WO2005118793A2

WO2005118793A2 - Leistungsverbesserte alkalische protease-varianten und wasch- und reinigungsmittel, enthaltend diese leistungsverbesserten alkalische protease-varianten

Info

Publication number: WO2005118793A2
Application number: PCT/EP2005/005746
Authority: WO
Inventors: Susanne Wieland; Angrit Weber; Angela Beckers; Karl-Heinz Maurer; Beatrix Kottwitz; Laurent Fourage; Fabrice Lefevre
Original assignee: Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien
Priority date: 2004-06-02
Filing date: 2005-05-28
Publication date: 2005-12-15
Also published as: EP1789546A2; WO2005118793A3; DE102004027091A1

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft Varianten Alkalischer Proteasen vom Subtilisin-Typ mit den Aminosäureaustauschen 224V, 250G und 253N und/oder 43V in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus. Sie sind mit weiteren Mutationen und Punktmutationen kombinierbar, insbesondere mit Austauschen in den Positionen 3, 4, und/oder 211. Unter denen in Position 211 haben sich die Austausche L211 D, L21 1 N, L211 Q und L211 E als besonders vorteilhaft herausgestellt. Diese Anmeldung betrifft außerdem Wasch- und Reinigungsmittel mit solchen Protease-Varianten, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren und deren Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln. Zudem nennt sie weitere technische Einsatzmöglichkeiten.

Description

Leistungsverbesserte Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese leistungsverbesserten Alkalische Protease-Varianten

Die vorliegende Anmeldung betrifft Varianten Alkalischer Proteasen vom Subtilisin-Typ mit den Aminosäureaustauschen 224V, 250G und 253N und/oder 43V in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus. Sie stellen eine Weiterentwicklung der Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ dar, vor allem hinsichtlich ihres Einsatzes in Wasch- und Reinigungsmitteln.

Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62), insbesondere Subtilisine werden aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin- Proteasen zugerechnet. Sie werden natürlicherweise von Mikroorganismen, insbesondere von ßac/7/t/s-Spezies gebildet und sekretiert. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen. Das heißt, sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel „Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in „Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996.

Proteasen sind neben anderen Enzymen etablierte aktive Inhaltsstoffe von Wasch- und Reinigungsmitteln. Sie bewirken dabei den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Günstigenfalls ergeben sich Synergieeffekte zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen der betreffenden Mittel. Unter den Wasch- und Reinigungsmittelproteasen nehmen Subtilisine aufgrund ihrer günstigen enzymatischen Eigenschaften wie Stabilität oder pH-Optimum eine herausragende Stellung ein. Subtilisine eignen sich daneben noch für eine Vielzahl weiterer technischer Verwendungsmöglichkeiten, beispielsweise als Bestandteile von Kosmetika (WO 97/07770 A1) oder in der organisch-chemischen Synthese (EP 380362 A1).

Bereits die natürlicherweise, vorzugsweise mikrobiell gebildeten Alkalischen Proteasen werden in Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt. So ist beispielsweise nach der Anmeldung WO 93/07276 A1 die aus Bacillus spec. 164-A1 erhältliche Protease 164-A1 der Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, und Vista Chemical Company, Austin, TX, USA, für den Gebrauch in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet. Andere Beispiele sind die Alkalische Protease aus Bacillus sp. PD138, NCIMB 40338 der Fa. Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, (WO 93/18140 A1), die aus Bacillus sp. ferm. BP-3376 stammende Proteinase K-16 der Fa. Kao Corp., Tokyo, Japan, (US- Patent 5344770) und gemäß WO 96/25489 A1 (Fa. Procter & Gamble, Cincinatti, OH, USA) die Protease aus dem psychrophilen Organismus Flavobacterium balustinum.

Natürliche Proteasen werden über an sich bekannte Mutagenese-Verfahren beispielsweise für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln optimiert. Dazu gehören Punkt- mutagenese, Deletion, Insertion oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen oder über sonstige Modifikationen. So sollen im folgenden die technisch wichtigsten Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ und deren hinsichtlich der vorliegenden Anmeldung relevanten Weiterentwicklungen in den Aminosäure-Positionen 224, 250, 253 und 43 in der Zählung der Alkalischen Protease von B. lentus DSM 5483 und gegebenenfalls in Kombination mit zusätzlichen Austauschen in den Positionen 3, 4 und/oder 211 diskutiert werden. Die in den verwandten Subtilisinen jeweils homologen Aminosäurepositionen sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Darin sind jeweils auch die Positionen hervorgehoben, bei denen die natürlicherweise in diesen Enzymen an den entsprechenden Stellen vorkommenden Aminosäuren mit einer erfindungsgemäß einzuführenden Aminosäure übereinstimmen.

Tabelle 1 : Homologisierung der besonders erfindungswesentlichen Positionen mit denen der wichtigsten Enzyme des Stands der Technik

1. Zeile: Numerierung gemäß der Alkalischen Protease aus B. lentus; fettgedruckt: natürlicherweise an den entsprechenden Positionen vorhandene Aminosäuren V224, G250 oder N253.

Subtilisin BPN', welches aus Bacillus amyloliquefaciens, beziehungsweise B. subtilis stammt, ist aus den Arbeiten von Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, S. 811-819 und von J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume H, S. 7911-7925 bekannt. Subtilisin BPN' dient im Stand der Technik insbesondere hinsichtlich der Numerierung der Positionen als Referenzenzym der Subtilisine.

So werden beispielsweise die auf alle Subtilisine bezogenen Punktmutationen der Anmeldung EP 130756 A1 in der Numerierung von BPN' angegeben. In den erfindungsrelevanten Positionen 230, 256, 259 und 44 werden hierin keine Austausche vorbeschrieben, sondern lediglich in der zusätzlich betrachteten Position 217. Das gleiche trifft auf EP 251446 A2 zu, deren Anmeldungsgegenstand von der Fa. Procter & Gamble Comp., Cincinnati, Ohio, USA, als „Protease B" bezeichnet wird. Die Anmeldung EP 199404 A1 , deren BPN'-Varianten von Procter & Gamble Comp. als „Protease A" bezeichnet werden, berührt keine der hier relevanten Positionen. „Proteasen C" zeichnen sich gemäß der Anmeldung WO 91/06637 A1 durch Punktmutationen von BPN' in den Positionen 123 und/oder 274 aus. Bei der „Protease D" handelt es sich um Varianten, in erster Linie der Protease aus Bacillus lentus, die gemäß WO 95/10591 A1 Mutationen in der Position 76 (nach BPN'-Zählung) und zusätzlich anderen Positionen tragen. Darunter kann auch die Position 217 sein. Auch diese Anmeldung betrifft somit nicht den Kern der vorliegenden Erfindung.

In der Anmeldung CA 2049097 A1 werden für BPN' die Austausche Y217K und Y217L beschrieben, jedoch nicht in Kombination mit einer weiteren Mutation in einer der Positionen 230, 256 und 259 oder 44. In dieser Position liegt in BPN' natürlicherweise ein V (vergleiche Tabelle 1). Durch Punktmutationen in den Loop-Regionen dieses Enzyms erhaltene Varianten werden beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 95/07991 A2 und WO 95/30010 A1 vorgestellt. Sie betreffen nicht die Positionen 3, 4, 44, 230, 256 und 259, weil diese nicht in einer Loop-Region liegen. WO 95/07991 A2 befaßt sich mit dem sechsten Loop des Moleküls; offenbart werden hier unter anderem Doppelmutanten, bei denen neben mindestens einer weiteren, hier nicht relevanten Mutation die Aminosäure in Position 217 zu 15 anderen Aminosäuren, darunter auch zu L mutiert ist. Waschmittel mit derartigen BPN'-Varianten werden in der Patentanmeldung WO 95/29979 A1 offenbart. Aus WO 95/30010 A1 gehen Mutationen in den anderen fünf Loop-Regionen hervor. Auch hier werden Austausche in Position 217 in Kombination mit anderen, an dieser Stelle ebenfalls nicht relevanten Punktmutationen beschrieben.

Die Protease Subtilisin Carlsberg wird in den Publikationen von E. L. Smith et al. (1968) in J. Biol. Chem., Volume 243, S. 2184-2191, und von Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res., Band 13, S. 8913-8926 beschrieben. Sie wird natürlicherweise von Bacillus licheniformis gebildet und war, beziehungsweise ist unter dem Handelsnamen Maxatase^® von der Firma Genencor International Inc., Rochester, New York, USA, sowie unter dem Handelsnamen Alcalase^® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich.

Durch Punktmutationen in den Loop-Regionen dieses Moleküls erhältliche Varianten sind aus der Anmeldung WO 96/28566 A2 bekannt. Von den hier relevanten Positionen ist lediglich die Position 216 betroffen. Dafür werden verschiedene Substitionen offenbart, und zwar in Kombination mit Austauschen in anderen Loop-Regionen des Moleküls. In Position 3 liegt bei Subtilisin Carlsberg natürlicherweise ein T und in Position 44 ein V.

Die Protease PB92 wird natürlicherweise von dem alkaliphilen Bakterium Bacillus nov. spec. 92 produziert und war unter dem Handelsnamen Maxacal^® von der Fa. Gist- Brocades, Delft, Niederlande, erhältlich. In ihrer ursprünglichen Sequenz wird sie in der Patentanmeldung EP 283075 A2 beschrieben.

Durch Punktmutation erhaltene Varianten dieses Enzyms für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln werden beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/02618 A1 und EP 328229 A1 offenbart. Hierunter sind keine in den Positionen 224, 250, 253, 43, 3 und 4. Aus beiden gehen Austausche in der Position 211 hervor, beispielsweise L211 E beziehungsweise L211Y, aber nur allein oder in Kombination mit anderen, hier nicht relevanten Punktmutationen.

Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase^®, beziehungsweise Savinase^® von der Fa. Novozymes vertrieben. Sie stammen ursprünglich aus ßac///t/s-Stämmen, die mit der Anmeldung GB 1243784 A offenbart werden.

Durch Punktmutagenese in Hinblick auf den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln weiterentwickelte Varianten dieser Enzyme werden beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/02618 A1 (siehe oben) und WO 95/30011 A2 offenbart. Analog zu WO 95/07991 A2 und WO 95/30010 A1 (siehe oben) gehen aus WO 95/30011 A2 Mutationen in den Loop-Regionen dieser Protease hervor. Hiervon ist wiederum nur die Position 211 , allein oder in Kombination mit anderen, allerdings hier nicht relevanten Punktmutationen betroffen.

Das Subtilisin DY ist ursprünglich von Nedkov et al. 1985 in Biol. Chem Hoppe-Seyler, Band 366, S. 421-430 beschrieben worden. Analog zu WO 95/30011 A2 (siehe oben) gehen aus WO 96/28557 A2 Mutationen in den Loop-Regionen dieser Protease hervor. Hiervon ist wiederum nur die Position 217 (in dieser Anmeldung mit der Nummer 216 belegt), allein oder in Kombination mit anderen, wiederum nicht für die vorliegende Anmeldung relevanten Punktmutationen betroffen.

Das von Thermoactinomyces vulgaris natürlicherweise gebildete Enzym Thermitase ist ursprünglich von Meloun et al. (FEBS Lett. 1983, S. 195-200) beschrieben worden. Dabei handelt es sich um ein Molekül, das insgesamt erhebliche Sequenzabweichungen gegenüber den übrigen Subtilisinen aufweist. So beträgt die Homologie zwischen den maturen Proteinen Thermitase und der Alkalischen Protease aus ß. lentus DSM 5483 (siehe unten) 45% Identität (62% ähnliche Aminosäuren). In Position 234 (entsprechend 224 in der ß. Ientus-A\ kaiischen Protease; siehe Tabelle 1) verfügt sie natürlicherweise über den Aminosäurerest V; ebenso in Position 52, die in der ß. /enrus-Alkalischen Protease der Position 43 entspricht. Austausche in den übrigen hier besonders relevanten Positionen 258, 261 , 52, 10 und 11 (vergleiche Tabelle 1) sind nicht vorbeschrieben. Varianten mit Substitutionen in den Loop-Regionen gehen aus der Anmeldung WO 96/28558 A2 hervor. Dort werden unter anderem Austausche in der Position 221 (entsprechend 211 in der ß. /enuvs-Alkalischen Protease) gegen 14 andere Aminosäuren, allein und in Kombination mit anderen in Loops befindlichen Mutationen beschrieben.

Auch bei der Proteinase K handelt es sich um eine Protease, die zu der Alkalischen Protease aus ß. lentus eine vergleichsweise nur noch geringe Homologie aufweist. Sie beträgt auf der Ebene der maturen Proteine nur 33% Identität (46% ähnliche Aminosäuren). Die Proteinase K stammt ursprünglich aus dem Mikroorganismus Tritirachium album Limber und ist von K.-D. Jany und B. Mayer 1985 in Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Band 366, S. 485-492 beschrieben worden.

In der Anmeldung WO 96/28556 A2 werden für die Proteinase K zahlreiche Austausche in den verschiedenen Loop-Regionen offenbart, darunter in der Position 220 (entsprechend 211 in der ß. /et?fι/s-Alkalischen Protease) zu 14 anderen Aminosäuren, jedoch nicht in Kombination mit weiteren Austauschen in den Positionen 233, 258, 261, 4 und 6. Eine der Position 43 der ß. /et?fws-Alkalischen Protease entsprechende Aminosäureposition ist in diesem Molekül nicht vorhanden (vergleiche Tabelle 1 und beispielsweise auch das Alignment in Tabelle 1 von WO 91/00345 A1).

WO 88/07581 A1 offenbart die zueinander sehr ähnlichen Proteasen TW3 und TW7 unter anderem für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln.

Die Protease aus Bacillus alcalophilus DSM 5466 und Punktmutationen zur Stabilisierung dieses Moleküls gegenüber Detergenzien offenbart das Patent US 5453372. Darunter befinden sich auch spezielle Austausche in der hier relevanten Position 43, nicht jedoch zu V.

Die Bacillopeptidase F aus Bacillus subtilis besitzt auf Aminosäureebene nur eine Ähnlichkeit von 30% Identität zu der ß. /etrtus-Alkalischen Protease. Dieses Enzym ist in der oben erwähnten Arbeit von Siezen et al. aufgeführt, bislang aber noch nicht für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben oder beansprucht. Weitere bekannte Proteasen sind die unter den Handelsnamen Durazym^®, Relase^®, Everlase^®, Nafizym, Natalase^® und Kannase^® von der Firma Novozymes, unter den Handelsnamen, Maxapem^®, Purafect^®, Purafect OxP^® und Properase^® von der Firma Genencor, unter dem Handelsnamen Protosol^® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien und unter dem Handelsnamen Wuxi^® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, erhältlichen Enzyme.

Bei der Alkalischen Protease aus ß. lentus handelt es sich um eine Alkalische Protease aus Bacillus species, die in der Anmeldung WO 91/02792 A1 beschrieben ist. Sie besitzt an sich bereits eine vergleichsweise hohe Stabilität gegenüber Oxidation und dem Einwirken von Detergenzien. In den Anmeldungen WO 91/02792 A1, beziehungsweise den Patenten EP 493398 B1 und US 5352604, wird deren heterologe Expression in dem Wirt ß. licheniformis ATCC 53926 beschrieben. In den Ansprüchen des genannten US- Patents werden die Positionen 208, 210, 212, 213 und 268 als charakteristisch für die ß. /e/irus-Alkalische Protease bezeichnet; diese entsprechen in der Zählung des maturen Proteins den Positionen 97, 99, 101, 102 und 157, in denen sich dieses Enzym von dem maturen Subtilisin 309 (Savinase^®) unterscheidet. Die dreidimensionale Struktur dieses Enzyms wird in der Veröffentlichung von Goddette et al. (1992) in J. Mol. Biol., Band 228, S. 580-595: "The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease, Subtilisin BL, at 1.4 A resolution" beschrieben.

Auch die Anmeldung WO 92/21760 A1 beziehungsweise das Patent US 5340735 offenbaren das Wildtyp-Enzym ß. /enrt/s-Alkalische Protease (gebildet von ß. lentus DSM 5483) unter SEQ ID NO.52 in seiner Aminosäuresequenz und unter SEQ ID NO.106 in seiner Nukleotidsequenz sowie in seiner dreidimensionalen Struktur. Darüber hinaus werden darin 51 verschiedene, von dieser über Aminosäureaustausche abgeleitete Varianten offenbart. Nach dieser Anmeldung ist die unter der Bezeichnung ATCC 68614 bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org) hinterlegte Variante M131 mit den Austauschen S3T/V4I/A188P/V193M/V199I am stärksten bevorzugt. Weitere bevorzugte Varianten beziehungsweise Verfahren, solche zu identifizieren, gehen beispielsweise aus den von der WO-Schrift abgeleiteten US-Patenten US 5500364, US 5985639 und US 6136553 hervor. Aus der Anmeldung WO 95/23221 A1 beziehungsweise den zugehörigen US-Patenten US 5691295, US 5801039 und US 5855625 gehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln durch gezielte Punktmutagenese leistungsverbesserte ß. lentus- Alkalische Protease-Varianten hervor, die als Weiterentwicklungen der zuvor genannten Moleküle zu betrachten sind. Als hier relevante Austausche gegenüber dem Wildtyp- Enzym aus ß. lentus DSM 5483 sind wiederum die Positionen 3, 4 und 211 zu nennen, insbesondere S3T, V4I, 211 D und 211 E. Die zugehörige Strategie, nämlich gezielt die Ladungsverhältnisse nahe der Substrat-Bindungstasche zu verändern, verdeutlicht das Patent US 6197589 B1.

Weitere Varianten Alkalischer Proteasen vom Subtilisin-Typ, die insbesondere anhand der Alkalischen Protease aus ß. lentus entwickelt worden sind, beschreiben die Anmeldungen WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2. So gehen aus der zuerst genannten ß. /enrus-Alkalische Protease-Varianten mit den Aminosäureaustauschen V199I und L211G und mindestens einer zur Stabilisierung des Moleküls betragenden Modifizierung hervor, wobei es sich vorzugsweise um S3T und/oder V4I handelt. WO 03/038082 A2 offenbart den Austausch G61A, vorzugsweise in Kombination mit anderen zuvor beschriebenen Austauschen. Austausche in den Positionen 224, 250, 253 oder 43 sind für ß. /etϊfws-Alkalische Proteasen bislang jedoch noch nicht beschrieben worden.

Weitere aus natürlichen Habitaten isolierte Alkalische Proteasen sowie Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese Alkalischen Proteasen, gehen beispielsweise aus den Anmeldungen DE 10064983.1 (aus Bacillus alcalophilus DSM 11233), WO 03/054185 A1 (aus Bacillus gibsonii DSM 14391), WO 03/056017 A2 (basierend auf DE 10163883 A1 ; aus Bacillus sp. DSM 14390), WO 03/055974 A2 (aus Bacillus sp. DSM 14392) und WO 03/054184 A1 (aus Bacillus gibsonii DSM 14393) hervor. Von keinem dieser fünf Enzyme sind bislang Punktmutanten biochemisch untersucht und beschrieben worden. Weitere Alkalische Proteasen gehen aus den nicht vorveröffentlichten Anmeldungen DE 10360805.2 und DE 102004019751.2 hervor.

Eine Strategie, um die Waschleistung der Subtilisine zu verbessern, besteht - wie auch aus dem bisher Gesagten hervorgeht - darin, in die bekannten Moleküle gezielte Punktmutationen einzuführen („Rationales Protein-Design"). Diese Strategie verfolgt beispielsweise das Patent US 5441882. Unter den hierin beschriebenen Austauschen sind auch solche in Position 217 (entsprechend 211 in der ß. fenfus-Alkalischen Protease), jedoch nicht in Kombination mit einer der anderen hier relevanten Mutationen.

Die Möglichkeit, in Position 230 (nach BPN'-Zählung) zu variieren, findet sich beispielsweise in WO 99/20769 A2. Dort wird konkret der Austausch A230V, aber nur in Kombination mit mehreren anderen Austauschen vorbeschrieben, und zwar immer zusammen mit mindestens S103A, V104I, G159D und Q245R.

Zwei Publikationen befassen sich mit der Position 256 in BPN', welche gemäß J. Am. Chem. Soc. (1996), Band 118 (7). Seiten 1645-1650 die über eine andere Stelle ausgeübte Calcium-Bindung beeinflußt. Sowohl nach dieser Publikation als auch nach der vorangegangenen in J. Am. Chem. Soc. (1994), Band 116 (15). Seiten 6521-6530 stabilisiert die Punktmutation K256Y das Molekül BPN' über eine (indirekte) Modifizierung der Ca²⁺-Bindung. Die Möglichkeit, in Position 256 zu mutieren, wird auch in WO 94/23053 A1 offenbart, jedoch keine konkrete Variante dazu. Dies trifft aber nur auf solche Wildtypenzyme zu, die an der betreffenden Stelle ein Y aufweisen, wie etwa Subtilisin Carlsberg, weil über Austausch dieses Tyrosin-Restes ein stabilisierender Effekt erzielt werden soll. Ein Austausch zu G in der Position 256 wird somit durch keine dieser Publikationen beschrieben oder nahegelegt.

Subtilisine mit einer verbesserten Leistung in Wasch- und Reinigungsmitteln gehen auch aus der Anmeldung WO 99/11768 A1 hervor. Sie werden durch Aminosäureaustausche in den Positionen 252, 255 und/oder 259 (in BPN'-Zählung) erhalten. Darunter sind auch die Austausche S259H und S259C, welche jedoch nur in Kombination mit Austauschen in beiden anderen genannten Positionen offenbart werden. Ein Austausch zu N an dieser Stelle oder Variationen in anderen hier relevanten Positionen werden durch diese Anmeldung nicht vorbeschrieben. Aus EP 516200 A1 (siehe unten) geht ebenfalls die Möglichkeit hervor, in Position 259 zu mutieren, allerdings nur zu P. Eine genauere Untersuchung dieser Stelle wurde mit der Publikation „Isolation, characterisation and structure of subtilisin from a thermostable Bacillus subtilis isolate" in FEBS Lett. (1995), Band 374 (3), Seiten 363-366, bekanntgemacht. Darin wird der Schluß nahegelegt, ein Austausch von S zu N in dieser Position könne die Thermostabilität erhöhen.

Eine andere Strategie der Leistungsverbesserung besteht darin, die Oberflächenladungen und/oder den isoelektrischen Punkt der Moleküle und darüber ihre Wechsel- Wirkungen mit dem Substrat zu verändern. Derartige Variationen werden beispielsweise in der Anmeldung WO 91/00334 A1 offenbart. Darunter sind Austausche (in der BPN'- Zählung) in den Positionen 256 (S256R, S256K) und 259 (S259L, S259D), allein oder in Kombination mit Substitutionen unter anderem in den Positionen 3 (keine konkrete Variante), 4 (keine konkrete Variante), und 217 (keine konkrete Variante). Auch Austausche in der Position 44 werden beansprucht, jedoch ohne Angabe einer konkreten Variante. Dieselben Variationen gehen auch aus den Anmeldungen WO 91/00345 A1 und EP 945502 A1 hervor. Insbesondere ein Gleichbleiben der Nettoladung, wie dies bei A230V oder I43V (in BLAP-Zählung) oder L211G (in BLAP- Zählung) der Fall ist, fällt nicht hierunter. Ein Austausch in der Position 230 und zu den konkreten Aminosäuren 256G und 259N wird somit durch keines dieser Dokumente vorbeschrieben oder nahegelegt.

