CN111417707A - 储存稳定的酶制剂、其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

液体酶制剂，含有组分(a)：至少一种通式(I)的盐：(R2)3N+‑(CH2)nC(R3)(R4)‑(O‑X)m‑O‑C(O)‑R1A‑(I)，其中n选自1‑12，m选自0‑50，R1选自线性或支化C1‑C10烷基和C6‑C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，R2相同或不同且选自C1‑C10烷基、苯基，R3和R4相同或不同且选自氢和C1‑C4烷基，X为C2‑C4亚烷基，以及A‑为无机或有机抗衡阴离子，组分(b)：至少一种选自水解酶(EC 3)的酶，以及任选地，组分(c)：至少一种选自不同于组分(a)的酶稳定剂、防腐剂和表面活性剂的化合物。

Description

储存稳定的酶制剂、其制备和应用
本发明涉及一种酶制剂，含有：
组分(a)：至少一种通式(I)的盐：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，
R2相同或不同且选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，
X为C2-C4亚烷基，以及
A-为无机或有机抗衡阴离子，
组分(b)：至少一种选自水解酶(EC 3)的酶，和
任选地，组分(c)：至少一种选自不同于组分(a)的酶稳定剂和表面活性剂的化合物。
酶在商业上通常作为通常衍生于发酵液的液体浓缩物生产。若保留在含水环境中，则该酶倾向于不稳定，因此常规实践是将其转化成无水形式：含水浓缩物可以例如在载体材料存在下冻干或喷雾干燥而形成聚集体。固体酶产品通常需要在使用之前“溶解”。为了稳定液体产品中的酶，已知的是使用酶抑制剂，优选可逆酶抑制剂来暂时抑制酶活性，直到释放该酶抑制剂。
已知硼酸和有机硼酸可逆抑制蛋白水解酶。有机硼酸对一种丝氨酸蛋白酶—枯草蛋白酶的抑制的讨论在Molecular&Cellular Biochemistry 51，1983，第5-32页中提供。为了再活化，需要在应用之前或之中除去该抑制剂，这例如可以通过稀释进行。
此外，已知脂解酶的稳定性通过加入稳定化材料如有机硼酸衍生物以与脂解酶的活性部位可逆地形成复合体而改进(例如EP0478050)。
由于环境考虑，需要至少降低用于酶稳定化的含硼化合物的量。寻求在酶存在下用作酶稳定剂的替代品。
本发明待解决的问题涉及提供一种替换的酶稳定剂。本发明的另一目的是要提供一种允许灵活配制到具有高或低水含量的配制剂—二者就其中所含酶而言具有优异的保存期—中的酶制剂。
该问题通过使用至少一种通式(I)的盐作为酶稳定剂解决，其中通式(I)如下：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，
R2相同或不同且选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，
X为C2-C4亚烷基，以及
A-为无机或有机抗衡阴离子。
本发明的酶稳定剂优选稳定选自水解酶(EC 3)的酶。酶名称基于theNomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology(IUBMB)的推荐对本领域熟练技术人员是已知的。酶名称包括：EC(酶委员会)号，推荐名，别名(若有的话)，催化活性和其他因素；见2017年3月12日最近更新版本的http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/。
在一个实施方案中，至少一种水解酶选自作用于酯键上的酶(EC 3.1)、糖基化酶(EC 3.2)和肽酶(EC 3.4)。
本发明提供了一种液体酶制剂，含有：
组分(a)：至少一种通式(I)的盐：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，
R2相同或不同且选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，
X为C2-C4亚烷基，以及
A-为无机或有机抗衡阴离子，
组分(b)：至少一种酶，优选选自水解酶(EC 3)的酶，和
任选地，组分(c)：至少一种选自不同于组分(a)的酶稳定剂和表面活性剂的化合物。
本发明的酶制剂可以在20℃和101.3kPa下为液体。在一个实施方案中，液体是指该酶制剂甚至在储存20天之后也不显示出痕量的沉淀形成或浊度。
组分(a)
盐(组分(a))是胆碱的有机酯或胆碱的衍生物的盐。盐(组分(a))的阴离子—抗衡离子—可以是无机或有机的，优选是有机的。盐(组分(a))的无机抗衡离子的实例是硝酸根、氢氧根、硫酸根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、碳酸根、碳酸氢根和卤离子，例如溴离子或氯离子。优选卤离子，尤其是氯离子，以及硫酸根、碳酸根和碳酸氢根。有机抗衡离子的实例是乳酸根、乙酸根、酒石酸根、柠檬酸根和CH3SO3 -(甲磺酸根)。在具有二价或三价抗衡离子的实施方案中，存在相应摩尔量的阳离子。
盐(组分(a))中的氮原子带有3个甲基和羟乙基。本发明上下文中所用术语胆碱的衍生物涉及带有至少一个甲基以外的烷基或2-羟基乙基以外的羟烷基或其他烷氧基的化合物。
更具体而言，组分(a)为通式(I)化合物：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，例如1-9，优选1、2、3或4，甚至更优选n为1；
m选自0-50，例如2-50，优选10-25。然而，最优选m为0；
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团。R1的优选实例是未取代的C1-C6烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正己基，优选的未取代C1-C10烷基是甲基和乙基，此外还有取代的C1-C10烷基如-CH(OH)-CH(OH)-COOH、CH(OH)-CH3、(E)-CH＝CHCOOH、(Z)-CH＝CHCOOH，-C6H5，对-HO-C6H4-，o,p-二羟基苯基和3,4,5-三羟基苯基。在优选实施方案中，O-C(O)-R1一起构成柠檬酸酯。甚至更优选R1为甲基；
R2相同或不同且选自苯基和C1-C10烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、2-正丙基庚基或异癸基，优选线性C1-C10烷基，更优选线性C1-C4烷基，甚至更优选至少两个R2基团为CH3且第三R2选自线性C1-C10烷基，最优选所有R2相同且为甲基；
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，优选正烷基，例如甲基、乙基、正丙基和正丁基，甚至更优选R3和R4均为氢。在另一实施方案中，R3为C1-C4烷基且R4为氢，优选R3为甲基且R4为氢；
X为C2-C4亚烷基，例如-CH2-CH2-、-CH(CH3)-CH2-、-(CH2)3-、CH2-CH(CH3)-或-(CH2)4-；以及
A-为无机或有机抗衡阴离子。盐(组分(a))的无机抗衡离子的实例是硫酸根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、碳酸根、碳酸氢根和卤离子，例如溴离子或氯离子。优选卤离子，尤其是氯离子，以及硫酸根、碳酸根和碳酸氢根。有机抗衡离子的实例是乳酸根、乙酸根、酒石酸根、柠檬酸根和CH3SO3 -(甲磺酸根)。
组分(a)不是表面活性剂。在一个实施方案中，5g组分(a)在1000g水中的溶液在20℃和101.3kPa下具有>45mN/m的动态表面张力。5g组分(a)在1000g水中的溶液在20℃和101.3kPa下可以具有≥50mN/m的动态表面张力。
动态表面张力可以用气泡压力张力计测量，其中测量借助毛细管在液体中形成的气泡的最大内部压力；测量的值通常对应于在一定表面年龄—从气泡形成开始到出现压力最大值的时间—下的表面张力。在一个实施方案中，用气泡压力张力计测量在20℃和101.3kPa下的动态表面张力过程中的表面年龄为50ms。
盐(组分(a))的最优选实例是以酒石酸根或柠檬酸根作为抗衡离子的胆碱酯的盐以及乙酰胆碱、胆碱柠檬酸酯和胆碱酒石酸酯的盐，例如乳酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐。
在其中抗衡阴离子A-为—或者可以为—二价如硫酸根、酒石酸根、碳酸根，或多价如磷酸根或柠檬酸根的实施方案中，必要的正电荷可以由另一盐(组分(a))衍生的阳离子或者由碱金属阳离子如钾或优选钠或者由未被取代或者被C1-C4烷基和/或2-羟基乙基取代的铵提供。
在其中R1带有一个或多个羧基的实施方案中，它们可以是游离COOH基团或者被碱金属，例如钾或尤其是钠部分或完全中和，或者它们可以例如用(R2)3N+-(CH2)n-(O-X)m-OH酯化。该类实施方案产生相应二-或三羧酸的二-或三酯，若适用的话。例如酒石酸或柠檬酸的单-和二酯的混合物以及柠檬酸的二-和三酯的混合物也是可行的。
在本发明的优选实施方案中，盐(组分(a))为式(II)化合物：
(CH3)3N+-(CH2)2-O-C(O)-R5(A1)- (II)
其中(A1)-选自甲磺酸根、酒石酸根和柠檬酸根，
并且其中R5选自-CH2-C(OH)(COOX2)-CH2-COOX2和-CH(OH)-CH(OH)-COOX1，
其中X1选自氢、碱金属—尤其是钠—和(CH3)3N+-(CH2)2-，
以及其中X2相同或不同且选自氢、碱金属—尤其是钠—和(CH3)3N+-(CH2)2-。在优选实施方案中，O-C(O)-R5的酯基和(A1)-相互对应。
在本发明的一个实施方案中，液体酶制剂相对于该酶制剂的总重量以在0.1-30重量％范围内的量含有组分(a)。该酶制剂可以以在0.1-15重量％，0.25-10重量％，0.5-10重量％，0.5-6重量％或1-3重量％范围内的量含有组分(a)，全部相对于该酶制剂的总重量。
在本发明的一个实施方案中，盐(组分(a))含有如下化合物(a’)作为杂质：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-OH R1-COO-
其中变量R1、R2、X、n和m与相应盐(组分(a))中的相同。所述杂质可以占盐(组分(a))的至多50mol％，优选0.1-20mol％，甚至更优选1-10mol％。尽管杂质化合物(a’)可以源于盐(组分(a))的合成且可以通过提纯方法除去，但并不优选除去它。
组分(b)
在本发明的一个方面，至少一种包含在组分(b)中的酶为液体酶浓缩物的一部分。本文的“液体酶浓缩物”是指任何包含至少一种酶的液体含酶产品。“液体”在酶浓缩物的上下文中涉及在20℃和101.3kPa下的物理外观。
该液体酶浓缩物可以来自固体酶在溶剂中的溶解。该溶剂可以选自水和有机溶剂。来自固体酶在溶剂中溶解的液体酶浓缩物可以包含其量至多为饱和浓度的酶。
本文的溶解是指固体化合物通过与至少一种溶剂接触而液化。溶解是指固体化合物完全溶解直到在规定溶剂中达到饱和浓度，其中不发生相分离。
在本发明的一个方面，所得酶浓缩物的组分(b)可以不含水，这是指不存在显著量的水。本文中非显著量的水是指该酶制剂包含小于25重量％，小于20重量％，小于15重量％，小于10重量％，小于7重量％，小于5重量％，小于4重量％，小于3重量％，小于2重量％的水，全部相对于该酶浓缩物的总重量，或者不含水。
在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含至少一种选自如下的有机溶剂：乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、二甘醇、丙基二甘醇、丁基二甘醇、己二醇、乙二醇甲基醚、乙二醇乙基醚、乙二醇丙基醚和苯氧基乙醇，优选乙醇、异丙醇或丙二醇。此外，本发明的酶制剂可以包含至少一种选自诸如2-丁氧基乙醇、异丙醇和d-柠檬烯的化合物的有机溶剂。
包含水的液体酶浓缩物可以称为“含水酶浓缩物”。含水酶浓缩物可以是含酶溶液，其中固体酶产品已经溶于水中。在一个实施方案中，“含水酶浓缩物”是指通过发酵由酶生产得到的含酶产品。
发酵是指在合适的营养培养基中培养表达所需酶并且表达所需蛋白的重组细胞以允许重组宿主细胞生长的方法(该方法可以称为发酵)。在发酵结束时，通常收集发酵液并进一步加工，其中该发酵液包含液体级分和固体级分。取决于该酶是否已经分泌到液体级分中，可以从发酵液的液体级分或从细胞裂解产物回收所需蛋白或酶。所需酶的回收使用本领域熟练技术人员已知的方法。适合从发酵液回收蛋白或酶的方法包括但不限于收集、离心、过滤、萃取和沉淀。
液体酶浓缩物可以包含的酶量在0.1-40重量％或0.5-30重量％或1-25重量％或3-25重量％或5-25重量％范围内，全部相对于该酶浓缩物的总重量。在一个实施方案中，液体酶浓缩物来自发酵并且是含水的。
由发酵得到的含水酶浓缩物可以包含的水量大于约50重量％，大于约60重量％，大于约70重量％或大于约80重量％，全部相对于该酶浓缩物的总重量。由发酵得到的含水酶浓缩物可以包含残留组分如来自发酵培养基的盐、来自增殖宿主细胞的细胞碎片、在发酵过程中由增殖宿主细胞产生的代谢物。在一个实施方案中，残留组分可以以小于30重量％，小于20重量％，小于10重量％或小于5重量％的量包含在液体酶浓缩物中，全部相对于该含水酶浓缩物的总重量。
至少一种包含在组分(b)中的酶选自水解酶(EC 3)，下文也称为酶(组分(b))。优选的酶(组分(b))选自作用于酯键上的酶(E.C.3.1)、糖基化酶(E.C.3.2)和肽酶(E.C.3.4)。作用于酯键上的酶(E.C.3.1)下文也称为脂肪酶(组分(b))。糖基化酶(E.C.3.2)下文也称为淀粉酶(组分(b))和纤维素酶(组分(b))。肽酶下文也称为蛋白酶(组分(b))。
水解酶(组分(b))在本发明上下文中由多肽序列(本文也称为氨基酸序列)辨别。多肽序列规定了三维结构，包括酶的“活性部位”，后者又决定了酶的催化活性。多肽序列可以由SEQ ID NO辨别。根据世界知识产权局(WIPO)标准ST.25(1998)，本文中氨基酸使用第一个字母大写的三字母代码或相应的一字母表示。
本发明的酶(组分(b))涉及亲本酶和/或变体酶，均具有酶促活性。具有酶促活性的酶呈酶催活性或产生酶促转变，意味着酶作用于底物上并将这些转化成产物。本文中的术语“酶”不包括酶的无活性变体。
(也称为“亲本酶”的亲本蛋白或酶的)“亲本”序列是对该序列引入变化(例如通过引入一个或多个氨基酸置换、插入、缺失或其组合)的起始序列，得到亲本序列的“变体”。术语亲本酶(或亲本序列)包括野生型酶(序列)和合成产生的序列(酶)，它们用作引入(进一步)变化的起始序列。
