CN100529066C - 在发酵过程中加入单丙二醇 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵微生物,产生所需要的相关多肽的方法,所需要的培养基至少要有50升,包括以下的组成:加入一种或多种下面列出的化合物:1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、卫矛醇、甘露醇、赤藻糖醇、纤维二糖、山梨醇和平均分子量不超过1000的多(聚)醚,在发酵之前或发酵过程中加入到培养基中,并且这些化合物要求是低代谢率的。
Description
技术领域
这项发明涉及在发酵过程中增加相关多肽的溶解性。
工艺背景
在发酵过程中经常可以见到多肽的结晶或无定形沉淀的形成,这是由于发酵产量越来越高,发酵配方的优化,和/或由于更多的有效生产有机体的鉴别/发展或形成。
在这种情况下,多肽在发酵过程中的产量高于它的溶解度,即意味着在发酵肉汤中会有部分以沉淀物的形式存在着。这种沉淀是结晶形式或是无定形状态。
这样就带来了问题:在发酵恢复时去掉细胞和其它固型成分之前,必须要采取一些措施以增加结晶/无定型沉淀物的溶解度,这种措施的实施常常会导致产量的下降。
这项发明的目的在于提供一种简便易行的方法来解决上述问题。
发明概要
我们很惊奇的发现,在发酵之前和/或发酵过程的中间,往发酵肉汤中加入一些碳水化合物和/或多羟基化合物(polyols)和/或其衍生物和/或聚合物,可以有效的阻止多肽结晶或沉淀的形成,其中微生物不会,或仅仅在很低的程度上,可以代谢产生以上所说的碳水化合物和/或多羟基化合物和/或其衍生物等等,而我们这项发明主要是与以下一些方法有关:
一种微生物的发酵方法,在至少50升的培养基中产生相关多肽,包括:
添加一种或多种下面所列出的化合物:包括1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、己六醇、甘露醇、赤藻糖醇、纤维二糖、山梨(糖)醇和平均分子量不到1000的多(聚)醚。在发酵之前和/或发酵中间加入到培养基中,其中这些化合物基本上是低代谢的,在此通过测量菌液的OD值,以(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)<25%来确定。
发明详述
这项发明是一种新的和非常高效的方法,可以有效阻止在发酵过程中的多肽结晶或沉淀的形成。
我们惊奇的发现,如果发酵过程中存在小量的例如5%(w/w)的单丙二醇(MPG),即可避免,显著延迟或显著降低结晶或无定型沉淀的形成。MPG对大多数微生物来说是一种非常差的碳源化合物或者很少被代谢的代谢物,或者根本不产生代谢变化,因此它可以在发酵之前和/或在发酵的过程中间加入,而不会显著影响到细胞的生长繁殖和多肽的产生。
通过在发酵过程中避免多肽结晶/无定型沉淀的形成,更为简单的分离过程能够获得更高的产量。
微生物
这项发明中所提到的微生物(微生物菌株)可以是任何种类的微生物。
其中首选的相关多肽来源于细菌源或真菌源。
例如:来源于革兰氏阳性细菌的相关多肽,如芽孢杆菌,如:Bacillusalkalophilus,解淀粉芽孢杆菌,短乳杆菌,环状芽孢杆菌,凝结牙孢杆菌,Bacillus lautus,,缓慢芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,苏云金芽孢杆菌;或链霉菌属菌株,例如:浅青紫链霉菌,鼠灰链霉菌;或者来源于革兰氏阴性杆菌,如埃希氏大肠杆菌或假单胞菌属。
相关多肽也可以是真菌来源,如来源于酵母菌株例如:假丝酵母,克鲁维酵母,毕赤酵母,糖酵母,裂殖酵母菌属,欧蓍草(Yarrowia)酵母菌株,如:卡尔斯伯酵母菌,酿酒酵母菌,糖化酵母,Saccharomyces douglasii,克鲁维氏糖酵母(Saccharomyces kluyveri),Saccharomyces norbensis,或Saccharomyces oviformis。
相关多肽也可以是丝状真菌来源,例如:Acremonium,曲霉菌,短梗霉菌,隐球酵母菌属,Filibasidium,镰刀霉,腐质霉菌,稻瘟霉菌,毛霉菌,黄毁丝霉菌,Neocallimastix菌,脉孢菌,拟青霉菌,青霉菌,瘤胃真菌,裂褶菌,Talaromyces菌,Thermoascus菌,果腐霉菌,中国弯颈霉菌,或木霉属菌株,特别的相关多肽来源于Aspergillus aculeatus,泡盛曲霉,黑曲霉,臭曲霉,日本曲霉,构巢曲霉,黑曲霉,稻曲霉,镰刀霉bactridioides,cerealis镰刀霉,crookwellense镰刀霉,黄色镰孢菌,禾谷镰刀霉,禾谷镰刀霉变种,异孢镰孢,negundi镰刀霉,尖孢镰孢菌,reticulatum镰刀霉,粉红镰孢菌,接骨木镰孢菌,sarcochroum镰刀霉,拟枝孢镰刀霉,硫色镰刀霉,金黄壳镰刀霉,trichothecioides镰刀霉,镰孢霉,insolens腐质霉菌,lanuginosa腐质霉菌,miehei毛霉菌,嗜温微生物Myceliophthorathermophila,脉孢菌,青霉属产紫青霉系,哈茨木霉,康宁木霉,长枝木霉,瑞氏木霉,或者绿色木霉株。