Die Anmeldung WO 00/24924 A2 beschreibt das Verfahren, über Punktmutationen die Nettoladung der Subtilisine zu verändern und darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alle hierin offenbarten Varianten weisen mindestens einen Austausch in Position 103 in Kombination mit mindestens einem anderen Austausch auf; darunter können auch Mutationen in den Positionen 230, 256, 259, 3, 4 und 217 (nicht jedoch 44) sein. Da im Sinne der vorliegenden Anmeldung Position 103 jedoch nicht verändert zu werden braucht und ein Austausch wie A230V oder V4I ladungsneutral sind, stellt dies keinen kritischen Stand der Technik dar. Auch von der hierin zusätzlich offenbarten Variationsmöglichkeit über die Position 76 ist die vorliegende Erfindung nicht betroffen. Das gleiche gilt für die Anmeldung WO 99/20770 A2, welche die betreffenden Enzym beansprucht. Aus der Anmeldung WO 99/20727 A2 gehen Wasch- und Reinigungsmittel mit derartigen Subtilisinvarianten hervor. Dieselben Mutanten werden in den Anmeldungen WO 99/20723 A2 und WO 99/20726 A2 für Wasch- und Reinigungsmittel offenbart, die zusätzlich eine Amylase beziehungsweise Bleiche enthalten. Nach dem erteilten Patent US 6312936 B1 müssen statt Position 76 zusätzlich zu Position 103 und optional den oben genannten Austauschen die Positionen 236 und/oder 245 mutiert sein, was auf die vorliegende ebenfalls Erfindung nicht zwingend zutrifft.

Ein weiterer, hier nicht sehr relevanter Stand der Technik besteht beispielsweise auch in der Anmeldung WO 99/11769 A1 , in welcher beschrieben wird, daß die Leistung von Subtilasen in Wasch- und Reinigungsmitteln durch Mutationen in den Positionen 134 und/oder 137 (BPN'-Numerierung), gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Punktmutationen verbessert werden kann. Unter diesen werden jedoch die Positionen 43, 230, 256 und 259 (BPN'-Numerierung) nicht genannt.

Eine moderne Richtung der Enzymentwicklung besteht darin, Elemente aus bekannten, miteinander verwandten Proteinen über statistische Verfahren zu neuen Enzymen mit bislang nicht erreichten Eigenschaften zu kombinieren. Solche Verfahren werden auch unter dem Oberbegriff Directed Evolution zusamengefaßt. Dazu gehören beispielsweise folgende Verfahren: Die StEP-Methode (Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., Band 16, S. 258-261), Random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., Band 26, S. 681-683), DNA-Shuffling (Stemmer, W.P.C. (1994), Nature, Band 370, S. 389-391) oder RACHITT (Coco, W.M. et al. (2001), Nat. Biotechnol., Band 19, S. 354- 359). Eine weitere Shuffling-Methode mit der Bezeichnung „Recombining ligation reaction" (RLR) ist in WO 00/09679 A1 beschrieben.

Eine weitere, insbesondere ergänzende Strategie besteht darin, die Stabilität der betreffenden Proteasen zu erhöhen und damit ihre Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Stabilisierung über Kopplung an ein Polymer ist für Proteasen für den Einsatz in Kosmetika beispielsweise in dem Patent US 5230891 beschrieben; sie geht mit einer besseren Hautverträglichkeit einher. Insbesondere für Wasch- und Reinigungsmittel sind dagegen Stabilisierungen durch Punktmutationen geläufiger.

So werden beispielsweise in WO 89/09830 A1 thermostabilere BPN'-Varianten beschrieben, die in der Positionen Y217 die Austausche gegen K oder L aufweisen. Weitere hier relevante Positionen werden dort nicht diskutiert. Außerdem lehrt diese Anmeldung, daß sich mehrere Stabilisierungsmöglichkeiten miteinander kombinieren lassen.

Ferner werden zur Stabilisierung über Punktmutagenese beschrieben:

- Austausch bestimmter Aminosäurereste gegen Prolin, etwa gemäß WO 92/19729 A1 und EP 516200 A1 ; dort ist auch die Möglichkeit, in Position 259 (BPN'-Zählung) zu mutieren, offenbart, insbesondere die Substitution S259P, und außerdem die Substitutionen S250P und S253P in Subtilisin 309;

- Einführung hydrophilerer, sterisch anspruchsvollerer oder zu einem ionischen Tensid gleichgerichtet geladener Gruppen auf der Oberfläche des Enzyms gemäß EP 995801 A1 ; dort werden unter anderem Proteasen offenbart, die Austausche in den

Positionen 256 und 4 (nach BPN'-Zählung) aufweisen sollen, jedoch ohne konkrete

Ausführungsformen;

- Substitutionen von Aminosäuren nahe dem aktiven Zentrum, etwa gemäß der

Anmeldung EP 398539 A1 : dort ist unter anderem eine Mutationsmöglichkeit in der

Position 217 von Subtilisin BPN' offenbart, zum Beispiel Y217L.

Weitere Möglichkeiten, Subtilisine, insbesondere solche, die sich von dem von Bacillus lentus ableiten, über Punktmutagenese zu stabilisieren, sind Mutationen in den Positionen 3 und 4, welche ursprünglich in der Anmeldung WO 92/21760 A1 offenbart worden sind und deren Stabilisierungseffekt in den Anmeldungen WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 beschrieben wird.

Wie all diese über einen langen Zeitraum durchgeführten Arbeiten belegen, besteht ein hoher Bedarf an technisch einsetzbaren Proteasen, die sich zum Teil drastisch, zum Teil nur in wenigen Positionen von bisher bekannten Proteasen unterscheiden. Sie decken damit ein breites Spektrum an Leistungsunterschieden ab. Dies zeigt sich vor allem bei ihrem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln, welche ihrerseits ein breites Leistungsspektrum abdecken sollen. So zeichnet sich eine geeignete Protease für Wasch- oder Reinigungsmittel vorzugsweise durch eine gewisse Unempfindlichkeit gegenüber den entsprechenden Bedingungen - wie Anwesenheit von an sich denaturierenden Tensi- den, von Bleiche, hohen Temperaturen etc. - und durch gute Leistungen gegenüber entsprechenden Substraten wie etwa den in unterschiedlichen Lebensmittelresten oder sonstigen Anschmutzungen zu findenden Proteinen aus. Eine weitere Auffächerung des Leistungsspektrums von Proteasen für Wasch- oder Reinigungsmittel ergibt sich durch die grundsätzlichen Unterschiede der Reinigungsverfahren. So wird beispielsweise bei der Textilreinigung das Waschgut in der Waschflotte zusätzlich zu den einwirkenden Substanzen intensiv mechanisch behandelt, während sich beispielsweise das maschinelle Geschirrspülen durch eine gewisse Statik auszeichnet. Hierfür werden somit in der Regel sehr leistungsfähige Inhaltsstoffe verwendet, die ihrerseits die enthaltenen Enzyme beeinträchtigen können.

Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, Alkalische Proteasen vom Subtilisin-Typ aufzufinden, die in technischen Anwendungen verbesserte Leistungen zeigen. Insbesondere sollten solche gefunden werden, die eine Leistungsverbesserung von Wasch- und/oder Reinigungsmitteln bewirken; dabei sollte die Aufgabe bereits dann als erfüllt angesehen werden, wenn wenigstens einer dieser beiden wesentlichen Leistungsaspekte an mindestens einem Anschmutzungstyp erfüllt wäre.

Ergänzende Aufgaben bestanden darin, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für derartige Proteasen codieren, und darüber gentechnische und mikrobiologische Elemente zu erhalten, die zur Gewinnung derartiger Proteasen genutzt werden können, sowie Verfahren zur Erzeugung entsprechender Varianten. Ferner sollten entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt werden.

Überraschenderweise wurde nun in einer ersten Lösung gefunden, daß sich leistungs- verbesserte Alkalische Proteasen erhalten lassen, indem an prinzipiell bekannten Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ die Aminosäureaustausche 224V, 250G und 253N in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gegenüber dem Ausgangsmolekül vorgenommen werden. Diese Leistungssteigerung läßt sich zudem mit zusätzlichen Mutationen weiter optimieren.

Diese Aufgabe wird somit durch Alkalische Protease-Varianten vom Subtilisin-Typ mit den Aminosäureaustauschen 224V, 250G und 253N in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gegenüber dem Ausgangsmolekül gelöst. Dabei ist einerseits zu beachten, daß es sich um eine Variante, also nicht um ein natürliches Enzym handelt, das durch diese drei Aminosäurereste in diesen drei Positionen gekennzeichnet ist. Andererseits ist es erfindungsgemäß möglich, daß solch eine Variante lediglich zwei oder einen dieser Aminosäureaustausche aufweist, wenn bereits im Ausgangsmolekül natürlicherweise die jeweils anderen Aminosäurepositionen 224V, 250G und/oder 253N vorhanden sind.

Einer zweiten Lösung zufolge handelt es sich um Alkalische Protease-Varianten vom Subtilisin-Typ mit dem Aminosäureaustausch 43V in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gegenüber dem Ausgangsmolekül, wobei auch hier wiederum nicht ein im Ausgangsmolekül natürlicherweise an dieser Stelle vorhandenes V gemeint ist, sondern eine Substitution einer anderen Aminosäure gegen V. Eine zusätzliche Optimierung, insbesondere hinsichtlich des Einsatzes in Wasch- und Reinigungsmitteln ist über weitere Mutationen, vor allem Punktmutationen und ganz besonders über Kombinationen beider Lösungen möglich. Mit den jeweils zugehörigen Nukleinsäuren werden Lösungen für die molekularbiologischen Teilaspekte der Aufgabe zur Verfügung gestellt, insbesondere die Herstellung erfindungsgemäßer Varianten. Somit stehen diese auch als Lösungen der zuletztgenannten Teilaspekte der Aufgabe zur Verfügung; sie werden unten weiter ausgeführt.

Unter einem Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist dreidimensionale Struktur annehmendes Polymer zu verstehen. In der vorliegenden Anmeldung werden die 19 proteinogenen, natürlich vorkommenden L- Aminosäuren mit den international gebräuchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet. Die Kombination einer dieser Bezeichnungen mit einer Nummer bezeichnet für das jeweilige Protein, welchen Aminosäure-Rest es in der jeweiligen Position trägt. Für Punktmutationen sind analoge Bezeichnungen etabliert. Positionsangaben beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf die jeweils maturen Formen der betreffenden Proteine, also ohne die Signalpeptide (siehe unten).

Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biochemische Funktion ausübt. Beispielsweise unter proteolytischen Enzymen oder Enzymen mit proteolytischer Funktion sind im allgemeinen solche zu verstehen, die die Säureamidbindungen von Proteinen hydrolysieren.

Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so daß dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N- terminalen Aminosäuren ausübt. Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die maturen Peptide, das heißt die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme gegenüber den Präproteinen bevorzugt.

Pro-Proteine sind inaktive Vorstufen von Proteinen. Deren Vorläufer mit Signalsequenz werden als Prä-Pro-Proteine bezeichnet.

Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. Aus ihnen können beispielsweise über reverse Transkription wiederum (c-)DNA-Moleküle abgeleitet werden.

Die einem Protein entsprechende Informationseinheit einer Nukleinsäure wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet. Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so daß eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann (Degeneriertheit des genetischen Codes). Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen und angegebene Nukleotidsequenzen jeweils nur als eine beispielhafte Codierung für eine bestimmte Aminosäurefolge angesehen werden.

Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen vollständige Gene herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus dem „Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Band 1 , S. 267-271 und Band 2, S. 227- 229, bekannt. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn auf einen bei einer Stammsammlung hinterlegten Stamm zurückgegriffen werden kann. Beispielsweise mit PCR- Primern, die anhand einer bekannten Sequenz synthetisierbar sind, und/oder über isolierte mRNA-Moleküle können aus solchen Stämmen die betreffenden Gene synthetisiert, Moniert und gewünschtenfalls weiter bearbeitet, beispielsweise mutagenisiert werden.

Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert (shuffling) werden; dies sind Genmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-, substitutionsmutierten oder Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten, beziehungsweise Fusionsproteinen.

Für die Beschreibung von Punktmutationen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. So bedeutet beispielsweise die Angabe A224V, daß an der Position 224 die ursprünglich vorhandene Aminosäure Alanin gegen Valin ausgetauscht worden ist. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptid kette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom übrigen Genom unabhängig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfülllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.

Sowohl Bakterienzellen als auch eukaryontische Zellen, die die genannten Vektoren enthalten, werden ungeachtet ihrer Unterschiede allgemein als Zellen bezeichnet. Solche Zellen, die einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor enthalten und somit zur Expression eines Transgens angeregt werden können, werden als Wirtszellen bezeichnet, denn sie beherbergen das betreffende genetische System.

Homologisierung ist der Vergleich einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz mit der von bekannten Genen oder Proteinen. Sie wird beispielsweise über ein Alignment vorgenommen. Das Maß für die Homologie ist ein Prozentsatz an Identität, wie er beispielsweise nach der von D. J. Lipman und W. R. Pearson in Science, Band 2Z7 (1985), S. 1435-1441 angegebenen Methode bestimmt werden kann. Vorzugsweise geschieht dies über Algorithmen, welche inzwischen von kommerziell erhältlichen Computergrogrammen angewendet werden. Hierzu gehört beispielsweise das Programm Vector NTI^® Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA, vorzugsweise mit den vorgegebenen Default-Parametem. Die Homologie-Angabe kann sich auf das gesamte Protein oder auf den jeweils zuzuordnenden Bereich beziehen. Ein weiter gefaßter Homologie-Begriff, die Ähnlichkeit, bezieht auch konservierte Variationen, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität in die Betrachtung mit ein, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Bei Nukleinsäuren kennt man nur den Prozentsatz an Identität.

Durch Homologisierung lassen sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz die Funktionen einzelner Sequenzbereiche sowie die enzymatische Aktivität des betrachteten gesamten Enzyms folgern. Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind solche mit vergleichbaren Funktionen, die sich durch Identität oder konservierte Austausche in der primären Aminosäuresequenz erkennen lassen. Sie umfassen einzelne Aminosäuren, kleinste Bereiche, sogenannte Boxen, die wenige Aminosäuren lang sind, bis hin zu langen Bereichen in der primären Aminosäuresequenz. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind somit auch kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes. Andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen enzymatischen Reaktion beteiligt sind, können sie qualitativ oder quantitativ modifizieren. Dies betrifft beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität.

Unter dem Begriff eines proteolytischen Enzyms oder dem einer Protease sind deshalb über die Funktionen der wenigen Aminosäurereste des katalytisch aktiven Zentrums hinaus alle Funktionen zu verstehen, wie sie sich durch das Einwirken des gesamten übrigen Proteins oder eines Teils oder mehrerer Teile des übrigen Proteins auf die eigentlich katalytisch aktiven Bereiche ergeben. Es ist darüberhinaus möglich, daß auch die Aktivitäten anderer Proteasen durch einen oder mehrere Teile, beispielsweise des erfindungsgemäßen Proteins qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Diese Beeinflussung anderer Faktoren wird ebenfalls als proteolytische Aktivität angesehen. Proteolytisch aktive Enzyme sind auch solche Proteasen, deren Aktivität zu einem gegebenen Zeitpunkt, etwa durch einen Inhibitor blockiert ist. Entscheidend ist ihre prinzipielle Eignung zur entsprechenden Proteolyse-Reaktion.

Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine oder solche, die vollständig translatierten Genen entsprechen, und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen.

Unter chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die natürlicherweise von verschiedenen Polypeptidketten aus demselben Organismus oder aus verschiedenen Organismen stammen. Dieses Vorgehen wird auch Shuffling oder Fusionsmutagenese genannt. Der Sinn einer solchen Fusion besteht beispielsweise darin, mithilfe des heranfusionierten erfindungsgemäßen Proteinteils eine enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren.

Unter durch Insertionsmutation erhaltenen Proteinen sind solche Varianten zu verstehen, die über an sich bekannte Methoden durch Einfügen eines Nukleinsäure-, beziehungsweise Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in chimären Proteinen.

Inversionsm utagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.

Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den Wirtsorganismus erfolgen. Hierfür können beispielsweise molekularbiologische Methoden, etwa die Cotransformation mit Genen, die für die betreffende Modifikation sorgen, eingesetzt werden. Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifikationen beeinflussen beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder führen eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbei, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies ist beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente, Fusionsproteine und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefaßt.

Unter der Leistung eines Enzyms wird dessen Wirksamkeit im jeweils betrachteten technischen Bereich, vorzugsweise im Rahmen eines entsprechend ausgerichteten Mittels verstanden. Diese basiert auf der eigentlichen enzymatischen Aktivität, hängt darüber- hinaus aber von weiteren, für den jeweiligen Prozeß relevanten Faktoren ab. Dazu gehören beispielsweise Stabilität, Substratbindung, Wechselwirkung mit dem das Substrat tragenden Material oder Wechselwirkungen mit anderen Inhaltsstoffen, insbesondere Synergien.

Unter der Waschleistung oder der Reinigungsleistung eines Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittels ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung der Effekt zu verstehen, den das betrachtete Mittel auf die verschmutzten Artikel, beispielsweise Textilien oder Gegenstände mit harten Oberflächen ausübt. Einzelne Komponenten solcher Mittel, beispielsweise einzelne Enzyme, werden hinsichtlich ihres Beitrags zur Wasch- oder Reinigungsleistung des gesamten Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittels beurteilt. Denn aus den enzymatischen Eigenschaften eines Enzyms kann nicht ohne weiteres auf seinen Beitrag zur Waschleistung eines Mittels geschlossen werden. Hier spielen als weitere Faktoren beispielsweise Stabilität, Substratbindung, Bindung an das Reinigungsgut oder Wechselwirkungen mit anderen Inhaltsstoffen der Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere Synergien bei der Entfernung der Verschmutzungen eine Rolle.

Als Referenzenzym zur Bezeichnung der erfindungsgemäßen Aminosäureaustausche dient die Alkalische Protease aus ß. lentus. Der reichhaltige Stand der Technik zu diesem Enzym ist einleitend dargestellt worden. Die Numerierung der Aminosäurepositionen folgt insbesondere den in SEQ ID NO. 1 und 2 angegebenen Sequenzen, wobei zu beachten ist, daß in SEQ ID NO. 1 unterhalb der Nukleotidsequenz die Aminosäuresequenz in der bevorzugten Zählung des maturen Proteins angegeben ist. Daran ist erkennbar, daß das mature Protein mit der Aminosäure Alanin beginnt, die durch das Codon in den Positionen 346-348 codiert wird. Die vorangehenden 115 Aminosäuren des Signalpeptids beziehungsweise der Prosequenz sind dementsprechend mit negativen Vorzeichen versehen. Bei der zur vorliegenden Anmeldung prioritätsbegründenden Anmeldung war zu beachten, daß dort in SEQ ID NO. 2 (vorgegeben durch das zur Erstellung des Sequenzprotokolls verwendete Programm Patentin 2.1) diese Unterscheidung nicht gemacht werden konnte und dort das gesamte Protein, einschließlich des Präproproteins durchnumeriert worden ist, weshalb sich insgesamt 380 Aminosäurereste für dasselbe Protein ergeben. Da in der Tat aber das mature Protein die proteolytische Aktivität ausübt, wurde bereits in der prioritätsbegründenden Anmeldung an der Aminosäurezählung gemäß SEQ ID NO. 1 festgehalten. Das Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung wurde mit dem Programm Patentin 3.1 erstellt, welches diese Zählweise auch in den abgeleiteten Aminosäuresequenzen fortsetzt.

Weitere äußere, nicht jedoch inhaltliche Anweichungen gegenüber dem Sequenzprotokoll der prioritätsbegründenden Anmeldung bestehen in folgenden Punkten:

- Die Angabe „CDS" (für „codierende Sequenz") in SEQ ID NO. 1 , 11 , 15, 17 und 21 bezeichnet jeweils einen um drei Positionen kürzeren Bereich; das ist auf einen Korrekturmechanismus dieses Programms zurückzuführen, der verlangt, daß das Stop- Codon aus der CDS-Angabe herausgenommen wird;

- das mature Peptid („mat_peptide") wird nur noch mit der Anfangsposition definiert (für SEQ ID NO. 1 , 11 , 15 und 21: 346; für SEQ ID NO. 17: 334);

- für SEQ ID NO. 1, 11 , 15, 17 und 21 wurde zusätzlich die Bezeichnung „gene", verbunden mit einer Angabe über die jeweilige Gesamtlänge (für SEQ ID NO. 1 , 11 , 15 und 21: 1-1155; für SEQ ID NO. 17: 1-1143) und der Erläuterung der Funktion des abgeleiteten Proteins („Alkaline protease") aufgenommen.

Entsprechende Angaben befinden sich in den neu aufgenommenen Sequenzen:

- Die Angabe „CDS" steht auch in SEQ ID NO. 25, 29, 33, 35 und 37 für „codierende Sequenz" und umfaßt jeweils den rein Aminosäure-codierenden Teil, welcher jeweils um die drei Positionen des Stop-Codons kürzer als das Gesamtgen ist, das heißt für SEQ ID NO. 25, 29, 33 und 35: 1152 und für SEQ ID NO. 37: 1140;

- das mature Peptid („mat_peptide") wird nur mit der Anfangsposition definiert, und zwar für SEQ ID NO. 25, 29, 33 und 35: 346 und für SEQ ID NO. 37: 334;

-SEQ ID NO. 25, 29, 33, 35 und 37 tragen zusätzlich die Bezeichnung „gene", verbunden mit einer Angabe über die jeweilige Gesamtlänge, und zwar für SEQ ID NO. 25, 29, 33 und 35: 1155 und für SEQ ID NO. 37: 1143, und der Erläuterung der Funktion des abgeleiteten Proteins: „Alkaline protease".

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf alle im Stand der Technik bekannten Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilisine), insbesondere die, die einleitend beschrieben worden sind, und durch Mutagenese weiterentwickelte Subtilisine. Hierunter sind insbesondere folgende zu erwähnen: Subtilisin BPN' und dessen Varianten, beispielsweise durch Mutation in Position 217 (in BPN'-Zählung), Subtilisin Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, das Subtilisin DY, die Thermitase, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, insbesondere aus ß. lentus DSM 5483, die Alkalischen Proteasen aus Bacillus alcalophilus DSM 11233, Bacillus gibsonii DSM 14391 , Bacillus sp. DSM 14390, Bacillus sp. DSM 14392 und Bacillus gibsonii DSM 14393 sowie diejenigen, die in den nicht vorveröffentlichten Anmeldungen DE 10360805.2 und DE 102004019751.2 beschrieben sind. Aufgrund der erfolgreichen Versuche anhand der erfindungsgemäßen Varianten der Alkalischen Protease aus ß. lentus DSM 5483 (Beispiele zur vorliegenden Anmeldung), ist zu erwarten, daß grundsätzlich alle Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ, insbesondere diese Enzyme durch erfindungsgemäße Punktmutationen hinsichtlich ihrer Beiträge zur Wasch- und/oder Reinigungsleistung entsprechender Mittel verbessert werden können.

Beispielsweise die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390), beschrieben in WO 03/056017 A2, weist in der Zählung nach der ß. /enfus-Alkalischen Protease natürlicherweise die Aminosäuren 224V, 250G und 253N auf. Somit können erfindungsgemäß nur Varianten, also nicht mehr solche Enzyme beansprucht werden, die natürlicherweise durch diese drei Aminosäurereste in diesen drei Positionen gekennzeichnet sind. Unter „natürlicherweise" sind dabei jeweils die Wildtyp-Enzyme zu verstehen. Sollten über mehrere nacheinanderfolgende Mutationsschritte eine oder mehrere dieser Positionen verändert worden sein, so ist dennoch jeweils auf das ursprüngliche Wildtyp-Enzym Bezug zu nehmen.

Andererseits ist es erfindungsgemäß möglich, durch entsprechend weniger Austausche, diese drei Positionen mit diesen Aminosäuren zu besetzen, wenn bereits im Ausgangsmolekül natürlicherweise die jeweils anderen Aminosäurepositionen 224V, 250G und/oder 253N vorhanden sind. Der einschlägige Stand der Technik hierzu ist einleitend , beschrieben. Tabelle 1 gibt Aufschluß darüber, welche Aminosäuren in den technisch wichtigsten Subtilisinen natürlicherweise an diesen Positionen liegen.

