BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von lignolytischen Brühen auf biochemischem Weg. Derart hergestellte Brühen haben Bedeutung im Abbau von Ligninen in ligninhaltigen Substanzen, wie Kraftlignine oder Lignosulfat, sowie im Abbau persistenter Schadstoffe wie DDT, Benzpyren, Dioxin, Chlorphenol und dergleichen. Diese Kulturen eignen sich für künftige Anwendungen im Umweltschutz und für die Entsorgungsprobleme der industriellen und öffentlichen Bereiche.
Es sind Verfahrensarten bekannt geworden, welche als produzierende Spezies Weissfäulepilze verwenden. Diese Verfahren sind: - Nichtgerührte, flache Kulturen in 125-ml-Flaschen mit 10-ml-Kulturinhalt. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Jäger, A., Croan, S. und Kirk, T.K.
(1985) Appl. Microbiol. 50, 1274-1278 verwiesen.
- Geschüttelte Kulturen in 125-ml-, 1-1- und 2-1-Flaschen mit mit 10- bis zu 1 00-ml-Mediumsinhalt auf Rotationsschüttlern unter Sauerstoffeinwirkung. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichungen von Asther, M., Corrieu, G., Drapron, R. und Odier, E. (1987) Enzym Microb. Technol. 9, 245-249 und von Jäger, A., Croan, S. und Kirk, T.K. (1985) Appl. Environ. Microbiol. 50, 1274-1278 verwiesen.
- Myzelkulturen in einem nichtgerührten vertikalen oder horizontalen Reaktor mit fortlaufender Zuführung von Sauerstoff. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Linko, Y.Y., Leisola, M., Lindholm, N., Troller, J., Linko, P. und Fiechter, A. (1986) J. Biotechnol. 4, 283-291 verwiesen.
- Bewegte Oberflächenverfahren oder Trommelreaktoren. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentli chung von Kirk, T.K., Croan, S., Tien, M., Murtagh, K.E. und
Farrel, R.L. (1986) Enzyme Microb. Technol. 8, 27-32 verwiesen.
- Immobilisierte Myzelkulturen in 250-ml-Flaschen z.T.
ohne Bewegung und unter Sauerstoffeinwirkung. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Linko, Y.Y., Leisola, M., Lindholm, N., Troller, J., Linko P. und Fiechter, A. (1986) J. Biotechnol. 4., 283-291 verwiesen.
- Oberflächenkulturen auf Silikonschlauch in einem gerührten Reaktor unter Sauerstoffeinwirkung. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Willershausen, H., Graf, H. und Jäger, A. (1987) in Lignin enzymic and microbial degradation les Colloques de l'INRA, Nr. 40, Seiten 203-207, Ed. INRA, Paris, verwiesen.
Die Nachteile an den bekannten Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von lignolytischer Brühe sind: - Die lignolytische Eigenschaft der Brühe wird durch biologische Aktivität der Mikroorganismen hervorgerufen. Für eine gute Produktion ist es daher wichtig, dass alle Mikroorganismen der Kultur ständig mit Nährlösung versorgt werden und die Kultivationsparameter (pH, Temperatur usw.) kontrolliert werden. Im Oberflächenverfahren wird nur ein Teil der Mikroorganismen, die sich auf der Kulturfläche befinden, versorgt. Die äusserste Kulturschicht bleibt inaktiv und nicht produktiv.
- Die Produktivität eines Oberflächenverfahrens ist abhängig von der vorhandenen Oberfläche. Im industriellen Prozess ergeben sich daraus Platzprobleme.
- Bei der Anwendung von immobilisierten Zellen zur Herstellung von lignolytischer Brühe müssen die verwendeten Trägermaterialien nach der Produktionsphase von der Brühe getrennt und evtl. zur Wiederverwertung gereinigt werden.
