CN110023475A - 酶在组合物中的稳定化 - Google Patents

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Abstract

包含组分(a)至少一种含硼化合物，和组分(b)戊烷‑1，2‑二醇和任选的一种或多种其他二醇的组合物，其中所述组合物在20℃和101.3kPa下是液体。所述的组合物稳定化丝氨酸蛋白酶。

Description

酶在组合物中的稳定化
本发明涉及包含至少一种含硼化合物和戊烷-1，2-二醇的组合物。所述组合物可任选包含一种或多种另外的二醇。本发明还涉及包含上述组合物、至少一种选自丝氨酸蛋白酶的酶和至少一种洗涤剂组分的洗涤剂组合物。
酶一般以液体浓缩物的形式被商业化生产，通常来自发酵液。如果酶保存在水环境中，则趋于失稳，因此传统的做法是将其转化为无水形式：水性浓缩物可以被冷冻干燥或喷雾干燥，例如在载体材料的存在下形成聚合体。然而，这些颗粒在使用前通常需要“溶解”，特别是当酶注定成为液体配方的一部分时。
酶的一个重要应用领域是洗涤剂组合物。含有酶的洗涤剂组合物必须满足一些最低要求：1)具有一定的货架期，2)对各种污垢(包括酶敏感的污渍)具有良好的清洁性能。后一方面直接受到酶的货架期的影响，因为目标是在一段时间内、例如在贮存这种洗涤剂组合物期间，保持洗涤剂组合物中酶的优良清洁性能。
酶以固体或液体组合物的形式加入到洗涤剂组合物中。当酶组合物是液体时，需使酶稳定以保持其活性。蛋白酶抑制剂可用于此目的，因为蛋白水解消化是导致活性丧失的主要原因。
硼酸(Boric acid)和硼酸(Boronic acid)已知可逆地抑制蛋白水解酶。《分子与细胞生物化学》(Molecular&Cellular Biochemistry)51，1983，第5-32页，讨论了硼酸对一种丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶的抑制作用。为了重新激活，这种抑制剂需要在使用前或使用过程中被去除，这可以例如通过稀释来实现。
WO 92/19709公开了含有蛋白酶的液体洗涤剂组合物，并讨论了该组合物中附加酶在产品贮存时被蛋白水解酶降解的问题。WO 92/19709的公开针对的是用α-羟基酸、如硼酸及其衍生物制备的液体洗涤剂组合物的问题，已知它们可逆地抑制蛋白水解酶，表现为与助洗剂复合，因此不能充分抑制蛋白水解酶。其中公开的液体洗涤剂包括：(a)硼酸或其衍生物与邻域多元醇的混合物，(b)蛋白水解酶，(c)与洗涤剂相容的第二种酶，(d)阴离子和/或非离子表面活性剂，以及(e)α-羟基酸助洗剂。它公开了在合有蛋白水解酶的重负荷液体组合物中，硼酸或多元醇本身不能为脂肪酶提供足够的稳定性。公开了在蛋白酶的存在下，利用硼酸和(1)丙烷-1，2二醇、(2)丁烷-1，2二醇、(3)己烷-1，2二醇、(4)山梨醇、(5)蔗糖和(6)甘露糖的混合物改善了脂肪酶稳定性。
EP 0381262公开了液体环境中蛋白水解酶和脂解酶的混合物。据称通过添加由硼化合物和多元醇组成的稳定体系，可以提高脂解酶的稳定性。多元醇只含有C、H和O原子，应该至少有两个邻羟基。合适的多元醇的典型实例据称是D-甘露醇、山梨醇和1，2-苯二醇。
本发明基于提供一种有效、可逆地抑制酶活性的组合物的问题，优选为可逆抑制蛋白水解活性。此外，所述组合物应在包含至少一种丝氨酸蛋白酶的液体组合物中有效。
问题通过提供包含以下组分的组合物解决：
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2二醇和任选的一种或更多种另外的二醇，
该组合物在20℃、101.3kPa下为液体。
在一个实施方案中，包含在组分(b)中的一种或多种另外的二醇选自戊烷-1，2二醇以外的水混溶二醇。
在一个实施方案中，组分(a)选自硼酸或其衍生物，优选为BBA和4-FPBA。
在一个实施方案中，包含在组合(a)中的至少一种含硼化合物选自苯基-硼酸或它的衍生物，诸如BBA和4-FPBA。
在一个实施方案中，本组合物包含另外的组分(c)，其包含至少一种丝氨酸蛋白酶和任选一种和多种另外的酶。
在一个实施方案中，包含在组分(c)中的一种或多种另外的酶选自丝氨酸蛋白酶以外的蛋白酶和/或脂肪酶和/或淀粉酶和/或纤维素酶。
在一个实施方案中，本组合物具有7至11.5范围的pH。
在一个实施方案中，本发明提供了戊烷-1，2二醇(组分(b))在含至少一种酶的组合物中在至少一种含硼化合物存在下的用途(方法)，其中至少一种酶选自丝氨酸蛋白酶[组分(c)]，用于丝氨酸蛋白酶的稳定。
在一个实施方案中，本发明提供了戊烷-1，2二醇(组分(b))在包含至少一种酶的组合物中在至少一种含硼化合物(组分(a))的存在下的用途(方法)，其中至少一种酶选自丝氨酸蛋白酶[组分(c)]，用于改善丝氨酸蛋白酶的稳定。
在一个实施方案中，本发明提供了包含以下组分的微囊：
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2二醇和任选一种或多种另外的二醇，和
组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选一种或多种另外的酶，
其中组分(a)、(b)和(c)是微囊核心组合物的一部分。
在一个实施方案中，核心组合物在20℃和101.3kPa下是液体。
本发明提供了制备组合物的方法，包含在非特定顺序下在一个或多个步骤中的混合
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2二醇和任选一种或多种另外的二醇，和
任选组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选一种或多种另外的酶，和
任选组分(d)：一种或多种洗涤剂组分。
在一个实施方案中，本发明提供了制备包含组分(a)、(b)、(c)和(d)的洗涤剂组合物的方法。
本发明进一步涉及包含以下组分的洗涤剂组合物：
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2二醇和任选一种或多种另外的二醇，和
组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选一种或多种另外的酶，和
组分(d)：一种或多种洗涤剂组分，
洗涤剂组合物可以是固体或液体。
在一个实施方案中，洗涤剂组合物包含有效量的组分(a)，用量范围相对于组合物总重的2％至50％的组分(b)，和用量范围0.01至20g/L的组分(c)。
本发明提供了去除污渍的方法，其包含酶敏感污渍与包含以下组分的组合物接触：
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2二醇和任选一种或多种另外的二醇，和
组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选一种或多种另外的酶，和
任选组分(d)：一种或多种去污剂组分。
在一个实施方案中，所述去除污渍的方法包含酶敏感污渍与含以下组分的洗涤剂组合物接触：
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2二醇和任选一种或多种另外的二醇，和
组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选一种或多种另外的酶，和
组分(d)：一种或多种洗涤剂组分。
本发明提供了一种用包含以下组分的洗涤剂组合物与污物接触的清洁方法
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2二醇和任选一种或多种另外的二醇，和
组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选一种或多种另外的酶，和
组分(d)：一种或多种洗涤剂组分。
清洁方法可以是清洗或硬表面清洁。
在一个实施方案中，污物包含至少一种酶敏感污渍。
发明详述
主要由多肽序列来鉴定本文中的酶。
本发明中单一氨基酸的缩写如下：
采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。“亲本”序列(亲本蛋白或酶，也称为“亲本酶”)是引入序列变化的起始序列(例如，通过引入一个或多个氨基酸取代基)，从而带来亲本序列的“变体”。术语亲本酶(或亲本序列)包括
1.野生型酶(序列)和
2.变体序列(酶)，其用作引入(进一步)变化的起始序列。
术语“酶变体”或“序列变体”或“变体酶”在氨基酸序列上与亲本酶有某种程度的差异；然而，通常要求变体至少保持各自亲本酶的酶特性。当与各自的亲本酶比较时，变体酶可具有至少相同的酶活性，或与各自的亲本酶相比时，变体酶可具有更高的酶活性。
在描述本发明的变体时，使用了以下术语：
如下方式描述取代：原始氨基酸，之后是氨基酸序列内的位置编号，之后是取代的氨基酸。例如，120位的组氨酸用丙氨酸取代，被命名为“His120Als”或“H120A”。
如下方式描述删除：提供原始氨基酸，之后是氨基酸序列内的位置编号，之后为＊。相应地，150位甘氨酸的删除被命名为“Gly150＊”或G150＊”。或者，删除用例如“D183和G184的删除”表示。
如下方式描述插入：提供原始氨基酸，之后是氨基酸序列内的位置编号，之后是原始氨基酸和加入的氨基酸。例如，在180位插入紧挨甘氨酸的赖氨酸，被命名位“Gly180GlyLys”或“G180GK”。当插入不知一个氨基酸残基时，例如在Gly180之后Lys和Ala，可表示为：Gly180GlyLysAla或G195GKA。
在取代和插入发生在同样位置的情况下，可表示为S99SD+S99A或简短表示为S99AD。
当氨基酸残基与被插入的现有氨基酸残基相同的情况下，显然术语中的简并性出现了。例如如果在上述实例中甘氨酸之后插入了甘氨酸，将表示为G180GG。
包含多处改变的变体用“+”隔开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”表示在170和195位的精氨酸与甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。或者，多处改变可用空格或逗号隔开，例如分别为R170Y G195E或R170Y，G195E。
一个位置可引入不同改变，不同的改变用逗号隔开，例如“Arg170Tyr，Glu”表示在170位的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。或者不同改变或任选的取代可在括号中表示，例如Arg170[Tyr，Gly]或Arg170{Tyr，Gly}或简短表示为R170[Y，G]或R170{Y，G}。
亲体酶分子的变体与具有酶活性的各亲体酶的氨基酸序列相比可具有至少n％相同的氨基酸序列，n为10至100之间的整数。在一个实施方案中，变体酶当与亲体酶的全长多肽序列比较时，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。在一个实施方案中，当与有酶活性的亲体酶比较，变体酶有n％相同时，其具有酶活性。
与本文中两个氨基酸序列比较相关的“同一性”是通过相同残基数除以比对区域长度计算的，比对区域是显示比完整长度更短的序列。该值乘以100得到“％-同一性”。为了测定两个氨基酸序列之间的％-同一性(即，成对序列比对)，第一步两个序列必须在其整个长度上比对(即，全局比对)。为了进行两个序列的全局比对，可使用任何适宜的计算机程序，像“NEEDLE”程序(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))、“MATGAT”程序(Campanella，J.J.，Bitincka，L.和Smalley，J.(2003)，BMC Bioinformatics，4：29)、“CLUSTAL”程序(Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1988)，Gene，73，237-244)或相似的程序。在无任何程序的情况下，序列也可以手动比对。在比对两个序列后，第二步应当通过比对确定同一性数值。一个指定对齐也可计算出不同的％-同一性数值，这取决于％-同一性计算所使用的方法。因此，创建序列比对的计算机程序，然后从比对计算％-同一性数值；对于指定比对也可报告不同的％-同一性数值，这具体取决于程序所用的计算方法。
因此，使用根据本发明的以下％-同一性计算公式：
％-同一性＝(相同残基/比对区长度，其显示比完整长度更短的序列)＊100。
根据本发明的％-同一性的计算示例如下(Seq 1和Seq 2的唯一目的是验证根据本发明的计算；除此目的，所述序列不具有创造性或功能上的意义)：
Seq 1：TTTTTTAAAAAAAACCCCHHHCCCCAAARVHHHHHTTTTTTTT-长度：43个氨基酸
Seq 2：TTAAAAAAAACCCCHHCCCCAAADLSSHHHHHTTTT-长度：36个氨基酸
因此，较短序列是序列2。
如下进行成对全局比对，在完整长度呈现两个序列：
根据本发明如下进行成对比对，在完整长度呈现更短的序列，得到：
相同残基数为32，与完整长度相比显示较短序列的比对长度是37(存在一个差距，其是较短序列比对长度的因素)
因此，根据本发明的％-同一性是：(32/37)＊100＝86％
涉及氨基酸取代的一个特别方面是保守突变，保守突变通常表现为对蛋白质折叠具有最小影响，与亲本酶的酶性质相比，相应酶变体的酶性质基本上保持不变。保守突变是指一个氨基酸与相似氨基酸交换的突变。这种交换很可能不会改变酶的性质。为了确定％相似性，使用以下方法：
氨基酸A与氨基酸S相似
氨基酸D与氨基酸E；N相似
氨基酸E与氨基酸D；K；Q相似
氨基酸F与氨基酸W；Y相似
氨基酸H与氨基酸N；Y相似
氨基酸I与氨基酸L；M；V相似
氨基酸K与氨基酸E；Q；R相似
氨基酸L与氨基酸I；M；V相似
氨基酸M与氨基酸I；L；V相似
氨基酸N与氨基酸D；H；S相似
氨基酸Q与氨基酸E；K；R相似
氨基酸R与氨基酸K；Q相似
氨基酸S与氨基酸A；N；T相似
氨基酸T与氨基酸S相似
氨基酸V与氨基酸I；L；M相似
氨基酸W与氨基酸F；Y相似
氨基酸Y与氨基酸F；H；W相似
保守性氨基酸取代可能发生在功能蛋白(如酶)的多肽序列的全长上。在一个实施方案中，这种突变不涉及酶的功能域。在一个实施方案中，保守突变不涉及酶的催化中心。
为了考虑保守突变，可以计算两个氨基酸序列的“相似性”值。两个氨基酸序列比较的“相似性”是通过将相同残基的数目加上相似残基的数目除以比对区域的长度来计算的，比对区域显示与完整长度相比的较短序列。该值乘以100得到“％-相似性”。
因此，使用以下方法计算根据本发明的％-相似度：
％-相似度＝[(相同残基+相似残基)/在完整长度中显示较短序列的比对区域长度]＊100。
使用以上实例，显示较短序列的成对比对完整长度，根据本发明如下计算％-相似度：
相同的残基数目是32个，交换的相似氨基酸数目是1个(在以上展示的比对中用“：”表示)，在完整长度中显示较短序列的比对长度是37(存在一个差距，其是较短序列比对长度的因素)
因此，根据本发明的％-相似度是：[(32+1)/37]＊100＝89％
预期包含与各亲体序列至少m％相似的保守突变的变体酶具有基本不变的酶性质，m为10至100的整数。在一个实施方案中，当与亲体酶全长多肽序列相比时，变体酶至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相似。在一个实施方案中，当与亲体酶比较时，有m％-相似度的变体酶具有酶活性。
酶通常通过使用重组宿主细胞进行商业生产，所述重组宿主细胞通过在适于表达所需酶的条件下培养、表达所需酶。培养通常在适宜的营养培养基中进行，使重组宿主细胞生长并表达所需的酶(该过程本文可被称作发酵)。发酵结束时收集发酵液，并可经进一步加工，其中发酵液包含
1、液体部分和
2、固体部分。
所需蛋白或酶可被分泌(至发酵液的液体部分中)，或可能不从宿主细胞分泌(则所需蛋白或酶包含在发酵液的固体部分中)。根据以上情况，所需蛋白或酶可从发酵液的液体部分或从细胞裂解液中回收。但是，所需蛋白可包含在发酵液的液体和固体部分中。
所需酶的回收使用了本领域技术人员已知的方法。从发酵液中回收蛋白或酶的适宜方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取和沉淀。如适用，得到的酶部分可在最终应用中原样使用，或可被进一步纯化。
对于酶的纯化，本领域已知各种方法，包括但不限于色谱法例如离子交换、亲和色谱、疏水色谱、色谱聚焦和尺寸排阻；电泳法例如制备型等电聚焦；差异化溶解度例如硫酸铵沉淀；SDS-PAGE，和提取。通过纯化方法可得到不同程度的酶纯度，并且如果适用，得到的任何质量的酶制品可被用于最终应用。得到的酶制品可以是液体。
酶如果保存在液体环境中倾向于不稳定，特别是如果把它们保存在水性环境中。因此，可通过例如加入化学品(例如，将硼酸加至蛋白酶部分中)的方法使液体酶制品稳定，或液体酶制品可通过例如在载体材料存在下冷冻干燥或喷雾干燥被转化为无水形式以形成聚集物。
本文的“酶性质”包括但不限于催化活性像底物/辅因子特异性、产品特异性、在时间过程中增加的稳定性、热稳定性、pH稳定性、化学稳定性和在贮存条件下改善的稳定性。
术语“底物特异性”反映了可通过酶催化转化的底物范围。
“酶活性”意指通过酶发挥的催化作用，以每毫克酶的单位数(比活性)或每分钟每个酶分子转化的底物分子(分子活性)表示。可通过酶的实际功能具体说明酶活性，例如通过催化肽键水解发挥蛋白水解活性的蛋白酶，通过酯键水解裂解发挥脂肪水解活性的脂肪酶，等等。
根据本发明“增加的酶活性”或“改善的酶活性”意指当与亲体酶比较时，变体酶发挥的催化作用提高了。此外，当无化学品和/或洗涤剂组分情况下与所定义的酶比较时，“提高的酶活性”也可能与所定义的酶和化学品和/或洗涤剂组分的(协同)作用带来改善的催化作用相关。
“酶测定”是测定酶活性的方法。酶测定允许测定经时的底物消耗或产物产生。根据其取样方法，连续测定(连续酶活性测定)可以与不连续测定区分出来(在某个时间点，在停止反应后测定酶活性)。本领域技术人员知晓为指定酶选择适当的酶测定方法。
酶活性在酶的贮存或操作使用期间可能变化。根据本发明的术语“酶稳定性”涉及在贮存或操作期间酶活性时时间的函数。本文的术语“贮存”是表示正贮存的产品或组合物自生产之时至最终应用中使用之时的事实。酶活性的保留作为贮存期间时间的函数，可被称作“贮存稳定性”。
“在最终应用中被使用”包括将组合物用于特定用途或目的的行为。在洗涤剂组合物的背景下的特定用途包括清洁污物的能力。在一个实施方案中，含酶洗涤剂组合物具有去除酶敏感污渍的能力。
酶敏感污渍的非限定实施例包括蛋白酶敏感污渍(本文亦可称作蛋白质污渍)、脂肪酶敏感污渍、淀粉酶敏感污渍和纤维素酶敏感污渍。在一个实施方案中，酶敏感污渍是通过含各酶组合物或通过含这种组合物的洗涤剂组合物去除的。
为了测定和定量在某些条件下贮存或使用的酶经时的催化活性变化，测定在确定条件下在贮存前零时间(100％)的“初始酶活性“和贮存后的较后的某个时间点的酶活性。通过比较测定的数值，可测定酶活性因贮存过程所致的潜在损失。酶活性损失程度确定着酶贮存稳定性。
为了更精确、为了测定和定量在某些条件下贮存或使用的酶催化活性的经时变化，在确定条件下在贮存前零时间测定“初始酶活性”(即100％酶活性)，和贮存后某个时间点的酶活性(x％酶活性)。通过测量数值的比较，可确定因贮存过程所致的潜在的酶活性损失。酶活性损失程度(100％-x％酶活性)决定了酶贮存稳定性。贮存稳定性可被称作“好”(如果在贮存期间酶活性损失不显著)或“不好”(如贮存期间酶活性损失显著)。显著性取决于最终应用的要求。
“酶活性半衰期”是酶活性衰减至其初始值的一半(50％)所需时间的量度。
影响酶的酶活性和/或贮存稳定性和/或操作稳定性的参数是例如pH、温度和氧化物质的存在情况：
ο“pH稳定性”，指蛋白质在特定pH下发挥功能的能力。通常，大多数酶在具有相当高或相当低的pH的条件下发挥功能。与酶的最适pH下的酶活性相比，pH稳定性的显着变化证据是酶活性的半衰期至少约5％或更多的改变(增加或减少)。
ο“热稳定性”(thermal stability)或“热稳定性”(thermostability)是指蛋白质在特定温度下发挥功能的能力。通常，大多数酶发挥功能的温度具有有限的温度范围。除了在中等温度(例如室温)下起作用的酶之外，还存在能够在非常高或非常低的温度下工作的酶。当暴露于给定温度时，酶热稳定性的显著变化证据为酶活性的半衰期中至少约5％或更高的改变(增加或减少)。
ο“氧化稳定性”，指蛋白质在氧化条件下发挥功能的能力，特别是在各种浓度的H2O2、过酸和其他氧化物存在下。与不存在氧化性化合物时存在的酶活性相比，氧化稳定性的显著变化证据是酶活性的半衰期至少约5％或更多的改变(增加或减少)。
ο“蛋白质水解的稳定性”是指蛋白质抵抗蛋白水解的能力。酶学上，蛋白水解受具有蛋白水解活性的蛋白酶催化。非酶促诱导的蛋白水解可能由极端的pH和/或高温引起。本文中蛋白水解的稳定性包括稳定蛋白酶以避免蛋白酶的自身蛋白水解。
酶贮存稳定性通常在水性溶液中在时间过程中受到损害。这可以通过酶在非水条件下贮存加以避免。在非水条件不适用的情况下，例如：在天然含水的组合物中，需要应用不同或另外的策略。通过抑制稳定蛋白水解酶(蛋白酶)是防止蛋白质(例如酶)蛋白水解降解(蛋白水解)成肽或氨基酸(其可以使例如酶的功能失活)的常用技术。蛋白酶的稳定化通常利用酶的可逆抑制。
“酶抑制剂”通过如下概述的几种机制减慢酶活性。抑制剂结合是可逆的或不可逆的。不可逆抑制剂通常通过修饰酶活性所必需的关键氨基酸而与酶共价结合。可逆抑制剂通常非共价结合(氢键、疏水相互作用、离子键)。已知四种一般类型的可逆抑制剂：
(1)底物和抑制剂竞争获得酶活性位点(竞争性抑制)，
(2)抑制剂与底物-酶复合物结合(非竞争性抑制)，
(3)抑制剂的结合降低了酶活性，但不影响底物的结合(非竞争性抑制)，
(4)抑制剂可与底物同时与酶结合(混合性抑制)。
认为通过使用酶抑制剂可使酶稳定。在本发明的上下文中，“被稳定的酶”是与相同的未被抑制的酶的催化活性相比，暂时抑制酶(可逆抑制)的催化活性所产生的效果。在本发明的一个实施方案中，通过包含在本发明组合物中的可逆抑制剂抑制蛋白酶的蛋白水解活性。由于抑制至少一种蛋白酶的蛋白水解活性，可以稳定另一种酶和蛋白酶本身，因为可以防止它们的蛋白水解降解，从而保留另一种酶的催化活性。
根据本发明的“增加的稳定性”或“改善的稳定性”涉及与相同的未被抑制的酶的催化活性相比，暂时抑制酶的催化活性所产生的效果。
“增加的稳定性”可指“增加的贮存稳定性”，“改善的稳定性”可指“改善的贮存稳定性”。
在一个实施方案中，当与贮存前相同的非稳定化蛋白酶相比，稳定的蛋白酶在贮存后保留其催化活性时，蛋白酶的稳定性增加或改善。
此外，当非稳定化蛋白酶存在下与相同的酶相比，所述酶在稳定化的蛋白酶存在下保留其催化活性时，不是蛋白酶的酶在本发明的背景中具有增加或改善的稳定性。
根据本发明待稳定的酶被分类为EC3的水解酶和其他酶。EC编号是根据国际生物化学和分子生物学联合会命名法的编号，并且优选涉及2016年1月1日有效的相应版本。
EC 3类的“水解酶”作用于酯键(EC 3.1，例如脂肪酶)，糖(EC 3.2，例如淀粉酶，纤维素酶)，醚键(EC 3.3)，肽键(EC 3.4，例如蛋白酶)，碳-氮键(EC 3.5)，酸酐(EC 3.6)，碳-碳键(EC 3.7)，卤化物键(EC 3.8)，磷-氮键(EC 3.9)，硫-氮键(EC 3.10)，碳-磷键(EC3.11)，硫-硫键(EC 3.12)和碳-硫键(EC 3.13)。
根据本发明的组合物包含
组分(a)：至少一种含硼化合物和
组分(b)：戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其他二醇，
其中组合物在20℃和101.3kPa下是液体。
本发明中的组分(a)是指至少一种含硼化合物。含硼化合物选自硼酸或其衍生物和硼酸或其衍生物如芳基硼酸或其衍生物、其盐、及其混合物。这里的硼酸可以称为原硼酸。在一个实施方案中，组分(a)中包含的至少一种化合物选自苯硼酸(BBA)及其衍生物。优选地，组分(a)选自苯硼酸(BBA)，其可以在本文中称为苯基硼酸(PBA)、其衍生物，以及它们的混合物。
在一个实施方案中，苯基硼酸衍生物选自式(I)和(II)的衍生物：
其中R1选自氢、羟基、未取代或取代的C1-C6烷基、和未取代或取代的C1-C6链烯基；在优选的实施方案中，R1选自羟基和未取代的C1烷基。
其中R2选自氢、羟基、未取代或取代的C1-C6烷基、和未取代或取代的C1-C6链烯基；在优选的实施方案中，R2选自H、羟基和取代的C1烷基。
在一个实施方案中，苯基-硼酸衍生物选自4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)、4-羧基苯基硼酸(4-CPBA)、4-(羟甲基)苯基硼酸(4-HMPBA)和对甲苯基硼酸(p-TBA)。