Vorzugsweise handelt es sich bei den beanspruchten Varianten um solche, die tatsächlich eine Proteaseaktivität entfalten, und hierunter solche, deren Leistung durch diese Aminosäureaustausche verbessert wird, insbesondere hinsichtlich ihres Beitrags zur Wasch- und/oder Reinigungsleistung eines Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittels. Hierbei ist jeweils der Bezug zum unmittelbar vorangegangenen Enzym herzustellen, das beispielsweise in einem den Beispielen der vorliegenden Anmeldung vergleichbaren Reaktionsansatz mit einem oder mehreren erfindungsrelevanten Austauschen weiterentwickelt wird. Dabei wird bereits durch diese drei Austausche allein eine Leistungsverbesserung gegenüber dem Ausgangsmolekül erzielt.

Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands stellen Alkalische Protease-Varianten mit weiteren Aminosäureaustauschen gegenüber der unmutierten Wildtyp-Alkalischen Protease dar. Das gilt insbesondere für Varianten mit weiteren Austauschen, von denen eine Verbesserung des Enzyms bereits bekannt ist. Sie können je nach Ermessen des hiermit betrauten Fachmanns vor, nach oder gleichzeitig mit den erfindungsgemäßen Sequenzvariationen vorgenommen werden. Hierunter sind insbesondere diejenigen gemeint, die im einleitend aufgeführten Stand der Technik erwähnt sind. So kann ein Enzym, welches bereits durch Mutationen aus einem Wildtypenzym abgeleitet worden ist, durch erfindungsgemäße Aminosäureaustausche zu einer erfindungsgemäßen Protease weiterentwickelt werden. Hierdurch ist eine gegebenenfalls weitere Verbesserung der Leistung der betreffenden Enzyme zu erwarten.

So wird etwa in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben, wie eine Variante der ß. lentus- Alkalischen Protease mit den bereits vorhandenen stabilisierenden (siehe unten) Austauschen S3T/V4I über ortsgerichtete Mutagenese zusätzlich die Aminosäureaustausche A224V/S250G/S253N erhält. Zusätzliche, zum Teil aus dem Stand der Technik bekannte Austausche werden anschließend vorgestellt. Somit ist es dem Fachmann nach an sich bekannten Methoden möglich, die betreffenden Varianten zu erzeugen und prinzipiell mit allen ihm bekannten weiteren Aminosäureaustauschen an alkalischen Proteasen zu kombinieren. Hierfür sind prinzipiell alle zu diesem Zweck im Stand der Technik etablierten Methoden geeignet. Dazu gehört die Punktmutagenese, wie sie beispielsweise über ortsgerichtete Primer durchgeführt werden kann. Primer, die zu diesem Zweck erfolgreich an der ß. /enrus-Alkalischen Protease eingesetzt werden können, sind im Sequenzprotokoll unter den Bezeichnungen BLAP-1s bis BLAP-4as (SEQ ID NO. 3 bis 10) angegeben. Analoge Primer lassen sich anhand der jeweiligen Sequenzen auch für die anderen Subtilisine entwerfen.

Alternativ hierzu kann auch eine unspezifische Mutagenese über ebenfalls bekannte Methoden, etwa mit Nitrosoguanidin als mutagenes Agens an den Ausgangssequenzen vorgenommen werden. Hierdurch erfolgen in der Regel zahlreiche Aminosäureaustausche, unter denen die genannten drei der Lehre der vorliegenden Anmeldung zufolge zu einer Verbesserung der Leistung der betreffenden Enzyme führen.

Eine weitere Möglichkeit zum Einführen dieser Mutationen ergibt sich aus einem Vergleich der Aminosäuresequenzen des Ausgangsmoleküls mit anderen aus dem Stand der Technik. So lehrt beispielsweise Figur 1, daß die ß. fenri/s-Alkalische Protease auch dadurch mit den drei Austauschen A224V, S250G und S253N versehen werden kann, daß sie in geeigneter Weise mit der Aminosäuresequenz der Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) kombiniert wird. Denn diese verfügt in den Positionen 224, 250 und 253 natürlicherweise über die drei erfindungsgemäß einzuführenden Aminosäuren. Das gleiche gilt für die Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233), die in der Anmeldung DE 10064983.1 beschrieben ist.

Solch eine Genfusion kann gezielt durch Restriktion zwischen den für die Positionen 157 und 224 codierenden Genabschnitten vorgenommen werden, wobei die betreffenden DNA-Sequenzen so miteinander verknüpft werden, daß zumindest die Positionen 97, 99, 101, 102 und 157 aus der ß. /entt/s-Alkalischen Protease und zumindest die Positionen 224, 250 und 253 aus der Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) oder aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233) stammen. Solch ein Vorgehen ist empfehlenswert, wenn über die Wirkung der eigentlichen Protease hinaus Effekte erzielt werden sollen, die auf die zugehörigen Nukleotidsequenzen zurückzuführen sind. Hierbei ist in erster Linie an die Codon-Usage zu denken, die zwischen den verschiedenen Spezies unterschiedlich ist. So kann eine Anpassung an den zur Expression und/oder zur großtechnischen Produktion ausgewählten Stamm erfolgen. Weitere Effekte können in der Regulation der betreffenden Gene oder in der Faltung der abgeleiteten RNA begründet sein. Bevorzugt sind dabei jeweils solche Ausführungsformen, bei denen möglichst viele derartiger Vorteile auf die eingebrachten jeweiligen Teilsequenzen zurückzuführen sind.

Für eine statistische Kombination dieser Gene stehen zum Beispiel die einleitend genannten Shuffling-Verfahren zur Verfügung.

Die alternative Ausführungsform ist durch den Aminosäureaustausch 43V in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gegenüber dem Ausgangsmolekül gekennzeichnet. Denn überraschenderweise konnte hierdurch ebenfalls eine Leistungssteigerung gegenüber dem Ausgangsmolekül erzielt werden, die allein auf diesen einen Aminosäureaustausch zurückzuführen ist. Er kann wie etwa in Beispiel 5 angegeben ist, über ortsgerichtete Mutagenese erzeugt werden. Dafür sind, wenn als Ausgangsmolekül eine B. /enfus-Alkalische Protease verwendet werden soll, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 19 und 20 angegebenen Primer BLAP-6s und BLAP-6as geeignet. Entsprechende Primer kann der Fachmann für die anderen im Stand der Technik beschriebenen Proteasen analog konstruieren.

Es wurde festgestellt, daß die auf die Austausche in den Positionen 224, 250 und 253 zurückzuführenden Effekte unabhängig von denen sind, die auf der Mutation 43V beruhen. In bevorzugten Ausführungsformen werden beide miteinander kombiniert. Dabei ist der auf diesen drei Positionen aufbauende Erfindungsaspekt, wie unten erläutert, jedoch nicht allein darauf beschränkt, daß in Kombination mit 224V, 250G und 253N zwangläufig nur der Austausch 43V auftritt. Vielmehr können diese drei Austausche auch mit anderen Punktmutationen in der Position 43 kombiniert werden oder diese Position gegenüber dem Ausgangsmolekül unverändert bleiben.

In Ausführungsformen, die entsprechend den vorherigen Erläuterungen bevorzugt sind, gehen in eine Genkombination oder Genfusion solche Varianten ein, die an sich bereits entsprechend vorteilhafte Aminosäureaustausche aufweisen. Alternativ hierzu können auch die beiden Wildtypsequenzen miteinander kombiniert und die ansonsten erwünschten Punktmutationen anschließend vorgenommen werden. Wie erwähnt zeichnen sich derartige Varianten, die auf ß. /e/iri/s-Alkalische Protease zurückzuführen sind, zumindest durch die Aminosäurepositionen 97D, 99R, 101A, 1021 und 157S aus, weil diese eindeutig aus dem Ausgangsmolekül stammen; das gilt entsprechend für solche Varianten, bei denen zuvor gezielte Austausche in eben diesen für die Katalyse wichtigen Positionen (siehe oben) vorgenommen worden sind.

Somit sind unter den erfindungsgemäßen Alkalische Protease-Varianten solche bevorzugt, die zusätzlich eine oder zunehmend bevorzugt mehrere der Aminosäurepositionen 97D, 99R, 101A, 1021 und 157S besitzen.

Dies gilt wiederum für die Zählung nach der ß. /et? t/s-Alkalischen Protease. Diese ein bis fünf Positionen können zusammen mit den oben genannten erfindungsgemäßen Austauschen ungeachtet sonstiger Mutationen in anderen Teilen des Moleküls gewissermaßen als „Fingerabdruck" einer erfindungsgemäßen, durch eine Kombination der zugehörigen Nukleinsäuren erhaltenen Alkalischen Protease-Varianten angesehen werden.

Unter den erfindungsgemäßen Alkalische Protease-Varianten sind weiterhin solche bevorzugt, die weitere Aminosäureaustausche gegenüber der unmutierten Wildtyp- Alkalischen Protease besitzen.

Denn entsprechend dem oben Gesagten, können in die Mutagenese zur Erzeugung erfindungsgemäßer Varianten nicht nur die Wildtypenzyme sondern auch dem Stand der Technik gemäß weiterentwickelte Alkalische Proteasen beziehungsweise die jeweils zugehörigen Gene eingebracht werden. So ist zu erwarten, daß die erfindungsgemäßen Austausche bei allen Arten von Alkalischen Proteasen zu einer Verbesserung ihrer Leistung, insbesondere hinsichtlich ihres Einsatzes in Wasch- oder Reinigungsmitteln führen.

Hierunter sind solche mit den weiteren Aminosäureaustauschen in einer oder mehreren der Positionen 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus bevorzugt. So gehen aus der Anmeldung WO 92/21760 A1 Einfach- und Mehrfachvarianten des Subtilisins aus Bacillus lentus DSM 5483 in folgenden Positionen hervor: 3, 4, 36, 42, 47, 56, 69, 87, 96, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 157, 188, 193, 199, 205, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268. Die Anmeldung WO 95/23221 A1 offenbart zusätzlich Austausche an diesem Molekül in den Positionen 99, 154 und 211, insbesondere R99G, R99A, R99S, S154D, S154E, L211D und L211E. Solche Varianten eignen sich der Anmeldung WO 95/07770 A1 zufolge besonders auch für den Einsatz in Kosmetika. Neben anderen Austauschen ist in der Anmeldung WO 02/088340 A2 auch der Austausch L211G beschrieben, und in WO 03/038082 A2 der Austausch G61A.

Hierbei werden die zusätzlichen Austausche in den Positionen 43, 224, 250 und 253 entsprechend den oben beschriebenen Vorzügen in den Schutzbereich einbezogen, sofern die betrachteten Varianten nicht ohnehin schon über einen erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch in diesen Positionen verfügen.

Mutationen in Position 43 wurden im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung als vorteilhaft erkannt, um die Leistung entsprechender Alkalischer Proteasen zu verbessern, insbesondere ihren Beitrag zur Wasch- und/oder Reinigungsleistung entsprechender Mittel. Hierbei wird prinzipiell jeder an dieser Stelle mögliche Aminosäureaustausch in den Schutzbereich einbezogen, Insbesondere gilt er für solche, bei denen eine dort vorhandene aliphatische Aminosäure (das heißt G, A, V, L oder I) gegen eine andere aliphatische Aminosäure ausgetauscht wird, besonders bevorzugt gegen V.

Das gilt entsprechend für die in Kombination mit 43V vorteilhaften möglichen Austausche in den Position 224, 250 und/oder 253, die die oben ausgeführten Vorteile liefern. Für die Position 224 sind im Sinne der vorliegenden Erfindung ebenfalls alle denkbaren Austausche möglich, hierunter ist die Einführung einer aliphatischen Aminosäure bevorzugt, weil die meisten der im Stand der Technik etablierten wichtigsten Enzyme an dieser Stelle ebenfalls über die aliphatische Aminosäure A verfügen (vergleiche Tabelle 1), und besonders bevorzugt ist V. Für die erfindungsgemäße Kombination des Austauschs 43V mit einer weiteren Mutationen in Position 250 sind ebenfalls prinzipiell alle Substitutionen möglich, vorzugsweise ebenfalls aliphatische Aminosäuren, besonders bevorzugt ist G, weil dieser Austausch erfindungsgemäß Vorteile hinsichtlich der Leistung des Enzyms bewirkt. Für die erfindungsgemäße Kombination des Austauschs 43V mit einerweiteren Mutationen in Position 253 sind ebenfalls prinzipiell alle Substitutionen möglich, vorzugsweise gegen die Säureamide N oder Q, besonders bevorzugt ist N, weil dieser Austausch erfindungsgemäß Vorteile hinsichtlich der Leistung des Enzyms bewirkt. Zunehmend bevorzugt werden entsprechend dem oben Gesagten Kombinationen des Austauschs 143V mit zwei oder drei dieser zusätzlichen Punktmutationen. Dies gilt entsprechend dem oben Gesagten insbesondere dann, wenn gleichzeitig die Positionen 224, 250 und 253 mit genau den drei Aminosäuren V, G beziehungsweise N belegt sind.

Hierunter sind dementsprechend solche erfindungsgemäßen Alkalischen Protease- Varianten bevorzugt, bei denen die weiteren Aminosäureaustausche in einer oder mehreren der Positionen 3, 4, 43, 61 , 188, 193, 199, 211, 224, 250 und 253 vorliegen.

Hierunter sind entsprechend dem oben Gesagten wiederum solche erfindungsgemäßen Alkalischen Protease-Varianten bevorzugt, bei denen es sich um einen oder mehrere der Aminosäureaustausche S3T, V4I, I43V, G61A, A188P, V193M, V199I, L211D, L211E L211G, L211N oder L211Q, A224V, S230G und S253N handelt.

Die Austausche S3T und V4I führen, wie insbesondere in WO 02/088340 A2 erläutert ist, vermutlich über einen Stabilisierungeffekt auf das Molekül zu einer Verbesserung dessen Beitrags zur Waschleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels. Eine Variante mit einem solchen doppelten Austausch wurde auch in Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung eingebracht. Die Austausche S3T, V4I, A188P, V193M, V199I und L211D kennzeichnen gemäß WO 95/23221 A1 mehrere besonders leistungsfähige Proteasen, insbesondere die Variante F49, die im Stand der Technik als leistungsfähiges Enzym etabliert ist.

Der Austausch V4I und die Kombination der drei Austausche A224V, S230G und S253 zeigen erfindungsgemäß weitere Verbesserungen hinsichtlich der Leistung, besonders des Beitrags zur Waschleistung der betreffenden Enzyme, wenn sie in Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittelrezepturen eingesetzt werden.

Die Punktmutation L211G führt, wie mit der Anmeldung WO 02/088340 A2 belegt ist, insbesondere in Kombination mit den stabilisierenden Austauschen S3T und/oder V4I in der ß. fenfr/s-Alkalische Protease zu einer Leistungsverbesserung bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln. Daneben bewirken auch die Variationen L211 E, L211Q und L211N Leistungsverbesserungen, insbesondere bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln, und zwar ganz besonders gegenüber bluthaltigen Anschmutzungen. Entsprechende Varianten werden weiter unten ausgeführt und in den Beispielen beschrieben.

Weiter bevorzugt sind solche der erfindungsgemäßen Alkalischen Protease-Varianten, bei denen das Ausgangsmolekül die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise aus Bacillus lentus DSM 5483, oder eine Variante davon ist.

Dieser Ausgangsstamm wird beispielsweise in der Anmeldung WO 91/02792 A1 beschrieben. Er ist unter der Bezeichnung DSM 5483 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) hinterlegt und steht somit für erfindungsgemäße Entwicklungen zur Verfügung. Die meisten der bisher aus dem Stand der Technik bekannten, hier diskutierten Punktmutationen wurden anhand dieses Moleküls entwickelt und haben sich dabei als besonders erfolgreich hinsichtlich des Beitrags zur Waschleistung herausgestellt, wenn die betreffende Variante in einer Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittelrezeptur eingesetzt wird. Das gleiche gilt für die nachfolgend bezeichneten erfindungsgemäßen Varianten in den Positionen 224, 250 und 253 und/oder 43. Wie oben ausgeführt und mit den Beispielen der vorliegenden Anmeldung illustriert, können die erfindungsgemäßen Austausche zusätzlich auch an solchen Varianten vorgenommen werden, die an sich bereits Weiterentwicklungen des Wildtypmoleküls darstellen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der zuvor beschriebenen Alkalische Protease-Varianten handelt es sich um die Variante ß. /enrus-Alkalische Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 12 oder 38 angegebene Variante.

Diese kann wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt oder anhand der Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO. 11 oder 37 nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden synthetisiert werden. Da Beispiel 1 deren Herstellung über ortsgerichtete Mutagenese beschreibt, es siclxalso nicht um ein aus einem natürlichen Organismus isoliertes Enzym handelt, wird die Angabe „Artificial Sequence" im Sequenzprotokoll bei SEQ ID NO. 11 und 12 auf folgende Weise erläutert: „Variant S3T/V4I/A224V/S250G/S253N of the Alkaline Protease from Bacillus lentus DSM 5483." Sie kann, wie in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung belegt ist, mit vorteilhaften Wirkungen in Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden.

SEQ ID NO. 37 trägt zusätzlich zur Angabe, daß es sich um das die Positionen 1 bis 1143 umfassende Gen für eine Alkalische Protease handelt, wobei das mature Peptid mit der Position 334 beginnt und der tatsächlich für Aminosäuren codierende Bereich die Positionen 1 bis 1140 umfaßt, folgende Angabe bezüglich des Vermerks „Artificial Sequence": „Variant S3T/V4I/A224V/S250G/S253N of the Alkaline Protease from Bacillus lentus DSM 5483; Variation of the signal peptide." Dieselbe Angabe wurde vom Computerprogramm Patentin Version 3.1 - wie bei allen anderen proteincodieren Sequenzen auch - automatisch in SEQ ID NO. 38 übernommen. Sie besagt, daß es sich in dem Bereich des maturen Proteins (in diesem Fall ab Nukleinsäure-Position 334 beziehungsweise Aminosäureposition +1) um dasselbe Enzym wie das von SEQ ID NO. 11 beziehungsweise 12 handelt. Allerdings bestehen im Bereich des vorangegehenden Signalpeptids folgende Unterschiede: Die den Codons -93, -90, -87 und -85 von SEQ ID NO. 11 entsprechenden Codons sind deletiert, und die Codons -92, -91 , -89, -88 und -86 lauten „tcg atc [-] gca tcg [-] gct", wodurch sich gegenüber der Aminosäurefolge FSDSASAAR in SEQ ID NO. 11/12 in SEQ ID NO. 37/38 die Aminosäurefolge [-] S I [-] A S [-] A [-] ergibt, die in deren Zählung den Positionen -89 bis -85 entspricht.

Obleich diese Sequenzvariation nicht auf die Ebene des maturen Proteins durchschlägt, hat es sich insbesondere in ßac///tvs-Spezies als vorteilhaft herausgestellt, derartige Alkalische Proteasen vom Subtilisin-Typ über dieses leicht abgeänderte Signalpeptid zu exprimieren. Aus diesem Grund ist die in SEQ ID NO. 37 und 38 angegebene Variante ebenso bevorzugt wie die, die in SEQ ID NO. 11 und 12 angegeben ist.

Das gleiche gilt für alle anderen erfindungsgemäßen Proteasen, insbesondere für die besonders bevorzugten Vertreter, welche im folgenden eingehender beschrieben werden. Der Einfachheit halber werden sie im Sequenzprotokoll mit dem Signalpeptid gemäß SEQ ID NO. 11 und 12 dargestellt. Doch sind die entsprechenden Signalpeptidvarianten ebenso in den jeweiligen Schutzbereich eingeschlossen. In einer nicht minder bevorzugten Ausführungsform der zuvor beschriebenen Alkalische Protease-Varianten handelt es sich um die Variante ß. enuvs-Alkalische Protease S3T/V4I/L211 D/A224V/S250G/S253N, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 16 angegebene Variante.

Diese kann wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt oder anhand der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 15 nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden synthetisiert werden. Die Angabe „Artificial Sequence" im Sequenzprotokoll wird in diesem Fall auf folgende Weise erläutert: „Variant S3T/V4I/L211 D/A224V/S250G/S253N of the Alkaline Protease from Bacillus lentus DSM 5483." Sie zeigt, wie in den Beispielen belegt ist, bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln vorteilhafte Wirkungen.

In einer weiteren, nicht minder bevorzugten Ausführungsform der zuvor beschriebenen Alkalische Protease-Varianten handelt es sich um die Variante ß. tet/rt/s-Alkalische Protease S3T7V4I/I43V/A224V/S250G/S253N, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 22 angegebene Variante.

Diese kann wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt oder anhand der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 21 nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden synthetisiert werden. Die Angabe „Artificial Sequence" im Sequenzprotokoll wird in diesem Fall auf folgende Weise erläutert: „Variant S3T/V4I/I43V/A224V/S250G/S253N of the Alkaline Protease from Bacillus lentus DSM 5483." Sie zeigt, wie in den Beispielen zur vorliegenden Annmeldung belegt ist, bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln vorteilhafte Wirkungen.

In einer weiteren nicht minder bevorzugten Ausführungsform der zuvor beschriebenen Alkalische Protease-Varianten handelt es sich um die Variante ß. fenft/s-Alkalische Protease S3T/V4I/L211 N/A224V/S250G/S253N, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 26 angegebene Variante.

Diese kann wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt oder anhand der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 25 nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden synthetisiert werden. Die Angabe „Artificial Sequence" im Sequenzprotokoll wird in diesem Fall auf folgende Weise erläutert: „Variant S3T/V4I/L211 N/A224V/S250G/S253N of the Alkaline Protease from Bacillus lentus DSM 5483." Sie zeigt, wie in Beispiel 16 belegt ist, bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln vorteilhafte Wirkungen.

In einer weiteren nicht minder bevorzugten Ausführungsform der zuvor beschriebenen Alkalische Protease-Varianten handelt es sich um die Variante ß. /enfivs-Alkalische Protease S3T/V4I/L211Q/A224V/S250G/S253N, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 30 angegebene Variante.

Diese kann wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt oder anhand der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 29 nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden synthetisiert werden. Die Angabe „Artificial Sequence" im Sequenzprotokoll wird in diesem Fall auf folgende Weise erläutert: „Variant S3T/V4I/L211Q/A224V/S250G/S253N of the Alkaline Protease from Bacillus lentus DSM 5483." Sie zeigt, wie in Beispiel 16 belegt ist, bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln vorteilhafte Wirkungen.

In einer weiteren nicht minder bevorzugten Ausführungsform der zuvor beschriebenen Alkalische Protease-Varianten handelt es sich um die Variante ß. /eπft/s-Alkalische Protease S3T/V4I/L211 E/A224V/S250G/S253N, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 34 angegebene Variante.

Diese kann wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt oder anhand der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 33 nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden synthetisiert werden. Die Angabe „Artificial Sequence" im Sequenzprotokoll wird in diesem Fall auf folgende Weise erläutert: „Variant S3T/V4I/L211 E/A224V/S250G/S253N of the Alkaline Protease from Bacillus lentus DSM 5483." Sie zeigt, wie in Beispiel 16 belegt ist, bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln vorteilhafte Wirkungen.

In einer weiteren nicht minder bevorzugten Ausführungsform der zuvor beschriebenen Alkalische Protease-Varianten handelt es sich um die Variante B. tenrws-Alkalische Protease S3TΛ/4I/I43V/L211 D/A224V/S250G/S253N, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 36 angegebene Variante.

