个涂层。例如这样的涂层可以是一个或多个中间涂层，或这样的涂层可以是一个或多个外涂层或其组合。涂层可以在颗粒组合物中起许多功能中的任一功能，取决于酶颗粒的最终用途。例如，涂层可以使酶对漂白引起的氧化有抗性，在将颗粒引入水性介质中时带来想要的溶解速率，或提供对抗环境湿度的屏障从而增加酶的储存稳定性并减少颗粒内微生物生长的可能性。
合适的涂层包括水溶性或水分散成膜聚合物如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纤维素衍生物如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇、聚氧化乙烯、阿拉伯胶、黄原胶、角叉菜胶、壳聚糖、乳胶聚合物和肠溶聚合物。另外。涂层剂可以与其他相同或不同范畴的活性剂联合使用。
合适的用于掺入颗粒涂层的PVA 包括具有低至高程度粘度的部分水解的、完全水解的和中等水解的PVA。优选的，外涂层含有具有低粘度的部分水解的PVA。其他可以有用的烯类聚合物包括聚醋酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮。有用的共聚物包括例如PVA-甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)共聚物和PVP-PVA共聚物。涂层可以另外含有一种或多种下列物质：增塑剂、增充剂、润滑剂、色素和任选地另外的酶。在本发明涂层中有用的合适的增塑剂是包括例如多元醇如糖、糖醇或聚乙二醇(PEG)、尿素、乙二醇、丙二醇或其他已知的增塑剂如柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二甲酯或水的增塑剂。在本发明涂层中有用的合适的色素包括但不限于精细分割的增白剂如二氧化钛或碳酸钙，或有色的色素和染料或其组合。优选地，这样的色素在溶解时是低残渣色素。合适的增充剂包括糖如蔗糖，或淀粉水解产物如麦芽糖糊精和玉米糖浆固体、粘土如高岭土和皂土和滑石。合适的润滑剂包括非离子表面活性剂如Neodol，动物脂醇、脂肪酸、脂肪酸盐如硬脂酸镁和脂肪酸酯。
液体制剂
本发明提供了组合物中含有不溶解酶的含酶液体制剂，所述组合物具有微生物细胞和/或细胞碎片(例如如上述回收的)。酶在液体制剂中有酶活性或具有催化潜力，即能够在测定法中或在适当溶剂和发生催化活性的条件中使用的应用中有催化活性。在各种具体实施方案中，液体制剂可以含有“稳定”即在储存过程中保持产品物理和生物化学性质的制剂成分(稳定性物质)，包括但不限于下列成分：一种或多种多元醇、一种或多种盐、一种或多种防腐物质或一种或多种缓冲盐(和调节pH的酸或碱)、一种或多种表面活性剂、一种或多种氨基酸、一种或多种抗氧化剂或其组合。在一些具体实施方案中，液体制剂包括一种或多种多元醇例如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、丙三醇、乳糖、右旋糖(dextrose)、丙二醇、浓度为约1至约50％(w/v)。在一些具体实施方案中，液体制剂含有一种或多种盐，例如NaCl、CaCl2、Na2SO4、甲酸钠、柠檬酸钠、谷氨酸一钠、氯化钙，浓度为约0.1至约50％(w/v)。在一些具体实施方案中，液体制剂含有一种或多种防腐剂例如苯甲酸钠、丙酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸酯，浓度为约0.1至约5％(w/v)。在一些具体实施方案中，液体制剂含有一种或多种缓冲盐例如醋酸钠、柠檬酸钠、MES、HEPES，浓度为0.1至约20％(w/v)。可以使用酸(例如弱酸如醋酸或甲酸，或强酸如HCl或H2SO4)或碱(例如NaOH或KOH)调节pH。综合描述液体制剂的参考文献见Isolation and Purification of Proteins(2003)R.Hatti-Kaul和B.Mattiasson，编，Marcell Dekker，Inc.，页549-604。
本发明还提供了制备含有组合物中的不溶解酶(例如如上述回收的)的液体制剂的方法，所述组合物具有微生物细胞和/或细胞碎片，其中酶在液体制剂中有酶活性。在一个具体实施方案中，方法包括提供含有不溶解酶(例如如上述回收的)和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，通过例如将所述组合物与上述一种或多种制剂成分例如一种或多种多元醇、一种或多种盐、一种或多种防腐物质和/或一种或多种缓冲盐，任选地在液体中，通常在水中结合而部分或完全溶解不溶解酶，因而制备了液体制剂。在一个具体实施方案中，方法包括提供含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片(例如如上述回收的)的组合物，溶解不溶解酶，例如将所述组合物与上述一种或多种制剂成分例如一种或多种多元醇、一种或多种盐、一种或多种防腐物质和/或一种或多种缓冲盐，可选地在液体中，通常在水中结合，所述组合物含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片，以及通过去除微生物细胞和/或细胞碎片，例如通过过滤如膜过滤和/或离心使含有不可溶的酶的组合物澄清，从而制备了澄清的液体制剂。
组合物
本发明提供了含有上述含酶颗粒或液体制剂的组合物。除了含酶颗粒或液体制剂，组合物含有在特定使用应用中如洗涤(例如去污剂)、纺织加工、动物饲养、酿造、烘烤、食品或饮料应用中颗粒或液体制剂适合使用的成分。
清洁组合物
在一些具体实施方案中，将本文所述的含酶颗粒或液体制剂掺入例如用于洗衣或洗碗盘用途的清洁组合物如去污剂中，从而提供了洗涤性能和/或洗涤益处。适于包括在清洁组合物中的酶包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦芽聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、过水解酶和淀粉酶或其混合。通常的组合是常规的可应用酶，像蛋白酶、脂酶、角质酶和/或纤维素酶与淀粉酶联合的混合物。
辅助物质也可以包括在清洁组合物中，从而例如辅助或增强洗涤性能，用于处理需要洗涤的物质，或修饰清洁组合物的外观，如香料、着色剂、染料等情况。应该理解的是这样的辅助剂是除了本文所述的含酶颗粒以外的。这些另外成分的精确性质和其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和需要使用其的洗涤操作的性质。合适的辅助物质包括但不限于表面活性剂、增洁剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、酶稳定剂、催化性物质、漂白激活剂、漂白加强剂、预制的过酸(preformed peracids)、聚合的分散剂、粘土去除/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹性剂(structure elasticizing agent)、纤维软化剂、载体、助水溶物、加工助剂和/或色素。除了下面的公开，这样的其他辅助剂和使用水平的合适例子在美国专利号5,576,282、6,306,812和6,326,348中有描述。
在一些具体实施方案中，清洁组合物不含磷酸盐/酯。在一些具体实施方案中，清洁组合物是不含磷酸盐/酯的洗碗盘去污剂。在一些具体实施方案中，清洁组合物是不含磷酸盐/酯的洗衣去污剂。在一些具体实施方案中，非磷酸盐/酯清洁组合物含有非磷酸盐/酯增洁剂(builder)例如柠檬酸盐。
表面活性剂-本文所述的清洁组合物可以含有表面活性剂或表面活性剂系统，其中表面活性剂可以选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂或其混合物。表面活性剂通常以约0.1重量％至约60重量％、约1重量％至约50重量％或约5重量％至约40重量％所述清洁组合物的水平存在。
增洁剂-本文所述的清洁组合物可以含有一种或多种去污剂增洁剂或增洁剂系统。当使用增洁剂时，清洁组合物通常含有清洁组合物的至少约1重量％、约3重量％至约60重量％或约5重量％至约40重量％的增洁剂。
增洁剂包括但不限于碱金属、多聚磷酸盐的铵盐和烷醇铵盐、碱金属硅酸盐、碱土和碱金属碳酸盐、铝硅酸盐增洁剂、聚羟酸盐化合物、etherhydroxypolycarboxylate、马来酸酐和乙烯或乙烯甲基醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸、和羧甲基羟丁二酸(carboxymethyloxysuccinic acid)、各种碱金属、聚乙酸(例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)的铵盐和取代铵盐、以及聚羧酸酯例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、羟丁二酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、1，3，5-苯三羧酸、羧甲基羟丁二酸，和其可溶盐。
螯合剂-本文所述的清洁组合物可以含有一种或多种螯合剂。适合的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或锰的螯合剂和其混合物。当使用螯合剂时，清洁组合物可以含有所述清洁组合物的约0.1重量％至约15重量％或约3.0重量％至约10重量％的螯合剂。
