DE10064983A1 - Neue Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) - Google Patents
Neue Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233)Info
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Abstract
Eine neu gefundene alkalische Protease vom Subtilisin-Typ aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) eignet sich aufgrund ihrer natürlichen enzymatischen Eigenschaften besonders als waschaktive Komponente in Wasch- und Reinigungsmitteln, aber auch für zahlreiche andere Einsatzmöglichkeiten.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein bislang unbekanntes proteolytisches Enzym,
welches aus Bacilius alcalophilus (DSM 11233) erhältlich ist und sich aufgrund seiner
natürlichen enzymatischen Eigenschaften besonders als waschaktive Komponente in
Wasch- und Reinigungsmitteln, aber auch für zahlreiche andere Einsatzmöglichkeiten
eignet.
Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilopeptidasen, Nagarsen, EC 3. 4. 21. 14) werden den
Serin-Proteasen zugerechnet. Sie hydrolysieren Säureamidbindungen, die im Inneren von
Peptiden oder Proteinen liegen. Das pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen
Bereich, oberhalb von pH 9. Subtilisine werden natürlicherweise von bestimmten Bacillus-
Spezies produziert und sekretiert. Sie eignen sich für eine Vielzahl von technischen
Verwendungsmöglichkeiten, insbesondere als aktive Inhaltsstoffe von Wasch- oder
Reinigungsmitteln.
Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen oder Cellulasen werden seit Jahrzehnten als
aktive Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln verwendet. Ihr jeweiliger Beitrag
zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung des betreffenden Mittels ist im Fall von
Protease die Fähigkeit zum Abbau proteinhaltiger Verunreinigungen, im Fall von Amylase
der Abbau von stärkehaltigen Verunreinigungen und im Fall von Lipase die fettspaltende
Aktivität. Cellulasen werden über ihre schmutzentfernende, das heißt primäre Wasch-,
beziehungsweise Reinigungsleistung hinaus, insbesondere wegen ihres Beitrags zur
Sekundärwaschleistung eines Waschmittels und wegen ihrer Faserwirkung auf Textilien
bevorzugt in Waschmitteln eingesetzt. Die jeweiligen Hydrolyseprodukte werden von den
übrigen Wasch- oder Reinigungsmittel-Bestandteilen angegriffen, gelöst, emulgiert oder
suspendiert oder aufgrund ihrer höheren Löslichkeit mit der Waschflotte ausgeschwemmt,
so daß es zu Synergieeffekten zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen
kommt.
Aufgrund ihrer geringen Substratspezifität, ihres günstigen pH-Optimums und ihrer
Stabilität gegenüber Tensiden werden als Proteasen für Wasch- und Reinigungsmittel
bevorzugt die alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ verwendet. Ihrer industriellen
Produktion kommen ihre vergleichsweise leichte Gewinnbarkeit durch Fermentation der
natürlichen Produzenten oder transgener Expressionsstämme und, da es sich um
sekretierte Proteine handelt, ihre Aufreinigung aus dem Kulturmedium entgegen.
Die wichtigsten derzeit in Waschmitteln verwendeten Subtilisin-Proteasen sind folgende
natürliche Moleküle, sowie die von diesen Wildtyp-Enzymen durch Mutagenese
abgeleiteten Varianten:
- - die Subtilisine 147 und 309 der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (WO 89/06279; Subtilisin 147 ist die Esperase®; Subtilisin 309 ist die Savinase®);
- - die Protease 164-A1 der Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, und Vista Chemical Company, Austin, TX, USA (WO 93/07276);
- - die Protease PB92 der Fa. Gist-Brocades, Delft, Niederlande, beziehungsweise der Fa. Genencor International Inc., Rochester, New York, USA (EP 328 229; Handelsname Maxacal®);
- - die Protease K-16 der Fa. Kao Corp., Tokyo, Japan, (US 5344770);
- - Subtilisin BPN' von Bacillus amyloliquefaciens;
- - Subtilisin Carlsberg von Bacillus licheniformis und
- - die Alkalische Protease aus Bacillus lentus der Henkel Research Corp., Santa Rosa, Kalifornien, USA (US 5352604), beziehungsweise von der Henkel KGaA (WO 92/21760).
Sie können wie folgt charakterisiert werden:
Die Subtilisine 147 und 309 und die von diesen durch weitere Punktmutationen abgeleiteten Enzyme werden in der Anmeldung WO 89/06279 offenbart. Gegenüber den Ausgangsmolekülen zeichnen sich die Punktmutanten durch erhöhte Oxidationsstbilität, erhöhte Aktivität und höhere Waschleistung aus.
Die Subtilisine 147 und 309 und die von diesen durch weitere Punktmutationen abgeleiteten Enzyme werden in der Anmeldung WO 89/06279 offenbart. Gegenüber den Ausgangsmolekülen zeichnen sich die Punktmutanten durch erhöhte Oxidationsstbilität, erhöhte Aktivität und höhere Waschleistung aus.
Die mit der Anmeldung WO 93/07276 beanspruchte Protease 164-A1 ist über eine
Anreicherungskultur für Mikroorganismen aus einem alkalischen Habitat erhalten worden,
die zusätzlich in Gegenwart von Tensiden und Bleichmitteln wachsen. Es handelt sich
also um eine Protease aus einem natürlichen Organismus, aus Bacillus spec., Stamm
164-A1, mit entsprechend geringerer Empfindlichkeit gegenüber denaturierenden
Bedingungen.
Von Subtilisin 309 unterscheidet sich die nach dem produzierenden Bakterienstamm
Bacillus nov. spec. 92 benannte Protease PB92 (oder Maxacal®; EP 0328229) in lediglich
einer Aminosäure an der Position 87. Mit der genannten Anmeldung werden von der
Protease PB92 weiter abgeleitete Punktmutanten offenbart.
Die Protease K-16 (US 5344770) stammt, ähnlich wie die Protease 164-A1, aus einem
Screening nach Mikroorganismen, welche unter dem Einwirken oberflächenaktiver Stoffe
noch lebensfähig sind. Sie wird gebildet von einer mit Bacillus subtilis verwandten Art,
genannt Bacillus sp. ferm. BP-3376.
Subtilisin BPN', welches aus Bacillus amyloliquefaciens stammt, wird in den Arbeiten von
Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol. Vol. 159, S. 811-819 und von J. A. Wells et at.
(1983) in Nucleic Acids Research, Vol. 11, S. 7911-7925 behandelt.
Die Protease Carlsberg wird in der Publikation von E. L. Smith et al. von 1968 in J. Biol.
Chem., Vol. 243, S. 2184-2191 vorgestellt; Varianten davon sind beispielsweise aus der
Anmeldung WO 96/28566 bekannt.
Auch die Alkalische Protease der Anmeldungen US 5352604 und WO 92/21760 ist
mikrobiellen Ursprungs. Sie stammt ursprünglich aus einem durch eine gezielte Suche
gefundenen Bacillus lentus. Sie wird, gemäß der genannten Anmeldung, aber effektiver
von einem entsprechend transformierten Bacillus licheniformis produziert.
Grundsätzlich ist man bei industriell verwendbaren Enzymen nicht auf die jeweiligen
Originalstämme als Produzenten angewiesen. Die zugehörigen Gene können über
gentechnische Methoden auf andere Bakterienstämme übertragen werden. Dafür eigenen
sich besonders solche, die sich durch eine hohe Produktions- und/oder Sekretionsrate
auszeichnen. Beispiele dafür befinden sind in den Anmeldungen EP 130 756 und
US 5352604.
Obgleich sie von verschiedenen Organismen gebildet werden, zeigen die Subtilisin-
Proteasen ausgesprochen hohe Homologien zueinander. In Abhängigkeit von ihrer
jeweiligen Aminosäuresequenz, Ladungsverteilung, hydrophoben und ionischen
Wechselwirkungen weisen bereits die natürlich vorkommenden Proteasen signifikante
Unterschiede auf. Diese bestehen beispielsweise in Aktivitäts- und
Spezifitätsunterschieden, etwa hinsichtlich ihrer pH- oder Temperatur-Optima, und
Stabilitätsunterschiede, hinsichtlich der Langzeitlagerung und der Verträglichkeit oder der
Synergie mit anderen Verbindungen, etwa in Wasch- oder Reinigungslösungen.
Insbesondere auf der Suche nach geeigneten Wasch- und Reinigungsmittelzusammen
setzungen ist es daher erforderlich, auf einen Grundstock an verschiedenen ähnlich
wirkenden, aber spezifische Eigenheiten aufweisenden Proteinen zurückgreifen zu kön
nen. Somit stellt auch jede neue Protease eine Bereicherung des Stands der Technik dar.
Ein parallel zur Suche nach neuen, natürlicherweise gebildeten Enzymen
eingeschlagener Weg ist die Modifikation bekannter Enzyme, um sie hinsichtlich
spezieller Anwendungsprofile, so etwa als aktive Komponenten in Wasch- oder
Reinigungsmitteln zu verbessern. Zu den angestrebten Zielen gehören beispielsweise die
Erhöhung ihrer Stabilität gegenüber dem Einfluß der verschiedenen Wasch- und
Reinigungsmittel-Bestandteile, wie denaturierende Tenside oder Proteasen, Erhöhung
ihrer Oxidations-Stabilität, Anpassung des pH- oder Temperatur-Optimums oder Senkung
der allergenen Wirkung. Hierzu werden an sich bekannte Methoden, vor allem
rekombinante DNA-Technologien angewendet, wie beispielsweise in den Anmeldungen
EP 130 756 und EP 251 446 für die Variationen des Subtilisins aus Bacillus
amyloliquefaciens offenbart wird. Beispiele für optimierte natürliche Enzyme sind die
bereits oben erwähnten punktmutierten Subtilisin-Moleküle. Darüberhinaus offenbaren
beispielsweise die Anmeldungen WO 95/10591, WO 98/20116 und EP 0 405901 Wasch-
und Reinigungsmittelzusammensetzungen mit punktmutierten Subtilisin-Proteasen und
WO 99/49057 solche mit Deletions- und Substitutionsmutationen.
Zur Optimierung der enzymatischen Eigenschaften sind auch chemische Modifikations
reaktionen bekannt, wie beispielsweise in der Anmeldung DE 40 13 142 für alle Arten von
Enzymen beschrieben worden ist.
Derartige Modifikationen sind jedoch nur jeweils auf die bekannten Enzyme,
beziehungsweise deren Gene anwendbar. Somit stellt das Auffinden neuer Enzyme mit
charakteristischen, a priori vorhandenen Eigenschaften eine immer wieder aktuelle
Aufgabe dar, insbesondere zur Optimierung von enzymhaltigen Wasch- oder
Reinigungsmitteln.
Der vorliegenden Erfindung lag also die Aufgabe zugrunde, eine weitere, noch nicht
bekannte Protease aufzufinden, die sich insbesondere für die Verwendung in Wasch- und
Reinigungsmitteln eignet. Das Wildtyp-Enzym sollte sich dadurch auszeichnen, daß es bei
Verwendung in einem entprechenden Mittel den für diesen Zweck etablierten Enzymen in
der Waschleistung zumindest nahekommt.
Als Lösung dieser Aufgabe wurde überraschenderweise festgestellt, daß der bei der
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der Nummer
DSM 11233 hinterlegte Stamm von Bacillus alcalophilus eine Alkalische Protease vom
Subtilisin-Typ sekretiert, die in ihrer primären Waschleistung den bekannten
Waschmittelproteasen mindestens gleichwertig, im Einzelfall sogar überlegen ist. Die für
dieses Enzym natürlicherweise codierende Nukleotidsequenz wird im Sequenzprotokoll
unter der SEQ ID NO. 1 angegeben; deren natürliche Aminosäuresequenz wird im
Sequenzprotokoll unter der SEQ ID NO. 2 angegeben. Diese unterscheidet sich von der
des Subtilisins 309 (Savinase®), welches aufgrund der Aminosäuresequenz als die
nächstähnliche Protease angesehen werden muß, in den drei Aminosäure-Positionen
230, 256 und 259 gemäß der Zählung der Protease Subtilisin BPN' aus Bacillus
amyloliquefaciens, beziehungsweise in den Positionen 224, 250 und 253 nach seiner
eigenen Zählung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Subtilisin-Proteasen, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß sie an der Position, die zu der Position 230 des Subtilisins BPN'
aus B. amyloliquefaciens homolog ist, den Aminosäurerest Valin aufweisen und an der
Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog
ist, Glycin aufweisen und an der Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus
B. amyloliquefaciens homolog ist, Asparagin aufweisen.
Diesem Erfindungsgegenstand werden Subtilisin-Proteasen zugeordnet, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß sich an der Position, die zu der Position 230 des Subtilisins
BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit
Ausnahme von Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Serin und Valin oder keine
Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der
Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog
ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin,
Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Prolin, Serin, Threonin und Tyrosin oder keine
Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der
Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog
ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin,
Asparaginsäure, Cystein, Isoleucin, Leucin, Lysin, Prolin, Serin und Threonin, oder keine
Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet.
Diesem Erfindungsgegenstand werden Subtilisin-Proteasen zugeordnet, deren
Aminosäuresequenz in mindestens 262, 263 264 265 266 oder 267 Positionen mit der in
SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine,
vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind. Ebenso werden ihm Subtilisin-Proteasen zugeordnet, deren Aminosäuresequenz in
mindestens 268 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz
übereinstimmt, worunter zwei, vorzugsweise drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind.
Diesem Erfindungsgegenstand werden Subtilisin-Proteasen zugeordnet, deren
Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz
übereinstimmt, insbesondere in den für die proteolytische Aktivität verantwortlichen
Bereichen.
Diesem Erfindungsgegenstand werden proteolytische Enzyme zugeordnet, die in
wenigstens einer, vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der antigenen
Determinanten, die die Positionen 224, 250 oder 253 umfassen, mit dem in SEQ ID NO. 2
bezeichneten Protein übereinstimmen.
Diesem Erfindungsgegenstand werden proteolytisch aktive Deletions-, Insertions- oder
Substitutionsvarianten oder proteolytisch aktive Fragmente eines der zuvor bezeichneten
Proteine zugeordnet, insbesondere solche Fragmente oder solche Varianten, bei denen
eine, vorzugsweise zwei, und ganz besonders bevorzugt drei der die Positionen 224, 250
und 253 in der SEQ ID NO. 2 umfassenden Sequenzbereiche in einer Größe von 20,
vorzugsweise 10, ganz besonders bevorzugt 5 Aminosäuren enthalten sind.
Diesem Erfindungsgegenstand werden auch die zuvor bezeichneten proteolytischen
Enzyme oder Fragmente zugeordnet, wenn sie zusätzlich derivatisiert sind.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands stellen proteolytische
Enzyme, Fragmente oder Derivate dar, die natürlicherweise von biologischen
Organismen, vorzugsweise von Mikroorganismen gebildet werden, besonders bevorzugt
von gram-positiven Bakterien, ganz besonders bevorzugt von solchen der Gattung
Bacillus und hierunter insbesondere von solchen der Spezies Bacillus alcalophilus
(DSM 11233).
Ein zweiter Erfindungsgegenstand sind Nukleinsäuren, die für eines der Proteine des
ersten Erfindungsgegenstand codieren. Diesem Erfindungsgegenstand werden für
Subtilisin-Proteasen codierende Nukleinsäuren zugeordnet, deren Nukleotidsequenz mit
der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz übereinstimmt, insbesondere in den
für die proteolytische Aktivität des abgeleiteten Enzyms verantwortlichen Bereichen.
Ein dritter Erfindungsgegenstand sind Vektoren, die einen im zweiten
Erfindungsgegenstand bezeichneten Nukleinsäurebereich enthalten und insbesondere
einen Nukleinsäurebereich enthalten, der für eines der zum ersten Erfindungsgegenstand
gehörenden Proteine oder Derivate codiert. Diesem Erfindungsgegenstand werden als
bevorzugte Ausführungsformen Klonierungs- und Expressionsvektoren zugeordnet, die
einen zum zweiten Erfindungsgegenstand gehörenden Nukleinsäurebereich enthalten und
insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthalten, der für eines der zum ersten
Erfindungsgegenstand gehörenden Proteine oder Derivate codiert.
Ein vierter Erfindungsgegenstand sind Zellen, die einen Vektor nach dem dritten
Erfindungsgegenstand enthalten, insbesondere Wirtszellen, die Proteine oder Derivate
des ersten Erfindungsgegenstands exprimieren oder zu deren Expression angeregt
werden können, insbesondere unter Einsatz eines Expressionsvektors dieses
Erfindungsgegenstands. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands
stellen als Wirtszellen Bakterien dar, insbesondere solche, die das gebildete Protein ins
umgebende Medium sekretieren. Weiter bevorzugte Ausführungsformen stellen Bakterien
der Gattung Bacillus, insbesondere der Species Bacillus licheniformis, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus dar. Weitere bevorzugte
Ausführungsformen stellen eukaryontische Zellen dar, insbesondere solche, die das
gebildete Protein posttranslational modifizieren.
Ein fünfter Erfindungsgegenstand sind Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen
Enzyms oder Derivats nach dem ersten Erfindungsgegenstand unter Verwendung einer
Zelle, die dieses natürlicherweise bildet, insbesondere eine im ersten Erfindungs
gegenstand benannte Zelle, oder unter Verwendung einer Wirtszelle gemäß dem vierten
Erfindungsgegenstand und/oder unter Verwendung eines Vektors gemäß dem dritten
Erfindungsgegenstand und/oder unter Verwendung einer Nukleinsäure gemäß dem
zweiten Erfindungsgegenstand.
Ein sechster Erfindungsgegenstand sind Wasch- oder Reinigungsmittel, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß sie ein proteolytisches Enzym nach dem ersten
Erfindungsgegenstand enthalten. Bevorzugte Ausführungsformen dieses
Erfindungsgegenstands sind solche Mittel, die zusätzlich weitere Enzyme, insbesondere
andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen und/oder Lipasen enthalten.
Ein siebter Erfindungsgegenstand sind Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder
zur Textilpflege, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie allein oder neben anderen
aktiven Inhaltsstoffen ein proteolytisches Enzym nach dem ersten Erfindungsgegenstand
enthalten, insbesondere für natürliche Fasern und ganz besonders für Wolle oder Seide.
Ein achter Erfindungsgegenstand sind Verfahren zur maschinellen Reinigung von
Textilien oder von harten Oberflächen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in
wenigstens einem der Verfahrensschritte ein proteolytisches Enzym nach dem ersten
Erfindungsgegenstand aktiv wird, vorzugsweise in einer Menge von 0,35 mg bis
2 000 mg, besonders bevorzugt von 3 mg bis 1 500 mg pro Anwendung.
Ein neunter Erfindungsgegenstand sind Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen
oder zur Textilpflege, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der
Verfahrensschritte ein proteolytisches Enzym nach dem ersten Erfindungsgegenstand
aktiv wird, insbesondere für Wolle oder Seide.