Diese kann wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt oder anhand der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 35 nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden synthetisiert werden. Die Angabe „Artificial Sequence" im Sequenzprotokoll wird in diesem Fall auf folgende Weise erläutert: „Variant S3T/V4I/I43V/L211 D/A224V/S250G/S253N of the Alkaline Protease from Bacillus lentus DSM 5483." Sie zeigt, wie in Beispiel 12 belegt ist, bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln vorteilhafte Wirkungen.

Selbstverständlich können alle bisher beschriebenen Aminosäuresubstitutionen noch weiter miteinander kombiniert werden. So ist es beispielsweise gemäß der Darstellung in Beispiel 5 möglich, Varianten S3T/V4I/I43V/L211N/A224V/S250G/S253N, S3TΛ/4I/I43V/L211 Q/A224V/S250G/S253N oder

S3T/V4I/I43V/L211E/A224V/S250G/S253N, sowohl von der ß. /enfus-Alkalischen Protease herzustellen, als auch von prinzipiell allen anderen im Stand der Technik etablierten Proteasen vom Subtilisin-Typ, wie sie einleitend beschrieben worden sind. Ferner können, wie bereits erläutert, Variationen innerhalb des Leader-Peptids vorgenommen werden, wenn hierdurch die Faltung und/oder die gesamte Produktion des maturen Proteins verbessert werden.

Unter den erfindungsgemäßen Alkalische Protease-Varianten sind jeweils die maturen Proteine bevorzugt.

Denn wie oben erläutert stellen diese die eigentlich aktiven Proteasen dar. Dabei handelt es sich im Falle der hier konkret beschriebenen Varianten gemäß SEQ ID NO. 12, 16, 22, 26, 30, 34, 36 und 38 um die Abschnitte der Aminosäurepositionen 1 bis 269. (Wie oben erläutert in der korrekten Zählung, nach welcher das Propeptid negative Vorzeichen erhält; insgesamt sind dies die 116. bis 384. Aminosäure des gesamten Präproproteins beziehungsweise bei SEQ ID NO. 38 die 112. bis 380. Aminosäure.)

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um solche Proteine, die von den zuvor ausgeführten erfindungsgemäßen Varianten durch Fragmentierung oder Deletionsmutagenese abgeleitet sind und mindestens eine und zunehmend bevorzugt mehrere Aminosäuren umfassen, die mit denen der Positionen 43, 97, 99, 101, 102, 157, 224, 250 und 253 des Ausgangsmoleküls in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 identisch sind, vorzugsweise mit proteolytischer Aktivität.

So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne daß dadurch die proteolytische Aktivität verlorengeht. Solche Mutationen werden beispielsweise in WO 99/49057 A1 beschrieben. WO 01/07575 A2 lehrt, daß durch derartige Deletionen die Allergenizität betreffender Proteasen gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden kann. Die Fragmentierung kommt dem in den nächsten beiden Absätzen ausgeführten Aspekt zugute. Wie oben ausgeführt kennzeichnet die Belegung der Positionen 224, 250 und 253 die erfindungsgemäße Proteasen; insgesamt können die Positionen 43, 97, 99, 101 , 102, 157, 224, 250 und 253 als „Fingerabdruck" angesehen werden, weshalb bevorzugte Ausführungsformen in zunehmend mehr dieser Positionen unverändert sind. Hinsichtlich des beabsichtigten Einsatzes dieser Enzyme ist es besonders bevorzugt, wenn sie auch nach der Fragmentierung oder Deletionsmutagenese eine proteolytische Aktivität besitzen.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um solche Proteine, die von einer erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ durch Insertionsmutagenese, durch Substitutionsmutagenese und/oder durch Fusion mit mindestens einem anderen Protein oder Proteinfragment abgeleitet sind und mindestens eine und zunehmend bevorzugt mehrere Aminosäuren umfassen, die mit denen der Positionen 43, 97, 99, 101 , 102, 157, 224, 250 und 253 des Ausgangsmoleküls in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 identisch sind, vorzugsweise mit proteolytischer Aktivität.

Zahlreiche Dokumente des Stands der Technik offenbaren vorteilhafte Wirkungen von Insertionen und Substitionen in Subtilisinen; darunter auch die genannten Publikationen WO 99/49057 A1 und WO 01/07575 A2. Prinzipiell gehören hierzu auch Einzelaustausche von Aminosäuren, die bereits oben näher ausgeführt worden sind. Es können aber auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren gegen andere ausgetauscht werden. Hierzu gehören auch Neukombinationen von Fragmenten oder größeren Enzymabschnitten mit anderen Proteasen oder Proteinen anderer Funktion. So ist es beispielsweise in Anlehnung an WO 99/57254 A1 möglich, ein erfindungsgemäßes Protein oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Ebenso können erfindungsgemäße Proteine beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben. Unter den zuvor ausgeführten erfindungsgemäßen Proteinen und Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ sind diejenigen mit mindestens einer zusätzlichen Stabilisierung bevorzugt, vorzugsweise über Punktmutagenese.

Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozeß führt dazu, daß ihre Aktivität länger anhält und damit in der Wirkung verstärkt wird. Als Stabilisierungsmöglichkeiten kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und zweckmäßigen Strategien in Betracht, insbesondere die einleitend für Subtilisine dargestellten, bespielsweise gemäß US 5230891 die kovalente Kopplung an ein Polymer.

Bevorzugt sind Stabilisierungen, die über Punktmutagenese des Moleküls selbst möglich sind. Denn diese erfordern im Anschluß an die Proteingewinnung keine weiteren Arbeitsschritte. Einige hierfür geeignete Punktmutationen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. So können gemäß US 6087315 und US 6110884 Proteasen dadurch stabilisiert werden, daß man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht.

Weitere Möglichkeiten sind beispielsweise:

- Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise gemäß der Lehre der Anmeldungen WO 88/08028 A1 und

WO 88/08033 A1 ; gemäß der ersten dieser Schriften müßten eine oder mehrere der an der Calcium-Bindung beteiligten Aminosäure-Reste gegen negativ geladene Aminosäuren ausgetauscht werden; gemäß der Lehre der Anmeldung WO 88/08033 müßten zur Stabilisierung über die Calcium-Bindung gleichzeitig in mindestens einer der Folgen der beiden Reste Arginin/Glycin Punktmutationen eingeführt werden;

- Gemäß dem Patent US 5453372 können Proteine durch bestimmte Mutationen auf der Oberfläche gegen den Einfluß von denaturierenden Agentien wie Tensiden geschützt werden.

Eine andere Möglichkeit zur Stabilisierung gegenüber erhöhter Temperatur und dem Einwirken von Tensiden wäre in Anwendung der Lehre aus WO 92/21760 A1, WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 die Stabilisierung über den Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht- kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten. Dies ist insbesondere für Alkalische Proteasen empfehlenswert, die ursprünglich as ß. lentus erhalten worden sind. Entsprechende Mutanten sind mit den Varianten gemäß SEQ ID NO. 12 und 16 in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben.

Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Molekül auf mehrere Arten stabilisiert wird. Denn beispielsweise nach WO 89/09819 A1 kann davon ausgegangen werden, daß mehrere stabilisierende Mutationen additiv wirken.

Unter den zuvor ausgeführten, erfindungsgemäßen Proteinen und Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ sind ferner diejenigen mit mindestens einer zusätzlichen Derivatisierung bevorzugt.

Unter Derivaten werden solche Proteine verstanden, die sich über eine zusätzliche Modifikation von den ausgeführten Proteinen ableiten. Derartige Modifikationen können beispielsweise die Stabilität, Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können auch dazu dienen, um die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen.

Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch erfolgen, etwa im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den produzierenden Wirtsorganismus. Hier sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben.

Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette oder durch kovalente Bindung einer anderen, beispielsweise makromolekularen Verbindung an das Protein. Eine chemische Modifikation wird beispielsweise in der Anmeldung DE 4013142 A1 beschrieben. Beispielsweise die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts geht aus WO 95/26398 A1 hervor. Es können beispielsweise Makromoleküle wie Proteine, etwa über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. So ist es beispielsweise in Anwendung der Lehre von WO 99/57154 A1 möglich, ein erfindungsgemäßes Protein auch über einen Nichtprotein-Linker mit einer spezifischen Bindungsdomäne zu versehen. Solche Derivate eignen sich besonders für den Einsatz in in Wasch- oder Reinigungsmitteln. Analog WO 00/01831 A2 können auch Protease- Inhibitoren über Linker, insbesondere Aminosäure-Linker an die erfindungsgemäßen Proteine gebunden werden. Kopplungen mit sonstigen makromolekularen Verbindungen, wie etwa Polyethylenglykol verbessern das Molekül hinsichtlich weiterer Eigenschaften wie Stabilität oder Hautverträglichkeit; das wurde bereits erläutert.

Unter Derivaten erfindungsgemäßer Proteine können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Enzyme verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, daß es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine proteolytische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit Protease- Inhibitoren ist vorteilhaft und aus dem Stand der Technik bekannt (WO 00/01826 A2).

Schließlich werden diesem Erfindungsgegenstand alle Proteine und Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ mit wenigstens einer antigenen Determinante eines der zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Proteine oder Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ zugerechnet, zunehmend bevorzugt über eine oder mehrere der Epitop- Regionen, innerhalb derer die Positionen 43, 97, 99, 101, 102, 157, 224, 250 und 253 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 liegen.

Denn wie oben bereits erläutert kennzeichnen die Aminosäuren in den Positionen 224, 250 und 253 beziehungsweise 43 die erfindungsgemäßen Proteasen. Gemeinsam mit den Positionen 97, 99, 101, 102, 157 stellen diese den erwähnten „Fingerabdruck" erfindungsgemäßer Proteine dar. Dies gilt insbesondere für die erfindungsgemäße Belegung dieser Positionen mit einer oder mehreren der Aminosäuren 224V, 250G, 253N, 43V, 97D, 99R, 101A, 1021 und/oder 157S, wobei es zunehmend bevorzugt ist, je mehr davon gleichzeitig realisiert sind. Antikörper, die speziell an diese Bereiche binden, vermögen somit erfindungsrelevante Proteine zu erkennen. Umgekehrt werden unter den erfindungsgemäßen Proteinen und Varianten jene bevorzugt, die über solche Antikörper identifizierbar sind. Dies dient beispielsweise dem Nachweis der betreffenden Enzyme in einer Präparation solcher Enzyme, vorzugsweise in einem erfindungsgemäßen Mittel (siehe unten).

Die Lösung einer Teilaufgabe und somit einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Nukleinsäuren dar, die für eine der beschriebenen, erfindungsgemäßen Alkalische Protease-Varianten codieren.

Das gilt entsprechend bevorzugt für alle als bevorzugt ausgeführten Protease-Varianten, weil für diese ein entsprechend zunehmender Bedarf besteht und somit die dafür codierenden Nukleinsäuren zunehmend wichtiger werden, beispielsweise hinsichtlich der Klonierung, der Weiterentwicklung, der Lagerung oder der Expression und der biotechnologischen Produktion.

Darunter sind die Nukleinsäuren bevorzugt, die in SEQ ID NO. 11, 15, 21, 25, 29, 33, 35 oder 37 dargestellt sind.

Denn hierbei handelt es sich um diejenigen, die für besonders bevorzugte Varianten codieren, für die in den Beispielen der vorliegenden Anmeldungen anhand der Primer von SEQ ID NO. 3 bis 10, 13, 14, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 31 und 32 die molekularbiologische Herstellung beschrieben ist und deren Genprodukte die erwünschten Vorteile aufweisen. Zum anderen werden diese Nukleinsäuren über das vorliegende Sequenzprotokoll zur Verfügung gestellt. Damit können sie außerdem nach weiteren aus dem Stand der Technik bekannten Methoden weiterentwickelt werden.

Weiterhin bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuren enthalten einen Teil, der den Positionen 346 bis 1152 gemäß SEQ ID NO. 1 , 11 , 15, 21 , 25, 29, 33 und 35 beziehungsweise 334 bis 1140 gemäß SEQ ID NO. 37 entspricht.

Denn diese Bereiche codieren für die maturen Proteine (Alkalischen Proteasen), an deren proteolytischer Aktivität erfindungsgemäß das größte Interesse besteht. Andererseits kann es in Hinblick auf den für eine biotechnologische Herstellung durch Kultivierung von Mikroorganismen (siehe unten) ausgesuchten Produktionsstamm vorteilhaft sein, neben der Anpassung der Codon-Usage (siehe unten) die durch das Signalpeptid ausgeübten Effekte zu berücksichtigen. Insofern stellen die Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 11 und 37, obgleich innerhalb des für das mature Protein codierenden Teil identisch, zwei Alternativen dar. Bei der Herstellung in bestimmten ßac///t/s-Spezies hat sich die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 37 gegenüber der von SEQ ID NO. 11 als vorteilhaft herausgestellt. Für andere Spezies mag es umgekehrt sein. Das Einführen weiterer Variationen ist einem mit der Kultivierung von Mikroorganismen vertrauten Biotechnologen an sich bekannt und kennzeichnet entsprechend bevorzugte Ausführungsformen auch des vorliegenden Gegenstands.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Vektoren, die einen der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche enthalten.

Denn um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, und damit insbesondere die Produktion erfindungsgemäßer Proteine vorzubereiten, werden sie geeigneterweise in Vektoren ligiert. Solche Vektoren sowie die zugehörigen Arbeitsmethoden sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Vektoren sind in großer Zahl und Variationsbreite, sowohl für die Klonierung als auch für die Expression kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Bacteriophagen oder von Viren ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren. Ferner werden sie nach der Art der Zelltypen, in denen sie sich zu etablieren vermögen, beispielsweise nach Vektoren für gramnegative, für grampositive Bakterien, für Hefen oder für höhere Eukaryonten unterschieden. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte beispielsweise für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sowie für die Expression des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins.

In einer Ausführungsform handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Klonierungsvektoren.

Denn Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifizierung oder der Selektion des interessierenden Gens für dessen molekularbiologische Charakterisierung. Gleichzeitig stellen sie transportierbare und lagerfähige Formen der beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die PCR oder In-vitro-Mutagenese-Verfahren.

Vorzugsweise handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Expressionsvektoren.

Denn derartige Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die entsprechenden Nukleinsäuren in biologischen Produktionssystemen zu realisieren und damit die zugehörigen Proteine zu produzieren. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus einem anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form einer sogenannten Expressionskassette angeordnet sein. Alternativ können einzelne oder alle Regulationselemente auch von der jeweiligen Wirtszelle bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind die Expressionsvektoren hinsichtlich weiterer Eigenschaften, wie beispielsweise die optimale Kopienzahl, auf das gewählte Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle (siehe unten) abgestimmt.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Zellen, die (aufgrund gentechnischer Modifizierung) einen der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche enthalten.

Der Ausdruck „aufgrund gentechnischer Modifizierung" ist deshalb in Klammern gesetzt worden, weil er letztlich nur der Veranschaulichung dient. Hierzu sei noch einmal in Erinnerung gerufen, daß erfindungsgemäß nur Protease-Varianten beansprucht werden, wie sie natürlicherweise nicht in der Natur vorkommen. Somit können sie, wie oben erläutert, nur über gentechnische Verfahren oder genauer: durch Herstellung eines entsprechenden künstlichen Gens und der Realisierung dessen genetischer Information hergestellt werden. Dementsprechend werden die betreffenden Sequenzen im Sequenzprotokoll auch als „artificial sequence" bezeichnet.

Vorzugsweise ist der genannte Nukleinsäurebereich Teil eines der oben bezeichneten, erfindungsgemäßen Vektoren, insbesondere eines Klonierungs- oder Expressionsvektors. Denn diese Zellen enthalten die genetische Information zur Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins. Sie ermöglichen beispielsweise die Amplifikation der entsprechenden Gene, aber auch deren Mutagenese oder Transkription und Translation und letztlich die biotechnologische Produktion der betreffenden Proteine. Diese genetische Information kann entweder extrachromosomal als eigenes genetisches Element, das heißt bei Bakterien in plasmidaler Lokalisation vorliegen oder in ein Chromosom integriert sein. Die Wahl eines geeigneten Systems hängt von Fragestellungen, wie beispielsweise die Art und Dauer der Lagerung des Gens, beziehungsweise des Organismus oder die Art der Mutagenese oder Selektion ab. So sind im Stand der Technik beispielsweise auf Bakteriophagen - und deren spezifischen Wirtszellen - beruhende Mutagenese- und Selektionsverfahren zur Entwicklung von Waschmittelenzymen beschrieben (WO 97/09446 A1).

Vorzugsweise handelt es sich dabei um Wirtszellen, die eines der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Proteine oder Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ exprimieren.

Denn die die Proteine bildenden Wirtszellen ermöglichen deren biotechnologische Produktion. Sie müssen dafür das betreffende Gen enthalten und zu dessen Transkription, zur Translation und gegebenenfalls den zusätzlichen Modifikationsschritten befähigt sein. Dies geschieht insbesondere unter Einsatz eines der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche, ganz besonders unter Einsatz eines zuvor bezeichneten Expressionsvektors.

Als Wirtszellen zur Proteinexpression eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor, dessen stabile Etablierung und die Regulation der Expression angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Vorzugsweise werden Laborstämme gewählt, die auf die Expression ausgerichtet sind. Solche sind kommerziell oder über allgemein zugängliche Stammsammlungen erhältlich. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise theoretisch aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden. Aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme müssen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden.

Grundsätzlich müssen für Länder, in denen menschliche embryonale Stammzellen nicht unter Patentschutz gestellt werden dürfen, solche erfindungsgemäßen menschlichen embryonalen Stammzellen aus dem Schutzbereich ausgenommen werden.

Besonders vorteilhaft sind Wirtszellen, die selbst Protease-negativ sind und somit gebildete Proteine nicht abbauen. Um solch einen handelt es sich bei dem in den Beispielen 1 bis 7 verwendeten Stamm Bacillus subtilis DB 104.

Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund entsprechender genetischer Elemente in ihrer Aktivität regulierbar sind, beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelldichte. Diese kontrollierbare Expression ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine; sie ist beispielsweise über ein entsprechendes Element auf dem betreffenden Vektor realisierbar. Geeigneterweise sind Gen, Expressionsvektor und Wirtszelle aufeinander abgestimmt, was beispielsweise die zur Expression notwendigen genetischen Elemente (Ribosomen-Bindungsstelle, Promotoren, Terminatoren) oder die Codon-Usage betrifft. Letztere kann beispielsweise dadurch optimiert werden, daß in dem Gen jene Codons, die von dem betreffenden Wirt nur schlecht translatiert werden, bei jeweils gleicher Bedeutung durch die für den jeweiligen Wirt gebräuchlicheren ersetzt werden.

Bevorzugt sind darunter Wirtszellen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Bakterien sind. Hierunter sind solche bevorzugt, die das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretieren.

Denn Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert werden. Zudem verfügt man bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produkt- bildungsrate, Zeitbedarf etc. gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein. Nach der Lehre der Anmeldung DE 10309555.1 kann sowohl in gramnegativen als auch grampositiven Bakterien die Proteinbildungsrate durch Erhöhung der PrfB-Aktivität (Peptide chain release factor B) gesteigert werden, beispielsweise durch den aus Bacillus licheniformis zur Verfügung gestellten Faktor PrfB.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Zelle um ein gramnegatives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsieila planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).

Denn bei gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. In der Anmeldung WO 01/81597 A1 wird ein Verfahren offenbart, nach welchem erreicht wird, daß auch gramnegative Bakterien die exprimierten Proteine ausschleusen. Solch ein System ist auch für die Herstellung erfindungsgemäßer Proteine geeignet. Die als bevorzugt genannten gramnegativen Bakterien sind in der Regel leicht, das heißt kommerziell oder über öffentliche Stammsammlungen zugänglich und im Zusammenspiel mit ebenfalls in großer Zahl zur Verfügung stehenden übrigen Komponenten wie etwa Vektoren auf spezifische Herstellbedingungen hin optimierbar.

In einer alternativen, nicht minder bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Zelle um ein grampositives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder ß. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum.

Denn grampositive Bakterien besitzen den gramnegativen gegenüber den grundsätzlichen Unterschied, sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abzugeben, aus welchem sich, wenn das gewünscht ist, die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aus dem Nährmedium aufreinigen lassen. Zudem sind sie mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Subtilisine verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Subtilisine, so daß sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. Ein weiterer Vorteil kann darin bestehen, daß über dieses Verfahren eine Mischung erfindungsmäßer Proteine mit den endogen von den Wirtsstämmen gebildeten Subtilisinen erhalten werden kann. Solch eine Coexpression geht ebenfalls aus der Anmeldung WO 91/02792 hervor. Sollte sie nicht gewünscht sein, müßten die in der Wirtszelle natürlicherweise vorhandenen Proteasegene dauerhaft oder vorübergehend inaktiviert werden.

Weiter bevorzugt sind erfindungsgemäße Wirtszellen, bei denen es sich um eukaryonti- sche Zellen, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces handelt.

Beispiele hierfür sind Pilze wie Actinomyceten oder eben Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Thermophile pilzliche Expressionssysteme werden beispielsweise in WO 96/02653 A1 vorgestellt. Solche eignen sich besonders zur Expression temperaturbeständiger Varianten. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein.

Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Herstellung eines zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Proteins oder einer zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ dar.

Dazu gehört jedes Verfahren zur Herstellung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, beispielsweise chemische Syntheseverfahren.

In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich dabei um Verfahren, unter Einsatz einer der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, vorzugsweise eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Vektors, besonders bevorzugt unter Einsatz einer der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen. Dazu gehören alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen, beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren, die auf den oben bezeichneten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aufbauen. Hierfür kann entsprechend dem oben Gesagten beispielsweise auf die Wildtypsequenz aus dem hinterlegten Stamm, auf die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1, 11, 15, 21, 25, 29, 33, 35 und 37 angegebenen Nukleinsäuren oder hiervon entsprechend abgeleitete Mutanten oder Teilsequenzen davon zurückgegriffen werden. Entsprechend dem oben Gesagten kann es dabei vorteilhaft sein, nicht nur im nicht-proteincodierenden Teil (etwa dem Promotor) sondern auch im Bereich des Signalpeptids Sequenzvariationen vorzunehmen, die sich günstig auf die Faltung und/oder die Produktion des gewünschten maturen Proteins auswirken.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz eines zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Vektors und besonders bevorzugt vorzugsweise unter Einsatz einer zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Zelle erfolgen. Denn hierdurch wird die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch verwertbarer Form zur Verfügung gestellt.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so daß optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Mittel, dar, die eine oben beschriebene, erfindungsgemäße Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ enthalten.

Hiermit werden alle Arten von Mitteln, insbesondere Gemische, Rezepturen, Lösungen etc., deren Einsetzbarkeit durch Zugabe eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins verbessert wird, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Es kann sich dabei je nach Einsatzgebiet beispielsweise um feste Gemische, beispielsweise Pulver mit gefriergetrockneten oder verkapselten Proteinen, oder um gelförmige oder flüssige Mittel handeln. Bevorzugte Rezepturen enthalten beispielsweise Puffersubstanzen, Stabilisatoren, Reaktionspartner und/oder Cofaktoren der Proteasen und/oder andere mit den Proteasen synergistische Inhaltsstoffe. Insbesondere sind darunter Mittel für die weiter unten ausgeführten Einsatzgebiete zu verstehen. Weitere Einsatzgebiete gehen aus dem Stand der Technik hervor und werden beispielsweise in dem Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998 dargestellt.

Diesem Erfindungsgegenstand werden als bevorzugte Ausführungsform Mittel zugerechnet, bei denen es sich um Wasch- oder Reinigungsmittel handelt.

Denn für Wasch- und Reinigungsmitteln mit erfindungsgemäßen Varianten wird eine Leistungssteigerung erreicht, die mit den Beiträgen von für diesen Zweck etablierten Enzymen zumindest vergleichbar ist, sie in einzelnen Aspekten sogar übertrifft.

Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach dem Stand der Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel. Dazu zählen beispielsweise feste, pulverförmige, flüssige, gelförmige oder pastöse Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel die oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro Gramm des Mittels.

Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132 beschriebenen Methode ermittelt werden. Sie wird dementsprechend in PE (Protease-Einheiten) angegeben. Eine entsprechende detaillierte Anleitung ist Beispiel 8 der vorliegenden Anmeldung zu entnehmen.

Neben einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ enthält ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie Enzymstabilisatoren, Tenside, z. B. nichtionische, anionische und/oder amphotere Tenside, und/oder Bleichmittel, und/oder Builder, sowie gegebenenfalls weitere übliche Inhaltsstoffe, die im folgenden ausgeführt werden.

Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann, beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C- Atomen, zum Beispiel aus Kokos-, Palm-, Taigfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise Cι_2-14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C_9-11-Alkohol mit 7 EO, C_13-15-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C_12-18-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C_12-ι₄-Alkohol mit 3 EO und Cι_2-ι₈-Alkohol mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow ränge ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Taigfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO. Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.

Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhafterweise eingesetzt werden kann, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkypolyglycoside genügen der allgemeinen Formel RO(G)_z, in der R einen linearen oder verzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Glycosylierungsgrad z liegt dabei zwischen 1 ,0 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1 ,0 und 2,0 und insbesondere zwischen 1 ,1 und 1,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare Alkylpolyglucoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.

Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N- dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Der Anteil dieser nichtionischen Tenside liegt vorzugsweise nicht über dem der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere bei nicht mehr als der Hälfte davon.

Weitere geeignete Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (II), R1 I

R-CO-N-[Z] (II)

in der RCO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoff atomen, R¹ für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht. Bei den Polyhydroxyfettsäureamiden handelt es sich um bekannte Stoffe, die üblicherweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers mit Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Alkanolamin und nachfolgende Acylierung mit einer Fettsäure, einem Fettsäurealkylester oder einem Fettsäurechlorid erhalten werden können.

Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (III), R¹-O-R² I R-CO-N-[Z] (III)

in der R für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R² für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei Cι_-4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest steht, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes.

[Z] wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers erhalten, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden.

Als anionische Tenside werden beispielsweise solche vom Typ der Sulfonate und Sulfate eingesetzt. Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C_9-ι₃- Alkylbenzolsulfonate, Olefinsulfonate, das heißt Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus C-ι_2-18- Monoolefinen mit end- oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende Alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in Betracht. Geeignet sind auch Alkansulfonate, die aus Cι_2-ιs-Alkanen beispielsweise durch Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse beziehungsweise Neutralisation gewonnen werden. Ebenso sind auch die Ester von α-Sulfofettsäuren (Estersulfonate), zum Beispiel die α-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren geeignet. Weitere geeignete Aniontenside sind sulfierte Fettsäureglycerinester. Unter Fettsäure- glycerinestern sind die Mono-, Di- und Triester sowie deren Gemische zu verstehen, wie sie bei der Herstellung durch Veresterung von einem Monoglycerin mit 1 bis 3 Mol Fettsäure oder bei der Umesterung von Triglyceriden mit 0,3 bis 2 Mol Glycerin erhalten werden. Bevorzugte sulfierte Fettsäureglycerinester sind dabei die Sulfierprodukte von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoff atomen, beispielsweise der Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Behensäure.

Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der Schwefelsäurehalbester der Cι₂-Cι₈-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol, Taigfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der C₁₀-C₂₀- Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen, auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die C₁₂-C₁₆-Alkylsulfate und C₁₂-C₁₅-Alkylsulfate sowie Cι -C₁₅-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind geeignete Aniontenside.

Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C_7-21-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte C_{9- 1}-Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C_12-18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet. Sie werden in Reinigungsmitteln aufgrund ihres hohen Schaumverhaltens nur in relativ geringen Mengen, beispielsweise in Mengen bis 5 Gew.-%, üblicherweise von 1 bis 5 Gew.-%, eingesetzt.

Weitere geeignete Aniontenside sind auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C_8-ι₈-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen (Beschreibung siehe oben). Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettal- kohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen.

Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.

Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Dioder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.

Die Tenside können in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln insgesamt in einer Menge von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das fertige Mittel, enthalten sein.

Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können Bleichmittel enthalten. Unter den als Bleichmittel dienenden, in Wasser H₂O₂ liefernden Verbindungen haben das Natriumpercarbonat, das Natriumperborattetrahydrat und das Natriumperborat- monohydrat besondere Bedeutung. Weitere brauchbare Bleichmittel sind beispielsweise Peroxopyrophosphate, Citratperhydrate sowie H₂O₂ liefernde persaure Salze oder Persäuren, wie Persulfate beziehungsweise Perschwefelsäure. Brauchbar ist auch das Hamstoffperoxohydrat Percarbamid, das durch die Formel H₂N-CO-NH₂ H₂O₂ beschrieben werden kann. Insbesondere beim Einsatz der Mittel für das Reinigen harter Oberflächen, zum Beispiel beim maschinellen Geschirrspülen, können sie gewünschtenfalls auch Bleichmittel aus der Gruppe der organischen Bleichmittel enthalten, obwohl deren Einsatz prinzipiell auch bei Mitteln für die Textilwäsche möglich ist. Typische organische Bleichmittel sind die Diacylperoxide, wie zum Beispiel Dibenzoylperoxid. Weitere typische organische Bleichmittel sind die Peroxysäuren, wobei als Beispiele besonders die Alkylperoxysäuren und die Arylperoxysäuren genannt werden. Bevorzugte Vertreter sind die Peroxybenzoesäure und ihre ringsubstituierten Derivate, wie Alkylperoxybenzoesäuren, aber auch Peroxy-α-Naphthoesäure und Magnesium-monoperphthalat, die aliphatischen oder substituiert aliphatischen Peroxysäuren, wie Peroxylaurinsäure, Peroxystearinsäure, ε-Phthalimidoper- oxycapronsäure (Phthalimidoperoxyhexansäure, PAP), o-Carboxybenzamidoperoxy- capronsäure, N-Nonenylamidoperadipinsäure und N-Nonenylamidopersuccinate, und aliphatische und araliphatische Peroxydicarbonsäuren, wie 1 ,12-Diperoxycarbonsäure, 1,9-Diperoxyazelainsäure, Diperoxysebacinsäure, Diperoxybrassylsäure, die Diperoxy- phthalsäuren, 2-Decyldiperoxybutan-1 ,4-disäure, N,N-Terephthaloyl-di(6- aminopercapronsäure) können eingesetzt werden.

Der Gehalt der Wasch- oder Reinigungsmittel an Bleichmittel kann 1 bis 40 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, betragen, wobei vorteilhafterweise Perboratmonohydrat oder Percarbonat eingesetzt wird.

Um beim Waschen bei Temperaturen von 60 °C und darunter, und insbesondere bei der Wäschevorbehandlung eine verbesserte Bleichwirkung zu erreichen, können die Mittel auch Bleichaktivatoren enthalten. Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glycolurile, insbesondere 1,3,4,6-Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoyl- succinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), acylierte Hydroxycarbonsäuren, wie Triethyl-O-acetylcitrat (TEOC), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, Isatosäureanhydrid und/oder Bernsteinsäureanhydrid, Carbonsäureamide, wie N-Methyldiacetamid, Glycolid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglycoldiacetat, Isopropenylacetat, 2,5- Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und die aus den deutschen Patentanmeldungen DE 196 16693 und DE 196 16 767 bekannten Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren in der europäischen Patentanmeldung EP 0525239 beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglucose (PAG), Pentaacetylfructose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliert.es, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin beziehungsweise Gluconolacton, Triazol beziehungsweise Triazolderivate und/oder teilchenförmige Caprolactame und/oder Caprolactamderivate, bevorzugt N-acylierte Lactame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam und N-Acetylcaprolactam, die aus den internationalen Patentanmeldungen WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 und WO 95/17498 bekannt sind. Die aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 769 bekannten hydrophil substituierten Acylacetale und die in der deutschen Patentanmeldung DE 196 16770 sowie der internationalen Patentanmeldung WO 95/14075 beschriebenen Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch die aus der deutschen Patentanmeldung DE 4443 177 bekannten Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Ebenso können Nitrilderivate wie Cyanopyridine, Nitrilquats, zum Beispiel N- Alkylammoniumacetonitrile, und/oder Cyanamidderivate eingesetzt werden. Bevorzugte Bleichaktivatoren sind Natrium-4-(octanoyloxy)-benzolsulfonat, n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), Undecenoyl- oxybenzolsulfonat (UDOBS), Natriumdodecanoyloxybenzolsulfonat (DOBS), Decanoyl- oxybenzoesäure (DOBA, OBC 10) und/oder Dodecanoyloxybenzolsulfonat (OBS 12), sowie N-Methylmorpholinum-acetonitril (MMA). Derartige Bleichaktivatoren können im üblichen Mengenbereich von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, enthalten sein.

Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. Bei diesen Stoffen handelt es sich um bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe wie beispielsweise Mn-, Fe-, Co-, Ru - oder Mo-Salenkomplexe oder -carbonylkomplexe. Auch Mn-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- und Cu-Komplexe mit N-haltigen Tripod-Liganden sowie Co-, Fe-, Cu- und Ru-Amminkomplexe sind als Bleichkatalysatoren geeignet, wobei solche Verbindungen bevorzugt eingesetzt werden, die in der DE 19709284 A1 beschrieben sind.

Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten in der Regel einen oder mehrere Builder, insbesondere Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und - wo keine ökologischen Gründe gegen ihren Einsatz sprechen - auch die Phosphate. Letztere sind insbesondere in Reinigungsmitteln für das maschinelle Geschirrspülen bevorzugt einzusetzende Gerüststoffe.

Zu nennen sind hier kristalline, schichtförmige Natriumsilicate der allgemeinen Formel

NaMSi_xO_2x+1-yH₂O, wobei M Natrium oder Wasserstoff bedeutet, x eine Zahl von 1 ,6 bis 4, vorzugsweise 1 ,9 bis 4,0 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Derartige kristalline Schichtsilicate werden beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 164514 beschrieben. Bevorzugte kristalline Schichtsilicate der angegebenen Formel sind solche, in denen M für Natrium steht und x die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl ß- als auch δ-Natriumdisilicate

Na₂Si₂O₅ yH₂O bevorzugt. Im Handel befinden sich derartige Verbindungen beispielsweise unter der Bezeichnung SKS^® (Firma Clariant). So handelt es sich bei

SKS-6^® vorwiegend um ein δ-Natriumdisilicat mit der Formel Na₂Si₂O₅ yH₂O, bei SKS-7^® vorwiegend um das ß-Natriumdisilicat. Durch Reaktion mit Säuren (zum Beispiel Citronensäure oder Kohlensäure) entsteht aus dem δ-Natriumdisilicat Kanemit

NaHSi₂O₅ yH₂O, im Handel unter den Bezeichnungen SKS-9^® beziehungsweise SKS- 10^® (Firma Clariant). Von Vorteil kann es auch sein, chemische Modifikationen dieser Schichtsilicate einzusetzen. So kann beispielsweise die Alkalität der Schichtsilicate geeignet beeinflußt werden. Mit Phosphat beziehungsweise mit Carbonat dotierte Schichtsilicate weisen im Vergleich zu dem δ-Natriumdisilicat veränderte Kristallmorphologien auf, lösen sich schneller und zeigen im Vergleich zu δ- Natriumdisilicat ein erhöhtes Calciumbindevermögen. So sind Schichtsilicate der allgemeinen Summenformel x Na₂O • y SiO₂ • z P₂O₅, in der das Verhältnis x zu y einer Zahl 0,35 bis 0,6, das Verhältnis x zu z einer Zahl von 1,75 bis 1200 und das Verhältnis y zu z einer Zahl von 4 bis 2800 entsprechen, in der Patentanmeldung DE 196 01 063 beschrieben. Die Löslichkeit der Schichtsilicate kann auch erhöht werden, indem besonders feinteilige Schichtsilicate eingesetzt werden. Auch Compounds aus den kristallinen Schichtsilicaten mit anderen Inhaltsstoffen können eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere Compounds mit Cellulosederivaten, die Vorteile in der desintegrierenden Wirkung aufweisen und insbesondere in Waschmitteltabletten eingesetzt werden, sowie Compounds mit Polycarboxylaten, zum Beispiel Citronensäure, beziehungsweise polymeren Polycarboxylaten, zum Beispiel Copolymeren der Acrylsäure, zu nennen. Einsetzbar sind auch amorphe Natriumsilikate mit einem Modul Na₂O : SiO₂ von 1 :2 bis 1 :3,3, vorzugsweise von 1 :2 bis 1 :2,8 und insbesondere von 1 :2 bis 1 :2,6, welche löseverzögert sind und Sekundärwascheigenschaften aufweisen. Die Löseverzögerung gegenüber herkömmlichen amorphen Natriumsilikaten kann dabei auf verschiedene Weise, beispielsweise durch Oberflächenbehandlung, Compoundierung, Kompaktierung/ Verdichtung oder durch Übertrocknung hervorgerufen worden sein. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter dem Begriff "amorph" auch "röntgenamorph" verstanden. Dies heißt, daß die Silikate bei Röntgenbeugungsexperimenten keine scharfen Röntgenreflexe liefern, wie sie für kristalline Substanzen typisch sind, sondern allenfalls ein oder mehrere Maxima der gestreuten Röntgenstrahlung, die eine Breite von mehreren Gradeinheiten des Beugungswinkels aufweisen. Es kann jedoch sehr wohl sogar zu besonders guten Buildereigenschaften führen, wenn die Silikatpartikel bei Elektronenbeugungsexperimenten verwaschene oder sogar scharfe Beugungsmaxima liefern. Dies ist so zu interpretieren, daß die Produkte mikrokristalline Bereiche der Größe 10 bis einige Hundert nm aufweisen, wobei Werte bis max. 50 nm und insbesondere bis max. 20 nm bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt sind verdichtete/kompaktierte amorphe Silikate, compoundierte amorphe Silikate und übertrocknete röntgenamorphe Silikate.

Ein gegebenenfalls einsetzbarer, feinkristalliner, synthetischer und gebundenes Wasser enthaltender Zeolith ist vorzugsweise Zeolith A und/oder P. Als Zeolith P wird Zeolith MAP^® (Handelsprodukt der Firma Crosfield) besonders bevorzugt. Geeignet sind jedoch auch Zeolith X sowie Mischungen aus A, X und/oder P. Kommerziell erhältlich und im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbar ist beispielsweise auch ein Co-Kristallisat aus Zeolith X und Zeolith A (ca. 80 Gew.-% Zeolith X), das von der Firma CONDEA Augusta S.p.A. unter dem Markennamen VEGOBOND AX^® vertrieben wird und durch die Formel nNa₂O ' (1-n)K₂O ^■ AI₂O₃ ^■ (2 - 2,5)SiO₂ (3,5 - 5,5) H₂O

beschrieben werden kann. Geeignete Zeolithe weisen eine mittlere Teilchengröße von weniger als 10 μm (Volumenverteilung; Meßmethode: Coulter Counter) auf und enthalten vorzugsweise 18 bis 22 Gew.-%, insbesondere 20 bis 22 Gew.-% an gebundenem Wasser. Selbstverständlich ist auch ein Einsatz der allgemein bekannten Phosphate als Buildersubstanzen möglich, sofern ein derartiger Einsatz nicht aus ökologischen Gründen vermieden werden sollte. Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatrium- beziehungsweise Pentakaliumtriphosphat (Natrium- beziehungsweise Kaliumtripolyphosphat) in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie die größte Bedeutung.

Alkalimetallphosphate ist dabei die summarische Bezeichnung für die Alkalimetall- (insbesondere Natrium- und Kalium-) -Salze der verschiedenen Phosphorsäuren, bei denen man Metaphosphorsäuren (HPO₃)_n und Orthophosphorsäure H₃PO neben höhermolekularen Vertretern unterscheiden kann. Die Phosphate vereinen dabei mehrere Vorteile in sich: Sie wirken als Alkaliträger, verhindern Kalkbeläge auf Maschinenteilen beziehungsweise Kalkinkrustationen in Geweben und tragen überdies zur Reinigungsleistung bei.

Natriumdihydrogenphosphat, NaH₂PO₄, existiert als Dihydrat (Dichte 1,91 gern^"3, Schmelzpunkt 60°) und als Monohydrat (Dichte 2,04 gern^"3). Beide Salze sind weiße, in Wasser sehr leicht lösliche Pulver, die beim Erhitzen das Kristallwasser verlieren und bei 200°C in das schwach saure Diphosphat (Dinatriumhydrogendiphosphat, Na₂H₂P₂O₇), bei höherer Temperatur in Natiumtrimetaphosphat (Na₃P₃O_g) und Maddrellsches Salz (siehe unten), übergehen. NaH₂PO₄ reagiert sauer; es entsteht, wenn Phosphorsäure mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und die Maische versprüht wird. Kaliumdihydrogenphosphat (primäres oder einbasiges Kaliumphosphat, Kaliumbiphosphat, KDP), KH₂PO , ist ein weißes Salz der Dichte 2,33 gern^"3, hat einen Schmelzpunkt von 253°C [Zersetzung unter Bildung von Kaliumpolyphosphat (KPO₃)_x] und ist leicht löslich in Wasser.

Dinatriumhydrogenphosphat (sekundäres Natriumphosphat), Na₂HPO , ist ein farbloses, sehr leicht wasserlösliches kristallines Salz. Es existiert wasserfrei und mit 2 Mol. (Dichte 2,066 gern^"3, Wasserverlust bei 95°), 7 Mol. (Dichte 1,68 gern^"3, Schmelzpunkt 48°C unter Verlust von 5 H₂O) und 12 Mol. Wasser (Dichte 1,52 gern^"3, Schmelzpunkt 35°C unter Verlust von 5 H₂O), wird bei 100°C wasserfrei und geht bei stärkerem Erhitzen in das Diphosphat Na₄P₂O₇ über. Dinatriumhydrogenphosphat wird durch Neutralisation von Phosphorsäure mit Sodalösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator hergestellt. Dikaliumhydrogenphosphat (sekundäres od. zweibasiges Kaliumphosphat), K₂HPO₄, ist ein amorphes, weißes Salz, das in Wasser leicht löslich ist.

Trinatriumphosphat, tertiäres Natriumphosphat, Na₃PO₄, sind farblose Kristalle, die als Dodecahydrat eine Dichte von 1 ,62 gern^"3 und einen Schmelzpunkt von 73-76°C (Zersetzung), als Decahydrat (entsprechend 19-20% P₂O₅) einen Schmelzpunkt von 100°C und in wasserfreier Form (entsprechend 39-40% P₂O₅) eine Dichte von 2,536 gern^"3 aufweisen. Trinatriumphosphat ist in Wasser unter Alkalischer Reaktion leicht löslich und wird durch Eindampfen einer Lösung aus genau 1 Mol Dinatriumphosphat und 1 Mol NaOH hergestellt. Trikaliumphosphat (tertiäres oder dreibasiges Kaliumphosphat), K₃PO , ist ein weißes, zerfließliches, körniges Pulver der Dichte 2,56 gern^"3, hat einen Schmelzpunkt von 1340° und ist in Wasser mit Alkalischer Reaktion leicht löslich. Es entsteht zum Beispiel beim Erhitzen von Thomasschlacke mit Kohle und Kaliumsulfat. Trotz des höheren Preises werden in der Reinigungsmittel-Industrie die leichter löslichen, daher hochwirksamen, Kaliumphosphate gegenüber entsprechenden Natrium-Verbindungen vielfach bevorzugt.

Tetranatriumdiphosphat (Natriumpyrophosphat), Na₄P₂O₇, existiert in wasserfreier Form (Dichte 2,534 gern^"3, Schmelzpunkt 988°C, auch 880°C angegeben) und als Decahydrat (Dichte 1,815-1 ,836 gern^"3, Schmelzpunkt 94°C unter Wasserverlust). Beide Substanzen sind farblose, in Wasser mit Alkalischer Reaktion lösliche Kristalle. Na₄P₂O₇ entsteht beim Erhitzen von Dinatriumphosphat auf >200°C oder indem man Phosphorsäure mit Soda im stöchiometrischem Verhältnis umsetzt und die Lösung durch Versprühen entwässert. Das Decahydrat komplexiert Schwermetall-Salze und Härtebildner und verringert daher die Härte des Wassers. Kaliumdiphosphat (Kaliumpyrophosphat), K₄P₂O₇, existiert in Form des Trihydrats und stellt ein farbloses, hygroskopisches Pulver mit der Dichte 2,33 gern^"3 dar, das in Wasser löslich ist, wobei der pH-Wert der 1%igen Lösung bei 25°C 10,4 beträgt.

Durch Kondensation des NaH₂PO beziehungsweise des KH₂PO₄ entstehen höhermolekulare Natrium- und Kaliumphosphate, bei denen man cyclische Vertreter, die Natrium- beziehungsweise Kaliummetaphosphate und kettenförmige Typen, die Natriumbeziehungsweise Kaliumpolyphosphate, unterscheiden kann. Insbesondere für letztere sind eine Vielzahl von Bezeichnungen in Gebrauch: Schmelz- oder Glühphosphate, Grahamsches Salz, Kurrolsches und Maddrellsches Salz. Alle höheren Natrium- und Kaliumphosphate werden gemeinsam als kondensierte Phosphate bezeichnet.

Das technisch wichtige Pentanatriumtriphosphat (Na₅P₃O₁₀; Natriumtripolyphosphat) ist ein wasserfrei oder mit 6 H₂O kristallisierendes, nicht hygroskopisches, weißes, wasserlösliches Salz der allgemeinen Formel NaO-[P(O)(ONa)-O]_n-Na mit n=3. In 100 g Wasser lösen sich bei Zimmertemperatur etwa 17 g, bei 60°C ca. 20 g, bei 100°C rund 32 g des kristallwasserfreien Salzes; nach zweistündigem Erhitzen der Lösung auf 100°C entstehen durch Hydrolyse etwa 8% Orthophosphat und 15% Diphosphat. Bei der Herstellung von Pentanatriumtriphosphat wird Phosphorsäure mit Sodalösung oder Natronlauge im stöchiometrischen Verhältnis zur Reaktion gebracht und die Lösung durch Versprühen entwässert. Ähnlich wie Grahamsches Salz und Natriumdiphosphat löst Pentanatriumtriphosphat viele unlösliche Metall-Verbindungen (auch Kalkseifen usw.). Pentakaliumtriphosphat, K₅P₃θ₁₀ (Kaliumtripolyphosphat), kommt beispielsweise in Form einer 50 Gew.-%-igen Lösung (> 23% P₂O₅, 25% K₂O) in den Handel. Die Kaliumpolyphosphate finden in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie breite Verwendung. Weiter existieren auch Natriumkaliumtripolyphosphate, welche ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind. Diese entstehen beispielsweise, wenn man Natriumtrimetaphosphat mit KOH hydrolysiert:

(NaPO₃)₃ + 2 KOH -» Na₃K₂P₃O₁₀ + H₂O

Diese sind erfindungsgemäß genau wie Natriumtripolyphosphat, Kaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus diesen beiden einsetzbar; auch Mischungen aus Natriumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Gemische aus Natriumtripolyphosphat und Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat sind erfindungsgemäß einsetzbar.

Als organische Cobuilder können in den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere Polycarboxylate oder Polycarbonsäuren, polymere Polycarboxylate, Polyasparaginsäure, Polyacetale, gegebenenfalls oxidierte Dextrine, weitere organische Cobuilder (siehe unten) sowie Phosphonate eingesetzt werden. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben. Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren, Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht zu vermeiden ist, sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der Polycarbonsäuren wie Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Zuckersäuren und Mischungen aus diesen.