沉淀助剂-本文所述的清洁组合物可以含有一种或多种沉淀助剂。合适的沉淀助剂包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸酯、泥土释放(soil release)聚合物例如聚对苯二甲酸、粘土例如高岭石、蒙脱石、凹凸棒石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭石，和其混合物。
染料转移抑制剂-本文所述的清洁组合物可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的染料转移抑制剂聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、N-氧化聚胺聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于所述清洁组合物中时，染料转移抑制剂可以以清洁组合物的约0.0001重量％至约10重量％、约0.01重量％至约5重量％或约0.1重量％至约3重量％的水平存在。
分散剂-本文所述清洁组合物可以含有一种或多种分散剂。合适的水溶性有机物质包括同聚酸或共聚酸或其盐，其中多聚羧酸包含至少2个相隔不超过2个碳原子的羧基。
酶稳定剂-去污剂中使用的酶可以通过各种技术稳定。本文应用的酶可以通过在完成的组合物中的水溶性钙和/或镁离子源的存在而稳定，所述组合物向酶提供这样的离子。
催化金属复合物-本文所述的清洁组合物可以包括一种或多种催化金属复合物。一类包含金属的漂白催化剂是催化系统，包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子，具有很少或没有漂白催化活性的辅助金属阳离子例如锌或铝阳离子，和对催化和辅助金属阳离子具有确定的稳定常数的螯合剂，具体的是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)和其水溶性盐。这些催化剂在美国专利号4,430,243中公开。本文中有用的含锰催化剂在例如美国专利号5,576,282中是已知的且有描述。本文中有用的钴漂白催化剂在例如美国专利号5,597,936和5,595,967中是已知的且有描述。这样的钴催化剂通过已知的方法制备，如例如美国专利号5,597,936和美国5,595,967中所教导。
在一些实施方案中，本文提供的组合物还适当包括大多环(macropolycyclic)刚性配体(即“MRL”)的过渡金属复合物。实际上，不为限制，本文的组合物和清洁方法是可调整的，以提供相当于至少亿分之一的水性洗涤介质中的活性MRL族，优选的提供从约0.005ppm至约25ppm，更优选的从约0.05ppm至约10ppm，和最优选的从约0.1ppm至约5ppm洗涤液中的MRL。合适的过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括锰、铁和铬。在一个具体实施方案中，MRL是桥连的超刚性配体，如5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂二环[6.6.2]十六烷。合适的过渡金属MRL可以通过已知的方法容易地制备，如例如PCT申请号WO 00/332601和美国专利号6,225,464中所教导。
本文公开的清洁组合物可以用于洗涤表面或织物上的部位。一般的，至少一部分该部位与不掺水形式的或稀释在洗涤液中的本清洁组合物的实施方案接触，之后任选的洗涤和/或漂洗该部位。为了本发明的目的，“洗涤”包括但不局限于擦洗和机械搅动。织物可以包括大多数在正常用户使用条件下能够被洗涤的任何织物。公开的清洁组合物在溶液中一般以从约500ppm至约15,000ppm的浓度应用。当洗涤溶剂为水时，水温范围一般从约5℃至约90℃，当该部位包含织物时，水和织物的质量比率一般从约1∶1至约30∶1。
纺织加工组合物
在一些具体实施方案中，将本文所述的含酶颗粒或液体制剂掺入纺织加工组合物中。适于包括在纺织加工组合物中的酶包括但不限于纤维素酶、过水解酶、聚酯酶(polyesterases)、淀粉酶、过氧化氢酶、果胶酶和漆酶、在一些具体实施方案中，纺织加工组合物还可以包括抗再沉淀剂(例如Repel-O-Tex，Sorez 100(ISP Corp.))。
动物饲料组合物
在一些具体实施方案中，将本文所述的含酶颗粒或液体制剂掺入动物饲料组合物中。适于包括在饲料组合物中的酶包括分解纤维素的和/或分解半纤维素的酶。适于掺入饲料组合物中的酶的非限制性例子包括植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、脂酶、转移酶、纤维素酶、磷脂酶、木质素酶和β-葡聚糖酶。
下列实施例是为了说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1
使用常规回收方法从含有部分沉淀的酶的发酵液中制备酶浓缩物和颗 粒制剂
制备细菌裂解液
使用本领域中熟知的技术发酵PCT申请号WO08/112459中所述的重组表达α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。发酵后，发酵液含有沉淀的酶。将发酵液样品在10,000rpm离心5分钟。获得的上清液含有离心前全发酵液中测定的总酶活性的10％。90％的酶是不溶解的。如美国专利申请号12/041,917中所述测定α-淀粉酶的活性。
为了细胞裂解，将发酵液温度调整至40℃并加入0.01％(w/w)的溶菌酶。将发酵液保持48小时，然后用0.6倍的水稀释，并立即用4％(w/w)阳离子聚合物(C581，来自Cytec Industries，Inc.)絮凝。将硅藻土以4％(w/w)(FW12，来自World Minerals)加入絮凝的发酵液中并通过装有HR9000过滤垫(涂布了FW12硅藻土饼)的封闭端真空过滤器过滤。细胞分离后滤液中的酶产率为6％。
澄清的滤液用装有10K截留分子量(MWCO)的聚醚砜(PES)卷式膜(KOCH膜系统)的超滤器浓缩。最终浓缩物含有11.5g/l或l.15％(w/v)活性α-淀粉酶和27.04％(w/w)的干固体物质。
该方法的总产率是整个发酵液中起始酶活性的5％，且纯度是4.3％(活性干固体/总干固体)。
颗粒制剂
如下从酶浓缩物中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的513g硫酸钠结晶(Saltec)载入Vector F1-1流化床涂布机并流化。向其中，将含有11.5g/L活性淀粉酶、1.6％滑石(Nytal 400)、0.5％聚乙烯醇(Erkol5/88)、1.0％消泡剂(来自Emerald Performance Materials的Foamblast882)和1.6％玉米淀粉(Cargill Foods)的2026g溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    3.6gpm(g/分钟)，在1.5小时内增加至13.6gpm。
                剩余的实验保持在13.6gpm。
入口温度        69℃，30分钟后增加至72℃
出口温度        在43.9℃和46.2℃之间
流化气流        在76.0cfm(立方英尺/分钟)和81.4cfm之间
雾化气压        30psi(磅/平方英寸)，在1.5小时内增加至40psi。
收集1043g产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的1043g酶载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有333g硫酸钠(占颗粒组合物的20％)的1667g水溶液喷涂在酶颗粒上。
喷涂参数如下：
溶液喷射速率    8.3gpm(g/分钟)，在15分钟内增加至19.2gpm。
                剩余的实验保持在19.2gpm。
入口温度        63℃，15分钟后增加至80℃
出口温度        在44.2℃和47.8℃之间
流化气流        在79.5cfm(立方英尺/分钟)和82.6cfm之间
雾化气压        40psi
收集1363g产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的1363g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有83g(占颗粒组合物的5％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)，83g(占颗粒组合物5％)二氧化钛(R902，来自DuPont)和25g(颗粒组合物的1.5％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的1065g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    4.2gpm(g/分钟)，在30分钟内增加至12.2gpm。
                剩余的实验保持在12.2gpm。
入口温度        75℃，30分钟后增加至78℃
出口温度        在46.0℃和52.4℃之间
流化气流        在78.4cfm(立方英尺/分钟)和81.2cfm之间
雾化气压        40psi
收集1487g最终产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是1.66mg/垫。
实施例2
通过溶解沉淀然后通过常规回收方法从含有部分沉淀的酶的发酵液中 制备酶浓缩物和颗粒制剂
酶浓缩物的制备