以上这些菌株在许多大的收集机构中都可以很方便的查找到,例如美国典型培养物保藏中心(ATCC),德国菌种保存中心(DSM),荷兰菌种保存中心(CBS),和农业研究服务专利收集中心,北方区域研究中心(NRRL)等等。
这项发明的目的在于,即这里所说的“得自”一词,与给定来源的菌株相联系,即从给定来源的菌株或细胞中插入一段给定来源的目的基因,使其表达所需要的相关肽段。
对目的微生物的修饰
根据这项发明,所选用的微生物需要经过一定的修饰,使它不能够,或只能进行低限度的对所选的碳水化合物和/或多羟基化合物和/或其衍生物的代谢,例如,原始的微生物能够对甘油或环式糊精进行代谢,但是改良修饰以后的微生物则不能或是只能低限度的对其进行代谢反应。
相关多肽
所需要的相关多肽可以是肽,也可以是蛋白质。
这项发明适用的优选相关肽的长度为2-100个氨基酸;更适宜的长度是10-80个氨基酸;更适宜的长度是15-60个氨基酸;最适宜的长度是15-40个氨基酸。
一个首选的典型例子,这种蛋白质是一种酶,是水解酶(根据国际生物化学分类规则委员会的建议,根据酶的命名法归类为EC3)。
除水解酶之外,另一个特殊的例子是:
蛋白酶:适宜的蛋白酶包括动物来源的蛋白酶,植物来源的蛋白酶或微生物来源的蛋白酶。其中,微生物来源的蛋白酶最好。包括经过化学修饰的蛋白酶或蛋白质重组工程突变形成的蛋白酶。蛋白酶可以是一种酸性蛋白酶,例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶,但是,适宜的蛋白酶是碱性的微生物来源的蛋白酶或胰岛素样的蛋白酶。一个碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶,尤其是杆菌属细菌来源的蛋白酶,如合成的枯草杆菌碱性蛋白酶、枯草菌溶素、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶168(具体描述见WO 89/06279)。胰岛素样蛋白酶的例子是胰岛素(例如:猪胰岛素或牛胰岛素)和镰刀霉蛋白酶(具体描述见WO 89/06270and WO 94/25583)。
各种不同的有用的蛋白酶例子的描述可以在WO 92/19729、WO98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中找到,尤其是在下列的一个或多个位点发生氨基酸替换的多肽或蛋白质变异体:27,36,57,76,87,97,101,104,120,123,167,170,194,206,218,222,224,235和274。
首选的已有商品化的蛋白酶包括:ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETM和KANNASETM(诺维信公司,A/S),MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OXPTM、FN2TM和FN3TM(杰能科国际有限公司)。
脂肪酶:适宜的脂肪酶包括那些细菌来源的脂肪酶或真菌来源的脂肪酶,也包括化学修饰后的或蛋白重组突变获得的脂肪酶。有用的脂肪酶的例子包括来源于腐质霉菌的脂肪酶(与嗜热真菌同义),例如:来源于H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶,如EP 258 068和EP 305 216中所描述,或来源于腐质霉菌,具体描述见WO 96/13580,来源于假单胞菌的脂肪酶,例如产碱假单胞菌,或类产碱假单胞菌(EP 218 272),洋葱假单胞菌(EP331 376),斯氏假单胞菌(GB 1,372,034),荧光假单胞菌,假单胞菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002),P.wisconsinensis(WO 96/12012),来源于芽孢杆菌的脂肪酶,例如:来源于枯草芽孢杆菌(Dartois et al.(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360),来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。
另外一些脂肪酶变异体的描述见于WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079以及WO 97/07202。