Ein zehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms
nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Reinigung von Textilien oder von harten
Oberflächen.
Ein elfter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach
dem ersten Erfindungsgegenstand zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen
von Wasch- oder Reinigungsmitteln.
Ein zwölfter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms
nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur biochemischen oder molekularbiologischen
Analyse, insbesondere im Rahmen eines enzymatischen Analyseverfahrens, besonders
zur Endgruppenbestimmung und darunter ganz besonders im Rahmen einer
Sequenzanalyse.
Ein dreizehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms
nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Präparation, Reinigung oder Synthese von
Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen.
Ein vierzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms
nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Synthese von niedermolekularen
Verbindungen oder von Proteinen.
Ein fünfzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms
nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen,
insbesondere zur Oberflächenbehandlung und ganz besonders in einem Verfahren zur
Behandlung von Leder.
Ein sechzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms
nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Gewinnung oder Behandlung von
Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum
Entfernen von Schutzschichten auf Geweben, besonders bevorzugt zur Behandlung von
Textilrohstoffen oder zur Textilpflege und ganz besonders bevorzugt zur
Oberflächenbehandlung von Wolle oder Seide.
Ein siebzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms
nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Behandlung von photographischen Filmen,
insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten.
Ein achtzehnter Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines proteolytischen Enzyms
nach dem ersten Erfindungsgegenstand zur Herstellung von Lebensmitteln oder von
Futtermitteln.
Ein neunzehnter Erfindungsgegenstand sind Kosmetika mit einem proteolytischen Enzym
nach dem ersten Erfindungsgegenstand oder kosmetische Verfahren unter Einbeziehung
eines solchen proteolytischen Enzyms oder die Verwendung eines solchen
proteolytischen Enzyms zu kosmetischen Zwecken, insbesondere im Rahmen
entsprechender Verfahren oder in entsprechenden Mitteln.
Unter einem Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen
Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner
Funktion zumeist dreidimensionale Struktur annehmendes Polymer zu verstehen. In
Tabelle 1 sind die 19 proteinogenen, natürlich vorkommenden L-Aminosäuren
zusammengestellt, zusammen mit den 1- und 3-Buchstaben-Codes, mit denen sie auch in
der vorliegenden Anmeldung abgekürzt werden.
Die Kombination einer dieser Bezeichnungen mit einer Nummer bezeichnet für das
jeweilige Protein, welchen Aminosäure-Rest es in der jeweiligen Position trägt. So steht
V224, beispielsweise für einen Valin-Rest in der Position 224, beginnend mit der Zählung
am N-Terminus des betreffenden Proteins. Eine Punktmutation an dieser Stelle,
beispielsweise gegen die Aminosäure Alanin würde gemäß dieser Nomenklatur mit der
Bezeichnung V224A abgekürzt.
Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen,
das eine bestimmte biochemische Funktion ausübt. Unter proteolytischen Enzymen oder
Enzymen mit proteolytischer Funktion sind solche zu verstehen, die die
Säureamidbindungen von Proteinen hydrolysieren, insbesondere solche, die im Inneren
der Proteine liegen, und deshalb auch als endo-Peptidasen bezeichnet werden können.
Subtilisin-Proteasen sind solche endo-Peptidasen, die natürlicherweise von gram
positiven Bakterien gebildet und zumeist sekretiert werden, oder von diesen,
beispielsweise über molekularbiologische Methoden abgeleitet sind und sich über
Teilbereiche, wie strukturbildende oder funktionstragende Regionen mit den natürlichen
Subtilisin-Proteasen homologisieren lassen. Sie werden beispielsweise in dem Artikel
"Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enyzmes",
herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996, dargestellt.
Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem
Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen,
dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus
der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder
dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter
natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so
daß dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N-
terminalen Aminosäuren ausübt.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus
Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für
die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als
Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als
Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die
Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für
die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer
exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle
ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.
Die einem Protein entsprechende Informationseinheit wird auch im Sinne der
vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet.
Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte
molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen
bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions- oder
Insertionsmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die
von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So
führen beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen zu deletions
insertions- oder substitutionsmutierten Genen und auf Proteinebene zu entsprechenden
Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren
bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein
interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zelllinie
über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom übrigen Genom
unabhängig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind
insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare
genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen
Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit
dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion
erfülllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die
Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als
Expressionsvektoren bezeichnet.
Homologe oder ähnliche Bereiche von verschiedenen Proteinen sind solche mit
vergleichbaren Funktionen, die sich durch Identität oder konservierte Austausche in der
primären Aminosäuresequenz erkennen lassen. Sie umfassen einzelne Aminosäuren,
kleinste Bereiche, sogenannte Boxen, die wenige Aminosäuren lang sind und meist für
die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben, bis hin zu langen Bereichen in der
primären Aminosäuresequenz. Unter den Funktionen der homologen Bereiche, insbeson
dere der genannten Boxen sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten
Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasser
stoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.
Das Maß für die Homologie ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Prozentsatz an
Identität, wie er beispielsweise nach der von D. J. Lipman und W. R. Pearson in Science
227 (1985), S. 1435-1441 angegebenen Methode bestimmt werden kann. Die Homologie
kann auf das gesamte Protein bezogen sein oder auf den jeweils zuzuordnenden Bereich
mit entsprechender Funktion. Ein weiter gefaßter Homologie-Begriff bezieht auch
konservierte Variationen, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität in die
Betrachtung mit ein: so sind unter konservierten Austauschen solche zu verstehen, bei
denen beispielsweise eine aliphatische Aminosäure (Gly, Ala, Val, Leu, Ile) gegen eine
andere aliphatische Aminosäure ausgetauscht worden ist oder eine aromatische (Phe,
Tyr, Trp) gegen eine andere aromatische oder, allgemein formuliert, eine Aminosäure
gegen eine Aminosäure ausgetauscht ist, die, gegebenenfalls unter Berücksichtigung der
jeweiligen chemischen Umgebung innerhalb des Proteins, eine ähnliche chemische
Aktivität auszuüben vermag.
Homologie- oder Ähnlichkeitsangaben können sich sowohl auf die Aminosäuresequenz
als auch auf die Nukleotidsequenz beziehen. Für letztere entfällt allerdings der weiter
gefaßte Begriff an "konservierten" Austauschen und man spricht nur von dem Prozentsatz
an Identität. Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen
drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß
verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so daß eine
bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur
geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann. Außerdem
weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus
diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in
die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden.
Durch Vergleich mit bekannten Enzymen läßt sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-
Sequenz die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch
andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind,
qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die
Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität
betreffen.
Unter dem Begriff eines proteolytischen Enzyms oder dem einer Protease ist deshalb
über die Funktionen der wenigen Aminosäurereste des katalytisch aktiven Zentrums
hinaus alle Funktionen zu verstehen, wie sie sich durch das Einwirken des gesamten
übrigen Proteins oder eines Teils oder mehrerer Teile des übrigen Proteins auf die
eigentlich katalytisch aktiven Bereiche ergeben. Auch allein solche modifizierenden
Funktionen oder Teilaktivitäten werden, sofern sie eine Proteolyse-Reaktion unterstützen,
im Sinne der Erfindung als proteolytische Aktivität angesehen. Zu solchen Hilfsfunktionen
oder Teilaktivitäten gehören beispielsweise die Bindung eines Substrats, eines Zwischen-
oder Endprodukts, die Aktivierung oder die Inhibierung oder Vermittlung eines
regulierenden Einflusses auf die hydrolytische Aktivität. Dabei kann es sich beispielsweise
auch um die Ausbildung eines Strukturelements handeln, das fern vom aktiven Zentrum
liegt. Die zweite Voraussetzung dafür, daß es sich um ein erfindungsgemäßes Protein
handelt, ist allerdings, daß sich durch das chemische Verhalten der eigentlich aktiven
Reste allein oder zusätzlich durch das Einwirken der modifizierenden Teile eine Hydrolyse
von Peptid-Bindungen ergibt. Es ist darüberhinaus möglich, daß auch die Aktivitäten
anderer Proteasen durch einen oder mehrere Teile, beispielsweise des
erfindungsgemäßen Proteins qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Diese
Beeinflussung anderer Faktoren wird als proteolytische Aktivität angesehen. Proteolytisch
aktive Enzyme sind auch solche, deren Aktivität zu einem gegebenen Zeitpunkt, etwa
duch einen Inhibitor blockiert ist. Entscheidend ist ihre prinzipielle Eignung zur
entsprechenden Proteolyse-Reaktion.
Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als
natürliche Proteine oder solche, die vollständig translatierten Genen entsprechen, und
beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer
Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet
werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische
Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines
Substrats.
Den Fragmenten prinzipiell gleichartig, sind Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen;
sie zeichnen sich diesen gegenüber jedoch dadurch aus, daß ihnen eher kurze Bereiche,
und damit nur einzelne Teilfunktionen fehlen.
Unter chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung
solche Proteine zu verstehen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die
natürlicherweise von verschiedenen Polypeptidketten aus demselben Organismus oder
aus verschiedenen Organismen stammen. Dieses Vorgehen wird auch Shuffling-
Mutagenese genannt. Der Sinn einer solchen Fusion kann beispielsweise darin bestehen,
mithilfe des heranfusionierten erfindungsgemäßen Proteinteils eine enzymatische
Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden
Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen
Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf welche sich unterschiedliche
Funktionen verteilen können. Zur Realisierung der letztgenannten Alternative ist es
beispielsweise möglich, posttranslational oder erst nach einem Aufreinigungsschritt durch
eine gezielte proteolytische Spaltung eine einzelne chimäre Polypeptidkette in mehrere zu
zerlegen.
Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteinen sind solche Varianten zu verstehen,
die über an sich bekannte Methoden durch Einfügen eines Nukleinsäure-,
beziehungsweise Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie
sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den chimären Proteinen zuzuordnen. Sie
unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten
Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist
der Anteil an Fremdprotein geringer als in chimären Proteinen.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform
sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von
der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener
Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als
Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine
verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche
Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der
Proteinbiosynthese durch den Wirtsorganismus erfolgen. Hierfür können technisch
molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Sie können aber auch chemisch
durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer
Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei
solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln,
die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße
Proteine gebunden werden. Derartige Modifikationen können beispielsweise die
Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine
vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei
der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den
Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente und
Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter
dem Oberbegriff Proteine zusammengefaßt.
Durch Isolierung aus dem Kulturüberstand (Beispiele 1 und 2) von Bacillus alcalophilus
spec. DSM 11233 konnte ein erfindungsgemäßes Enzym einer besonders bevorzugten
Ausführungsform gewonnen werden. Dieser Stamm ist gemäß dem Budapester Vertrag
über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen vom 28. April
1977 am 17.10.1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH in Braunschweig (DSMZ) hinterlegt worden. Er trägt dort die Bezeichnung PEC30
- ID 96-877 und die Eingangsnummer DSM 11233. Die maßgeblichen Angaben über die
Merkmale dieses biologischen Materials, wie sie von der DSMZ am 17.3.1997 bei der
Hinterlegung bestimmt worden sind, werden in folgender Tabelle 2 zusammengestellt.
Wie über diese Charakterisierung hinaus nun überraschenderweise festgestellt werden
konnte, sekretiert dieser Stamm eine proteolytische Aktivität, die in den Ausführungs
beispielen der vorliegenden Anmeldung untersucht worden ist und sich folgendermaßen
biochemisch umreißen läßt: Es handelt sich um ein 27 kD-Protein, mit einem
isoelektrischen Punkt oberhalb von 10 (Beispiel 4). Die maximale proteolytische Aktivität
liegt bei 15minütiger Inkubation bei pH 11,5 und 50°C; als kinetische Parameter wurden
mit dem Substrat AAPF-pNA für KM der Wert 0,67 mM, für Vmax ein Wert von 9,2 µmol/(ml.min)
und für Kcat ein Wert von 138 s-1 ermittelt; das Temperaturoptimum liegt bei
50°C und das pH-Optimum bei 11,5 (Beispiel 5).
Das Gen für dieses Protein ist nach Standard-Methoden, nämlich über PCR mit
Consunsus-Primern und Klonierung der PCR-Produkte isoliert und anschließend
sequenziert worden (Beispiel 1). Auf diesen Ergebnissen beruhen die im
Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 angegeben
Nukleotid-, beziehungsweise Aminosäuresequenzen.
Auf Aminosäure-Ebene muß Subtilisin 309 (Savinase®) als die nächstähnliche Protease
angesehen werden. Von dessen Aminosäuresequenz unterscheidet sich das von Bacillus
alcalophilus (DSM 11233) gebildete erfindungsgemäße Protein in den drei Aminosäure-
Positionen 230, 256 und 259 in der Zählung der Protease Subtilisin BPN' aus Bacillus
amyloliquefaciens. Dies sind in der Zählung nach SEQ ID NO. 1 die Positionen 224, 250
und 253 der Subtilisin-Protease aus B. alcalophilus (DSM 11233).
Diese drei Positionen können zur Beschreibung aller erfindungsgemäßen Proteasen
herangezogen werden. Sie stellen gewissermaßen einen Fingerabdruck oder jeweilige
Fingerprint-Bereiche für alle erfindungsgemäßen Enzyme dar.
In der Position 224 der erfindungsgemäßen Protease aus Bacillus alcalophilus
(DSM 11233) befindet sich Valin; in der Position 250 befindet sich Glycin; und in der
Position 253 befindet sich Asparagin. Subtilisin 309, beispielsweise, besitzt in diesen drei
Positionen, wie aus den Alignments der Fig. 1 und 2 abgelesen werden kann, die
Aminosäuren Alanin (in Position 224), Serin (in Position 250), beziehungsweise erneut
Serin (in Position 253). BPN', beispielsweise, weist neben Abweichungen in anderen
Bereichen, in diesen drei Positionen die Aminosäuren Alanin, Lysin, beziehungsweise
Asparaginsäure auf. Anstelle des kleinen Methylrestes der Aminosäure Alanin, wie er in
den beiden anderen genannten Proteasen an Position 224 liegt, liegt in dem Enzym von
B. alcalophilus (DSM 11233) der raumfüllendere Isopropylrest; der eine Hydroxyl-Gruppe
tragende, beziehungsweise stark basische Rest an der Position 250 der beiden anderen
Proteasen wird in dem Enzym aus B. alcalophilus (DSM 11233) lediglich durch ein Proton
eingenommen; und der eher neutrale, beziehungsweise saure Rest in Position 253 wird in
dem Enzym aus B. alcalophilus (DSM 11233) durch einen eher alkalischen Rest
eingenommen.
Man kann daraus folgern, daß zumindest in diesen Bereichen erfindungsgemäße
Proteasen von den beiden genannten strukturelle Unterschiede und/oder Unterschide
hinsichtlich der Oberflächenladung des Moleküls aufweisen. Solche Unterschiede können
- ohne einen biochemischen Mechanismus postulieren zu wollen - beispielsweise die
Wechselwirkung mit makromolekularen Substraten oder niedermolekularen Agentien
erheblich beeinflussen oder Unterschiede hinsichtlich der Ladungsverteilung oder
Stabilität der Gesamtmoleküle zur Folge haben. Beide Effekte könnten den jeweils
beabsichtigten Verwendungszwecken erfindunsgemäßer Enzyme zugutekommen.
Eine Ausführungsform des ersten Erfindungsgegenstands stellt somit jede Subtilisin-
Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie an der Position, die zu der Position
230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, den Aminosäurerest Valin
aufweist und an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B.
amyloliquefaciens homolog ist, Glycin aufweist und an der Position, die zu der Position
259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Asparagin aufweist.
Da der Einfluß dieser drei Positionen auf die Gesamtaktivität von Subtilisin-Proteasen
noch nicht systematisch untersucht ist, umfaßt der Erfindungsgedanke auch alle
Varianten von Subtilisin-Proteasen, die in diesen drei Positionen andere Aminosäuren
aufweisen, als die, die bisher beschrieben worden sind. Eine entsprechende
Zusammenstellung befindet sich beispielsweise in dem Artikel "Subtilases: Subtilisin-like
Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enyzmes", herausgegegeben von R.
Bott und C. Betzel, New York, 1996.
Diese Abgrenzung läßt sich somit folgendermaßen vornehmen: Eine weitere
Ausführungsform des ersten Erfindungsgegenstands stellt somit jede Subtilisin-Protease
dar, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sich an der Position, die zu der Position 230 des
Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure
mit Ausnahme von Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Serin und Valin oder keine
Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der
Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog
ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin,
Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Prolin, Serin, Threonin und Tyrosin oder keine
Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet, und/oder sich an der
Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog
ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Arginin, Asparagin,
Asparaginsäure, Cystein, Isoleucin, Leucin, Lysin, Prolin, Serin und Threonin, oder keine
Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet.
Dabei sind Folgen von 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 und 2
Aminosäuren Länge zunehmend bevorzugt. Da sich die Substitution der genannten
Aminosäuren durch Folgen von mehr als 20 Aminosäuren wahrscheinlich in so
erheblicher Weise auf Sekundär- und Tertiärstrukturen der betreffenden Proteine
auswirken, daß die proteolytische Funktion insgesamt beeinträchtigt sein dürfte, können
größere Insertionen nicht mehr in diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
aufgenommen werden.
Zu der gefundenen Protease aus B. alcalophilus (DSM 11233), deren
Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. 2 angegeben ist, kann nach Subtilisin 309
(Savinase®) die Protease aus Bacillus lentus (BLAP) als die nächstähnliche Protease
angesehen werden. Von dieser unterscheidet sich die Sequenz des Enzyms aus B.
alcalophilus (DSM 11233) in den acht Positionen 99, 101, 103, 104, 163, 230, 256 und
259 in der Zählung der Protease Subtilisin BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens,
beziehungsweise in den Positionen 97, 99, 101, 102, 157, 224, 250 und 253 in der
Zählung nach SEQ ID NO. 2. Dies kann beispielsweise auch anhand der Fig. 1 und 2
nachvollzogen werden.
Somit fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung alle Subtilisin-Proteasen,
deren Aminosäuresequenz in mindestens 262 und jeweils zunehmend bevorzugt in
mindestens 263, 264, 265, 266 und 267 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen
Aminosäuresequenz übereinstimmen, worunter eine, vorzugsweise zwei, besonders
bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind. Denn jede dieser drei
Positionen ist für die erfindungsgemäße Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233)
charakteristisch. So weisen, wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt, die Proteasen BLAP,
Savinase® und BPN' an der Position 224 den Aminosäure-Rest Alanin, an der Position
250 die Reste Serin, beziehungsweise Lysin und an der Position 253 die Reste Serin,
beziehungsweise Asparaginsäure auf.
Darüber hinaus bevorzugt sind solche Subtilisin-Proteasen, deren Aminosäuresequenz in
mindestens 268 Positionen mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz
übereinstimmt, worunter zwei, vorzugsweise drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind.