使用本领域中熟知的技术发酵PCT申请号WO08/112459中所述的重组表达α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。发酵后，发酵液含有沉淀的酶。将发酵液样品在10,000rpm离心5分钟。获得的上清液含有离心前全发酵液中测定的总酶活性的5％。95％的酶是不溶解的。
为了细胞裂解，将发酵液温度调整至40℃并加入0.01％(w/w)的溶菌酶。将发酵液保持1.5小时。然后将温度增加至60℃并在60℃保持1小时。然后用1倍的水稀释发酵液。
沉淀的酶在加热步骤和稀释后保持不溶解。然后在细胞分离前，通过轻柔混合将裂解液与5％(w/w)葡萄糖和3％(w/w)NaCl在pH 9室温孵育28小时。大部分沉淀的α-淀粉酶活性(84％)被溶解。
然后用4％(w/w)阳离子聚合物(C581，来自Cytec Industries，Inc.)絮凝裂解液。将硅藻土(FW12，来自World Minerals)以4％(w/w)加入絮凝的发酵液中并通过预先涂布了FW12硅藻土饼的旋转真空滚筒过滤器过滤。细胞分离后滤液中的酶产率为87％。
用装有10K MWCO PES卷式膜(KOCH膜系统)的超滤器浓缩澄清的滤液。最终的浓缩物含有60g/l或6％(w/v)活性α-淀粉酶和27％(w/w)干固体物质。
该方法的总产率是全发酵液中起始酶活性的84％且纯度是22％(活性干固体/总干固体)。但是，所述浓缩物含有葡萄糖和NaCl。去除这些物质将不利地影响该方法的成本。
颗粒制剂
如下从酶浓缩物中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为200μm至600μm的478g蔗糖结晶载入Vector F1-1流化床涂布机并流化。向其中，将含有60.0g/L活性淀粉酶、115g(颗粒组合物的9.8％)的玉米淀粉(Cargill Foods)的628g溶液喷涂在蔗糖结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    2.9gpm(g/分钟)，在52分钟内增加至17.3gpm。
                剩余的实验保持在20.2gpm。
入口温度        对于喷雾器1在71℃和74℃之间
出口温度        在44.7℃和48.5℃之间
流化气流        在83.5cfm(立方英尺/分钟)和87.2cfm之间
雾化气压        32psi(磅/平方英寸)，在52分钟内增加至40psi。
收集700g产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的700g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有120g(占颗粒组合物的10.2％)蔗糖(C&HSugars)、120g(颗粒组合物的10.2％)玉米淀粉(Cargill Foods)、72g(占颗粒组合物的6.1％)二氧化钛(R902DuPont)和15g(占颗粒组合物的1.3％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的1308g水溶液喷涂在酶颗粒上。
喷涂参数如下：
溶液喷射速率    12.2gpm(g/分钟)，在10分钟内增加至20.2gpm。
                剩余的实验保持在20.2gpm。
入口温度    74℃，15分钟后增加至82℃
出口温度    在46.3℃和47.7℃之间
流化气流    在85.0cfm(立方英尺/分钟)和88.0cfm之间
雾化气压    在35psi和36psi之间
收集988g产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的988g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有29g(占颗粒组合物的2.5％)羟丙基甲基纤维素(HPMC E-15Dow Chemicals)和4g(占颗粒组合物的0.3％)聚乙二醇600(Electron Microscopy Sciences的Carbowax)的586g水溶液喷涂在酶颗粒上。
喷涂参数如下：
溶液喷射速率    8.1gpm(g/分钟)，在45分钟内增加至15.6gpm。
                剩余的实验保持在15.6gpm。
入口温度        在75℃和82℃之间
出口温度        在43.6℃和50.3℃之间
流化气流        在85.0cfm(立方英尺/分钟)和87.8cfm之间
雾化气压        40psi
收集1014g最终产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是2.80mg/垫。
实施例3
从来自含有部分沉淀的酶的发酵液的匀浆细胞裂解液中制备酶浓缩物 和颗粒制剂
匀浆的细胞裂解液的制备
使用本领域中熟知的技术发酵PCT申请号WO08/112459中所述的重组表达α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。发酵后，发酵液含有沉淀的酶。将发酵液样品在10,000rpm离心5分钟。获得的上清液含有离心前全发酵液中测定的总酶活性的6％。
如实施例2中所述进行细胞的裂解。然后将裂解液冷却至10℃并在Gaulin匀浆器中以6,000psi匀浆。酶的产率为90％，纯度为6％(活性干固体/总干固体)。
颗粒制剂
如下从匀浆的裂解液中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的17.64kg硫酸钠结晶(Saltec)载入Deseret 60流化床涂布机并流化。向其中，将含有12.53g/L活性淀粉酶、5.88kg(占颗粒组合物的5％)滑石(Nytal400)，1.18kg(占颗粒组合物1.0％)消泡剂(Foamblast 882来自EmeraldPerformance Materials)、7.06kg(占颗粒组合物的6％)玉米淀粉(Cargill Foods)和1.18kg(占颗粒组合物的1.0％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的259.41kg溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    50gpm(g/分钟)，在3小时内增加至500gpm。
                剩余的实验保持在500gpm。
入口温度        在73℃和85℃之间
出口温度        在42.7℃和55.7℃之间
流化气流        在800cfm(立方英尺/分钟)和952cfm之间
雾化气压        60psi(磅/平方英寸)，在5小时内增加至68psi。
收集65.2kg产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的65.2kg酶颗粒载入Deseret 60流化床涂布机并流化。然后将含有22.22kg硫酸钠(占颗粒组合物的20％)的111.11kg水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾过程2中在500gpm(g/分钟)至580gpm之间。
入口温度    85℃
出口温度    在48.3℃和54.1℃之间
流化气流    在1109cfm(立方英尺/分钟)和1234cfm之间
雾化气压    70psi
收集88kg产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的84.967kg酶颗粒载入Deseret 60流化床涂布机并流化。然后将含有6.12kg(占颗粒组合物5.2％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)、6.12kg(占颗粒组合物的5.2％)二氧化钛(R902，来自DuPont)、1.53kg(占颗粒组合物的1.3％)滑石(Nytal 400)和1.53kg(占颗粒组合物的1.3％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的84.97kg水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾过程3中在310gpm(g/分钟)至400gpm之间。
入口温度        85℃
出口温度        在48.8℃和56.8℃之间
流化气流        在1070cfm(立方英尺/分钟)和1238cfm之间
雾化气压        在70psi和76psi之间
收集97.6kg产物。
喷雾器4：将来自喷雾器3的97.6kg酶颗粒载入Deseret 60流化床涂布机并流化。然后将含有471g(占颗粒组合物的0.4％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的9.41kg水溶液喷涂在酶颗粒上。
喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾器4中为295gpm
入口温度        85℃
出口温度        在47.1℃和51.1℃之间
流化气流        在1126cfm(立方英尺/分钟)和1220cfm之间
雾化气压        在65psi和68psi之间
收集101.2kg产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是0.33mg/垫。
实施例4
从含有部分沉淀的酶的发酵液的匀浆的和渗滤的细胞裂解液中制备酶 浓缩物和颗粒制剂
匀浆的细胞裂解液的制备