术语“酶变体”或“序列变体”或“变体酶”涉及与其亲本酶在一定程度上在其氨基酸序列上不同的酶。若无相反指示，“具有酶促活性”的变体酶是指该变体酶具有与相应亲本酶相同类型的酶促活性。
在描述本发明的变体时，使用如下所述的命名：
氨基酸置换通过在亲本酶的原始氨基酸之后提供该氨基酸序列内的位置编号，然后是置换的氨基酸而描述。
氨基酸缺失通过在亲本酶的原始氨基酸之后提供该氨基酸序列内的位置编号，然后是*而描述。
氨基酸插入通过在亲本酶的原始氨基酸之后提供该氨基酸序列内的位置编号，然后是该原始氨基酸和该额外氨基酸而描述。例如在紧邻甘氨酸的赖氨酸的位置180插入表示为“Gly180GlyLys”或“G180GK”。
在其中置换和插入发生在相同位置的情况下，这可以表示为S99SD+S99A或简称S99AD。在其中插入与现有氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，清楚的是出现命名简并。若例如在上述实例中的甘氨酸之后插入甘氨酸，则这由G180GG表示。
当在一个位置可以引入不同的改变时，不同的改变由逗号分隔，例如“Arg170Tyr，Glu”表示在位置170的精氨酸用酪氨酸或谷氨酸置换。或者，不同的改变或任选的置换可以用括弧表示，例如Arg170[Tyr，Gly]或Arg170{Tyr，Gly}；或者简称R170[Y，G]或R170{Y，G}；或者全称R170Y，R170G。
酶变体可以通过与亲本酶相比较时其序列一致性限定。序列一致性通常以“序列一致性％”或“一致性％”提供。为了计算序列一致性，在第一步中必须产生序列比对。根据本发明，必须产生成对全局对齐，这意味着两个序列必须在其整个长度上对齐，这通常通过使用称为对齐算法的数学近似产生。
根据本发明，对齐通过使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(1979)48，第443-453页)产生。优选将程序“NEEDLE”(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite(EMBOSS))用于本发明的目的，使用程序默认参数(间隙打开＝10.0，间隙延伸＝0.5且矩阵＝EBLOSUM62)。
根据本发明，应用一致性％的下列计算：一致性％＝(相同残基/在其完整长度上显示本发明的相应序列的对齐区域长度)*100。
根据本发明，酶变体可以描述为与相应亲本酶的氨基酸序列至少n％相同的氨基酸序列，其中“n”为10-100之间的整数。在一个实施方案中，变体酶在与亲本酶的全长氨基酸序列相比较时至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同，其中该酶变体具有酶促活性。
酶变体可以通过与亲本酶相比较时其序列相似性限定。序列相似性通常提供为“序列相似性％”或“相似性％”。序列相似性％考虑限定的氨基酸组共享相似性能，例如其尺寸、其疏水性、其电荷或其他特性。本文中一种氨基酸用相似氨基酸交换可以称为“保守突变”。
为了确定本发明的相似性％，下列情形适用：氨基酸A与氨基酸S相似；氨基酸D与氨基酸E和N相似；氨基酸E与氨基酸D、K和Q相似；氨基酸F与氨基酸W和Y相似；氨基酸H与氨基酸N和Y相似；氨基酸I与氨基酸L、M和V相似；氨基酸K与氨基酸E、Q和R相似；氨基酸L与氨基酸I、M和V相似；氨基酸M与氨基酸I、L和V相似；氨基酸N与氨基酸D、H和S相似；氨基酸Q与氨基酸E、K和R相似；氨基酸R与氨基酸K和Q相似；氨基酸S与氨基酸A、N和T相似；氨基酸T与氨基酸S相似；氨基酸V与氨基酸I、L和M相似；氨基酸W与氨基酸F和Y相似；氨基酸Y与氨基酸F、H和W相似。
保守氨基酸置换可以在功能蛋白如酶的多肽序列的全长序列上发生。在一个实施方案中，该类突变与酶的功能域无关。在一个实施方案中，保守突变与酶的催化中心无关。
为了考虑保守突变，可以由用于计算一致性％的相同对齐计算两个氨基酸序列的序列相似性值。
根据本发明，应用相似性％的下列计算：相似性％＝[(相同残基+相似残基)/在其完整长度上显示本发明的相应序列的对齐区域长度)*100。
根据本发明，酶变体可以描述为与相应亲本序列至少m％相似的氨基酸序列，其中“m”为10-100之间的整数。在一个实施方案中，变体酶在与亲本酶的全长多肽序列相比较时至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似，其中该变体酶具有酶促活性。
“酶促活性”是指酶所产生的催化效果，通常表示为单位/毫克酶(比活性)，涉及每分钟每个酶分子转化的底物分子(分子活性)。
当变体酶显示出相应亲本酶的酶促活性的至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或100％时，所述酶变体可以具有本发明的酶促活性。
至少一种包含在组分(b)中的酶选自水解酶(EC 3)。
脂肪酶
在一个实施方案中，本发明酶制剂包含至少一种脂肪酶(EC 3.1.1；组分(b))。“脂肪酶”、“脂解酶”、“类脂酯酶”全部涉及EC类3.1.1的酶(“羧酸酯水解酶”)。脂肪酶是指具有脂肪酶活性(或脂解活性；甘油三酯脂肪酶，EC 3.1.1.3)、角质酶活性(EC 3.1.1.74；具有角质酶活性的酶在本文可以称为角质酶)、甾醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡-酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)的活性蛋白。
测定脂解活性的方法在文献中是众所周知的(例如见Gupta等(2003)，Biotechnol.Appl.Biochem.37，第63-71页)。例如，脂肪酶活性可以通过底物—释放为黄色且可以在405nm下检测的pNP的棕榈酸对硝基苯基酯(pNP-Palmitate，C:16)中的酯键水解测量。
“脂解活性”是指脂肪酶所产生的催化效果，其可以以脂解单位(LU)提供。例如，1LU可能对应于在pH不变下在下列条件下每分钟产生1μmol可滴定脂肪酸的脂肪酶量：温度30℃；pH＝9.0；底物可以是3.3重量％橄榄油和3.3％阿拉伯树胶的乳液，在5mmol/l三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的13mmol/l Ca2+和20mmol/l NaCl存在下。
脂肪酶(组分(b))包括细菌或真菌来源的那些。在本发明的一个方面，合适的脂肪酶(组分(b))选自下列：来自腐质霉属(Humicola)(同义词嗜热真菌属(Thermomyces))的脂肪酶，例如如EP 258068，EP 305216，WO 92/05249和WO 2009/109500所述来自H.lanuginosa(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))或者如WO 96/13580所述来自特异腐质霉(H.insolens)；如WO 92/05249所述衍生于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶；来自假单胞菌属(Pseudomonas)(这些中的一些现在改名为伯克霍尔德菌属(Burkholderia))菌株的脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272，WO 94/25578，WO 95/30744，WO 95/35381，WO 96/00292)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1372034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)，威斯康辛假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)，门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(WO 95/14783)，荚壳假单胞菌(P.glumae)(WO 95/35381，WO96/00292)；来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO 2011/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO 2012/137147)的脂肪酶，GDSL类型链霉菌脂肪酶(WO 2010/065455)；如WO 2011/084412所公开的来自嗜热单孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶；如WO 2011/084417所公开的来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的脂肪酶；例如如WO 00/60063所公开的芽孢杆菌脂肪酶，如Dartois等(1992)，Biochemicaet Biophysica Acta，1131，253-360或WO 2011/084599所公开的来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的脂肪酶，来自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP S64-074992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶；如WO 94/01541所公开的来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US5389536，WO 88/09367)；来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的角质酶(WO 2010/107560)；如WO 90/09446，WO 00/34450和WO 01/92502所公开的来自太阳镰刀菌(Fusarumsolani pisi)的角质酶；以及如WO 00/34450和WO 01/92502所公开的来自Humicolalanuginosa的角质酶。
合适的脂肪酶(组分(b))还包括称为酰基转移酶或过水解酶的那些，例如与南极假丝酵母脂肪酶A同源的酰基转移酶(WO 2010/111143)，来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 2005/056782)，来自CE7家族的过水解酶(WO 2009/67279)以及耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)过水解酶的变体，尤其是S54V变体(WO2010/100028)。
合适的脂肪酶(组分(b))还包括为具有脂解活性的上述脂肪酶的变体的那些。该类合适的脂肪酶变体(组分(b))例如是由WO 95/22615，WO 97/04079，WO 97/07202，WO 00/60063，WO 2007/087508，EP 407225和EP 260105所公开的方法开发的那些。
合适的脂肪酶(组分(b))包括当与如上所公开的亲本酶的全长多肽序列相比较时至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的具有脂解活性的脂肪酶变体。
合适的脂肪酶(组分(b))包括当与该亲本酶的全长多肽序列相比较时至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似的具有脂解活性的脂肪酶变体。
在一个实施方案中，脂肪酶(组分(b))选自真菌甘油三酯脂肪酶(EC类别3.1.1.3)。真菌甘油三酯脂肪酶(组分(b))可以选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)的脂肪酶。在一个实施方案中，疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(组分(b))选自根据US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的甘油三酯脂肪酶及其具有脂解活性的变体。根据US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的甘油三酯脂肪酶在本文可以称为Lipolase。
疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(组分(b))可以选自当与US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的全长多肽序列相比较时至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的具有脂解活性的变体。
疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(组分(b))可以选自仅包含保守突变的具有脂解活性的变体，但与US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的功能域无关。该实施方案的具有脂解活性的脂肪酶变体当与US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的全长多肽序列相比较时可以至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似。
疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(组分(b))可以与US 5869438的特征在于具有氨基酸T231R和N233R的SEQ ID NO:2至少80％相同。所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶可以进一步包含下列氨基酸交换中的一个或多个：Q4V，V60S，A150G，L227G，P256K。
在一个实施方案中，至少一种脂肪酶选自市售脂肪酶，包括但不限于以商品名LipolaseTM、LipexTM、LipolexTM和LipocleanTM(Novozymes A/S)，Lumafast(最初来自Genencor)和Lipomax(Gist-Brocades/现为DSM)销售的产品。
根据本发明，组分(b)可以包含至少两种优选选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)的脂肪酶的组合。