Die zusätzliche Behandlung der Brühe wirkt sich im grosstechnischen Massstab nachteilig auf die Wirtschaftlichkeit dieses Prozesses aus.
Keines der bekannten Verfahren ist für die technischen bzw. grosstechnischen Betriebe geeignet. Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren für die kommerzielle Produktion von lignolytischen Brühen anzugeben, wobei die Herstellung und Aufarbeitung der Reaktionslösung technisch einfach gestaltet sein soll.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Lösungen mit hoher lignolytischer Aktivität in einem technisch einfachen Verfahren herzustellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Verfahren mit den in Anspruch 1 angegebenen Merkmalen. Die bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemässen Verfahren haben die in den Ansprüchen 2 bis 6 angegebenen Merkmale.
Überraschenderweise und entgegen den Lehren des Standes der Technik wurde festgestellt, dass Phanerochaete chrysosporium auch im Rührkesseln lignolytische Aktivität zeigt, wenn bestimmte Bedingungen erfüllt sind. Die gerührten Submerssysteme sind besonders geeignet für den grosstechnischen Einsatz, da die Homogenität innerhalb des Kultivationsgefässes besser gewährleistet ist als beim Oberflächenverfahren oder bei immobilisierten Zellen. Die Massstabsvergrösserung und die Kontrolle der Kultivations-/Produktionsparametern sind im Falle des gerührten Kessels einfacher.
Die Anwendung von nichtträgergebundenen und freien Mikroorganismen ermöglicht die direkte Verwendung oder Weiterverarbeitung der produzierten Brühe.
Die Taxonomie der erfindungsgemäss geeigneten Basidomyzeten ist nicht abgeschlossen, und unter die Bezeichnung Weissfäulepilze oder white-red fungi fallen vermutlich auch unterschiedliche Gattungen der Rost- und/oder Brandpilze, z. B. Fusarium; für das erfindungsgemässe Verfahren haben sich insbesondere die bereits beschriebenen Weissfäulepilze Phanerochaete chrysosporium und Coriolus versicolot als brauchbar erwiesen.
Rost- und/oder Brandpilze, insbesondere Phanerochaete chrysosporium, sind bei Züchtungen in geeigneten Medien und unter geeigneten Bedingungen zur Bildung von lignolytischen Lösungen befähigt. Für die lignolytischen Eigenschaften der Brühe sind verschiedene Enzyme, wie Ligninperoxidase (Ligninase), Manganperoxidase und Laccase, verantwortlich. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Kirk, T.K. (1987) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 321, 461474 verwiesen. Die vollständige Identifikation der beteiligten Enzyme und deren Zusammensetzung und Regulation sind noch nicht abgeschlossen.
Die durch erfindungsgemässes Verfahren hergestellte Brühe ist gekennzeichnet durch die in Anspruch 7 genannten Merkmale. Die Brühe wird lignolytisch aktiv, wenn ein oder mehrere der in Anspruch 7 genannten Bedingungen erfüllt werden, nämlich: - Nachweis von Ligninperoxidase im Kulturfiltrat. Die Bestimmung der Ligninase erfolgt nach dem Verfahren, das von Tien, M. und Kirk, T.K. (1984) im Proc. Natl. Acad. Sci.
81, 2280-2284 beschrieben ist.
- Entfärbung von Remazol brilliant blue R dye . Nach Zugabe von z.B. 3 mgl-' dieses Farbstoffes färbt sich die Brühe blau. Wenn die Kultur nun aktiv wird, verschwindet diese Färbung.
- Abbau von Lignin. Zugabe von z.B. 100 mgl-' eines Lignins (käufliches Alkalilignin aus Föhrenholz, Indulin) in lignolytisch aktive Brühe führt zum Abbau dieses Lignins.