使用本领域中熟知的技术发酵PCT申请号WO08/112459中所述的重组表达α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。发酵后，发酵液含有沉淀的酶。如实施例3中所述制备匀浆的裂解液。
用装有10K MWCO PES卷式膜(KOCH膜系统)的超滤器渗滤和浓缩匀浆的裂解液。最终的浓缩物含有11g/l或1.1％(w/v)活性α-淀粉酶和16.7％(w/w)的干固体物质。
使用城市给水渗滤匀浆的裂解液。进行了恒定体积渗滤，即通过保持含有匀浆裂解液的给料槽中的体积恒定，加入城市给水从而替换从系统中去除的渗透液体积。使用的渗滤水的总量是0.5倍的最初匀浆裂解液。将渗滤的匀浆裂解液进一步浓缩至16％(w/w)的干固体。获得的制备物的纯度9.3％(活性干固体/总干固体)。纯度比实施例3中制备的匀浆裂解液高1.25倍。
颗粒制剂
如下从匀浆的和渗滤的裂解液中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的29.606kg硫酸钠结晶(Saltec)载入Deseret 60流化床涂布机并流化。向其中，将含有14.2g/L活性淀粉酶、5.88kg(占颗粒组合物的5％)滑石(Nytal400)、1.18kg(占颗粒组合物的1.0％)消泡剂(Foamblast 882，来自Emerald Performance Materials)、11.77kg(占颗粒组合物的10％)玉米淀粉(Cargill Foods)和1.18kg(颗粒组合物的1.0％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的170.79kg溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    106gpm(g/分钟)，在5小时内增加至550gpm。
                剩余的实验保持在550gpm。
入口温度        在80℃和82.6℃之间
出口温度        在51.0℃and 60.9℃之间
流化气流        在804cfm(立方英尺/分钟)和1058cfm之间
雾化气压        65psi(磅/平方英寸)，在5小时内增加至70psi。
收集66.6kg产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的66.6kg酶颗粒载入Deseret 60流化床涂布机并流化。然后将含有22.22kg硫酸钠(占颗粒组合物的20％)的111.11kg水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾器2中在400gpm(g/分钟)至640gpm之间。
入口温度        在83.5℃和85.6℃之间
出口温度        在51.4℃和54.8℃之间
流化气流        在1097cfm(立方英尺/分钟)和1246cfm之间
雾化气压        70psi
收集93.8kg产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的93.8kg酶颗粒载入Deseret 60流化床涂布机并流化。然后将含有6.12kg(占颗粒组合物的5.2％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)、6.12kg(占颗粒组合物的5.2％)二氧化钛(R902，来自DuPont)、1.53kg(占颗粒组合物的1.3％)滑石(Nytal 400)和1.53kg(占颗粒组合物的1.3％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的84.97kg水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾器3中在200gpm(g/分钟)至410gpm之间。
入口温度        在79.6℃和83.9℃之间
出口温度        在55.9℃和59.6℃之间
流化气流        在1121cfm(立方英尺/分钟)和1244cfm之间
雾化气压        在70ps i和75ps i之间
收集108.4kg产物。
喷雾器4：将来自喷雾器3的108.4kg酶颗粒载入Deseret 60流化床涂布机并流化。然后将含有471g(占颗粒组合物的0.4％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的9.41kg水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾器4中为250gpm
入口温度    在82.7℃和82.9℃之间
出口温度    在57.4℃和59.7℃之间
流化气流    在1157cfm(立方英尺/分钟)和1299cfm之间
雾化气压    70psi
收集110.0kg产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是0.15mg/垫。
实施例5
从含有部分沉淀的酶的发酵液的渗滤细胞裂解液中制备酶浓缩物和颗 粒制剂
渗滤细胞裂解液的制备
使用本领域中熟知的技术发酵PCT申请号WO08/112459中所述的重组表达α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。发酵后，发酵液含有沉淀的酶。如实施例2中所述裂解细胞。使用城市给水如实施例4中所述渗滤裂解液。将渗滤的裂解液进一步浓缩至18.2％(w/w)干固体。获得的制备物的纯度为17％(活性干固体/总干固体)。所述纯度比实施例3中制备的匀浆裂解液的高1.7倍。
实施例6
从含有部分沉淀的酶的发酵液的渗滤细胞裂解液中制备酶浓缩物和颗 粒制剂
渗滤的细胞裂解液的制备
如实施例1中所述发酵PCT申请号WO08/112459中所述的重组表达α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌。如实施例5渗滤并浓缩裂解液。获得的制备物具有2.14％的酶活性且干固体是17.2％。
颗粒制剂
如下从渗滤的裂解液中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的691g硫酸钠结晶(Saltec)载入Vector F1-1流化床涂布机并流化。向其中，将含有23.41g/L活性淀粉酶、5％滑石(Nytal 400)、1.0％消泡剂(Foamblast882，来自Emerald Performance Materials)和5％玉米淀粉(Cargill Foods)的1470g溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    2.6gpm(g/分钟)，在1.5小时内增加至14.1gpm。
入口温度        69℃，30分钟后增加至72℃
出口温度        在44.9℃和45.8℃之间
流化气流        在78.6cfm(立方英尺/分钟)和80.8cfm之间
雾化气压        30psi(磅/平方英寸)，在1.5小时内增加至40psi。
收集1050g产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的1050g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有333g硫酸钠(占颗粒组合物的20％)的1667g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在15.6gpm(g/分钟)和17.4gpm之间。
入口温度        在78℃和82℃之间
出口温度        在46.0℃和47.5℃之间
流化气流        在78.6cfm(立方英尺/分钟)和82.0cfm之间
雾化气压        40psi
收集1352g产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的1352g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有88g(占颗粒组合物的5％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)、88g(占颗粒组合物的5％)二氧化钛(R902，来自DuPont)和26g(占颗粒组合物的1.5％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的1127g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    3.2gpm(g/分钟)，在60分钟内增加至10.2gpm。
                剩余的实验保持在10.2gpm。
入口温度        75℃，10分钟后增加至80℃
出口温度        在52.0℃和53.7℃之间
流化气流    在82.5cfm(立方英尺/分钟)和83.1cfm之间
雾化气压    40psi
收集1535g最终产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是1.50mg/垫。
实施例7
制备具可溶酶的细菌发酵液浓缩物和颗粒制剂
酶浓缩物的制备