Ganz besonders bevorzugt sind darüberhinaus Subtilisin-Proteasen, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß ihre Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NO.2
angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt. Dies gilt insbesondere für die Bereiche
des Enzyms, die für die proteolytische Aktivität verantwortlich sind.
Unterschiede in der Sekundär- oder Tertiärstruktur von Proteinen können experimentell
über Wechselwirkungen mit Antikörpern detektiert werden, denn deren Epitope sind auf
spezifische Wechselwirkungen mit passenden dreidimensionalen Strukturen hin
ausgebildet. Damit können Variationen in Proteinstrukturen erkannt werden, die bis auf
die Einflüsse einzelner Aminosäuren zurückzuführen sind. Die auf diesem Prinzip
beruhenden experimentellen Methoden sind im Stand der Technik etabliert und eignen
sich besonders, um erfindungsgemäße Proteine von nicht-erfindungsgemäßen zu
unterscheiden, und zwar insbesondere unter Bedingungen, in denen diese aktive
Konformationen, das heißt aktive dreidimensionale Strukturen annehmen. Die
erfindungsgemäßen Proteine einer Ausführungsform zeichnen sich über ihre
proteolytische Funktion hinaus dadurch aus, daß sie in wenigstens einer, vorzugsweise
zwei und besonders bevorzugt drei der antigenen Determinanten, die die Positionen 224,
250 oder 253 umfassen, mit dem in SEQ ID NO. 2 bezeichneten Protein übereinstimmen.
Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Methoden bekannt, um Gene zu mutieren
und auf diese Weise entsprechende Proteinvarianten zu erzeugen. Diese Techniken sind
auch auf erfindungsgemäße Proteine anwendbar, um sie hinsichtlich spezifischer
Anwendungen weiterzuentwicklen. Von besonderer Bedeutung sind dabei einzelne
Aminosäure-Austauche, sogenannte Punktmutationen. Entsprechende Varianten werden
innerhalb der oben bezeichneten Bereiche in den vorliegenden Erfindungsgegenstand
eingeschlossen.
Aber auch größere Bereiche erfindungsgemäßer Proteine können Mutationen unterworfen
werden. Dies kann dann vorteilhaft sein, wenn bestimmte Teilaktivitäten ausgeschlossen,
verstärkt oder mit anderen Funktionen verknüpft werden sollen. Ausführungsformen der
vorliegenden Erfindung stellen somit proteolytisch aktive Deletions-, Insertions- oder
Substitutionsvarianten oder proteolytisch aktive Fragmente der zuvor bezeichneten
Proteine dar. Dies gilt insbesondere für solche Varianten, bei denen ein, vorzugsweise
zwei, und besonders bevorzugt drei der die Positionen 224, 250 und 253 nach SEQ ID
NO. 2 umfassenden Bereiche enthalten sind. Denn diese verleihen den jeweiligen
Varianten ihre erfindungsspezifischen Eigenschaften. Diese Sequenzbereiche besitzen
zunehmend bevorzugt jeweils Größen von 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8,
7, 6, 5, 4, 3 oder 2 Aminosäuren.
Die zuvor bezeichneten Proteine können beispielsweise durch Kopplung nieder- oder
höher-molekularer chemischer Verbindungen oder durch chemische Modifikationen, wie
sie beispielsweise in der Anmeldung DE 40 13 142 beschrieben sind, für ihren jeweiligen
Anwendungszweck optimiert werden. Es können auch Modifikationen vorgenommen
werden, die natürlicherweise von verschiedenen Organismen im Zusammenhang mit der
Proteinbiosynthese durchgeführt werden, wie beispielsweise die Bindung eines
Fettsäurerestes nahe des N-Terminus. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
stellen somit proteolytische Enzyme oder Fragmente dar, die zusätzlich derivatisiert sind.
Im Zusammenhang mit dem Einsatz erfindungsgemäßer Proteine in Wasch- oder
Reinigungsmitteln ist beispielsweise die Kopplung mit anderen waschaktiven Substanzen
oder Enzymen besonders sinnvoll. Vergleichbare Kopplungs-Ansätze werden
beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 00/18865 und WO 00/57155 für Cellulose-
Bindungsdomänen beschrieben.
Proteine, die zumindest eins der zuvor genannten Charakteristika aufweisen und aus
natürlichen Quellen stammen, sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung, insbesondere wenn sie aus Mikroorganismen stammen, besonders bevorzugt
aus gram-positiven Bakterien, ganz besonders bevorzugt aus gram-positiven Bakterien
der Gattung Bacillus; unter den Bacillus-Species ist Bacillus alcalophilus bevorzugt, und
darunter besonders der Stamm B. alcalophilus (DSM 11233). Denn aus diesem wurde die
Ausführungsform des erfindungsgemäßen Enzyms, deren zugehörige Sequenzen im
Sequenzprotokoll angegeben sind, ursprünglich erhalten.
Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation eines Proteins kann ein solches mit
diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der
produzierenden Mikroorganismen. So zeigen bereits Kulturüberstände von B. alcalophilus
(DSM 11233) eine proteolytische Aktivität, was zeigt, daß auch Rohextrakte proteolytische
Verwendung finden können, etwa zum Inaktivieren anderer proteinogener Aktivitäten.
Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten
anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle
Präparationen des eigentlichen erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig
davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität
entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, daß es bei der Lagerung keine oder
nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine proteolytische
Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise vom Faltungszustand des Proteins abhängig
sein oder aus der reversiblen Bindung eines oder mehrer Begleitstoffe aus der
Präparation an ein erfindungsgemäßes Protein.
Nukleinsäuren bilden den Ausgangspunkt nahezu aller gängigen molekularbiologischen
Untersuchungen und Weiterentwicklungen von Proteinen. Dazu gehören insbesondere
die Sequenzierung der Gene und die Ableitung der zugehörigen Aminosäure-Sequenz,
jede Art von Mutagenese und die Expression der Proteine. Solche Methoden sind
beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning:
a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989,
beschrieben.
Den zweiten Erfindungsgegenstand bilden somit Nukleinsäuren, die für die Proteine des
ersten Erfindungsgegenstands codieren. Diese zugehörigen Gene stellen gewissermaßen
die molekularbiologische Dimension der vorliegenden Erfindung dar.
Auf der Ebene der DNA können erfindungswesentlichen Enzyme über alle allgemein unter
dem Begriff "Protein Engineering" zusammengefaßten Methoden auf verschiedene
Anwendungen hin optimiert werden. Insbesondere können dadurch erreicht werden: eine
Verbesserung der Oxidationsbeständigkeit des abgeleiteten Proteins, der Stabilität
gegenüber denaturierenden Agentien oder Proteasen, gegenüber hohen Temperaturen,
sauren oder stark alkalischen Bedingungen, eine Veränderung der Sensitivität gegenüber
Calcium oder anderen Cofaktoren, eine Senkung der Immunogenität oder der allergenen
Wirkung.
Zu erfindungsgemäßen mutierten Genen gehören beispielsweise solche, die für einzelne,
gezielte Basenaustausche oder randomisierte Punktmutationen, für Deletionen einzelner
Basen oder von Teilsequenzen, Fusionen mit anderen Genen oder Genfragmenten oder
Inversionen verantwortlich sind. Derartige Mutationen oder Modifikationen können das
von den betreffenden Nukleinsäuren abgeleitete Enzym für spezifische Anwendungen
prädestinieren. Solch eine Mutagenese kann zielgerichtet oder über zufallsgemäße
Methoden, beispielsweise mit einem anschließenden auf die Aktivität gerichteten
Erkennungs- und/oder Auswahlverfahren (Screening und Selektion) an den klonierten
Genen durchgeführt werden. Die mutierten Gene unterliegen dem Schutzbereich der hier
beschriebenen Erfindung, wenn die von ihnen abgeleiteten Proteine innerhalb der oben
bezeichneten Ähnlichkeitsbereiche liegen. Dies gilt insbesondere für die Teilbereiche, die
einer der Aminosäure-Positionen 224, 250 oder 253 gemäß SEQ ID NO. 2 entsprechen.
Insbesondere bei den Nukleinsäuren, die für Proteinfragmente codieren, sind alle drei
Leseraster sowohl in sense- als auch in antisense-Orientierung zu berücksichtigen. Denn
solche Oligonukleotide können über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als
Ausgangspunkte zur Synthese verwandter Nukleinsäuren, z. B. aus anderen als den hier
offenbarten Organismen verwendet werden. Solche Oligonukleotide werden,
insbesondere, wenn sie einen der Bereiche überdecken, die den drei Aminosäure-
Positionen 224, 250 oder 253 entsprechen, ausdrücklich in den Schutzbereich der
vorliegenden Erfidung einbezogen. Das gilt auch für solche, die gerade in diesen
Positionen variable Sequenzen aufweisen, so daß innerhalb einer Population vieler
Primer auch mindestens einer vorliegen kann, der für solch eine Position für eine der SEQ
ID NO. 1 entsprechende Teilsequenz codiert. Das gleiche gilt für Antisense-
Oligonukleotide, die beispielsweise zur Expressions-Regulation eingesetzt werden
können.
Besonders bevorzugt sind für Subtilisin-Proteasen codierende Nukleinsäuren, deren
Nukleotidsequenz mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz
übereinstimmt. Dies gilt insbesondere für die für die proteolytische Aktivität des
abgeleiteten Enzyms verantwortlichen Bereiche.
Um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, werden sie geeigneterweise
in Vektoren ligiert. Dazu gehören beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen
Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische
Vektoren. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und
biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins. Einen
Erfindungsgegenstand der vorliegenden Erfindung stellen somit Vektoren dar, die die
oben bezeichneten Nukleinsäuremoleküle enthalten, insbesondere solche, die für die
oben bezeichneten proteolytischen Enzyme codieren.
Bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands sind Klonierungsvektoren.
Diese eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion
des interessierenden Gens für die molekularbiologische Charakterisierung des
betreffenden Gens. Gleichzeitig stellen sie transportierbare und lagerfähige Formen der
beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte für
molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise
die PCR oder In-vitro-Mutagenese-Verfahren. Bevorzugt sind solche Klonierungsvektoren,
die Nukleinsäurebereiche enthalten, die für die oben bezeichneten proteolytischen
Enzyme codieren.
Erfindungsgemäße Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die Nukleinsäuren des
zweiten Erfindungsgegenstands in biologischen Produktionssystemen zu realisieren und
damit die Proteine des ersten Erfindungsgegenstands zu produzieren. Bevorzugte
Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die
sämtliche zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise den
natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus
einem anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form einer
sogenannten Expressionskassete angeordnet sein. Bevorzugt sind solche
Expressionsvektoren, die Nukleinsäurebereiche enthalten, die für die oben bezeichneten
proteolytischen Enzyme codieren.
Eine weitere Umsetzungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung stellen Zellen dar, die
einen Vektor nach dem dritten Erfindungsgegenstand enthalten. Sie bilden somit die
mikrobiologische Dimension der vorliegenden Erfindung, indem sie beispielsweise die
Amplifikation der entsprechenden Gene, aber auch deren Mutagenese oder Transkription
und Translation und letztlich die biotechnologische Produktion ermöglichen.
Eine Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands sind Wirtszellen, die eines der
erfindungsgemäßen Proteine exprimieren oder zu deren Expression angeregt werden
können. Sie ermöglichen damit deren biotechnologische Produktion. Sie müssen dafür
das betreffende Gen, geeigneterweise über einen Vektor, erhalten haben, das heißt
transformiert worden sein. Dieser Vektor kann in der Wirtszelle extrachromosomal als
eigenes genetisches Element vorliegen oder in ein Chromosom integriert sein. Vorzugs
weise handelt es sich dabei um einen der oben bezeichneten Expressionsvektoren.
Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten,
Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut
handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor
und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien.
Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und
biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit,
hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute
Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Häufig müssen aus der Fülle an
verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme die
optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden. Jedes
erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen
gewonnen werden.
Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund
entsprechender genetischer Elemente in ihrer Aktivität regulierbar sind, beispielsweise
durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, durch Änderung der
Kultivierungsbedingungen oder in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelldichte. Diese
kontrollierbare Expression ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der
interessierenden Proteine.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen bakterielle Wirtszellen dar, insbesondere
solche, die das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretieren. Denn Bakterien
zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die
Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert
werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl
von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Dies kann für spezielle
Anwendungen vorteilhaft sein. Gram-positive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli, geben
demgegenüber sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium
ab, aus welchem sich nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform die exprimierten
erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt Bacillus alcalophilus
(DSM 11233) selbst, um erfindungsgemäße Proteine (homolog) zu exprimieren.
Demgegenüber ist jedoch die heterologe Expression bevorzugt. Zu den für die heterologe
Expression bevorzugten Bakterien gehören solche der Gattung Bacillus, insbesondere
solche der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder
andere Species oder Stämme von Bacillus alcalophilus.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellen
eukaryontische Wirtszellen dar, insbesondere solche, die das gebildete Protein
posttranslational modifizieren. Beispiele für geeignete Eukaryonten sind Pilze wie
Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Zu den
Modifikationen, die derartige Systeme besonders im Zusammenhang mit der
Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer
Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccaride.
Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Herstellung eines
erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms oder Derivats dar. So können beispielsweise
die oben bezeichneten DNA- und Aminosäuresequenzen, wie sie beispielsweise aus dem
Sequenzprotokoll abgeleitet werden können, entsprechende Oligopeptide oder
Oligonukleotide synthetisiert werden.
Ebenso können aufgrund der in der vorliegenden Anmeldung in Tabelle 2 angegebenen
Stammeigenschaften von B. alcalophilus (DSM 11233) Methoden entwickelt werden, um
natürliche Produzenten solcher Enzyme zu detektieren und die entsprechenden Proteine
aus natürlichen, bislang noch nicht in dieser Hinsicht untersuchten Quellen zu isolieren.
Zunehmend bevorzugt handelt es sich bei bei diesen natürlichen Organismen um die
oben bereits bezeichneten Bakterienspecies. Solche Zellen können für entsprechende
Herstellungsverfahren kultiviert und eingesetzt werden.
Demgegenüber ist die Herstellung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms
oder Derivats mithilfe der oben bezeichneten transgenen Wirtszellen und/oder unter
Verwendung eines der oben bezeichneten Vektoren und/oder unter Verwendung einer der
oben bezeichneten Nukleinsäuren bevorzugt.
Denn diese Vektoren stellen bereits die zugehörige DNA in molekularbiologisch
verwendbarer Form zur Verfügung, und die benannten transgenen Organismen können
durch Etablieren geeigneter Bedingungen unmittelbar zur Produktion dieser Proteine
veranlaßt werden.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der
zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen
die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird.
Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert
werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes
erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an
Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren muß für jeden konkreten Einzelfall
experimentell ermittelt werden. Prinzipiell wird dabei folgendermaßen vorgegangen:
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren werden geeigneterweise in Form der DNA in einen
geeigneten Expressionsvektor ligiert. Dieser wird in die Wirtszelle transformiert,
beispielsweise in Zellen eines leicht zu kultivierenden Bakterienstammes, der die
Proteine, deren Gene unter der Kontrolle entsprechender genetischer Elemente stehen, in
das umgebende Nährmedium ausschleust; regulierende Elemente dafür können
beispielsweise vom Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden. Aus dem
umgebenden Medium kann das erfindungsgemäße Protein über mehrere
Aufreinigungsschritte, wie beispielsweise Fällungen oder Chromatographien, aufgreinigt
werden. Ein Fachmann ist in der Lage, ein System, welches im Labormaßstab
experimentell optimiert worden ist, auf einen großtechnischen Produktionsmaßstab zu
übertragen.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Waschmittel oder Reinigungsmittel dar, die
dadurch gekennzeichnet sind, daß sie zusätzlich ein erfindungsgemäßes Protein
enthalten.
Damit sind alle denkbaren Reinigungsmittelarten gemeint, sowohl Konzentrate, als auch
unverdünnt anzuwendende Mittel; zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der
Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören
beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der
vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören
beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle
Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan,
Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche
wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet.
Jegliche Reinigungsmittelart stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar,
sofern sie um ein erfindungsgemäßes Protein bereichert ist.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach den Stand der
Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der
erfindungsgemäßen Mittel. Dazu zählen beispielsweise feste, pulverförmige, flüssige,
gelförmige oder pastöse Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert
oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate,
Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt.
Neben einem erfindungswesentlichen Enzym enthält ein erfindungsgemäßes Mittel
gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie Tenside, z. B. nichtionische, anionische und/oder
amphotere Tenside, und/oder Bleichmittel, und/oder Builder, sowie gegebenenfalls
weitere übliche Inhaltsstoffe.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise
ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und
durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der
Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann,
beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie
sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch
Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-
Atomen, z. B. aus Kokos-, Palm-, Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8
EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören
beispielsweise C12-14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C9-11-Alkohol mit 7 EO, C13-15-Alkohole
mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C12-18-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und
Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C12-14-Alkohol mit 3 EO und C12-18-Alkohol
mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die
für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte
Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow range
ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch
Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Talgfettalkohol
mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO.
Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als
alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden
eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und
propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der
Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.
Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhafterweise eingesetzt
werden kann, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkypolyglycoside genügen
der allgemeinen Formel RO(G)z, in der R einen linearen oder verzweigten, insbesondere
in 2-Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8
bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine
Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der
Glycosylierungsgrad z liegt dabei zwischen 1,0 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1,0 und
2,0 und insbesondere zwischen 1,1 und 1,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare
Alkylpolyglucoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest
und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.
Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-
dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanol
amide können geeignet sein. Der Anteil dieser nichtionischen Tenside liegt vorzugsweise
nicht über dem der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere bei nicht mehr als der Hälfte
davon.
Weitere geeignete Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (II),
in der RCO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R1 für
Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für
einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und
3 bis 10 Hydroxylgruppen steht. Bei den Polyhydroxyfettsäureamiden handelt es sich um
bekannte Stoffe, die üblicherweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden
Zuckers mit Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Alkanolamin und nachfolgende
Acylierung mit einer Fettsäure, einem Fettsäurealkylester oder einem Fettsäurechlorid
erhalten werden können.
Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (III),
in der R für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12
Kohlenstoffatomen, R1 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder
einen Arylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R2 für einen linearen, verzweigten oder
cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8
Kohlenstoffatomen steht, wobei C1-4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind und [Z] für
einen linearen Polyhydroxyalkylrest steht, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydrox
ylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte
Derivate dieses Restes.
[Z] wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers erhalten,
beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose.
Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können beispielsweise durch
Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die
gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden.
Als anionische Tenside werden beispielsweise solche vom Typ der Sulfonate und Sulfate
eingesetzt. Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C9-13-
Alkylbenzolsulfonate, Olefinsulfonate, d. h. Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansul
fonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus C12-18-Monoolefinen mit end-
oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid
und anschließende alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in
Betracht. Geeignet sind auch Alkansulfonate, die aus C12-18-Alkanen beispielsweise durch
Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse beziehungsweise
Neutralisation gewonnen werden. Ebenso sind auch die Ester von α-Sulfofettsäuren
(Estersulfonate), z. B. die α-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern-
oder Talgfettsäuren geeignet.