Der Ligninabbau wird durch die Abnahme der Kulturabsorption bei 280 nm und pH 11 festgestellt.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird unter aeroben Bedingungen in einem Rührkessel (Bioreaktor) gearbeitet, der eine Heizung und einen oder mehrere Turbinenrührer besitzt. Zum Animpfen einer im Reaktor vorgelegten Menge Kulturmedium und zur Probennahme ist der Reaktor mit zwei Schleusen versehen. Mit einer Temperaturregelung wird die Heizung gesteuert, welche die Temperatur im Innern des Reaktors konstant hält. Mit einem pH-Meter wird der pH der Brühe laufend überwacht und gegebenenfalls mit Säure oder Lauge automatisch geregelt. Ferner wird durch eine Leitung Sauerstoff, Luft oder ein anderes sauerstoffhaltiges Gasgemisch in einer zur Erhaltung aerober Bedingungen ausreichender Menge eingespiesen.
Während der Kultivation wird konstant so gerührt, dass sich die Zellfäden ballen und Pellets bilden. Die Pelletbildung ist für das erfindungsgemässe Verfahren wesentlich. Zu hohe Rührerumlaufgeschwindigkeiten führen dazu, dass Pelletbildung verhindert wird oder ein erheblicher Teil der Pellets zerbricht oder zerfasert wird. Hierzu sind an sich übliche Rührer mit relativ niedrigen Rührerspitzengeschwindigkeiten von 0,5 bis 1,0 mm ¯ ' geeignet. Eine abschliessende Definition von Rührbedingungen und Kinetik ist praktisch nicht möglich, doch kann die Optimierung im Rahmen der oben angegebenen Grenze zwischen Ballen der Zellfäden und Zerstörung der Pellets bei einem gegebenen Pilzmaterial leicht anhand von wenigen einfachen Versuchen ermittelt werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann, abgesehen von den nachfolgenden erläuterten speziel- len Bedingungen, unter den für die erwähnten Mikroben geeigneten allgemeinen Kulturbedingungen (Temperatur, pH-Wert, essentielle Wachstumskomponenten) gearbeitet werden. Beispielsweise ist ein Temperaturbereich von 25 bis 40 "C für die Kultivation geeignet und ein solcher von 35 bis 38 "C bevorzugt. Der pH-Wert des Mediums liegt allgemein zwischen 3,5 und 6,5 und vorzugsweise zwischen 4 und 5.
Das Medium für die Züchtung der Pellets kann die üblichen Quellen für Kohlenstoff (einfache Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Glucose, Fructose, polymere Kohlenhydrate, z.B. Stärke, Cellulose, Glucane oder Salze organischer Säuren, wie Acetate, Succinate, Tartrate usw.) und Stickstoff (Ammoniumsalze, Nitrate oder komplexe organische Stickstoffverbindungen) sowie Vitamine (Thiamin ist meistens ausreichend) und Mineralstoffe wie Fe, Mg, Ca, und Spurenelemente wie Mn, Co, Zn, Cu (Netzwasser ist meistens ausreichend). Die Menge der Mediumszutaten soll so gewählt werden, dass das Wachstum durch einen oder mehrere essentielle Wachstumsstoffe vorzugsweise Kohlenstoff beschränkt wird und die restlichen Zutaten im Überschuss vorhanden sind.
Der Anteil eines Wachstumsstoffes am Kulturmedium wird dann als limitierend bezeichnet, wenn eine Verminderung des Anteils des Wachstumsstoffes am Kulturmedium zu einer merklichen Abnahme der Biomassenproduktion führt. Eine solche Verarmung bzw. Limitierung der essentiellen Wachstumsstoffe hat zur Folge, dass sich das Pilzmaterial praktisch nicht mehr vermehrt, was zu einer lignolytischen Aktivierung der Brühe führt.