在一个实施方案中，组分(a)中包含的至少一种化合物选自苯硼酸(BBA)和4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)。
在优选的实施方案中，组分(a)选自苯硼酸(BBA)和4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)。
其它适宜的衍生物包括2-噻吩基硼酸、3-噻吩基硼酸、(2-乙酰氨基苯基)硼酸、2-苯并呋喃基硼酸、1-萘基硼酸、2-萘基硼酸、2-FPBA、3-FBPA、1-噻蒽基硼酸、4-二苯并呋喃硼酸、5-甲基-2-噻吩基硼酸、1-苯并噻吩-2硼酸、2-呋喃基硼酸、3-呋喃基硼酸、4，4-联苯-二硼酸、6-羟基-2-萘硼酸、4-(甲硫基)苯基硼酸、4-(三甲基甲硅烷基)苯基硼酸、3-溴噻吩硼酸、4-甲基噻吩硼酸、2-萘基硼酸、5-溴噻吩硼酸、5-氯噻吩硼酸、二甲基噻吩硼酸、2-溴苯基硼酸、3-氯苯基硼酸、3-甲氧基-2-噻吩硼酸、对甲基苯乙基硼酸、2-噻蒽硼酸、二苯并噻吩硼酸、9-蒽硼酸、3，5-二氯苯硼酸、二苯硼酸酐、邻氯苯基硼酸、对氯苯基硼酸、间溴苯基硼酸、对溴苯基硼酸、对氟苯基硼酸、辛基硼酸、1，3，5三甲基苯基硼酸、3-氯-4-氟苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸、3，5-双-(三氟甲基)苯基硼酸、2，4-二氯苯基硼酸和4-甲氧基苯基硼酸。
组分(b)包含至少戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其他二醇。
在一个实施方案中、戊烷-1，2-二醇与其他与水混溶的醇混合。这些其他与水混溶的醇可选自乙烷-1，2-二醇、丙烷-1，2-二醇、丁烷-1，2-二醇、丙烷-1，2，3-三醇、2-(2-羟基乙氧基)乙烷-1-醇、2-(2-羟基丙氧基)丙烷-1-醇及其混合物。
在一个实施方案中，戊烷-1，2-二醇与邻位的其他二醇混合，所述邻位二醇选自乙烷-1，2-二醇、丙烷-1，2-二醇、丁烷-1，2-二醇或丙烷-1，2，3-三醇。在优选的实施方案中，组分(b)是丙烷-1，2-二醇和戊烷-1，2-二醇的混合物或丙烷-1，2，3-三醇和戊烷-1，2-二醇的混合物。
在一个实施方案中，包含如上所述的组分(a)和(b)的组合物包含另外的组分(c)，其中组分(c)包含至少一种蛋白酶和任选的一种或多种其他酶。包含组分(a)、组分(b)和组分(c)的组合物在本文中可称为“酶稳定组合物”。
组分(c)中包含的任何蛋白酶是EC 3.4类的成员。EC 3.4类的“蛋白酶”进一步分类为氨肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC 3.4.13)、二肽基肽酶和三肽基肽酶(EC 3.4.14)、肽基二肽酶(EC 3.4.15)、丝氨酸-型羧肽酶(EC 3.4.16)、金属羧肽酶(EC 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)、ω肽酶(EC 3.4.19)、丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(EC 3.4.23)、金属内肽酶(EC 3.4.24)、苏氨酸内肽酶(EC3.4.25)、未知催化机制的内肽酶(EC 3.4.99)。
在一个实施方案中，组分(c)中包含的至少一种酶选自丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)。在一个实施方案中，组分(c)包含一种以上的丝氨酸蛋白酶。在一个实施方案中，组分(c)中包含的“一种或多种其他酶”选自除丝氨酸蛋白酶之外的一种或多种蛋白酶，和/或“除蛋白酶之外的一种或多种酶”，例如脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。
丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶的特征在于在催化活性位点含有丝氨酸，其在催化反应期间与底物形成共价加合物。
根据本发明的丝氨酸蛋白酶可选自糜蛋白酶(例如EC 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.36)、弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.37或EC 3.4.21.71)、颗粒酶(例如、EC3.4.21.78或EC 3.4.21.79)、激肽释放酶(例如EC 3.4.21.34、EC 3.4.21.35、EC3.4.21.118、或EC 3.4.21.119、)纤溶酶(例如EC 3.4。21.7)、胰蛋白酶(例如EC3.4.21.4)、凝血酶(例如EC 3.4.21.5)和枯草杆菌蛋白酶(也称为亚肽酶，例如EC3.4.21.62)，后者也称为“枯草杆菌蛋白酶”。优选地，组分(c)的至少一种酶选自枯草杆菌蛋白酶(也称为枯草杆菌蛋白酶或枯草杆菌酶)。
蛋白酶的晶体结构显示活性位点通常位于相邻结构域之间的分子表面上的凹槽中，并且底物特异性由沿着负责断裂水解的催化位点的一侧或两侧上的凹槽分布的结合位点的性质决定。因此，蛋白酶的特异性可以通过使用概念模型来描述，在模型中每个特异性亚位点能够容纳单个氨基酸残基的侧链。这些位点从催化位点S1、S2...Sn朝向底物的N末端编号，S1′、S2′...Sn′朝向C末端编号。它们容纳的这些残基分别编号为P1、P2...Pn和P1′、P2′...Pn′：
底物 P3 P2 P1 + P1’ P2’ P3’
酶 S3 S2 S1 ＊ S1’ S2’ S3’
在该表示中，酶的催化位点标记为“＊”，并且肽键切割(易断裂键)用符号“+”表示。
一般说来，三种主要类型的蛋白酶活性(蛋白水解活性)是：胰蛋白酶样，其中在P1处的Arg(N)或Lys(K)之后存在酰胺底物的裂解，胰凝乳蛋白酶样，其中裂解发生在P1处的一个疏水氨基酸之后，弹性蛋白酶样为P1处Ala(A)之后的裂解。
Siezen等人(1991)，Protein Eng，4：719-737和Siezen等人(1997)，ProteinScience 6：501-523提出了一种暂命名为枯草杆菌酶的丝氨酸蛋白酶亚组。它们以超过170个氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶的同源性分析来定义，所述丝氨酸蛋白酶之前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，并且根据Siezen等人现在是枯草杆菌酶的一个亚组。已经鉴定了多种枯草杆菌酶，并且已经确定了许多枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于这些枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述，可参考Siezen等人(1997)，Protein Science 6：501-523。
枯草杆菌酶可分为6个亚组，即枯草杆菌蛋白酶家族、热酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、kexin家族和热解蛋白家族。
枯草杆菌酶的亚组是枯草杆菌蛋白酶，其是来自S8家族的丝氨酸蛋白酶，如MEROPS数据库(http://merops.sanger.ac.uk)所定义。肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物。在亚家族S8A中，活性位点残基经常出现在基序Asp-Thr/Ser-Gly(其类似于AA中天冬氨酸内肽酶家族中的序列基序)，His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro中。该家族的大多数成员在中性-温和的碱性pH下具有活性。该家族中的许多肽酶都是耐热的。酪蛋白通常用作蛋白质底物，典型的合成底物是Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-NHPhNO2。
家族S8、亚家族A的着名成员是：
名称 MEROPS家族S8，亚家族A
枯草杆菌蛋白酶Carlsberg S08.001
枯草杆菌蛋白酶lentus S08.003
嗜热蛋白酶 S08.007
枯草杆菌蛋白酶BPN’ S08.034
枯草杆菌蛋白酶DY S08.037
碱性肽酶 S08.038
枯草杆菌蛋白酶ALP 1 S08.045
仙台枯草杆菌蛋白酶 S08.098
碱性弹性蛋白酶YaB S08.157
枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶类具有限定催化三联体的共同氨基酸序列，其将它们与胰凝乳蛋白酶相关类的丝氨酸蛋白酶区分开。枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶都具有包含天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体。
在枯草杆菌蛋白酶相关蛋白酶中，从氨基到羧基末端读取的这些氨基酸的相对顺序是天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。在胰凝乳蛋白酶相关蛋白酶中，相对顺序是组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。因此，本文的枯草杆菌蛋白酶是指具有枯草杆菌蛋白酶相关蛋白酶的催化三联体的丝氨酸蛋白酶。实例包括如WO 89/06276和EP 0283075、WO 89/06279、WO 89/09830、WO89/09819、WO 91/06637和WO 91/02792中所述的枯草杆菌蛋白酶。
枯草杆菌蛋白酶类型的亲体蛋白酶(EC 3.4.21.62)和变体可以是细菌蛋白酶。所述细菌蛋白酶可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌、梭状杆菌、肠球菌、地芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、海洋杆菌、葡萄球菌、链球菌或链霉菌蛋白酶、或革兰氏阴性细菌多肽、例如弯曲杆菌、大肠杆菌、黄杆菌、梭杆菌、螺杆菌、llyobacter、奈瑟菌、假单胞菌、沙门氏菌或解脲支原体蛋白酶。它们充当非特异性内肽酶，即它们水解任何肽键。它们的最适pH通常在中性至明显碱性范围内。例如，R.Siezen的“Subtilases：Subtilisin-like Proteases”，“枯草杆菌蛋白酶”中的第75-95页，由R.Bott和C.Betzel编辑，纽约，1996提供了该家族的综述。
可商购的蛋白酶包括但不限于以如下商品名销售的： Duralase TM、Durazym TM、Ultra、 Ultra、PrimasePolarzyme Ultra、Ultra、和(Novozymes A/S)销售的那些，以商品名Prime、 和Optimase(Danisco/DuPont)，AxapemTM(Gist-BrocasesNV)销售的那些，迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶(BLAP；US5,352,604的图29中显示的序列)及其变体，和来自Kao的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
在本发明的一个方面，丝氨酸蛋白酶(亲本和/或变体)可以是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、芽孢杆菌、芽孢杆菌、芽孢杆菌。扁豆、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌蛋白酶。
在本发明的一个实施方案中，枯草杆菌酶选自以下：
·来自解淀粉芽孢杆菌BPN′的枯草杆菌酶(由Vasantha等人(1984)J.Bacteriol，第159卷，第811-819页和JA Wells等人(1983)在Nucleic Acids Research，第11卷，第7911-7925页中描述)，
·来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌酶(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg；在EL Smith等人(1968)，J.Biol Chem，第24卷，第2184-2191页和Jacobs等人(1985)在Nucl.Acids Res，第13卷中公开，p.8913-8926)中公开，
·枯草杆菌酶PB92(碱性蛋白酶PB92的原始序列描述于EP 283075A2)，
·GB 1243784中公开的枯草杆菌酶147和/或309
·如WO 91/02792中公开的来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌酶，例如来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483或如WO 95/23221中所述的迟缓芽孢杆菌DSM 5483的变体，
·DE 10064983中公开的来自嗜碱芽孢杆菌(DSM 11233)的枯草杆菌酶，
·如WO 2003/054184中公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14391)的枯草杆菌酶，
·在WO 2003/056017中公开的芽孢杆菌属的枯草杆菌酶(DSM 14390)，
·在WO 2003/055974中公开的芽孢杆菌属的枯草杆菌酶(DSM 14392)，
·在WO 2003/054184中公开的来自吉氏芽孢杆菌(DSM 14393)的枯草杆菌酶，
·具有如WO 2005/063974中所述的SEQ ID NO：4的枯草杆菌酶或与其至少40％相同且具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶，
·具有如WO 2005/103244中所述的SEQ ID NO：4的枯草杆菌酶或与其至少80％相同且具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶，
·具有如WO 2005/103244中所述的SEQ ID NO：7的枯草杆菌酶或与其至少80％相同且具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶，和
·如DE 102005028295.4申请中所述的具有SEQ ID NO：2的枯草杆菌酶或与其至少66％相同且具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶。
根据本发明的有用枯草杆菌蛋白酶的实例包括描述于以下的变体：WO 92/19729、WO 95/23221、WO 96/34946、WO 98/2015、WO 98/2011、WO 99/11768、WO 01/44452、WO 02/088340、WO 03/006602、WO 2004/03186、WO 2004/041979、WO 2007/006305、WO 2011/036263、WO 2011/036264和WO 2011/072099。适宜的实例尤其包括源自SEQ ID NO：22的枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶变体，如EP 1921147中所述(其是来自芽孢杆菌DSM 5483的成熟碱性蛋白酶的序列)，其在以下一个或多个位置具有氨基酸取代：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(根据BPN的编号)，它具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，这种枯草杆菌蛋白酶在Asp32、His64和Ser221位置未发生突变(根据BPN′编号)。
在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶具有如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22，或与其至少80％相同并具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且通过在101位具有氨基酸谷氨酸(E)、或天冬氨酸(D)、或天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)、或丙氨酸(a)、或甘氨酸(G)、或丝氨酸(S)(根据BPN′编号)表征，并具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，其特征在于在101位具有氨基酸谷氨酸(E)、或天冬氨酸(D)(根据BPN’编号)并具有蛋白水解活性。这样的枯草杆菌蛋白酶变体可以优选地包含101位的氨基酸取代，例如R101E或R101D，单独或与位置3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167，170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和/或274(根据BPN′编号)处的一处或多处取代，并具有蛋白水解活性。
在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且其特征在于包含至少以下氨基酸(根据BPN′编号)并具有蛋白水解活性：
(a)位置3的苏氨酸(3T)
(b)位置4的异亮氨酸(4I)
(c)63位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(63A，63T或63R)
(d)第156位的天冬氨酸或谷氨酸(156D或156E)
(e)第194位脯氨酸(194P)
(f)位置199的蛋氨酸(199M)
(g)位置205的异亮氨酸(205I)
(h)位置217的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(217D，217E或217G)，
(i)根据(a)至(h)的两种或更多种氨基酸的组合。
在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且其特征在于包含一个氨基酸(根据(a)-(h))或根据(i)的组合和氨基酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G或101S(根据BPN′编号)，并具有蛋白水解活性。
在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且其特征在于包含突变(根据BPN′编号)R101E，或S3T+V4I+V205I，或S3T+V4I+V199M+V205I+L217D，且具有蛋白水解活性。
在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶包含与EP 1921147中描述的SEQ ID NO：22具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且进一步的特征在于包含R101E和S3T、V4I和V205I(根据BPN′编号)并具有蛋白水解活性。
在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶包含与EP 1921147中描述的SEQ ID NO：22具有至少80％同一性的氨基酸序列，进一步的特征在于包含R101E，和选自S156D、L262E、Q137H、S3T、R45E、D、Q、P55N、T58W、Y、L、Q59D、M、N、T、G61D、R、S87E、G97S、A98D、E、R、S106A、W、N117E、H120V、D、K、N、S125M、P129D、E136Q、S144W、S161T、S163A、G、Y171L、A172S、N185Q、V199M、Y209W、M222Q、N238H、V244T、N261T、D和L262N、Q、D(如WO 2016/096711并且根据BPN′编号)的一个或多个取代，并且具有蛋白水解活性。
如上所述计算枯草杆菌蛋白酶变体的％同一性。如上公开的与各亲本序列至少n％相同的枯草杆菌蛋白酶变体酶包括n为至少40至100的变体。取决于如上提供的适用的％-同一性值，在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体具有蛋白水解作用，当与亲本酶的全长多肽序列相比时，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
在另一个实施方案中，本发明涉及枯草杆菌蛋白酶变体，其包含不属于相应枯草杆菌蛋白酶的功能结构域的保守性突变。取决于如上所述适用的％-同一性值，该实施方案的枯草杆菌蛋白酶变体具有蛋白水解活性，与亲本酶的全长多肽序列相比时，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相似。
在一个实施方案中，组分(c)包含至少一种枯草杆菌蛋白酶，其选自与本发明的SEQ ID No：2至少90％相同并具有蛋白水解活性的那些。优选地，枯草杆菌蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌的碱性蛋白酶。
在一个实施方案中，组分(c)包含至少一种枯草杆菌蛋白酶，其选自与本发明的SEQ ID No：1至少90％相同并具有蛋白水解活性的那些。优选地，枯草杆菌蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌的碱性蛋白酶。
根据本发明的蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶，具有“蛋白水解活性”或“蛋白酶活性”。该性质与蛋白酶的水解活性有关(蛋白质水解，意指在多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键水解)，蛋白酶在含有蛋白质，例如酪蛋白、血红蛋白和BSA的底物上。定量地，蛋白水解活性与蛋白酶或蛋白水解酶在限定的时间内降解蛋白质的速率有关。分析蛋白水解活性的方法在文献中是众所周知的(参见例如Gupta等(2002)，Appl.Microbiol.Biotechnol.60：381-395)。
根据本发明，这样的蛋白水解活性可以通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA，短AAPF；参见例如DelMar等人(1979)，Analytical Biochem99，316-320)来确定，作为底物pNA通过蛋白水解切割从底物分子上切下，使游离pNA的黄色释放，其可通过测量OD405来定量。其他方法是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，组分(c)包含至少一种丝氨酸蛋白酶，其量为0.1g/L至150g/L，1g/L至100g/L，10g/L至100g/L，或30g/L至90g/L。
在本发明的一个实施方案中，组分(c)包含一种或多种非蛋白酶的其他酶，其在本文中可被称为“其他酶”。根据本发明的“其他酶”可选自适用于本发明组合物申请的任何酶，例如脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、裂解酶、过氧化物酶、氧化酶过水解酶、甘露聚糖酶、果胶酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种脂肪酶。“脂肪酶”、“脂肪分解酶”、“脂质酯酶”均指EC 3.1.1类的酶(“羧酸酯水解酶”)。这种酶可具有脂肪酶活性(或脂解活性；三酰基甘油脂肪酶，EC 3.1.1.3)，角质酶活性(EC 3.1.1.74；具有角质酶活性的酶在本文中可称为角质酶)，甾醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。
可商购的脂肪酶包括但不限于以商品名LipolaseTM、LipexTM、LipolexTM和LipocleanTM(Novozymes A/S)、Lumafast(最初来自Genencor)和Lipomax(Gist-Brocades/现在DSM)销售的那些。
在本发明的一个方面，合适的脂肪酶选自以下：
·来自Humicola(同义词嗜热真菌属)的脂肪酶，例如来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)，如EP258068、EP305216、WO92/05249和WO2009/109500中所述，或来自H.insolens，如WO 96/13580中所述，