在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自根据如上所公开的US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的甘油三酯脂肪酶及其具有脂解活性的变体的脂肪酶。
在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种优选选自甘油三酯脂肪酶(EC3.1.1.3)的脂肪酶和至少一种优选选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，更优选选自枯草蛋白酶类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶的组合。
蛋白酶
在一个实施方案中，本发明酶制剂包含至少一种蛋白酶(组分(b))。蛋白酶是EC3.4类别的成员。蛋白酶(组分(b))包括氨肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC 3.4.13)、二肽基肽酶和三肽基肽酶(EC 3.4.14)，肽基二肽酶(EC 3.4.15)，丝氨酸型羧肽酶(EC 3.4.16)，金属羧肽酶(EC 3.4.17)，半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)，ω肽酶(EC 3.4.19)，丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)，天冬氨酸内肽酶(EC 3.4.23)，金属内肽酶(EC 3.4.24)，苏氨酸内肽酶(EC 3.4.25)或催化机理未知的内肽酶(EC 3.4.99)。
在一个实施方案中，至少一种蛋白酶(组分(b))选自丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶的特征在于在催化活性部位具有丝氨酸，其在催化反应过程中与底物形成共价加合物。丝氨酸蛋白酶(组分(b))在本发明上下文中选自糜蛋白酶(例如EC3.4.21.1)，弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.36)，弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.37或EC3.4.21.71)，粒酶(例如EC 3.4.21.78或EC 3.4.21.79)，激肽释放酶(例如EC 3.4.21.34，EC 3.4.21.35，EC 3.4.21.118或EC 3.4.21.119)，纤溶酶(例如EC 3.4.21.7)，胰蛋白酶(例如EC 3.4.21.4)，凝血酶(例如EC 3.4.21.5)和枯草蛋白酶。枯草蛋白酶也已知为枯草杆菌蛋白酶，例如EC 3.4.21.62，后者在下文也称为“枯草蛋白酶”。
Siezen等(1991)，Protein Eng.4:719-737和Siezen等(1997)，Protein Science6:501-523已经提出了暂定为枯草杆菌酶的丝氨酸蛋白酶亚组。枯草杆菌酶包括枯草蛋白酶家族，嗜热蛋白酶家族，蛋白酶K家族，羊毛硫抗生素肽酶家族，Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶亚组是为来自MEROPS数据库(http://merops.sanger.ac.uk)所定义的家族S8的丝氨酸蛋白酶的枯草蛋白酶。肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草蛋白酶及其同源物。在亚族S8A中，活性部位残基通常出现在基元Asp-Thr/Ser-Gly(类似于clan AA中的天冬氨酸内肽酶的家族中的序列基元)、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro中。
枯草蛋白酶相关类别的丝氨酸蛋白酶(组分(b))共享共同的氨基酸序列，后者限定了将其与糜蛋白酶相关类别的丝氨酸蛋白酶区分的催化三联体。枯草蛋白酶和糜蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶均具有包含天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体。
实例包括如WO 89/06276，EP 0283075，WO 89/06279，WO 89/09830，WO 89/09819，WO 91/06637和WO 91/02792所述的枯草蛋白酶。
蛋白酶是产生“蛋白酶活性”或“蛋白水解活性”的活性蛋白。蛋白水解活性与蛋白酶或蛋白水解酶在限定的时间范围内降解蛋白质的速率有关。
分析蛋白水解活性的方法在文献中是众所周知的(例如见Gupta等(2002)，Appl.Microbiol.Biotechnol.60:381-395)。蛋白水解活性可以通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基酰替苯胺(Suc-AAPF-pNA，简称AAPF；例如见DelMar等(1979)，AnalyticalBiochem 99，316-320)作为底物测定。pNA通过蛋白水解裂解从底物分子裂解，导致释放可以通过测量OD405而定量的游离pNA的黄色。
蛋白水解活性可以以单位/克酶提供。例如，1U蛋白酶可以对应于在pH 8.0和37℃下(酪蛋白作为底物)每分钟释放1μmol福林阳性氨基酸和肽(作为酪氨酸)的蛋白酶量。
枯草蛋白酶类型(EC 3.4.21.62)的蛋白酶(组分(b))可以是来自微生物的细菌蛋白酶，选自芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶，或者革兰氏阴性细菌多肽如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(llyobacter)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和尿素支原体菌属(Ureaplasma)。
在本发明的一个方面，至少一种蛋白酶(组分(b))选自嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)，灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，蜡样芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白酶。
在本发明的一个实施方案中，至少一种蛋白酶(组分(b))选自下列：来自解淀粉芽孢杆菌BPN'的枯草蛋白酶(如Vasantha等(1984)在J.Bacteriol.第159卷，第811-819页中和JA Wells等(1983)在Nucleic Acids Research，第11卷，第7911-7925页中所述)；来自地衣芽孢杆菌的枯草蛋白酶(枯草蛋白酶Carlsberg；如EL Smith等(1968)在J.Biol Chem，第243卷，第2184-2191页中和Jacobs等(1985)在Nucl.Acids Res，第13卷，第8913-8926页中所公开)；枯草蛋白酶PB92(碱性蛋白酶PB92的原始序列描述于EP 283075 A2中)；如WO 89/06279所公开的枯草蛋白酶147和/或309(分别为
Figure BDA0002513126850000161
)；如WO 91/02792所公开的来自迟缓芽孢杆菌，如来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的枯草蛋白酶或如WO95/23221所述的迟缓芽孢杆菌DSM 5483的变体；如DE 10064983所公开的来自嗜碱芽孢杆菌(DSM 11233)的枯草蛋白酶；如WO 2003/054184所公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14391)的枯草蛋白酶；如WO 2003/056017所公开的来自芽孢杆菌属(DSM 14390)的枯草蛋白酶；如WO 2003/055974所公开的来自芽孢杆菌属(DSM 14392)的枯草蛋白酶；如WO 2003/054184所公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14393)的枯草蛋白酶；如WO 2005/063974所述具有SEQID NO:4的枯草蛋白酶；如WO 2005/103244所述具有SEQ ID NO:4的枯草蛋白酶；如WO2005/103244所述具有SEQ ID NO:7的枯草蛋白酶；以及如申请DE 102005028295.4所述具有SEQ ID NO:2的枯草蛋白酶。
在一个实施方案中，组分(b)至少包含在WO 89/06279表I中作为序列a)公开的的枯草蛋白酶309(本文可称为Savinase)或至少80％与其相同的变体并且具有蛋白水解活性。
按照本发明有用的蛋白酶(组分(b))的实例包括描述于下列中的变体：WO 92/19729，WO 95/23221，WO 96/34946，WO 98/20115，WO 98/20116，WO 99/11768，WO 01/44452，WO 02/088340，WO 03/006602，WO 2004/03186，WO 2004/041979，WO 2007/006305，WO 2011/036263，WO 2011/036264和WO 2011/072099。合适的实例尤其包括如EP 1921147所述在下列位置中的一个或多个中用氨基酸置换衍生于SEQ ID NO:22(为来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的成熟碱性蛋白酶的序列)的枯草蛋白酶蛋白酶变体：3，4，9，15，24，27，33，36，57，68，76，77，87，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，106，118，120，123，128，129，130，131，154，160，167，170，194，195，199，205，206，217，218，222，224，232，235，236，245，248，252和274(根据BPN'编号)，它们具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，该蛋白酶在位置Asp32、His64和Ser221(根据BPN’编号)没有变异。
合适的蛋白酶(组分(b))包括当与如上所公开的亲本酶的全长多肽序列相比较时至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的具有蛋白水解活性的蛋白酶变体。
合适的蛋白酶(组分(b))包括当与该亲本酶的全长多肽序列相比较时至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似的具有蛋白水解活性的蛋白酶变体。
在一个实施方案中，至少一种蛋白酶(组分(b))具有如EP 1921147所述的SEQ IDNO:22或者至少80％与其相同的蛋白酶并且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶的特征在于在位置101(根据BPN’编号)具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)或天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)或丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)并且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶包括一个或多个进一步置换：(a)在位置3上的苏氨酸(3T)，(b)在位置4上的异亮氨酸(4I)，(c)在位置63上的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(63A、63T或63R)，(d)在位置156上的天冬氨酸或谷氨酸(156D或156E)，(e)在位置194上的脯氨酸(194P)，(f)在位置199上的蛋氨酸(199M)，(g)在位置205上的异亮氨酸(205I)，(h)在位置217上的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(217D、217E或217G)，(i)两种或更多种根据(a)-(h)的氨基酸的组合。至少一种蛋白酶(组分(b))可以与EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同并且特征在于包含与氨基酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G或101S(根据BPN’编号)一起的一种氨基酸(根据(a)-(h))或根据(i)的组合并且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶的特征在于包含变异(根据BPN’编号)R101E或者S3T+V4I+V205I或者R101E和S3T、V4I和V205I或者S3T+V4I+V199M+V205I+L217D并且具有蛋白水解活性。
在一个实施方案中，根据EP 1921147所述的SEQ ID NO:22的蛋白酶的特征在于包含变异(根据BPN’编号)S3T+V4I+S9R+A15T+V68A+D99S+R101S+A103S+I104V+N218D并且具有蛋白水解活性。
在一个实施方案中，至少一种蛋白酶选自市售蛋白酶，其包括但不限于以商品名
Figure BDA0002513126850000181
DuralasTM、DurazymTM、
Figure BDA0002513126850000182
Ultra、
Figure BDA0002513126850000183
Ultra、
Figure BDA0002513126850000184
Figure BDA0002513126850000185
Ultra、
Figure BDA0002513126850000186
Ultra、
Figure BDA0002513126850000187
和
Figure BDA0002513126850000188
(Novozymes A/S)销售的产品，以商品名
Figure BDA0002513126850000189