首选的商品化的脂肪酶包括:LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM(诺维信公司A/S)。
淀粉酶:适当的淀粉酶(α和/或β淀粉酶)包括细菌源或真菌源的淀粉酶,也包括化学修饰后的或蛋白重组突变形成的淀粉酶。淀粉酶包括,例如:来源于芽孢杆菌的α-淀粉酶,例如:来源于地衣芽孢杆菌株的淀粉酶,更多的细节描述见于GB 1,296,839。
有用的淀粉酶的例子有变异体,如WO 94/02597、WO 94/18314、WO96/23873、WO 97/43424和WO 01/66712中所描述的,尤其是在下列这些位点发生一个或多个氨基酸替换的:15,23,105,106,124,128,133,154,156,181,188,190,197,202,208,209,243,264,304,305,391,408和444。
目前已经商品化的淀粉酶有DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM、NATALASETM、TERMAMYL LCTM、TERMAMYL SCTM、LIQUIZYME-XTM和BANTM(诺维信公司,A/S),RAPIDASETM和PURASTARTM(杰能科国际有限公司)。
纤维素酶:适宜的纤维素酶包括细菌源的或真菌源的,也包括化学修饰后的或蛋白重组突变形成的。适宜的纤维素酶包括来源于芽孢杆菌、假单胞菌、腐质霉菌、镰刀霉、果腐霉、顶胞霉,例如:来源于insolens腐质霉菌,Myceliophthora thermophila和尖镰孢菌的真菌纤维素酶,具体描述见US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259.。
特别适宜的纤维素酶是碱性或中性的纤维素酶,具有颜色的偏好。这些纤维素酶的例子如EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940中所描述的。另外一些纤维素酶变异体的例子如:WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所描述。
可买到的商品化的纤维素酶有CELLUZYMETM、CAREZYMETM和CAREZYME CORETM(诺维信公司A/S),CLAZINASETM和PURADAXHATM(杰能科国际有限公司),和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
氧化还原酶
根据这项发明,氧化还原酶包括:过氧化物酶和氧化酶例如:漆酶和过氧化氢酶。
其他的首选的水解酶有碳水化合物水解酶包括MANNAWAYTM.。其他首选的酶还包括转移酶,裂解酶,异构酶和连接酶。
发酵
这项发明对于工厂中的大规模的发酵都是适用的,例如对于任何至少有50升培养基的发酵都适用,更适用于至少100升的,更更适用于至少500升的,尤适用于至少1000升的,最适用于至少5000升培养基的发酵。
微生物发酵可以采用任何传统的方法。培养基可以是氮源和/或碳源化合物的混合物,例如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解产物、棉花籽粗粉、玉米浆、酵母提取物、干酪素、干酪素水解产物、马铃薯蛋白、马铃薯蛋白水解产物、糖蜜及其它类似的东西。培养基可以经过化学的方法精练,如WO 98/37179中所描述。
发酵的过程可以是分批进行,也可以补料分批进行,重复补料分批或连续发酵进行。
在补料分批发酵过程中,在发酵开始之前,培养基中没有加入或者只有一部分含有一或多种结构性成分和/或结晶成分的化合物加入,而全部或剩下的部分是在发酵过程中加入的。选择性加入的化合物可以同时加进去,也可以在发酵过程中分别单独加入。
在重复补料分批或连续发酵过程中,完全成分的初始培养基是在发酵进行的过程中加入的。完全成分的初始培养基可以和其他结构成分进料同时加入,也可以与他们分开而单独加入。在重复补料分批发酵过程中,在固定的时间间隔内,要从培养基中每次去除含固定生物量的培养基:而在连续进行的发酵过程中,除去一部分含固定生物量培养基的过程则是连续进行的。因此,整个发酵过程是一个不断去除一部分旧的培养基同时又在不断添加一部分等量的新培养基的过程。
在这项发明中,首选的代表是补料分批发酵过程,重复补料分批发酵过程或连续发酵过程。
碳水化合物
在这项发明中,代谢比较缓慢的碳水化合物如支链淀粉、限制性糊精和海藻糖等都可以使用。
碳水化合物在这项发明中的具体应用体现在,在微生物接种之前或接种之后在培养基中加入一定量的低代谢率的碳水化合物,如至少0.1%(w/w),更适宜的量是至少0.5%(w/w)。低代谢率的碳水化合物在接种之前或接种之后加入到培养基中的总量最多在10%(w/w),更适宜的是最多到8%(w/w),然后依次的更为适宜的量为:6%(w/w)、5%(w/w)、4%(w/w)、3%(w/w)、2%(w/w)以及1%(w/w)。