·如WO 92/05249中所述的源自米黑根毛霉的脂肪酶。
·来自假单胞菌菌株的脂肪酶(其中一些现已更名为伯克霍尔德氏菌)，例如来自P.alcaligenes或类产碱假单孢菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272、WO 94/25578、WO95/30744、WO 95/35381、WO 96/00292)、洋葱头锈菌(P cepacia)(EP331376)，施氏假单孢菌(P.stutzeri)(GB 1372034)、荧光假单孢菌(P.fluorescens)、假单孢菌属菌株SD705(WO95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单孢菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、门多萨假单孢菌(Pseudomonas mendocina)(WO 95/14783)、颖壳假单孢菌(P.glumae)(WO 95/35381，WO 96/00292)
·来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO 2011/150157)和始旋链霉菌(S.priistinaespiralis)(WO2012/137147)的脂肪酶，GDSL型链霉菌脂肪酶(WO2010/065455)，
·如WO2011/084412中公开的来自嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶，
·WO2011/084417中公开的来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的脂肪酶，
·例如如WO 00/60063中所公开的芽孢杆菌(Bacillus)脂肪酶，如Dartois等人(1992)Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360或WO2011/084599所公开的来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，嗜热脂肪芽杆菌(B.stearothermophilus)(JP S64-074992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
·如WO 94/01541中公开的来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶。
合适的脂肪酶还包括称为酰基转移酶或过水解酶的那些，例如，与南极假丝酵母脂肪酶A(WO2010/111143)具有同源性的酰基转移酶，来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶(WO2005/056782)，来自CE7家族的过水解酶(WO 2009/67279)，以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是S54V变体(WO2010/100028)。
在本发明的一个方面，合适的角质酶选自以下：
·来自门多萨假单孢菌的角质酶(US 5389536，WO 88/09367)
·来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的角质酶(WO 2010/107560)
·如WO 90/09446、WO 00/34450和WO 01/92502中公开的来自Fusarun solanipisi的角质酶
·如WO 00/34450和WO 01/92502中公开的来自柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)的角质酶
合适的脂肪酶和/或角质酶还包括那些具有脂解酶活性或角质酶活性的上述脂肪酶和/或角质酶的变体。这种合适的脂肪酶变体例如是通过WO 95/22615、WO 97/04079、WO97/07202、WO 00/60063、WO 2007/087508、EP 407225和EP 260105中公开的方法开发的那些。
合适的脂肪酶/角质酶还包括那些具有脂解酶活性或角质酶活性的上述脂肪酶/角质酶的变体。合适的脂肪酶/角质酶变体包括与如上公开的亲本酶的全长多肽序列相比具有至少40-100％同一性的变体。在一个实施方案中，具有脂解活性或角质酶活性的脂肪酶/角质酶变体可以是当与如上公开的亲本酶的全长多肽序列相比时至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
在另一个实施方案中，本发明涉及脂肪酶/角质酶变体，其包含不属于相应脂肪酶/角质酶的功能结构域的保守突变。具有脂解活性或角质酶活性的该实施方案的脂肪酶/角质酶变体与亲本酶的全长多肽序列相比，可以是至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相似。
根据本发明的脂肪酶具有“脂肪分解活性”。测定脂解活性的方法在文献中是众所周知的(参见例如Gupta等人(2003)，Biotechnol.Appl.Biochem.37，第63-71页)。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种淀粉酶。根据本发明的“淀粉酶”(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些(分别为EC 3.2.1.1和3.2.1.2)。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。
可商购的淀粉酶包括但不限于以商品名DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X和BANTM(来自Novozymes A/S)和RapidaseTM、Purastar TM、PoweraseTM、EffectenzTM(来自DuPont的M100)、PreferenzTM(S1000、S110和F1000；来自DuPont)、PrimaGreenTM(ALL；DuPont)、OptisizeTM(DuPont)销售的那些。
在本发明的一个方面，淀粉酶是亲本酶或变体酶，其选自以下：
·来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、具有如WO 95/10603中所述的SEQ ID NO：2的淀粉酶。合适的变体是如WO 95/10603中描述的与SEQ ID NO：2至少90％相同和成在以下位置包含一个或多个取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444，其具有淀粉分解活性。此类变体描述于WO 94/02597、WO 94/018314、WO 97/043424和WO99/019467的SEQ ID NO：4中。
·来自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的淀粉酶，其具有如WO 02/10355中公开的SEQ ID NO：6或与其具有至少90％相同的具有淀粉分解活性的淀粉酶。SEQID NO：6的合适变体，包括与其至少90％相同和/或在位置181和/或182缺失和/或在193位取代的那些。
·来自如WO 99/19467中公开的具有SEQ ID NO：6的芽孢杆物种707的淀粉酶或与具有淀粉分解活性淀粉酶至少90％相同的淀粉酶。
·来自盐敏芽胞杆菌(Bacillus halmapalus)的淀粉酶，其具有如WO 96/23872中所述的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7，也被描述为SP-722，或与具有淀粉分解活性的序列之一至少90％相同的淀粉酶。
·来自芽孢杆菌属DSM 12649的如WO 00/22103中公开的具有SEQ ID NO：4的淀粉酶或至少90％相同的具有淀粉分解活性的淀粉酶。
·来自WO 2009/061380中公开的具有SEQ ID NO：2的芽孢杆菌菌株TS-23的淀粉酶或至少90％相同的具有淀粉分解活性的淀粉酶。
·来自嗜纤维菌属物种(Cytophaga sp)的具有如WO2013/184577中公开的SEQ IDNO：1或至少90％相同的具有淀粉分解活性的淀粉酶。
·来自如WO2010/104675中公开的具有SEQ ID NO：1的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)DSM 90的淀粉酶或至少90％相同的具有淀粉分解活性的淀粉酶。
合适的淀粉酶包含如WO 00/60060中所述的SEQ ID NO：2的氨基酸1至485或包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1至485至少96％相同的氨基酸序列的淀粉酶，其具有淀粉分解活性。
其他合适的淀粉酶是具有如WO 2006/002643中所述的SEQ ID NO：12的淀粉酶或与其具有至少80％同一性并具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：12相比具有至少80％同一性和/或在Y295F和M202LITV位置具有取代并具有淀粉分解活性的淀粉酶。
合适的淀粉酶包括WO 2011/098531中描述的具有SEQ ID NO：6的淀粉酶或具有至少80％同一性的具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：6相比具有至少80％同一性和/或包含在选自193[G、A、S、T或M]、195[F、W、Y、L、I或V]、197[F、W、Y、L、I或V]、198[Q或N]、200[F、W、Y、L、I或V]、203[F、W、Y、L、I或V]、206[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D或E]、210[F、W、Y、L、I或V]、212[F、W、Y、L、I或V]、213[G、A、S、T或M]和243[F、W、Y、L、I或V]的一个或多个位置上的取代并具有淀粉分解活性的淀粉酶。
合适的淀粉酶是具有如WO2013/001078中所述的SEQ ID NO：1的淀粉酶或具有至少85％同一性的具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：1相比具有至少85％同一性和/或包含对应于位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476和G477的两个或更多个(几个)位置的改变并具有淀粉分解活性的淀粉酶。
其他合适的淀粉酶是具有如WO2013/001087中所述的SEQ ID NO：2的淀粉酶或与其具有至少85％同一性并具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：2相比具有至少85％同一性和/或包含具有淀粉分解活性的181+182位、182+183位或183+184位缺失的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：2相比具有至少85％同一性和/或包含181+182位或182+183位或183+184位缺失，其包含任何一个或两个以上对应于W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476和G477的位置的修饰并具有淀粉分解活性的淀粉酶。
淀粉酶还包括来自上述淀粉酶的杂合α-淀粉酶，例如WO 2006/066594中所述。
合适的淀粉酶还包括那些具有淀粉分解活性的上述淀粉酶变体的淀粉酶。
取决于如上所提供的适用的％-同一性值，一个实施方案中的淀粉酶变体可以是与上文公开的亲本酶的全长多肽序列相比具有至少40％至100％相同的那些。在一个实施方案中，具有淀粉分解活性的淀粉酶变体与如上公开的亲本酶的全长多肽序列相比可以是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含不属于相应淀粉酶的功能结构域的保守性突变的淀粉酶变体。取决于如上提供的适用的％-同一性值，该实施方案中的淀粉酶变体可以是当与亲本酶的全长多肽序列相比至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相似的具有淀粉分解活性的淀粉酶。
根据本发明的淀粉酶具有涉及多糖中葡糖苷键的(内切)水解的“淀粉分解活性”或“淀粉酶活性”。α-淀粉酶活性可以通过本领域技术人员已知的测量α-淀粉酶活性的测定来确定。测量α-淀粉酶活性的测定的实例是：
α-淀粉酶活性可通过使用Phadebas片剂作为底物的方法测定(Phadebas淀粉酶试验，由Magle Life Science提供)。淀粉通过α-淀粉酶水解，得到可溶性蓝色片段。在620nm处用分光光度法测定所得蓝色溶液的吸光度，其是α-淀粉酶活性的函数。测定的吸光度与给定条件下待测α-淀粉酶的比活性(纯α-淀粉酶蛋白的活性/mg)成正比。
α-淀粉酶活性也可以通过使用亚乙基-4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷(EPS)的方法测定。D-麦芽七糖苷是封闭的寡糖，其可被内切淀粉酶切割。在切割后，试剂盒中包含的α-葡萄糖苷酶消化底物以释放具有黄色的游离PNP分子，因此可以通过405nm处的可见分光光度法测定。含有EPS底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Roche Costum Biotech(目录号10880078103)生产。时间依赖性吸收曲线的斜率与给定条件下所讨论的α-淀粉酶的比活性(每mg酶的活性)成正比。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种纤维素酶。“纤维素酶”(Cellulases)，“纤维素酶”(cellulase enzymes)或“纤维素分解酶”(cellulolyticenzymes)是参与纤维素水解的酶。已知三种主要类型的纤维素酶，即纤维二糖水解酶(1，4-PD-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)，内切-ss-1，4-葡聚糖酶(内切-1，4-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.4)和ss-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。
在本发明的一个方面，纤维素酶是EC3.2.1.4的内切葡聚糖酶，其可以被命名为内切葡聚糖酶、内切-1，4-ss-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶和β-1，4-葡聚糖酶。内切葡聚糖酶可以在含有超过20种EC 3.2.1.4的内切葡聚糖酶的家族5下通过氨基酸序列相似性(Henrissat，B.Antcessed at UniProt 10/26/2011)进行分类。还参考T.-M.Enveri，“微生物纤维素酶”(“Microbial Cellulases”)在W.M.Fogarty，Microbial Enzymes and Biotechnology，Applied Science Publishers，第183-224页(1983)；Enzymology，(1988)第160卷，第200-391页(Wood，W.A和Kellogg，S.T编辑)；Béguin，P，“纤维素降解的分子生物学”(“Molecular Biology of CelluloseDegradation”)，Annu.Rev.Microbiol.(1990)，第44卷，第219248页；Begun，P和Aubert，J-P，“纤维素的生物降解”(“The biological degradation of cellulose”)，FEMSMicrobiology Reviews 13(1994)第25-58页；Henrissat，B.，“纤维素酶及其与纤维素的相互作用”(“Cellulases and their interaction with cellulose”)，Cellulose(1994)，第1卷，第169-196页。
可商购的纤维素酶是CelluzymeTM、EndolaseTM、CarezymeTM、CellusoftTM、RenozymeTM、CellucleanTM(来自Novozymes A/S)、EcostoneTM、BiotouchTM、EconaseTM、EcopulpTM(来自AB Enzymes Finland)、ClazinaseTM和Puradax HATM、Genencor洗涤剂纤维素酶L、IndiAgeTM Neutra(来自Genencor International Inc./DuPont)、RevitalenzTM(2000来自DuPont)、PrimafastTM(DuPont)和KAC-500TM(来自Kao Corporation)。
根据本发明的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。
合适的亲本和变体酶选自以下属：
·芽孢杆菌(Bacillus)，如芽孢杆菌属物种(Bacillus sp)CBS 670.93和CBS669.93
·漆酶(Melanocarpus)，例如WO 97/14804中公开的Melanocarpus albomyces
·梭菌(Clostridium)，例如嗜热梭菌(Clostridinm thermocellum)
·腐殖霉属(Humicola)，例如如EP 0495257、EP 0531315、EP 0531372、US4435307、US 5648263、US 5776757、WO 89/09259、WO 91/17244、WO 94/07998中所公开的(序列显示在图1中“43kdhum及其变体”、WO 95/24471、WO 96/11262和WO 98/12307所公开的特异腐质霉(Humicola insolens)(DSM1800)。
·镰刀菌(Fusarium)，例如如EP 0495257、EP 0531315、EP 0531372、US 5648263、US 5776757、WO 89/09259、WO 91/17244、WO 95/24471和WO 96/11262中所公开的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)例如菌株J79(DSM2672)。
·梭孢壳霉(Thielavia)，如EP 0531315、US 5648263、US 5776757、WO 89/09259、WO 91/17244、WO 95/24471、WO 96/11262、WO 96/29397(SEQ ID NO：9及其变体)和WO 98/12307所公开的如太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)或嗜热毁丝霉菌株(Myceliophthora thermophila)CBS 11765。
·木霉属(Trichoderma)，如EP 1305432、EP 1240525、WO 92/06165、WO 94/21801、WO 94/26880、WO 95/02043、WO 95/24471和WO 02/099091中所公开的里氏木霉(Trichoderma reesei)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)或哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。
·曲霉菌(Aspergillus)，如WO 93/17244中公开的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)
·欧文氏菌(Erwinia)，如M.H.Boyer等人在European Journal ofBiochemistry，第162卷，第311-316页(1987)中描述的欧文氏菌(Erwiniachrysanthermi)。
·如WO 96/11262和WO 96/29397(SEQ ID NO：1)中公开的顶孢霉(Acremonium)，例如顶孢霉物种(Acremonium sp.)，柿顶孢霉(Acremonium persicinum)，Acremoniumacremonium，Acremonium brachypenium，Acremonium dichromosporum，Acremoniumobclavatum，Acremonium pinkertoniae，粉灰顶孢霉(Acremonium roseogriseum)，Acremonium incoloratum，棕色枝顶孢(Acremonium furatum)(SEQ ID NO：5及其变体)。
·细胞弧菌(Cellvibrio)，例如纤维弧菌属混杂DSM 11683，纤维弧菌属混杂DSM11684，纤维弧菌属混杂DSM 11685，纤维弧菌属混杂ACM 2601，纤维弧菌属混杂DSM 1523和纯黄色纤维弧菌属DSM 11686，如WO 98/08940中所公开的。
·头孢菌属(Cephalosporium)，如头孢霉属物种(Cephalosporium sp.)RYM-202如WO 96/11262中所公开。
合适的纤维素酶还包括那些具有纤维素分解活性的上述纤维素酶的变体。合适的纤维素酶变体包括与如上公开的亲本酶的全长多肽序列相比具有至少40-100％同一性的变体。在一个实施方案中，具有纤维素分解活性的纤维素酶变体与上文公开的亲本酶的全长多肽序列相比，可以是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
在另一个实施方案中，本发明涉及纤维素酶变体，其包含不属于相应纤维素酶的功能结构域的保守性突变。具有纤维素分解活性的该实施方案的纤维素酶变体与亲本酶的全长多肽序列相比，可以是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相似。
根据本发明的纤维素酶具有“纤维素分解活性”或“纤维素酶活性”，根据本发明涉及内切葡聚糖酶活性。用于测量内切葡聚糖酶活性的测定法是本领域技术人员已知的。
例如，纤维素分解活性可以通过纤维素酶将羧甲基纤维素水解成还原性碳水化合物的事实来确定，其还原能力通过铁氰化物反应以比色法测定，Hoffman，W.S.，J.Biol.Chem.120，51(1937)。
纤维素分解活性不仅可以导致去除含有污渍的纤维素，而且可以有利于通过减少起球，去除使织物表面粗糙或模糊的原纤维来实现织物整理，或者可以产生石洗外观。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种过水解酶。合适的“过水解酶”能够催化过水解反应，导致在过氧源(例如过氧化氢)存在下由羧酸酯(酰基)底物产生过酸。虽然许多酶以低水平进行该反应，但过水解酶表现出高的过水解：水解比通常大于1。合适的过水解酶可以是植物、细菌或真菌来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。
有用的过水解酶的实例包括天然存在的分枝杆菌过水解酶或其变体。示例性酶衍生自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。此类酶，其酶性质、结构及其变体描述于WO 2005/056782、WO 2008/063400、US 2008145353和US 2007167344中。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种甘露聚糖酶。“甘露聚糖酶”可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。其可以是来自芽孢杆菌或腐质霉的野生型、特别是B.agaradhaerens、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或H.insolens。合适的甘露聚糖酶描述于WO 99/064619中。
市售的甘露聚糖酶是(Novozymes AIS)。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种过氧化物酶和/或氧化酶。合适的过氧化物酶和氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。