Wesentlich für das erfindungsgemässe Verfahren ist es, dass das Medium eine oder mehrere zell andstab licierende Substanzen wie Polyethylenglycol und/oder Polypropylenglycol aber auch Kohlenwasserstoffe enthält. Die Untersuchungen zur Abklärung der Wirkungsweise der erfindungsgemäss geeigneten Substanzen auf die Aktivierung der Brühe sind nicht abgeschlossen. Ähnliche Effekte werden durch Zugabe von Detergentien wie Tween oder Oleinsäure erreicht. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichungen von Asther, M., Corrieu, G., Drapron, R. und Odier, E. (1987) Enzym Microb. Technol. 9, 245-249 und von Jäger, A., Croan, S. und Kirk, T.K. (1985) Appl. Environ. Microbiol.
50, 1274-1278 verwiesen.
Die aktive Brühe kann als solche z. B. für den Abbau von Ligninen in ligninhaltigen Substanzen oder von persistenten Schadstoffen verwendet werden; oder sie kann in bekannter Weise durch Zentrifugieren und/oder Filtration für die Herstellung eines Enzympräparates mit lignolytischer Aktivität aufgearbeitet werden. Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 Produktion von lignolytischer Brühe unter Zugabe von Polypropylenglycol
Der Stamm Phanerochaete chrysosporium, mit der Hinterlegungsnummer ATCC 24725, wurde auf 40 ml 2% Maltagar in 300-ml-Erlenmeierkolben für 4 Tage oder länger bei 37 "C bis zur vollständigen Sporulierung (Agarfläche zugedeckt mit weissen Sporen) kuliviert. Die Sporen wurden in 30 ml sterilem Wasser suspendiert und ihre Anzahl mikroskopisch festgestellt. Die Sporensuspension wurde für die Impfung des Reaktors gebraucht.
Zur Einleitung des erfindungsgemässen Verfahrens wurde ein mechanisch gerührter Reaktor mit zwei sechsblättrigen Scheibenrührern und vier Strömungsbrechern (baffels) verwendet. Skizze dieses Rührkesselreaktors, Zusammenstellung der Abmessungen vom Gefäss, Einbauten, Rühr- und Begasungseinrichtungen sowie einige kennzeichnende geometrische Kenngrössen sind in Fig. 1 angegeben. Die Belüftung erfolgte jeweils mittels eines Gasverteilungsrings unterhalb der niedersten Rühreinheit. Der Reaktor hatte vier Strömungsbrecher, und sein Gesamtvolumen betrug 0,042 m3. Der Reaktor war auf ein maximales Füllvolumen von 0,03 m3 ausgelegt. Der Reaktor wurde mit 30 1 frischem Kulturmedium, das die in der folgenden Tabelle angegebene Zusammensetzung hat, versetzt und dessen pH-Wert mit Phosphorsäure auf 4,5 eingestellt und bei 121 C während 20 min sterilisiert.
Tabelle 1 Komponente Konzentration (Liter)-' Glucose 3 g Diammoniumtartrat 0,66 g MgSO4-7H20 0,15g CaCI2 zu 2H20 30 mg FeSO4-7H20 5,55 mg Thiamin 100 mg Leitungswasser Rest
Nach der Sterilisierung des Reaktors wurde der Rührer auf 150+ 20 U/min eingestellt, die Temperatur des Mediums auf 37 i 2 "C gebracht und mit der Temperaturregelung auf diesem Wert gehalten. Der pH-Wert betrug 4,5 + 0,2 und wurde laufend von der pH-Regelung überwacht. Der für die Züchtung benötigte pH-Wert wurde mit 16%iger NaOH und 20%iger H2SO4 eingestellt.
Danach wurde das Kulturmedium mit der vorbereiteten Sporensuspension (7.106 Sporen 1-') inokuliert und mit geschlossenem Abzugsventil bei der angegebenen Temperatur gehalten und unter fortlaufender Frischluftzuführung (volumenbezogener Gasdurchsatz von 0,11 Luft pro 1 Flüssigkeit pro min) durch die Belüftungsleitung und Luftableitung aerob gehalten. Gelegentlich wurden 100 ml Probe durch das Abzugsventil des Reaktors aus dem Kulturmedium entnommen, durch einen tarierten Papierfilter filtriert und die Glucosekonzentration im Filtrat gemessen. Die Bestimmung des Glucosegehaltes wurde in einem automatischen Analysator (YSI-Instruments, USA) durchgeführt. Die auf dem Filter zurückgebliebene Biomasse wurde bei 80 "C getrocknet und ausgewogen.