Prime、Purafect
Figure BDA00025131268500001810
Purafect
Figure BDA00025131268500001811
Purafect
Figure BDA00025131268500001812
Figure BDA00025131268500001813
Figure BDA00025131268500001814
Figure BDA00025131268500001815
和
Figure BDA00025131268500001816
(Danisco/DuPont)、AxapemTM(Gist-Brocases N.V.)销售的那些，迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶(BLAP；US 5,352,604图29所示序列)及其变体以及来自KaoCorp的KAP(嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)枯草蛋白酶)。
根据本发明，组分(b)可以包含至少两种蛋白酶的组合，优选选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，更优选选自枯草蛋白酶类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)—全部如上所公开。
在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种脂肪酶和至少一种蛋白酶的组合。在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)的脂肪酶和至少一种选自丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)，更优选选自枯草蛋白酶类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的蛋白酶。
在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)的脂肪酶和至少一种选自根据EP 1921147中所述SEQ ID NO:22的蛋白酶或其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶—全部如上所公开。
在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自根据US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的甘油三酯脂肪酶及其具有脂解活性的变体的脂肪酶和至少一种选自根据EP1921147中所述SEQ ID NO:22的蛋白酶或其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶—全部如上所公开。
在一个实施方案中，组分(b)包含至少一种选自根据US 5869438的SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的甘油三酯脂肪酶及其具有脂解活性的变体的脂肪酶和至少一种选自如WO89/06279的表I a)所公开的枯草蛋白酶309或其具有蛋白水解活性的变体的蛋白酶—全部如上所公开。
淀粉酶
在一个实施方案中，本发明酶制剂包含至少一种淀粉酶(组分(b))。本发明的“淀粉酶”(组分(b))(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些(分别是EC 3.2.1.1和3.2.1.2)。包括化学改性或蛋白质工程突变体。
本发明的淀粉酶(组分(b))具有涉及多糖中的葡糖苷键(内)水解的“淀粉分解活性”或“淀粉酶活性”。α-淀粉酶活性可以通过本领域熟练技术人员已知的测量α-淀粉酶活性的分析测定。测量α-淀粉酶活性的分析的实例是：
α-淀粉酶活性可以通过使用Phadebas片剂作为底物的方法(Phadebas淀粉酶测试，由Magle Life Science提供)测定。通过α-淀粉酶水解淀粉，得到可溶性蓝色碎片。在620nm下以分光光度法测量的所得蓝色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函数。测量的吸光度与所述α-淀粉酶在给定条件组下的比活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白质)成正比。
α-淀粉酶活性还可以通过使用亚乙基-4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷(EPS)的方法测定。D-麦芽七糖苷是可以通过内淀粉酶裂解的封闭寡糖。在裂解之后，包括在试剂盒中的α-葡萄糖苷酶消化底物而释放具有黄色的游离PNP分子，因此可以通过可见分光光度法在405nm下测量。包含EPS底物和α-葡萄糖苷酶的试剂盒由Roche Costum Biotech制造(样本号10880078103)。时间依赖性吸收曲线的斜率与所述α-淀粉酶在给定条件组下的比活性(每mg酶的活性)成正比。
淀粉分解活性可以以单位/克酶提供。例如，1单位α-淀粉酶在pH 6.9和20℃下在3分钟内可以由淀粉释放1.0mg麦芽糖。
至少一种淀粉酶(组分(b))可以选自如下：来自具有WO 95/10603中所述SEQ IDNO:2的地衣芽孢杆菌的淀粉酶；来自具有WO 02/10355中所公开的SEQ ID NO:6的嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的淀粉酶；来自具有WO 99/19467中所公开的SEQ IDNO:6的芽孢杆菌属707的淀粉酶；来自具有WO 96/23872中所述SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的哈马帕卢氏杆菌(Bacillus halmapalus)，也描述为SP-722的淀粉酶；来自具有WO 00/22103中所公开的SEQ ID NO:4的芽孢杆菌属DSM 12649的淀粉酶；来自具有WO 2009/061380中所公开的SEQ ID NO:2的芽孢杆菌属菌株TS-23的淀粉酶；来自具有WO 2013/184577中所公开的SEQ ID NO:1的噬纤维菌属(Cytophaga)的淀粉酶；来自具有WO 2010/104675中所公开的SEQ ID NO:1的蜡样芽孢杆菌DSM 90的淀粉酶；来自包含WO 00/60060中所述SEQ ID NO:2的氨基酸1-485的芽孢杆菌属的淀粉酶。
合适的淀粉酶(组分(b))包括当与如上所公开的亲本酶的全长多肽序列相比较时至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的具有淀粉酶活性的淀粉酶变体。
合适的淀粉酶(组分(b))包括当与该亲本酶的全长多肽序列相比较时至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似的具有淀粉酶活性的淀粉酶变体。
至少一种淀粉酶(组分(b))可以具有如WO 2006/002643所述的SEQ ID NO:12或者至少80％与其相同并且具有淀粉分解活性。至少一种淀粉酶可以与SEQ ID NO:12至少80％相同并且包含在位置Y295F和M202LITV上的置换。
至少一种淀粉酶(组分(b))可以具有如WO 2011/098531所述的SEQ ID NO:6或者至少80％与其相同并且具有淀粉分解活性。至少一种淀粉酶可以与SEQ ID NO:6至少80％相同并且包含在一个或多个选自193[G,A,S,T或M]、195[F,W,Y,L,I或V]、197[F,W,Y,L,I或V]、198[Q或N]、200[F,W,Y,L,I或V]、203[F,W,Y,L,I或V]、206[F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D或E]、210[F,W,Y,L,I或V]、212[F,W,Y,L,I或V]、213[G,A,S,T或M]和243[F,W,Y,L,I或V]的位置上的置换。
至少一种淀粉酶(组分(b))可以具有如WO 2013/001078所述的SEQ ID NO:1或者至少85％与其相同并且具有淀粉分解活性。至少一种淀粉酶可以与SEQ ID NO:1至少85％相同并且包含在对应于位置G304，W140，W189，D134，E260，F262，W284，W347，W439，W469，G476和G477的两个或更多个(几个)位置上的改变。
至少一种淀粉酶(组分(b))可以具有如WO 2013/001087所述的SEQ ID NO:2或者至少85％与其相同并且具有淀粉分解活性。至少一种淀粉酶可以与SEQ ID NO:2至少85％相同并且包含位置181+182或182+183或183+184的缺失以及具有淀粉分解活性。在一个实施方案中，所述淀粉酶可以在对应于W140，W159，W167，Q169，W189，E194，N260，F262，W284，F289，G304，G305，R320，W347，W439，W469，G476和G477的位置的任一个中包含一个或两个或更多个进一步修饰。
在一个实施方案中，至少一种淀粉酶选自市售淀粉酶，包括但不限于以商品名DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、LiquozymeX和BANTM(来自Novozymes A/S)以及RapidaseTM、PurastarTM、PoweraseTM、EffectenzTM(来自DuPont的M100)，PreferenzTM(S1000、S110和F1000；来自DuPont)，PrimaGreenTM(ALL；DuPont)，OptisizeTM(DuPont)销售的产品。
根据本发明，可以使用至少两种淀粉酶(组分(b))的组合。
在一个实施方案中，组分(b)包括至少一种脂肪酶和至少一种淀粉酶的组合。
在一个实施方案中，组分(b)包括至少一种蛋白酶和/或至少一种淀粉酶的组合。
在一个实施方案中，组分(b)包括至少一种脂肪酶、至少一种蛋白酶和至少一种淀粉酶的组合。
纤维素酶
本发明酶制剂可以包含至少一种纤维素酶(组分(b))。三种主要类型的纤维素酶是已知的，即纤维二糖水解酶(1,4-P-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)，内切-ss-1,4-葡聚糖酶(内切-1,4-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.4)和ss-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21).
“纤维素酶”、“纤维素酶酶”或“纤维分解酶”(组分(b))是在纤维素水解中所涉及的酶。测量“纤维素酶活性”或“纤维分解活性”的分析对本领域熟练技术人员是已知的。例如，纤维分解活性可以借助纤维素酶将羧甲基纤维素水解成还原性碳水化合物这一事实测定，还原性碳水化合物的还原能力根据Hoffman，W.S.，J.Biol.Chem.120，51(1937)借助铁氰化物反应以比色法测定。
纤维分解活性可以以单位/克酶提供。例如，1单位可以在pH 5.0和37℃下在1小时内由纤维素释放1.0μmol葡萄糖(2小时温育时间)。
本发明的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。
在一个实施方案中，至少一种纤维素酶(组分(b))选自市售纤维素酶，包括但不限于CelluzymeTM、EndolaseTM、CarezymeTM、CellusoftTM、RenozymeTM、CellucleanTM(来自Novozymes A/S)，EcostoneTM、BiotouchTM、EconaseTM、EcopulpTM(来自AB EnzymesFinland)，ClazinaseTM和Puradax HATM，Genencor洗涤剂纤维素酶L，IndiAgeTM Neutra(来自Genencor International Inc./DuPont)，RevitalenzTM(来自DuPont的2000)，PrimafastTM(DuPont)和KAC-500TM(来自Kao Corporation)。
组分(c)
在一个实施方案中，本发明的液体酶制剂含有组分(c)，后者包括至少一种选自不同于组分(a)的酶稳定剂、防腐剂和表面活性剂的化合物。
不同于组分(a)的酶稳定剂：
本发明的液体酶制剂可以包含至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂。所述酶稳定剂(组分(c))可以选自含硼化合物、多元醇、肽醛、其他稳定剂及其混合物。
含硼化合物：
含硼化合物(组分(c))可以选自硼酸或其衍生物和有机硼酸或其衍生物如芳基硼酸或其衍生物，选自其盐以及选自其混合物。这里的硼酸可以称为原硼酸。
在一个实施方案中，含硼化合物(组分(c))选自芳基硼酸及其衍生物。在一个实施方案中，含硼化合物选自也称为苯基硼酸(PBA)的苯硼酸(BBA)、其衍生物及其混合物。在一个实施方案中，苯基硼酸衍生物选自式(IIIa)和(IIIb)的衍生物：
Figure BDA0002513126850000231
其中
R1选自氢、羟基、未取代或取代的C1-C6烷基和未取代或取代的C1-C6链烯基；在优选实施方案中，R选自羟基和未取代的C1烷基；
R2选自氢、羟基、未取代或取代的C1-C6烷基和未取代或取代的C1-C6链烯基；在优选实施方案中，R选自H、羟基和取代的C1烷基。
在一个实施方案中，苯基硼酸衍生物(组分(c))选自4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)、4-羧基苯基硼酸(4-CPBA)、4-(羟甲基)苯基硼酸(4-HMPBA)和对甲苯基硼酸(p-TBA)。
其他合适的衍生物(组分(c))包括2-噻吩基硼酸、3-噻吩基硼酸、(2-乙酰氨基苯基)硼酸、2-苯并呋喃基硼酸、1-萘基硼酸、2-萘基硼酸、2-FPBA、3-FBPA、1-噻蒽基硼酸、4-二苯并呋喃硼酸、5-甲基-2-噻吩基硼酸、1-苯并噻吩-2-硼酸、2-呋喃基硼酸、3-呋喃基硼酸、4,4-联苯基二硼酸、6-羟基-2-萘硼酸、4-(甲硫基)苯基硼酸、4-(三甲基甲硅烷基)苯基硼酸、3-溴噻吩硼酸、4-甲基噻吩硼酸、2-萘基硼酸、5-溴噻吩硼酸、5-氯噻吩硼酸、二甲基噻吩硼酸、2-溴苯基硼酸、3-氯苯基硼酸、3-甲氧基-2-噻吩硼酸、对甲基苯基乙基硼酸、2-噻蒽基硼酸、二苯并噻吩硼酸、9-蒽硼酸、3,5-二氯苯基硼酸、二苯基硼酸酐、邻氯苯基硼酸、对氯苯基硼酸、间溴苯基硼酸、对溴苯基硼酸、对氟苯基硼酸、辛基硼酸、1,3,5-三甲基苯基硼酸、3-氯-4-氟苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸、3,5-二(三氟甲基)苯基硼酸、2,4-二氯苯基硼酸、4-甲氧基苯基硼酸及其混合物。