根据本发明的氧化酶特别包括酶分类EC 1.10.3.2所包含的任何漆酶，或由其衍生的任何具有漆酶活性的片段，或具有相似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC 1.10。3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)、或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。来自真菌的合适实例包括可自黄曲霉属、脉孢菌属(Neurospora)菌株得到的漆酶，例如，粗糙脉孢菌(N.crassa)、柄孢壳属(Podospora)、葡萄孢属(Botrytis)、金钱菌属(Collybia)、Farnes、香菇属(Lentinus)、侧耳属(Pleurotus)，栓菌(Trametes)，例如长绒毛栓菌(T.villosa)和云芝(T.versicolor)，丝核菌属(Rhizoctonia)，例如立枯丝核菌(R.solani)，鬼伞属(Coprinopsis)，例如灰白拟鬼伞(C.cinerea)，毛头鬼伞(C.comatus)，费赖斯鬼伞(C.friesii)和裙纹鬼伞(C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)，例如黄盖小脆柄菇(P.condelleana)，斑裙菇属(Panaeolus)，例如大孢花褶伞(P.papilionaceus)，毁丝霉属(Myceliophthora)，例如嗜热毁丝霉，柱顶孢属(Schytalidium)，例如嗜热链球菌，多孔菌属，例如筛孔多孔菌(P.pinsitus)，射脉菌属(Phlebia)，例如射脉齿菌(P.radiata)(WO 92/01046)，或革盖菌属(Coriolus)，例如，毛云芝菌(C.hirsutus)(JP 2238885)。
漆酶可以源自鬼伞或毁丝霉。在一个实施方案中，漆酶来自灰白拟鬼伞，如WO 97/08325中所公开的；或者来自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，如WO 95/33836中所公开的。
漆酶可以是细菌漆酶，例如漆酶。漆酶可以是革兰氏阳性细菌多肽、例如芽孢杆菌、链球菌、链霉菌、葡萄球菌、肠球菌、乳杆菌、乳球菌、梭菌、地芽孢杆菌或海洋杆菌漆酶、或革兰氏阴性细菌多肽，例如大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、螺杆菌、黄杆菌、梭杆菌、llyobacter、奈瑟菌属或脲原体属(Ureaplasma)漆酶。
在一个实施方案中，漆酶选自WO 2009/127702的SEQ ID NO：2、4、6和8中所述的那些及其变体。
术语“漆酶活性”在本文中定义为酶分类EC 1.10.3.2所覆盖的或类似活性，例如儿茶酚氧化酶活性(EC 1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶活性(EC 1.10.3.4)、或胆红素氧化酶活性(EC 1.3.3.5)，其催化使用分子氧底物的氧化。
“漆酶活性”通过在有氧条件下氧化丁香醛连氮测定。在530nm处测定所产生的紫色。分析条件是19μM丁香醛连氮，23mM Tris/马来酸盐缓冲液，pH 7.5下30℃和1分钟反应时间。
其他氧化酶的实例包括但不限于氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、半乳糖氧化酶、多元醇氧化酶(例如WO 2008/051491)和醛糖氧化酶。氧化酶及其相应的底物可用作产生过氧化氢的酶系统，因此可用作过氧化氢源。例如过氧化物酶、卤过氧化物酶和过水解酶的数种酶需要过氧化氢源。通过研究EC 1.1.3._、EC 1.2.3._、EC 1.4.3._和EC1.5.3._或类似的类别(在国际生物化学联合会下)，本领域技术人员容易识别这种氧化酶组合的其他实例和底物。
过氧化物酶(EC 1.11.1.7)使用过氧化氢作为底物。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属的过氧化物酶，例如，来自灰盖鬼伞(C.cinereus)及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602、WO 98/10060和WO 98/15257中所述。
可商购的过氧化物酶包括Guardzyme TM(Novozymes A/S)，PrimaGreen TM Oxy(DuPont)。
“过氧化物酶活性”可以通过如Childs等人1975(Biochemical J，145，p.93-103)所述的ABTS方法测量，商业试剂盒可从不同的供应商处获得。其他测量方法是本领域已知的那些。
用于本发明的过氧化物酶还包括卤过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶和表现出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。卤过氧化物酶根据其对卤离子的特异性进行分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化氯离子形成次氯酸盐。
在一个实施方案中，卤过氧化物酶是氯过氧化物酶。在一个实施方案中，卤过氧化物酶是钒卤过氧化物酶，即含有钒酸盐的卤过氧化物酶。在本发明的一个实施方案中，含有钒酸盐的卤过氧化物酶与氯离子源结合。
已经从许多不同的真菌中分离出卤过氧化物酶，特别是来自真菌组的暗色丝孢菌，例如Caldariomyces，例如海洋真菌(C.fumago)，链格孢菌属(Alternaria)，弯孢菌属(Curvularia)，例如糙壁弯孢霉(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis)，脐蠕孢属(Drechslera)，细基格孢属(Ulocladium)和葡萄孢属(Botrytis)。还从细菌如假单胞菌中分离出卤过氧化物酶，例如，吡咯假单孢菌(P.pyrrocinia)和链孢菌属(Streptomyces)，例如金黄色葡萄球菌。
在一个实施方案中，卤过氧化物酶来自弯孢属物种(Curvularia sp)，特别是糙壁弯孢霉(Curvularia verruculosa)或不等弯孢(Curvularia inaequalis)，例如如WO 95/27046中所述的不等弯孢CBS 102.42；或如WO 97/04102中所述的糙壁弯孢霉CBS 147.63或糙壁弯孢霉CBS 444.70；或如来自WO 2001/79459中所述的哈氏脐蠕孢(Drechslerahartlebii)，如WO 2001/79458中所述的Dendryphiella salina，如WO 2001/79461中所述的Phaeotrichoconis crotalarie，或如WO 2001/79460中所述的内生真菌物种(Geniculosporium sp)。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种裂解酶。“裂解酶”可以是源自芽孢杆菌的果胶酸裂合酶，特别是地衣芽孢杆菌或黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)，或衍生自它们的变体，例如，如US 6,124,127、WO 99/027083、WO 99/027084、WO 2002/006442、WO 2002/092741、WO 2003/095638中所述。
可商购的果胶酸裂解酶是XpectTM、PectawashTM和PectawayTM(Novozymes A/S)；PrimaGreenTM、EcoScour(杜邦)。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种选自果胶酶和/或阿拉伯糖酶和/或半乳聚糖酶和/或木聚糖酶的酶。合适的果胶酶和/或阿拉伯糖酶和/或半乳聚糖酶和/或木聚糖酶是本领域技术人员已知的。
包含组分(a)和(b)和(c)的本发明组合物优选在20℃和101.3kPa下为液体。这种组合物可包含0.1g/L至150g/L的组分(c)。在一个实施方案中，本发明的组合物包含组分(c)，其量为1g/L至100g/L。优选地，本发明组合物中组分(c)的量在10g/L至100g/L的范围内，更优选地，本发明组合物中组分(c)的量在30克/升至90克/升的范围内。组分(c)的量意指组合物中包含的酶的总量。
由于抑制含硼化合物(优选硼酸或其衍生物)对蛋白水解活性酶的有效性变化，组合物中组分(a)的量优选适应该目的，并且本文可被称为“组分(a)的有效量”。在一个实施方案中，组合物中组分(a)的量相对于总组合物重量为0.1-30％。
在本发明的一个具体实施方案中，4-FPBA的使用浓度范围为0.5％至8％(重量)，或相对于总组合物为1％至5％(重量)。在本发明的另一个实施方案中，苯硼酸(BBA)的用量相对于总组合物为5％至25％(重量)。在本发明的另一个实施方案中，4-(羟甲基)苯基硼酸的用量相对于总组合物为5-25％(重量)。在本发明的另一个实施方案中，对甲苯基硼酸的用量相对于总组合物为5％至25％(重量)。
在一个实施方案中，本发明组合物中组分(b)相对于总组合物的量为10％至65％。优选地，组分(b)的量相对于总组合物为30％至60％(重量)。
本发明的组合物包含戊烷-1，2-二醇，其量优选为至少10％(重量)，更优选为至少20％(重量)，甚至更优选为至少35％(重量)，和特别是相对于组合物的总重量的量为至少50％(重量)。
在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶，优选枯草杆菌蛋白酶的稳定性在组分(a)和(b)存在下在与仅存在组分(a)时相同的丝氨酸蛋白酶相比时得到改善，并且当与不存在组分(a)和(b)的情况下相同的丝氨酸蛋白酶比较时，也是如此。
在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中丝氨酸蛋白酶，优选枯草杆菌蛋白酶的稳定性在组分(a)和(b)存在期间，在与仅存在组分(a)以及在不存在组分(a)和(b)的情况下与相同的丝氨酸蛋白酶比较时得到改善。
为了测定蛋白水解活性随时间的变化，可以在零时间(即贮存前)在限定条件下测定酶的“初始蛋白水解活性”，并且可以在后来的时间的某一点(即贮存后)测定“贮存后的蛋白水解活性”。组分(a)和/或(b)贮存后和释放后的蛋白水解活性除以初始蛋白水解活性乘以100得到“应用中可获得的蛋白水解活性”(x％)。当蛋白酶在应用中可获得的蛋白水解活性等于100％时，根据本发明的蛋白酶被稳定化。在一个实施方案中，应用中可获得的蛋白水解活性为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。
100％减去x％给出“贮存期间蛋白水解活性的丧失”。在一个实施方案中，当在贮存期间基本上不发生蛋白水解活性的损失时，根据本发明的蛋白酶被稳定化，即蛋白水解活性的损失等于0％。在一个实施方案中、基本上没有蛋白水解活性的损失意指蛋白水解活性的损失小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
与非稳定化蛋白酶相比，包含组分(a)和(b)的组合物中包含的蛋白酶可显示出降低的蛋白水解活性。在本发明中，将组分(a)和/或(b)等抑制剂加入到组分(c)中以后测量的蛋白水解活性除以初始蛋白水解活性乘以100后被称为“残留蛋白水解活性”(y％)。在一个实施方案中，当未呈现出残留的蛋白水解活性时蛋白酶被稳定化，即y％等于0％。在一个实施方案中，y％小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％。
在一个实施方案中，组分(c)中包含的除丝氨酸蛋白酶以外、优选除枯草杆菌蛋白酶以外的一种或多种酶，具有改善的稳定性。除了丝氨酸蛋白酶之外的酶在稳定化的丝氨酸蛋白酶存在下，在贮存期间与非稳定化的丝氨酸蛋白酶存在下，与丝氨酸蛋白酶以外的相同酶相比，当保持其催化活性时具有改善的稳定性。
为了测定除丝氨酸蛋白酶之外的酶的活性随时间的变化，在定义的条件下测定(即在贮存之前)除了丝氨酸蛋白酶之外的酶的零时“初始酶活性”，测定在某个时间点(即贮存后)除了丝氨酸蛋白酶之外的酶的活性得到“贮存后的酶活性”。贮存后的酶活性除以初始酶活性乘以100得到除丝氨酸蛋白酶之外的酶的“保持的酶活性”(z％)。优选地，当其保持的酶活性等于100％时，根据本发明除丝氨酸蛋白酶之外的这种酶被稳定化。在一个实施方案中，保持的酶活性等于至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。
从100％减去z％给出“除丝氨酸蛋白酶之外的酶的活性的丧失”。优选地，根据本发明，当除了丝氨酸蛋白酶之外的酶的活性基本上没有损失时，除了丝氨酸蛋白酶之外的酶被稳定化，即除了丝氨酸蛋白酶之外的酶的活性的损失等于0％。在一个实施方案中，除了丝氨酸蛋白酶之外基本上没有酶活性的损失意指所述酶活性的损失小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
在一个实施方案中，包含在含有根据本发明的组分(a)、(b)和(c)的组合物中的酶可以使用另外的稳定剂和/或蛋白酶抑制剂来稳定，例如NaCl或KCl、乳酸、甲酸等不同的盐或肽醛，如二、三或四肽醛或醛类似物(B1-BO-R形式，其中R是H、CH3、CX3、CHX2或CH2X(X＝卤素)，BO是单个氨基酸残基(在一个实施方案中具有任选取代的脂族或芳族侧链)；B1由一个或多个氨基酸残基组成(在一个实施方案中为一个、两个或三个)，任选地包含N-末端保护基团，或如WO 09/118375和WO 98/13459中所述，或蛋白质类型的蛋白酶抑制剂，例如RASI、BASI、WASI(水稻、大麦和小麦的双功能α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI。在一些实施方案中，本发明组合物中包含的酶通过在成品组合物中存在水溶性锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子被稳定化，将这些离子以及下述其他金属离子提供给酶，例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))。
在一个实施方案中，含组分(a)和(b)和任选的(c)的组合物包含pH调节化合物，当加入到液体组合物中时，其提供高于5、高于6或高于7的pH。优选地，当加入到液体组合物中时，pH调节化合物提供高于7.5、高于8、高于8.5、高于9、高于9.5、高于10、高于10.5、高于11或高于11.5的pH。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含pH调节化合物、其使液体组合物的pH在5至11.5的范围内、在6至11.5的范围内、在7至11的范围内、或在8至11的范围内。
合适的pH调节化合物可以是氢氧化钠、氢氧化钾或碱性缓冲盐。合适的缓冲盐可以是碳酸氢钾、碳酸钾、焦磷酸四钾、三聚磷酸钾、碳酸氢钠和碳酸钠。合适的也可以是pH调节化合物的混合物，其满足调节适当pH的目的。
在一个实施方案中，含组分(a)和(b)和任选的(c)的组合物包含一种或多种防腐剂。通常将防腐剂加入液体组合物中以防止由于微生物的侵袭导致所述组合物的改变。合适的防腐剂的非限制性实例包括(季铵)铵化合物、异噻唑啉酮、有机酸和甲醛释放剂。合适的(季铵)化合物的非限制性实例包括苯扎氯铵、聚六亚甲基双胍(PHMB)、二癸基二甲基氯化铵(DDAC)和N-(3-氨基丙基)-N-十二烷基丙烷-1，3-二胺(二胺)。合适的异噻唑啉酮的非限制性实例包括1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(MIT)、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(CIT)、2-辛基-2H-异噻唑-3-酮(OIT)和2-丁基-苯并[d]异噻唑-3-酮(BBIT)。合适的有机酸的非限制性实例包括苯甲酸、山梨酸、L-(+)-乳酸、甲酸和水杨酸。合适的甲醛释放剂的非限制性实例包括N，N′-亚甲基双吗啉(MBM)、2，2′，2”-(六氢-1，3，5-三嗪-1，3，5-三基)三乙醇(HHT)、(亚乙二氧基)二甲醇、α，α’，α”-三甲基-1，3，5-三嗪-1，3，5(2H，4H，6H)-三乙醇(HPT)、3，3′-亚甲基双[5-甲基噁唑烷](MBO)和顺-1-(3-氯烯丙基)-3，5，7-三氮杂-1-氮杂金刚烷基氯(CTAC)。
其它有用的防腐剂包括碘代丙炔基丁基氨基甲酸酯(IPBC)，释放卤素的化合物如二氯-二甲基-乙内酰脲(DCDMH)、溴-氯-二甲基-乙内酰脲(BCDMH)和二溴-二甲基-乙内酰脲(DBDMH)；溴硝基化合物如溴硝丙二醇(2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇)、2，2-二溴-2-氰基乙酰胺(DBNPA)；戊二醛等醛类；苯氧乙醇；联苯-2-醇；和吡啶硫酮锌或钠。
本发明组合物中防腐剂的量取决于所用的实际防腐剂或防腐剂混合物。本发明的组合物可包含相对于组合物总重量为0.0005％至2％的量的防腐剂。
本发明还涉及制备组合物的方法，该方法包括以非特定顺序在一个或多个步骤中混合
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其它二醇，和
任选地，组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选的一种或多种其他酶。
在一个实施方案中，制备的组合物在20℃和101.3kPa下是液体。液体组合物的潜在残留浓度差可以用水填充。残留间隙意指到液体组合物100％的重新加量体积。
用于制备本发明组合物的组分(a)、(b)和任选的(c)是如上所述的那些。本发明的组合物可用作进一步的组合物制备、例如洗涤剂组合物制备的贮备液。
一方面，本发明涉及使用戊烷-1，2-二醇来稳定酶的方法。本发明还涉及戊烷-1，2-二醇用于稳定酶的用途。
本发明涉及戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其它二醇[如上所述的组分(b)]、在至少一种含硼化合物存在下[即如上所述的组分(a)]、在包含至少一种丝氨酸蛋白酶和任选的一种或多种其他酶的组合物中[即如上所述的组分(c)]用于稳定包含在组分(c)中的丝氨酸蛋白酶的使用方法和用途。此外，本发明涉及在包含组分(c)的组合物中，组分(b)在组分(a)存在下用于改善组分(c)中包含的丝氨酸蛋白酶稳定化的使用方法和用途。
此外，本发明涉及稳定丝氨酸蛋白酶的方法，优选组合物中的枯草蛋白酶，其中戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其他二醇[即如上所述的组分(b)是一种，和至少一种含硼化合物[即如上所述的组分(a)]是组合物的另一组分。在一个实施方案中，该方法是改善丝氨酸蛋白酶的蛋白酶稳定性的方法。
在这种背景下蛋白酶稳定性的改善可意指在戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其他二醇(即如上所述的组分(b))存在下，和至少一种含硼化合物(即即如上所述的组分(a))当与包含含硼化合物但不合戊烷-1，2-二醇的组合物中所述蛋白酶的稳定性相比时，蛋白酶稳定性得到改善。
在本发明的一个方面，将至少包含组分(a)和(b)和(c)的组合物转化为无水形式，例如，通过冷冻干燥或喷雾干燥，例如在无机载体材料存在下形成聚集体。至少包含组分(a)和(b)和(c)的组合物可以引入制粒工艺，例如造粒、挤出-滚圆、高剪切制粒和喷雾包衣，如本领域技术人员已知的技术。
在一个方面，本发明涉及至少包含以下组分的微囊
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其它二醇，和
组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选的一种或多种其他酶
其中组分(a)和(b)和(c)包封在壳(即微囊)中。
微囊基本上是球形物体，其由核心和围绕核心的壁材料组成。微囊内的材料被称为核心、核心组合物、内相或填充物，而膜有时被称作壳、衣层或壁。根据本发明，液体核心被固体壁材料包围。对于许多应用，壁由聚合物材料形成。
本文中，至少包含组分(a)和(b)和(c)的组合物可以是微囊的“核心组合物”的一部分。在一个实施方案中，包含组分(a)和(b)和(c)的组合物是微囊的“核心组合物”。在一个实施方案中，核心组合物在20℃和101.3kPa下是液体。组分(a)、(b)和(c)是如上所述的那些。
本发明的微囊具有0.5μm至至多1000μm的平均直径。优选地，微囊的平均直径在1μm至500μm的范围内，在10μm至500μm的范围内，在50μm至500μm的范围内，或在50μm至200μm的范围内。胶囊的直径可取决于周围化学环境的水活度变化。
已知许多壳材料用于制造微囊壁。壳可以由天然、半合成或合成材料组成。天然壳材料是例如，阿拉伯树胶、琼脂、琼脂糖、麦芽糖糊精、海藻酸或其盐，例如、海藻酸钠或海藻酸钙、脂肪和脂肪酸、鲸蜡醇、胶原蛋白、壳聚糖、卵磷脂、明胶、白蛋白、虫胶、多糖，如淀粉或葡聚糖、多肽、蛋白质水解产物、蔗糖和蜡。半合成壳材料尤其是化学修饰的纤维素，特别是纤维素酯和纤维素醚，例如乙酸纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素、以及淀粉衍生物，特别是淀粉醚和淀粉酯。合成壳材料的非限制性实例包括聚合物，例如聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、三聚氰胺甲醛、聚氨酯或聚脲。
根据壳材料的类型和生产方法，在每种情况下形成具有不同性质，例如直径、粒度分布、壁厚和物理和/或化学性质的微囊。微囊化的目的一方面是核心组合物与其周围的隔离，另一方面是核心组合物在使用时的释放(壁必须及时破裂)。可以通过熔化壁或在特定条件下溶解它来释放胶囊内容物。在其他系统中，壁被溶剂作用、酶侵蚀、化学反应、水解或缓慢崩解破坏。最突出的是，洗涤剂配方中适用性的限制因素是当洗涤剂组合物在水中稀释时核心组合物的快速释放，但确保在洗涤剂组合物中贮存期间核心组合物不释放。
本领域技术人员熟悉物理化学和化学微囊化技术，例如离子凝胶化、凝聚-相分离、界面缩聚、界面交联、原位聚合和基质聚合。例如，微囊可以通过基于乳液的体外微囊化技术形成。已知两种主要方法用于基于乳液的体外微囊化：水包油和油包水微囊化。水包油微囊通常用于包封非极性活性成分。油包水微囊化用于包封极性(即水溶性)活性物质如酶。
油包水微囊化可包括以下步骤：
·初始水相和油相的制备，
·形成油包水乳液，
·通过在水相和油相界面聚合单体或预聚物形成膜(界面缩聚)，
·可选的后修饰，
·可选的隔离和/或配方，
·添加到包含一种或多种组分(d)的洗涤剂组合物中。
该过程可以是整批处理过程，也可以是连续或半连续过程。
除了油包水和水包油系统之外，水包水(含水双相)系统是已知的。水包水体系可以通过在含有水溶性聚合物的水性体系中通过例如加入盐引发相分离而得到，得到含有水溶性聚合物的一种水相和含有溶解盐的另一种水相。
在一个实施方案中，微囊的核心组合物另外包含至少一种如上公开的pH调节化合物，其提供如上所述的pH。
在一个实施方案中，微囊的核心组合物另外包含一种或多种如上公开的防腐剂。
一方面，本发明涉及包含如上所述的组分(a)和(b)和(c)的洗涤剂组合物，和至少一种洗涤剂组分(d)。“洗涤剂组合物”或“清洁组合物”是指用于清洁污染物质的组合物。清洁包括洗涤和硬表面清洁。根据本发明的污染材料包括纺织品和/或硬表面。
术语“洗涤”涉及家庭洗涤和工业洗涤，并且是指用含有本发明洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的方法。洗涤过程可以通过使用诸如家用或工业洗衣机的技术设备来进行。或者，洗涤过程可以手工完成。
术语“纺织品”是指任何纺织材料，包括纱线(由用于针织或编织的天然或合成纤维制成的线)、纱线中间体、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料、以及由这些材料制成织物(通过编织，针织或毡合纤维制成的纺织品)，例如服装(任何由纺织品制成的衣服)、布和其他物品。
术语“纤维”包括天然纤维、合成纤维及其混合物。天然纤维的实例是植物(例如亚麻，黄麻和棉花)或动物来源，包括蛋白质如胶原蛋白、角蛋白和丝心蛋白(例如丝、羊毛、安哥拉羊毛、马海毛、羊绒)。合成来源的纤维的实例是聚氨酯纤维，例如或聚酯纤维、聚烯烃，例如弹性纤维、或聚酰胺纤维，例如尼龙。纤维可以是单纤维或纺织品的一部分，例如针织物、机织织物或非织造织物。
术语“硬表面清洁”在本文中定义为清洁硬表面，其中硬表面可包括家庭中的任何硬表面，例如地板、家具、墙壁、卫生陶瓷、玻璃、金属表面、包括餐具或碗碟。