多羟基化合物
根据这项发明可以应用一种非常有用的碳水化合物亚类——多羟基化合物,任何一种多羟基化合物都可以使用。然而,首选的多羟基化合物有以下几类:1,2-丙二醇(单丙二醇)、1,3-丙二醇、丙三醇、乙二醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、卫矛醇、甘露醇、赤藻糖醇、纤维二糖、山梨糖醇。
值得注意的是有一些多羟基化合物,例如甘油,很容易被许多细胞代谢,但是在其摄入可以被阻断,就意味着在这项发明中甘油也是可以使用的。
在这项发明中,多羟基化合物在微生物接种之前或者在微生物接种之后加入到培养基中,其加入的量至少为0.1%(w/w),更适宜的量为最少0.5%(w/w)。多羟基化合物在接种之前或者在接种之后加入到培养基中的总量最多在10%(w/w),更适宜的是最多到8%(w/w),然后依次的更为适宜的量为:6%(w/w)、5%(w/w)、4%(w/w)、3%(w/w)、2%(w/w)以及1%(w/w)。
在某些更适宜的条件下,可以添加两种或多种多羟基化合物,例如:甘油和单丙二醇,或者多羟基化合物和低代谢率的碳水化合物的混合物等等。
衍生物
另一类非常有用的碳水化合物亚类是其衍生物,在这项发明中也可以使用。可以使用的碳水化合物衍生物有:梅拉德产物、甲基糖苷类、葡萄糖苷酸(glucoronic acid)、氨基糖类、或N-乙酰基葡糖胺。
在这项发明中,碳水化合物衍生物在微生物接种之前或者在微生物接种之后加入到培养基中,其加入的量至少为0.1%(w/w),更适宜的量为最少0.5%(w/w)。碳水化合物衍生物在接种之前或者在接种之后加入到培养基中的总量最多在10%(w/w),更适宜的是最多到8%(w/w),然后依次的更为适宜的量为:6%(w/w)、5%(w/w)、4%(w/w)、3%(w/w)、2%(w/w)以及1%(w/w)。
聚合物
聚合物例如多(聚)醚,其平均分子量不超过1000;适宜的平均分子量不超过900,更适宜的平均分子量不超过800,更更适宜的平均分子量不超过700(例如聚乙烯乙二醇200(PEG 200),聚乙烯乙二醇400(PEG 400)),或者他们的衍生物包括聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物的嵌段聚合物和嵌段共聚物,在这些聚合物的末端有保护性的酰基集团或烷基集团。以上这些聚合体在这项发明中都可以使用。
在这项发明中,聚合体在微生物接种之前或者在微生物接种之后加入到培养基中,其加入的量至少为0.1%(w/w),更适宜的量为最少0.5%(w/w)。聚合体在接种之前或者在接种之后加入到培养基中的总量最多在10%(w/w),更适宜的是最多到8%(w/w),然后依次的更为适宜的量为:6%(w/w)、5%(w/w)、4%(w/w)、3%(w/w)、2%(w/w)以及1%(w/w)。
盐
除了在培养基中添加低代谢率的碳水化合物之外,再加入适量的盐会更有利。(见例子4)。
可选用的盐类有如下几种:氯化物、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、铵盐,例如:NaCl、KCl、Na2SO4、K2SO4。
代谢程度
用下面的实验来检测产生所需要的相关肽的微生物是否没有代谢或是最低限度的代谢了所加入的化合物。
选择合适的适宜微生物生长的培养基。
所选择的微生物的培养基应当满足以下这些参数要求:
a:仅以葡萄糖作为碳水化合物的唯一来源,
b;当去掉葡萄糖时,培养基应当只能够支持显著降低的微生物生长(不多于50%)。
微生物在以下三种培养基中生长的比较:
I:通用培养基(以葡萄糖作为作为唯一的碳水化合物的来源)
II:没有葡萄糖的培养基I
III:没有葡萄糖的培养基I,但是添加了相同C-摩尔数的待检测化合物
然后在三种培养基中进行8小时的微生物生长跟踪监测。接种浓度选用单位剂量的菌种以保证在通用培养基中的微生物在75%的时间范围内生长出来。生物量通过在650nm处的光密度的测量来确定。测定在不同培养基中的所得OD。
待检测的化合物被定义为低代谢率,如果:
(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)<25%;优选
(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)<20%;优选
(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)<15%;优选