Weitere geeignete Aniontenside sind sulfierte Fettsäureglycerinester. Unter
Fettsäureglycerinestern sind die Mono-, Di- und Triester sowie deren Gemische zu
verstehen, wie sie bei der Herstellung durch Veresterung von einem Monoglycerin mit 1
bis 3 Mol Fettsäure oder bei der Umesterung von Triglyceriden mit 0,3 bis 2 Mol Glycerin
erhalten werden. Bevorzugte sulfierte Fettsäureglycerinester sind dabei die Sulfierpro
dukte von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise der
Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure,
Stearinsäure oder Behensäure.
Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der
Schwefelsäurehalbester der C12-C18-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol,
Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der C10-C20-Oxoalkohole
und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin
bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen,
auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein
analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von
fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die C12-C16-Alkylsulfate
und C12-C15-Alkylsulfate sowie C14-C15-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind
geeignete Aniontenside.
Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten
geradkettigen oder verzweigten C7-21-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte C9-11-Alkohole mit
im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C12-18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind
geeignet. Sie werden in Reinigungsmitteln aufgrund ihres hohen Schaumverhaltens nur in
relativ geringen Mengen, beispielsweise in Mengen bis 5 Gew.-%, üblicherweise von 1 bis
5 Gew.-%, eingesetzt.
Weitere geeignete Aniontenside sind auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die
auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden und die
Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise
Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte
Sulfosuccinate enthalten C8-18-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen.
Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von
ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside dar
stellen (Beschreibung siehe unten). Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettal
kohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung
ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit
vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzu
setzen.
Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind
gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure,
Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen
Fettsäuren, z. B. Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.
Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium-
oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder
Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer
Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.
Die Tenside können in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln
insgesamt in einer Menge von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von
8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das fertige Mittel, enthalten sein.
Erfindungsgemäße Mittel können Bleichmittel enthalten. Unter den als Bleichmittel
dienenden, in Wasser H2O2 liefernden Verbindungen haben das Natriumpercarbonat, das
Natriumperborattetrahydrat und das Natriumperboratmonohydrat besondere Bedeutung.
Weitere brauchbare Bleichmittel sind beispielsweise Peroxopyrophosphate,
Citratperhydrate sowie H2O2 liefernde persaure Salze oder Persäuren, wie Persulfate
beziehungsweise Perschwefelsäure. Brauchbar ist auch das Harnstoffperoxohydrat
Percarbamid, das durch die Formel H2N-CO-NH2.H2O2 beschrieben werden kann.
Insbesondere beim Einsatz der Mittel für das Reinigen harter Oberflächen, zum Beispiel
beim maschinellen Geschirrspülen, können sie gewünschtenfalls auch Bleichmittel aus
der Gruppe der organischen Bleichmittel enthalten, obwohl deren Einsatz prinzipiell auch
bei Mitteln für die Textilwäsche möglich ist. Typische organische Bleichmittel sind die
Diacylperoxide, wie zum Beispiel Dibenzoylperoxid. Weitere typische organische
Bleichmittel sind die Peroxysäuren, wobei als Beispiele besonders die Alkylperoxysäuren
und die Arylperoxysäuren genannt werden. Bevorzugte Vertreter sind die
Peroxybenzoesäure und ihre ringsubstituierten Derivate, wie Alkylperoxybenzoesäuren;
aber auch Peroxy-α-Naphthoesäure und Magnesium-monoperphthalat, die aliphatischen
oder substituiert aliphatischen Peroxysäuren, wie Peroxylaurinsäure, Peroxystearinsäure,
c-Phthalimidoperoxycapronsäure (Phthalimidoperoxyhexansäure, PAP), o-Carboxybenz
amidoperoxycapronsäure, N-Nonenylamidoperadipinsäure und N-Nonenylamidoper
succinate, und aliphatische und araliphatische Peroxydicarbonsäuren, wie 1,12-
Diperoxycarbonsäure, 1,9-Diperoxyazelainsäure, Diperoxysebacinsäure, Diperoxybrassylsäure,
die Diperoxyphthalsäuren, 2-Decyldiperoxybutan-1,4-disäure, N,N-Terephthaloyl
di(6-aminopercapronsäure) können eingesetzt werden.
Der Gehalt der Mittel an Bleichmittel kann 1 bis 40 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%,
betragen, wobei vorteilhafterweise Perboratmonohydrat oder Percarbonat
eingesetzt wird. Eine synergistische Verwendung von Amylase mit Percarbonat oder von
Amylase mit Percarbonsäure wird mit den Anmeldungen WO 99/63036, beziehungsweise
WO 99/63037 offenbart.
Um beim Waschen bei Temperaturen von 60°C und darunter, und insbesondere bei der
Wäschevorbehandlung eine verbesserte Bleichwirkung zu erreichen, können die Mittel
auch Bleichaktivatoren enthalten. Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter
Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-
Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte
Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder
N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte
Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere
Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl-
2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glycolurile, insbesondere 1,3,4,6-
Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI),
acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat
(n- beziehungsweise iso-NOBS), acylierte Hydroxycarbonsäuren, wie Triethyl-O-
acetylcitrat (TEOC), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid,
Isatosäureanhydrid und/oder Bernsteinsäureanhydrid, Carbonsäureamide, wie N-
Methyldiacetamid, Glycolid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin,
Ethylenglycoldiacetat, Isopropenylacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und die aus den
deutschen Patentanmeldungen DE 196 16 693 und DE 196 16 767 bekannten Enolester
sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren in der europäischen
Patentanmeldung EP 0 525 239 beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zucker
derivate, insbesondere Pentaacetylglucose (PAG), Pentaacetylfructose, Tetraacetylxylose
und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin
beziehungsweise Gluconolacton, Triazol beziehungsweise Triazolderivate und/oder
teilchenförmige Caprolactame und/oder Caprolactamderivate, bevorzugt N-acylierte
Lactame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam und N-Acetylcaprolactam, die aus den
internationalen Patentanmeldungen WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103,
WO 95/00626, WO 95/14759 und WO 95/17498 bekannt sind. Die aus der deutschen Patentanmeldung
DE 196 16 769 bekannten hydrophil substituierten Acylacetale und die in
der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 770 sowie der internationalen Patentanmel
dung WO 95/14075 beschriebenen Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt.
Auch die aus der deutschen Patentanmeldung DE 44 43 177 bekannten Kombinationen
konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Ebenso können Nitrilderivate
wie Cyanopyridine, Nitrilquats, zum Beispiel N-Alkylammoniumacetonitrile, und/oder
Cyanamidderivate eingesetzt werden. Bevorzugte Bleichaktivatoren sind Natrium-4-
(octanoyloxy)-benzolsulfonat, n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n-
beziehungsweise iso-NOBS), Undecenoyloxybenzolsulfonat (UDOBS), Natrium
dodecanoyloxybenzolsulfonat (DOBS), Decanoyloxybenzoesäure (DOBA, OBC 10)
und/oder Dodecanoyloxybenzolsulfonat (OBS 12), sowie N-Methylmorpholinum-acetonitril
(MMA). Derartige Bleichaktivatoren können im üblichen Mengenbereich von 0,01 bis
20 Gew.-%, vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis
10 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, enthalten sein.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch
sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. Bei diesen Stoffen handelt es sich um
bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe
wie beispielsweise Mn-, Fe-, Co-, Ru- oder Mo-Salenkomplexe oder -carbonylkomplexe.
Auch Mn-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- und Cu-Komplexe mit N-haltigen Tripod-Liganden
sowie Co-, Fe-, Cu- und Ru-Amminkomplexe sind als Bleichkatalysatoren geeignet, wobei
solche Verbindungen bevorzugt eingesetzt werden, die in der DE 197 09 284 A1
beschrieben sind. Gemäß WO 99/63038 vermögen auch Acetonitril-Derivate und gemäß
WO 99/63041 bleichaktivierende Übergangsmetallkomplexverbindungen in Kombination
mit Amylasen eine bleichaktivierende Wirkung zu entfalten.
Erfindungsgemäße Mittel enthalten in der Regel einen oder mehrere Builder, insbesonde
re Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und - wo keine ökologischen Grün
de gegen ihren Einsatz sprechen - auch die Phosphate. Letztere sind insbesondere in
Reinigungsmitteln für das maschinelle Geschirrspülen bevorzugt einzusetzende Gerüst
stoffe.
Zu nennen sind hier kristalline, schichtförmige Natriumsilicate der allgemeinen Formel
NaMSixO2x+1.yH2O, wobei M Natrium oder Wasserstoff bedeutet, x eine Zahl von 1,6 bis 4,
vorzugsweise 1,9 bis 4,0 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2,3
oder 4 sind. Derartige kristalline Schichtsilicate werden beispielsweise in der
europäischen Patentanmeldung EP 0 164 514 beschrieben. Bevorzugte kristalline
Schichtsilicate der angegebenen Formel sind solche, in denen M für Natrium steht und x
die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl β- als auch δ-Natriumdisilicate
Na2Si2O5.yH2O bevorzugt. Im Handel befinden sich derartige Verbindungen
beispielsweise unter der Bezeichnung SKS® (Fa. Clariant). So handelt es sich bei SKS-6®
vorwiegend um ein δ-Natriumdisilicat mit der Formel Na2Si2O5.yH2O, bei SKS-7®
vorwiegend um das β-Natriumdisilicat. Durch Reaktion mit Säuren (z. B. Citronensäure
oder Kohlensäure) entsteht aus dem δ-Natriumdisilicat Kanemit NaHSi2O5.yH2O, im
Handel unter den Bezeichnungen SKS-9® beziehungsweise SKS-10® (Fa. Clariant). Von
Vorteil kann es auch sein, chemische Modifikationen dieser Schichtsilicate einzusetzen.
So kann beispielsweise die Alkalität der Schichtsilicate geeignet beeinflußt werden. Mit
Phosphat beziehungsweise mit Carbonat dotierte Schichtsilicate weisen im Vergleich zu
dem δ-Natriumdisilicat veränderte Kristallmorphologien auf, lösen sich schneller und
zeigen im Vergleich zu δ-Natriumdisilicat ein erhöhtes Calciumbindevermögen. So sind
Schichtsilicate der allgemeinen Summenformel xNa2O.ySiO2.zP2O5, in der das
Verhältnis x zu y einer Zahl 0,35 bis 0,6, das Verhältnis x zu z einer Zahl von 1,75 bis
1200 und das Verhältnis y zu z einer Zahl von 4 bis 2800 entsprechen, in der
Patentanmeldung DE 196 01 063 beschrieben. Die Löslichkeit der Schichtsilicate kann
auch erhöht werden, indem besonders feinteilige Schichtsilicate eingesetzt werden. Auch
Compounds aus den kristallinen Schichtsilicaten mit anderen Inhaltsstoffen können
eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere Compounds mit Cellulosederivaten, die
Vorteile in der desintegrierenden Wirkung aufweisen und insbesondere in
Waschmitteltabletten eingesetzt werden, sowie Compounds mit Polycarboxylaten, z. B.
Citronensäure, beziehungsweise polymeren Polycarboxylaten, z. B. Copolymeren der
Acrylsäure, zu nennen.
Einsetzbar sind auch amorphe Natriumsilikate mit einem Modul Na2O : SiO2 von 1 : 2 bis
1 : 3, 3, vorzugsweise von 1 : 2 bis 1 : 2,8 und insbesondere von 1 : 2 bis 1 : 2,6, welche
löseverzögert sind und Sekundärwascheigenschaften aufweisen. Die Löseverzögerung
gegenüber herkömmlichen amorphen Natriumsilikaten kann dabei auf verschiedene
Weise, beispielsweise durch Oberflächenbehandlung, Compoundierung, Kompaktierung/
Verdichtung oder durch Übertrocknung hervorgerufen worden sein. Im Rahmen dieser
Erfindung wird unter dem Begriff "amorph" auch "röntgenamorph" verstanden. Dies heißt,
daß die Silikate bei Röntgenbeugungsexperimenten keine scharfen Röntgenreflexe
liefern, wie sie für kristalline Substanzen typisch sind, sondern allenfalls ein oder mehrere
Maxima der gestreuten Röntgenstrahlung, die eine Breite von mehreren Gradeinheiten
des Beugungswinkels aufweisen. Es kann jedoch sehr wohl sogar zu besonders guten
Buildereigenschaften führen, wenn die Silikatpartikel bei Elektronenbeugungs
experimenten verwaschene oder sogar scharfe Beugungsmaxima liefern. Dies ist so zu
interpretieren, daß die Produkte mikrokristalline Bereiche der Größe 10 bis einige Hundert
nm aufweisen, wobei Werte bis max. 50 nm und insbesondere bis max. 20 nm bevorzugt
sind. Insbesondere bevorzugt sind verdichtete/kompaktierte amorphe Silikate,
compoundierte amorphe Silikate und übertrocknete röntgenamorphe Silikate.
Ein ggf. einsetzbarer, feinkristalliner, synthetischer und gebundenes Wasser enthaltender
Zeolith ist vorzugsweise Zeolith A und/oder P. Als Zeolith P wird Zeolith MAP®
(Handelsprodukt der Firma Crosfield) besonders bevorzugt. Geeignet sind jedoch auch
Zeolith X sowie Mischungen aus A, X und/oder P. Kommerziell erhältlich und im Rahmen
der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbar ist beispielsweise auch ein Co-
Kristallisat aus Zeolith X und Zeolith A (ca. 80 Gew.-% Zeolith X), das von der Firma
CONDEA Augusta S. p. A. unter dem Markennamen VEGOBOND AX® vertrieben wird und
durch die Formel
nNa2O.(1-n)K2O.Al2O3.(2-2,5)SiO2.(3,5-5,5)H2O
beschrieben werden kann. Geeignete Zeolithe weisen eine mittlere Teilchengröße von
weniger als 10 µm (Volumenverteilung; Meßmethode: Coulter Counter) auf und enthalten
vorzugsweise 18 bis 22 Gew.-%, insbesondere 20 bis 22 Gew.-% an gebundenem
Wasser.
Selbstverständlich ist auch ein Einsatz der allgemein bekannten Phosphate als
Buildersubstanzen möglich, sofern ein derartiger Einsatz nicht aus ökologischen Gründen
vermieden werden sollte. Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate
haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatrium-
beziehungsweise Pentakaliumtriphosphat (Natrium- beziehungsweise Kalium
tripolyphosphat) in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie die größte Bedeutung.
Alkalimetallphosphate ist dabei die summarische Bezeichnung für die Alkalimetall-
(insbesondere Natrium- und Kalium-)-Salze der verschiedenen Phosphorsäuren, bei
denen man Metaphosphorsäuren (HPO3)n und Orthophosphorsäure H3PO4 neben
höhermolekularen Vertretern unterscheiden kann. Die Phosphate vereinen dabei mehrere
Vorteile in sich: Sie wirken als Alkaliträger, verhindern Kalkbeläge auf Maschinenteilen
beziehungsweise Kalkinkrustationen in Geweben und tragen überdies zur
Reinigungsleistung bei.
Natriumdihydrogenphosphat, NaH2PO4, existiert als Dihydrat (Dichte 1,91 gcm-3,
Schmelzpunkt 60°) und als Monohydrat (Dichte 2,04 gcm-3). Beide Salze sind weiße, in
Wasser sehr leicht lösliche Pulver, die beim Erhitzen das Kristallwasser verlieren und bei
20 80669 00070 552 001000280000000200012000285918055800040 0002010064983 00004 805500°C in das schwach saure Diphosphat (Dinatriumhydrogendiphosphat, Na2H2P2O7, bei
höherer Temperatur in Natiumtrimetaphosphat (Na3P3O9) und Maddrellsches Salz (siehe
unten), übergehen. NaH2PO4 reagiert sauer; es entsteht, wenn Phosphorsäure mit
Natronlauge auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und die Maische versprüht wird.
Kaliumdihydrogenphosphat (primäres oder einbasiges Kaliumphosphat,
Kaliumbiphosphat, KDP), KH2PO4, ist ein weißes Salz der Dichte 2,33 gcm-3, hat einen
Schmelzpunkt 253° [Zersetzung unter Bildung von Kaliumpolyphosphat (KPO3)x] und ist
leicht löslich in Wasser.
Dinatriumhydrogenphosphat (sekundäres Natriumphosphat), Na2HPO4, ist ein farbloses,
sehr leicht wasserlösliches kristallines Salz. Es existiert wasserfrei und mit 2 Mol. (Dichte
2,066 gcm-3, Wasserverlust bei 95°), 7 Mol. (Dichte 1,68 gcm-3 Schmelzpunkt 48° unter
Vertust von 5H2O) und 12 Mol. Wasser (Dichte 1,52 gcm-3, Schmelzpunkt 35° unter
Verlust von 5H2O), wird bei 100° wasserfrei und geht bei stärkerem Erhitzen in das
Diphosphat Na4P2O7 über. Dinatriumhydrogenphosphat wird durch Neutralisation von
Phosphorsäure mit Sodalösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator
hergestellt. Dikaliumhydrogenphosphat (sekundäres od. zweibasiges Kaliumphosphat),
K2HPO4, ist ein amorphes, weißes Salz, das in Wasser leicht löslich ist.
Trinatriumphosphat, tertiäres Natriumphosphat, Na3PO4, sind farblose Kristalle, die als
Dodecahydrat eine Dichte von 1,62 gcm-3 und einen Schmelzpunkt von 73-76°C
(Zersetzung), als Decahydrat (entsprechend 19-20% P2O5) einen Schmelzpunkt von
100°C und in wasserfreier Form (entsprechend 39-40% P2O5) eine Dichte von 2,536 gcm-
3 aufweisen. Trinatriumphosphat ist in Wasser unter alkalischer Reaktion leicht löslich und
wird durch Eindampfen einer Lösung aus genau 1 Mol Dinatriumphosphat und 1 Mol
NaOH hergestellt. Trikaliumphosphat (tertiäres oder dreibasiges Kaliumphosphat), K3PO4,
ist ein weißes, zerfließliches, körniges Pulver der Dichte 2,56 gcm-3, hat einen
Schmelzpunkt von 1340° und ist in Wasser mit alkalischer Reaktion leicht löslich. Es
entsteht z. B. beim Erhitzen von Thomasschlacke mit Kohle und Kaliumsulfat. Trotz des
höheren Preises werden in der Reinigungsmittel-Industrie die leichter löslichen, daher
hochwirksamen, Kaliumphosphate gegenüber entsprechenden Natrium-Verbindungen
vielfach bevorzugt.