术语“洗碗”是指所有形式的洗涤餐具，例如用手或自动洗碗洗涤餐具。洗碗包括但不限于清洁所有形式的餐具，如盘子、杯子、玻璃杯、碗，各种形式的餐具，如勺子、刀子、叉子和餐具，以及陶瓷、塑料，如三聚氰胺、金属、瓷器、玻璃和丙烯酸树脂。
本发明的洗涤剂组合物包含一种或多种洗涤剂组分。取决于所需的应用，洗涤剂组合物中洗涤剂组分的类型和/或量不同。所选择的组分取决于所需的清洁应用和/或洗涤剂组合物的物理形式。
术语“洗涤剂组分”在本文中定义为适用于洗涤剂组合物的成分类型，例如表面活性剂、助洗剂、聚合物、漂白体系。本领域已知的任何承认其已知特征的组分是根据本发明的合适的洗涤剂组分(d)。
洗涤剂组分在洗涤剂组合物的最终应用中可具有一种以上的功能，因此在本文特定功能的背景中提及的任何洗涤剂组分在洗涤剂组合物的最终应用中也可具有另一种功能。在洗涤剂组合物的最终应用中，特定洗涤剂组分的功能通常取决于其在洗涤剂组合物中的量，即洗涤剂组分的有效量。
在本文中术语“洗涤剂组分的有效量”包括(a)洗涤剂组分有效去除待清洁物体上的污渍的能力[即洗涤剂组分本身的清洁性能]和/或(b)洗涤剂组分对洗涤剂组合物清洁有效性的贡献[即洗涤剂组合物的清洁性能]。优选地，本发明的洗涤剂组合物包含有效量的一种或多种洗涤剂组分。
在相关清洁条件下评估清洁性能。这里的术语“相关清洁条件”是指洗衣机、自动洗碗机或手动清洁过程中实际使用的条件，特别是清洁温度、时间、清洁机理、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
对于各个洗涤剂组分列举的数值范围提供了洗涤剂组合物中包含的量。必须将这样的范围理解为包括限定范围的数字并且包括在限定范围内的每个整数。
如果没有另外描述，“重量％”或“％w/w”意指与总洗涤剂组合物有关。在这种情况下，“重量％”或“％w/w，，计算如下：物质的浓度作为该物质的重量除以组合物的总重量，乘以100。
如本文所用术语“约”是指例如通过在现实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的典型测量和液体处理程序可能发生的数量变化。通过这些程序中的无意错误；通过用于制备组合物或实施方法的成分的制造、来源或纯度的差异；等等。无论是否由术语“约”修饰，权利要求包括数量的等价物，并且指的是可能发生的数字量的变化。
本发明的洗涤剂组合物可包含本发明的组合物，其至少包含如上所述的组分(a)、(b)和(c)，其中组分(c)的量决定组分(a)和(b)的有效量。
包含在洗涤剂组合物中的酶的量(即如上所说的组分(c))通常在0.01g/L至20g/L的范围内。特别地，洗涤剂组合物中组分(c)的量在0.1g/L至10g/L的范围内。所提供的值优选与洗涤剂组合物中蛋白质的总量有关。
本发明的洗涤剂组合物优选包含有效量的含硼化合物(即如上所述的组分(a))的量相对于洗涤剂组合物的总重量为0.001％-10％(重量)。有效量的含硼化合物可指有效抑制组分(c)中包含的至少一种酶的量。
由于组分(a)的量取决于抑制蛋白水解酶的有效性，在本发明的一个具体实施方案中，4-FPBA以有效量使用，其可以在相对于洗涤剂组合物的总重量0.005％至0.08％重量，或0.01％至0.05％重量的范围内。在本发明的另一个实施方案中，苯硼酸的用量相对于洗涤剂组合物的总重量为0.05％-1％(重量)。在本发明的另一个实施方案中，4-(羟甲基)苯基硼酸的用量相对于洗涤剂组合物的总重量为0.05％-1％(重量)。在本发明的另一个实施方案中，对甲苯基硼酸的用量相对于洗涤剂组合物的总重量为0.05％-1％(重量)。在本发明的另一个实施方案中，硼酸的用量相对于洗涤剂组合物的总重量为0.5％-5％(重量)。
本发明的洗涤剂组合物优选包含有效量的戊烷-1，2-二醇(即如上所述的组分(b))，是指有效抑制组分(c)中包含的至少一种酶的量。相对于洗涤剂组合物的总重量，本发明洗涤剂组合物中组分(b)的量优选为2％-50％(重量)。在洗涤剂组合物的一个具体实施方案中，组分(b)的量相对于洗涤剂组合物总重量为3％-20％(重量)，或更特别是4％-15％(重量)。
本发明组合物的组分(b)优选包含至少10％重量的戊烷-1，2-二醇，更优选至少20％重量的戊烷-1，2-二醇，甚至更优选至少35％重量的戊烷-1，2-二醇，或具体地至少50％重量的戊烷-1，2-二醇，以上全部为相对于组分(b)的总重。
包含如上所述的组分(a)和(b)和(c)的本发明的洗涤剂组合物，和至少一种如下所述的洗涤剂组分(d)，可以通过提高组分(c)的稳定性来表征。当与缺乏有效量的组分(a)和(b)的洗涤剂组合物相比时，所述洗涤剂组合物的特征可在于组分(c)的稳定性增加。
本发明的洗涤剂组合物中包含的蛋白酶、优选丝氨酸蛋白酶的蛋白水解活性随时间(例如在贮存期间)的潜在变化可如上文所公开的那样确定：组分(a)和/或(b)释放后的蛋白水解活性除以初始蛋白水解活性乘以100得到最终应用中可获得的蛋白水解活性(x％)，其中在洗涤剂组合物的背景下应用，最终应用包括去除蛋白酶敏感性污渍的能力。当蛋白酶在最终应用中可获得的蛋白水解活性等于100％时，根据本发明蛋白酶、优选丝氨酸蛋白酶被稳定化。在一个实施方案中，应用中可获得的蛋白水解活性为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。
如上所公开的，从100％减去x％得到贮存期间蛋白水解活性的损失。在洗涤剂组合物的背景下，蛋白酶，优选丝氨酸蛋白酶可以根据本发明进行稳定化，这时在洗涤剂组合物的贮存期间基本上没有发生蛋白水解活性的损失，即蛋白水解活性的损失等于0％。在一个实施方案中，基本上没有蛋白水解活性的损失意指蛋白水解活性的损失小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
包含在本发明的洗涤剂组合物中的除丝氨酸蛋白酶之外的酶的活性随时间的潜在变化可如上所述确定：贮存后的酶活性除以初始酶活性乘以100得到除丝氨酸蛋白酶之外的酶的“保持的酶活性”(z％)，其可在洗涤剂组合物的最终应用中获得。优选地，根据本发明除丝氨酸蛋白酶之外的这种酶被稳定化，这时其保持的酶活性等于100％。在一个实施方案中，保持的酶活性等于至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。
从100％减去z％给出“除丝氨酸蛋白酶之外的酶的活性的丧失”。在洗涤剂组合物的背景下，根据本发明可以使除丝氨酸蛋白酶之外的酶稳定化，此时基本上不发生丝氨酸蛋白酶以外的酶的活性损失，即丝氨酸以外的酶的活性的丧失等于0％。在一个实施方案中，除丝氨酸蛋白酶之外的酶的活性基本上没有损失意指所述酶活性的损失小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
本发明的洗涤剂组合物包含如上公开的组分(a)、(b)和(c)，并且可包含一种或多种洗涤剂组分以形成洗涤剂组合物，例如下面举例说明的：
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物总重量的0％至约40％、约0.2％至约30％、约0.5％至约25％、约1％至约15％、约3％至约5％，或者约8％至约12％重量的非离子表面活性剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量为约0.05％至约10％、约0.1％至约8％、或约0.5％至约5％重量的两性表面活性剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的约1％至约50％、约3％至约40％、约5％至约30％、或约10％至约25％重量的阴离子表面活性剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量为约0.05％至约15％、约0.1％至约10％、或约0.5％至约8％重量的阳离子表面活性剂。
固体洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量为0％至约60％、约1％至约50％、或至多约20％重量的助洗剂。
液体洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的0％至约20％、约1％至约15％、约5％至约10％、或者在约5％至约8％重量的范围内的助洗剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含pH调节化合物，其在本文中可被称为碱，含量相对于洗涤剂组合物总重量的0％至25％范围内、2％至20％重量的范围内，或5％至15％重量的范围内。
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的0％至10％、0.1％至5％，或1％至3％重量的抑泡剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含总量的抗再沉积剂，其在本文中可称为抗灰化剂，用量均相对于洗涤剂组合物的总重量的0％至10％的范围内，或在0.1％至1％重量的范围内。
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量0％至2％范围、或0.05％至0.5％重量的染料转移抑制剂。
本发明的洗涤剂组合物，优选固体洗涤剂组合物，可包含约0.01％至约10％重量、或约0.3％至约10％重量范围的氯漂白剂，所有百分数均相对于洗涤剂组合物的总重量。
本发明的洗涤剂组合物，优选固体洗涤剂组合物，可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的0.5％至30％、1％至20％、或者1％至20％、2％至15％重量范围内的过氧化物。在一个实施方案中，包含在洗涤剂组合物中的过氧化物相对于洗涤剂组合物的总重量为低于5重量％。
本发明的洗涤剂组合物，优选固体洗涤剂组合物，可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的0.01％至10％、0.01％至5％或0.01％至2％重量范围的光漂白剂总量。
本发明的洗涤剂组合物，优选固体洗涤剂组合物，可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的0.5％至10％、0.5％至8％或1％至8％重量范围内的漂白活化剂总量。
本发明的洗涤剂组合物，优选固体洗涤剂组合物，可包含相对于洗涤剂组合物的总重量0.005％至2％、0.01％至2％或0.01％至1％重量范围内的漂白催化剂总量。
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的0.001％至5％、0.01％至2％、或0.05％至1％重量范围内的荧光增白总量。
本发明的洗涤剂组合物，优选液体洗涤剂组合物，可包含相对于组合物的总重量的0.0005％至2％范围内的防腐剂。本发明组合物中防腐剂的量取决于所用的实际防腐剂或防腐剂混合物。
本发明的洗涤剂组合物，优选液体洗涤剂组合物，可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的约0.005％至约5％、约0.01％至约5％、约0.01％至约1％、约0.05％至约0.8％、约0.1％至约0.6％、或在约0.3％至约0.5％重量范围内的增稠剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总量0％至10％的水溶助长剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含相对于洗涤剂组合物的总重量的0％至15％、或0.1％至10％、或0.1％至5％、或0.1％至1.5％重量的腐蚀抑制剂。
指定用于自动洗碗(ADW)的洗涤剂组合物可以没有表面活性剂。在本发明的上下文中，不合表面活性剂应表示相对于洗涤剂组合物的总重量，表面活性剂的总含量为0.1％或更少。这些组合物也可以不含有机聚合物，如聚丙烯酸酯、聚乙烯亚胺和聚乙烯吡咯烷酮(分子量(Mw)为1,000克或更高)。在本发明的上下文中，不含有机聚合物应意指有机聚合物的总含量相对于洗涤剂组合物的总重量为0.1％或更少。ADW洗涤剂组合物可以不含主要量的单羧酸和二羧酸例如乙酸、丙酸、马来酸、丙烯酸、己二酸、琥珀酸等的的碱金属盐。在该上下文中的主要量是指相对于洗涤剂组合物的总重量超过0.5重量％的量。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种表面活性剂。“表面活性剂”(Surfactant)(在本文中与“表面活性剂”(surface active agent)同义使用，是指当加入液体中时改变界面处液体性质的有机化学品。根据其离子电荷，表面活性剂被称为非离子、阴离子、阳离子或两性。
表面活性剂的非限制性实例公开于McCutcheon的2016 Detergents and Emulsi-fiers，和McCutcheon的2016 Functional Materials，North American andInternational Edi-tion，MC Publishing Co，2016版。在本领域技术人员已知的相同出版物的早期版本中公开了其他有用的实例。
非离子表面活性剂是指既不含正电荷也不带负电(即离子)官能团的表面活性剂。与阴离子和阳离子表面活性剂相反，非离子表面活性剂不会在溶液中电离。
以下提供的任何类型的表面活性剂的实例应理解为非限制性的。
非离子表面活性剂可以是通式(Ia)和(Ib)的化合物：
通式(Ia)和(Ib)的变量定义如下：
R1选自C1-C23烷基和C2-C23链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的；实例为：n-C7H15、n-C9H19、n-C11H23、n-C13H27、n-C15H31、n-C17H35、i-C9H19、i-C12H25。
R2选自H、C1-C20烷基和C2-C20链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
R3和R4各自独立地选自C1-C16烷基，其中烷基是直链或支链的；实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1，2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基。
R5选自H和C1-C18烷基，其中烷基是直链或支链的。
通式(Ia)和(Ib)的整数定义如下：
m在0至200的范围内，优选1-80、更优选3至20；n和o，各自独立地在0到100的范围内；n优选为1至10、更优选为1至6；o优选在1至50的范围内，更优选在4至25的范围内。m、n和o的总和至少为1，优选m、n和o的总和在5至100的范围内，更优选在9到50之间。
通式(I)的非离子表面活性剂可以是任何结构，是嵌段或无规结构，并且不限于所示的式(I)的顺序。
非离子表面活性剂还可以是通式(II)的化合物，其可以称为烷基多糖苷(APG)：
通式(II)的变量定义如下：
R1选自C1-C17烷基和C2-C17链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的；实例为：n-C7H15、n-C9H19、n-C11H23、n-C13H27、n-C15H31、n-C17H35、i-C9H19、i-C12H25。
R2选自H、C1-C17烷基和C2-C17链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
G1选自具有4至6个碳原子的单糖，例如葡萄糖和木糖。
通式(II)的整数w为1.1至4，w为平均数。
非离子表面活性剂还可以是通式(III)的化合物：
通式(III)的变量定义如下：
AO选自环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)、环氧丁烷(BO)及其混合物。
R6选自C5-C17烷基和C5-C17链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
R7选自H、C1-C18-烷基，其中烷基是直链或支链的。
通式(III)的整数y是1至70、优选7至15的数。
非离子表面活性剂可进一步选自脱水山梨糖醇酯和/或乙氧基化或丙氧基化脱水山梨糖醇酯。非限制性实例是以商品名SPAN和TWEEN销售的产品。
非离子表面活性剂可进一步选自烷氧基化的单或二烷基胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAMA)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺、GA或脂肪酸葡糖酰胺，FAGA)，及其组合。
两种或多种不同的非离子表面活性剂的混合物也可以存在于本发明的洗涤剂组合物中。
两性表面活性剂是哪些取决于pH，可以是阳离子的、两性离子的或阴离子的。
表面活性剂可以是包含通式(IV)的两性结构的化合物，其可以被称为修饰的氨基酸(蛋白原性以及非蛋白原性)：
通式(IV)中的变量定义如下：
R8选自H、C1-C4烷基、C2-C4-链烯基，其中烷基和/或是直链或支链的。
R9选自C1-C22-烷基、C2-C22-链烯基、C10-C22烷基羰基和C10-C22链烯基羰基。
R10选自H、甲基、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)OH、-(CH2)2C(O)NH2、-(CH2)2C(O)OH、(咪唑-4-基)-甲基、-CH(CH3)C2H5、-CH2CH(CH3)2、-(CH2)4NH2、苄基、羟基甲基、-CH(OH)CH3、(吲哚-3-基)-甲基、(4-羟基-苯基)-甲基、异丙基、-(CH2)2SCH3，和-CH2SH。
Rx选自H和C1-C4-烷基。
表面活性剂还可以是包含通式(Va)、(Vb)或(Vc)的两性结构的化合物，其可以被称为甜菜碱和/或磺基甜菜碱：
通式(Va)、(Vb)和(Vc)中的变量定义如下：
R11选自直链或支链的C7-C22烷基和直链或支链的C7-C22链烯基。
R12各自独立地选自直链C1-C4烷基。
R13选自C1-C5烷基和羟基C1-C5烷基；例如2-羟丙基。
A-选自羧酸盐和磺酸盐。
通式(Va)，(Vb)和(Vc)中的整数r在2至6的范围内。
表面活性剂还可以是包含通式(VI)的两性结构的化合物，其可以被称为烷基-两性羧酸盐：
通式(VI)中的变量定义如下：
R11选自C7-C22烷基和C7-C22链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的，优选是直链的。
R14选自-CH2C(O)O-M+、-CH2CH2C(O)O-M+和-CH2CH(OH)CH2SO3 -M+。
R15选自H和-CH2C(O)O-。
通式(VI)中的整数r在2至6的范围内。
其它合适的烷基-两性羧酸盐的非限制性实例包括椰油酰基两性乙酸钠、月桂酰基两性乙酸钠、辛酰基两性乙酸钠、椰油酰基两性二乙酸二钠、月桂酰基两性二乙酸二钠、辛基两性二乙酸二钠、辛酰基两性二乙酸二钠、椰油酰基两性二丙酸二钠、月桂酰基两性二丙酸二钠、辛基两性二丙酸二钠和辛酰基两性二丙酸二钠。
表面活性剂还可以是包含通式(VII)的两性结构的化合物，其可以称为氧化胺(AO)：
通式(VII)中的变量定义如下：
R16选自C8-C18直链或支链烷基、羟基C8-C18烷基、酰基酰氨基丙基(acylamidopropoyl)和C8-C18烷基苯基基团；其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
R17选自C2-C3亚烷基、羟基C2-C3亚烷基及其混合物。
R18：每个残基可独立地选自C1-C3烷基和羟基C1-C3；R15基团可彼此相连，例如通过氧或氮原子形成环结构。
通式(VII)中的整数x为0至5，优选0至3，最优选0。
其他合适的氧化胺的非限制性实例包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C18烷氧基乙基二羟基乙基氧化胺。这种材料的实例包括二甲基辛基氧化胺、二乙基癸基氧化胺、双-(2-羟乙基)十二烷基氧化胺、二甲基十二烷基氧化胺、二丙基十四烷基氧化胺、甲基乙基十六烷基氧化胺、十二烷基酰胺丙基二甲基氧化胺、十六烷基二甲基氧化胺、硬脂基二甲基氧化胺、动物脂二甲基氧化胺和二甲基-2-羟基十八烷基氧化胺。
另一个合适的氧化胺实例是椰油酰胺基丙基二甲基氨基氧化物，有时也称为椰油酰胺丙基胺氧化物。
两种或多种不同的两性表面活性剂的混合物可存在于本发明的洗涤剂组合物中。
阴离子表面活性剂是指具有带负电荷的离子基团的表面活性剂。阴离子表面活性剂包括但不限于含有疏水基团和至少一种水溶性阴离子基团的表面活性化合物，通常选自硫酸盐，磺酸盐和羧酸盐以形成水溶性化合物。
阴离子表面活性剂可以是通式(VIII)的化合物，当A-是SO3-时，它可以被称为(脂肪族)醇/烷基(乙氧基/醚)硫酸盐[(f)A(e)S]。当A-是-RCOO-时，(脂肪)醇/烷基(乙氧基/醚)羧酸酯[(F)A(E)C]：
通式(VIIIa和VIIIb)中的变量定义如下：
R1选自C1-C23-烷基(诸如1-、2-、3-、4-C1-C23-烷基)和C2-C23-链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的，并且其中2-、3-或4-烷基；实例为n-C7H15、n-C9H19、n-C11H23、n-C13H27、n-C15H31、n-C17H35、i-C9H19、i-C12H25。
R2选自H、C1-C20-烷基和C2-C20-链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
R3和R4彼此独立地选自C1-C16-烷基，其中烷基是直链或支链的，实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1，2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基。
A-选自-RCOO-、-SO3 -和RSO3 -，其中R选自直链或支链C1-C8-烷基和C1-C4羟基烷基，其中烷基是。
M+选自H和盐形成阳离子。形成盐的阳离子可以是单价的或多价的；因此M+等于1/vMv+。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和单、二和三乙醇胺的铵盐。
通式(VIIIa)和(VIIIb)的整数定义如下：
m在0至200的范围内，优选1-80、更优选3至20；n和o，各自独立地在0到100的范围内；n优选为1至10，更优选为1至6；o优选在1至50的范围内，更优选在4至25的范围内。m、n和o的总和至少为1，优选m、n和o的总和在5至100的范围内，更优选在9到50之间。
通式(VIII)的阴离子表面活性剂可以是任何结构，嵌段共聚物或无规共聚物。
此外适宜的阴离子表面活性剂包括C12-C18磺基脂肪酸烷基酯的盐(M+)诸如C12-C18磺基脂肪酸甲酯)、芳基磺酸(诸如n-C10-C18-烷基苯磺酸)C10-C18-烷基酯和烷氧基甲酸C10-C18烷基酯。
在所有情况下M+选自盐形成阳离子。形成盐的阳离子可以是单价的或多价的；因此M+等于1/v Mv+。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和单、二和三乙醇胺的铵盐。
其它合适的阴离子表面活性剂的非限制性实例包括支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷烃-2，3-二基双(硫酸盐)、羟烷基磺酸盐和二磺酸盐、仲烷磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、磺化脂肪酸甘油酯、烷基-或链烯基琥珀酸、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸的二酯和单酯。
阴离子表面活性剂可以是通式(IX)的化合物，其可被称为N-酰基氨基酸表面活性剂：
通式(IX)中的变量定义如下：
R19选自直链或支链的C6-C22-烷基和直链或支链的C6-C22-链烯基诸如油烯基。
R20选自H和C1-C4-烷基。
R21选自H、甲基、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)OH、-(CH2)2C(O)NH2、-(CH2)2C(O)OH、(咪唑-4-基)-甲基、-CH(CH3)C2H5、-CH2CH(CH3)2、-(CH2)4NH2、苄基、羟基甲基、-CH(OH)CH3、(吲哚-3-基)-甲基、(4-羟基-苯基)-甲基、异丙基、-(CH2)2SCH3、和-CH2SH。
R22选自-COOX和-CH2SO3X，其中X选自Li+、Na+和K+。