(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)<10%;优选
(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)<5%;优选
(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)=0%
根据这种检测方法,检测例子1中的各种化合物的代谢率。
所需的相关多肽的得自
这项发明的更进一步的方面就涉及到了,下游的对培养基的处理工艺。在发酵过程结束后,需要应用标准的技术方法得自培养基中的所需要的相关多肽片段,相关的下游得自技术与所需要得自的相关多肽的特性有关。
一个典型的得自培养基中的相关多肽的程序包括以下这些部分或全部的步骤:
1)培养基的前处理(例如絮凝)
2)从培养基中分离去除细菌和其他固型物质(初级分离)
3)过滤
4)浓缩
5)过滤
6)稳定化和标准化。
除了上述提到的这些程序之外,还需要有其他的一些得自程序,例如pH值的调整、温度的调节、结晶化处理、带有活性碳成分的水溶性多肽的处理,以及应用各种吸附剂等等。
通过应用这项发明的方法,例如在发酵过程中加入MPG,在得自时,所需要的相关多肽的产量大大提高了,结晶形成降低或消失了。
这项发明会在以下通过一些例子得到进一步的阐明,而不是说对这项发明的应用领域有任何的限制,特此声明。
例子1
对不同的多羟基化合物和碳水化合物作为碳源对微生物生长的适宜性 的评估。
摇菌培养基:
Med-F18摇菌培养基(最终混合之后的浓度)
A部分:细菌蛋白胨0.5;酵母提取物0.5g/l;硫酸镁,7H2O 0.5g/l;硫酸铵2g/l;氯化钙,2H2O 0.1g/l;柠檬酸50mg/l;痕量金属(MnSO4,H2O2.5mg/l;FeSO4,7H2O 9.9mg/l;CuSO4,5H2O 1.0mg/l;ZnCl2 1.0mg/l);PLURONICTM 0.1g/l;pH调节到6.7。
B部分:5g/l磷酸二氢钾,pH用NaOH调节到6.7。
C部分:相当于每升含0.08摩尔碳元素的碳源等价物(例如:2.5g/l葡萄糖)
所有培养基用的水都是去矿物质水。
A,B和C部分在121℃蒸馏灭菌20分钟后混合。
菌株:地衣芽孢杆菌
通过摇菌过程,监测细菌的生长情况,以此来评估不同的多羟基化合物和碳水化合物作为碳源对细菌生长的适宜性。
首先菌株在培养前经过一段时间的生长,以保证菌株处于良好的生长状态。
然后每一个摇菌瓶中接种相同量的菌株,通过在650nm处检测其吸光度值来判断。
每一个瓶中的接种体密度以OD x ml细菌悬液=80作为选择依据,结果是在0时间每瓶中的OD=0.8。
每一型菌株分别接种三个培养瓶。
摇菌瓶的类型:
I:Med-F 18加入C部分,C部分中是葡萄糖(葡萄糖的终浓度是2.5g/l(相当于每升含0.08摩尔的碳).
II:Med-F 18不加C部分,培养基中没有任何葡萄糖
III:Med-F 18加入C部分,用以下的任何一种碳水化合物来代替葡萄糖:
-2.1g/l MPG(相当于每升含0.08摩尔的碳)
-2.1g/l PEG 200(相当于每升含0.08摩尔的碳)或者
-2.4g/l蔗糖(相当于每升含0.08摩尔的碳)
最后培养基中的终浓度分别为2.1g/l MPG;2.1g/l PEG 200或2.4g/l蔗糖。
由于错误,准备的培养基的上述物质的终浓度分别为:2.5g/l MPG;2.5g/l PEG 200;and 2.5g/l蔗糖。这样,如果这些化合物很容易被代谢掉,这些培养基的OD值较希望的培养基要高一些。
摇菌瓶在37℃条件下,300rpm震荡培养8小时。
在6小时和8小时的时候分别检测一下各摇菌瓶的OD值,获得以下表格中的结果:
表1.MPG的检测:
三个震荡培养瓶在6小时和8小时的平均OD值(650nm)
OD(650nm)时间[小时] | OD<sub>I</sub> | OD<sub>II</sub> | OD<sub>III</sub> | (OD<sub><u>III</u></sub><u>-OD</u><sub><u>II</u></sub><u>)</u>(OD<sub>I</sub>-OD<sub>II</sub>) |
6 | 4.23 | 1.51 | 1.61 | 3.8% |
8 | 4.08 | 1.46 | 1.57 | 4.3% |
从上述结果可以很容易的看出,在这个例子中,MPG被很缓慢的代谢或基本没有被代谢。同样,很明显的,培养基在6个小时的时候已经达到饱和,因为从6小时到8小时的OD值基本没有再增加。
表2.PEG 200的检测:
三个震荡培养瓶在6小时和8小时的平均OD值(650nm)