Nach einer kurzen Verzögerungsphase (Lagphase) von einem Tag sank die Glucosekonzentration in der Kultur, und die Biotrockenmasse nahm gleichzeitig zu. Ein Tag nach dem Inokulieren erschienen die Pilze in Form kleiner Pellets, welche sich im Verlaufe des Versuches bis am 4. Tag zu einer Grösse von 3 bis 4 mm entwickelten. Die Glucose war nach 6 Tagen vollständig verbraucht. Ein bis zwei Tage danach konnte die Ligninase im Kulturfiltrat nachgewiesen werden, die in 5 Tagen eine Aktivität von 46 bis 62 Ul-1 erreichte.
Beispiel 2 Produktion von lignolytischer Brühe und die Entfärbung von Remazolblau
Phanerochaete chrysosporium wurde wie in Beispiel 1 gezüchtet. Nach dem vollständigen Verbrauch von Glucose wurden 3 mgl -1 Remazolblau ins Kulturmedium zugegeben.
Die blaue Farbe des Remazols verschwand innerhalb von 1 bis 2 Tagen.
Beispiel 3 Produktion lignolytischer Brühe und Ligninabbau
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch unter Zugabe von 0,1 gl-' Föhrenholzlignin aus der Sulfatkochung (Westvaco Co., Charleston, S.C., USA) gearbeitet. Es wurde 70 bis 80% vom Lignin innerhalb von 2 bis 3 Tagen abgebaut.
Beispiel 4 Produktion von lignolytischer Brühe unter Zugabe von Polyethylenglycol
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch unter Verwendung von Polyethylenglycol in gleicher Menge wie Polypropylenglycol. Ein bis zwei Tage nach dem vollständigen Glucoseverbrauch wurde die Brühe lignolytisch aktiv, und die Ligninase erreichte eine Aktivität von 102 bis 106 Ul-i 5 bis 6 Tage.
Beispiel 5 Produktion von lignolytischer Brühe unter Zugabe von Hexadecan
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch unter Verwendung von Hexadecan in gleicher Menge wie Polypropylenglycol. Ein bis zwei Tage nach dem vollständigen Abbau von Glucose verschwand die blaue Farbe vom Remazol, und es wurde eine Ligninaseaktivität von 10 bis 20 Ul-l erreicht.
DESCRIPTION
The invention relates to a method for producing lignolytic broths by biochemical means. Broths produced in this way are important in the breakdown of lignins in lignin-containing substances, such as kraft lignins or lignosulfate, and in the breakdown of persistent pollutants such as DDT, benzopyrene, dioxin, chlorophenol and the like. These crops are suitable for future environmental protection applications and for the disposal problems of industrial and public areas.
Process types are known which use white rot fungi as the producing species. These procedures are: - Non-stirred, flat cultures in 125 ml bottles with 10 ml culture content. In this connection it is to the publication of Jäger, A., Croan, S. and Kirk, T.K.
(1985) Appl. Microbiol. 50, 1274-1278.
- Shaken cultures in 125 ml, 1-1 and 2-1 bottles with 10 to 1 00 ml medium content on rotary shakers under the influence of oxygen. In this connection, reference is made to the publications by Asther, M., Corrieu, G., Drapron, R. and Odier, E. (1987) Enzym Microb. Technol. 9, 245-249 and by Jäger, A., Croan, S. and Kirk, T.K. (1985) Appl. Environ. Microbiol. 50, 1274-1278.