Auch die Säuren an sich können eingesetzt werden. Sie besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch- oder Reinigungsmitteln, sofern nicht der sich durch die Mischung der übrigen Komponenten ergebende pH-Wert gewünscht ist. Insbesondere sind hierbei system- und umweltverträgliche Säuren wie Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide können als pH-Regulatoren dienen. Derartige Regulatoren sind in den erfindungemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1 ,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.

Als Builder sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70 000 g/mol.

Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen M_w der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.

Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2 000 bis 20 000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2 000 bis 10 000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3 000 bis 5 000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein.

Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2 000 bis 70 000 g/mol, vorzugsweise 20 000 bis 50 000 g/mol und insbesondere 30 000 bis 40 000 g/mol. Die (co-) polymeren Polycarboxylate können entweder als Pulver oder als wässerige Lösung eingesetzt werden. Der Gehalt der Mittel an (co-)polymeren Polycarboxylaten kann von 0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-%, betragen.

Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie beispielsweise Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer enthalten.

Insbesondere bevorzugt sind auch biologisch abbaubare Polymere aus mehr als zwei verschiedenen Monomereinheiten, beispielsweise solche, die als Monomere Salze der Acrylsäure und der Maleinsäure sowie Vinylalkohol beziehungsweise Vinylalkohol- Derivate oder die als Monomere Salze der Acrylsäure und der 2-Alkylallylsulfonsäure sowie Zucker-Derivate enthalten.

Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Acrolein und Vinylacetat aufweisen. Ebenso sind als weitere bevorzugte Buildersubstanzen polymere Aminodicarbonsäuren, deren Salze oder deren Vorläufersubstanzen zu nennen. Besonders bevorzugt sind Polyasparaginsäuren beziehungsweise deren Salze und Derivate.

Weitere geeignete Buildersubstanzen sind Polyacetale, welche durch Umsetzung von Dialdehyden mit Polyolcarbonsäuren, welche 5 bis 7 C-Atome und mindestens 3 Hydroxylgruppen aufweisen, erhalten werden können. Bevorzugte Polyacetale werden aus Dialdehyden wie Glyoxal, Glutaraldehyd, Terephthalaldehyd sowie deren Gemischen und aus Polyolcarbonsäuren wie Gluconsäure und/oder Glucoheptonsäure erhalten.

Weitere geeignete organische Buildersubstanzen sind Dextrine, beispielsweise Oligomere beziehungsweise Polymere von Kohlenhydraten, die durch partielle Hydrolyse von Stärken erhalten werden können. Die Hydrolyse kann nach üblichen, beispielsweise säure- oder enzym katalysierten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich um Hydrolyseprodukte mit mittleren Molmassen im Bereich von 400 bis 500 000 g/mol. Dabei ist ein Polysaccharid mit einem Dextrose-Äquivalent (DE) im Bereich von 0,5 bis 40, insbesondere von 2 bis 30 bevorzugt, wobei DE ein gebräuchliches Maß für die reduzierende Wirkung eines Polysaccharids im Vergleich zu Dextrose ist, welche ein DE von 100 besitzt. Brauchbar sind sowohl Maltodextrine mit einem DE zwischen 3 und 20 und Trockenglucosesirupe mit einem DE zwischen 20 und 37 als auch sogenannte Gelbdextrine und Weißdextrine mit höheren Molmassen im Bereich von 2 000 bis 30 000 g/mol.

Bei den oxidierten Derivaten derartiger Dextrine handelt es sich um deren Umsetzungsprodukte mit Oxidationsmitteln, welche in der Lage sind, mindestens eine Alkoholfunktion des Saccharidrings zur Carbonsäurefunktion zu oxidieren. Besonders bevorzugte organische Builder für erfindungsgemäße Mittel sind oxidierte Stärken, beziehungsweise deren Derivate aus den Anmeldungen EP 472042, WO 97/25399 und EP 755944.

Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise Ethylen- diamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird Ethylendiamin-N,N^'- disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate und Glycerintrisuccinate. Geeignete Einsatzmengen liegen in zeolith-, carbonat- und/oder silicathaltigen Formulierungen zwischen 3 und 15 Gew.-%.

Weitere brauchbare organische Cobuilder sind beispielsweise acetylierte Hydroxy- carbonsäuren beziehungsweise deren Salze, welche gegebenenfalls auch in Lactonform vorliegen können und welche mindestens 4 Kohlenstoffatome und mindestens eine Hydroxygruppe sowie maximal zwei Säuregruppen enthalten.

Eine weitere Substanzklasse mit Cobuildereigenschaften stellen die Phosphonate dar. Dabei handelt es sich insbesondere um Hydroxyalkan- beziehungsweise Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1- Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriamin- pentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, z. B. als Hexanatriumsalz der EDTMP beziehungsweise als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.

Darüberhinaus können alle Verbindungen, die in der Lage sind, Komplexe mit Erdalkaliionen auszubilden, als Cobuilder eingesetzt werden.

Buildersubstanzen können in den erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln gegebenenfalls in Mengen bis zu 90 Gew.-% enthalten sein. Sie sind vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-% enthalten. Erfindungsgemäße Waschmittel weisen Buildergehalte von insbesondere 5 Gew.-% bis 50 Gew.-% auf. In erfindungsgemäßen Mitteln für die Reinigung harter Oberflächen, insbesondere zur maschinellen Reinigung von Geschirr, beträgt der Gehalt an Buildersubstanzen insbesondere 5 Gew.-% bis 88 Gew.-%, wobei in derartigen Mitteln vorzugsweise keine wasserunlöslichen Buildermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfindungs- gemäßer Mittel zur insbesondere maschinellen Reinigung von Geschirr sind 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% wasserlöslicher organischer Builder, insbesondere Alkalicitrat, 5 Gew.-% bis 15 Gew.-% Alkalicarbonat und 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% Alkalidisilikat enthalten.

Lösungsmittel, die in den flüssigen bis gelförmigen Zusammensetzungen von Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden können, stammen beispielsweise aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glycolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanolen, Ethylen- glykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono- n-butylether, Diethylenglykol-methylether, Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propyl-ether, Dipropylenglykolmonomethyl-, oder - ethylether, Di-isopropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol- t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel.

Lösungsmittel können in den erfindungsgemäßen flüssigen bis gelförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln in Mengen zwischen 0,1 und 20 Gew.-%, bevorzugt aber unter 15 Gew.-% und insbesondere unterhalb von 10 Gew.-% eingesetzt werden.

Zur Einstellung der Viskosität können der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein oder mehrere Verdicker, beziehungsweise Verdickungssysteme zugesetzt werden. Diese hochmolekularen Stoffe, die auch Quell(ungs)mittel genannt werden, saugen meist die Flüssigkeiten auf und quellen dabei auf, um schließlich in zähflüssige echte oder kolloide Lösungen überzugehen.

Geeignete Verdicker sind anorganische oder polymere organische Verbindungen. Zu den anorganischen Verdickern zählen beispielsweise Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäuern und Bentonite. Die organischen Verdicker stammen aus den Gruppen der natürlichen Polymere, der abgewandelten natürlichen Polymere und der vollsynthetischen Polymere. Solche aus der Natur stammenden Polymere sind beispielsweise Agar-Agar, Carrageen, Tragant, Gummi arabicum, Alginate, Pektine, Polyosen, Guar-Mehl, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine und Casein. Abgewandelte Naturstoffe, die als Verdicker verwendet werden, stammen vor allem aus der Gruppe der modifizierten Stärken und Cellulosen. Beispielhaft seien hier Carboxymethylcellulose und andere Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose sowie Kernmehlether genannt. Vollsynthetische Verdicker sind Polymere wie Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen, Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine, Polyamide und Polyurethane.

Die Verdicker können in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-%, und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf die fertige Zusammensetzung, enthalten sein.

Das erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel kann gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyte und weitere Hilfsstoffe, wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbüber- tragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffe, Färb- und/oder Duftstoffe, sowie mikrobielle Wirkstoffe, UV-Absorbenzien und/oder Enzymstabilisatoren enthalten.

Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1 ,3,5-triazinyl-6- amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4- Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.

Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.

Um einen Silberkorrosionsschutz zu bewirken, können in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln für Geschirr Silberkorrosionsinhibitoren eingesetzt werden. Solche sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise Benzotriazole, Eisen(lll)-chlorid oder CoSO₄. Wie beispielsweise aus der europäischen Patentschrift EP 0 736 084 B1 bekannt ist, sind für die gemeinsame Verwendung mit Enzymen besonders geeignete Silberkorrosionsinhibitoren Mangan-, Titan-, Zirkonium-, Hafnium-, Vanadium-, Cobalt- oder Cersalze und/oder -komplexe, in denen die genannten Metalle in einer der Oxidationsstufen II, III, IV, V oder VI vorliegen. Beispiele für derartige Verbindungen sind MnSO , V₂O₅, V₂O₄, VO₂, TiOSO₄, K₂TiF₆, K₂ZrF₆, Co(NO₃)₂, Co(NO₃)₃, sowie deren Gemische.

"Soil-Release"-Wirkstoffe oder "Soil-Repellents" sind zumeist Polymere, die bei der Verwendung in einem Waschmittel der Wäschefaser schmutzabstoßende Eigenschaften verleihen und/oder das Schmutzablösevermögen der übrigen Waschmittelbestandteile unterstützen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei deren Einsatz in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen beobachtet werden.

Besonders wirksame und seit langer Zeit bekannte Soil-Release-Wirkstoffe sind Co- polyester mit Dicarbonsäure-, Alkylenglykol- und Polyalkylenglykoleinheiten. Beispiele dafür sind Copolymere oder Mischpolymere aus Polyethylenterephthalat und Polyoxyethylenglykol (DT 16 17 141 , beziehungsweise DT 22 00 911). In der deutschen Offenlegungsschrift DT 22 53063 sind saure Mittel genannt, die unter anderem ein Copolymer aus einer dibasigen Carbonsäure und einem Alkylen- oder Cycloalkylenpolyglykol enthalten. Polymere aus Ethylenterephthalat und Polyethylenoxid-terephthalat und deren Einsatz in Waschmitteln sind in den deutschen Schriften DE 28 57292 und DE 33 24 258 und der Europäischen Patentschrift EP 0 253 567 beschrieben. Das europäische Patent EP 066944 betrifft Mittel, die einen Copolyester aus Ethylenglykol, Polyethylenglykol, aromatischer Dicarbonsäure und sulfonierter aromatischer Dicarbonsäure in bestimmten Molverhältnissen enthalten. Aus dem europäischen Patent EP 0 185427 sind Methyl- oder Ethylgruppen- endverschlossene Polyester mit Ethylen- und/oder Propylen-terephthalat- und Polyethylenoxid-terephthalat-Einheiten und Waschmitel, die derartiges Soil-release- Polymer enthalten, bekannt. Das europäische Patent EP 0 241 984 betrifft einen Polyester, der neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten auch substituierte Ethyleneinheiten sowie Glycerineinheiten enthält. Aus dem europäischen Patent EP 0 241 985 sind Polyester bekannt, die neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten 1 ,2-Propylen-, 1 ,2-Butylen- und/oder 3-Methoxy-1 , 2- propylengruppen sowie Glycerineinheiten enthalten und mit d- bis C -Alkylgruppen endgruppenverschlossen sind. Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 272 033 sind zumindest anteilig durch Cι- -Alkyl- oder Acylreste endgruppenverschlossene Polyester mit Poly-propylenterephthalat- und Polyoxyethylenterephthalat-Einheiten bekannt. Das europäische Patent EP 0 274 907 beschreibt sulfoethyl- endgruppenverschlossene terephthalathaltige Soil-release-Polyester. Gemäß der europäischen Patentanmeldung EP 0 357 280 werden durch Sulfonierung ungesättigter Endgruppen Soil-Release-Polyester mit Terephthalat-, Alkylenglykol- und Poly-C_2-4- Glykol-Einheiten hergestellt. Die internationale Patentanmeldung WO 95/32232 betrifft saure, aromatische schmutzablösevermögende Polyester. Aus der internationalen Patentanmeldung WO 97/31085 sind nicht polymere soil-repellent-Wirkstoffe für Materialien aus Baumwolle mit mehreren funktioneilen Einheiten bekannt: Eine erste Einheit, die beispielsweise kationisch sein kann, ist zur Adsorption auf die Baumwolloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkung befähigt, und eine zweite Einheit, die hydrophob ausgebildet ist, ist verantwortlich für das Verbleiben des Wirkstoffs an der Wasser/ Baumwolle-Grenzfläche.

Zu den für den Einsatz in erfindungsgemäßen Textilwaschmitteln in Frage kommenden Farbübertragungsinhibitoren gehören insbesondere Polyvinylpyrrolidone, Polyvinyl- imidazole, polymere N-Oxide wie Poly-(vinylpyridin-N-oxid) und Copolymere von Vinyl- pyrrolidon mit Vinylimidazol.

Beim Einsatz in maschinellen Reinigungsverfahren kann es von Vorteil sein, den betreffenden Mitteln Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an Cι₈-C₂₄-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls signierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit signierter Kieselsäure oder Bistearylethylendiamid. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granuläre, in Wasser lösliche, beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamiden bevorzugt.

Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen kann darüber hinaus abrasiv wirkende Bestandteile, insbesondere aus der Gruppe umfassend Quarzmehle, Holzmehle, Kunststoffmehle, Kreiden und Mikroglaskugeln sowie deren Gemische, enthalten. Abrasivstoffe sind in den erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 15 Gew.-%, enthalten.

Färb- und Duftstoffe werden Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt, um den ästhetischen Eindruck der Produkte zu verbessern und dem Verbraucher neben der Wasch- und Reinigungsleistung ein visuell und sensorisch "typisches und unverwechselbares" Produkt zur Verfügung zu stellen. Als Parfümöle beziehungsweise Duftstoffe können einzelne Riechstoffverbindungen, zum Beispiel die synthetischen Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind zum Beispiel Benzylacetat, Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzyl-carbinylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenyl-glycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden zum Beispiel die linearen Alkanale mit 8-18 C-Atomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen zum Beispiel die Jonone, α-lsomethylionon und Methyl-cedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene wie Limonen und Pinen. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Solche Parfümöle können auch natürliche Riechstoffgemische enthalten, wie sie aus pflanzlichen Quellen zugänglich sind, zum Beispiel Pine-, Citrus-, Jasmin-, Patchouly-, Rosen- oder Ylang-Ylang-Öl. Ebenfalls geeignet sind Muskateller, Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeeröl, Vetiveröl, Olibanumöl, Galbanumöl und Labdanumöl sowie Orangenblütenöl, Neroliol, Orangenschalenöl und Sandelholzöl. Üblicherweise liegt der Gehalt von Wasch- und Reinigungsmitteln an Farbstoffen unter 0,01 Gew.-%, während Duftstoffe bis zu 2 Gew.-% der gesamten Formulierung ausmachen können.

Die Duftstoffe können direkt in die Wasch- oder Reinigungsmittel eingearbeitet werden, es kann aber auch vorteilhaft sein, die Duftstoffe auf Träger aufzubringen, die die Haftung des Parfüms auf dem Reinigungsgut verstärken und durch eine langsamere Duftfreisetzung für langanhaltenden Duft, insbesondere von behandelten Textilien sorgen. Als solche Trägermaterialien haben sich beispielsweise Cyclodextrine bewährt, wobei die Cyclodextrin-Parfüm-Komplexe zusätzlich noch mit weiteren Hilfsstoffen beschichtet werden können. Ein weiter bevorzugter Träger für Duftstoffe ist der beschriebene Zeolith X, der anstelle von oder in Mischung mit Tensiden auch Duftstoffe aufnehmen kann. Bevorzugt sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, die den beschriebenen Zeolith X und Duftstoffe, die vorzugsweise zumindest teilweise an dem Zeolithen absorbiert sind, enthalten.

Bevorzugte Farbstoffe, deren Auswahl dem Fachmann keinerlei Schwierigkeit bereitet, besitzen eine hohe Lagerstabilität und Unempfindlichkeit gegenüber den übrigen Inhaltsstoffen der Mittel und gegen Licht sowie keine ausgeprägte Substantivität gegenüber Textilfasern, um diese nicht anzufärben.

Zur Bekämpfung von Mikroorganismen können Wasch- oder Reinigungsmittel antimikrobielle Wirkstoffe enthalten. Hierbei unterscheidet man je nach antimikrobiellem Spektrum und Wirkungsmechanismus zwischen Bakteriostatika und Bakteriziden, Fungistatika und Fungiziden usw. Wichtige Stoffe aus diesen Gruppen sind beispielsweise Benzalkoniumchloride, Alkylarylsulfonate, Halogenphenole und Phenolmercuriacetat. Die Begriffe antimikrobielle Wirkung und antimikrobieller Wirkstoff haben im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre die fachübliche Bedeutung, die beispielsweise von K. H. Wallhäußer in „Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung : Keimidentifizierung - Betriebshygiene" (5. Aufl. - Stuttgart; New York : Thieme, 1995) wiedergegeben wird, wobei alle dort beschriebenen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung eingesetzt werden können. Geeignete antimikrobielle Wirkstoffe sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen der Alkohole, Amine, Aldehyde, antimikrobiellen Säuren beziehungsweise deren Salze, Carbonsäureester, Säureamide, Phenole, Phenolderivate, Diphenyle, Diphenylalkane, Hamstoffderivate, Sauerstoff-, Stickstoff-acetale sowie -formale, Benzamidine, Isothiazoline, Phthalimidderivate, Pyri- dinderivate, antimikrobiellen oberflächenaktiven Verbindungen, Guanidine, antimikrobiellen amphoteren Verbindungen, Chinoline, 1 ,2-Dibrom-2,4-dicyanobutan, lodo-2- propyl-butyl-carbamat, lod, lodophore, Peroxoverbindungen, Halogenverbindungen sowie beliebigen Gemischen der voranstehenden.

Der antimikrobielle Wirkstoff kann dabei ausgewählt sein aus Ethanol, n-Propanol, i- Propanol, 1,3-Butandiol, Phenoxyethanol, 1 ,2-Propylenglykol, Glycerin, Undecylensäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Dihydracetsäure, o-Phenylphenol, N-Methylmorpholin- acetonitril (MMA), 2-Benzyl-4-chlorphenol, 2,2'-Methylen-bis-(6-brom-4-chlorphenol), 4,4'-Dichlor-2'-hydroxydiphenylether (Dichlosan), 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether (Trichlosan), Chlorhexidin, N-(4-Chlorphenyl)-N-(3,4-dichlorphenyl)-hamstoff, N,N'-(1 ,10- decan-diyldi-1-pyridinyl-4-yliden)-bis-(1-octanamin)-dihydrochlorid, N,N'-Bis-(4-chlorphe- nyl)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecandiimidamid, Glucoprotaminen, antimikrobiellen oberflächenaktiven quaternären Verbindungen, Guanidinen einschl. den Bi- und Polyguanidinen, wie beispielsweise 1 ,6-Bis-(2-ethylhexyl-biguanido-hexan)- dihydrochlorid, 1.e-DKN^N^-phenyldiguanido-Ns.Ns'J-hexan-tetrahydochlorid, 1 ,6-Di- (N^Ni'-phenyl-N^Ni-methyldiguanido-Ns.Ns^-hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N₁,N₁'-o- chlorophenyldiguanido- Ns.Ns -hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(Nι,N₁'-2,6- dichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, l .δ-DKN_LN^- eta-φ- methoxyphenyl) diguanido-N₅,N₅']-hexane-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N₁,N₁'-alpha-methyl- .beta.-phenyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N₁,N₁'-p- nitrophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-( N^N - phenyldiguanido-N5,N₅')-di-n-propylether-dihydrochlorid, omega:omega'-Di-(N₁,N₁'-p- chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')-di-n-propylether-tetrahydrochlorid, 1 ,6-Di-(N ,N₁'-2,4- dichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-p- methylphenyldiguanido- N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N₁,N₁'-2,4,5- trichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid, l

chlorophenyl) ethyldiguanido-N₅,N₅'] hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N₁,N₁'-p- chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')m-xylene-dihydrochlorid, 1 ,12-Di-(N₁,N-ι'-p- chlorophenyldiguanido-N₅,N ') dodecan-dihydrochlorid, 1 ,10-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido- N₅,N₅')-decan-tetrahydrochlorid, 1 ,12-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido- N₅,N₅') dodecan- tetrahydrochlorid, l .ö-D Ni.Ni'-o-chlorophenyldiguanido- N₅,N₅') hexan-dihydrochlorid, 1 ,6-Di-(N ,N '-o-chlorophenyldiguanido- Ns,N₅') hexan-tetrahydrochlorid, Ethylen-bis-(1- tolyl biguanid), Ethylen-bis-(p-tolyl biguanide), Ethylen-bis-(3,5-dimethylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(p-tert-amylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(nonylphenylbiguanid), Ethylen-bis- (phenylbiguanid), Ethylen-bis-(N-butylphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,5- diethoxyphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,4-dimethylphenyl biguanid), Ethylen-bis (o- diphenylbiguanid), Ethylen-bis (mixed amyl naphthylbiguanid), N-Butyl-ethylen-bis- (phenylbiguanid), Trimethylen bis (o-tolylbiguanid), N-Butyl-trimethyle- bis-(phenyl biguanide) und die entsprechenden Salze wie Acetate, Gluconate, Hydrochloride, Hydrobromide, Citrate, Bisulfite, Fluoride, Polymaleate, N-Cocosalkylsarcosinate, Phosphite, Hypophosphite, Perfluorooctanoate, Silicate, Sorbate, Salicylate, Maleate, Tartrate, Fumarate, Ethylendiamintetraacetate, Iminodiacetate, Cinnamate, Thiocyanate, Arginate, Pyromellitate, Tetracarboxybutyrate, Benzoate, Glutarate, Monofluorphosphate, Perfluorpropionate sowie beliebige Mischungen davon. Weiterhin eignen sich halogenierte Xylol- und Kresolderivate, wie p-Chlormetakresol oder p-Chlor- meta-xylol, sowie natürliche antimikrobielle Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft (zum Beispiel aus Gewürzen oder Kräutern), tierischer sowie mikrobieller Herkunft. Vorzugsweise können antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindungen, ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft und/oder ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft, äußerst bevorzugt mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft aus der Gruppe, umfassend Coffein, Theobromin und Theophyllin sowie etherische Öle wie Eugenol, Thymol und Geraniol, und/oder mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft aus der Gruppe, umfassend Enzyme wie Eiweiß aus Milch, Lysozym und Lactoperoxidase, und/oder mindestens eine antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindung mit einer Ammonium-, Sulfonium-, Phosphonium-, lodonium- oder Arsoniumgruppe, Peroxoverbindungen und Chlorverbindungen eingesetzt werden. Auch Stoffe mikrobieller Herkunft, sogenannte Bakteriozine, können eingesetzt werden.

Die als antimikrobielle Wirkstoffe geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen (QAV) weisen die allgemeine Formel (R¹)(R²)(R³)(R⁴) N⁺ X^" auf, in der R¹ bis R⁴ gleiche oder verschiedene Cι-C₂₂-Alkylreste, C₇-C₂₈-Aralkylreste oder heterozyklische Reste, wobei zwei oder im Falle einer aromatischen Einbindung wie im Pyridin sogar drei Reste gemeinsam mit dem Stickstoffatom den Heterozyklus, zum Beispiel eine Pyridinium- oder Imidazoliniumverbindung, bilden, darstellen und X^" Halogenidionen, Sulfationen, Hydroxidionen oder ähnliche Anionen sind. Für eine optimale antimikrobielle Wirkung weist vorzugsweise wenigstens einer der Reste eine Kettenlänge von 8 bis 18, insbesondere! 2 bis 16, C-Atomen auf. QAV sind durch Umsetzung tertiärer Amine mit Alkylierungsmitteln, wie zum Beispiel Methylchlorid, Benzylchlorid, Dimethylsulfat, Dodecylbromid, aber auch Ethylenoxid herstellbar. Die Alkylierung von tertiären Aminen mit einem langen Alkyl-Rest und zwei Methyl-Gruppen gelingt besonders leicht, auch die Quaternierung von tertiären Aminen mit zwei langen Resten und einer Methyl-Gruppe kann mit Hilfe von Methylchlorid unter milden Bedingungen durchgeführt werden. Amine, die über drei lange Alkyl-Reste oder Hydroxy-substituierte Alkyl-Reste verfügen, sind wenig reaktiv und werden bevorzugt mit Dimethylsulfat quaterniert.