Tetranatriumdiphosphat (Natriumpyrophosphat), Na4P2O7, existiert in wasserfreier Form
(Dichte 2,534 gcm-3, Schmelzpunkt 988°, auch 880° angegeben) und als Decahydrat
(Dichte 1,815-1,836 gcm-3, Schmelzpunkt 94° unter Wasserverlust). Beide Substanzen
sind farblose, in Wasser mit alkalischer Reaktion lösliche Kristalle. Na4P2O7 entsteht beim
Erhitzen von Dinatriumphosphat auf < 200° oder indem man Phosphorsäure mit Soda im
stöchiometrischem Verhältnis umsetzt und die Lösung durch Versprühen entwässert. Das
Decahydrat komplexiert Schwermetall-Salze und Härtebildner und verringert daher die
Härte des Wassers. Kaliumdiphosphat (Kaliumpyrophosphat), K4P2O7, existiert in Form
des Trihydrats und stellt ein farbloses, hygroskopisches Pulver mit der Dichte 2,33 gcm-3
dar, das in Wasser löslich ist, wobei der pH-Wert der 1%igen Lösung bei 25° 10,4 beträgt.
Durch Kondensation des NaH2PO4 beziehungsweise des KH2PO4 entstehen
höhermolekulare Natrium- und Kaliumphosphate, bei denen man cyclische Vertreter, die
Natrium- beziehungsweise Kaliummetaphosphate und kettenförmige Typen, die Natrium-
beziehungsweise Kaliumpolyphosphate, unterscheiden kann. Insbesondere für letztere
sind eine Vielzahl von Bezeichnungen in Gebrauch: Schmelz- oder Glühphosphate,
Grahamsches Salz, Kurrolsches und Maddrellsches Salz. Alle höheren Natrium- und
Kaliumphosphate werden gemeinsam als kondensierte Phosphate bezeichnet.
Das technisch wichtige Pentanatriumtriphosphat, Na5P3O10 (Natriumtripolyphosphat), ist
ein wasserfrei oder mit 6H2O kristallisierendes, nicht hygroskopisches, weißes,
wasserlösliches Salz der allgemeinen Formel NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na mit n = 3. In 100 g
Wasser lösen sich bei Zimmertemperatur etwa 17 g, bei 60° ca. 20 g, bei 100° rund 32 g
des kristallwasserfreien Salzes; nach zweistündigem Erhitzen der Lösung auf 100°
entstehen durch Hydrolyse etwa 8% Orthophosphat und 15% Diphosphat. Bei der
Herstellung von Pentanatriumtriphosphat wird Phosphorsäure mit Sodalösung oder
Natronlauge im stöchiometrischen Verhältnis zur Reaktion gebracht und die Lösung durch
Versprühen entwässert. Ähnlich wie Grahamsches Salz und Natriumdiphosphat löst
Pentanatriumtriphosphat viele unlösliche Metall-Verbindungen (auch Kalkseifen usw.).
Pentakaliumtriphosphat, K5P3O10 (Kaliumtripolyphosphat), kommt beispielsweise in Form
einer 50 Gew.-%-igen Lösung (< 23% P2O5, 25% K2O) in den Handel. Die
Kaliumpolyphosphate finden in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie breite
Verwendung. Weiter existieren auch Natriumkaliumtripolyphosphate, welche ebenfalls im
Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind. Diese entstehen beispielsweise,
wenn man Natriumtrimetaphosphat mit KOH hydrolysiert:
(NaPO3)3 + 2KOH → Na3K2P3O10 + H2O
Diese sind erfindungsgemäß genau wie Natriumtripolyphosphat, Kaliumtripolyphosphat
oder Mischungen aus diesen beiden einsetzbar; auch Mischungen aus
Natriumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus
Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Gemische aus
Natriumtripolyphosphat und Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat sind
erfindungsgemäß einsetzbar.
Als organische Cobuilder können in den erfindungsgemäßen Wasch- und
Reinigungsmitteln insbesondere Polycarboxylate oder Polycarbonsäuren, polymere
Polycarboxylate, Polyasparaginsäure, Polyacetale, ggf. oxidierte Dextrine, weitere
organische Cobuilder (siehe unten) sowie Phosphonate eingesetzt werden. Diese
Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben.
Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form ihrer
Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche
Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen.
Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure,
Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren,
Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht
zu vermeiden ist, sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der
Polycarbonsäuren wie Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure,
Weinsäure, Zuckersäuren und Mischungen aus diesen.
Auch die Säuren an sich können eingesetzt werden. Sie besitzen neben ihrer
Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und
dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch-
oder Reinigungsmitteln, sofern nicht der sich durch die Mischung der übrigen
Komponenten ergebende pH-Wert gewünscht ist. Insbesondere sind hierbei system- unbd
umweltverträgliche Säuren wie Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure,
Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und
beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Aber auch Mineralsäuren, insbesondere
Schwefelsäure oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide können als
pH-Regulatoren dienen. Derartige Regulatoren sind in den erfindungemäßen Mitteln in
Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%,
enthalten.
Als Builder sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die
Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche
mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70 000 g/mol.
Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne
dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen Mw der jeweiligen Säureform, die
grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein
UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen
Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den
untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen
deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard
eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der
Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.
Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse
von 2 000 bis 20 000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus
dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2 000 bis
10 000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3 000 bis 5 000 g/mol, aufweisen, bevorzugt
sein.
Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure
mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als
besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die
50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative
Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2 000 bis 70 000 g/mol,
vorzugsweise 20 000 bis 50 000 g/mol und insbesondere 30 000 bis 40 000 g/mol. Die
(co-)polymeren Polycarboxylate können entweder als Pulver oder als wässerige Lösung
eingesetzt werden. Der Gehalt der Mittel an (co-)polymeren Polycarboxylaten kann von
0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-%, betragen.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie
beispielsweise Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer
enthalten.
Insbesondere bevorzugt sind auch biologisch abbaubare Polymere aus mehr als zwei
verschiedenen Monomereinheiten, beispielsweise solche, die als Monomere Salze der
Acrylsäure und der Maleinsäure sowie Vinylalkohol beziehungsweise Vinylalkohol-
Derivate oder die als Monomere Salze der Acrylsäure und der 2-Alkylallylsulfonsäure
sowie Zucker-Derivate enthalten.
Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein
und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Acrolein und Vinylacetat aufweisen.
Ebenso sind als weitere bevorzugte Buildersubstanzen polymere Aminodicarbonsäuren,
deren Salze oder deren Vorläufersubstanzen zu nennen. Besonders bevorzugt sind
Polyasparaginsäuren beziehungsweise deren Salze und Derivate.
Weitere geeignete Buildersubstanzen sind Polyacetale, welche durch Umsetzung von
Dialdehyden mit Polyolcarbonsäuren, welche 5 bis 7 C-Atome und mindestens 3
Hydroxylgruppen aufweisen, erhalten werden können. Bevorzugte Polyacetale werden
aus Dialdehyden wie Glyoxal, Glutaraldehyd, Terephthalaldehyd sowie deren Gemischen
und aus Polyolcarbonsäuren wie Gluconsäure und/oder Glucoheptonsäure erhalten.
Weitere geeignete organische Buildersubstanzen sind Dextrine, beispielsweise Oligomere
beziehungsweise Polymere von Kohlenhydraten, die durch partielle Hydrolyse von
Stärken erhalten werden können. Die Hydrolyse kann nach üblichen, beispielsweise
säure- oder enzymkatalysierten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es
sich um Hydrolyseprodukte mit mittleren Molmassen im Bereich von 400 bis
500 000 g/mol. Dabei ist ein Polysaccharid mit einem Dextrose-Äquivalent (DE) im
Bereich von 0,5 bis 40, insbesondere von 2 bis 30 bevorzugt, wobei DE ein
gebräuchliches Maß für die reduzierende Wirkung eines Polysaccharids im Vergleich zu
Dextrose ist, welche ein DE von 100 besitzt. Brauchbar sind sowohl Maltodextrine mit
einem DE zwischen 3 und 20 und Trockenglucosesirupe mit einem DE zwischen 20 und
37 als auch sogenannte Gelbdextrine und Weißdextrine mit höheren Molmassen im
Bereich von 2 000 bis 30 000 g/mol.
Bei den oxidierten Derivaten derartiger Dextrine handelt es sich um deren
Umsetzungsprodukte mit Oxidationsmitteln, welche in der Lage sind, mindestens eine
Alkoholfunktion des Saccharidrings zur Carbonsäurefunktion zu oxidieren. Besonders
bevorzugte organische Builder für erfindungsgemäße Mittel sind oxidierte Stärken,
beziehungsweise deren Derivate aus den Anmeldungen EP 472 042, WO 97/25399, und
EP 755 944.
Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise
Ethylendiamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird Ethylendiamin-
N,N'-disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze
verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate
und Glycerintrisuccinate. Geeignete Einsatzmengen liegen in zeolithhaltigen und/oder
silicathaltigen Formulierungen zwischen 3 und 15 Gew.-%.
Weitere brauchbare organische Cobuilder sind beispielsweise acetylierte
Hydroxycarbonsäuren beziehungsweise deren Salze, welche gegebenenfalls auch in
Lactonform vorliegen können und welche mindestens 4 Kohlenstoffatome und mindestens
eine Hydroxygruppe sowie maximal zwei Säuregruppen enthalten.
Eine weitere Substanzklasse mit Cobuildereigenschaften stellen die Phosphonate dar.
Dabei handelt es sich insbesondere um Hydroxyalkan- beziehungsweise
Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1-Hydroxyethan-
1,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird
vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das
Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen
vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriamin
pentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden
vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, z. B. als Hexanatriumsalz
der EDTMP beziehungsweise als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt.
Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die
Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen.
Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten,
bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder
Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.
Darüberhinaus können alle Verbindungen, die in der Lage sind, Komplexe mit
Erdalkaliionen auszubilden, als Cobuilder eingesetzt werden.
Buildersubstanzen können in den erfindungsgemäßen Mitteln gegebenenfalls in Mengen
bis zu 90 Gew.-% enthalten sein. Sie sind vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-%
enthalten. Erfindungsgemäße Waschmittel weisen Buildergehalte von insbesondere
5 Gew.-% bis 50 Gew.-% auf. In erfindungsgemäßen Mitteln für die Reinigung harter
Oberflächen, insbesondere zur maschinellen Reinigung von Geschirr, beträgt der Gehalt
an Buildersubstanzen insbesondere 5 Gew.-% bis 88 Gew.-%, wobei in derartigen Mitteln
vorzugsweise keine wasserunlöslichen Buildermaterialien eingesetzt werden. In einer
bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel zur insbesondere maschinellen
Reinigung von Geschirr sind 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% wasserlöslicher organischer
Builder, insbesondere Alkalicitrat, 5 Gew.-% bis 15 Gew.-% Alkalicarbonat und 20 Gew.-%
bis 40 Gew.-% Alkalidisilikat enthalten.
Lösungsmittel, die in den flüssigen bis gelförmigen Zusammensetzungen von Wasch- und
Reinigungsmitteln eingesetzt werden können, stammen beispielsweise aus der Gruppe
ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glycolether, sofern sie im
angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden
die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanolen,
Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether,
Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykol-methylether, Diethylenglykolethylether,
Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propylether, Dipropylenglykolmonomethyl-, oder -
ethylether, Di-isopropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder
Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol-
t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel.
Lösungsmittel können in den erfindungsgemäßen flüssigen bis gelförmigen Wasch- und
Reinigungsmitteln in Mengen zwischen 0,1 und 20 Gew.-%, bevorzugt aber unter 15 Gew.-%
und insbesondere unterhalb von 10 Gew.-% eingesetzt werden.
Zur Einstellung der Viskosität können der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein
oder mehrere Verdicker, beziehungsweise Verdickungssysteme zugesetzt werden. Diese
hochmolekularen Stoffe, die auch Quell(ungs)mittel genannt werden, saugen meist die
Flüssigkeiten auf und quellen dabei auf, um schließlich in zähflüssige echte oder kolloide
Lösungen überzugehen.
Geeignete Verdicker sind anorganische oder polymere organische Verbindungen. Zu den
anorganischen Verdickern zählen beispielsweise Polykieselsäuren, Tonmineralien wie
Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäuern und Bentonite. Die organischen Verdicker
stammen aus den Gruppen der natürlichen Polymere, der abgewandelten natürlichen
Polymere und der vollsynthetischen Polymere. Solche aus der Natur stammenden
Polymere sind beispielsweise Agar-Agar, Carrageen, Tragant, Gummi arabicum, Alginate,
Pektine, Polyosen, Guar-Mehl, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine
und Casein. Abgewandelte Naturstoffe, die als Verdicker verwendet werden, stammen vor
allem aus der Gruppe der modifizierten Stärken und Cellulosen. Beispielhaft seien hier
Carboxymethylcellulose und andere Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose
sowie Kernmehlether genannt. Vollsynthetische Verdicker sind Polymere wie Polyacryl-
und Polymethacryl-Verbindungen, Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether,
Polyimine, Polyamide und Polyurethane.
Die Verdicker können in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-%,
und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1,5 Gew.-%, bezogen auf die fertige
Zusammensetzung, enthalten sein.
Das erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel kann gegebenenfalls als weitere
übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyte und weitere Hilfsstoffe, wie
optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbüber
tragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffe, Farb- und/oder Duftstoffe, sowie
mikrobielle Wirkstoffe und/oder UV-Absorbenzien enthalten.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller Derivate der
Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten.
Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-
amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle
der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine
Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller
vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze
des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-
Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen
Aufheller können verwendet werden.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz
in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer
Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder
Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren
Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen
enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als
die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt
werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose,
Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxy
propylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in
Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.
Um einen Silberkorrosionsschutz zu bewirken, können in erfindungsgemäßen Reinigungs
mitteln für Geschirr Silberkorrosionsinhibitoren eingesetzt werden. Solche sind aus dem
Stand der Technik bekannt, beispielsweise Benzotriazole, Eisen(III)-chlorid oder CoSO4.
Wie beispielsweise aus der europäischen Patentschrift EP 0 736 084 B1 bekannt ist, sind
für die gemeinsame Verwendung mit Enzymen besonders geeignete Silberkorrosions
inhibitoren Mangan-, Titan-, Zirkonium-, Hafnium-, Vanadium-, Cobalt- oder Cersalze
und/oder -komplexe, in denen die genannten Metalle in einer der Oxidationsstufen II, III,
IV, V oder VI vorliegen. Beispiele für derartige Verbindungen sind MnSO4, V2O5, V2O4,
VO2, TiOSO4, K2TiF6, K2ZrF6, Co(NO3)2, Co(NO3)3, sowie deren Gemische.
"Soil-Release"-Wirkstoffe oder "Soil-Repellents" sind zumeist Polymere, die bei der
Verwendung in einem Waschmittel der Wäschefaser schmutzabstoßende Eigenschaften
verleihen und/oder das Schmutzablösevermögen der übrigen Waschmittelbestandteile
unterstützen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei deren Einsatz in Reinigungsmitteln
für harte Oberflächen beobachtet werden.
Besonders wirksame und seit langer Zeit bekannte Soil-Release-Wirkstoffe sind
Copolyester mit Dicarbonsäure-, Alkylenglykol- und Polyalkylenglykoleinheiten. Beispiele
dafür sind Copolymere oder Mischpolymere aus Polyethylenterephthalat und
Polyoxyethylenglykol (DT 16 17 141, beziehungsweise DT 22 00 911). In der deutschen
Offenlegungsschrift DT 22 53 063 sind saure Mittel genannt, die unter anderem ein
Copolymer aus einer dibasigen Carbonsäure und einem Alkylen- oder
Cycloalkylenpolyglykol enthalten. Polymere aus Ethylenterephthalat und Polyethylenoxid
terephthalat und deren Einsatz in Waschmitteln sind in den deutschen Schriften
DE 28 57 292 und DE 33 24 258 und der Europäischen Patentschrift EP 0 253 567
beschrieben. Das europäische Patent EP 066 944 betrifft Mittel, die einen Copolyester
aus Ethylenglykol, Polyethylenglykol, aromatischer Dicarbonsäure und sulfonierter
aromatischer Dicarbonsäure in bestimmten Molverhältnissen enthalten. Aus dem
europäischen Patent EP 0 185 427 sind Methyl- oder Ethylgruppen-endverschlossene
Polyester mit Ethylen- und/oder Propylen-terephthalat- und Polyethylenoxidterephthalat-
Einheiten und Waschmitel, die derartiges Soil-release-Polymer enthalten, bekannt. Das
europäische Patent EP 0 241 984 betrifft einen Polyester, der neben Oxyethylen-Gruppen
und Terephthalsäureeinheiten auch substituierte Ethyleneinheiten sowie Glycerineinheiten
enthält. Aus dem europäischen Patent EP 0 241 985 sind Polyester bekannt, die neben
Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten 1,2-Propylen-, 1,2-Butylen- und/oder
3-Methoxy-1,2-propylengruppen sowie Glycerineinheiten enthalten und mit C1- bis C4-
Alkylgruppen endgruppenverschlossen sind. Aus der europäischen Patentanmeldung
EP 0 272 033 sind zumindest anteilig durch C1-4-Alkyl- oder Acylreste
endgruppenverschlossene Polyester mit Poly-propylenterephthalat- und
Polyoxyethylenterephthalat-Einheiten bekannt. Das europäische Patent EP 0 274 907
beschreibt sulfoethyl-endgruppenverschlossene terephthalathaltige Soil-release-
Polyester. Gemäß der europäischen Patentanmeldung EP 0 357 280 werden durch
Sulfonierung ungesättigter Endgruppen Soil-Release-Polyester mit Terephthalat-,
Alkylenglykol- und Poly-C2-4-Glykol-Einheiten hergestellt. Die internationale
Patentanmeldung WO 95/32232 betrifft saure, aromatische schmutzablösevermögende
Polyester. Aus der internationalen Patentanmeldung WO 97/31085 sind nicht polymere
soil-repellent-Wirkstoffe für Materialien aus Baumwolle mit mehreren funktionellen
Einheiten bekannt: Eine erste Einheit, die beispielsweise kationisch sein kann, ist zur
Adsorption auf die Baumwolloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkung befähigt,
und eine zweite Einheit, die hydrophob ausgebildet ist, ist verantwortlich für das
Verbleiben des Wirkstoffs an der Wasser/Baumwolle-Grenzfläche.
Zu den für den Einsatz in erfindungsgemäßen Textilwaschmitteln in Frage kommenden
Farbübertragungsinhibitoren gehören insbesondere Polyvinylpyrrolidone, Polyvinyl
imidazole, polymere N-Oxide wie Poly-(vinylpyridin-N-oxid) und Copolymere von Vinyl
pyrrolidon mit Vinylimidazol.
Beim Einsatz in maschinellen Reinigungsverfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln
Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen
natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C18-C24-Fettsäuren
aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise
Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, ggf. silanierter Kieselsäure
sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter
Kieselsäure oder Bistearylethylendiamid. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus
verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, z. B. solche aus Silikonen, Paraffinen oder
Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Pa
raffinhaltige Schauminhibitoren, an eine granulare, in Wasser lösliche, beziehungsweise
dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus
Paraffinen und Bistearylethylendiamiden bevorzugt.
Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen kann darüber hinaus
abrasiv wirkende Bestandteile, insbesondere aus der Gruppe umfassend Quarzmehle,
Holzmehle, Kunststoffmehle, Kreiden und Mikroglaskugeln sowie deren Gemische,
enthalten. Abrasivstoffe sind in den erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln vorzugsweise
nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 15 Gew.-%, enthalten.
Farb- und Duftstoffe werden Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt, um den
ästhetischen Eindruck der Produkte zu verbessern und dem Verbraucher neben der
Wasch- und Reinigungsleistung ein visuell und sensorisch "typisches und
unverwechselbares" Produkt zur Verfügung zu stellen. Als Parfümöle beziehungsweise
Duftstoffe können einzelne Riechstoffverbindungen, z. B. die synthetischen Produkte vom
Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe verwendet
werden. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind z. B. Benzylacetat,
Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzyl
carbinylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenyl
glycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern
zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden z. B. die linearen Alkanale mit
8-18 C-Atomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd,
Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen z. B. die Jonone, α-
Isomethylionon und Methyl-cedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol,
Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen
gehören hauptsächlich die Terpene wie Limonen und Pinen. Bevorzugt werden jedoch
Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende
Duftnote erzeugen. Solche Parfümöle können auch natürliche Riechstoffgemische
enthalten, wie sie aus pflanzlichen Quellen zugänglich sind, z. B. Pine-, Citrus-, Jasmin-,
Patchouly-, Rosen- oder Ylang-Ylang-Öl. Ebenfalls geeignet sind Muskateller, Salbeiöl,
Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeeröl,
Vetiveröl, Olibanumöl, Galbanumöl und Labdanumöl sowie Orangenblütenöl, Neroliol,
Orangenschalenöl und Sandelholzöl. Üblicherweise liegt der Gehalt von Wasch- und
Reinigungsmitteln an Farbstoffen unter 0,01 Gew.-%, während Duftstoffe bis zu 2 Gew.-%
der gesamten Formulierung ausmachen können.
Die Duftstoffe können direkt in die Wasch- und Reinigungsmittel eingearbeitet werden, es
kann aber auch vorteilhaft sein, die Duftstoffe auf Träger aufzubringen, die die Haftung
des Parfüms auf dem Reinigungsgut verstärken und durch eine langsamere
Duftfreisetzung für langanhaltenden Duft, insbesondere von behandelten Textilien sorgen.
Als solche Trägermaterialien haben sich beispielsweise Cyclodextrine bewährt, wobei die
Cyclodextrin-Parfüm-Komplexe zusätzlich noch mit weiteren Hilfsstoffen beschichtet
werden können. Ein weiter bevorzugter Träger für Duftstoffe ist der beschriebene Zeolith
X, der anstelle von oder in Mischung mit Tensiden auch Duftstoffe aufnehmen kann.
Bevorzugt sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, die den beschriebenen Zeolith X und
Duftstoffe, die vorzugsweise zumindest teilweise an dem Zeolithen absorbiert sind,
enthalten.
Bevorzugte Farbstoffe, deren Auswahl dem Fachmann keinerlei Schwierigkeit bereitet,
besitzen eine hohe Lagerstabilität und Unempfindlichkeit gegenüber den übrigen
Inhaltsstoffen der Mittel und gegen Licht sowie keine ausgeprägte Substantivität
gegenüber Textilfasern, um diese nicht anzufärben.
Zur Bekämpfung von Mikroorganismen können Wasch- oder Reinigungsmittel
antimikrobielle Wirkstoffe enthalten. Hierbei unterscheidet man je nach antimikrobiellem
Spektrum und Wirkungsmechanismus zwischen Bakteriostatika und Bakteriziden,
Fungistatika und Fungiziden usw. Wichtige Stoffe aus diesen Gruppen sind
beispielsweise Benzalkoniumchloride, Alkylarylsulfonate, Halogenphenole und
Phenolmercuriacetat. Die Begriffe antimikrobielle Wirkung und antimikrobieller Wirkstoff
haben im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre die fachübliche Bedeutung, die
beispielsweise von K. H. Wallhäußer in "Praxis der Sterilisation, Desinfektion-
Konservierung : Keimidentifizierung-Betriebshygiene" (5. Aufl. - Stuttgart; New York
Thieme, 1995) wiedergegeben wird, wobei alle dort beschriebenen Substanzen mit
antimikrobieller Wirkung eingesetzt werden können. Geeignete antimikrobielle Wirkstoffe
sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen der Alkohole, Amine, Aldehyde,
antimikrobiellen Säuren beziehungsweise deren Salze, Carbonsäureester, Säureamide,
Phenole, Phenolderivate, Diphenyle, Diphenylalkane, Harnstoffderivate, Sauerstoff-,
Stickstoff-acetale sowie -formale, Benzamidine, Isothiazoline, Phthalimidderivate, Pyri
dinderivate, antimikrobiellen oberflächenaktiven Verbindungen, Guanidine, anti
mikrobiellen amphoteren Verbindungen, Chinoline, 1,2-Dibrom-2,4-dicyanobutan, Iodo-2-
propyl-butyl-carbamat, Iod, Iodophore, Peroxoverbindungen, Halogenverbindungen sowie
beliebigen Gemischen der voranstehenden.
Der antimikrobielle Wirkstoff kann dabei ausgewählt sein aus Ethanol, n-Propanol, i-
Propanol, 1,3-Butandiol, Phenoxyethanol, 1,2-Propylenglykol, Glycerin, Undecylensäure,
Benzoesäure, Salicylsäure, Dihydracetsäure, o-Phenylphenol, N-Methylmorpholin
acetonitril (MMA), 2-Benzyl-4-chlorphenol, 2,2'-Methylen-bis-(6-brom-4-chlorphenol), 4,4'-
Dichlor-2'-hydroxydiphenylether (Dichlosan), 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether
(Trichlosan), Chlorhexidin, N-(4-Chlorphenyl)-N-(3,4-dichlorphenyl)-harnstoff, N,N'-(1,10-
decan-diyldi-1-pyridinyl-4-yliden)-bis-(1-octanamin)-dihydrochlorid, N,N'-Bis-(4-chlorphe
nyl)-3,12-diimino-2,4, 11,13-tetraaza-tetradecandiimidamid, Glucoprotaminen, antimikro
biellen oberflächenaktiven quaternären Verbindungen, Guanidinen einschl. den Bi- und
Polyguanidinen, wie beispielsweise 1,6-Bis-(2-ethylhexyl-biguanido-hexan)-dihydrochlorid,
1,6-Di-(N1,N1'-phenyldiguanido-N5,N5')-hexan-tetrahydochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-phenyl-
N1,N1-methyldiguanido-N5,N5')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-o-
chlorophenyldiguanido- N5,N5')-hexan-dihydrochlorid,1,6-Di-(N1,N1'-2,6-
dichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid,1,6-Di-[N1,N1'-beta-(p-
methoxyphenyl)diguanido-N5,N5]-hexane-dihydrochlorid,1,6-Di-(N1,N1'-alpha-methyl-
.beta.-phenyldiguanido-N5,N5')-hexan-dihydrochlorid,1,6-Di-(N1,N1'-p-
nitrophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N1,N1'-
phenyldiguanido-N5,N5')-di-n-propylether-dihydrochlorid, omega:omega'-Di-(N1,N1'-p-
chlorophenyldiguanido-N5,N5')-di-n-propylether-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-2,4-
dichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-p-
methylphenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid,1,6-Di-(N1,N1'-2,4,5-
trichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid,1,6-Di-[N1,N1'-alpha-(p-
chlorophenyl)ethyldiguanido-N5,N5'] hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N1,N1'-p-
chlorophenyldiguanido-N5,N5')m-xylene-dihydrochlorid, 1,12-Di-(N1,N1'-p-
chlorophenyldiguanido-N5,N5')dodecan-dihydrochlorid, 1,10-Di-(N1,N1'-phenyldiguanido-
N5,N5')-decan-tetrahydrochlorid, 1,12-Di-(N1,N1'-phenyldiguanido-N5,N5')dodecan
tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-o-chlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid,
1,6-Di-(N1,N1'-o-chlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid, Ethylen-bis-(1-
tolyl biguanid), Ethylen-bis-(p-tolyl biguanide), Ethylen-bis-(3,5-dimethylphenylbiguanid),
Ethylen-bis-(p-tert-amylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(nonylphenylbiguanid), Ethylen-bis-
(phenylbiguanid), Ethylen-bis-(N-butylphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,5-
diethoxyphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,4-dimethylphenyl biguanid), Ethylen-bis (o
diphenylbiguanid), Ethylen-bis (mixed amyl naphthylbiguanid), N-Butyl-ethylen-bis-
(phenylbiguanid), Trimethylen bis (o-tolylbiguanid), N-Butyl-trimethyle- bis-(phenyl
biguanide) und die entsprechenden Salze wie Acetate, Gluconate, Hydrochloride,
Hydrobromide, Citrate, Bisulfite, Fluoride, Polymaleate, N-Cocosalkylsarcosinate,
Phosphite, Hypophosphite, Perfluorooctanoate, Silicate, Sorbate, Salicylate, Maleate,
Tartrate, Fumarate, Ethylendiamintetraacetate, Iminodiacetate, Cinnamate, Thiocyanate,
Arginate, Pyromellitate, Tetracarboxybutyrate, Benzoate, Glutarate, Monofluorphosphate,
Perfluorpropionate sowie beliebige Mischungen davon. Weiterhin eignen sich halogenierte
Xylol- und Kresolderivate, wie p-Chlormetakresol oder p-Chlor-meta-xylol, sowie
natürliche antimikrobielle Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft (z. B. aus Gewürzen oder
Kräutern), tierischer sowie mikrobieller Herkunft. Vorzugsweise können antimikrobiell
wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindungen, ein natürlicher antimikrobieller
Wirkstoff pflanzlicher Herkunft und/oder ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer
Herkunft, äußerst bevorzugt mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff
pflanzlicher Herkunft aus der Gruppe, umfassend Coffein, Theobromin und Theophyllin
sowie etherische Öle wie Eugenol, Thymol und Geraniol, und/oder mindestens ein
natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft aus der Gruppe, umfassend En
zyme wie Eiweiß aus Milch, Lysozym und Lactoperoxidase, und/oder mindestens eine
antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindung mit einer Ammonium-,
Sulfonium-, Phosphonium-, Iodonium- oder Arsoniumgruppe, Peroxoverbindungen und
Chlorverbindungen eingesetzt werden. Auch Stoffe mikrobieller Herkunft, sogenannte
Bakteriozine, können eingesetzt werden.
Die als antimikrobielle Wirkstoffe geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen (QAV)
weisen die allgemeine Formel (R1)(R2)(R3)(R4) N+ X- auf, in der R1 bis R4 gleiche oder
verschiedene C1-C22-Alkylreste, C7-C28-Aralkylreste oder heterozyklische Reste, wobei
zwei oder im Falle einer aromatischen Einbindung wie im Pyridin sogar drei Reste
gemeinsam mit dem Stickstoffatom den Heterozyklus, z. B. eine Pyridinium- oder
Imidazoliniumverbindung, bilden, darstellen und X- Halogenidionen, Sulfationen,
Hydroxidionen oder ähnliche Anionen sind. Für eine optimale antimikrobielle Wirkung
weist vorzugsweise wenigstens einer der Reste eine Kettenlänge von 8 bis 18,
insbesondere 12 bis 16, C-Atomen auf
QAV sind durch Umsetzung tertiärer Amine mit Alkylierungsmitteln, wie z. B. Methylchlorid,
Benzylchlorid, Dimethylsulfat, Dodecylbromid, aber auch Ethylenoxid herstellbar. Die
Alkylierung von tertiären Aminen mit einem langen Alkyl-Rest und zwei Methyl-Gruppen
gelingt besonders leicht, auch die Quaternierung von tertiären Aminen mit zwei langen
Resten und einer Methyl-Gruppe kann mit Hilfe von Methylchlorid unter milden
Bedingungen durchgeführt werden. Amine, die über drei lange Alkyl-Reste oder Hydroxy-
substituierte Alkyl-Reste verfügen, sind wenig reaktiv und werden bevorzugt mit
Dimethylsulfat quaterniert.
Geeignete QAV sind beispielweise Benzalkoniumchlorid (N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl
ammoniumchlorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-Dichlorbenzyl-dimethyl-C12-
alkylammoniumchlorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumchlorid (Benzyl-dodecyl-bis-
(2-hydroxyethyl)-ammonium-chlorid), Cetrimoniumbromid (N-Hexadecyl-N,N-trimethyl
ammoniumbromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumchlorid (N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[p-
(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-pheno-xy]ethoxy]ethyl]-benzylammoniumchlorid, CAS No. 121-
54-0), Dialkyldimethylammonium-chloride wie Di-n-decyl-dimethyl-ammoniumchlorid (CAS
No. 7173-51-5-5), Didecyldi-methylammoniumbromid (CAS No. 2390-68-3), Dioctyl
dimethyl-ammoniumchloric, 1-Cetylpyridiniumchlorid (CAS No. 123-03-5) und
Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1) sowie deren Mischungen. Besonders bevorzugte
QAV sind die Benzalkoniumchloride mit C8-C18-Alkylresten, insbesondere C12-C14-Aklyl-
benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid.
Benzalkoniumhalogenide und/oder substituierte Benzalkoniumhalogenide sind
beispielsweise kommerziell erhältlich als Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason,
Variquat® ex Witco/Sherex und Hyamine® ex Lonza, sowie Bardac® ex Lonza. Weitere
kommerziell erhältliche antimikrobielle Wirkstoffe sind N-(3-Chlorallyl)-hexaminiumchlorid
wie Dowicide® und Dowicil® ex Dow, Benzethoniumchlorid wie Hyamine® 1622 ex Rohm
& Haas, Methylbenzethoniumchlorid wie Hyamine® 10X ex Rohm & Haas,
Cetylpyridiniumchlorid wie Cepacolchlorid ex Merrell Labs.
Die antimikrobiellen Wirkstoffe werden in Mengen von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-%,
bevorzugt von 0,001 Gew.-% bis 0,8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,005 Gew.-% bis
0,3 Gew.-% und insbesondere von 0,01 bis 0,2 Gew.-% eingesetzt.
Die Mittel können UV-Absorbenzien (UV-Absorber) enthalten, die auf die behandelten
Textilien aufziehen und die Lichtbeständigkeit der Fasern und/oder die Lichtbeständigkeit
sonstiger Rezepturbestandteile verbessern. Unter UV-Absorber sind organische
Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu
absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, z. B.
Wärme wieder abzugeben.
Verbindungen, die diese gewünschten Eigenschaften aufweisen, sind beispielsweise die
durch strahlungslose Desaktivierung wirksamen Verbindungen und Derivate des
Benzophenons mit Substituenten in 2- und/oder 4-Stellung. Weiterhin sind auch
substituierte Benzotriazole, in 3-Stellung Phenylsubstituierte Acrylate (Zimtsäurederivate,
gegebenenfalls mit Cyanogruppen in 2-Stellung), Salicylate, organische Ni-Komplexe
sowie Naturstoffe wie Umbelliferon und die körpereigene Urocansäure geeignet.
Besondere Bedeutung haben Biphenyl- und vor allem Stilbenderivate wie sie
beispielsweise in der EP 0728749 A beschrieben werden und kommerziell als Tinosorb®
FD oder Tinosorb® FR ex Ciba erhältlich sind. Als UV-B-Absorber sind zu nennen: 3-
Benzylidencampher beziehungsweise 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, z. B.
3-(4-Methylbenzyliden)campher, wie in der EP 0693471 B1 beschrieben; 4-
Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-
ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4-
(Dimethylamino)benzoesäureamylester; Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-
Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimt
säureisoamylester, 2-Cyano-3,3-phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene); Ester
der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4-
isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester; Derivate des Benzophenons,
vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-
methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon; Ester der
Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester;
Triazinderivate, wie z. B. 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1'-hexyloxy)-1,3,5-triazin und
Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone
(Uvasorb® HEB); Propan-1,3-dione, wie z. B. 1-(4-tert.Butylphenyl)-3-
(4'methoxyphenyl)propan-1,3-dion; Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1
beschrieben. Weiterhin geeignet sind 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure
und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und
Glucammoniumsalze; Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2-
Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze; Sulfonsäurederivate des
3-Benzylidencamphers, wie z. B. 4-(2-Oxo-3-bornylidenmethyl)benzol-sulfonsäure und 2-
Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)sulfonsäure und deren Salze.
Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage,
wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion, 4-tert.-
Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789), 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan-
1,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 197 12 033 A1 (BASF).
Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt
werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch
unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse, vorzugsweise nanoisierte Metal
loxide beziehungsweise Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind
insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums,
Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können
Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze
werden in Form der Pigmente bereits für hautpflegende und hautschützende Emulsionen
und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren
Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und
insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form
aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine
ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form
besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, d. h. hydrophilisiert oder
hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind ummantelte Titandioxide, wie z. B.
Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex® T2000 (Merck; als hydrophobe Coatingmittel
kommen dafür bevorzugt Silicone und besonders bevorzugt Trialkoxyoctylsilane oder
Simethicone in Frage. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere
geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P. Finkel in SÖFW-Journal 122
(1996), S. 543 zu entnehmen.
Die UV-Absorbenzien werden üblicherweise in Mengen von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%,
vorzugsweise von 0,03 Gew.-% bis 1 Gew.-%, eingesetzt.
Zu den für Wasch- und Reinigungsmitteln üblichen Inhaltsstoffen werden im allgemeinen
auch wasch-, bzw. reinigungsaktive Enzyme gerechnet. Gleichzeitig stellen Wasch- oder
Reinigungsmittel, die über ein erfindungsgemäßes Protein hinaus durch zusätzlich weitere
Enzyme gekennzeichnet sind, bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
dar. Dazu gehören beispielsweise andere Proteasen, aber auch Oxidoreductasen,
Cutinasen, und/oder Esterasen, und besonders bevorzugt Lipasen, Amylasen und/oder
Cellulasen. Deren besonders gewünschte Beiträge zu der Gesamtwaschleistung
betreffender Mittel sind bereits in der Einleitung benannt worden. Weitere Enzyme
erweitern die Reinigunsgleitung entsprechender Mittel um ihre jeweils spezifische
enzymatische Leistung.