OD(650nm)时间[小时] | OD<sub>I</sub> | OD<sub>II</sub> | OD<sub>III</sub> | (OD<sub><u>III</u></sub><u>-OD</u><sub><u>II</u></sub><u>)</u>(OD<sub>I</sub>-OD<sub>II</sub>) |
6 | 4.23 | 1.51 | 1.50 | -0.2% |
8 | 4.08 | 1.46 | 1.45 | -0.4% |
从上述结果可以很容易的看出,在这个例子中,PEG200被很缓慢的代谢或基本没有被代谢。
表3.蔗糖的检测:
三个震荡培养瓶在6小时和8小时的平均OD值(650nm)
OD(650nm)时间[小时.] | OD<sub>I</sub> | OD<sub>II</sub> | OD<sub>III</sub> | (OD<sub><u>III</u></sub><u>-OD</u><sub><u>II</u></sub><u>)</u>(OD<sub>I</sub>-OD<sub>II</sub>) |
6 | 4.23 | 1.51 | 4.23 | 100.1% |
8 | 4.08 | 1.46 | 4.02 | 97.7% |
从以上结果可以很容易的看到蔗糖在这个例子中被很容易的代谢掉了。
例子2
在发酵过程中在培养基中加入MPG,使酶的溶解性提高了。
菌株:地衣芽孢杆菌
所需要的相关多肽:α-淀粉酶变异体,具体描述见WO 01/66712。
培养基:
除非另有说明,这里所用的水全部为自来水。所有培养基的灭菌都是用已知的常规方法,以保证整个发酵过程都是在统一的培养基中进行的。
第一个接种培养基:
LB琼脂:10g/l酪蛋白胨;5g/l酵母浸出物;10g/l氯化钠;12g/l Bacto琼脂,调整pH为6.8到7.2,应用Merck的预混合料混合。
转移缓冲液:
M-9缓冲液(应用去离子水):磷酸氢二钠,2H2O 8.8g/l;磷酸二氢钾3g/l;氯化钠4g/l;硫酸镁,7H2O 0.2g/l。
接种震荡培养瓶培养基(接种前浓度):
PRK-50:110g/l大豆粗粉;磷酸氢二钠,2H2O 5g/l;灭菌前用NaOH/H3PO4将pH调节到8.0。
组成(make-up)培养基(浓度是接种前浓度):
胰蛋白胨(Difco公司的酪蛋白水解产物)30g/l;硫酸镁,7H2O 4g/l;磷酸氢二钾7g/l;磷酸氢二钠,2H2O 7g/l;硫酸二铵4g/l;柠檬酸0.78g/l;维生素(二氯硫胺素34.2mg/l;核黄素2.9mg/l;尼克酸23mg/l;D-泛酸钙28.5mg/l;盐酸吡哆醛5.7mg/l;D-生物素1.1mg/l;叶酸2.9mg/l);痕量金属(MnSO4,H2O 39.2mg/l;FeSO4,7H2O 157mg/l;CuSO4,5H2O15.6mg/l;ZnCl2 15.6mg/l);抗沫剂(SB2121)1.25ml/l;灭菌之前用NaOH/H3PO4将pH调整到6.0。
添加成分:
葡萄糖,1H2O 820g/l;
接种的步骤程序:
首先菌株在LB琼脂斜面上,在37℃条件下生长一天,然后用M-9缓冲液冲洗琼脂斜面,测量所得自菌液在650nm下的光密度值。
震荡接种瓶(PRK-50)中接种的菌液的光密度值OD(650nm)x ml细菌悬液=0.1。
这个震荡接种瓶在37℃条件下,300rpm震荡培养20个小时。
在主要发酵发酵罐中的发酵过程从由震荡培养瓶中的生长菌液接种以后就开始了,接种菌液的体积大约占到组成培养基的10%(即800ml的总培养基中加入80ml的接种菌液)。
发酵设备:
标准的发酵实验室设备有温度控制系统,氨水和磷酸调控的pH控制系统,以及在整个发酵过程中保证氧饱和度在20%以上的溶解氧电极测量系统。
发酵参数:
温度:41℃
应用氨水和磷酸调节使pH保持在6.8到7.2之间
对照:6.8(氨水);7.2(磷酸)
通风:1.5升/分钟/公斤培养基重量
转速:1500rpm
添加策略:
0hr.0.05g/min/kg接种后最初的肉汤
8hr.0.156g/min/kg接种后最初的肉汤
结束时:0.156g/min/kg接种后最初的肉汤
实验计划:
用相同的物质接种三个平行的接种罐进行平行的发酵过程,
发酵A如上所述进行发酵过程。
发酵B如上所述进行发酵过程,但是在接种前加入50g/L MPG(单丙二醇)
发酵C如上所述进行发酵过程,但是在接种后24小时加入50g/LMPG。
(在发酵B和发酵C,加入的MPG的浓度取决于接种前接种罐中整个培养基的体积)
发酵进行三天后取样检测。将所取样本平行分成两等份(样本I和样本II).样本II在38℃条件下,以离心力为15000gav离心20分钟。离心后的上清液用0.2μm的过滤器(Sartorius Minisart,order no.:16534)过滤(sample IIsup)。