多元醇：
多元醇(组分(c))可以选自含有2-6个羟基的多元醇。合适的实例包括乙二醇、丙二醇、1,2-丙二醇、1,2-丁二醇、乙二醇、己二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、果糖、乳糖和四氢呋喃二醇。
肽醛：
肽醛(组分(c))可以选自二-、三-或四肽醛和醛类似物(呈B1-BO-R形式，其中R为H、CH3、CX3、CHX2或CH2X(X＝卤素)，BO为单一氨基酸残基(在一个实施方案中具有任选被取代的脂族或芳族侧链)；并且B1由一个或多个(在一个实施方案中为1、2或3个)氨基酸残基构成，任选包含N-保护端基，或者如WO 09/118375和WO 98/13459所述，或者蛋白质类型的蛋白酶抑制剂如RASI、BASI、WASI(稻、大麦和小麦的双功能α-淀粉酶/枯草蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI。
其他稳定剂
其他稳定剂(组分(c))可以选自盐如NaCl或KCl以及乳酸和甲酸的碱金属盐。
其他稳定剂(组分(c))可以选自在成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性源，其对酶提供该类离子，以及其他金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))。稳定液体酶制剂的化合物本身
稳定该液体酶制剂的化合物本身是指产生液体制剂的储存稳定性所需酶稳定剂以外的任何化合物，其量有效确保储存稳定性。
储存稳定性在液体制剂上下文中对本领域熟练技术人员而言通常包括产物外观和剂量均匀性方面。
产物外观受产物的pH和化合物如防腐剂、抗氧化剂、粘度改性剂、乳化剂等的存在影响。
剂量均匀性通常与产品的均匀性有关。
防腐剂：
本发明的液体酶制剂可以包含至少一种防腐剂。防腐剂以有效防止该液体酶制剂，优选该含水酶制剂的微生物污染的量加入。
合适防腐剂的非限制性实例包括(季)铵化合物，异噻唑啉酮类，有机酸和甲醛释放剂。合适(季)铵化合物的非限制性实例包括苯扎氯铵、聚六亚甲基双胍(PHMB)、二癸基二甲基氯化铵(DDAC)和N-(3-氨基丙基)-N-十二烷基-1,3-丙二胺(Diamine)。合适异噻唑啉酮类的非限制性实例包括1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(MIT)、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(CIT)、2-辛基-2H-异噻唑-3-酮(OIT)和2-丁基苯并[d]异噻唑-3-酮(BBIT)。合适有机酸的非限制性实例包括苯甲酸、山梨酸、L-(+)-乳酸、甲酸和水杨酸。合适甲醛释放剂的非限制性实例包括N,N'-亚甲基二吗啉(MBM)、2,2',2”-(六氢-1,3,5-三嗪-1,3,5-三基)三乙醇(HHT)、(亚乙二氧基)二甲醇、α,α',α”-三甲基-1,3,5-三嗪-1,3,5(2H,4H,6H)-三乙醇(HPT)、3,3′-亚甲基二[5-甲基唑烷](MBO)和顺式-1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮金刚烷氯化物(CTAC)。
其他有用的防腐剂包括丁基氨基甲酸碘丙炔酯(IPBC)，卤素释放化合物如二氯二甲基乙内酰脲(DCDMH)、溴氯二甲基乙内酰脲(BCDMH)和二溴二甲基乙内酰脲(DBDMH)；溴代硝基化合物如拌棉醇(bronopol)(2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇)、2,2-二溴-2-氰基乙酰胺(DBNPA)；醛类，如戊二醛；苯氧基乙醇；联苯-2-酚以及吡啶硫酮锌或钠。
表面活性剂：
本发明的液体酶制剂可以包含至少一种表面活性剂(组分(c))。表面活性剂的实例包括非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂，下文也称为非离子表面活性剂(组分(c))、两性表面活性剂(组分(c))、阴离子表面活性剂(组分(c))和阳离子表面活性剂(组分(c))。在一个实施方案中，本发明的液体酶制剂包含至少一种选自非离子表面活性剂、两性表面活性剂和阴离子表面活性剂的表面活性剂。
该液体酶制剂相对于该酶制剂的总重量可以含有0.1-60重量％的表面活性剂(组分(c))。组分(c)可以包含至少一种选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂和胺氧化物表面活性剂的化合物以及前述表面活性剂中至少两种的组合。在一个实施方案中，本发明的酶制剂含有5-30重量％阴离子表面活性剂和例如在3-20重量％范围内的至少一种非离子表面活性剂，全部相对于该酶制剂的总重量。
至少一种非离子表面活性剂(组分(c))可以选自烷氧基化醇、氧化乙烯和氧化丙烯的二-和多嵌段共聚物以及脱水山梨醇与氧化乙烯或氧化丙烯的反应产物、烷基聚糖苷(APG)、羟烷基混合醚和胺氧化物。
烷氧基化醇和烷氧基化脂肪醇的优选实例例如是通式(IV)的化合物：
Figure BDA0002513126850000261
其中
R3相同或不同且选自氢和线性C1-C10烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，特别优选氢或甲基，
R4选自支化或线性C8-C22烷基，例如n-C8H17、n-C10H21、n-C12H25、n-C14H29、n-C16H33或n-C18H37，
R5选自C1-C10烷基，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基或异癸基。
变量m和n在0-300范围内，其中n和m之和为至少1，优选在3-50范围内。优选m在1-100范围内且n在0-30范围内。
在一个实施方案中，通式(III)的化合物可以是嵌段共聚物或无规共聚物，优选嵌段共聚物。
烷氧基化醇的其他优选实例例如是通式(V)的化合物：
Figure BDA0002513126850000271
其中
R6相同或不同且选自氢和线性C1-C10烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，特别优选氢或甲基，
R7选自支化或线性C6-C20烷基，尤其是n-C8H17、n-C10H21、n-C12H25、n-C13H27、n-C15H31、n-C14H29、n-C16H33、n-C18H37，
a为在0-10，优选1-6范围内的数，
b为在1-80，优选4-20范围内的数，
c为在0-50，优选4-25范围内的数。
总和a+b+c优选在5-100范围内，甚至更优选在9-50范围内。
羟烷基混合醚的优选实例是通式(VI)的化合物：
Figure BDA0002513126850000272
其中各变量如下所定义：
R8相同或不同且选自氢和线性C1-C10烷基，优选在每种情况下相同且为乙基，特别优选氢或甲基，
R9选自支化或线性C8-C22烷基，例如异-C11H23、异-C13H27、n-C8H17、n-C10H21、n-C12H25、n-C14H29、n-C16H33或n-C18H37，
R10选自C1-C18烷基，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基和正十八烷基。
变量m和x在0-300范围内，其中n和m之和为至少1，优选在5-50范围内。优选m在1-100范围内且n在0-30范围内。
通式(V)和(VI)的化合物可以是嵌段共聚物或无规共聚物，优选嵌段共聚物。
其他合适的非离子表面活性剂选自由氧化乙烯和氧化丙烯构成的二-和多嵌段共聚物。其他合适的非离子表面活性剂选自乙氧基化或丙氧基化脱水山梨醇酯。胺氧化物或烷基聚糖苷，尤其是线性C4-C18烷基聚葡糖苷和支化C8-C18烷基聚糖苷如平均通式(VII)的化合物同样合适。
Figure BDA0002513126850000281
其中
R11为C1-C4烷基，尤其是乙基、正丙基或异丙基，
R12为-(CH2)2-R11，
G1选自具有4-6个碳原子的单糖，尤其选自葡萄糖和木糖，
y在1.1-4范围内，y为平均数。
非离子表面活性剂的其他实例是通式(VIIIa)和(VIIIb)的化合物：
Figure BDA0002513126850000282
其中
AO选自氧化乙烯、氧化丙烯和氧化丁烯，
EO为氧化乙烯CH2CH2-O，
R13为C1-C4烷基，尤其是乙基、正丙基或异丙基，
R14选自支化或线性C8-C18烷基，
A3O选自氧化丙烯和氧化丁烯，
w为在15-70，优选30-50范围内的数，
w1和w3为在1-5范围内的数，以及
w2为在13-35范围内的数。
合适的其他非离子表面活性剂的综述可以在EP-A 0 851 023和DE-A 198 19 187中找到。
在一个实施方案中，该酶制剂含有两种或更多种不同非离子表面活性剂(组分(c))的混合物。
至少一种两性表面活性剂(组分(c))可以选自在使用条件下在相同分子中带有正电荷和负电荷的表面活性剂。两性表面活性剂的优选实例是所谓的甜菜碱表面活性剂。甜菜碱表面活性剂的许多实例每分子带有一个季化氮原子和一个羧酸基团。两性表面活性剂的特别优选实例是椰油酰胺丙基甜菜碱(月桂酰胺丙基甜菜碱)。
胺氧化物表面活性剂的实例是通式(IX)的化合物：
R13R14R15N→O (IX)
其中R13、R14和R15相互独立地选自脂族、脂环族或C2-C4亚烷基C10-C20烷基酰胺基结构部分。优选R12选自C8-C20烷基或C2-C4亚烷基C10-C20烷基酰胺基且R13和R14均为甲基。
特别优选的实例是月桂基二甲基氧化胺，有时也称为月桂胺氧化物。另一特别优选的实例是椰油酰胺基丙基二甲基氧化胺，有时也称为椰油酰胺基丙基胺氧化物。
至少一种阴离子表面活性剂(组分(c))可以选自C8-C18烷基硫酸酯，C8-C18脂肪醇聚醚硫酸酯，乙氧基化C4-C12烷基酚(乙氧基化：1-50mol氧化乙烯/mol)的硫酸半酯，C12-C18磺基脂肪酸烷基酯，例如C12-C18磺基脂肪酸甲酯，此外还有C12-C18烷基磺酸和C10-C18烷基芳基磺酸的碱金属盐和铵盐。优选上述化合物的碱金属盐，特别优选钠盐。
阴离子表面活性剂(组分(c))的具体实例是通式(X)的化合物：
CsH2s+1-O(CH2CH2O)t-SO3M (X)
其中
s为在10-18，优选12-14范围内的数，甚至更优选s＝12，
t为在1-5，优选2-4范围内的数，甚至更优选3，
M选自碱金属，优选钾，甚至更优选钠。
变量s和t可以是平均数且因此它们不一定是整数，而在式(X)的单个分子中，s和t均表示整数。
合适阴离子表面活性剂(组分(c))的其他实例是皂类，例如硬脂酸、油酸、棕榈酸、醚羧酸和烷基醚磷酸的钠或钾盐。
在一个实施方案中，本发明酶制剂是含水的，含有的水量在5-95重量％，5-30重量％，5-25重量％或20-70重量％范围内，全部相对于该酶制剂的总重量。所述酶制剂相对于该酶制剂的总重量可以含有0-20重量％范围内的有机溶剂。在一个实施方案中，该酶制剂含有5-15重量％范围内的水且不含显著量的有机溶剂，例如1重量％或更少，全部相对于该酶制剂的总重量。
本发明酶制剂可以是碱性的或者显示出中性或轻微酸性pH值，例如6-14，6.5-13，8-10.5或8.5-9.0。
酶配制剂的制备：
本发明涉及一种制备酶制剂的方法，所述方法包括至少混合如上所公开的组分(a)和如上所公开的组分(b)的步骤。
组分(b)可以是固体。可以在二者与至少一种溶剂接触之前将固体组分(b)加入固体组分(a)中。至少一种溶剂如上所公开。与至少一种溶剂接触可能导致至少一种分子组分(a)和至少一种分子组分(b)的增溶，导致至少一种分子组分(b)的稳定化。在一个实施方案中，使固体组分(a)和(b)完全溶于至少一种溶剂中而没有相分离。
固体组分(a)可以在与固体或液体组分(b)混合之前溶于至少一种溶剂中。在一个实施方案中，在与组分(b)混合之前将组分(a)完全溶于至少一种溶剂中。至少一种溶剂如上所公开。
组分(b)可以为液体，其中至少一种酶可以包含在如上所公开的液体酶浓缩物中。液体组分(b)可以用固体组分(a)补充，其中固体组分(a)溶于液体组分(b)中。在一个实施方案中，液体组分(b)是含水的，优选由发酵得到。
在一个实施方案中，将如上所公开的组分(c)与组分(a)和(b)混合，其中混合的特征在于在一个或多个步骤中进行。
酶稳定化
本发明涉及一种通过加入组分(a)的步骤稳定组分(b)的方法，其中组分(a)和(b)是如上所公开的那些。在一个实施方案中，组分(b)为液体。在一个实施方案中，本发明涉及一种在至少一种表面活性剂存在下通过加入组分(a)的步骤稳定组分(b)的方法，其中组分(a)和(b)以及至少一种表面活性剂是如上所公开的那些。在一个实施方案中，本发明涉及一种通过加入组分(a)的步骤稳定组分(b)的方法，其中组分(b)包含至少一种脂肪酶和至少一种蛋白酶。
本发明进一步涉及一种在液体配制剂中稳定至少一种酶的方法，包括在一个或多个步骤中以未规定的顺序将如上所公开的组分(a)和(b)与一种或多种配制组分混合。在一个实施方案中，液体配制剂是洗涤剂配制剂。
本发明涉及组分(a)作为组分(b)的添加剂的用途。在一个实施方案中，组分(a)和(b)为固体且组分(b)在使固体组分(a)和(b)的混合物与至少一种溶剂接触时稳定化。至少一种溶剂如上所公开。与至少一种溶剂接触可能导致至少一种分子组分(a)和至少一种分子组分(b)的增溶，导致至少一种分子组分(b)的稳定化。在一个实施方案中，使固体组分(a)和(b)完全溶于至少一种溶剂中而没有相分离。
酶的稳定化可能涉及在时间范围内的稳定性(例如储存稳定性)、热稳定性、pH稳定性和化学稳定性。本文的术语“酶稳定性”优选涉及例如在储存或操作过程中作为时间函数的酶促活性保留。本文的术语“储存”意欲表示产品或组合物从制造时间到用于最终应用的时间点储存的事实。在储存过程中作为时间函数的酶促活性保留称为“储存稳定性”。
为了测定酶促活性随时间的变化，可以在限定条件下在时间0(即在储存之前)测量酶的“初始酶促活性”并且可以随后在一定时间(即在储存之后)测量“储存之后的酶促活性”。
储存之后的酶促活性除以初始酶促活性乘以100得到“在应用中可以得到的酶促活性”(a％)。