Dafür kommen in erster Linie aus Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, gewonne
ne Enzyme in Frage. Sie werden in bekannter Weise durch Fermentationsprozesse aus
geeigneten Mikroorganismen gewonnen, die zum Beispiel in den deutschen
Offenlegungsschriften DE 19 40 488, DE 20 44 161, DE 22 01 803 und DE 21 21 397,
den US-amerikanischen Patentschriften US 3 632 957 und US 4 264 738, der euro
päischen Patentanmeldung EP 006 638 sowie der internationalen Patentanmeldung
WO 91/912792 beschrieben sind. Falls es sich bei der erfindungsgemäß hergestellten Zu
bereitung um eine proteasehaltige Zubereitung handelt, kann die Proteaseaktivität bis zu
1 500 000 Proteaseeinheiten pro Gramm Zubereitung betragen (PE, bestimmt nach der in
Tenside, Bd. 7 (1970), S. 125-132 beschriebenen Methode), vorzugsweise liegt sie bei
150 000 bis 350 000 PE, insbesondere 160 000 PE bis 300 000 PE, pro Gramm
Zubereitung.
Ein erfindungsgemäßes Protein kann besonders während der Lagerung durch
Stabilisatoren beispielsweise vor Denaturierung, Zerfall oder Inaktivierung, etwa durch
physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden.
Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren, die bei Verdünnung
des Mittels in der Waschflotte abdissozieren. Benzamidin-Hydrochlorid und Leupeptin
sind für diesen Zweck etabliert. Häufig werden Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder
deren Salze oder Ester verwendet, darunter vor allem Derivate mit aromatischen
Gruppen, etwa gemäß WO 95/12655 ortho-substituierte, gemäß WO 92/19707 meta-
substituierte und gemäß US 5 972 873 para-substituierte Phenylboronsäuren,
beziehungsweise deren Salze oder Ester. In den Anmeldungen WO 98/13460 und
EP 583 534 werden Peptidaldehyde, d. h. Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, und
zwar solche aus 2-50 Monomeren, zur reversiblen Inhibierung von Wasch- und
Reinigungsmittelproteasen offenbart. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren
gehört u. a. Ovomucoid (WO 93/00418). Beispielsweise mit der Anmeldung WO 00/01826
werden spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren für die Protease Subtilisin zur
Verwendung in Protease-haltigen Mitteln offenbart, und mit WO 00/01831 entsprechende
Fusionsproteine aus Protease und Inhibitor.
Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -
propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C12, wie
beispielsweise aus den Anmeldungen EP 0 378 261 und WO 97/05227 bekannt ist, wie
Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Mit der
Anmeldung DE 196 50 537 werden für diesen Zweck endgruppenverschlossene
Fettsäureamidalkoxylate offenbart. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren
vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich ein enthaltenes Enzym zu
stabilisieren.
Niedere aliphatische Alkohole, v. a. aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin,
Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit sind weitere häufig eingesetzte
Enzymstabilisatoren. Ebenso werden Calciumsalze verwendet, wie beispielsweise
Calciumacetat oder das in der Patentschrift EP 0 028 865 für diesen Zweck offenbarte
Calcium-Formiat, und Magnesiumsalze, etwa gemäß der europäischen Anmeldung
EP 0 378 262.
Polyamid-Oligomere (WO 99/43780) oder polymere Verbindungen wie Lignin
(WO 97/00932), wasserlösliche Vinyl-Copolymere (EP 828 762) oder, wie in EP 702 712
offenbart, Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym-
Präparation u. a. gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert-Schwankungen.
Polyamin-N-Oxid-enthaltende Polymere (EP 587 550 und EP 581 751) wirken gleichzeitig
als Enzymstabilisatoren und als Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere
Stabilisatoren sind die in WO 97/05227 neben anderen Bestandteilen offenbarten linearen
C8-C18 Polyoxyalkylene. Alkylpolyglycoside könnten wie in den Anmeldungen
WO 97/43377 und WO 98/45396 die enzymatischen Komponenten des
erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und sogar in ihrer Leistung steigern. Vernetzte N-
haltige Verbindungen, wie in WO 98/17764 offenbart, erfüllen eine Doppelfunktion als
Soil-release-Agentien und als Enzym-Stabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches
Polymer wirkt in einer Mischung mit anderen Stabilisatoren gemäß der Anmeldung
WO 97/32958 stabilisierend auf eine Cellulase, so daß sich solche oder ähnliche
Bestandteile auch für das erfindungswesentliche Enzym eignen könnten.
Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen, wie u. a. in EP 780 466 offenbart, die
Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall. Schwefelhaltige Reduktionsmittel
sind beispielsweise aus den Patentschriften EP 0 080 748 und EP 0 080 223 bekannt.
Andere Beispiele sind Natrium-Sulfit (EP 533 239) und reduzierende Zucker
(EP 656 058).
Vielfach werden auch Kombinatonen von Stabilisatoren verwendet, beispielsweise aus
Polyolen, Borsäure und/oder Borax in der Anmeldung WO 96/31589, die Kombination von
Borsäure oder Borat, reduzierenden Salzen und Bernsteinsäure oder anderen
Dicarbonsäuren in der Anmeldung EP 126 505 oder die Kombination von Borsäure oder
Borat mit Polyolen oder Polyaminoverbindungen und mit reduzierenden Salzen, wie in der
Anmeldung EP 080 223 offenbart. Die Wirkung von Peptid-Aldehyd-Stabilisatoren wird
gemäß WO 98/13462 durch die Kombination mit Borsäure und/oder Borsäurederivaten
und Polyolen gesteigert und gemäß WO 98/13459 durch die zusätzliche Verwendung von
Calcium-Ionen noch weiter verstärkt.
Mittel mit stabilisierten Enzymaktivitäten stellen bevorzugte Ausführungsformen der
vorliegenden Erfindung dar. Besonders bevorzugt sind solche mit Enzymen, die auf
mehrere der dargestellten Weisen stabilisiert sind.
Da erfindungsgemäße Mittel in allen denkbaren Formen angeboten werden können,
stellen erfindungsgemäße Enzyme, bzw. Proteine in allen bekannten und für die Zugabe
zu den jeweiligen Mitteln zweckmäßigen Formulierungen jeweilige Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung dar. Dazu gehören beispielsweise flüssige Formulierungen,
feste Granulate oder Kapseln.
Die verkapselte Form bietet sich an, um die Enzyme vor anderen Bestandteilen, wie
beispielsweise Bleichmitteln, zu schützen oder um eine kontrollierte Freisetzung
(controlled release) zu ermöglichen. Je nach der Größe dieser Kapseln wird nach Milli-
Mikro- und Nanokapseln unterschieden, wobei Mikrokapseln für Enzyme besonders
bevorzugt sind. Solche Kapseln werden beispielsweise mit den Patentanmeldungen
WO 97/24177 und DE 199 18 267 offenbart. Eine mögliche Verkapselungsmethode
besteht darin, daß die Proteine, ausgehend von einer Mischung der Proteinlösung mit
einer Lösung oder Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat, in dieser Substanz
verkapselt werden. Ein solches Verkapselungsverfahren wird mit der deutschen
Anmeldung DE 199 56 382 mit dem Titel "Verfahren zur Herstellung von
mikroverkapselten Enzymen" beschrieben.
Im Fall fester Mittel können die Proteine beispielsweise in getrockneter, granulierter
und/oder verkapselter Form eingesetzt werden. Sie können separat, d. h. als eigene
Phase, oder mit anderen Bestandteilen zusammen in derselben Phase, mit oder ohne
Kompaktierung zugesetzt werden. Sollen mikroverkapselte Enzyme in fester Form
verarbeitet werden, so kann das Wasser mit aus dem Stand der Technik bekannten
Verfahren aus den sich aus der Aufarbeitung ergebenden wäßrigen Lösungen entfernt
werden, wie Sprühtrocknung, Abzentrifugieren oder durch Umsolubilisieren. Die auf diese
Weise erhaltenen Teilchen haben üblicherweise eine Teilchengröße zwischen 50 und
200 µm.
Flüssigen, gelförmigen oder pastösen erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme,
und auch das erfindungswesentliche Protein ausgehend von einer nach dem Stand der
Technik durchgeführten Proteingewinnung und Präparation in konzentrierter wäßriger
oder nichtwäßriger Lösung, Suspension oder Emulsion zugesetzt werden, aber auch in
Gelform oder verkapselt oder als getrocknetes Pulver. Derartige erfindungsgemäße
Wasch- oder Reinigungsmittel werden in der Regel durch einfaches Mischen der
Inhaltsstoffe hergestellt, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer
gegeben werden können.
Neben der primären Waschleistung können die in Waschmitteln enthaltenen Proteasen
ferner die Funktion erfüllen, andere enzymatische Bestandteile durch proteolytische
Spaltung zu aktivieren oder nach entsprechender Einwirkzeit zu inaktivieren, so wie
beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/29426 oder EP 747 471 offenbart worden ist.
Vergleichbare regulatorische Funktionen sind auch über das erfindungsgemäße Enzym
möglich. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind ferner solche Mittel mit
Kapseln aus proteasesensitivem Material, welche beispielsweise von erfindungsgemäßen
Proteinen zu einem beabsichtigten Zeitpunkt hydrolysiert werden und ihren Inhalt
freisetzen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei anderen mehrphasigen Mitteln erzielt
werden.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen
oder zur Textilpflege dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie allein oder neben
anderen Inhaltsstoffen ein erfindungsgemäßes proteolytisches Enzym enthalten. Denn
insbesondere natürliche Fasern, wie beispielsweise Wolle oder Seide, zeichnen sich
durch eine charakteristische, mikroskopische Oberflächenstruktur aus. Diese kann, wie
am Beispiel der Wolle im Artikel von R. Breier in Melliand Textilberichte vom 1.4.2000 (S.
263) ausgeführt worden ist, langfristig zu unerwünschten Effekten, wie etwa Verfilzung
führen. Zur Vermeidung solcher Effekte werden die natürlichen Rohstoffe mit
erfindunsgemäßen Mitteln behandelt, welche beispielsweise dazu beitragen, die auf
Proteinstrukturen beruhende geschuppte Oberflächenstruktur zu glätten und damit einem
Verfilzen entgegenwirken. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform stellen derartige
Mittel für Wolle oder Seide dar.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Mittel mit einer
erfindungsgemäßen Protease so konzipiert, daß es regelmäßig als Pflegemittel verwendet
werden kann, beispielsweise indem es dem Waschprozeß zugesetzt, nach dem Waschen
angewendet oder unabhängig von dem Waschen appliziert wird. Der gewünschte Effekt
besteht darin, eine glatte Oberflächenstruktur des Textils zu erhalten und/oder
Schädigungen des Gewebes vorzubeugen und/oder zu verringern.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur maschinellen Reinigung von
Textilien oder von harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in
wenigstens einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes proteolytisches Enzym
aktiv wird.
Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen
dadurch aus, daß in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive
Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen
werden, oder daß das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Reinigungsmittel oder
einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Das gleiche gilt für Verfahren zur
maschinellen Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem
Begriff feste Stoffe zusammengefaßt werden. Derartige Verfahren können in wenigstens
einem der Verfahrensschritte um erfindungsgemäße Proteine bereichert werden, und
stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Bevorzugt ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Enzyms in einer Menge von
0,35 mg bis 2 000 mg, besonders bevorzugt von 3 mg bis 1 500 mg pro Anwendung.
Da das erfindungsgemäße Enzym natürlicherweise bereits eine proteinauflösende
Aktivität besitzt und diese auch in Medien entfaltet, die sonst keine Reinigungskraft
besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen
Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, daß
gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen
als einzige reinigungsaktive Komponente das erfindungsgemäße Enzym aufgebracht
wird. Dies stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
dar.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Behandlung von
Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in
wenigstens einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes proteolytisches Enzym
aktiv wird. Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien
zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder
beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine
pflegende Komponente bereichern. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich
um Wolle oder wollhaltige Textilien oder um Seide oder seidenhaltige Textilien.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar.
Denn erfindungsgemäße Enzyme können, insbesondere entsprechend den oben
beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten
Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Um bevorzugte
Ausführungsformen handelt es sich bei der Verwendung außerhalb eines maschinellen
Verfahrens, beispielsweise bei der Handwäsche oder bei der manuellen Entfernung von
Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch-
oder Reinigungsmitteln dar. Denn, wie bekannt ist, können Protein-Bestandteile von
Wasch- oder Reinigungsmitteln durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden.
Diesen ansonster eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ein Gegenstand der
vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es aber auch möglich, daß durch Proteolyse eine
andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem
eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt, wie dies beispielsweise
in der Anmeldung WO 00/01831 offenbart worden ist. Ein anderes Beispiel für eine solche
Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle seiner
Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird.
Erfindungsgemäße Proteine werden somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder
Freisetzungsreaktionen verwendet.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur biochemischen oder molekularbiologischen Analyse,
insbesondere im Rahmen eines enzymatischen Analyseverfahrens dar. Erfindungsgemäß
und nach Römpp, "Lexikon Chemie" (Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme
Verlag, 1999) wird unter der enzymatischen Analyse jede biochemische Analytik
verstanden, die sich spezifischer Enzyme oder Substrate bedient, um einerseits Substrate
in ihrer Identität oder ihrer Konzentration oder andererseits Enzyme in Identität oder
Aktivität zu bestimmen. Anwendungsgebiete sind beispielsweise die klinische Chemie,
Lebensmittelchemie, Molekularbiologie, Biotechnologie, Botanik, Mikrobiologie, Zoologie
oder Pharmakologie.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung
zur Endgruppenbestimmung, insbesondere im Rahmen einer Sequenzanalyse dar. Diese
wird eingesetzt, um Makromoleküle, insbesondere Proteine zu bestimmen. Sofern für eine
solche Analyse eine Protease oder ein Fragment einer Protease verwendet wird, eignet
sich dafür auch die erfindungsgemäße Protease. Dies ist insbesondere für die Analyse
von Proteinsequenzen denkbar. Denn dafür werden die interessierenden Proteine im
allgemeinen zunächst chemisch mit Proteasen gespalten, bevor die erhaltenen
Fragmente einem weiteren Abbau, z. B. dem Edman-Abbau unterworfen werden.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder
biologischen Wertstoffen dar. So kann es im Verlauf der Aufreinigung von Naturstoffen
oder biologischen Wertstoffen beispielsweise notwendig sein, diese von
Proteinverunreinigungen zu befreien. Dabei kann es sich beispielweise um
niedermolekulare Verbindungen, insbesondere mit pharmakologischer Bedeutung
handeln, aber auch um alle anderen Zellinhalts- oder Speicherstoffe oder sogar um
Proteine selbst handeln. Dies ist sowohl im Labormaßstab, als auch in großtechnischer
Dimension, beispielsweise nach der fermentativen Herstellung eines Wertstoffes
durchführbar.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen
chemischen Verbindungen dar. Dies geschieht in Umkehrung der von ihnen
natürlicherweise katalysierten Reaktion, beispielsweise dann, wenn Proteinfragmente
miteinander verknüpft werden oder an eine nicht überwiegend aus Protein bestehende
Verbindung Aminosäuren gebunden werden sollen. Derartige Verwendungsmöglichkeiten
werden beispielsweise in der Anmeldung EP 380362 vorgestellt. Je nach
Reaktionsbedingungen eignet sich für ein solches Verfahren eine alkalische Protease wie
die der vorliegenden Erfindung.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen dar, wenn diese von
Protein-Verunreinigungen befreit werden sollen. Hier sind nicht-mikrobiologisch zu
erhaltende Rohstoffe, etwa aus der Landwirtschaft gemeint.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellt die Verwendung zur Oberflächenbehandlung, und
ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder dar. Dieses ist ein
aufgrund seiner wirtschaftlichen Bedeutung besonders bevorzugter Rohstoff. So werden
im Verlauf des Gerbverfahrens, inbesondere im Schritt der alkalischen Weiche (Römpp,
"Lexikon Chemie", Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag, 1999)
wasserlösliche Proteine mithilfe proteolytischer Enzyme, z. B. auch bakteriellen Ursprungs
aus dem Hautmaterial herausgelöst. Hierfür eignen sich, insbesondere wenn alkalische
Bedingungen herrschen, erfindungsgemäße Proteasen.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder
Zwischenprodukten in der Textilherstellung dar. Dabei geht es in erster Linie um
natürlicherweise mit ihnen verbundenen Proteine. Ein Beispiel dafür ist die Aufarbeitung
von Baumwolle, die in einem als Schlichten bezeichneten Prozeß von den
Kapselbestandteilen befreit werden muß; ein anderes die Behandlung von Wolle; ähnlich
gestaltet sich auch die Verarbeitung von Rohseide. Enzymatische Verfahren sind
vergleichbaren chemischen Verfahren besonders in ihrer Umweltverträglickeit überlegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäße Proteine dazu
verwendet, um Schutzschichten von Textilien, insbesondere Zwischenprodukten oder
Werkstoffen zu entfernen oder ihre Oberfläche zu glätten, bevor sie in einem
nachfolgenden Verarbeitungsschritt weiterbearbeitet werden.
In jeweils besonders bevorzugten Ausführungsformen werden erfindungsgemäße
Proteine zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, insbesondere zur
Oberflächenbehandlung von Wolle oder Seide verwendet. Dies gilt sowohl für die
Herstellung für derartige Textilien, als auch für die Pflege während des Gebrauchs,
beispielsweise im Zusammenhang mit der Textilreinigung.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur Behandlung von photographischen Filmen dar, insbesondere
zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten. Denn mit solchen
Schutzschichten, insbesondere solchen aus Silbersalz-haltigen Gelatin-Emulsionen
werden Filme, wie beispielsweise Röntgenfilme beschichtet, welche nach der Belichtung
vom Trägermaterial abgelöst werden müssen. Hierfür können insbesondere unter
alkalischen Reaktionsbedingungen erfindungsgemäße Proteasen verwendet werden.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln dar. So
werden Proteasen schon von alters her zur Lebensmittelherstellung verwendet. Ein
Beispiel dafür ist die Verwendung von Lab für den Reifungsprozeß von Käse oder
anderen Milchprodukten. Solche Prozesse können um ein erfindungsgemäßes Protein
bereichert oder vollständig von ihm durchgeführt werden. Auch kohlenhydratreiche
Lebensmittel oder Lebensmittelrohstoffe für Nicht-Ernährungszwecke, wie beispielsweise
Mehl oder Dextrin, können mit entsprechenden Proteasen behandelt werden, um sie von
begleitenden Proteinen zu befreien. Auch für solche Anwendungen ist eine
erfindungsgemäße Protease geeignet, insbesondere dann, wenn sie unter alkalischen
Bedingungen durchgeführt werden sollen.
Entsprechendes gilt für die Futtermittelherstellung. Hier kann es neben einer vollständigen
Befreiung von Proteinen auch von Interesse sein, die proteinhaltigen Ausgangsstoffe oder
Stoffgemische mit Proteasen lediglich kurze Zeit zu behandeln, um sie für die Haustiere
leichter verdaulich zu machen.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen kosmetische Mittel mit einem
erfindungsgemäßen proteolytischen Enzym oder kosmetische Verfahren unter
Einbeziehung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms oder die Verwendung
eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zu kosmetischen Zwecken,
insbesondere im Rahmen entsprechender Verfahren oder in entsprechenden Mitteln dar.
Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozeß der menschlichen Haut
(Desquamation) eine entscheidende Rolle (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venerol., Bd. 71
(1991), S. 471-474). Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive
Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut
vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen, beispielsweise gemäß der
Anmeldungen WO 95/07688 oder WO 99/18219. Der Einsatz einer Subtilisin-Proteae für
kosmetische Zwecke wird beispielsweise in WO 97/07770 beschrieben. Auch
erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder
durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwikender Stoffe in ihrer Aktivität
kontrolliert sind, eignen sich als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder
Pflegemitteln.
Dementsprechend wird auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen
Enzyms zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen,
insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder
Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten
werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel ist in diesen Anspruch
eingeschlossen.
Nach Standardmethoden präparierte chromosomale DNA aus B. alcalophilus
(DSM 11233) diente als Matrize für die PCR-Amplifikation des Genfragments, das für die
von ihm erhältliche Alkalische Protease codiert. Diese PCR erfolgte mit den Primern P1:
5'-GGC GCA ATC AGT GCC ATG GGG-3' und P2: 5'-CGT CTT CGC CGT TGT GCG
ATT-3'. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in einen geeigneten Vektor kloniert (p-
GEMTeasy®, Fa. Promega, Madison, Wisconsin, USA) und mehre unabhängige Isolate
sequenziert. Die erhaltene DNA-Sequenz sowie die daraus abgeleitete Proteinsequenz
sind im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1, beziehungsweise SEQ ID NO. 2
dargestellt.
Für die Expression dieser Protease wurde nach Standardmethoden die Fusion mit einer
geeigneten Expressionskassette erzeugt, die Pomotor, Signal- und Propeptid einer
Subtilisinprotease umfaßte, und in den Wirt Bacillus subtilis DB 104 zur Expression
gebracht. Die in den Kulturüberstand sekretierte mature Protease wurde entweder direkt,
das heißt im Kulturüberstand, oder nach ihrer Aufreinigung charakterisiert.
Der mit der in Beispiel 1 beschriebenen Expressionskassette für das erfindungsgemäße
Protein transformierte Wirtstamm Bacillus subtilis DB 104 wurde in einem Medium,
bestehend aus 10 g/l Casitone, 20 g/l, Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l, NaCl, 27 g/l,
Natrium-Succinat und 2 g/l, Glucose in bidestilliertem Wasser kultiviert.
Über folgende Aufreinigungsschritte wurde aus dem Kulturmedium einer 100 ml-Kultur
eines nach den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Produktionsstamms ein singuläres Enzym
erhalten: Dialyse des Überstands einer stationären Kultur gegen 20 mM HEPES/NaOH-
Puffer, pH 7,8, Anionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose® (Fa. Pharmacia-
Amersham Biotech, Schweden), Kationenaustauschchromatographie an S-Sepharose®
(Fa. Pharmacia-Amersham) und erneute Dialyse gegen bidestilliertes Wasser.
Das proteolytische Enzym konnte 46fach mit einer Ausbeute von ca. 52% aufgereinigt
werden, das heißt, aus 100 ml Kulturlösung wurden auf diese Weise 3,22 mg eines
gemäß SDS-Gelektrophorese und Coomassie-Färbung reinen Proteins gewonnen.
Bei denaturierender SDS-Polyacrylgelelektrophorese im FAST®-System der Fa.
Pharmacia-Amersham Biotech, Schweden, weist das proteolytische Enyzm aus Bacillus
alcalophilus (DSM 11233) ein Molekulargewicht von 27 kD auf.
Gemäß isoelektrischer Fokussierung liegt der isoelektrische Punkt des proteolytischen
Enyzms aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) oberhalb von 10.
Die Aktivität des nach Beispiel 3 aufgreinigten erfindungsgemäßen Proteins wurden mit
Casein als Substrat ermittelt. Bei 15minütiger Inkubation bei pH 11,5 und 50°C war die
Protease maximal aktiv.
Mit dem Substrat Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid wurden als kinetische Parameter für KM
0,67 mM, für Vmax 9,2 µmol/(ml.min) und für Kcat 138 s-1 ermittelt.
Bei jeweils 15minütiger Inkubation bei pH 8,5 wurde bei Bestimmung mit Casein als
Substrat das Temperaturoptimum der Protease-Aktivität aus Bacillus alcalophilus (DSM
11233) mit einem Wert von 50°C ermittelt. Im Bereich zwischen 50 und 65°C weist das
Enzym 60% der maximalen Aktivität auf; ab 70°C fällt die Aktivität auf unter 20% des
Werts von 50°C ab.
Das pH-Optimum des proteolytischen Enyzms aus Bacillus alcalophilus(DSM 11233) liegt
bei Bestimmung mit Casein als Substrat bei 11,5. Bei pH 12 konnten nur noch 40% der
maximalen Aktivität gemessen werden. Bei pH 8 konnten noch 50% der maximalen
Aktivität bestimmt werden. Unterhalb von pH 6 war keine Aktivität meßbar.
Die pH- und Temperaturstabilität des Enzyms wurde noch einmal kombiniert bei 50°C und
Inkubation in Glycin-NaOH-Puffer, pH 11, und bei 60°C und Inkubation in Glycin-NaOH-
Puffer, pH 10, über verschiedene Zeiträume überprüft. Die Aktivität lag in beiden Fällen
über einen Zeitraum von mehr als einer Stunde oberhalb von 50% des Maximalwertes
von pH 11,5 und 50°C. Damit konnte noch einmal bestätigt werden, daß das
proteolytische Enzym aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) gegenüber alkalischen pH-
Werten und hohen Temperaturen bemerkenswert stabil ist.
Die Eignung des erfindungsgemäßen Enzyms als aktive Komponente in Wasch- und
Reinigungsmitteln wurde mit einem Stabilitätstest unter Waschbedingungen untersucht.
Dafür wurde es über einen langen Zeitraum einer Waschlösung von
5 g Universalwaschmittel in 1 l destilliertem Wasser ausgesetzt. Das Mittel setzte sich
folgendermaßen zusammen (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 4% lineares
Alkylbenzolsulfonat, Na-Salz, 4% C12-C18-Fettalkoholsulfat, Na-Salz, 5,5% C12-C18-
Fettalkohol mit 7 EO, 1% Natrium-Seife, 11% Natriumcarbonat, 2,5% amorphes
Natriumdisilikat, 20% Natriumperborat-Tetrahydrat, 5,5% TAED, 25% Zeolith A,
4,5% Polycarboxylat, 0,5% Phosphonat, 2,5% Schauminhibitorgranulat,
5% Natriumsulfat, 1% Proteasegranulat, Rest: Wasser, optischer Aufheller, Parfüm,
Salze.
Bei diesem Versuch zeigte sich erst nach mehreren Tagen eine Abnahme an
proteolytischer Aktivität, und erst nach 6 Tagen ein vollständiger Aktivitätsverlust,
während das Enzym bei Lagerung in Puffer seine enzymatische Aktivität lange auf hohem
Niveau behielt.
Dieser Versuch belegt die Eignung des erfindungsgemäßen Enzyms als proteolytische
Komponente eines Wasch- oder Reinigungsmittels. Denn bei erfindungsgemäßem
Gebrauch braucht eine enzymatische Aktivität in der Waschflotte selten länger als eine
Stunde anzuhalten, und während der Lagerung wirken in bevorzugten Ausführungsformen
enzymhaltiger Mittel entsprechende Stabilisatoren einem Abbau der Enzyme entgegen.
Zur Untersuchung der Waschleistung der erfindungsgemäßen Protease wurden
Miniwaschversuche unternommen. Dafür wurde in drei parallelen Versuchsansätzen die
Waschmittelgrundrezeptur des Beispiels 6, jedoch ohne Proteasegranulat in der
Ausgangsmischung jeweils aktivitätsgleich mit den für Waschmittel optimierten Proteasen
Savinase® (Hersteller: Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark), Alkalischer Protease
aus Bacillus lentus gemäß Anspruch 2 der Patentanmeldung WO 92/21760 und der
erfindungsgemäßen Protease versetzt.
Weiße Baumwolllappen wurden standardisiert mit den Anschmutzungen Blut, Milch und
Tusche versehen und in Lösungen von jeweils 5 g der drei verschiedenen, mit den
Proteasen versetzten Waschmitteln in 100 ml destilliertem Wasser bei 50°C unter
vollständiger Benetzung geschwenkt. Nach 15, 30, 45 und 60 min wurden jeweils einzelne
Lappen entnommen und photometrisch der erzielte Reinheitsgrad gemessen. Dafür
wurde der Wert des absorbierten sichtbaren Lichts jeweils vor und nach dem Waschen
bestimmt und beide Werte jeweils in Relation zueinander gesetzt. Daraus ergibt sich als
Meßwert die Änderung der Farbmaßzahl (dF). Je stärker sich die auf die
Anschmutzungen zurückzuführende Farbe gegenüber dem Ausgangswert ändert, desto
besser ist die erzielte Waschleistung. Unterschiede zwischen den drei Meßreihen liefern
die Beiträge der Proteasen zu den Waschleistungen der jeweiligen Mittel. Das Ergebnis
ist in Tabelle 3 dargestellt.
Die Protease aus B. lentus zeigt eine eindeutige Waschleistung, doch sind ihre Werte zu
allen Zeitpunkten die niedrigsten. Die Savinase® zeigt eine mit dem Zeitverlauf
kontinuierlich steigende Waschleistung, die bis 30 min über der der erfindungsgemäßen
Protease liegt. Ab 45 min führt jedoch diese zu den besten Waschleistungen. Ab einer
Einwirkzeit von 45 min ist die Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) somit zwei
bislang verwendeten Waschmittelproteasen in ihrer Waschleistung überlegen. Sie führt
auch bei einer Einwirkzeit von 60 min zu dem absolut besten Ergebnis. Dies überrascht
umso mehr, als es sich dabei um ein Wildtyp-Enzym handelt und nicht um eines wie
Savinase®, das für diese spezielle Anwendung optimiert worden ist.
Fig. 1: Alignment der Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) mit denen
von zwei bekannten Enzymen; Zählung nach Savinase®.
Darin bedeuten:
BLAP: Alkalische Protease aus Bacillus lentus (US 5352604, WO 92/21760);
Savinase: Das Handelsprodukt Savinase® der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (WO 89/06279; Subtilisin 309);
Protease (DSM 11233): Das erfindungsgemäße proteolytische Enzym aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233).
Darin bedeuten:
BLAP: Alkalische Protease aus Bacillus lentus (US 5352604, WO 92/21760);
Savinase: Das Handelsprodukt Savinase® der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (WO 89/06279; Subtilisin 309);
Protease (DSM 11233): Das erfindungsgemäße proteolytische Enzym aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233).
Fig. 2: Alignment der Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen
proteolytischen Enzyms aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) mit denen
von drei bekannten Enzymen; Zählung nach BPN'.
Darin bedeuten:
BLAP: Alkalische Protease aus Bacillus lentus (US 5352604, WO 92/21760);
Savinase: Das Handelsprodukt Savinase® der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (WO 89/06279; Subtilisin 309);
Protease (DSM 11233): Das erfindungsgemäße proteolytische Enzym aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233);
BPN': Subtilisin BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens gemäß J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Vol. 11, S. 7911-7925, erhältlich unter der Eintragungsnummer X00165 bei der Datenbank des EMBL, in Cambridge, Großbritannien (http:/ /www.ebi.ac.uk).
Darin bedeuten:
BLAP: Alkalische Protease aus Bacillus lentus (US 5352604, WO 92/21760);
Savinase: Das Handelsprodukt Savinase® der Fa. Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark (WO 89/06279; Subtilisin 309);
Protease (DSM 11233): Das erfindungsgemäße proteolytische Enzym aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233);
BPN': Subtilisin BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens gemäß J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Vol. 11, S. 7911-7925, erhältlich unter der Eintragungsnummer X00165 bei der Datenbank des EMBL, in Cambridge, Großbritannien (http:/ /www.ebi.ac.uk).
Claims (45)
1. Subtilisin-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß sie an der Position, die zu der
Position 230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, den
Aminosäurerest Valin aufweist und an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins
BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Glycin aufweist und an der Position, die zu
der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, Asparagin
aufweist.
2. Subtilisin-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß sich an der Position, die zu
der Position 230 des Subtilisins BPN' aus B. amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige
andere Aminosäure mit Ausnahme von Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Serin und
Valin oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet,
und/oder sich an der Position, die zu der Position 256 des Subtilisins BPN' aus B.
amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von
Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Prolin, Serin, Threonin
und Tyrosin oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren befindet,
und/oder sich an der Position, die zu der Position 259 des Subtilisins BPN' aus B.
amyloliquefaciens homolog ist, jede beliebige andere Aminosäure mit Ausnahme von
Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Isoleucin, Leucin, Lysin, Prolin, Serin
und Threonin, oder keine Aminosäure oder eine Folge von bis zu 20 Aminosäuren
befindet.
3. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 262 Positionen mit
der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine,
vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind.
4. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 263 Positionen mit
der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine,
vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind.
5. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 264 Positionen mit
der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine,
vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind.
6. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 265 Positionen mit
der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine,
vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind.
7. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 266 Positionen mit
der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine,
vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind.
8. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 267 Positionen mit
der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter eine,
vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der Aminosäuren V224, G250 und N253
sind.
9. Subtilisin-Protease, deren Aminosäuresequenz in mindestens 268 Positionen mit
der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, worunter zwei,
vorzugsweise drei der Aminosäuren V224, G250 und N253 sind.
10. Subtilisin-Protease, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäuresequenz mit
der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz übereinstimmt, insbesondere in
den für die proteolytische Aktivität verantwortlichen Bereichen.
11. Proteolytisches Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es in wenigstens einer,
vorzugsweise zwei, besonders bevorzugt drei der antigenen Determinanten, die die
Positionen 224, 250 oder 253 umfassen, mit dem in SEQ ID NO. 2 bezeichneten Protein
übereinstimmen.
12. Proteolytisch aktive Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvariante oder
proteolytisch aktives Fragment eines der in den Ansprüchen 1 bis 11 bezeichneten
Proteine, insbesondere solch ein Fragment oder solche eine Variante, bei der eine,
vorzugsweise zwei, und besonders bevorzugt drei der die Positionen 224, 250 und 253 in
der SEQ ID NO. 2 umfassenden Sequenzbereiche in einer Größe von 20, vorzugsweise
10, ganz besonders bevorzugt 5 Aminosäuren enthalten sind.
13. Proteolytisches Enzym oder Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich derivatisiert ist.
14. Proteolytisches Enzym, Fragment oder Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis
13, dadurch gekennzeichnet, daß es natürlicherweise von einem biologischen
Organismus, vorzugsweise von einem Mikroorganismus gebildet wird.
15. Proteolytisches Enzym, Fragment oder Derivat nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium
handelt.
16. Proteolytisches Enzym, Fragment oder Derivat nach Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem gram-positiven Bakterium um eines der Gattung
Bacillus handelt.
17. Proteolytisches Enzym, Fragment oder Derivat nach Anspruch 16, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus alcalophilus
(DSM 11233) handelt.
18. Nukleinsäure, die für eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine
codiert.
19. Für eine Subtilisin-Protease codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz mit
der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz übereinstimmt, insbesondere in den
für die proteolytische Aktivität des abgeleiteten Enzyms verantwortlichen Bereichen.
20. Vektor, der einen in den Ansprüchen 18 oder 19 bezeichneten
Nukleinsäurebereich enthält und insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthält, der für
eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine oder Derivate codiert.
21. Klonierungsvektor, der einen in den Ansprüchen 18 oder 19 bezeichneten
Nukleinsäurebereich enthält und insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthält, der für
eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine oder Derivate codiert.
22. Expressionsvektor, der einen in den Ansprüchen 18 oder 19 bezeichneten
Nukleinsäurebereich enthält und insbesondere einen Nukleinsäurebereich enthält, der für
eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine oder Derivate codiert und
dessen Biosynthese ermöglicht.
23. Zelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 22 enthält.
24. Wirtszelle, die eines der in Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine oder
Derivate exprimiert oder zu dessen Expression angeregt werden kann, insbesondere
unter Einsatz eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 22.
25. Wirtszelle gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein
Bakterium ist, insbesondere eines, das das gebildete Protein ins umgebende Medium
sekretiert.
26. Wirtszelle gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Bakterium
der Gattung Bacillus, insbesondere der Species Bacillus licheniformis, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus ist.
27. Wirtszelle gemäß Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine
eukaryontische Zelle ist, insbesondere eine, die das gebildete Protein posttranslational
modifiziert.
28. Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Enzyms oder Derivats nach einem
der Ansprüche 1 bis 17 unter Verwendung einer Zelle, die dieses natürlicherweise bildet,
insbesondere eine gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder unter Verwendung einer
Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27 und/oder unter Verwendung eines
Vektors gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22 und/oder unter Verwendung einer
Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19.
29. Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
proteolytisches Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält.
30. Mittel nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich weitere
Enzyme, insbesondere andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen und/oder Lipasen
enthält.
31. Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, dadurch
gekennzeichnet, daß es allein oder neben anderen aktiven Inhaltsstoffen ein
proteolytisches Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält, insbesondere für
natürliche Fasern und ganz besonders für Wolle oder Seide.
32. Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen,
dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein
proteolytisches Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 aktiv wird, vorzugsweise in
einer Menge von 0,35 mg bis 2 000 mg, besonders bevorzugt von 3 mg bis 1 500 mg pro
Anwendung.
33. Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, dadurch
gekennzeichnet, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein proteolytisches
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17 aktiv wird, insbesondere für Wolle oder Seide.
34. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.
35. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln.
36. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur biochemischen oder molekularbiologischen Analyse, insbesondere im Rahmen eines
enzymatischen Analyseverfahrens.
37. Verwendung nach Anspruch 36 zur Endgruppenbestimmung, insbesondere im
Rahmen einer Sequenzanalyse.
38. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen
Wertstoffen.
39. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen.
40. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung,
ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder.
41. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der
Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben.
42. Verwendung nach Anspruch 40 und/oder 41 zur Behandlung von Textilrohstoffen
oder zur Textilpflege, insbesondere zur Oberflächenbehandlung von Wolle oder Seide.
43. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von
gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten.
44. Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 17
zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.
45. Kosmetika mit einem proteolytischen Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 17
oder kosmetische Verfahren unter Einbeziehung eines proteolytischen Enzyms nach
einem der Ansprüche 1 bis 17 oder die Verwendung eines proteolytischen Enzyms nach
einem der Ansprüche 1 bis 17 zu kosmetischen Zwecken, insbesondere im Rahmen
entsprechender Verfahren oder in entsprechenden Mitteln.
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