- Mycelium cultures in a non-stirred vertical or horizontal reactor with continuous supply of oxygen. In this context, reference is made to the publication by Linko, Y.Y., Leisola, M., Lindholm, N., Troller, J., Linko, P. and Fiechter, A. (1986) J. Biotechnol. 4, 283-291.
- Moving surface processes or drum reactors. In this context, reference is made to the publication by Kirk, T.K., Croan, S., Tien, M., Murtagh, K.E. and
Farrel, R.L. (1986) Enzyme Microb. Technol. 8, 27-32.
- Immobilized mycelium cultures in 250 ml bottles
without movement and under the influence of oxygen. In this context, reference is made to the publication by Linko, Y.Y., Leisola, M., Lindholm, N., Troller, J., Linko P. and Fiechter, A. (1986) J. Biotechnol. 4th, 283-291.
- Surface cultures on silicone tubing in a stirred reactor under the influence of oxygen. In this context, reference is made to the publication by Willershausen, H., Graf, H. and Jäger, A. (1987) in Lignin enzymic and microbial degradation les Colloques de l'INRA, No. 40, pages 203-207, Ed. INRA, Paris.
The disadvantages of the known methods for the microbial production of lignolytic broth are: The lignolytic property of the broth is caused by the biological activity of the microorganisms. For good production, it is therefore important that all microorganisms in the culture are constantly supplied with nutrient solution and that the cultivation parameters (pH, temperature, etc.) are checked. In the surface process, only a part of the microorganisms that are on the cultivated area are supplied. The outermost cultural layer remains inactive and not productive.
- The productivity of a surface process depends on the existing surface. This results in space problems in the industrial process.
- When using immobilized cells for the production of lignolytic broth, the carrier materials used must be separated from the broth after the production phase and possibly cleaned for recycling.
The additional treatment of the broth has an adverse effect on the economy of this process on an industrial scale.
None of the known methods is suitable for technical or large-scale operations. The aim of the invention is therefore to provide a process for the commercial production of lignolytic broths, the preparation and workup of the reaction solution being designed to be technically simple.
The object of the invention is to produce the solutions with high lignolytic activity in a technically simple process. This object is achieved according to the invention by a method with the features specified in claim 1. The preferred embodiment of the method according to the invention has the features specified in claims 2 to 6.
Surprisingly, and contrary to the teachings of the prior art, it was found that Phanerochaete chrysosporium also shows lignolytic activity in the stirred kettle if certain conditions are met. The stirred submerged systems are particularly suitable for large-scale use, since the homogeneity within the culture vessel is better guaranteed than with the surface process or with immobilized cells. The scale-up and the control of the cultivation / production parameters are easier in the case of the stirred kettle.
The use of non-carrier-bound and free microorganisms enables the broth produced to be used or processed directly.
The taxonomy of the basidomycetes suitable according to the invention is not complete, and the term white rot fungi or white-red fungi presumably also include different genera of rust and / or smut fungi, e.g. B. Fusarium; The white rot fungi Phanerochaete chrysosporium and Coriolus versicolot, which have already been described, have proven to be particularly useful for the process according to the invention.
Rust and / or burn fungi, in particular Phanerochaete chrysosporium, are capable of forming lignolytic solutions when grown in suitable media and under suitable conditions. Various enzymes such as lignin peroxidase (ligninase), manganese peroxidase and laccase are responsible for the lignolytic properties of the broth. In this context, reference is made to the publication by Kirk, T.K. (1987) Phil. Trans. R. Soc. London. A 321, 461474. The full identification of the enzymes involved and their composition and regulation have not yet been completed.
The broth produced by the process according to the invention is characterized by the features mentioned in claim 7. The broth becomes lignolytically active if one or more of the conditions mentioned in claim 7 are met, namely: - Detection of lignin peroxidase in the culture filtrate. Ligninase is determined using the method described by Tien, M. and Kirk, T.K. (1984) in Proc. Natl. Acad. Sci.