根据本发明，当其“在应用中可以得到的”酶促活性在与储存之前的初始酶促活性相比等于100％时该酶是稳定。若其在应用中可以得到的酶促活性与储存之前的初始酶促活性相比为至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少99.5％，则该酶在本发明中可以称为稳定的。
在一个实施方案中，在37℃下储存30天之后可以得到的脂解活性与储存之前的初始酶促活性相比为至少60％。
从100％扣减a％得到与储存之前的初始酶促活性相比“储存过程中的酶促活性损失”。在一个实施方案中，当在储存过程中基本没有发生酶促活性损失，即酶促活性与储存之前的初始酶促活性相比等于0％时，根据本发明酶是稳定的。在本发明内基本没有酶促活性损失可以指酶促活性损失与储存之前的初始酶促活性相比小于30％，小于25％，小于20％，小于15％，小于10％，小于9％，小于8％，小于7％，小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，小于2％或小于1％。
在一个实施方案中，在37℃下储存30天之后的脂解活性损失与储存之前的初始脂解活性相比小于40％。
在本发明的一个方面，使用组分(a)降低至少一种包含在液体酶浓缩物中的酶在储存过程中的酶促活性损失。在本发明内酶促活性损失的降低可以指酶促活性损失与储存之前的初始酶促活性相比降低至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少99.5％。
在一个实施方案中，在37℃下储存30天之后的脂解活性损失与储存之前的初始脂解活性相比通过组分(a)降低至少60％。
在一个实施方案中，在37℃下储存30天之后的蛋白水解活性损失与储存之前的初始蛋白水解活性相比通过组分(a)降低至少20％。
由酶抑制剂抑制的酶与所述酶的未抑制酶促活性相比通常显示出降低的酶促活性。在加入酶抑制剂之后测量的酶促活性除以初始酶促活性乘以100在本文可以称为“残留酶促活性”(b％)。当酶显示的残留酶促活性(b％)与储存之前的初始酶促活性相比小于50％，小于45％，小于40％，小于35％，小于30％，小于25％，小于20％，小于15％，小于10％，小于5％或小于1％时，在本文中可以将它们称为“稳定化的”。若在释放抑制剂之后其在应用中可以得到的酶促活性与储存之前的初始酶促活性相比为至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％或100％，则可以将酶称为稳定化的。该抑制剂在本文可以称为“酶稳定剂”。
酶制剂在配制方法中的用途
本发明在一方面涉及本发明液体酶制剂在配制到洗涤剂配制剂中的用途，其中在一个或多个步骤中以未规定的顺序将组分(a)和(b)与一种或多种洗涤剂组分混合。
本发明一方面涉及一种含有本发明液体酶制剂和一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂配制剂。
取决于所需应用如洗涤白色纺织品，彩色纺织品和羊毛，在洗涤剂配制剂中洗涤剂组分在类型和/或量上变化。选取的组分进一步取决于洗涤剂配制剂的物理形式(液体、固体、凝胶，在袋中提供或作为片剂提供等)。例如为洗涤配制剂选取的组分进一步取决于本身与诸如所用洗涤温度、洗衣机机械学(立轴或横轴洗衣机)、每个洗涤循环的耗水量等方面和地理特性如水的平均硬度有关的区域习俗。
单独的洗涤剂组分和在洗涤剂配制剂中的使用对本领域熟练技术人员是已知的。合适的洗涤剂组分尤其包括表面活性剂、助洗剂、聚合物、碱性漂白体系、荧光增白剂、抑泡剂和稳定剂、水溶助长剂以及缓蚀剂。其他实例例如描述于“complete Technology Bookon Detergents with Formulations(Detergent Cake，Dishwashing Detergents，Liquid&Paste Detergents，Enzyme Detergents，Cleaning Powder&Spray Dried WashingPowder)”，Engineers India Research Institute(EIRI)，第6版(2015)中。对本领域熟练技术人员而言另一参考书reference book可以是“Detergent FormulationEncyclopedia”，Solverchem Publications，2016。
应理解的是洗涤剂组分除了包含在本发明酶制剂中的组分外。若包含在本发明酶制剂中的组分也是洗涤剂组分，则可能需要调节浓度以使得该组分对于该洗涤剂配制剂中所需要的目的有效。
洗涤剂组分在洗涤剂配制剂的最终应用中可以具有不止一种功能，因此，在本文的特定功能上下文中提到的任何洗涤剂组分也可以在洗涤剂配制剂的最终应用中具有另一功能。特定洗涤剂组分在洗涤剂配制剂的最终应用中的功能通常取决于其在该洗涤剂配制剂中的量，即洗涤剂组分的有效量。
术语“有效量”包括单独组分提供有效去污和/或有效清洁条件(例如pH、发泡量)的量，某些组分有效提供光学益处(例如光学增亮、染料转移抑制)的量和/或某些组分有效帮助加工(维持加工、储存和使用过程中的物理特性；例如流变改性剂、水溶助长剂、干燥剂)的量。
在一个实施方案中，洗涤剂配制剂是两种以上洗涤剂组分的配制剂，其中至少一种组分有效去污，至少一种组分有效提供最佳清洁条件并且至少一种组分有效维持该洗涤剂的物理特性。
本发明的洗涤剂配制剂可以包含溶于溶剂中的组分(a)和组分(b)。“溶于”可以指溶于整个洗涤剂配制剂中。“溶于”可以指组分(a)和组分(b)为可以包封的本发明酶制剂的一部分。包封的液体酶制剂可以是液体洗涤剂配制剂的一部分或固体洗涤剂配制剂的一部分。
在本发明的一个实施方案中，洗涤剂配制剂含有0.5-20重量％，特别是1-10重量％组分(b)和0.01-10％，更特别的是0.05-5重量％，最特别的是0.1-2重量％组分(a)，全部相对于液体洗涤剂配制剂的总重量。
本发明的洗涤剂配制剂可以包含至少一种选自助洗剂、聚合物、香料和染料的化合物。
在本发明的一个实施方案中，组分(a)在洗涤剂配制剂中以有效提供所需助洗剂功能的量用作助洗剂。使用组分(a)作为助洗剂允许可变洗涤剂配制剂，要么具有高水含量要么具有低水含量。对于具有低水含量的液体洗涤剂配制剂，除了组分(a)外可以不使用其他助洗剂物质。本文中的低水含量可以指至少≤30重量％，至少≤20重量％，至少≤10重量％或至少≤5重量％，全部相对于洗涤剂配制剂的总重量。
在一个实施方案中，洗涤剂配制剂可以含有一种或多种不同于组分(a)的助洗剂。
本发明洗涤剂配制剂可以含有1-40重量％不同于组分(a)的洗涤助洗剂，如但不限于沸石、磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、聚合物助洗剂或氨基羧酸盐如亚氨基二琥珀酸碱金属盐，例如IDS-Na4，此外还有次氮基三乙酸(“NTA”)，甲基甘氨酸二乙酸(“MGDA”)，谷氨酸二乙酸(“GLDA”)，乙二胺四乙酸(“EDTA”)或二亚乙基三胺五乙酸(“DTPA”)。优选的碱金属盐是钾盐，尤其是钠盐。
洗涤助洗剂的其他实例是具有络合基团的聚合物，例如其中20-90mol％的N原子带有至少一个CH2COO-基团的聚乙烯亚胺，以及上述螯合剂的相应碱金属盐，尤其是其钠盐。
合适聚合物的其他实例是聚亚烷基亚胺，例如聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。聚亚烷基亚胺可以直接使用或者作为聚烷氧基化衍生物使用，例如乙氧基化或丙氧基化。聚亚烷基亚胺每分子含有至少三个亚烷基亚胺单元。
在本发明的一个实施方案中，所述亚烷基亚胺单元是C2-C10亚烷基二胺单元，例如1,2-丙二胺，优选α,ω-C2-C10亚烷基二胺，例如1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺、1,6-己二胺(也称为1,6-亚己基二胺)、1,8-辛二胺或1,10-癸二胺，甚至更优选1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺和1,6-己二胺。
在本发明的另一实施方案中，所述聚亚烷基亚胺选自聚亚烷基亚胺单元，优选聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺单元。
术语“聚乙烯亚胺”在本发明上下文中不仅仅涉及聚乙烯亚胺均聚物，而且涉及与其他亚烷基二胺结构单元，例如NH-CH2-CH2-CH2-NH结构单元、NH-CH2-CH(CH3)-NH结构单元、NH-(CH2)4-NH结构单元、NH-(CH2)6-NH结构单元或(NH-(CH2)8-NH结构单元一起含有NH-CH2-CH2-NH结构单元的聚亚烷基亚胺，但是NH-CH2-CH2-NH结构单元就摩尔份额而言占主导。优选的聚乙烯亚胺含有就摩尔份额而言占主导，例如相对于所有亚烷基亚胺结构单元占60mol％或更多，更优选占至少70mol％的NH-CH2-CH2-NH结构单元。在特殊实施方案中，术语聚乙烯亚胺涉及涉及那些每个聚乙烯亚胺单元仅带有1个或0个不同于NH-CH2-CH2-NH的亚烷基亚胺结构单元的聚亚烷基亚胺。
术语“聚丙烯亚胺”在本发明上下文中不仅仅涉及聚丙烯亚胺均聚物，而且涉及与其他亚烷基二胺结构单元，例如NH-CH2-CH2-CH2-NH结构单元、NH-CH2-CH2-NH结构单元、NH-(CH2)4-NH结构单元、NH-(CH2)6-NH结构单元或(NH-(CH2)8-NH结构单元一起含有NH-CH2-CH(CH3)-NH结构单元的聚亚烷基亚胺，但是NH-CH2-CH(CH3)-NH结构单元就摩尔份额而言占主导。优选的聚丙烯亚胺含有就摩尔份额而言占主导，例如相对于所有亚烷基亚胺结构单元占60mol％或更多，更优选占至少70mol％的NH-CH2-CH(CH3)-NH结构单元。在特殊实施方案中，术语聚丙烯亚胺涉及那些每个聚丙烯亚胺单元仅带有1个或0个不同于NH-CH2-CH(CH3)-NH的亚烷基亚胺结构单元的聚亚烷基亚胺。
支链可以是亚烷基氨基，如但不限于-CH2-CH2-NH2基团或(CH2)3-NH2基团。更长支链例如可以是-(CH2)3-N(CH2CH2CH2NH2)2或-(CH2)2-N(CH2CH2NH2)2基团。高度支化聚乙烯亚胺例如是支化度在0.25-0.95范围内，优选在0.30-0.80范围内，特别优选至少0.5的聚乙烯亚胺树枝状分子或相关分子。支化度例如可以通过优选在D2O中的13C-NMR或15N-NMR光谱法测定并且按如下定义：
DB＝D+T/D+T+L
其中D(树枝状)对应于叔氨基的比例，L(线性)对应于仲氨基的比例且T(末端)对应于伯氨基的比例。
在本发明上下文中，支化聚乙烯亚胺单元是DB在0.25-0.95，特别优选在0.30-0.90％范围内，非常特别优选至少0.5的聚乙烯亚胺单元。优选的聚乙烯亚胺单元是很少支化或者没有支化的那些，因此为主要线性或线性聚乙烯亚胺单元。
在本发明上下文中，不认为CH3基团是支链。
在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺可以具有在1-1000mg KOH/g，优选10-500mg KOH/g，最优选50-300mg KOH/g范围内的伯胺值。伯胺值可以根据ASTM D2074-07计算。
在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺可以具有在10-1000mg KOH/g，优选50-500mg KOH/g，最优选50-500mg KOH/g范围内的仲胺值。仲胺值可以根据ASTM D2074-07计算。
在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺可以具有在1-300mg KOH/g，优选5-200mg KOH/g，最优选10-100mg KOH/g范围内的叔胺值。叔胺值可以根据ASTM D2074-07计算。
在本发明的一个实施方案中，叔N原子的摩尔份额通过15N-NMR光谱法测定。在叔胺值和根据13C-NMR光谱法的结果不一致的情况下，给予通过13C-NMR光谱法得到的结果优先。
在本发明的一个实施方案中，所述聚亚烷基亚胺的平均分子量Mw在250-100,000g/mol，优选250-50,000g/mol，更优选800-25,000g/mol范围内。聚亚烷基亚胺的平均分子量Mw可以通过相应聚亚烷基亚胺中间体的凝胶渗透色谱法(GPC)测定，用1.5重量％甲酸水溶液作为洗脱液并且用交联聚甲基丙烯酸羟乙基酯作为固定相。
所述聚亚烷基亚胺可以是游离的或者烷氧基化的，所述烷氧基化选自乙氧基化、丙氧基化、丁氧基化以及前述中至少两种的组合。优选氧化乙烯、1,2-氧化丙烯以及氧化乙烯和1,2-氧化丙烯的混合物。若使用至少两种氧化烯的混合物，则它们可以逐步或同时反应。
在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺每单元带有至少6个氮原子。
在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺用2-50摩尔氧化烯/NH基团，优选5-30摩尔氧化烯/NH基团，甚至更优选5-25摩尔氧化乙烯或1,2-氧化丙烯或其组合/NH基团烷氧基化。在本发明上下文中，NH2单元记作两个NH基团。优选烷氧基化所有—或者几乎所有—NH基团，并且没有留下可检测量的NH基团。
取决于该类烷氧基化聚亚烷基亚胺的制造，分子量分布可以窄或宽。例如，多分散性Q＝Mw/Mn在1-3范围内，优选至少2，或者它可以大于3且至多为20，例如3.5-15，甚至更优选在4-5.5范围内。
在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺的多分散性Q在2-10范围内。
在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚亚烷基亚胺选自聚乙氧基化聚乙烯亚胺、乙氧基化聚丙烯亚胺、乙氧基化α,ω-己二胺、乙氧基化和丙氧基化聚乙烯亚胺、乙氧基化和丙氧基化聚丙烯亚胺以及乙氧基化和聚丙氧基化α,ω-己二胺。
在本发明的一个实施方案中，烷氧基化聚乙烯亚胺的平均分子量Mn(数均)由GPC测定在2,500-1,500,000g/mol，优选2,500-500,000g/mol范围内。
在本发明的一个实施方案中，平均烷氧基化聚亚烷基亚胺选自乙氧基化α,ω-己二胺以及乙氧基化和聚丙氧基化α,ω-己二胺，各自具有的平均分子量Mn(数均)在800-500,000g/mol范围内。
缓冲剂的实例是单乙醇胺和N,N,N-三乙醇胺。
消泡剂的实例是聚硅氧烷。
香料的实例是水杨酸苄基酯、作为
Figure BDA0002513126850000381