Geeignete QAV sind beispielweise Benzalkoniumchlorid (N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl- ammoniumchlorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-Dichlorbenzyl-dimethyl-C12- alkylammoniumchlorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumchlorid (Benzyl-dodecyl-bis- (2-hydroxyethyl)-ammonium-chlorid), Cetrimoniumbromid (N-Hexadecyl-N,N-trimethyl- ammoniumbromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumchlorid (N,N-Diιmethyl-N-[2-[2-[p- (1,1,3,3-tetramethylbutyl)-pheno-xy]ethoxy]ethyl]-benzylammoniumchlorid, CAS No. 121- 54-0), Dialkyldimethylammonium-chloride wie Di-n-decyl-dimethyl-ammoniumchlorid (CAS No. 7173-51-5-5), Didecyldi-methylammoniumbromid (CAS No. 2390-68-3), Dioctyl-dimethyl-ammoniumchloric, 1-Cetylpyridiniumchlorid (CAS No. 123-03-5) und Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1) sowie deren Mischungen. Besonders bevorzugte QAV sind die Benzalkoniumchloride mit C₈-C₁₈-Alkylresten, insbesondere Cι₂-C₁ -Aklyl- benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid.

Benzalkoniumhalogenide und/oder substituierte Benzalkoniumhalogenide sind beispielsweise kommerziell erhältlich als Barquat^® ex Lonza, Marquat^® ex Mason, Variquat^® ex Witco/ Sherex und Hyamine^® ex Lonza, sowie Bardac^® ex Lonza. Weitere kommerziell erhältliche antimikrobielle Wirkstoffe sind N-(3-Chlorallyl)-hexaminiumchlorid wie Dowicide^® und Dowicil^® ex Dow, Benzethoniumchlorid wie Hyamine^® 1622 ex Rohm & Haas, Methylbenzethoniumchlorid wie Hyamine^® 10X ex Rohm & Haas, Cetylpyridiniumchlorid wie Cepacolchlorid ex Merrell Labs.

Die antimikrobiellen Wirkstoffe werden in Mengen von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 Gew.-% bis 0,8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,005 Gew.-% bis 0,3 Gew,-% und insbesondere von 0,01 bis 0,2 Gew.-% eingesetzt. Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel können UV-Absorbenzien (UV- Absorber) enthalten, die auf die behandelten Textilien aufziehen und die Lichtbeständigkeit der Fasern und/oder die Lichtbeständigkeit sonstiger Rezepturbestandteile verbessern. Unter UV-Absorber sind organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, zum Beispiel Wärme wieder abzugeben.

Verbindungen, die diese gewünschten Eigenschaften aufweisen, sind beispielsweise die durch strahlungslose Desaktivierung wirksamen Verbindungen und Derivate des Benzophenons mit Substituenten in 2- und/oder 4-Stellung. Weiterhin sind auch substituierte Benzotriazole, in 3-Stellung Phenylsubstituierte Acrylate (Zimtsäurederivate, gegebenenfalls mit Cyanogruppen in 2-Stellung), Salicylate, organische Ni-Komplexe sowie Naturstoffe wie Umbelliferon und die körpereigene Urocansäure geeignet. Besondere Bedeutung haben Biphenyl- und vor allem Stilbenderivate wie sie beispielsweise in der EP 0728749 A beschrieben werden und kommerziell als Tinosorb^® FD oder Tinosorb^® FR ex Ciba erhältlich sind. Als UV-B-Absorber sind zu nennen: 3- Benzylidencampher beziehungsweise 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, zum Beispiel 3-(4-Methylbenzyliden)campher, wie in der EP 0693471 B1 beschrieben; 4- Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2- ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4- (Dimethylamino)benzoesäureamylester; Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4- Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimt- säureisoamylester, 2-Cyano-3,3-phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene); Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4- isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester; Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'- methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon; Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester; Triazinderivate, wie zum Beispiel 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1'-hexyloxy)-1 ,3,5- triazih und Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb® HEB); Propan-1,3-dione, wie zum Beispiel 1-(4-tert.Butylphenyl)-3- (4'methoxyphenyl)propan-1,3-dion; Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1 beschrieben. Weiterhin geeignet sind 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze; Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2- Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze; Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie zum Beispiel 4-(2-Oxo-3-bornylidenmethyl)benzol- sulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)sulfonsäure und deren Salze.

Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion, 4-tert.- Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789), 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)- propan-1,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 19712033 A1 (BASF). Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse, vorzugsweise nanoisierte Metalloxide beziehungsweise Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente bereits für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, das heißt hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind ummantelte Titandioxide, wie zum Beispiel Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex® T2000 (Merck; als hydrophobe Coatingmittel kommen dafür bevorzugt Silicone und besonders bevorzugt Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P. Finkel in SÖFW-Journal 122 (1996), S. 543 zu entnehmen.

Die UV-Absorbenzien werden üblicherweise in Mengen von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,03 Gew.-% bis 1 Gew.-%, eingesetzt.

Erfindungsgemäße Mittel können zur Steigerung der Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung Enzyme enthalten, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Hierzu gehören insbesondere weitere Proteasen, Amylasen, Lipasen, Hemicellulasen, Cellulasen oder Oxidoreduktasen, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 x 10^"6 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein.

Unter den weiteren Proteasen sind solche vom Subtilisin-Typ bevorzugt. Beispiele hierfür sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase^® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaard, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase^®, beziehungsweise Savinase^® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP^® geführten Varianten ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1 , WO 95/23221 A1 , WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 beschrieben werden. Weitere verwendbare Proteasen aus verschiedenen Bacillus sp. und ß. gibsonii gehen aus den einleitend bereits erwähnten Patentanmeldungen WO 03/054185 A1 , WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2 und WO 03/054184 A1 hervor.

Weitere brauchbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym^®, Relase^®, Everlase^®, Nafizym, Natalase^®, Kannase^® und Ovozymes^® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect^®, Purafect^® OxP und Properase^® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol^® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi^® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather^® und Protease P^® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.

Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus ß. amyloliquefaciens oder aus ß. stearothermophilus sowie deren für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus ß. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl^® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar^®ST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser α-Amylase sind von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Duramyl^® und Termamyl^®ultra, von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar^®OxAm und von der Firma Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, als Keistase^® erhältlich. Die α-Amylase von ß. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN^® ertrieben, und abgeleitete Varianten von der α- Amylase aus ß. stearothermophilus unter den Namen BSG^® und Novamyl^®, ebenfalls von der Firma Novozymes.

Desweiteren sind für diesen Zweck die in der Anmeldung WO 02/10356 A2 offenbarte α-

Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die in der Anmeldung

WO 02/44350 A2 beschriebene Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus ß. agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben. Ferner sind die amylolytischen Enzyme einsetzbar, die dem Sequenzraum von α-Amylasen angehören, der in der Anmeldung

WO 03/002711 A2 definiert wird, und die, die in der Anmeldung WO 03/054177 A2 beschrieben werden. Ebenso sind Fusionsprodukte der genannten Moleküle einsetzbar, beispielsweise die aus der Anmeldung DE 10138753 A1.

Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl^® von der Firma Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der α-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Weitere, erfindungsgemäß einsetzbare Handelsprodukte sind beispielsweise die Amylase-LT^® oder die Amylase Stainzyme^® der Firma Novozymes.

Erfindungsgemäße Mittel können Lipasen oder Cutinasen, insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten enthalten, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen. Hierzu gehören beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Sie werden beispielsweise von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase^®, LipoIase^®Ultra, LipoPrime^®, Lipozyme^® und Lipex^® vertrieben. Desweiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusahum solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von der Firma Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE^®, Lipase P^®, Lipase B^®, beziehungsweise Lipase CES^®, Lipase AKG^®, Bacillis sp. Lipase^®, Lipase AP^®, Lipase M-AP^® und Lipase AML^® erhältlich. Von der Firma Genencor sind beispielsweise die Lipasen, beziehungsweise Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige Handelsprodukte sind die ursprünglich von der Firma Gist-Brocades vertriebenen Präparationen M1 Lipase^® und Lipomax^® und die von der Firma Meito Sangyo KK, Japan, unter den Namen Lipase MY-30^®, Lipase OF^® und Lipase PL^® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast^® von der Firma Genencor.

Erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere wenn sie für die Behandlung von Textilien gedacht sind, Cellulasen enthalten, je nach Zweck als reine Enzyme, als Enzympräparationen oder in Form von Mischungen, in denen sich die einzelnen Komponenten vorteilhafterweise hinsichtlich ihrer verschiedenen Leistungsaspekte ergänzen. Zu diesen Leistungsaspekten zählen insbesondere Beiträge zur Primärwaschleistung, zur Sekundärwaschleistung des Mittels (Antiredepositionswirkung oder Vergrauungsinhibition) und Avivage (Gewebewirkung), bis hin zum Ausüben eines „stone washed"-Effekts.

Eine brauchbare pilzliche, Endoglucanase(EG)-reiche Cellulase-Präparation, beziehungsweise deren Weiterentwicklungen werden von der Firma Novozymes unter dem Handelsnamen Celluzyme^® angeboten. Die ebenfalls von der Firma Novozymes erhältlichen Produkte Endolase^® und Carezyme^® basieren auf der 50 kD-EG, beziehungsweise der 43 kD-EG aus H. insolens DSM 1800. Weitere einsetzbare Handelsprodukte dieser Firma sind Cellusoft^® und Renozyme^®. Letzteres basiert auf der Anmeldung WO 96/29397 A1. Leistungsverbesserte Cellulase-Varianten gehen beispielsweise aus der Anmeldung WO 98/12307 A1 hervor. Ebenso sind die in der Anmeldung WO 97/14804 A1 offenbarten Cellulasen einsetzbar; beispielsweise die darin offenbarte 20 kD-EG aus Melanocarpus, die von der Firma AB Enzymes, Finnland, unter den Handelsnamen Ecostone^® und Biotouch^® erhältlich ist. Weitere Handelprodukte der Firma AB Enzymes sind Econase^® und Ecopulp^®. Weitere geeignete Cellulasen aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93 werden in WO 96/34092 A2 offenbart, wobei die aus Bacillus sp. CBS 670.93 von der Firma Genencor unter dem Handelsnamen Puradax^® erhältlich ist. Weitere Handelsprodukte der Firma Genencor sind „Genencor detergent celluiase L" und lndiAge^®Neutra.

Erfindungsgemäße Mittel können insbesondere zur Entfernung bestimmter Probleman- schmutzungen weitere Enzyme enthalten, die unter dem Begriff Hemicellulasen zusammengefaßt werden. Hierzu gehören beispielsweise Mannanasen, Xanthanlyasen, Pektinlyasen (=Pektinasen), Pektinesterasen, Pektatlyasen, Xyloglucanasen (=Xylanasen), Pullulanasen und ß-Glucanasen. Geeignete Mannanasen sind beispielsweise unter den Namen Gamanase^® und Pektinex AR^® von der Firma Novozymes, unter dem Namen Rohapec^® B1 L von der Firma AB Enzymes, unter dem Namen Purabrite^® von der Firma Genencor und unter dem Namen Pyrolase^® von der Firma Diversa Corp., San Diego, CA, USA erhältlich. Eine geeignete ß-Glucanase aus einem ß. alcalophilus geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 99/06573 A1 hervor. Die aus ß. subtilis gewonnene ß-Glucanase ist unter dem Namen Cereflo^® von der Firma Novozymes erhältlich.

Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Mangan-peroxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) enthalten. Als geeignete Handelsprodukte sind Denilite^® 1 und 2 der Firma Novozymes zu nennen. Vorteilhafterweise werden zusätzlich vorzugsweise organische, besonders bevorzugt aromatische, mit den Enzymen wechselwirkende Verbindungen zugegeben, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elektronenfluß zu gewährleisten (Mediatoren).

Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, etwa durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder filamentöse Fungi.

Die Aufreinigung der betreffenden Enzyme erfolgt günstigerweise über an sich etablierte Verfahren, beispielsweise über Ausfällung, Sedimentation, Konzentrierung, Filtration der flüssigen Phasen, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Einwirken von Chemikalien, Desodorierung oder geeignete Kombinationen dieser Schritte.

Erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme in jeder nach dem Stand der Technik etablierten Form zugesetzt werden. Hierzu gehören beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren versetzt.

Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem, vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed- Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.

Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so daß ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.

Ein in einem erfindungsgemäßen Mittel enthaltenes Protein und/oder Enzym kann besonders während der Lagerung gegen Schädigungen wie beispielsweise Inaktivierung, Denaturierung oder Zerfall etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden. Bei mikrobieller Gewinnung der Proteine und/oder Enzyme ist eine Inhibierung der Proteolyse besonders bevorzugt, insbesondere wenn auch die Mittel Proteasen enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Mittel enthalten zu diesem Zweck Stabilisatoren. Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren. Häufig werden hierfür Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester eingesetzt, darunter vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren, insbesondere 4-Formylphenyl- Boronsäure, beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren werden zu diesem Zweck eingesetzt. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren für die Protease Subtilisin sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren sind hierfür geeignet.

Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -Propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C₁₂, wie beispielsweise Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Auch endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate sind für diesen Zweck geeignet. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich ein enthaltenes Enzym zu stabilisieren.

Niedere aliphatische Alkohole, vor allem aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit sind weitere häufig eingesetzte Enzymstabilisatoren. Auch Di-Glycerinphosphat schützt gegen Denaturierung durch physikalische Einflüsse. Ebenso werden Calcium- und/oder Magnesiumsalze eingesetzt, wie beispielsweise Calciumacetat oder Calcium-Formiat.

Polyamid-Oligomere oder polymere Verbindungen wie Lignin, wasserlösliche Vinyl- Copolymere oder Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym-Präparation unter anderem gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert- Schwankungen. Polyamin-N-Oxid-enthaltende Polymere wirken gleichzeitig als Enzymstabilisatoren und als Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere Stabilisatoren sind lineare C₈-C₁₈ Polyoxyalkylene. Auch Alkylpolyglycoside können die enzymatischen Komponenten des erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und vermögen vorzugsweise, diese zusätzlich in ihrer Leistung zu steigern. Vernetzte N-haltige Verbindungen erfüllen vorzugsweise eine Doppelfunktion als Soil-release-Agentien und als Enzymstabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches Polymer stabilisiert insbesondere eine gegebenenfalls enthaltene Cellulase.

Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen die Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall; hierfür sind beispielsweise schwefelhaltige Reduktionsmittel geläufig. Andere Beispiele sind Natrium-Sulfit und reduzierende Zucker.

Besonders bevorzugt werden Kombinationen von Stabilisatoren eingesetzt, beispielsweise aus Polyolen, Borsäure und/oder Borax, die Kombination von Borsäure oder Borat, reduzierenden Salzen und Bernsteinsäure oder anderen Dicarbonsäuren oder die Kombination von Borsäure oder Borat mit Polyolen oder Polyaminoverbindungen und mit reduzierenden Salzen. Die Wirkung von Peptid- Aldehyd-Stabilisatoren wird günstigerweise durch die Kombination mit Borsäure und/oder Borsäurederivaten und Polyolen gesteigert und noch weiter durch die zusätzliche Wirkung von zweiwertigen Kationen, wie zum Beispiel Calcium-Ionen.

Da erfindungsgemäße Mittel in allen denkbaren Formen angeboten werden können, stellen erfindungsgemäße Enzyme, beziehungsweise Proteine in allen für die Zugabe zu den jeweiligen Mitteln zweckmäßigen Formulierungen jeweilige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Dazu gehören beispielsweise flüssige Formulierungen, feste Granulate oder Kapseln.

Die verkapselte Form bietet sich an, um die Enzyme oder andere Inhaltsstoffe vor anderen Bestandteilen, wie beispielsweise Bleichmitteln, zu schützen oder um eine kontrollierte Freisetzung (controlled release) zu ermöglichen. Je nach der Größe dieser Kapseln wird nach Milli-, Mikro- und Nanokapseln unterschieden, wobei Mikrokapseln für Enzyme besonders bevorzugt sind. Solche Kapseln werden beispielsweise mit den Patentanmeldungen WO 97/24177 und DE 19918267 offenbart. Eine mögliche Verkapselungsmethode besteht darin, daß die Proteine, ausgehend von einer Mischung der Proteinlösung mit einer Lösung oder Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat, in dieser Substanz verkapselt werden. Ein solches Verkapselungsverfahren wird mit der Anmeldung WO 01/38471 beschrieben.

Im Fall fester Mittel können die Proteine beispielsweise in getrockneter, granulierter und/oder verkapselter Form eingesetzt werden. Sie können separat, das heißt als eigene Phase, oder mit anderen Bestandteilen zusammen in derselben Phase, mit oder ohne Kompaktierung zugesetzt werden. Sollen mikroverkapselte Enzyme in fester Form verarbeitet werden, so kann das Wasser mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aus den sich aus der Aufarbeitung ergebenden wäßrigen Lösungen entfernt werden, wie Sprühtrocknung, Abzentrifugieren oder durch Umsolubilisieren. Die auf diese Weise erhaltenen Teilchen haben üblicherweise eine Teilchengröße zwischen 50 und 200 μm.

Flüssigen, gelförmigen oder pastösen erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme, und auch das erfindungsgemäße Protein ausgehend von einer nach dem Stand der Technik durchgeführten Proteingewinnung und Präparation in konzentrierter wäßriger oder nichtwäßriger Lösung, Suspension oder Emulsion zugesetzt werden, aber auch in Gelform oder verkapselt oder als getrocknetes Pulver. Derartige erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe hergestellt, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können.

Neben der primären Waschleistung können die in Waschmitteln enthaltenen Proteasen ferner die Funktion erfüllen, andere enzymatische Bestandteile durch proteolytische Spaltung zu aktivieren oder nach entsprechender Einwirkzeit zu inaktivieren, so wie beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/29426 oder EP 747471 offenbart worden ist. Vergleichbare regulatorische Funktionen sind auch über das erfindungsgemäße Protein möglich. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind ferner solche Mittel mit Kapseln aus proteasesensitivem Material, welche beispielsweise von erfindungsgemäßen Proteinen zu einem beabsichtigten Zeitpunkt hydrolysiert werden und ihren Inhalt freisetzen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei anderen mehrphasigen Mitteln erzielt werden.

Eine weitere Ausführungsform stellen Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, die eine erfindungsgemäße Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ enthalten.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um Mittel zur Behandlung von Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere von solchen mit Wolle oder Seide. Denn insbesondere natürliche Fasern, wie beispielsweise Wolle oder Seide, zeichnen sich durch eine charakteristische, mikroskopische Oberflächenstruktur aus. Diese kann, wie am Beispiel der Wolle im Artikel von R. Breier in Melliand Textilberichte vom 1.4.2000 (S. 263) ausgeführt worden ist, langfristig zu unerwünschten Effekten, wie etwa Verfilzung führen. Zur Vermeidung solcher Effekte werden die natürlichen Rohstoffe mit erfindungsgemäßen Mitteln behandelt, welche beispielsweise dazu beitragen, die auf Proteinstrukturen beruhende geschuppte Oberflächenstruktur zu glätten und damit einem Verfilzen entgegenwirken.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel mit einer erfindungsgemäßen Protease so konzipiert, daß es regelmäßig als Pflegemittel verwendet werden kann, beispielsweise indem es dem Waschprozeß zugesetzt, nach dem Waschen angewendet oder unabhängig von dem Waschen appliziert wird. Der gewünschte Effekt besteht darin, eine glatte Oberflächenstruktur des Textils über einen langen Zeitraum zu erhalten und/oder Schädigungen des Gewebes vorzubeugen und/oder zu verringern.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens einem der Verfahrensschritte eine erfindungsgemäße Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ aktiv wird.

Darunter sind solche Verfahren bevorzugt, bei denen die erfindungsgemäße Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt wird.

Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.

Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, daß in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder daß das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Das gleiche gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff harte Oberflächen zusammengefaßt werden. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um erfindungsgemäße Proteine bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.

Da bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme natürlicherweise bereits eine proteinauflösende Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, daß gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen als einzige reinigungsaktive Komponente ein erfindungsgemäßes Enzym aufgebracht wird. Dies stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform solcher Verfahren werden die betreffenden erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise erfindungsgemäße Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittel bereitgestellt.

Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands stellen Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine erfindungsgemäße Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ aktiv wird.

Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.

Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide. Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung einer oben beschriebenen erfindungsgemäßen Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar.

Entsprechend bevorzugt gelten für diese Verwendungen die oben ausgeführten Konzentrationsbereiche.

Denn erfindungsgemäße Proteasen können, insbesondere entsprechend den oben beschriebenen Eigenschaften und den oben beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittel bereitgestellt.

Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln dar.

Denn wie bekannt ist, können Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. Diesen ansonsten eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es wie oben beschrieben möglich, daß durch Proteolyse eine andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt, wie dies beispielsweise in der Anmeldung WO 00/01831 A2 offenbart worden ist. Ein anderes Beispiel für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle seiner Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird. Erfindungsgemäße Proteine können somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln. Entsprechend dem oben Gesagten stellen auch folgende Verwendungen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar:

- Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung,

- und hierunter insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben;

- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege und hierunter bevorzugt

- die entsprechende Verwendung für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.

Die vorliegende Erfindung wird auch in Form von solchen eine erfindungsgemäße Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ enthaltenden Mitteln verwirklicht, bei denen es sich um Kosmetika handelt. Hierunter werden alle Arten von reinigenden und pflegenden Mittel für menschliche Haut oder Haar verstanden, insbesondere reinigende Mittel.

Denn Proteasen spielen auch im Zeilerneuerungsprozeß der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venerol., Band 71 (1991), S. 471-474). Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen. Der Einsatz von Subtilisin-Proteasen mit Aminosäureaustauschen in den Positionen R99G/A/S, S154D/E und/oder L211D/E für kosmetische Zwecke wird beispielsweise in WO 97/07770 A1 beschrieben. Entsprechend dem oben Gesagten könnten beispielsweise diese Varianten über erfindungsgemäße Punktmutationen weiterentwickelt werden. Somit eignen sich auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Besonders bevorzugt sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben, beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger (vergleiche US 5230891) stabilisiert und/oder durch Punktmutationen an hochallergenen Positionen derivatisiert sind, so daß sie für den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen. Dementsprechend werden auch entsprechende kosmetische Reinigungs- und Pflegeverfahren und die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel, beziehungsweise zu dessen Herstellung ist in diesen Anspruch eingeschlossen.

Neben dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln und Kosmetika sind im Stand der Technik zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten von Proteasaen, insbesondere Subtilisisinen etabliert. Einen Überblick hierüber bietet beispielsweise das Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley- Verlag, New York, 1998. All diese Techniken können erfindungsgemäße Alkalischen Proteasen vom Subtilisin- Typ bereichert werden. Sollte sich herausstellen, daß sie durch den Einsatz erfindungsgemäßer Proteasen weiterentwickelt werden können, so sind diese in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Hierzu gehören insbesondere folgende Einsatzgebiete:

- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen;

- darunter bevorzugte die Verwendung zur Endgruppenbestimmung im Rahmen einer Peptid-Sequenzanalyse;

- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen, vorzugsweise im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren;

- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen chemischen Verbindungen;

- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder, vorzugsweise im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren;

- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten; - die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.

Beispiele

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) werden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.