使用本领域熟知的技术发酵表达枯草杆菌蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。发酵后，发酵液含有大部分是可溶的枯草杆菌蛋白酶。将发酵液在10,000rpm离心5分钟。获得的上清液含有与全发酵液样品中活性相同的活性。将发酵液调整至pH5.8±0.2，用1.5+0.2倍的城市给水稀释并立即用8％C311(Kemira)絮凝。将絮凝的发酵液通过预先涂布了硅藻土(FW12，来自World Minerals)的旋转真空滚筒过滤器过滤。用装有10K MWCO PES卷式膜(KOCH膜系统)的超滤器浓缩澄清的滤液。最终的浓缩物含有57.23g/L和19.1％(w/w)干固体物质。如通过酶浓缩物的上清液(14,000rpm，4min)活性测定的，酶浓缩物中枯草杆菌蛋白酶活性在颗粒化前保持可溶，其与全酶浓缩物的活性相同。
颗粒制剂
如下从超滤浓缩物中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的643g硫酸钠结晶(Saltec)载入Vector F1-1流化床涂布机并流化。向其中，将含有活性蛋白酶、0.7％滑石(Nytal 400)、0.9％消泡剂(Foamblast 882，来自Emerald Performance Materials)和0.5％聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)的593g溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    3.5gpm(g/分钟)，在1.5小时内增加至9.0gpm。
入口温度        57℃，1小时15分钟后增加至86℃
出口温度        在45.2℃和48.9℃之间
流化气流        在72.4cfm(立方英尺/分钟)和83.6cfm之间
雾化气压        30psi(磅/平方英寸)，在30分钟内增加至37psi。
收集769g产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的769g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有400g硫酸钠(占颗粒组合物的27.7％)的2001g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在10gpm(g/分钟)至17.5gpm之间
入口温度        在73℃和76℃之间
出口温度        在44.6℃和45.7℃之间
流化气流        在79.7cfm(立方英尺/分钟)和81.4cfm之间
雾化气压        40psi
收集1178g产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的1178g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有78g(占颗粒组合物的5.4％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)、78g(占颗粒组合物的5.4％)二氧化钛(R902，来自DuPont)、20g(占颗粒组合物的1.35％)滑石(Nytal 400)和20g(占颗粒组合物的1.35％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的1127g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    5.2gpm(g/分钟)，在30分钟内增加至12.2gpm。
                剩余的实验保持在12.2gpm。
入口温度        70℃，15分钟后增加至76℃
出口温度        在51.0℃和52.5之间
流化气流        在80.7cfm(立方英尺/分钟)和84.2cfm之间
雾化气压        在40psi和42psi之间
收集1356g产物。
喷雾器4：将来自喷雾器3的1356g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有3g(占颗粒组合物的0.22％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的67.0g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾器4中为17.0gpm
入口温度        76℃
出口温度        在44.0℃和46.5℃之间
流化气流        在80.8cfm(立方英尺/分钟)和81.7cfm之间
收集1359g最终产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是1.03mg/垫。
实施例8
制备具沉淀物的酶浓缩物和颗粒制剂
用沉淀的酶制备酶浓缩物
在实施例7中的超滤后将硫酸钠以12％(w/v)的浓度加入最终的酶浓缩物中以诱导沉淀。将带有硫酸钠的浓缩物在10℃混合18小时。获得的浆液用于颗粒化。
颗粒制剂
如下从含有沉淀的酶的酶浓缩物中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的500硫酸钠结晶(Saltec)载入Vector F1-1流化床涂布机并流化。向其中，将含有活性蛋白酶、0.7％滑石(Nytal 400)、0.9％消泡剂(Foamblast 882，来自Emerald Performance Materials)和0.5％聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)的999g溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    4.5gpm(g/分钟)，在30分钟内增加至10.6gpm。
入口温度        在69.0℃和74.0℃之间
出口温度        在44.5℃和47.1℃之间
流化气流        在79.8cfm(立方英尺/分钟)和82.2cfm之间
雾化气压        31psi(磅/平方英寸)，在60分钟内增加至40psi。
收集705g产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的705g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有369g硫酸钠(占颗粒组合物的27.7％)的1847g水溶液喷涂在酶颗粒上。
喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在15.2gpm(g/分钟)至18.2gpm之间
入口温度        在70℃和78℃之间
出口温度        在42.9℃和45.1℃之间
流化气流        在80.2cfm(立方英尺/分钟)和81.2cfm之间
雾化气压        40psi
收集1061g产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的1061g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有72g(占颗粒组合物的5.4％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)、72g(占颗粒组合物的5.4％)二氧化钛(R902，来自DuPont)、18g(占颗粒组合物的1.35％)滑石(Nytal 400)和18g(占颗粒组合物的1.35％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的1000g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    3.8gpm(g/分钟)，在60分钟内增加至9.9gpm。
                剩余的实验保持在9.9gpm。
入口温度        72℃，15分钟后增加至84℃
出口温度        在51.4℃和52.9℃之间
流化气流        在80.4cfm(立方英尺/分钟)和82.3cfm之间
雾化气压        在40psi和42psi之间
收集1226g产物。
喷雾器4：将来自喷雾器3的1226g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有3g(占颗粒组合物的0.22％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的62.0g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾器4中为17.0gpm
入口温度        69℃
出口温度        在41.4℃和42.3℃之间
流化气流        在80.8cfm(立方英尺/分钟)和80.5cfm之间
收集1228g最终产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是2.5mg/垫。
实施例9
制备具酶沉淀物的裂解的细菌发酵液和颗粒制剂
制备具沉淀的酶的细菌的发酵液裂解液
使用本领域熟知的技术发酵实施例7中所述的表达枯草杆菌蛋白酶的枯草芽孢杆菌。发酵后，发酵液含有大部分是可溶的枯草杆菌蛋白酶。将溶菌酶以1％的浓度加入发酵液中并在37℃保持3小时。获得的含有可溶和不溶解酶的裂解液含有57g/mL活性和18.23％干固体。
颗粒制剂