市购的2-甲基丙酸2-(4-叔丁基苯基)酯以及己基肉桂醛。
染料的实例是酸性蓝9、酸性黄3、酸性黄23、酸性黄73、颜料黄101、酸性绿1、溶剂绿7和酸性绿25。
液体洗涤剂配制剂可以包含至少一种选自有机溶剂、防腐剂、粘度改性剂和水溶助长剂的化合物。
在本发明的一个实施方案中，液体洗涤剂配制剂含有的有机溶剂量相对于该液体洗涤剂配制剂的总重量为0.5-25重量％。尤其当本发明液体洗涤剂配制剂在袋等中提供时，相对于该液体洗涤剂配制剂的总重量可以含有8-25重量％的有机溶剂。有机溶剂是如上所讨论的那些。
本发明液体洗涤剂配制剂可以以有效避免该液体洗涤剂配制剂的微生物污染的量含有一种或多种选自如上所讨论的那些的防腐剂。
在本发明的一个实施方案中，液体洗涤剂配制剂含有一种或多种粘度改性剂。合适粘度改性剂的非限制性实例包括琼脂、角叉菜、黄蓍胶、阿拉伯树胶、藻酸盐、果胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、明胶、槐豆胶，交联聚(甲基)丙烯酸酯，例如用二(甲基)丙烯酰胺交联的聚丙烯酸，此外还有硅酸，粘土如—但不限于—蒙脱石、沸石、糊精和酪蛋白。可以以有效提供所需粘度的量含有粘度改性剂。
在本发明的一个实施方案中，液体洗涤剂配制剂含有一种或多种水溶助长剂，后者可以为有机溶剂如乙醇、异丙醇、乙二醇、1,2-丙二醇，以及在正常条件下没有限制地为水溶混性的其他有机溶剂。合适水溶助长剂的其他实例是甲苯磺酸、二甲苯磺酸和枯烯磺酸的钠盐。可以以促进或者使得在水中具有有限溶解度的化合物溶解的量含有水溶助长剂。
“洗涤剂配制剂”或“清洁配制剂”在本文中是指指定用于清洁污损材料的配制剂。清洁包括洗涤和硬表面清洁。本发明的污损材料包括纺织品和/或硬表面。
术语“洗涤”涉及家用洗涤和工业洗涤二者且指用含有本发明洗涤剂配制剂的溶液处理纺织品的过程。该洗涤过程可以通过使用工业装置如家用或工业洗衣机进行。或者，该洗涤过程可以用手进行。
术语“纺织品”是指任何纺织材料，包括纱线(用于针织或编织的由天然或合成纤维制成的线状物)、纱线中间体、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及由这些材料制成的织物(通过编织、针织或制毡纤维制成的纺织品)如衣服(任何由纺织品制成的服装用品)、服装和其他制品。
术语“纤维”包括天然纤维、合成纤维及其混合物。天然纤维的实例是植物(如亚麻、黄麻和棉)或动物来源的纤维，包含蛋白质如胶原蛋白、角蛋白和蚕丝蛋白(例如丝绸、羊绒、安哥拉山羊毛、马海毛、山羊绒)。合成来源的纤维实例是聚氨酯纤维如
Figure BDA0002513126850000391
或
Figure BDA0002513126850000392
聚酯纤维，聚烯烃纤维如弹性蛋白，或聚酰胺纤维如尼龙。纤维可以是单纤维或纺织品如针织衫、织造物或非织造物的一部分。
术语“硬表面清洁”在本文被定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括家庭中的任何硬表面，如地板、布置家具、墙壁、卫生陶瓷、玻璃、包括刀具或碟盘在内的金属表面。
术语“餐具洗涤”涉及所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动餐具洗涤。餐具洗涤包括但不限于清洁所有形式的陶器如盘子、杯子、玻璃、碗，所有形式的刀具如勺子、刀、叉和餐具以及陶瓷，塑料如蜜胺、金属、瓷器、玻璃和丙烯酸系材料。
其他用途
本发明涉及一种去污方法，包括使污斑与包含组分(a)和(b)以及一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂配制剂接触的步骤。在一个实施方案中，该洗涤剂配制剂包含本发明酶制剂。在一个实施方案中，该方法涉及除去包含脂肪的污斑。
脂肪取决于熔融温度可以细分为脂肪、油脂或油。油在室温下通常为液体。油脂在室温下比油具有更高粘度并且可以称为糊状。
在一个实施方案中，除去包含脂肪的污斑在≤40℃的温度下，尤其是在≤30℃的温度下进行。
实施例
本发明由下列实施例进一步说明。
通用说明：百分数为重量％，除非另有具体指出。
乙酰胆碱(A.12)购自Sigma Aldrich。抗衡离子是氯离子。
(A.14)的前体可以在三甲胺的乙氧基化中代替使用HCl而直接生产或者经由胆碱碳酸氢盐与甲磺酸的反应生产，见Constantinescu等，Chem.Eng.Data，2007，52 1280-1285。
I.盐(组分(a))的合成
基于蒸除的水量并通过IR光谱法，可以显示酯化反应完全。
90％甲磺酸涉及10％水和90％甲磺酸的混合物。
I.1合成本发明盐(A.1)：
将225g(1.5mol)量的酒石酸溶于280g 75重量％氯化胆碱水溶液(1.5mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入15g量的90重量％甲磺酸水溶液并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用200g二甘醇稀释。得到617g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用7.8g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.1)。
I.2合成本发明盐(A.2)：
将150g量的酒石酸(1.0mol)溶于374g 75重量％氯化胆碱水溶液(2.0mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入15g量的90重量％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用200g二甘醇稀释。得到607g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用8.7g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.2)。
I.3合成本发明盐(A.3)：
将210g量的一水合柠檬酸(1.0mol)溶于374g 75重量％氯化胆碱水溶液(2.0mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入18g量的90重量％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用200g二甘醇稀释。得到607g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用10.3g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.3)。
I.4合成本发明盐(A.4)：
将210g量的一水合柠檬酸(1.0mol)溶于561g 75重量％氯化胆碱水溶液(3.0mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入18g量的90重量％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用270g二甘醇稀释。得到868g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用9.6g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.4)。
I.5合成本发明盐(A.5)：
将210g量的一水合柠檬酸(1.0mol)溶于485g 75重量％胆碱甲磺酸盐水溶液(2.0mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入18g量的90重量％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用200g二甘醇稀释。得到663g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用12.5g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.5)。
I.6合成本发明盐(A.6)：
将98.1g量的马来酸酐(1.0mol)与363g作为干物质的胆碱甲磺酸盐(2.0mol)混合。将该混合物在旋转蒸发器中加热至135℃。在混合1小时之后加入12g量的甲磺酸(纯)并在800毫巴的压力下升温至145℃。在混合1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用200g二甘醇稀释。得到653g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用8.9g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.6)。
I.7合成本发明盐(A.7)：
将210g量的一水合柠檬酸(1.0mol)溶于437g 70重量％β-甲基胆碱氯化物水溶液(HO-CH(CH3)-CH2-N(CH3)3Cl，2.0mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水–油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入18g量的90重量％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用200g二甘醇稀释。得到676g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用12.3g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.7)。
I.8合成本发明盐(A.8)：
将105g量的一水合柠檬酸(0.5mol)溶于327g 70重量％β-甲基胆碱氯化物水溶液(1.5mol).在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入13g量的90重量％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用170g二甘醇稀释。得到471g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用21.7g三乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.8)。
I.9合成本发明盐(A.9)：
将210g量的一水合柠檬酸(1.0mol)溶于520g 70重量％β-正丙基胆碱氯化物水溶液(2.0mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入18g量的90％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用250g丙二醇稀释。得到774g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用11.9g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.9)。
I.10合成本发明盐(A.10)：
将210g量的一水合柠檬酸(1.0mol)溶于520g 70％二甲基单丁基胆碱氯化物水溶液(2.0mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在45分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入18g量的90％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用200g丙二醇稀释。得到788g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用11.4g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.10)。
I.11合成本发明盐(A.11)：
将105g量的一水合柠檬酸(0.5mol)溶于397g 60重量％二甲基正辛基胆碱氯化物水溶液(1.0mol)。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在90分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入9.5g量的90％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用200g丙二醇稀释。得到470g量的微黄色液体。将200g如此得到的液体等分试样用8.9g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.11)。
I.13合成本发明盐(A.13)：
将85g量的没食子酸(3,4,5-三羟基苯甲酸，0.5mol)分散于121g 75重量％胆碱甲磺酸盐水溶液(0.5mol)中。在旋转蒸发器(2L烧瓶)中在90分钟内除去水—油浴温度100-120℃，50-80毫巴。加入8g量的90％甲磺酸并在800毫巴的压力下升温至145℃。在旋转蒸发1小时之后将压力连续降至10毫巴，同时在145℃下除水另外4.5小时。得到浅黄色物质，将其用100g二甘醇稀释。得到271g量的微黄色液体。将100g如此得到的液体等分试样用4.6g乙醇胺中和至pH值为6-6.5(10％，在水中)。得到本发明盐(A.13)。对比盐：
C-(A.15)：氯化胆碱，75重量％水溶液，购自BASF SE
C-(A.16)：
将75g(0.5mol)量的酒石酸分批(15g单位)溶于206g 80重量％胆碱碳酸氢盐水溶液(1.0mol)中。搅拌该溶液，直到CO2放出停止。通过旋转蒸发(2L烧瓶)在90分钟内除去水—油浴温度120℃，10毫巴。得到清澈物质，将其用150g二甘醇稀释。得到390g清澈溶液，C-(A.16)。检测不到酯形成。
C-(A.17)：
将105g(0.5mol)量的一水合柠檬酸分批(20g单位)溶于206g 80重量％胆碱碳酸氢盐水溶液(1.0mol)中。搅拌该溶液，直到CO2放出停止。通过旋转蒸发(2L烧瓶)在90分钟内除去水—油浴温度120℃，10毫巴。得到清澈物质，将其用150g二甘醇稀释。得到412g清澈溶液，C-(A.17)。检测不到酯形成。
C-(A.18)：