然后用常规方法检测样本I和样本IIsup中的α-淀粉酶活性(例如可以应用WO 95/26397中描述的α-淀粉酶活性的检测方法)。然而,如果待检样品中的酶有部分是以固体形式存在的话,则样品在分析前需要用尿素处理。以1∶50(w/v)的比例将样本溶解在含40%(w/w)尿素,25.5mg/L硬脂醇醚35和4.4g/L CaCl2,2H2O的溶液中,则结晶和沉淀的α-淀粉酶都可以以活性形式溶解,而溶解的α-淀粉酶则可以进行活性分析了。
用于分析的样本I和样本IIsub都要溶解在如上所述的尿素缓冲液中,然后才可以进行分析。
样本IIsup中测定的是酶的溶解活性,而样本I则测定的是酶的总活性(包括溶解的酶的活性和结晶和沉淀的酶的活性)。
结果:
以下这些活性是在发酵三天后所测得的活性。发酵A中测得的总活性作为活性的100%,溶解活性(例如样本IIsup的活性)给出与样本I活性的相对值。
表4。
发酵名称 | 种类 | 样本I中的酶的总活性 | 样本II<sub>sup</sub>中的溶解的酶活性 |
发酵A | 标准 | 100% | 19% |
发酵B | 添加了MPG | 101% | 53% |
发酵C | 发酵一天后添加了MPG | 99% | 95% |
从表4中的结果很明显可以看出来在培养基中添加了MPG以后,在培养基中溶解的酶活性显著升高了。
例子3
对产量提高和过程的评价
在应用杆菌菌株进行大规模发酵(大于50升)生产低溶解度的α-淀粉酶的过程中,应用两个发酵进行对比。其中一个发酵中在接种24小时后加入2%(w/w)MPG,这一例中的发酵液在显微镜(40X)下也看不到酶的结晶。另一例发酵罐中的发酵过程最为对照,不添加任何MPG,这一例中的发酵液在显微镜T(40X)可看到酶的结晶出现。
两批发酵同时平行进行,经过一系列的絮凝过程,pH调整到4个不同的设定点,所有加入物的量都由体积比%w/w来计算。絮凝过程由以下成分组成:200%水;2%CaCl2;1.2%Al2(OH)5Cl;pH调整到设定的数值(见下表);0.5%Superfloc C591和0.2 to 0.3%的Superfloc A130的用量取决于pH的大小。所有的絮结产物都是基于100g的培养基的,所有的添加物也是搅拌中加入的。絮凝过程在室温下进行(大约20℃)。样本离心后收集上清液测其中的α-淀粉酶的活性。
絮结pH | 加入MPG的发酵肉汤的上清产量 | 对照上清产量 |
7.5 | 83% | 30% |
10.0 | 102% | 33% |
10.5 | 100% | 37% |
11.0 | 98% | 40% |
表5:在不同pH点絮结表明在发酵过程中加入MPG对上清(过滤液)产量的影响
在工厂大规模的生产中,第一次离心后的大量的沉淀还要进行第二次离心以提高总的分离率。絮结产物中的沉淀的pH调整到7.5(上面所提到的),重悬于150%的水中,加入1%CaCl2,最后用0.1 to 0.2%Superfloc A130再次絮结。最初,基于没有加入MPG的发酵肉汤的絮结产物中的沉淀所获取的酶的活性是加入了MPG的发酵肉汤的絮结产物中的沉淀所获取的酶的活性的三倍。而且,在没有加入MPG的发酵肉汤中的沉淀在显微镜(40X)下可以看到结晶,而在加入了MPG的发酵肉汤中的沉淀则在显微镜(40X)下没有任何可见的结晶。
样本再次被离心,然后检测沉淀中离心分离出来的上清液中的α-淀粉酶的活性。
絮结产物的pH | 加入MPG的发酵肉汤的上清产量 | 对照上清产量 |
7.5 | 52% | 6% |
10.0 | 61% | 7% |
10.5 | 64% | 10% |
11.0 | 67% | 10% |
表6:在不同的pH值下从第一次絮结产物进行第二次絮结表明在发酵中加入MPG对产量的影响
从上面的例子可以看出,在发酵过程中加入MPG可以减少或完全避免结晶产物的形成,从而显著提高酶的回收。
例子4
在发酵中同时添加MPG和矿物盐的影响
材料和方法:
发酵方法与例子2中所描述的相似(发酵A),作为这些实验的基础。
表7.实验设计
1)这表明在接种一天之后添加MPG。加入MPG的量取决于接种前组成培养基的总体积。
2)在接种前是否在主要培养基中加入了额外的矿物质或是已有矿物质又加入了额外的量。
3)盐浓度,总量取决于接种前组成培养基的总体积。
实验设计:
发酵D在这个研究中用做对照,而发酵E,F,G,H,I则依据表7在总量中加入不同的额外的矿物盐。
发酵三天后取样。样本平行分成两等份(样本I和样本II).样本II在38℃条件下,离心力为15000gav离心20分钟。上清液在0.2μm的过滤器中过滤(Sartorius Minisart,order no.:16534)(sample IIsup).。