如下从具有沉淀的酶的裂解液中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的585g硫酸钠结晶(Saltec)载入Vector F1-1流化床涂布机并流化。向其中，将含有活性蛋白酶、0.7％滑石(Nytal 400)、0.9％消泡剂(Foamblast 882，来自Emerald Performance Materials)和0.5％聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)的993g溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率  4.5gpm(g/分钟)，在2小时内增加至12.5gpm。
入口温度      在63℃和70℃之间
出口温度      在43.0℃和47.5℃之间
流化气流      在79.8cfm(立方英尺/分钟)和81.1cfm之间
雾化气压      31psi(磅/平方英寸)，在30分钟内增加至38psi。
收集785g产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的785g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有400g硫酸钠(占颗粒组合物的27.7％)的2001g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在15.2gpm(g/分钟)至21.1gpm之间
入口温度    在65℃和78℃之间
出口温度    在44.1℃和45.6℃之间
流化气流    在78.5cfm(立方英尺/分钟)和81.6cfm之间
雾化气压    在39psi和40psi之间
收集1168g产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的1168g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有78g(占颗粒组合物的5.4％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)、78g(占颗粒组合物的5.4％)二氧化钛(R902，来自DuPont)、20g(占颗粒组合物的1.35％)滑石(Nytal 400)和20g(占颗粒组合物的1.35％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的1083g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    3.0gpm(g/分钟)，在60分钟内增加至8.0gpm。
                剩余的实验保持在8.0gpm。
入口温度        73℃，30分钟后增加至78℃
出口温度        在52.0℃和52.9℃之间
流化气流        在80.3cfm(立方英尺/分钟)和83.7cfm之间
雾化气压        在40psi和42psi之间
收集1347g产物。
喷雾器4：将来自喷雾器3的1347酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有3g(占颗粒组合物的0.22％)Neodol(23-6.5，来自Shell Chemicals)的67.0g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在整个喷雾器4中为12.6gpm
入口温度        63℃
出口温度        在41.1℃和44.1℃之间
流化气流        在80.9cfm(立方英尺/分钟)和81.5cfm之间
收集1349g最终产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是1.4mg/垫。
实施例10
制备具可溶的酶的真菌发酵液浓缩物和颗粒制剂
制备具可溶的酶的浓缩的真菌发酵液
使用本领域熟知的技术发酵表达葡萄糖淀粉酶的瑞氏木霉(Trichoderma reseei)。发酵后，发酵液含有大部分是可溶的葡萄糖淀粉酶。葡萄糖淀粉酶的活性如美国专利号7,262,041中所述测定。如美国专利申请号2007/0246406中所述通过微量过滤去除细胞。使用10K MWCO PES卷式膜将澄清的发酵液浓缩10倍。将酶的浓缩物储存于10℃直到准备使用。在储存时，形成沉淀。通过离心(10,000g，20min，10℃)去除沉淀。获得的清澈上清液用于制备下面所述的颗粒组合物。
颗粒制剂
如下从真菌发酵液中的可溶的酶制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的466g硫酸钠结晶(Saltec)载入Vector F1-1流化床涂布机并流化。向其中，将含有活性淀粉酶、5％玉米淀粉(Cargill Foods)和1％聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)的512g溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    8.2gpm(g/分钟)，在15分钟内增加至10.1gpm。剩余的实验保持在10.1gpm。
入口温度        在71℃和77℃之间
出口温度        在46.7℃和49.1℃之间
流化气流        在75.3cfm(立方英尺/分钟)和80.7cfm之间
雾化气压        31psi(磅/平方英寸)，在45分钟内增加至41psi。
收集615g产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的615g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有533g硫酸钠(占颗粒组合物的40％)的2667g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在15.4gpm(g/分钟)至18.5gpm之间
入口温度        在72℃和78℃之间
出口温度    在43.8℃和45.7℃之间
流化气流    在80.0cfm(立方英尺/分钟)和81.8cfm之间
雾化气压    38psi
收集1113g产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的1113g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有40g(占颗粒组合物的3％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)、80g(占颗粒组合物的6％)滑石(Nytal 400)的667g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    4.6gpm(g/分钟)，在60分钟内增加至11.0gpm。
入口温度        68℃，10分钟后增加至82℃
出口温度        在44.2℃和52.4℃之间
流化气流        在82.3cfm(立方英尺/分钟)和83.5cfm之间
雾化气压        40psi
收集1221g终产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是1.66mg/垫。
实施例11
制备具酶沉淀物的真菌发酵液和颗粒制剂
使用本领域熟知的技术发酵如实施例10中所述的表达葡萄糖淀粉酶的瑞氏木霉。发酵后，发酵液含有大部分可溶的葡萄糖淀粉酶。如美国专利号5,801,034中所述不裂解而杀死细胞。将离心实施例10的酶浓缩物获得的沉淀加入带有被杀死的细胞的发酵液中。获得的发酵液含有可溶的和不溶解的酶。含酶发酵液显示447U/mL活性和19.7％(w/w)干固体。通过测定整个样品和上清液(14,000rpm，5分钟)的活性测定存在的沉淀物的量。数据总结于下表1。90％的活性存在于上清液中(作为可溶的酶)，10％以沉淀形式存在。
表1
重量    活性        总活性
(g)     (GAU/ml)    (x103GAU)
发酵液+沉淀    200    447.2    89.440
上清液         181    445.9    80.708
颗粒制剂
如下从含有沉淀的酶的真菌发酵液中制备颗粒组合物。
喷雾器1：将具有颗粒直径大小范围为150μm至350μm的472g硫酸钠结晶(Saltec)载入Vector F1-1流化床涂布机并流化。向其中，将含有活性淀粉酶、5％玉米淀粉(Cargill Foods)和1％聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)的494g溶液喷涂在硫酸钠结晶上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    8.2gpm(g/分钟)，在10分钟内增加至10.8gpm。剩余的实验保持在10.8gpm。
入口温度        在68℃和71℃之间
出口温度        在44.7℃和46.5℃之间
流化气流        在78.5cfm(立方英尺/分钟)和79.4cfm之间
雾化气压        33psi(磅/平方英寸)，在20分钟内增加至40psi。
收集612g产物。
喷雾器2：将来自喷雾器1的612g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有533g硫酸钠(占颗粒组合物的40％)的2667g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    在17.2gpm(g/分钟)至23.4gpm之间