81, 2280-2284.
- Decolorization of Remazol brilliant blue R dye. After adding e.g. 3 mgl- 'of this dye the broth turns blue. If the culture now becomes active, this coloring disappears.
- Lignin breakdown. Addition of e.g. 100 mgl- 'of a lignin (commercially available alkali lignin from pine wood, indulin) in lignolytically active broth leads to the breakdown of this lignin.
Lignin degradation is determined by the decrease in culture absorption at 280 nm and pH 11.
To carry out the method according to the invention, work is carried out under aerobic conditions in a stirred tank (bioreactor) which has a heater and one or more turbine stirrers. The reactor is equipped with two locks for inoculating a quantity of culture medium placed in the reactor and for taking samples. The heating, which keeps the temperature inside the reactor constant, is controlled by a temperature control. The pH of the broth is continuously monitored with a pH meter and automatically regulated with acid or alkali if necessary. Furthermore, oxygen, air or another oxygen-containing gas mixture is fed in through a line in an amount sufficient to maintain aerobic conditions.
During cultivation, the mixture is constantly stirred in such a way that the cell threads clump and pellets form. Pellet formation is essential for the process according to the invention. Excessively high stirrer speeds mean that pellet formation is prevented or that a considerable part of the pellets are broken or frayed. For this purpose, conventional stirrers with relatively low stirrer tip speeds of 0.5 to 1.0 mm ¯ 'are suitable. A final definition of stirring conditions and kinetics is practically not possible, but the optimization within the framework of the above-mentioned boundary between bales of cell filaments and destruction of the pellets for a given mushroom material can easily be determined using a few simple experiments.
Apart from the special conditions explained below, the process according to the invention can be carried out under the general culture conditions (temperature, pH value, essential growth components) suitable for the microbes mentioned. For example, a temperature range of 25 to 40 "C is suitable for cultivation and that of 35 to 38" C is preferred. The pH of the medium is generally between 3.5 and 6.5 and preferably between 4 and 5.
The medium for growing the pellets can be the usual sources of carbon (simple carbohydrates, such as sugar, e.g. glucose, fructose, polymeric carbohydrates, e.g. starch, cellulose, glucans or salts of organic acids, such as acetates, succinates, tartrates etc.) and nitrogen (Ammonium salts, nitrates or complex organic nitrogen compounds) as well as vitamins (thiamine is usually sufficient) and minerals such as Fe, Mg, Ca, and trace elements such as Mn, Co, Zn, Cu (network water is usually sufficient). The amount of medium ingredients should be chosen so that the growth is limited by one or more essential growth substances, preferably carbon, and the remaining ingredients are present in excess.
The proportion of a growth substance in the culture medium is called limiting if a reduction in the proportion of the growth substance in the culture medium leads to a noticeable decrease in biomass production. Such a depletion or limitation of the essential growth substances has the consequence that the mushroom material practically no longer multiplies, which leads to a lignolytic activation of the broth.
It is essential for the method according to the invention that the medium contains one or more cell and rod licensing substances such as polyethylene glycol and / or polypropylene glycol but also hydrocarbons. The investigations to clarify the mode of action of the substances suitable according to the invention on the activation of the broth have not been completed. Similar effects are achieved by adding detergents such as tween or oleic acid. In this connection, reference is made to the publications by Asther, M., Corrieu, G., Drapron, R. and Odier, E. (1987) Enzym Microb. Technol. 9, 245-249 and by Jäger, A., Croan, S. and Kirk, T.K. (1985) Appl. Environ. Microbiol.
50, 1274-1278.
As such, the active broth may e.g. B. used for the degradation of lignins in lignin-containing substances or persistent pollutants; or it can be worked up in a known manner by centrifugation and / or filtration for the production of an enzyme preparation with lignolytic activity. The invention is illustrated by the following examples.