合适的N-酰基氨基酸表面活性剂的非限制性实例是N-酰化谷氨酸的单和二羧酸盐(例如，单、二和三乙醇胺的钠、钾、铵和铵盐)，例如，椰油酰谷氨酸钠、月桂酰谷氨酸钠、肉豆蔻酰谷氨酸钠、棕榈酰谷氨酸钠、硬脂酰谷氨酸钠、椰油酰基谷氨酸二钠、硬脂酰谷氨酸二钠、椰油酰谷氨酸钾、月桂酰谷氨酸钾和肉豆蔻酰谷氨酸钾；N-酰化丙氨酸的羧酸盐(例如、单、二和三乙醇胺的钠盐、钾盐、铵盐和铵盐)，例如椰油酰基丙氨酸钠和三乙醇胺月桂酰丙氨酸盐；N-酰化甘氨酸的羧酸盐(例如，单、二和三乙醇胺的钠盐、钾盐、铵盐和铵盐)、例如椰油酰基甘氨酸钠和椰油酰基甘氨酸钾；N-酰化肌氨酸的羧酸盐(例如，单、二和三乙醇胺的钠、钾、铵和铵盐)、例如月桂酰肌氨酸钠、椰油酰基肌氨酸钠、肉豆蔻酰肌氨酸钠、油酰肌氨酸钠和月桂酰肌氨酸铵盐。
阴离子表面活性剂可进一步选自皂类。合适的是饱和和不饱和C12-C18脂肪酸的盐(M+)，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、油酸、(水合的)芥酸。M+选自成盐阳离子。形成盐的阳离子可以是单价的或多价的；因此M+等于1/v Mv+。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和单、二和三乙醇胺的铵盐。
其他合适的肥皂的非限制性实例包括衍生自天然脂肪酸的皂混合物，例如牛油、椰子油、棕榈仁油、月桂油、橄榄油或介花油。这种皂混合物包含不同量的月桂酸和/或肉豆蔻酸和/或棕榈酸和/或硬脂酸和/或油酸和/或亚油酸的皂，具体取决于皂来源的天然脂肪酸。
合适的阴离子表面活性剂的其它非限制性实例包括衍生自天然脂肪酸的硫酸盐、磺酸盐或羧酸盐(M+)，例如牛油、椰子油、棕榈仁油、月桂油、橄榄油或菜籽油。这种阴离子表面活性剂包括月桂酸和/或肉豆蔻酸和/或棕榈酸和/或硬脂酸和/或油酸和/或亚油酸的不同量的硫酸盐、磺酸盐或羧酸盐，具体取决于天然脂肪酸，肥皂是从天然脂肪酸得到的。
两种或多种不同阴离子表面活性剂的混合物也可存在于本发明的洗涤剂组合物中。
非离子和/或两性和/或阴离子表面活性剂的混合物也可存在于本发明的洗涤剂组合物中。
阳离子表面活性剂是指具有带正电荷的离子基团的表面活性剂。
通常，这些阳离子部分是含氮基团，例如季铵或质子化氨基。阳离子质子化胺可以是伯胺、仲胺或叔胺。
阳离子表面活性剂可以是通式(X)的化合物，其可被称为季铵化合物(季铵化合物)：
通式(X)中的变量定义如下：
R23选自H、C1-C4烷基(例如甲基)和C2-C4链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
R24选自C1-C4烷基(例如甲基)、C2-C4链烯基和C1-C4羟基烷基(例如羟基乙基)，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
R25选自C1-C22烷基(例如甲基、C18烷基)、C2-C4链烯基、C12-C22基羰基氧基甲基和C12-C22烷基羰基氧基乙基(例如C16-C18烷基羰基氧基乙基)，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
R26选自C12-C18烷基、C2-C4链烯基、C12-C22烷基羰基氧基甲基、C12-C22烷基羰基氧基乙基和3-(C12-C22烷基羰基氧基)-2(C12-C22烷基羰基氧基)-丙基。
X-选自卤素离子，例如Cl-或Br-。
其它阳离子表面活性剂的非限制性实例包括胺，例如伯、仲和叔单胺，具有C18烷基或链烯基链、乙氧基烷基胺、烷氧基乙二胺、咪唑(如1-(2-羟基乙基)-2-咪唑啉、2-烷基-1-(2-羟基乙基)-2-咪唑啉等)、季铵盐类似烷基季铵氯化物表面活性剂如n-烷基(C12-C18)二甲基苄基氯化铵、正十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物和萘基取代的季铵氯化物，如二甲基-1-萘基甲基氯化铵。
特别合适的阳离子表面活性剂可以是：
-N，N-二甲基-N-(羟基-C7-C25-烷基)铵盐；
-用烷基化试剂季铵化的单和二(C7-C25-烷基)二甲基铵化合物；
-酯季铵化合物，特别是用C8-C22-羧酸酯化的季酯化单、二和三链烷醇胺；
-咪唑啉季铵盐，特别是式XI或XII的1-烷基咪唑啉盐
公式(XI)和(XII)中的变量定义如下：
R27选自C1-C25-烷基和C2-C25-链烯基；
R28选自C1-C4-烷基和羟基-C1-C4-烷基；
R29选自C1-C4-烷基、羟基-C1-C4-烷基和R＊-(CO)-R30-(CH2)j-基团，其中R＊选自C1-C21-烷基和C2-C21-链烯基；R30选自-O-和-NH-；j是2或3。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种选自络合剂(螯合剂、螯合剂)、沉淀剂和离子交换化合物的化合物，它们可与Ca和Mg形成水溶性络合物。这些化合物在本文中可称为“助洗剂”(builders)或“助洗剂”(building agents)，但并不意味着这些化合物在洗涤剂组合物的最终应用中受限于此功能。
用于本发明洗涤剂组合物中的助洗剂可选自磷酸盐基助洗剂。术语“磷酸盐”包括但不限于偏磷酸钠、正磷酸钠、磷酸氢钠、焦磷酸钠、磷酸三钠、三聚磷酸五钠、偏磷酸六钠和聚磷酸盐如三聚磷酸钠。
优选地，本发明的洗涤剂组合物不含磷酸盐，这意味着基本上不含磷酸盐基助洗剂。本文中，“基本上不含磷酸盐”应理解为意指磷酸盐和聚磷酸盐的总含量为10ppm至1重量％，通过重量分析测定并参考相应的本发明洗涤剂组合物。
根据本发明的非磷酸盐基助洗剂包括葡萄糖酸钠、柠檬酸盐、硅酸盐、碳酸盐、膦酸盐、氨基羧酸盐、聚羧酸盐、聚磺酸盐和聚膦酸盐。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种柠檬酸盐。术语“柠檬酸盐”包括单和二碱金属盐，特别是柠檬酸的单和优选三钠盐，柠檬酸的铵或取代的铵盐以及柠檬酸本身。柠檬酸盐可用作无水化合物或水合物，例如柠檬酸钠二水合物。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种硅酸盐。在本发明的上下文中，“硅酸盐”特别包括二硅酸钠和偏硅酸钠、硅铝酸盐如铝硅酸钠如沸石A(即Na12(AlO2)12(SiO2)12＊27H2O)和片状硅酸盐。特别是式α-Na2Si2O5，β-Na2Si2O5和δ-Na2Si2O5的那些。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种碳酸盐。术语“碳酸盐”包括碱金属碳酸盐和碱金属碳酸氢盐，优选钠盐。特别合适的是碳酸钠(Na2CO3)。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种膦酸盐。“膦酸盐”包括但不限于2-膦基丁烷-1，2，4-三羧酸(PBTC)；亚乙基二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA；1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(HEDP)，CH2C(OH)[PO(OH)2]2；氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、N[CH2PO(OH)2]3；氨基三(亚甲基膦酸酯)，钠盐(ATMP)，N[CH2PO(ONa)2]3；2-羟基乙基亚氨基双(亚甲基)膦酸)，HOCH2CH2N[CH2PO(OH)2]2；二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)，(HO)2POCH2N[CH2CH2N[CH2PO(OH)2]2]2；二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸盐)，钠盐，C9H(28-x)N3NaxO15P5(x＝7)；六亚甲基二胺(四亚甲基膦酸盐)，钾盐，C10H(28-x)N2KxO12P4(x＝6)；和双(六亚甲基)三胺(五亚甲基-膦酸)，(HO2)POCH2N[(CH2)2N[CH2PO(OH)2]2]2。其盐也可以是合适的。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种氨基羧酸盐。合适的“氨基羧酸盐”的非限制性实例包括但不限于：二乙醇甘氨酸(DEG)、二甲基甘氨酸(DMG)、硝基三乙酸(NTA)、N-羟基乙基氨基二乙酸、乙基二胺四乙酸(EDTA)、N-(2羟基乙基)亚氨基二乙酸(HEIDA)、羟基乙二胺三乙酸、N-羟基乙基-乙基二胺三乙酸(HEDTA)、羟基乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-二乙酸(GLDA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羟基亚氨基二琥珀酸、亚乙基二胺二琥珀酸(EDDS)、天冬氨酸-二乙酸和碱金属盐或其铵盐。进一步合适的是天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N、N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、N-(2-磺基甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺基乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺基甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺基乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N，N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N，N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N，N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N，N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N，N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N，N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N，N-二乙酸(TUDA)和磺基甲磺酸基-N，N-二乙酸(SMDA)及其碱金属盐或铵盐。本文中使用的术语“铵盐”是指具有至少一个带有永久或暂时季铵化的氮原子的阳离子的盐。带有至少一个永久季铵化的氮原子的阳离子的实例包括四甲基铵、四乙基铵、二甲基二乙基铵和n-C10-C20-烷基三甲基铵。带有至少一个暂时季铵化的氮原子的阳离子的实例包括质子化胺和氨，如单甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、单乙基铵、二乙基铵、三乙基铵，n-C10-C20-烷基二甲基铵2-羟乙基铵、双(2-羟乙基)铵、三(2-羟乙基)铵、N-甲基2-羟乙基铵、N，N-二甲基-2-羟乙基铵，尤其是NH4 +。
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂组合物包含一种以上的助洗剂。优选地，相对于洗涤剂组合物的总重量，本发明的洗涤剂组合物含有小于0.2重量％的次氮基三乙酸(NTA)，或0.01至0.1重量％的NTA。
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂组合物包含至少一种氨基羧酸盐，其选自甲基甘氨酸二乙酸盐(MGDA)、谷氨酸二乙酸盐(GLDA)及其各自的盐，例如其中的碱(如钠)盐。量为0.1％至25.0％(重量)、1.0％至18.0％(重量)、3.0％至15.0％(重量)、3.0％至10.0％(重量)，或相对于洗涤剂组合物的总重量，其含量为5.0％至8.0％(重量)。合适的MGDA和/或GLDA盐的非限制性实例包括MGDA和GLDA的三碱金属盐，例如三钾盐和三钠盐。
在本发明的一个实施方案中，MGDA的碱金属盐选自通式(XIII)的化合物：
[CH3-CH(COO)-N(CH2-COO)2]Na3-x-yKxHy (XIII)
式(XIII)的变量定义如下：
x选自0.0至0.5，优选至多0.25，
y选自0.0至0.5，优选至多0.25。
在本发明的一个实施方案中，GLDA的碱金属盐选自通式(XIV)的化合物
[OOC-(CH2)2-CH(COO)-N(CH2-COO)2]Na4-x-yKxHy (XIV)
公式(XIV)的变量定义如下：
x选自0.0至0.5，优选至多0.25，
y选自0.0至0.5，优选至多0.25。
在本发明的一个实施方案中，MGDA的碱金属盐可以选自L-对映体的碱金属盐、外消旋混合物的碱金属盐和MGDA的对映体富集的碱金属盐，与D-对映体相比具有过量的L-对映体。优选来自L-对映体和D-对映体的混合物的碱金属盐，其中L/D的摩尔比为55∶45至85∶15。这种混合物与例如外消旋混合物相比具有更低的吸湿性。对映体过量可以例如通过测定偏振(偏振测定)或优选通过色谱法测定，例如通过HPLC用手性柱测定，例如用一种或多种环糊精作为固定相。优选通过HPLC用固定的光学活性铵盐如D-青霉胺测定对映体过量。
GLDA的碱金属盐可以选自L-对映异构体的碱金属盐、外消旋混合物和富含对映异构体的GLDA的碱金属盐，与D-对映异构体相比具有过量的L-对映异构体。优选L-对映体和D-对映体的混合物的碱金属盐，其中L/D的摩尔比为80∶20或更高，优选85∶15至99∶1。这种GLDA的碱金属盐与例如外消旋混合物或纯D-对映体相比具有更好的生物降解性。对映体过量值可以例如通过测量偏振(偏振测定)或优选通过色谱法测定，例如通过HPLC用手性柱测定，例如用一种或多种环糊精作为固定相。优选通过HPLC用固定的光学活性铵盐如D-青霉胺测定对映体过量。
通常，在本发明的上下文中，少量的MGDA和/或GLDA也可以带有除碱金属之外的阳离子。因此，少量助洗剂、例如总助洗剂的0.01％至5mol％可以带有碱土金属阳离子，例如Mg2+或Ca2+，或过渡金属阳离子，例如Fe2+或Fe3+阳离子。相对于相应的助洗剂，“少量”的MGDA和/或GLDA在本文中是指总计0.1％至1w/w％。
在本发明的一个实施方案中，洗涤剂组合物中所包含的MGDA和/或GLDA，可包含范围在0.1％至10％重量的一种或多种杂质，含量为相对于一种或多种光学惰性杂质的相应助洗剂，至少一种杂质选自：亚氨基二乙酸、甲酸、乙醇酸、丙酸、乙酸和它们各自的碱金属盐或单、二或三铵盐的至少一种。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种聚羧酸盐。术语“聚羧酸盐”包括聚合的聚羧酸盐和非聚合的多羧酸盐(非聚合的多羧酸盐，包括带有两个、三个和四个碳酸基团的化合物)，例如琥珀酸，C2-C16-烷基二琥珀酸盐、C2-C16-链烯基二琥珀酸盐、乙烯二胺N，N′-二琥珀酸、酒石酸二乙酸盐、碱金属丙二酸盐、酒石酸单乙酸盐、丙烷三羧酸、丁烷四羧酸和环戊烷四羧酸。
合适的聚合多羧酸盐包括含有选自通式(XV)的不饱和羧酸单体的化合物：
通式(XV)中的变量定义如下：
R1、R2和R3独立地选自H；直链或支链的C1-C12烷基、直链或支链的C2-C12链烯基，其中烷基和/或链烯基可被-NH2、-OH、或-COOH取代；-COOH；和-COOR5，其中R5选自直链或支链的C1-C12烷基和直链或支链的C2-C12链烯基。
R4可以是间隔基团，其任选地选自-(CH2)n-，其中n在0至4的范围内，-COO-(CH2)k-，k为1-6，-C(O)-NH-和-C(O)-NR6-，其中R6选自直链或支链的C1-C22烷基、直链或支链的C2-C22链烯基和C6-C22芳基。
合适的不饱和羧酸的非限制性实例包括丙烯酸、甲基丙烯酸(MAA)、2-乙基丙烯酸、2-苯基丙烯酸、丙二酸、巴豆酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、山梨酸、肉桂酸、甲基烯丙二酸、不饱和C4-C10二羧酸及其混合物。
聚羧酸盐可以是均聚物，其中重复单体是相同的不饱和羧酸，例如聚丙烯酸(PAA)。聚羧酸盐也可以是与重复单体为至少两种不同的不饱和羧酸的共聚物，例如丙烯酸与甲基丙烯酸的共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸与马来酸和/或富马酸的共聚物。在一个实施方案中，丙烯酸和马来酸的共聚物包含50％至90％重量的丙烯酸和50％至10％重量的马来酸。
聚羧酸盐也可以是具有至少一种选自如上定义的单乙烯基不饱和羧酸的单体与至少一种疏水或亲水修饰的单体的共聚物。合适的疏水性单体是，例如异丁烯、二异丁烯、丁烯、戊烯、己烯和苯乙烯、具有10个或更多个碳原子的烯烃或其混合物，例如1-癸烯、1-十二碳烯、1-十四烯、1-十六碳烯、1-十八碳烯、1-二十碳烯、1-二十二碳烯、1-二十四碳烯和1-十六碳烯、C22-α-烯烃、C20-C24-α-烯烃和聚异丁烯的混合物，每个分子平均含有12-100个碳原子。
合适的亲水性单体是具有磺酸盐或膦酸盐基团的单体，以及具有羟基官能团的非离子单体或具有环氧烷基团的非离子单体。例如：烯丙醇、异戊二烯醇、甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚丁二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚(丙烯氧化物-共-乙烯氧化物)(甲基)丙烯酸酯、乙氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基聚丁二醇(甲基)丙烯酸酯和乙氧基聚(丙烯氧化物-共-乙烯氧化物)(甲基)丙烯酸酯。这里的聚亚烷基二醇可包含每分子3至50个烷基氧化物单元(AO)、每个分子5至40个AO、或每分子10至30个AO。
聚羧酸盐包括上面列出的化合物的盐。形成盐的阳离子可以是单价的或多价的。合适的实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和单、二和三乙醇胺的铵盐。
根据本发明的合适的聚羧酸盐包括聚羧酸盐化合物，其平均分子量(Mw)为约500g/mol至约500,000g/mol，范围为约1,000至约100,000g/mol，或在约3,000至约80,000g/mol的范围内。
聚羧酸盐可以通过烷氧基化作用衍生化，例如乙氧基化和/或丙氧基化。
烷氧基化的聚羧酸盐包括每2至8个丙烯酸酯单元具有一个乙氧基侧链的聚丙烯酸酯。在一个实施方案中，包含聚丙烯酸酯的聚羧酸盐每7至8个丙烯酸酯单元具有一个乙氧基侧链。侧链与聚丙烯酸酯“主链”酯键连接，以提供“梳形”聚合物型结构。分子量可以在约2,000g/mol至约50,000g/mol的范围内。
包含丙烯酸的聚羧酸盐的合适的非限制性实例包括Sokalan PA30、SokalanPA20、Sokalan PA15、Sokalan PAIO和Sokalan CP10(BASF GmbH、Ludwigshafen、Germany)、AcusolTM45N、Acusol480N、Acusol 460N和Acusol820(由Rohm and Haas、Philadelphia、Pennsylvania、USA)聚丙烯酸，例如AcusolTM 445和AcusolTM 420(由Rohm and Haas、Philadelphia、Pennsylvania、USA销售)丙烯酸/马来酸共聚物，例如AcusolTM 425N和丙烯酸/甲基丙烯酸共聚物。
本文所述的洗涤剂组合物可包含的量为洗涤剂组合物的0.1％至10％w/w，0.25％至5％w/w或0.3％至2％w/w的烷氧基化的聚羧酸盐。
洗涤剂组合物可包含选自聚磺酸盐的聚合物。“聚磺酸盐”包括含有通式(XVI)的磺酸单体的化合物：
其中式(XVI)中的变量定义如下：
R1、R2和R3独立地选自H；直链或支链C1-C12烷基、直链或支链C2-C12链烯基，其中烷基和/或链烯基可被以下基团取代：-NH2、-OH、或-COOH；-COOH；和-COOR5，其中R5选自直链或支链C1-C12烷基和直链或支链C2-C12链烯基。
R4可以是间隔基团，其任选地选自-(CH2)n-，n为0至4，-COO-(CH2)k-，k为1至6，-C(O)-NH-和-C(O)-NR6-，其中R6选自直链或支链C1-C22烷基、直链或支链C2-C22链烯基，和C6-C22芳基(后者意指还包括不止一个环的环体系，所述的环选自5、6、7和8元环，例如萘)。
在一个实施方案中，磺酸单体选自式(XVII)、(XVIII)和(XIX)的化合物：
H2C＝CH-X-SO3H (XVII)
H2C＝C(CH3)-X-SO3H (XVIII)
HO3S-X-(R2)C＝C(R3)-X-SO3H (XIX)
式(XVII)、(XVIII)和(XIX)中的变量定义如下：
R2和R3独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基。
X可以是间隔基团，其任选地选自-(CH2)n-，n为0至4，-COO-(CH2)k-，k为1至6，-C(O)-NH-和-C(O)-NR5-，其中R5选自直链或支链的C1-C22烷基、直链或支链的C2-C22链烯基和C6-C22芳基。
合适的磺酸单体的非限制性实例包括1-丙烯酰胺基-1-丙烷磺酸、2-丙烯酰氨基-2-丙烷磺酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙烷磺酸、2-甲基丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸、3-甲基丙烯酰胺基-2-羟基-1-丙烷磺酸、烯丙基磺酸、甲基烯丙基磺酸、烯丙氧基苯磺酸、甲基烯丙氧基苯磺酸、2-羟基-3-(2-丙烯氧基)-丙磺酸、2-甲基-2-丙烯-磺酸、苯乙烯磺酸、乙烯基磺酸、3-磺基丙基丙烯酸酯、3-磺基丙基甲基丙烯酸酯、磺基甲基丙烯酰胺、磺基甲基甲基丙烯酰胺，及其混合物。
在一个实施方案中、聚磺酸盐包括磺酸单体以及选自不饱和羧酸的单体。选自不饱和羧酸的单体包括作为聚羧酸盐的合适单体列出的那些。
聚磺酸盐包括以上列出的化合物的盐。形成盐的阳离子可以是单价的或多价的。合适的实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和单、二和三乙醇胺的铵盐。
合适的聚磺酸盐可具有小于或等于约100,000g/mol、小于或等于约75,000g/mol、或小于或等于约50,000g/mol的重均分子量。合适的聚磺酸盐的重均分子量可以为约3,000g/mol至约50,000g/mol、或者为约5,000g/mol至约45,000g/mol。
磺化/羧化聚合物的合适的非限制性实例包括Alco Chemical提供的Alcosperse240、Aquatreat AR 540和Aquatreat MPS；Rohm&Haas提供的Acumer 3100、Acumer 2000、Acusol 587G和Acusol 588G；BF Goodrich提供的Goodrich K-798、K-775和K-797；特别优选的聚合物是Rohm&Haas提供的Acusol 587G和Acusol 588G、Versaflex SiTM(由AlcoChemical，美国田纳西州销售)。
本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种聚膦酸盐。术语“聚膦酸盐”包括乙烯基膦酸和丙烯酸或另外的乙烯基化合物的共聚物、聚乙烯基膦酸及其盐。形成盐的阳离子可以是单价的或多价的。合适的实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和单、二和三乙醇胺的铵盐。
洗涤剂组合物可包含一种或多种聚胺。“聚胺”是可以选自下组的化合物：
i)包含两个或更多个主链氮原子的聚胺；
ii)包含一个或多个阳离子主链氮原子的聚胺；
iii)包含一个或多个烷氧基主链氮原子的聚胺；
iv)包含一个或多个阳离子主链氮原子和一个或多个烷氧基主链氮原子的聚胺；和
v)其混合物。
聚胺包含聚胺主链，其中连接氨基单元的主链单元能够被修饰。
除了主链组合物的修饰之外，一个或多个主链氨基单元氢可以被其他单元取代，其可以将阴离子或阳离子部分引入到聚胺中。
在聚胺的情况下，“阳离子部分”被定义为“能够带正电荷的单元”。这种阳离子单元可以是聚胺主链的季铵单元(即聚胺主链内的氨基被修饰成铵单元)或季铵单元，其包含取代聚胺主链的单元。
在聚胺的情况下，“阴离子部分”被定义为“能够带负电荷的单元”。这种阴离子单元是“单独或作为另一单元的一部分，沿聚胺主链取代氢的单元”。
在一个实施方案中，根据本发明的聚胺是具有基本主链的聚亚烷基亚胺，即聚胺主链，其包含伯、仲和叔胺氮原子J，其通过亚烷基R连接以形成通式[J-R]n-J的化合物。