入口温度        在74℃和82℃之间
出口温度        在44.6℃和45.5℃之间
流化气流        在81.2cfm(立方英尺/分钟)和81.9cfm之间
雾化气压        38psi
收集1081g产物。
喷雾器3：将来自喷雾器2的1081g酶颗粒载入Vector FL-1流化床涂布机并流化。然后将含有40g(占颗粒组合物的3％)聚乙烯醇(5/88，来自Erkol)、80g(占颗粒组合物的6％)滑石(Nytal 400)的667g水溶液喷涂在酶颗粒上。喷涂参数如下：
溶液喷射速率    7.2gpm(g/分钟)，在60分钟内增加至10.8gpm。
入口温度        78℃，在60分钟内增加至81℃
出口温度        在52.7℃和53.1℃之间
流化气流        在83.2cfm(立方英尺/分钟)和83.6cfm之间
雾化气压        41psi
收集1190g最终产物。
使用Heubach磨损试验分析颗粒的粉尘。颗粒的粉尘水平是7.9mg/垫。
实施例12
从含有细胞成分和不溶解酶的浓缩物中制备的颗粒在去污剂中的酶稳 定性
在各种去污剂基料中评估如实施例4中所述制备的酶颗粒的稳定性：Calgonite 5-1、具有柠檬酸盐的WFK、具有磷酸盐的WFK，及Somat(Henkel)。WFK去污剂基料可以从wfk Testgewebe GmbH(www.testgewebe.de)获得。去污剂中的酶颗粒(2％w/w)在22℃保存在封闭的容器中。在储存后的0时间、5周、2个月和4个月测定残余的酶活性。数据总结在下面的表2中。
表2
去污剂中酶颗粒的稳定性
去污剂基料         第0天    5周      2个月   4个月
Calgonite 5-1      100％    98％     93％    96％
具有柠檬酸盐的WFK  100％    100％    94％    96％
具有磷酸盐的WFK    100％    100％    96％    100％
Somat              100％    89％     89％    98％
实施例13
从含有细胞成分和不溶解酶的浓缩物中制备的颗粒的应用性能
评估，如实施例4中所述制备的酶颗粒在储存于含有漂白去污剂基料的IEC A*中之前和之后的洗涤性能。在37℃/70％相对湿度(RH)在开放杯子中储存样品1周。使用各种污迹进行新鲜颗粒和新鲜去污剂和在去污剂中储存1周的颗粒的应用测试：CS-26(棉织品上的玉米淀粉)、CS-27(棉织品上的马铃薯淀粉)，CS-28(棉织品上的大米淀粉)、CS-29(棉织品上的木薯淀粉)和EMPA-161(棉织品上的淀粉)。
洗涤测试
在Miele Novotronic W822洗衣机中进行洗涤测试：程序“正常”/“棉织品”，温度40℃，水的硬度8.5GH。去污剂：有漂白剂的IEC A*：剂量8g/L(＝136g/次洗涤)，包括0.15g Purafect 4000E(可以从DaniscoUS Inc.的Genencor分部获得)和0.139g实施例4颗粒。
性能测定
用Minolta CR300比色计进行测定：CIELAB L*ab数值范围，D65标准照明，无UV滤片，白色背景。使用下面的公式计算污物的去除(SR)：
Figure BPA00001275952600591
其中
ΔE＝sqrt((ΔL*)2+(Δa)2+(Δb)2)
图1显示实施例4颗粒的测试性能在储存后保持不变。
实施例14
从含有细胞成分和不溶解酶的浓缩物中制备的颗粒在储存过程中的酶 稳定性
评估如实施例7-9中所述制备的酶颗粒的储存稳定性。使用的条件是37℃，70％相对湿度的腔室中，样品放置在开放的容器中。基于最初的活性测定并计算残余的活性。数据总结在下面的表3中。
表3
Figure BPA00001275952600601
实施例15
实施例1-5中所述回收方法的性质比较
如上面实施例1-5中所述回收的α-淀粉酶的活性和纯度显示在表4中。酶的纯度通过用酶活性除以干固体的总量而计算。
表4
酶裂解液浓缩物的性质
实施例16
从含有细胞成分和不溶解酶的浓缩物中制备的颗粒在储存于带有漂白 剂的去污剂基料过程中的酶稳定性
评估如实施例1、2、4和6中所述制备的酶颗粒在带有漂白剂粉末的去污剂基料IEC A*中的储藏稳定性。IEC A*粉末去污剂购自WFK且不含漂白剂。加入下列的漂白系统：3％TEAD和20％过硼酸盐.2H2O。使用的储存条件为37℃，70％相对湿度的腔室中，样品放置在开放的聚丙烯容器中。基于最初的活性测定并计算残余的活性。数据显示在图2中。
实施例17
从含有酶结晶的发酵液中制备澄清的酶溶液
所有的操作在室温进行。
起始材料
在本领域中已知的标准条件下(例如见美国专利号7,429,476)发酵经改造而表达天冬氨酸蛋白酶的瑞氏木霉。收获时发酵液的pH是4.62且酶形成了大的结晶，总活性的98％在离心物中。
过滤1-回收蛋白酶结晶
将521g收获的发酵液在带有63g硅藻土过滤助剂Celatom FW-6的烧杯中混合。将302g混合物通过0.45μm的尼龙膜过滤器(Nalgene154-0045)过滤。回收155g滤液和146g滤饼。98％的酶活性保留在滤饼中，弃去滤液。
结晶溶解
将131g来自先前步骤的滤饼转移至烧杯中并用87g的50mM硫酸混合。在室温放置45分钟后，混合物具有3.2的pH，且显微镜证实所有的蛋白酶结晶得到溶解。
过滤2-蛋白酶溶液的澄清
将来自先前步骤的184g结晶溶解混合物在过滤1中使用的相同类型的过滤器上进行过滤。当饼的表面变干时，通过追加50g的水将滤液从沉积的固体上移走。收集154g滤液并弃去80g的滤饼。澄清的滤液含有88％的起始酶活性，其滴度比起始发酵液的高16％。
实施例18
澄清的酶制剂的制备
起始材料：细菌发酵液
使用本领域熟知的技术发酵重组表达α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌。发酵后，使用0.01％(w/w)的溶菌酶2小时，然后在60℃热处理2小时将发酵液裂解。
18.1从含有可溶的酶的发酵液中制备(常规回收)
将5g起始材料在14,000rpm离心10分钟从而将固相从液相中分离。上清液含有88％的酶活性。对干固体的纯度为6％。对总蛋白质的纯度为14％。
18.2从含有不溶解酶的发酵液中制备
裂解液中α-淀粉酶的结晶
使用40g起始材料。使用20％的醋酸将裂解液的pH调整至5。将pH调整过后的产物在摇动器上孵育：50℃，80rpm摇动。
离心#1-α-淀粉酶结晶和细胞碎片的回收
孵育44小时后，将5g裂解液在14,000rpm离心10分钟从而将固相从液相中分离。
α-淀粉酶结晶的溶解
将回收的固体重悬于自来水中从而达到5g的原始裂解液重量。将3g丙二醇加入悬浮液中。使用5％NaOH将pH调整至6.5并通过在室温颠倒18小时混合。然后将混合物在40℃孵育2小时。
离心#2-淀粉酶溶液的澄清
将结晶溶解混合物在14,000rpm离心10分钟从而将固相从液相中分离。使用0.45μm注射器过滤器进一步将获得的离心机滤液(centrate)(液体上清液)澄清。清澈的淀粉酶溶液含有85％在用于结晶的起始裂解液中发现的活性。对干固体的纯度为42％。对总蛋白质的纯度为34％。
18.3使用絮凝从含有不溶解酶的发酵液中制备
絮凝
将10g/L C581阳离子聚合物加入含有来自实施例18.2的溶解的α-淀粉酶结晶的5g裂解液中，然后通过手工颠倒10次轻柔混合。
离心#2-淀粉酶溶液的澄清
将絮凝的结晶溶解混合物在14,000rpm离心10分钟从而将固相从液相中分离。清澈的浓缩液含有85％用于结晶的起始裂解液中发现的活性。对总蛋白质的纯度为39％。
如实施例18.1、18.2和18.3中所述回收的α-淀粉酶溶液的纯度显示在表5中。酶的纯度通过将酶活性除以干固体的总量或通过除以总蛋白质的浓度而计算。
表5：澄清的酶溶液的性质
Figure BPA00001275952600631
*不包括丙二醇的贡献
                                             
虽然为了理解清楚的目的，已经通过举例说明和实施例的方式描述了上述发明，对本领域技术人员显而易见的是：无需背离本发明的精神和范围可以实施某些改变和修改。因此，所述描述不应该被理解为是限制本发明的范围。
据此通过参考将本文引用的所有的公开物、专利和专利申请以其全部以如同每个单独的公开物、专利或专利申请被特别地和单独地指出是如此通过参考并入的所有目的和相同程度并入本文。

Claims (53)

1.一种用于从含有微生物细胞和/或来自微生物细胞的细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶的方法，所述方法包括从微生物发酵液中回收不溶解酶而不去除微生物细胞和/或细胞碎片，从而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物发酵液通过选自下列的方法制备：
将酶与含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液混合，其中所述的酶不是所述微生物细胞产生的，且其中所述的酶在所述的微生物发酵液中是不溶解的，或者其中所述的酶在所述微生物发酵液中是可溶的，且所述方法另外包括通过加入沉淀剂使得至少一些所述的酶不溶解；
将沉淀剂加入含有所述微生物细胞表达的可溶的酶的微生物发酵液中，因而引起至少一些酶变得不溶解；和