Example 1 Production of lignolytic broth with the addition of polypropylene glycol
The strain Phanerochaete chrysosporium, with the accession number ATCC 24725, was cultivated on 40 ml 2% maltagar in 300 ml Erlenmeier flasks for 4 days or longer at 37 ° C. until complete sporulation (agar surface covered with white spores). The spores were grown in Suspended 30 ml of sterile water and determined their number microscopically.The spore suspension was used for the vaccination of the reactor.
A mechanically stirred reactor with two six-bladed disk stirrers and four baffles was used to initiate the process according to the invention. Sketch of this stirred tank reactor, compilation of the dimensions of the vessel, internals, stirring and gassing devices as well as some characteristic geometric parameters are given in Fig. 1. The ventilation was carried out in each case by means of a gas distribution ring below the lowest stirring unit. The reactor had four baffles and its total volume was 0.042 m3. The reactor was designed for a maximum filling volume of 0.03 m3. The reactor was mixed with 30 l of fresh culture medium, which has the composition given in the table below, and its pH was adjusted to 4.5 with phosphoric acid and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes.
Table 1 component concentration (liter) - 'glucose 3 g diammonium tartrate 0.66 g MgSO4-7H20 0.15 g CaCl2 to 2H20 30 mg FeSO4-7H20 5.55 mg thiamine 100 mg tap water rest
After the reactor had been sterilized, the stirrer was set to 150+ 20 rpm, the temperature of the medium was brought to 37 1 2 ° C. and kept at this value by means of the temperature control. The pH was 4.5 + 0.2 and was continuously monitored by the pH control and the pH value required for cultivation was set with 16% NaOH and 20% H2SO4.
The culture medium was then inoculated with the prepared spore suspension (7,106 spores 1- ') and kept at the specified temperature with the trigger valve closed and kept aerobic with continuous supply of fresh air (volume-related gas throughput of 0.11 air per 1 liquid per min) through the ventilation line and air discharge . Occasionally, 100 ml of sample was removed from the culture medium through the reactor discharge valve, filtered through a tared paper filter and the glucose concentration in the filtrate was measured. The determination of the glucose content was carried out in an automatic analyzer (YSI-Instruments, USA). The biomass remaining on the filter was dried at 80 ° C. and weighed out.
After a short delay phase (lag phase) of one day, the glucose concentration in the culture decreased and the dry biomass increased at the same time. One day after the inoculation, the mushrooms appeared in the form of small pellets, which developed in the course of the experiment up to the 4th day to a size of 3 to 4 mm. The glucose was completely consumed after 6 days. One to two days later, the ligninase could be detected in the culture filtrate, which reached an activity of 46 to 62 Ul-1 in 5 days.
Example 2 Production of Lignolytic Broth and Decolorization of Remazole Blue
Phanerochaete chrysosporium was grown as in Example 1. After the complete consumption of glucose 3 mgl -1 Remazolblau were added to the culture medium.
The blue color of the remazole disappeared within 1 to 2 days.
Example 3 Production of Lignolytic Broth and Lignin Degradation
The procedure was as in Example 1, but with the addition of 0.1 gl- 'pine wood lignin from the sulfate boil (Westvaco Co., Charleston, S.C., USA). 70 to 80% of the lignin was broken down within 2 to 3 days.
Example 4 Production of lignolytic broth with the addition of polyethylene glycol
The procedure was as in Example 1, but using polyethylene glycol in the same amount as polypropylene glycol. One to two days after complete glucose consumption, the broth became lignolytically active and the ligninase reached an activity of 102 to 106 ul-i for 5 to 6 days.
Example 5 Production of lignolytic broth with addition of hexadecane
The procedure was as in Example 1, but using hexadecane in the same amount as polypropylene glycol. One to two days after the complete breakdown of glucose, the blue color of the remazol disappeared and ligninase activity of 10 to 20 ul-1 was achieved.