R单元可选自
a)C2-C12直链亚烷基、C3-C12支链亚烷基、C6-C16取代或未取代的亚芳基、C7-C40取代或未取代的亚烷基亚芳基或其混合物。
b)根据式-(R2O)w R3-的亚烷基氧基亚烷基单元，
其中R2选自亚乙基、1，2-亚丙基、1，3-亚丙基、1，2-亚丁基、1，4-亚丁基，及其混合物；
且其中R3选自C2-C8直链亚烷基、C3-C8支链亚烷基、亚苯基、取代的亚苯基，及其混合物。
指标w在0至约25。
R2和R3单元也可包含其他主链单元。当包含亚烷基-氧基亚烷基单元时，R2和R3单元优选为乙烯、丙烯和丁烯的混合物，指数w可以在1至约20的、在约2至约10或约6的范围内。
c)根据下式的羟基亚烷基单元
其中R4是氢、C1-C6烷基、-(CH2)u(R2O)t(CH2)uY，及其混合物。当R单元包含羟基亚烷基单元时，R4可以是氢或-(CH2)u(R2O)t(CH2)uY，其中指标t大于0，例如10至30的整数；指标u可以是0至6；Y可以是氢或阴离子单元，例如-SO3M；x、y和z各自独立在0-20的范围。在一个实施方案中，指数各自至少为1且R4是氢(2-羟基亚丙基单元)，或(R2O)tY。对于多羟基单元，y选自2和3。
d)根据下式的羟基亚烷基/氧基亚烷基单元：
其中R2选自亚乙基、1，2-亚丙基、1，3-亚丙基、1，2-亚丁基、1，4-亚丁基，及其混合物(如b)所述)；R4是氢、C1-C6烷基、-(CH2)u(R2O)t(CH2)uY，及其混合物(如c)所述)；w是0至约25(如d所述))；x、y和z各自独立地为0至20(如c)所述)。X可以是氧或氨基单元-NR4-，指标r可以是0或1。指标j和k各自独立地是1至20。当亚烷基氧基单元不存在时，指标w为0。
e)根据下式的羧基亚烷基氧基单元：
-(R2O)w(R3)w(X)r-CO-(X)r-R3-(X)r-CO-(X)r(R3)w(OR2)w-
其中R2选自亚乙基、1，2-亚丙基、1，3-亚丙基、1，2-亚丁基、1，4-亚丁基及其混合物(如b)所述)；R3选自C2-C8直链亚烷基、C3-C8支链亚烷基、亚苯基、取代的亚苯基，及其混合物(如b)所述)；w在0至约25(如b)所述)；X可以是氧或氨基单元-NR4-(如d)所述)；r可以是0或1(如d)所述)。
f)根据下式的主链接枝单元
其中R4是氢、C1-C6烷基、-(CH2)u(R2O)t(CH2)uY及其混合物(如c)所述)。当R单元包含主链接枝单元时，R4可以是氢或-(CH2)u(R2O)t(CH2)uY。j和k各自独立地在1至20范围(如d)所述)；t0，例如在10至30的范围，且u可以在0至6的范围(如c)所述)；w在0至约25的范围(如d)所述)；x、y和z各自独立地在0至20的范围(如c)所述)。Y可以是氢、C1-C4直链烷基、-N(R1)2、阴离子单元，或其混合物。
所公开的R单元可以彼此组合以实现聚胺不同程度的亲水性。
在聚胺的上下文中，术语“取代基”定义为“替代氢原子的相容部分”。合适的取代基的非限制性实例包括羟基、次氮基、肟基、卤素、硝基、羧基，尤其是-CHO、CO2H、-CO2R′、-CONH2、-CONHR′、-CONR′2，其中R′是C1-C12直链或支链烷基、氨基、C1-C12单或二烷基氨基、-OSO3M、-SO3M、-OPO3M或-OR”，其中R”是C1-C12直链或支链烷基；及其混合物。
M选自H、成盐阳离子如Na，及其混合物。
J单元是主链氨基单元，所述单元选自：
i)具有下式的伯氨基单元：[NH2-R1]-和-NH2
ii)具有下式的仲氨基单元：-[NH-R1]-
iii)具有下式的叔氨基单元：-[NB-R1]-
iv)具有下式的伯季氨基单元：-[N+H2-R1]-
v)具有下式的仲季氨基单元：-[N+H(Q)-R1]-
vi)具有下式的叔季氨基单元：-[N+B(Q)-R1]-
vii)具有下式的伯氨基N-氧化物单元：-[NH2(O)-R1]-
viii)具有下式的仲氨基N-氧化物单元：-[NH(O)-R1]-
ix)具有下式的叔氨基N-氧化物单元：-[NB(O)-R1]-
x)及其混合物。
前述J单元中包含的B单元具有式[J-R]-，并且用支化表示聚胺主链的延续。存在的B单元以及构成分支的任何其他氨基单元的数目反映在指数n的总值中。
上述J单元中R1单元可选自
a.氢(通常在任何主链修饰之前存在)
b.C1-C22烷基、C1-C4烷基、乙基和甲基
c.季铵化单元Q
d.根据下式之一的C7-C22亚芳基烷基：
其中R5可以是直链或支链的C1-C16烷基，且n’可以是0或1；
其中R6可以是氢、直链或支链的C1-C15烷基，及其混合物；m’可以在1至16的范围。
e.-[CH2CH(OR4)CH2O]s(R2O)tY
其中R2选自亚乙基、1，2-亚丙基、1，3-亚丙基、1，2-亚丁基、1，4-亚丁基，及其混合物；
R4可以是氢、C1-C6烷基、-(CH2)u(R2O)t(CH2)uY，或其混合物，其中指标t大于0，例如在10至30；指标u可以是0至6；且Y可以是氢C1-C4直链烷基、-N(R1)2，或阴离子单元；Y可以是-N(R1)2，这时Y是主链接枝单元R单元的部分；
指标s可以是0至5。指标t是0、5至约100范围的均值，或5至约15范围。
f.阴离子单元。
前述J单元中的Q单元是选自C1-C4直链烷基(如甲基)、苄基及其混合物的季铵化单元。每个主链季氮将有阴离子提供电荷中性。
阴离子基团包括共价连接到聚合物上的两个单元以及存在的外部阴离子以实现电荷中性。适合使用的阴离子的非限制性实例包括卤素，尤其是氯化物；甲基硫酸盐；硫酸氢盐和硫酸盐。本领域技术人员将认识到，阴离子通常是作为季铵化试剂的一部分的单元，尤其是甲基氯、二甲基硫酸盐、苄基溴。
例如，羧酸单元-CO2H是中性的，但是在去质子化时，该单元变成阴离子单元。阴离子Y单元的非限制性实例包括-(CH2)fCO2M、-C(O)(CH2)fCO2M、-(CH2)fPO3M、-(CH2)fOPO3M、-(CH2)fSO3M、-CH2(CHSO3M)-(CH2)fSO3M、-CH2(CHSO2M)(CH2)fSO3M、-C(O)CH2CH(SO3M)CO2M、-C(O)CH2CH(CO2M)NHCH(CO2M)CH2CO2M、-C(O)CH2CH(CO2M)NHCH2CO2M、-CH2CH(OZ)CH2O(R1O)tZ、-(CH2)fCH-[O(R2O)tZ]CHfO(R2O)tZ，及其混合物，其中Z是氢或阴离子单元；f在0至6的范围。
阴离子Y单元还包括下式的低聚和多聚单元
-CH2CH(OH)CH2O-CH2CH(SO3Na)CH2SO3Na
-CH2CH(OH)CH2O-CH2CH(SO2Na)CH2SO3Na
-CH2CH(OH)CH2O-CH2CH2CH2SO3Na
-CH2CH(OSO3Na)CH2O-CH2CH(SO2Na)CH2OSO3Na
聚胺可包含一个或多个在聚胺主链上被取代的阴离子单元。
通常，粒状洗涤剂组合物需要高度阴离子电荷，这意味着约40％、大于50％、大于75％或大于90％的阴离子Y单元可包含-SO3M单元。
通常，液体洗涤剂组合物需要少于90％、少于75％、少于50％或少于40％的包含-SO3M的阴离子Y单元。
聚胺化合物可包含下式的聚胺主链：
[H2N-R]w[N(H)-R]x[N(B)-R]yNH2
其中R是C2-C12直链亚烷基、C3-C12支链亚烷基，及其混合物；B表示通过支化的结构的延续；w、x和y取决于分子量和相对支化度而变化。
低分子量聚亚烷基亚胺可具有选自亚乙基、1，3-亚丙基和1，6亚己基的R。指数w、x和y使所述低分子量聚亚烷基亚胺的分子量不超过600g/mol。非限制性实例低分子量聚亚烷基亚胺中的聚胺单元包括二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、二亚丙基三胺、三亚丙基四胺和二六亚甲基三胺。
中等范围分子量的聚亚烷基亚胺可具有选自亚乙基、1，3-亚丙基及其混合物的R。指数w、x和y使所述聚胺的分子量在约600至约50,000g/mol的范围内。
高分子量聚亚烷基亚胺可具有选自亚乙基的R。指数w、x和y使所述聚胺的分子量在约50,000至约1,000,000g/mol的范围内。
聚亚烷基亚胺的平均分子量(Mw)范围可为约100至数百万g/mol。优选地，平均分子量在约100至约1,000,000g/mol的范围内，在约250至100,000g/mol的范围内，在约500至约5,000g/mol的范围内。在约500至约1,000g/mol的范围内，或在约600至约800g/mol的范围内。
聚亚烷基亚胺可以是直链或支链的，并且可以通过接枝或封端进一步修饰。优选的接枝剂的非限制性实例是氮丙啶(亚乙基亚胺)、己内酰胺及其混合物。合适的封端反应包括但不限于聚胺与C1-C22直链或支链一元羧酸的反应，例如月桂酸和肉豆蔻酸。
在接枝之前或之后，聚胺可以与形成酰胺的T交联单元交联，T交联单元可以是包含聚酰胺形成单元的羰基；或聚胺可与非酰胺形成的L交联单元交联，L交联单元可以使用表卤代醇、优选表氯醇得到，作为交联剂。
本文优选的聚亚烷基亚胺主链是表现为很少支化或没有支化的那些主链，因此主要是线性的聚烷基亚胺主链。在本发明的上下文中，聚亚烷基亚胺中的CH3-基团不被认为是支链。支链可以是亚烷基氨基，例如但不限于-CH2-CH2-NH2基团或(CH2)3-NH2-基团。例如，更长的分支可以是，例如-(CH2)3-N(CH2CH2CH2NH2)2基团。
本发明的洗涤剂组合物可以是一种或多种pH调节化合物，在本文中可被称为碱，其提供高于5、高于6或高于7的pH。优选地，当pH调节化合物加入洗涤剂组合物中时，提供高于7.5、高于8、高于8.5、高于9、高于9.5、高于10、高于10.5、高于11或高于11.5的pH。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含pH调节化合物，其使液体组合物的pH在5至11.5、6至11.5、7至11、或8至11的范围内。
合适的pH调节化合物可以是氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇胺和/或碱性缓冲盐。合适的缓冲盐可以是碳酸氢钾、碳酸钾、焦磷酸四钾、三聚磷酸钾、碳酸氢钠和碳酸钠。合适的也可以是pH调节化合物的混合物，其满足调节适当pH的目的。
本发明的洗涤剂组合物可以适应于起泡特性以满足各种目的。手洗餐具洗涤剂通常要求稳定的泡沫。通常要求自动洗碗机清洁剂是低泡沫的。洗衣洗涤剂的范围可以从高泡沫到中等泡沫或中等泡沫到低泡沫。通常建议将低泡沫洗衣洗涤剂用于前装式、滚筒式洗衣机和洗衣干衣机组合。
本领域技术人员熟悉使用泡沫稳定剂或抑泡剂作为适用于特定应用的洗涤剂组合物中的洗涤剂组分。合适的泡沫稳定剂可选自链烷醇酰胺和烷基胺氧化物。合适的泡沫抑制剂可选自烷基磷酸酯、硅氧烷和肥皂。
取决于最终应用，本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种抗再沉积剂，其在本文中可称为抗灰化剂。通常，抗再沉积剂是为了防止在清洁过程中去除污渍后，污渍再沉积。合适的抗再沉积剂的非限制性实例包括羧基甲基纤维素、聚碳酸酯、聚乙二醇和硅酸钠。
取决于最终应用，本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种染料转移抑制剂(DTI)。通常，染料转移抑制剂旨在防止在洗涤过程中从一种纺织品中释放的染料转移到存在的另一种纺织品中。合适的染料转移抑制剂的非限制性实例包括修饰的聚羧酸盐，聚胺N-氧化物如聚(4-亚乙基吡啶-N-氧化物)，如PVNO和N-亚乙基吡咯烷酮和N-亚乙基咪唑的共聚物，如PVPVI。
取决于最终应用，洗涤剂组合物可包含一种或多种漂白剂，如氯漂白剂、光漂白剂和过氧化物漂白剂，以及它们的混合物。过氧化物漂白剂可与漂白活化剂和/或漂白催化剂组合。
合适的氯漂白剂的非限制性实例包括但不限于1，3-二氯-5，5-二甲基乙内酰脲、N-氯磺酰胺，氯胺T、氯胺B、次氯酸钠、次氯酸钙、次氯酸镁、次氯酸钾、二氯异氰尿酸钾和二氯异氰尿酸钠。
合适的光漂白剂的非限制性实例包括磺化的锌酞菁和磺化的铝酞菁，及其混合物。
根据本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种过氧化物漂白剂。过氧化物漂白剂可选自H2O2和H2O2的前体。H2O2前体的合适实例包括化合物，例如无机和有机过氧化物、和过氧酸。无机过氧化物可选自过硫酸盐、过硼酸盐、过碳酸盐和过硅酸盐的化合物。合适的无机过氧化物的非限制性实例是过硼酸钠四水合物、过硼酸钠一水合物和过碳酸钠。有机过氧化物可选自单或聚过氧化物、脲过氧化物、C1-C4链烷醇氧化酶和C1-C4链烷醇、烷基羟基过氧化物(例如氢过氧化枯烯)和叔丁基过氧化氢化合物。
包含在本发明洗涤剂组合物中的过氧化物可以是各种不同的结晶形式并具有不同的水含量，它们也可以与其它无机或有机化合物一起使用，以改善它们的贮存稳定性。
过氧酸可选自无机和有机过氧酸。无机过氧酸的合适的非限制性实例是单过硫酸钾(MPS)。有机过氧酸可选自式(XX)的有机单过氧酸：
R′-C(O)-O-OM′(XX)
其中M′是氢或碱金属(例如Na-盐)，和
R’是氢、C1-C4烷基、苯基、-C1-C2亚烷基-苯基或邻苯二甲酰亚氨基-C1-C8亚烷基。
根据式(XX)的合适过氧酸的非限制性实例包括HCOOOH、CH3COOOH、ε-邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸及其碱金属盐(例如钠盐)。
过氧酸可选自二过氧酸，例如1,12-二过氧十二烷二酸(DPDA)；1，9-二过氧乙酰乙酸；二过氧基溴酸；二过氧己酸；二过氧间苯二甲酸；2-癸基二过氧丁-1，4-二酸；4，4′-磺酰基二过氧苯甲酸；双(单过氧邻苯二甲酸酯)六水合镁(Mg-DPP)；二酮酰氧基过氧化物(DAP)；和过氧苯甲酸。
在一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂组合物包含一种或多种无机过氧化物。
过氧化物、尤其是无机过氧化物，可任选地通过漂白活化剂活化。因此，本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种漂白活化剂。在过水解条件下，这种漂白活化剂可以产生具有1至10个碳原子或2至4个碳原子的未取代或取代的过苯并-和/或过氧羧酸。合适的漂白活化剂的非限制性实例包括带有具有所述碳原子数的O-和/或N-酰基和/或未取代或取代的苯甲酰基的那些。优选选自聚酰化亚烷基二胺如四乙酰基乙二胺(TAED)、酰化甘脲如四乙酰基甘脲(TAGU)、N，N-二乙酰基-N，N-二甲基-脲(DDU)、酰化三嗪衍生物，如1，5-二乙酰基-2，4-二氧代六氢-1，3，5-三嗪(DADHT)、和式(XXI)化合物
其中式(XXI)中的变量定义如下：
R”是磺酸盐基团、羧酸基团或羧酸盐基团，
R’是直链或支链(C7-C15)烷基。
合适的漂白活化剂的非限制性实例包括名称为LOBS(十二烷酰氧基苯磺酸盐)、NOBS(壬酰氧基苯磺酸盐)、IsoNOBS(3，5，5-三甲基己酰氧基苯磺酸钠盐)和DOBA(癸酰氧基苯甲酸)、BOBS(苯甲酰氧基苯磺酸盐)、BCL(苯甲酰基己内酰胺)、MOR(4-吗啉代腈)和ACL(乙酰基己内酰胺)的已知化合物。
合适的漂白活化剂也可选自链烷酰氧基乙酸酯化合物，酰化多元醇，例如特别是三乙酸甘油酯、乙二醇二乙酸酯、2，5-二乙酰氧基-2，5-二氢呋喃、乙酰化山梨糖醇和甘露醇。合适的漂白活化剂也可选自酰化糖衍生物，例如五乙酰基葡萄糖(PAG)、蔗糖聚乙酸盐(SUPA)、五乙酰基果糖、四乙酰基木糖和八乙酰基乳糖。合适的漂白活化剂也可选自乙酰化、任选地N-烷基化的葡糖胺和葡糖酸内酯。与过氧化物形成过氧酰亚胺酸的腈化合物也可适合作为漂白活化剂。
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂组合物包含四乙酰基乙二胺和/或壬酰氧基苯磺酸盐。
过氧化物也可与漂白催化剂组合使用，并任选与漂白活化剂组合使用。漂白催化剂可选自基于氧氮丙啶鎓的漂白催化剂、酰腙漂白催化剂、促进漂白的过渡金属盐或过渡金属络合物，例如锰-、铁-、钴-、钌-或钼-salen络合物或羰基复合物。与含氮三脚架配体的锰、铁、钴、钌、钼、钛、钒和铜配合物可用作漂白催化剂。
可以使用的漂白催化剂的非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰-胶原、钴-胺催化剂、三联吡啶-锰配合物和三氮杂环壬烷锰(MnTACN)催化剂；合适的是锰与1，4，7-三甲基-1，4，7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1，2，4，7-四甲基-1，4，7-三氮杂环壬烷的络合物(Me4-TACN)，特别是Me3-TACN，例如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2和[2，2′，2″-次氮基三(乙烷-1，2-diylazanylylidene-K N-methanylylidene)triphenolato-K3O]锰(III)，Fe(III)TAML和五氨基乙酸基硝酸钴(III)(PAAN)。漂白催化剂也可以是其他金属化合物，如钴-、铁-、铜-和钌-胺络合物。
漂白催化剂的其它实例是N-磺酰基噁唑烷、磺酰亚胺、季胺亚胺盐、季吖啶鎓盐、二氢异喹啉鎓化合物、季氧杂吖啶鎓化合物及其前体。
根据最终应用，洗涤剂组合物可包含一种或多种荧光增白剂(FWA)。洗涤剂组合物可包含选自双-三嗪基氨基-二苯乙烯二磺酸类化合物的荧光增白剂，例如DMA-X和5BM-GX。
荧光增白剂也可选自双-三唑基-芪二磺酸类和双-苯乙烯基-联苯衍生物如CBS-X、CBS-SP和CBS-CL。
荧光增白剂也可选自双-苯并呋喃基联苯、双-苯并噻唑衍生物、双-苯并咪唑基衍生物、香豆素衍生物、石脑-三唑-二苯乙烯衍生物、吡唑啉衍生物和双-苯乙烯基-苯类的化合物。
合适的荧光增白剂的非限制性实例还包括4，4′-双-(2-二乙醇基氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2，2′-二磺酸盐；4，4′-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2，2′-二磺酸盐；4，4′-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸盐；4，4′-双-(2-苯胺基-4-(甲基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2，2′-二磺酸盐；4，4′-双-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)芪-2，2′-二磺酸；2-(芪基-4″-(萘并-1′，2′：4，5)-1，2，3-三唑-2″-磺酸盐；4，4′-双{[(4-苯胺基-6-吗啉代-1，3，5-三嗪-2-基)]氨基}芪-2-2′-二磺酸盐；和4，4′-双(2-磺基苯乙烯基)联苯。
取决于其物理形式，本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种防腐剂。通常将防腐剂加入到液体组合物中，以防止由于微生物的侵袭而改变所述组合物。合适的防腐剂的非限制性实例包括(季铵)铵化合物、异噻唑啉酮、有机酸和甲醛释放剂。合适的(季铵)铵化合物的非限制性实例包括苯扎氯铵、聚己二甲酰基双胍(PHMB)、二癸基二甲基氯化铵(DDAC)和N-(3-氨基丙基)-N-十二烷基丙烷-1，3-二胺(二胺)。合适的异噻唑啉酮的非限制性实例包括1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(MIT)、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(CIT)、2-辛基-2H-异噻唑-3-酮(OIT)和2-丁基-苯并[d]异噻唑-3-酮(BBIT)。合适的有机酸的非限制性实例包括苯甲酸、山梨酸、L-(+)-乳酸、甲酸和水杨酸。合适的甲醛释放剂的非限制性实例包括N，N′-亚甲基双吗啉(MBM)、2，2′，2″-(六氢-1，3，5-三嗪-1，3，5-三基)三乙醇(HHT)、(亚乙基二氧基)二甲醇、α，α′，α″-三甲基-1，3，5-三嗪-1，3，5(2H，4H，6H))-三乙醇(HPT)、3，3′-亚甲基双[5-甲基噁唑烷](MBO)和顺式-1-(3-氯烯丙基)-3，5，7-三氮杂-1-氮杂金刚烷氯化物(CTAC)。
其它有用的防腐剂包括碘代丙炔基丁基氨基甲酸酯(IPBC)，释放卤素的化合物如二氯二甲基-乙内酰脲(DCDMH)、溴-氯-二甲基-乙内酰脲(BCDMH)和二溴-二甲基-乙内酰脲(DBDMH)；溴硝基化合物如溴硝醇(2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇)、2，2-二溴-2-氰基乙酰胺(DBNPA)；戊二醛等醛类；苯氧乙醇；联苯-2-醇；和吡啶硫酮锌或钠。
取决于其物理形式，本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种流变改性剂，流变改性剂在本文中可称为增稠剂。根据本发明的“增稠剂”选自以下：
i)聚合物结构剂
用于本发明的天然衍生的聚合物结构剂的实例包括：羟基乙基纤维素、疏水修饰的羟基乙基纤维素、羧基甲基纤维素、多糖衍生物及其混合物。合适的多糖衍生物包括：果胶、藻酸盐、阿拉伯半乳聚糖(阿拉伯胶)、角叉菜胶、结冷胶、黄原胶、瓜尔胶及其混合物。用于本发明的合成聚合物结构剂的实例包括：聚羧酸盐、聚丙烯酸盐、疏水修饰的乙氧基化氨基甲酸酯、疏水修饰的非离子多元醇及其混合物。一方面，所述聚羧酸盐聚合物可以是聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其混合物。另一方面，聚丙烯酸酯可以是不饱和单或二碳酸与甲基丙烯酸的C1-C30烷基酯的共聚物。所述共聚物可以商品名Carbopol Aqua 30购自Noveoninc。
ii)二亚苄基多元醇缩醛衍生物
根据本发明的组合物可包含一种或多种二亚苄基多元醇缩醛衍生物(DBPA)。DBPA衍生物可包含二亚苄基山梨糖醇缩醛衍生物(DBS)。所述DBS衍生物可选自：1，3：2，4-二亚苄基山梨糖醇；1，3：2，4-二(对-甲基亚苄基)山梨糖醇；1，3：2，4-二(对氯亚苄基)山梨糖醇；1，3：2，4-二(2，4-二甲基二亚苄基)山梨糖醇；1，3：2，4-二(对乙基亚苄基)山梨糖醇；1，3：2，4-二(3，4-二甲基二亚苄基)山梨糖醇；及其混合物。
iii)二酰氨基胶凝剂
在一个方面，外部结构化体系可包含分子量为约150至约1,500g/mol，或甚至为约500至约900g/mol的二酰氨基胶凝剂。这种二酰氨基胶凝剂可包含至少两个氮原子，其中至少两个所述氮原子形成酰氨基官能取代基。一方面，酰氨基是不同的。另一方面，酰氨基官能团是相同的。二酰氨基胶凝剂具有下式(XXII)：
其中式(XXII)中二酰氨基胶凝剂的变量定义如下：
R3和R4是氨基官能端基，或甚至是酰氨基官能端基，一方面，R3和R4可包含pH可调基团，其中pH可调酰氨基-胶凝剂可具有约1至约30、或甚至约2至约10的pKa。一方面，pH可调基团可包含吡啶。一方面，R3和R4可以是不同的。另一方面，R3和R4可以相同。
L是分子量为14至500g/mol的连接部分。一方面，L可包含含有2至20个碳原子的碳链。另一方面，L可包含pH可调基团。一方面，pH可调基团是仲胺。一方面，R3、R4或L中的至少一个可包含pH可调基团。
iv)细菌纤维素
术语“细菌纤维素”包括通过CPKelco U.S.的醋酸杆菌属(Acetobacter)细菌例如发酵产生的任何类型的纤维素，并且包括通常称为微纤化纤维素、网状细菌纤维素等的材料。一方面，所述纤维可具有1.6nm至3.2nm×5.8nm至133nm的横截面尺寸。另外，细菌纤维素纤维可具有至少约100nm、或约100至约1,500nm的平均微纤维长度。一方面，细菌纤维素微纤维可具有纵横比，意指平均微纤维长度除以最宽的横截面微纤维宽度，为约100∶1至约400∶1，或甚至约200∶1至约300∶1。
本发明一方面，细菌纤维素至少部分用聚合物结构剂涂覆(参见上文)。一方面，至少部分涂覆的细菌纤维素包含约0.1％至约5％w/w、或甚至约0.5％至约3％w/w的细菌纤维素；相对于洗涤剂组合物的总重量，聚合物结构剂的含量为约10％至约90％w/w。合适的细菌纤维素可包括上述细菌纤维素，合适的聚合物结构化剂包括羧甲基纤维素、阳离子羟基甲基纤维素及其混合物。
v)来源于非细菌纤维素的纤维素纤维
纤维素纤维可以从蔬菜、水果或木材中提取。可商购的实例是来自FMC的来自Fiberstar的Citri-Fi或来自Cosun的Betafib。
vi)非聚合物结晶羟基功能材料
本发明一方面，组合物可包含非聚合的结晶羟基官能结构剂。所述非聚合的结晶羟基官能结构剂可包含可结晶的甘油酯，其可预先乳化以有助于分散到最终的液体洗涤剂组合物中。