然后用常规方法检测样本I和样本IIsup中的α-淀粉酶活性(例如可以应用WO 95/26397中描述的α-淀粉酶活性的检测方法)。然而,如果待检样品中的酶有部分是以固体形式存在的话,则样品在分析前需要用尿素处理。以1∶50(w/v)的比例将样本溶解在含40%(w/w)尿素,25.5mg/L硬脂醇醚35和4.4g/L CaCl2,2H2O的溶液中,则结晶和沉淀的α-淀粉酶都可以以活性形式溶解,而溶解的α-淀粉酶则可以进行活性分析了。
用于分析的样本I和样本IIsub都要溶解在如上所述的尿素缓冲液中,然后才可以进行分析。
样本IIsup中测定的是酶的溶解活性,而样本I则测定的是酶的总活性(包括溶解的酶的活性和结晶和沉淀的酶的活性)。
结果:
表8:以下这些活性是在发酵三天后所测得的活性。发酵D中测得的总活性作为活性的100%,溶解活性(例如样本IIsup的活性)给出样本I活性对于特定的发酵的相对值。
发酵名称 | 描述 | 总培养基样本I中的酶的活性 | 溶液样本II<sub>sup</sub>中的酶活性 |
发酵D | 发酵一天后加入MPG(对照) | 100 | 39 |
发酵E | 类型D+NaCl在组成中 | 96 | 156 |
发酵F | 类型D+KCl在组成中 | 88 | 149 |
发酵G | 类型D+Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>在组成中 | 99 | 148 |
发酵H | 类型D+K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>在组成中 | 82 | 152 |
发酵I | NaCl在组成中,不加MPG | 109 | 15 |
在有些例子中,样本II中的酶活性高于样本I中的酶活性,这是由于在这些例子中,所有的酶都是可溶性的,去掉一部分菌体以后反而增加了样本中的酶的浓度,这是由于菌体体积较大,而其中酶含量又较低的缘故。
表8中的数据清楚的显示加入了MPG以后,酶的溶解度显著的提高了(D对I是39%对15%;而E对I是156%对15%)。通过上表还可以清楚的看到加入MPG可以显著提高酶的可溶性的作用可以通过另外的加入各种矿物质而得到加强。
表8显示了一个协同作用(见发酵罐D(加入MPG);发酵罐I(加入NaCl);和发酵罐E(同时加入MPG和NaCl))。
例子5
α-淀粉酶溶液(例如从例子2中通过传统方法获取的肉汤)在40℃,pH值10.5-11条件下浓缩,在40℃通过0.2μm的过滤器过滤,25ml分装入7个小瓶中,然后加入下列的多羟基化合物:
小瓶编号. 多羟基化合物
1. 对照
2. 5%(w/w)PEG 200
3. 5%(w/w)PEG 400
4. 5%(w/w)山梨醇
5. 5%(w/w)纤维二糖
6. 5%(w/w)木糖醇
7. 5%(w/w)单丙二醇(MPG)
在每个小瓶中插入一个磁力棒,并且将pH调节到7.5,然后将小瓶在室温下放置两天,缓慢搅拌。
通过过滤器(0.2μm过滤器)将结晶去除,然后检测滤液(=母液)和过滤之前的液体的酶活性。结果显示在下表中,以母液中的活性值与过滤之前的液体中的总活性值之比给出(%)。
表9
小瓶编号 | 加入的多羟基化合物 | 母液中的酶活性与总酶活性的百分比(%) |
1 | 对照 | 9 |
2 | 5%(w/w)PEG 200 | 58 |
3 | 5%(w/w)PEG 400 | 53 |
4 | 5%(w/w)山梨醇 | 33 |
5 | 5%(w/w)纤维二糖 | 38 |
6 | 5%(w/w)木糖醇 | 29 |
7 | 5%(w/w)单丙二醇(MPG) | 29 |
表中的数据清楚的显示了多羟基化合物的加入显著的增加了淀粉酶的溶解度。
Claims (9)
1.一种通过在至少50升的培养基中进行细菌发酵产生所需要的酶的方法,包括:
在发酵之前或发酵过程中,向培养基中加入一种或多种选自下列的化合物:1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、卫矛醇、甘露醇、赤藻糖醇、纤维二糖、山梨醇和平均分子量不超过1000的聚醚。
2.根据权利要求1所述的方法,其中的细菌是芽孢杆菌属细菌。
3.根据权利要求1所述的方法,其中的酶是水解酶(依据酶命名法归类于EC 3)。
4.根据权利要求1所述的方法,其中的化合物添加的量至少为培养基的0.1%(w/w)。
5.根据权利要求1所述的方法,其中的化合物是1,2-丙二醇。
6.根据权利要求1所述的方法,其中发酵培养基中除了所述化合物还添加盐。
7.根据权利要求6所述的方法,其中加入的盐选自氯化物、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐以及铵盐。
8.根据权利要求1所述的方法,其中回收所需要的酶。
9.根据权利要求1所述的方法,其中在细菌菌体去除之后回收酶。
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