将105g(0.5mol)量的一水合柠檬酸分批(20g单位)溶于309g 80重量％胆碱碳酸氢盐水溶液(1.5mol)中。搅拌该溶液，直到CO2放出停止。通过旋转蒸发(2L烧瓶)在90分钟内除去水—油浴温度120℃，10毫巴。得到清澈物质，将其用150g二甘醇稀释。得到497g清澈粘稠溶液，C-(A.18)。检测不到酯形成。
C-(A.19)：一水合柠檬酸
C-(A.20)：柠檬酸的单钠盐
C-(A.21)：柠檬酸的二钠盐
C-(A.22)：柠檬酸的三钠盐
C-(A.19)、C-(A.20)、C-(A.21)和C-(A.22)是用于洗涤剂配制剂中的已知助洗剂化合物。
II.应用测试
II.1液体配制剂
低水液体洗涤剂配制剂用二醇如二甘醇或DPG取代水并且因此溶解性是必然的。盐(A.1)-(A.11)和C-(A.16)至C-(A.18)各自可溶于二甘醇和/或二丙二醇中并且因此可以无水配制。
在烧瓶中将50g C-(A.19)、C-(A.20)、C-(A.21)和C-(A.22)各自与100g二甘醇合并在一起并在100℃和搅拌下加热30分钟。移走加热源并将所得白色悬浮液在10小时时间内冷却至环境温度。将所得淤浆过滤(滤纸)并将滤饼用50g异丙醇洗涤两次。重量分析测定分离的化合物C-(A.19)、C-(A.20)、C-(A.21)和C-(A.22)，表明在无水存在下C-(A.19)、C-(A.20)、C-(A.21)和C-(A.22)由于溶解性不足而不能使用。作为滤饼得到下列量：C-(A.19)：44.0g；C-(A.20)：45.8g；C-(A.21)：47.2g；C-(A.22)：48.2g。
II.2酶稳定性
在37℃下评价脂肪酶和蛋白酶在水中的储存稳定性。
基础测试配制剂通过将根据表1的组分混合以制备基础配制剂I-VI而制备。
若适用的话，将相应盐(组分(a))或对比化合物以表1所示的量加入相应基础配制剂中。
将酶(组分(b))以表1所示量加入相应基础配制剂中。表1所提供的酶量涉及活性蛋白。取决于测量何种酶活性加入脂肪酶或蛋白酶。
Figure BDA0002513126850000451
100L(CAS号9001-62-1，EC-No.232-619-9)购自Sigma-Aldrich。
Figure BDA0002513126850000452
16.0L(CAS号9014-01-1，EC-No.232-752-2)购自Sigma-Aldrich。
加入水以完成到100的余量。
表1：液体配制剂
Figure BDA0002513126850000461
(B.1)：n-C18烷基-(OCH2CH2)25-OH
(B.2)：C10-C18烷基聚糖苷共混物
(B.3)：C10-C12烷基苯磺酸钠
(B.4)：枯烯磺酸钠
(B.5)：月桂醇聚醚硫酸钠—n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na
(B.6)：n-C12H25(CH3)2N→O
**对于没有本发明化合物的对比试验，那些用相同量的二甘醇代替。
脂肪酶活性：
在表2所示某些时间点的Lipolase活性通过使用对硝基苯酚戊酸酯(2.4mM pNP-C5，在100mM Tris pH 8.0中，0.01％Triton X100)作为底物测定。在5分钟内在405nm和20℃下每30秒测量吸收。时间依赖性吸收曲线的斜率(在405nm下每分钟的吸收度增加)与脂肪酶活性成正比。
表2显示在储存之后测量的液体配制剂中的脂肪酶活性；在37℃下1-30天。表2中提供的脂解活性值参照在时间0时在参比配制剂中测定的100％值计算。
配制剂的命名如下：在句点之前的罗马数字表征基础配制剂，阿拉伯数字表征盐类型(A.#本发明盐(组分(a))；C-(A.#)对比化合物)。零(“0”)：无盐，但有二甘醇。
表2：在37℃下储存时间范围内的脂肪酶活性
Figure BDA0002513126850000471
Figure BDA0002513126850000481
蛋白酶活性：
在表3所示某些时间点的Savinase活性通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基酰替苯胺(Suc-AAPF-pNA，简称AAPF)作为底物测定。通过蛋白水解裂解将pNA从底物分子裂解，导致游离pNA的黄色的释放，这通过测量OD405而测定。在20℃下进行测量。
表3显示在37℃下储存1-30天之后测量的液体配制剂中的蛋白酶活性。表3中提供的蛋白水解活性值参照在时间0时在参比配制剂中测定的100％值计算。
配制剂的命名如下：在句点之前的罗马数字表征基础配制剂，阿拉伯数字表征盐类型(A.#本发明盐(组分(a))；C-(A.#)对比化合物)。零(“0”)：无盐，但有二甘醇。
表3：在37℃下储存时间范围内的蛋白酶活性
Figure BDA0002513126850000491
II.3纺织品清洁测试
评价配制剂在清洁两种类型测试织物中的洗涤剂性能。测试布样包含由于CFT过程而含有蛋白质和脂肪组分的复杂污垢以及测试布样含有脂肪/颗粒物类型的污垢。
测试按如下进行：将含有8个标准化染污织物片—尺寸各自为2.5×2.5cm并且两侧缝合在聚酯载体上—的多污斑检测仪一起在瓶式去污力测试仪中用2.5g棉织物和5g/L液体测试衣用洗涤剂洗涤，表4。
条件如下：装置：来自SDL Atlas，Rock Hill，USA的瓶式去污力测试仪。洗涤液：250ml，洗涤时间：60分钟，洗涤温度：30℃。水硬度：2.5mmol/L；Ca:Mg:HC03 4:1:8。
布液比1:12。在洗涤循环之后在水中漂洗多污斑检测仪，然后在环境温度下干燥14小时的时间。
使用下列预染污测试织物：
CFT C-S-10：棉上的黄油
CFT C-S-62：猪油，在棉上着色
CFT C-S-68：在棉上的巧克力冰激凌
EMPA 112：在棉上的可可
EMPA 141/1：在棉上的口红
EMPA 125：表面活性剂检测仪
wfk20D：在聚酯/棉混纺织物上的颜料和皮脂类脂肪
CFT C-S-70：巧克力慕司
wfk＝Wfk Test Fabrics GmbH，Krefeld
EMPA＝Swiss Federal Institute of Materials Testing
CFT＝Center for Test Material B.V.
使用颜色测量评价总的清洁水平。检测仪上污斑的反射度值使用具有UV截止滤光片的球面反射光谱仪(来自Datacolor，USA的SF 500型，波长范围360-700nm，光学几何学d/8°)在460nm下测量。在这种情况下，借助CIE-Lab颜色空间分类在洗涤之前和之后测量亮度L*、在红-绿颜色轴上的值a*和在黄-蓝颜色轴上的b*值并对检测仪的8个污斑进行平均。通过评价颜色工具按下列方程定义并自动计算色值变化(ΔE)：
ΔE＝ΔDelta a*2+ΔDelta b*2+ΔDelta L*2，
ΔE是所获得的清洁效果的度量。所有测量重复六次，以得到平均数。注意到更高的ΔE值表明更好的清洁。熟练技术人员可以检测1个单位的差异。非专业人员可以容易地检测2个单位。结果示于表5中。
Rw＝洗涤的污垢反射度
Ro＝未染污反射度
由于助洗剂导致的去垢力增加按如下计算：在该研究期间对各布样总共重复6次；计算90-95％的统计置信水平。
测试配制剂通过将根据表14的组分混合以制备配制剂VII-XIII而制备。
适用的话，将相应盐(组分(a))或对比化合物以表4中提供的量加入相应基础配制剂中。
适用的话，将
Figure BDA0002513126850000511
100L以表4中提供的量加入相应基础配制剂中。
适用的话，将
Figure BDA0002513126850000512
16.0L以表4中提供的量加入相应基础配制剂中。
加入水以完成到100的余量。
表4：液体洗衣配制剂
Figure BDA0002513126850000513
(B.1)：n-C18烷基-(OCH2CH2)25-OH
(B.2)：C10-C18烷基聚糖苷共混物
(B.3)：C10-C12烷基苯磺酸钠
(B.4)：枯烯磺酸钠
(B.5)：月桂醇聚醚硫酸钠—n-C12H25-O-(CH2CH2O)3-SO3Na
(B.6)：n-C12H25(CH3)2N→O
**对于没有本发明化合物的对比试验，用相同量的二甘醇代替那些。
由于盐(组分(a))导致的去垢力增加按如下计算：在该研究期间对各布样总共重复6次；计算>90％的统计置信水平。表5显示了上述多污斑检测仪的ΔE总和。瓶式去污力测试仪测试用新制配制剂和在37℃的储存温度下储存2个月的配制剂进行。作为近似，在37℃下一周等于在20℃下31/2周。
表5：瓶式去污力测试仪测试的结果
Figure BDA0002513126850000521

Claims (14)

1.液体酶制剂，含有：
组分(a)：至少一种通式(I)的盐：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，
R2相同或不同且选自C1-C10烷基和苯基，
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，
X为C2-C4亚烷基，以及
A-为无机或有机抗衡阴离子，
组分(b)：至少一种选自水解酶(EC 3)，优选选自脂肪酶(EC 3.1.1)和内肽酶(EC3.4.21)，更优选选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)和枯草蛋白酶类型蛋白酶(EC3.4.21.62)的酶，以及
任选地，组分(c)：至少一种选自不同于组分(a)的酶稳定剂、防腐剂以及优选选自非离子、两性和阴离子表面活性剂的表面活性剂的化合物。
2.根据权利要求1的酶制剂，其中组分(a)具有选自卤离子、硫酸根、碳酸根、酒石酸根、柠檬酸根、乳酸根和甲磺酸根的抗衡离子。
3.根据权利要求1或2的酶制剂，其中通式(I)化合物中的R2全部为甲基。
4.根据前述权利要求中任一项的酶制剂，其中所述酶制剂相对于所述酶制剂的总重量以0.1-30重量％的量含有组分(a)。
5.根据前述权利要求中任一项的酶制剂，其中组分(a)含有化合物(a’)作为杂质：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-OH R1-COO- (a’)
其中变量R1、R2、X、n和m与相应组分(a)中的相同。
6.根据前述权利要求中任一项的酶制剂，其中所述酶制剂含有组分(c)，其中组分(c)包含至少一种选自含硼化合物和肽醛的酶稳定剂。
7.制备酶制剂的方法，所述方法包括至少混合如下组分的步骤：
组分(a)：至少一种为通式(I)化合物的盐：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，
R2相同或不同且选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，
X为C2-C4亚烷基，以及
A-为无机或有机抗衡阴离子，以及
组分(b)：至少一种选自水解酶(EC 3)，优选选自脂肪酶(EC 3.1.1)和内肽酶(EC3.4.21)，更优选选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)和枯草蛋白酶类型蛋白酶(EC3.4.21.62)的酶。
8.通过加入至少一种通式(I)的盐的步骤在液体酶制剂内稳定至少一种选自水解酶(EC 3)，优选选自脂肪酶(EC 3.1.1)和内肽酶(EC 3.4.21)，更优选选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)和枯草蛋白酶类型蛋白酶(EC3.4.21.62)的酶的方法：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，
R2相同或不同且选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，
X为C2-C4亚烷基，以及
A-为无机或有机抗衡阴离子。
9.根据权利要求8的方法，其中在至少一种优选选自非离子表面活性剂、两性表面活性剂和阴离子表面活性剂的表面活性剂存在下稳定所述酶。
10.至少一种通式(I)的盐作为至少一种选自水解酶(EC 3)，优选选自脂肪酶(EC3.1.1)和内肽酶(EC 3.4.21)，更优选选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)和枯草蛋白酶类型蛋白酶(EC 3.4.21.62)的酶的添加剂的用途：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，
R2相同或不同且选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，
X为C2-C4亚烷基，以及
A-为无机或有机抗衡阴离子，
其中所述盐和所述酶为固体且其中所述酶的稳定化在所述盐和所述酶与至少一种溶剂接触时发生。
11.权利要求1-6中任一项的液体酶制剂在配制到洗涤剂配制剂中的用途，其中在一个或多个步骤中将权利要求1-6中任一项的酶制剂与一种或多种洗涤剂组分混合。
12.洗涤剂配制剂，包含：
组分(a)：至少一种通式(I)的盐：
(R2)3N+-(CH2)nC(R3)(R4)-(O-X)m-O-C(O)-R1 A- (I)
其中
n选自1-12，
m选自0-50，
R1选自线性或支化C1-C10烷基和C6-C10芳基，其中R1可以带有一个或多个羟基或者C＝O或若适用的话被部分或完全中和的COOH基团，
R2相同或不同且选自C1-C10烷基、苯基，
R3和R4相同或不同且选自氢和C1-C4烷基，
X为C2-C4亚烷基，以及
A-为无机或有机抗衡阴离子，
组分(b)：至少一种选自水解酶(EC 3)，优选选自脂肪酶(EC 3.1.1)和内肽酶(EC3.4.21)，更优选选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)和枯草蛋白酶类型蛋白酶(EC3.4.21.62)的酶，
任选地，组分(c)：至少一种不同于组分(a)的酶稳定剂，优选选自如上所公开的含硼化合物，更优选选自如上所公开的苯基硼酸(PBA)或其衍生物，最优选为4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)，以及
至少一种洗涤剂组分。
13.除去包含脂肪的污斑的方法，包括使所述污斑与根据权利要求12的洗涤剂配制剂接触的步骤，其中至少一种包含在所述洗涤剂配制剂的组分(b)中的酶包含至少一种优选选自甘油三酯脂肪酶(EC 3.1.1.3)的脂肪酶(EC 3.1.1)。
14.根据权利要求13的方法，其中在≤40℃的温度下将所述污斑从纺织品除去。
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