一方面，可结晶甘油酯可包括氢化蓖麻油或“HCO”或其衍生物，条件是其能够在液体洗涤剂组合物中结晶。
取决于其物理形式，本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种水溶助长剂。通常，水溶助长剂用于防止液体洗涤剂组合物分层和/或确保液体洗涤剂组合物均匀性。合适的水溶助长剂的非限制性实例包括甲苯、二甲苯和枯烯磺酸盐的铵盐、钾盐或钠盐。
取决于本发明洗涤剂组合物的最终应用，洗涤剂组合物可包含一种或多种织物柔软化合物。织物柔软剂通常意指洗衣添加剂，赋予纺织品柔软的感觉和光滑的表面，减少静电和起皱，并使熨烫更容易。织物柔软剂可以是如上所述的选择的阳离子季铵化合物。
通常，织物柔软剂被设计用于添加到漂洗或干燥循环中。然而，织物柔软成分也可以掺入洗衣洗涤剂组合物中。
取决于最终应用，本发明的洗涤剂组合物可包含一种或多种腐蚀抑制剂。合适的腐蚀抑制剂的非限制性实例包括硅酸钠、三唑如苯并三唑、双苯并三唑、氨基三唑、烷基氨基三唑、苯酚衍生物如氢醌、邻苯二酚、羟基氢醌、没食子酸、间苯三酚和连苯三酚。
本发明涉及一种制备洗涤剂组合物的方法，该方法包括在一个或多个步骤中以非特定的顺序混合
组分(a)：至少一种含硼化合物，和
组分(b)：戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其它二醇，和
组分(c)：至少一种丝氨酸蛋白酶和任选的一种或多种其他酶，和
组分(d)：一种或多种洗涤剂组分。
组分(a)和(b)和(c)和(d)是如上所述的那些，包括它们的各种优选实施方案。
包含组分(a)、(b)和(c)的液体组合物-作为贮备溶液-可以引入包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。引入包含组分(a)、(b)和(c)(贮备溶液)的液体组合物可以通过稀释到洗涤剂组合物中的方式进行，例如通过稀释约1∶10、约1∶20、约1∶30、约1∶40、约1∶50、约1∶60、约1∶70、约1∶80、约1∶90、约1∶100、约1∶200、约1∶300、约1∶400、约1∶500、或约1∶1000。
此外，组分(a)、(b)和(c)可以直接与一种或多种洗涤剂组分混合以形成洗涤剂组合物。
在一个实施方案中，将包含至少含组分(a)和(b)和(c)的液体组合物的微囊引入包含一种或多种洗涤剂组分的液体洗涤剂组合物中。在另一个实施方案中，包含所述液体组合物的微囊例如是喷雾干燥的并引入到固体洗涤剂组合物中。
在一个实施方案中，包含至少组分(a)、(b)和(c)的组合物当例如通过冷冻干燥或喷雾干燥转化为无水形式时，例如在载体材料存在下形成聚集体，将其引入包含一种或多种洗涤剂组分的固体或液体洗涤剂组合物中。
本发明洗涤剂组合物的“物理形式”包括液体和固体洗涤剂组合物。
本发明的洗涤剂组合物可以是液体洗涤剂组合物。根据本发明的液体洗涤剂组合物在20℃和101.3kPa下是液体。在本发明的上下文中，凝胶型液体洗衣洗涤剂是液体洗衣洗涤剂的特殊实施方案。凝胶型液体洗衣洗涤剂通常含有至少一种粘度调节剂，并且它们含有很少或不含非水溶剂。凝胶型液体洗衣洗涤剂可直接应用于脏衣物中的污渍。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的液体洗涤剂组合物具有500至20,000mPa·s的动态粘度，根据Brookfield例如用Brookfield粘度计LVT-II在25℃下、用转子3在20rpm下测定。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的液体洗涤剂组合物可以具有50至98重量％、优选至多95％的水含量。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的液体洗涤剂组合物可具有2-50重量％、优选10-35重量％的总固体含量。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的液体洗涤剂组合物可包含除水之外的溶剂(即有机溶剂)，例如乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、二甘醇、丙基二甘醇、丁基二甘醇、己二醇、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚、乙二醇丙醚和苯氧基乙醇，优选乙醇、异丙醇或丙二醇。根据本发明的液体洗涤剂组合物可包含0.5％至12％重量的有机溶剂，指的是各液体洗涤剂组合物总重。在本发明的液体洗涤剂组合物以单位剂量、例如以小袋的形式提供的实施方案中，有机溶剂的含量可以在8％至25％重量的范围内，参考相应的液体洗涤剂组合物总量。
本发明的洗涤剂组合物可以是固体洗涤剂组合物。本发明中的固体洗涤剂组合物是指洗涤剂组合物在20℃和101.3kPa下是固体。固体洗涤剂组合物可以是粉末或单位剂量，例如片剂用于洗涤。
根据本发明的固体洗涤剂组合物，其总固体含量可以具有0.1至10重量％的残留水分。通过蒸发确定干重来测定残余水分。
本发明的洗涤剂组合物可包含含有以下组分的微囊
至少一种含硼化合物[即如上所述的组分(a)]和
戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其它二醇[即如上所述的组分(b)]和
至少一种丝氨酸蛋白酶和任选的一种或多种其他酶[即如上所述的组分(c)]。
这种洗涤剂组合物可以是液体或固体。
本发明的洗涤剂组合物可包含聚集体和/或颗粒，其包含如上所述的组分(a)和(b)和(c)。这种洗涤剂组合物可以是固体。
本发明的洗涤剂组合物可以采用单位剂量产品的形式，它是在由水溶性材料(即薄膜)制成的包装中单剂量的包装。这种包装可以称为小袋。
小袋可以是任何形式、形状和材料，其适于保存组合物，例如，使组合物在与水接触之前不会从小袋中释放。小袋的内部容积可被分成隔室。本文定义的袋的隔室是封闭结构，由水溶性薄膜制成，所述水溶性薄膜包围体积空间，所述容积空间包含组合物的不同组分。所述容积空间优选地由水溶性薄膜包围，使得容积空间与外部环境分离。对于本发明的目的，术语“外部环境”是指“任何不能通过包围隔室的水溶性薄膜并且不包含隔室”的东西。术语“分离的”对于本发明的目的而言“在物理上是不同的，因为如果所述第二成分不包含在包含所述第一成分的相同隔室中，则防止隔室包含的第一成分与第二成分接触”。
用以下重量分析法测定，水溶性薄膜通常具有至少50％、优选至少75％或甚至至少95％的溶解度：在400ml烧杯中加入10克0.1克材料，其中重量已经过测定，加入245ml1ml蒸馏水。将其在磁力搅拌器上设定600rpm剧烈搅拌30分钟。然后，将混合物通过折叠的具有如上定义孔径(最大50微米)的定性烧结玻璃过滤器过滤。通过任何常规方法从收集的滤液中干燥除去水分，并测定剩余聚合物的重量(其为溶解或分散的部分)。然后，可以计算％溶解度或分散性。
优选的薄膜是聚合物材料，优选形成薄膜或薄片的聚合物。该薄膜可以例如通过本领域已知的聚合物材料的浇铸、涂覆、吹塑、挤出或吹塑挤出获得。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮及其水溶性N-乙烯基吡咯烷酮共聚物、聚亚烷基氧化物、丙烯酰胺、丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙酸乙烯酯、多元羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、包括淀粉和明胶的多糖、天然树胶如黄原胶和卡拉胶。更优选聚合物选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、麦芽糖糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟基丙基甲基纤维素(HPMC)。
也可以使用聚合物的混合物。根据其应用和所需，尤其可能有利于控制隔室或袋的机械性能和/或溶解性质。例如，膜中可优选包含聚合物的混合物，由此一种聚合物材料具有比另一种聚合物材料更高的水溶性，和/或一种聚合物材料具有比另一种聚合物材料更高的机械强度。
可以根据本领域已知的方法制备小袋。
可将根据本发明的固体洗涤剂组合物和/或根据本发明的液体洗涤剂组合物包含在小袋的不同隔室中。用于液体组分的隔室的组成可能与含有固体的隔室不同(参见例如EP2014756)。该组合物包含至少一种含硼化合物[即如上所述的组分(a)]和戊-1，2-二醇和任选的一种或多种其他二醇[即如上所述的组分(b)]和至少一种丝氨酸蛋白酶和任选的一种或多种其他酶[即如上所述的组分(c)]，它们可以包含在液体或固体洗涤剂组合物中。在一个实施方案中，包含至少组分(a)和(b)和(c)的液体组合物另外包含一种或多种如上所述的pH调节化合物和/或一种或多种防腐剂。在一个实施方案中，包含至少组分(a)和(b)和(c)的组合物可被包封在小袋的一个隔室中。
本文的单位剂量产品还指固体洗涤剂组合物，以挤出的颗粒，或具有一定大小的片剂形式提供，片剂的大小在约1克和约250克之间，例如，约30g至约125g、约30g至约100g、例如约30g至约100g、例如约30克至约75克。还可以通过压缩洗涤剂组合物的组分来形成片剂，使得所生产的片剂足够坚固以能够承受处理和运输而不会造成损害。除了坚固外，片剂还必须足够快地溶解，以便洗涤剂组分在洗涤循环开始时尽快释放到洗涤水中。
用于单位剂量固体块的固体洗涤剂组合物可包含固化基质。固化基质通常包括碱金属氢氧化物碱度源、可水合盐例如碳酸钠(苏打灰)、多元羧酸聚合物和用于形成固体组合物的水装料。此外，其他赋形剂化合物可用于辅助制成片剂。合适化合物的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酰富马酸镁、硫酸钠(无水)、硫酸镁(无水)、碳酸钠(无水)、碳酸镁(无水)。
在某些清洁温度下，可以通过片剂的硬度/密度来改变溶解速率。为了具有抗结块效果，在组合物中存在至少一种抗结块剂，例如Mg-硅酸盐、Al-硅酸盐、Na-铝硅酸盐。
片剂可包含一种或多种聚合物崩解剂，优选交联的崩解剂。片剂还可包含一种或多种掺入交联聚合物崩解剂的崩解延迟剂。由此，可以形成不同的相，其有助于在清洁过程中的不同时间点控制各相的溶解。
适用于本发明的交联聚合物崩解剂包括交联淀粉、交联纤维素醚、交联聚乙烯吡咯烷酮，优选所谓的“聚乙烯吡咯烷酮-爆米花聚合物”或“PVPP”，交联羧基取代的乙烯系不饱和单体、交联的聚苯乙烯磺酸盐及其混合物。非常优选的是交联聚乙烯吡咯烷酮，例如PVPP。合适的交联剂包括选自二乙烯基和二烯丙基交联剂的双官能和多官能连接部分、多元醇、聚乙烯醇、聚亚烷基聚胺、含亚乙基亚胺的聚合物、含乙烯胺的聚合物及其混合物。或者，爆米花聚合物如PVPP可以通过所谓的增殖聚合(也称为“爆米花聚合”)使用合适的交联单体获得。
交联聚合物崩解剂的粒度和粒度分布对于控制片剂在运输和贮存期间的崩解性能和稳定性是很重要的。在一个优选的实施方案中，聚合物崩解剂的粒度分布为至少约40％、优选至少约50％、更优选至少约55％的重量落在250至850微米的范围内，从提供最佳崩解和稳定性曲线的观点来看，小于约40％、优选小于约30％、大于850微米这种分布是优选的。
片剂可包含一种或多种非交联的聚合物崩解剂。优选的非交联聚合物崩解剂的粒度分布为至少90％重量的崩解剂具有低于约0.3mm的粒度，并且其至少30％重量的粒度低于约0.2mm。合适地，非交联的聚合物崩解剂选自淀粉、纤维素及其衍生物、藻酸盐、糖、可溶胀的粘土及其混合物。
在多相片剂中，通过适当选择各种片剂相中崩解延迟剂的水平(浓度)，也可以实现受控的溶出特性。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种用于洗衣机的洗涤剂片剂，该洗涤剂片剂包含多个压缩相，所述压缩相在至少两个相中具有不同浓度的崩解阻滞剂，并且其中至少一个相包含交联的聚合物崩解剂，以便在洗衣机中提供两相或更多相的不同溶解。优选地，崩解延迟剂在至少两相中的浓度(相对于相应的相)相差至少约5％、更优选至少约20％、特别优选至少约50％。
本文中合适的崩解延迟剂包括但不限于有机和其他粘合剂、凝胶、可熔固体、蜡、溶解触发剂(例如响应于pH、离子浓度或温度)、水分吸收剂(例如可水合但无水或部分水合的盐)、粘性或中间相形成表面活性剂、及其混合物。本文特别优选的崩解延迟剂包括氧化胺表面活性剂、非离子表面活性剂及其混合物。用于本发明的优选的氧化胺是十四烷基二甲基氧化胺、十六烷基二甲基氧化胺及其混合物。
优选地，包含酶的相在清洁过程的早期崩解。在多相片剂中，待分解的第一相的优选洗涤剂组分包括一种或多种助洗剂、一种或多种表面活性剂、一种或多种酶、任选的一种或多种漂白剂、和一种或多种崩解剂。这种包含酶的相可包含本发明的微囊，其已通过喷雾干燥进行干燥，以掺入片剂中。包含酶的相可包含酶在根据本发明的聚集体或颗粒中。
待崩解的后续相的优选洗涤剂组分包括一种或多种助洗剂、一种或多种酶、一种或多种崩解剂和任选的一种或多种崩解阻滞剂。
在本发明的一个优选方面，待崩解的第一相重量超过4克。更优选地，所述第一相的重量为10g至30g、甚至更优选为15g至25g、最优选为18g至24g。随后的崩解阶段重量不到4克。更优选地，第二和/或任选的后续相重量为1g至3.5g、最优选为1.3g至2.5g。
去污和清洁方法使用包含至少一种含硼化合物[即，如上所述的组分(a)]和戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其他二醇[即如上所述的组分(b)]和至少一种丝氨酸蛋白酶和任选的一种或多种其他酶[即如上所述的组分(c)]：
本发明涉及包括使用包含如上所述的组分(a)，如上所述的组分(b)和如上所述的组分(c)的组合物的用途和方法，包括在适于清洁所述物品的条件下，使待清洁物品与本发明的组合物接触的步骤。在一个实施方案中，待清洁的物品与本发明的洗涤剂组合物接触。清洁的物品有：纺织品和/或硬表面，例如玻璃、金属表面，包括刀叉餐具或碗碟。
本发明还涉及使用包含如上所述的组分(a)、如上所述的组分(b)和如上所述的组分(c)的组合物用于除去酶敏感性污渍诸如蛋白质污渍的用途和方法。蛋白质污渍的非限制性实例包括源自体液的污渍，例如血液、乳制品例如牛奶、婴儿配方食品、蛋、蔬菜、身体污垢、草和泥。
在一个实施方案中，本发明涉及从纺织品或硬表面(例如玻璃)、包括刀叉餐具或碗碟的金属表面上除去酶敏感性污渍如蛋白质污渍的方法。
本发明涉及一种清洁方法，包括在一定条件下使包含如上所述的组分(a)、如上所述的组分(b)和如上所述的组分(c)的组合物与待清洁物体在适合清洁所述物体的条件下接触的步骤。在一个实施方案中，待清洁的物体与本发明的洗涤剂组合物接触。清洁方法可以是洗涤或硬表面清洁。可清洁的物体有：纺织品和/或硬表面，例如玻璃、金属表面，包括刀叉餐具或碗碟。
在一个实施方案中，本发明涉及使用包含如上所述的组分(a)、如上所述的组分(b)和如上所述的组分(c)的组合物处理纺织品或硬表面如玻璃、包括刀叉餐具或碗碟的金属表面的方法用于去除蛋白质污渍。蛋白质污渍的非限制性实例包括源自体液的污渍，例如血液、乳制品例如牛奶、婴儿配方食品、蛋、蔬菜、身体污垢、草和泥。
实施例：
使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA，短AAPF)作为底物测定蛋白酶的蛋白水解活性，其中pNA通过蛋白水解切割从底物分子上切割，释放游离pNA的黄色，通过测定OD405定量。
除非另外说明，在30℃下测量酶活性。
当以％w/w提供二醇和/或硼酸盐和/或酶的浓度时，％w/w与测试的组合物的总重量有关。
实施例1：在含硼化合物存在下二醇对蛋白酶活性的抑制
测试样品：
50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)、4.4μM4-FPBA、4.8mM Suc-AAPF-pNA和16nM根据SEQID No：1的蛋白酶，含2.3％w/w二醇或不含二醇。
在存在Suc-AAPF-pNA底物和仅4-FPBA的情况下测定蛋白酶活性，其在表A中给出100％值。
还测定了在AAPF-pNA底物下，4-FPBA和2.3％二醇的蛋白酶活性。
表A：
在BBA和二醇的存在下，蛋白酶的蛋白水解活性降低，意指蛋白酶的蛋白水解活性被二醇抑制。从表A可以得出结论，加入二醇可增加4-FPBA对蛋白水解活性的抑制作用；与使用的其他二醇相比，戊烷-1，2-二醇产生强烈的抑制作用。
实施例2：仅用二醇抑制蛋白酶活性
为了测试单独使用二醇对蛋白酶贮存稳定性的影响，将根据SEQ ID No：1的蛋白酶在45℃下与不同浓度的丙烷-1，2-二醇和戊烷-1，2-二醇一起贮存，如表B所示，贮存前含4％的根据SEQ ID No：1的活性蛋白酶，评估其在贮存期间蛋白水解活性的变化。
在4.8mM Sus-AAPF-pNa存在下测定蛋白水解活性。使用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)的缓冲体系。在贮存前(时间＝0)，测得的蛋白酶活性设定为100％。各时间点贮存(45℃下)后测得的蛋白酶活性示于表B中。
表B：
从表B可以得出结论，单独使用戊烷-1，2-二醇不能稳定蛋白酶，反而使蛋白酶不稳定；随着丙烷-1，2-二醇的量增加，蛋白酶则越加稳定。
实施例3：在存在和不存在含硼化合物的情况下用二醇抑制蛋白酶活性测试样品：
50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)、137μMBBA、4.8mM Suc-AAPF-pNA和16nM根据SEQ IDNo：1的蛋白酶，加135mM二醇或不加二醇。
在Suc-AAPF-pNA底物存在下，在不存在BBA和二醇的情况下测定蛋白酶活性，在表B中给出100％值。
在Suc-AAPF-pNA底物和BBA存在下测定蛋白酶活性，BBA使蛋白酶稳定化，参见表C-1。
表C-I：
BBA 蛋白酶活性
- 100％
+ 66％
从表C-I可得出结论：BBA稳定了蛋白酶，因为在BBA存在下蛋白酶的蛋白水解活性降低(蛋白水解活性的抑制)。
然后在Suc-AAPF-pNA底物和二醇(不含BBA)存在下测定蛋白酶活性，其通过二醇实现蛋白酶的稳定化，参见表C-II。
表C-II：
二醇 BBA 二醇(135mM) 蛋白酶活性
甘氨酸 - + 97％
戊烷-1，2-二醇 - + 70％
丙烷-1，2-二醇 - + 94％
乙二醇 - + 97％
丁烷-1，2-二醇 - + 84％
在二醇存在下，蛋白酶的蛋白水解活性降低，意味着蛋白酶的蛋白水解活性受到抑制。从表C-II与表C-1比较可以得出结论，与BBA相比，单独使用二醇对蛋白水解活性具有不太明显的稳定作用。在测试的二醇中，戊烷-1，2-二醇对蛋白水解活性具有最佳抑制作用。
然后在Suc-AAPF-pNA底物和BBA和二醇的存在下测定蛋白酶活性，其通过BBA和二醇使蛋白酶稳定化，参见表C-III。
表C-III：
二醇 BBA 二醇(135mM) 蛋白酶活性
甘油 + + 31％
1，2-戊二醇 + + 15％
1，2-丙二醇 + + 40％
乙二醇 + + 43％
1，2-丁二醇 + + 24％
在BBA和二醇的存在下，蛋白酶的蛋白水解活性降低，意味着蛋白酶的蛋白水解活性受到抑制。从表C-III与表B比较可以得出结论，二醇在BBA存在下增加了蛋白酶的稳定性。在测试的二醇中，戊烷-1，2-二醇对蛋白酶的稳定化具有最好的增加效果。
此外，通过比较表C1中提供的戊烷-1，2-二醇(BBA：66％)、C-II(戊烷-1，2-二醇：70％)和C-III(BBA+戊烷-1，2-二醇：15％)的结果，BBA和戊-1，2-二醇的协同稳定化是显而易见的。
实施例4：二醇的混合物
测试样品：
50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)、4.4μM4-FPBA、4.8mM Suc-AAPF-pNA和16nM根据SEQID No：1的蛋白酶，含有一种或两种二醇。
在Suc-AAPF-pNA底物和4-FPBA以及一种或两种二醇的存在下测定蛋白酶活性，其通过4-FPBA和一种或两种二醇使蛋白酶稳定，参见表D.
表D：
丙烷-1，2-二醇[mM] 120 96 76 45 0
戊烷-1，2-二醇[mM] 0 11,2 22,5 34 120
总二醇[mM] 120 107 98,5 79 120
蛋白酶活性 91％ 79,5％ 72％ 70％ 45,5％
仅Suc-AAPF-pNA底物和4-FPBA存在下的蛋白酶活性设定为100％。
结果显示，与单独使用4-FPBA稳定化相比，Suc-AAPF-pNA底物、4-FPBA和一种或两种二醇存在下的蛋白酶活性降低。这意味着一种或两种二醇增加了蛋白酶的稳定性。在所测试的二醇中，单用戊烷-1，2-二醇稳定蛋白酶最佳。
从表D可以得出结论，在丙烷-1，2-二醇和戊烷-1，2-二醇的二醇混合物中增加戊烷-1，2-二醇的浓度和降低丙烷-1，2-二醇的浓度有利于稳定蛋白酶。
实施例5：蛋白酶在洗涤剂组合物中的贮存稳定性
洗涤剂组合物的模型配方：
＊相对于模型配方(A+B)的总重量
模型制剂(100％)由85％A和15％B组成。制剂的pH为8.2。
使用的酶：
蛋白酶：SEQ ID No：2
淀粉酶：来自Novozymes的StainzymeTM
脂肪酶：来自Novozymes的LipexTM
在37℃贮存后，将样品稀释至少100倍，测定制剂的蛋白水解活性。抑制剂的作用由于稀释被逆转。
表E中的100％数值给出了在制剂贮存之前测定的蛋白水解活性。
表E
从表E可以得出结论，在1％w/w硼酸盐存在下比使用2％w/w硼酸盐的贮存效果差，后者比使用3％w/w硼酸盐的贮存效果差。
此外，从表E可以得出结论，含有2％戊烷-1，2-二醇和3％丙烷-1，2-二醇的贮存与含9％(w/w)丙烷-1，2-二醇的贮存同样有效。与使用2％戊烷-1，2-二醇和3％丙烷-1，2-二醇或用9％(w/w)丙烷-1，2-二醇贮存相比，使用3％丙烷-1，2-二醇贮存效果较差。
此外，测定含蛋白酶制剂贮存后的淀粉分解活性。通过从亚乙基封闭的4-硝基苯基麦芽庚糖苷底物(EPS-G7)释放对硝基苯酚(pNP)发色团来测定淀粉分解活性。表F中的100％值为在37℃下配方贮存之前测定的淀粉分解活性。
表F：
从表F可以得出结论，与单独使用丙烷-1，2-二醇稳定化相比，2％(w/w)戊烷-1，2-二醇和3％(w/w)丙烷-1，2-二醇的混合物具有更高的稳定效果。

Claims (13)

1.组合物，其包含
组分(a)：至少一种苯基硼酸或其衍生物，和
组分(b)：戊烷-1，2-二醇和任选的一种或多种其它与水混溶的二醇
其中所述组合物在20℃和101.3kPa下是液体。
2.根据权利要求1的组合物，其中的苯基硼酸衍生物选自4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)、4-羧基苯基硼酸(4-CPBA)、4-(羟甲基)苯基硼酸(4-HMPBA)和对甲苯基硼酸(p-TBA)。
3.根据权利要求1的组合物，其中包含的组分(b)的量相对于总组合物为10％-65％。
4.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物还包含组分(c)，其包含至少一种丝氨酸蛋白酶和任选的一种或多种其他酶。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物包含量为1g/L至100g/L的组分(c)。
6.根据前述权利要求中任一项的组合物，该组合物具有7-11.5的pH。
7.洗涤剂组合物，其包含
组分(a)：如前述权利要求中任一项所定义，和
组分(b)：如前述权利要求中任一项所定义，和
组分(c)：如前述权利要求中任一项所定义，和
组分(d)：一种或多种洗涤剂组分，
其中组分(b)的含量相对于组合物的总重量为2％至50％w/w，且组分(c)包含的量为0.01g/L至20g/L。
8.制备根据前述权利要求中任一项的组合物的方法，包括在一个或多个步骤中以非特定顺序混合
如前述权利要求中任一项所定义的组分(a)，和
如前述权利要求中任一项所定义的组分(b)，和
任选地，如前述权利要求中任一项所定义的组分(c)，和
任选地，如权利要求8所定义的组分(d)。
9.权利要求8的方法，其中制备的组合物是洗涤剂组合物，并且其中至少组分(a)、(b)和(c)以贮备溶液引入。
10.微囊，其包含根据权利要求1-6的组合物，
其中组分(a)和(b)和(c)是微囊的核心组合物的部分。
11.戊烷-1，2-二醇在包含至少一种丝氨酸蛋白酶的组合物中在至少一种苯基硼酸或其衍生物存在下改善至少所述丝氨酸蛋白酶的稳定性的用途。
12.去除污渍的方法，包括使酶敏感性污渍与根据权利要求7的洗涤剂组合物相接触。
13.清洁方法，其包括使污染材料与根据权利要求7的洗涤剂组合物相接触。
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