在发酵培养基中的微生物细胞中表达酶，其中至少一些酶在发酵培养基中是不溶解的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述回收包括至少一种选自发酵液预处理、细胞裂解、匀浆化、渗滤和固体-液体分离的回收操作，
其中当所述回收包括两种或两种以上进行的所述回收操作时，所述回收操作可以以任何顺序进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述回收包括从微生物发酵液中去除至少部分液相。
5.根据权利要求4所述的方法，其中从微生物发酵液中去除至少部分液相的操作包括浓缩微生物发酵液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中浓缩微生物发酵液包括选自超滤、微量过滤、反向渗透和纳米过滤的膜过滤方法。
7.根据权利要求4所述的方法，其中从微生物发酵液中去除至少部分液相包括选自旋转真空过滤、板框过滤、带过滤、离心、旋风分离、滗析或蒸发的方法。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述不溶解酶通过将沉淀剂加入含有可溶的酶的微生物发酵液中，因而使得至少一些酶在微生物发酵液中不溶解而制备，其中沉淀剂选自调整pH、调整温度、加入盐、加入酸、加入碱、加入至少一种其它的蛋白质，加入缓冲液或加入聚合电解质或其组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中包含回收的不溶解酶的该组合物含有完整微生物细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中完整的微生物细胞是活的微生物细胞。
11.根据权利要求9所述的方法，其中完整的微生物细胞是死的微生物细胞。
12.根据权利要求1所述的方法，其中含有微生物细胞和/或细胞碎片的所述微生物发酵液含有微生物细胞裂解液，其中所述微生物细胞裂解液通过破坏微生物细胞膜制备。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法另外包括破坏完整微生物细胞的微生物细胞膜，从而制备含有回收的不溶解酶的微生物细胞裂解液。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中破坏微生物细胞膜包括将微生物细胞与能够裂解微生物细胞的酶接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述能够裂解微生物细胞的酶是溶菌酶。
16.根据权利要求12或13任一项所述的方法，其中破坏微生物细胞膜包括选自匀浆化、高剪切混合、压力挤压或高剪切泵送的机械剪切方法。
17.根据权利要求12或13任一项所述的方法，另外包括将微生物细胞裂解液匀浆，从而制备匀浆的微生物细胞裂解液。
18.根据权利要求17所述的方法，另外包括渗滤微生物细胞裂解液。
19.根据权利要求1所述的方法，其中微生物细胞是细菌细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中细菌细胞是芽孢杆菌细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌的细胞。
22.根据权利要求1所述的方法，其中微生物细胞是真菌细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中真菌细胞是木霉属细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中木霉属细胞是瑞氏木霉的细胞。
25.根据权利要求1所述的方法，其中至少约10％的酶在微生物发酵液中是不溶解的。
26.根据权利要求1所述的方法，其中与所述回收前不溶解酶的纯度相比，不溶解酶的纯度增加至少约10％。
27.根据权利要求1所述的方法制备的组合物，其中所述组合物含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。
28.根据权利要求27所述的组合物，另外含有至少一种制剂成分。
29.一种用于制备澄清的液体酶溶液的方法，包括：
(a)提供含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物；
(b)通过加入一种或多种溶解酶的物质和/或通过改变物理条件以使酶溶解至少一部分而溶解至少一部分的不溶解酶，因而制备了可溶的酶溶液；和
(c)从根据步骤(b)制备的溶液中去除固体，因而制备了澄清的液体酶溶液。
30.一种制备含酶颗粒制剂的方法，包括制备含有组合物的含酶颗粒，所述组合物含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。
31.根据权利要求30所述的方法，其中含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的所述组合物通过这样的方法制备：所述方法包括从含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶，而不去除微生物细胞和/或细胞碎片，因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。
32.根据权利要求30所述的方法，其中含酶颗粒通过选自顶喷流化床加工、底喷沃斯特涂布机加工、高剪切颗粒化、挤压或锅包衣的颗粒化方法制备。
33.根据权利要求30所述的方法，包括在顶喷流化床处理器中将含有所述不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的含酶层涂布在核心上，其中所述方法任选地包括在所述核心和所述含酶层之间涂布盐层。
34.根据权利要求33所述的方法，另外包括将含有屏障盐的层涂布在所述含酶层上。
35.根据权利要求34所述的方法，另外包括将含有聚合物和/或色素的外涂层涂布在所述屏障盐层上。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述含酶颗粒通过将屏障盐层和/或一种或多种涂层涂布在含有所述不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的含酶核心上制备。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述的含酶核心通过顶喷流化床加工制备。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述的含酶核心通过高剪切颗粒化制备。
39.一种含酶颗粒，含有：
核心；
任选地，涂布在核心上的盐层；和
涂布在核心或盐层上的含酶层，其中所述含酶层含有组合物，所述组合物含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。
40.根据权利要求39所述的含酶颗粒，其中含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的所述组合物通过下列方法制备：所述方法包括从含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶，不去除微生物细胞和/或细胞碎片，因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。
41.根据权利要求39所述的含酶颗粒，另外含有涂布在所述含酶层上的屏障盐层。
42.根据权利要求39所述的含酶颗粒，另外含有涂布在所述屏障盐层上的外涂层，其中所述外涂层含有聚合物和/或色素。
43.一种含有含酶核心和屏障盐层和/或一个或多个包围核心的涂层的含酶颗粒，其中所述核心含有组合物，所述组合物含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。
44.根据权利要求43所述的含酶颗粒，其中含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的所述组合物通过下述方法制备：所述方法包括从含有微生物细胞和/或细胞碎片的微生物发酵液中回收不溶解酶，不去除微生物细胞和/或细胞碎片，因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。
45.根据权利要求43所述的含酶颗粒，其中所述的含酶核心通过顶喷流化床加工而制备。
46.根据权利要求43所述的含酶颗粒，其中所述含酶核心通过高剪切颗粒化制备。
47.一种含有根据权利要求39至46任一项所述的含酶颗粒的去污剂组合物。
48.一种含有根据权利要求39至46任一项所述的含酶颗粒的纺织品加工组合物。
49.一种含有根据权利要求39至46任一项所述的含酶颗粒的动物饲料组合物。
50.一种含有根据权利要求39至46任一项所述的含酶颗粒的食品组合物。
51.一种含有组合物的含酶液体制剂，所述组合物含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片。
52.根据权利要求51所述的液体制剂，其中含有不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的所述组合物通过下述方法制备：所述方法包括从微生物发酵液中回收不溶解酶，不去除微生物细胞和/或细胞碎片，因而制备了含有回收的不溶解酶和微生物细胞和/或细胞碎片的组合物，其中至少一些酶在微生物发酵液中是不溶解的。
53.根据权利要求51所述的液体制剂，另外含有一种或多种选自多元醇、盐、防腐剂、表面活性剂和抗氧化剂的制剂成分。
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