Beispiel 1

Ortsgerichtete Mutagenese zur Erzeugung der B. /enfus-Alkalischen Protease

S3T V4I/A224V/S250G/S253N

Ein pBC2-Vektor mit der DNA der Alkalischen Protease-Variante aus B. lentus DSM 5483-Variante S3T/V4I (Variante beschrieben in WO 92/21760 A1 ; analog den nachfolgenden Standardmethoden erhältlich aus der im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung angegebenen SEQ ID NO. 1) wird nach Herstellerangaben mit dem QuickChange^®-Kit der Firma Stratagene, La Jolla, USA, behandelt. Hierfür wurden die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 3 bis 10 dargestellten Primer entworfen, wobei jeweils ein Primer-Paar („s" und „as") zusammenwirkt, um in dem von diesem Primerpaar überdeckten Bereich die gewünschte(n) Mutation(en) hervorzurufen. Der erhaltene punktmutierte Vektor wird via Protoplastentransformation in den Expressionsstamm Bacillus subtilis DB104 (beschrieben in F. Kawamura & R. H. Doi „Construction of a Bacillus subtilis Double Mutant Deficient in Extracellular Alkaline and Neutral Porteases" (1984); J. Bacteriol., Band 160, Seiten 442-444) transformiert.

Die Transformanten werden auf eine milchpulverhaltige Agarplatte (1 ,5 % Agar, 0,5 % NaCI, 0,1 % K₂HPO₄, 0,1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 1 % Milchpulver, pH 10) überstempelt. Nach 2, 4 und 8 Stunden wird die Größe der von den Transformanten erzeugten Lysehöfe vermessen und diejenigen aus diesem Primärscreening gewählt, die die größten Höfe zeigen.

Die so selektierten Kandidaten werden in Horikoshi-Medium pH 9 (0,1 % K₂HPO₄, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,02 % MgSO₄, 0,3% Na₂CO₃) für 72 h bei 37°C und 200 rpm in Mikrotiterplatten (96 mal 1.000 μl) kultiviert, die Zellen durch Zentrifugation von Überstand getrennt und von den Überständen die Proteaseaktivität mit AAPF bestimmt. Hierzu wird das Substrat Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid (AAPF; Firma Bachern Biochemica GmbH, Heidelberg) zugegeben und für 5 min bei pH 8,6 und 25°C inkubiert.

Von den besten Kandidaten werden 500-ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml Horikoshi- Medium (siehe oben) mit jeweils einer Kolonie der nach Beispiel 1 transformierten ßac///tts-Stämme angeimpft und bei 37°C kultiviert. Aus diesen Stämmen werden die Insert-tragenden pBC2-Plasmide nach Standardmethoden isoliert und die Inserts sequenziert.

Hierunter befindet sich auch ein Bacillus subtilis DB104 pBC2-Klon, dessen Insert-DNA unter SEQ ID NO. 11 dargestellt ist. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO. 12 gezeigt. Sie codiert demnach für eine ß. /enrt/s-Alkalische Protease- Variante mit den Aminosäureaustauschen A224V, S250G und S253N gegenüber dem Ausgangsgen beziehungsweise insgesamt mit den Aminosäureaustauschen S3T, V4I, A224V, S250G und S253N gegenüber dem Wildtypmolekül ß. /enfi/s-Alkalische Protease (vergleiche Figuren 1 und 2).

Beispiel 2

Aufreinigung und Charakterisierung der B. lenfr/s-Alkalischen Protease

S3T/V4I/A224V/S250G/S253N

Der nach dem vorherigen Beispiel erhältliche Bacillus subtilis DB104-Stamm mit dem Plasmid pBC2 ß. lentus Alkalische Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N wird in einem 500 ml-Schüttelkolben in 100 ml Horikoshi-Medium (siehe oben) für 72 h bei 37°C und 200 rpm kultiviert. Der Kulturüberstand wird gegen HEPES/NaOH-Puffer (20 mM, pH 7,8) dialysiert und mittels einer negativen Anionenaustausch-Chromatographie (Q- Sepharose^®, Firma Pharmacia-Amersham Biotech, Schweden) von den Medienbestandteilen abgetrennt. Die Protease befindet sich im Durchbruch. Das proteolytische Eluat wird an einer Kationenaustauschersäule (S-Sepharose^®, Firma Pharmacia-Amersham) mit einem Gradientenpuffer (HEPES/NaOH , 0 - 1 M NaCI, pH 7,6) chromatographiert. Die Protease wird mit 0,15 M NaCI eluiert und anschließend mittels einer Kationenaustausch-Chromatographie (Rescource S^®, Firma Pharmacia- Amersham), und HEPES/NaOH, pH 7,6 als Eluens aufkonzentriert.

Auf diese Weise wird ein gemäß SDS-Gelektrophorese und Coomassie-Färbung reines Protein gewonnen.

Beispiel 3

SDS-Polyacrylgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung der B. lentus-

Alkalischen Protease S3T V4I/A224V/S250G/S253N

Bei denaturierender SDS-Polyacrylgelelektrophorese im PHAST^®-System der Firma Pharmacia-Amersham Biotech, Schweden, weist die nach den Beispielen 1 und 2 erhältliche Alkalische Protease-Variante ß. /enfus-Alkalische Protease S3TΛ 4I/A224V/S250G/S253N ein Molekulargewicht von 26 kD auf.

Gemäß isoelektrischer Fokussierung, ebenfalls im PHAST^®-System der Firma Pharmacia-Amersham Biotech, liegt deren isoelektrischer Punkt bei 11.

Die spezifische Aktivität für das Tetrapeptid AAPF (vergleiche Beispiel 1) beträgt 283 U/mg.

Beispiel 4

Punktmutagenese zur Erzeugung der β. /enfus-Alkalischen Protease

S3T/V4I/L211 D/A224V/S250G/S253N

Der gemäß Beispiel 1 erhältliche pBC2-Vektor mit der Protease aus B.lentus DSM 5483 mit den Austauschen S3T/V4I/A224N/S250G/S253N wird erneut nach Herstellerangaben mit dem QuickChange^®-Kit der Firma Fa. Stratagene, La Jolla, USA, behandelt. Hierfür wurden die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 13 und 14 dargestellten Primer BLAP-5s und BLAP-5as entworfen, wobei das Primer-Paar („s" und „as") zusammenwirkt, um eine Mutation hervorzurufen. Der erhaltene punktmutierte Vektor wird wiederum via Protoplastentransformation in den Expressionsstamm Bacillus subtilis DB104 (siehe oben) transformiert. Die Transformanten werden auf eine milchpulverhaltige Agarplatte (1,5 % Agar, 0,5 % NaCI, 0,1 % K₂HPO₄, 0,1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 1 % Milchpulver, pH 10) überstempelt. Nach 2, 4 und 8 Stunden wird die Größe der von den Transformanten erzeugten Lysehöfe vermessen und diejenigen aus diesem Primärscreening gewählt, die die größten Höfe zeigen.

Von den besten Kandidaten werden in 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml Horikoshi- Medium (siehe oben) mit jeweils einer Kolonie der transformierten ßac///tvs-Stämme angeimpft und bei 37°C kultiviert. Aus diesen Stämmen werden die Insert-tragenden pBC2-Plasmide nach Standardmethoden isoliert und die Inserts sequenziert.

Hierunter befindet sich auch ein Bacillus subtilis DB104 pBC2-Klon, dessen lnsert-DNA unter SEQ ID NO. 15 dargestellt ist. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO. 16 gezeigt. Sie codiert demnach für eine B. terrfus-Alkalische Protease-Variante mit dem Aminosäureaustausch L211D gegenüber dem Ausgangsgen beziehungsweise insgesamt mit den Aminosäureaustauschen S3T, V4I, L211D, A224V, S250G und S253N gegenüber dem Wildtypmolekül B. /enfus-Alkalische Protease (vergleiche Figuren 1 und 2).

Beispiel 5

Punktmutagenese zur Erzeugung der ß. /entus-Alkalischen Proteasen

S3T/V41/I43V/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/I43V/L211 D/A224N/S250G/S253N

Das vorherige Beispiel wird wiederholt, wobei jedoch statt des Primerpaars BLAP-5s und BLAP-5as (SEQ ID NO. 13 und 14) die ebenfalls zusammenwirkenden Primer BLAP-6s (SEQ ID NO. 19) und BLAP-6as (SEQ ID NO. 20) eingesetzt werden. Transformation, Sequenzierung und Kultivierung eines proteaseexprimierenden Stamms erfolgen wie im vorherigen Beispiel.

Unter den erhaltenen proteasepositiven Stämmen befindet sich auch ein Bacillus subtilis DB104 pBC2-Klon, dessen Insert-DNA unter SEQ ID NO. 21 dargestellt ist. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO. 22 gezeigt. Sie codiert demnach für eine ß. teπrus-Alkalische Protease-Variante mit dem Aminosäureaustausch I43V gegenüber dem Ausgangsgen beziehungsweise insgesamt mit den Aminosäureaustauschen S3T, V4l, I43V, A224V, S250G und S253N gegenüber dem Wildtypmolekül ß. /enftvs-Alkalische Protease (vergleiche Figuren 1 und 2).

Wird auf entsprechende Weise anstelle des pBC2-Vektors mit der Protease aus B.lentus DSM 5483 mit den Austauschen S3TΛ 4I/A224N/S250G/S253N der gemäß Beispiel 4 erhaltene pBC2-Vektors mit der Protease aus B.lentus DSM 5483 mit den Austauschen S3T/V4I/L211D/A224N/S250G/S253N in die in diesem Beispiel beschriebene Reaktion eingebracht, erhält man die Mehrfachvariante

S3T/V4I/I43V/L211D/A224N/S250G/S253N. Sie weist somit zusätzlich zu den Austauschen S3T, V4I, L211D, A224V, S250G und S253N gegenüber dem Wildtypmolekül ß. /eπfι/s-Alkalische Protease die gemäß diesem Beispiel vornehmbare Punktmutation I43V auf. Die zugehörigen DNA- und Aminosäuresequenzen sind unter SEQ ID NO. 35 beziehungsweise 36 dargestellt.

Beispiel 6

Punktmutagenese zur Erzeugung der ß. /entus-Alkalischen Proteasen S3T/V4I/L211 N/A224V/S250G/S253N, S3T/V4I/L211 Q/A224V/S250G/S253N und S3T V4I/L211 E/A224V/S250G/S253N

Wie in Beispiel 4 wird der gemäß Beispiel 1 erhältliche pBC2-Vektor mit der Protease aus B.lentus DSM 5483 mit den Austauschen S3T/V4I/A224N/S250G/S253N erneut nach Herstellerangaben mit dem QuickChange^®-Kit der Firma Fa. Stratagene, La Jolla, USA, behandelt. Hierfür werden in drei parallelen Ansätzen folgende Mutagenese-Primer verwendet:

1. L211 N-s (SEQ ID NO. 23) und L211 N-as (SEQ ID NO. 24);

2. L211 Q-s (SEQ ID NO. 27) und L211 Q-as (SEQ ID NO. 28) und 3. L211 E-s (SEQ ID NO. 31) und L211 E-as (SEQ ID NO. 32).

Der erhaltenen punktmutierten Vektoren werden wiederum via Protoplastentransformation in den Expressionsstamm Bacillus subtilis DB104 (siehe oben) transformiert und hieraus wie in Beispiel 4 beschrieben, Bacillus subtilis DB104- pBC2-Klone erhalten, deren Insert-DNA unter SEQ ID NO. 25 (Austausch L211 N), 29 (Austausch L211Q) und 33 (Austausch L211 E) dargestellt ist.

Die zugehörigen, abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NO. 26 (Austausch L211N), 30 (Austausch L211Q) und 34 (Austausch L211E) gezeigt. Sie codieren demnach für folgende ß. /eπfus-Alkalische Protease-Varianten:

1. S3T/V4I/L211 N/A224V/S250G/S253N ,

2. S3T/V4I/L211 Q/A224V/S250G/S253N und

3. S3T/V4I/L211 E/A224V/S250G/S253N.

Beispiel 7

Anzucht der B. /enfus-Alkalischen Proteasen S3T V4I/L211 N/A224V/S250G/S253N, S3T/V4I/L211Q/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/L211 E/A224V/S250G/S253N in Bacillus subtilis DB104

Die gemäß Beispiel 6 erhaltenen Varianten in Bacillus subtilis DB104 werden in 100 ml MLBSP-Medium (20 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCI, 10 g/l Casiton, 27 g/l Natriumsuccinat, 0,1 g/l MgSO₄, 75 mg/l CaCI₂, 0,1 mg/l MnCI₂, 0,14 mg/l FeSO₄, 20 g/l Glucose, 0,05M PIPES pH=7,2 , 0,075M KPO₄ pH=7,0 in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben bei 37°C und unter Schütteln bei 200 rpm kultiviert.

Beispiel 8

Bestimmung der Proteaseaktivität (PE) der B. /enfivs-Alkalischen Proteasen S3T V4I/L211 N/A224V/S250G/S253N, S3T V4I/L211Q/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/L211 E/A224V/S250G/S253N

Die proteolytische Aktivität der gemäß den Beispielen 6 und 7 erhaltenen Varianten wird in Anlehnung an die in Tenside 7 (1970), Seite 125-132 beschriebene Methode durch eine diskontinuierliche Bestimmung unter Verwendung von Casein als Substrat wie folgt gemessen: Die Konzentrationen der Substrat-Lösung betragen 12 mg pro ml Casein (Firma Merck, Darmstadt, Nr. 2242) und 30 mM Tris in synthetischem Leitungswasser (wäßrige Lösung von 0,029 % (w/v) CaCI₂ * 2 H₂0, 0,014 % (w/v) MgCI₂ * 6 H₂O und 0,021 % (w/v) NaHCO₃) mit einer Härte von 15 Grad dH (deutsche Härte). Die Substrat- Lösung wird auf 70°C erwärmt, und der pH wird mit 0,1 N NaOH bei 50°C auf pH 8,5 eingestellt. Die Protease-Lösung wird mit 2% (w/v) wasserfreiem Pentanatrium- Tripolyphosphat in synthetischem Leitungswasser hergestellt, wobei der pH mit Salzsäure auf 8,5 eingestellt wird. Zu 600 μl der Casein-Substrat-Lösung werden 200 μl der Enzym-Lösung zugegeben. Das Gemisch wird 15 min bei 50°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 600 μl 0,44 M Trichloressigsäure (TCA) 0,22 M Natriumacetat in 3% (v/v) Essigsäure beendet. Nach Abkühlen auf Eis innerhalb von 15 min wird das TCA-unlösliche Protein durch Zentrifugieren entfernt, ein Aliquot von 900 μl wird mit 300 μl 2 N NaOH gemischt, und die Extinktion dieses Gemisches, das TCA-Iösliche Peptide enthält, wird bei 290 nm aufgenommen. Kontrollwerte werden durch Hinzufügen von 600 μl der TCA-Lösung zu 600 μl Casein-Lösung hergestellt, gefolgt von 200 μl Enzym-Lösung. Definitionsgemäß besitzt eine Protease-Lösung, die unter den Bedingungen dieses Versuchs eine Extinktionsänderung von 0,500 OD bei 290 nm hervorruft, eine Aktivität von 10 PE pro ml.

Beispiel 9

Beitrag der B. lentus DSM 5483-Alkalischen Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei niedrigerer Temperatur

Für dieses Beispiel wurden standardisiert mit Anschmutzungen versehene Textilien eingesetzt, die von der Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz (EMPA), bezogen worden waren. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet: A und C (Blut/Milch/Tusche auf Baumwolle), B und D (Blut/Milch/Tusche auf einem Polyester-Baumwolle-Mischgewebe).

Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen launderometrisch auf ihre Waschleistung hin untersucht. Dafür wurde jeweils ein Flottenverhältnis von 1 :12 eingestellt und für 30 min bei einer Temperatur von 40°C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,88 g des jeweiligen Mittels pro I Waschflotte. Die Wasserhärte betrug 16° deutscher Härte.

Als Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 4 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 4 % C₁₂-C₁₈-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 5,5 % C₁₂-Cι₈-Fettalkohol mit 7 EO, 1 % Natrium-Seife, 11 % Natriumcarbonat, 2,5 % amorphes Natriumdisilikat, 20 % Natriumperborat-Tetrahydrat, 5,5 % TAED, 25 % Zeolith A, 4,5 % Polycarboxylat, 0,5 % Phosphonat, 2,5 % Schauminhibitorgranulat, 5 % Natriumsulfat, Rest: Wasser, optischer Aufheller, Salze.

Sie wurde für die verschiedenen Versuchsreihen so mit folgenden Proteasen versetzt, daß sich für die Ansätze A und B jeweils eine Endkonzentration von 2.250 PE an proteolytischer Aktivität pro I Waschflotte und für die Ansätze C und D jeweils eine Endkonzentration von 5.625 PE an proteolytischer Aktivität pro I Waschflotte ergab: ß. /eπfus-Alkalische Protease F49 (WO 95/23221 ; Hersteller: Firma Biozym, Kundl, Österreich), Savinase^® (Firma Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dänemark) beziehungsweise die erfindungsgemäße Protease-Variante ß. lentus DSM 5483-Alkalische Protease S3TΛ/4I/A224V/S250G/S253N.

Nach dem Waschen wurde der Weißgrad der gewaschenen Textilien im Vergleich zu dem von Bariumsulfat gemessen, der auf 100 % normiert worden war. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Datacolor SF500-2 bei 460 nm (UV-Sperrfilter 3), 30 mm Blende, ohne Glanz, Lichtart D65, 10°, d/8°. Die erhaltenen Ergebnisse werden als Prozent Remission, das heißt als Prozentangaben im Vergleich zu Bariumsulfat zusammen mit den jeweiligen Anfangswerten in folgender Tabelle 2 zusammengestellt. Angegeben sind die Mittelwerte aus jeweils 3 Messungen. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluß auf den Beitrag des enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels.

Tabelle 2: Beitrag der erfindungsgemäßen Variante S3T/V4I/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei einer Temperatur von 40°C

Im Ansatz A liegt die erfindungsgemäße Protease-Variante ß. lentus DSM 5483- Alkalische Protease S3TV4I/A224V/S250G/S253N hinsichtlich ihres Beitrags zur Waschleistung des betreffenden Mittels zwischen dem von den etablierten Proteasen ß. /e/jfus-Alkalische Protease F49 und Savinase^®. Bei den übrigen Ansätzen, das heißt auch bei C, der sich von A nur hinsichtlich der eingesetzten Protease-Gesamt- Konzentration unterscheidet, zeigt sie einen deutlich besseren Leistungsbeitrag als die Vergleichs-Enzyme.

Dieses Ergebnis wurde in einer Wiederholung dieses Versuchs bei geringfügig anderen absoluten Meßwerten bestätigt.

Beispiel 10 Beitrag der B. lentus DSM 5483-Alkalischen Protease S3T V4I/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei höherer Temperatur

Für dieses Beispiel wurden die Ansätze des vorangegangenen Beispiels unter ansonsten identischen Bedingungen bei einer Temperatur von 60°C wiederholt. Dabei wurden die in folgender Tabelle 3 zusammengestellten Ergebnisse ermittelt:

Tabelle 3: Beitrag einer erfindungsgemäßen Variante zur Waschleistung bei einer Temperatur von 60°C

In allen Ansätzen bei der Temperatur von 60°C bewirkt die erfindungsgemäße ß. lentus DSM 5483-Alkalische Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N eine höhere Waschleistung des betreffenden Mittels als die etablierten Proteasen ß. /eπ us-Alkalische Protease F49 und Savinase^®.

Beispiel 11 Beitrag der ß. lentus DSM 5483-Alkalischen Protease S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei niedrigerer Temperatur

Beispiel 9 wurde bei 40°C mit der ß. lentus DSM 5483-Alkalischen Protease S3T/V4I/A224V/L211 D/S250G/S253N wiederholt. Als Vergleich diente wiederum die ß. /eπrus-Alkalische Protease F49. Diese beiden Enzyme wurden in der ansonsten unveränderten Rezeptur gemäß Beispiel 9 (unter Gewichtsausgleich über die anorganischen Füllsalze) nicht aktivitätsgleich sondern proteingleich eingesetzt. Hierfür wurden Proteasegehalte von 0,2 Gew.-% (Reihen A und C) und 0,6 Gew.-% (Reihen B und D) an der Gesamtrezeptur gewählt, wodurch sich im Fall von 0,2 Gew.-% 0,388 mg Enzymprotein pro I Flotte ergaben und im Fall von 0,6 Gew.-% 1,164 mg/l. Die Ermittlung der Werte an den Anschmutzungen A und C beziehungsweise B und D erfolgte in ansonsten identischer Weise wie in Beispiel 9. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4: Beitrag der erfindungsgemäßen Variante S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei einer Temperatur von 40°C

In allen vier Ansätzen übertrifft die erfindungsgemäße Protease-Variante ß. lentus DSM 5483-Alkalische Protease S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N hinsichtlich ihres Beitrags zur Waschleistung des betreffenden Mittels die etablierte Protease ß. lentus- Alkalische Protease F49 deutlich.

Beispiel 12 Beitrag der ß. lentus DSM 5483-Alkalischen Proteasen S3T V4I/A224V/S250G/S253N, S3T V4I/I43V/A224V/S250G/S253N, S3T V4I/L211 D/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/I43V/L211 D/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei niedrigerer Temperatur

In einer weiteren Wiederholung von Beispiel 9 wurden die Meßreihen B (Blut/Milch/Tusche an einem Polyester-Baumwolle-Gewebe bei 2.250 PE pro I Waschflotte) und C (Blut/Milch/Tusche an einem Baumwolle-Gewebe bei 5.625 PE pro I Waschflotte) unter ansonsten identischen Bedingungen an vier verschiedenen erfindungsgemäßen Protease-Varianten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5: Beitrag der erfindungsgemäßen Varianten S3T/V4I/A224V/S250G/S253N, S3T/V4I/I43V/A224V/S250G/S253N, S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/I43V/L211D/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei einer Temperatur von 40°C.

In beiden Meßreihen erkennt man wiederum die Leistungssteigerung der Variante ß. lentus DSM 5483-Alkalische Protease S3TΛ/4I/A224V/S250G/S253N gegenüber dem Mittel ohne Protease und der ß. /errtt/s-Alkalischen Protease F49. Die zusätzliche Mutation in Position 43 bewirkt in einem Fall eine Leistungssteigerung gegenüber der erfindungsgemäßen Variante, die zusätzliche Mutation in Position 211 liefert Werte, die immer noch deutlich über dem für F49 liegen. Die Mehrfachvariante S3TΛ 4I/I43V/L211D/A224V/S250G/S253N zeigt ebenfalls Ergebnisse, die über denen der etablierten ß. /et? ιvs-Alkalische Protease F49 liegen.

Beispiel 13 Beitrag der ß. lentus DSM 5483-Alkalischen Proteasen S3T/V4I/A224V/S250G/S253N, S3T/V4I/I43V/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei höherer Temperatur

In einer weiteren Wiederholung des vorangegangenen Beispiels mit drei der erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen wurde unter ansonsten identischen Bedingungen eine Waschtemperatur von 60°C eingestellt. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 6 zusammengestellt. Tabelle 6: Beitrag der erfindungsgemäßen Varianten S3T/V4I/A224V/S250G/S253N, S3T/V4l/l43V/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/L211 D/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei einer Temperatur von 60°C.

Alle drei getesteten erfindungsgemäßen Varianten zeigen in beiden Meßreihen für die gegenüber dem vorherigen Beispiel höhere Temperatur bessere Leistungsbeiträge als die ß. /et?fι/s-Alkalische Protease F49. Hierbei schneidet in einem Fall die Variante ß. lentus DSM 5483-Alkalische Protease S3TA/4I/I43V/A224V/S250G/S253N und im anderen Fall die ß. lentus DSM 5483-Alkalische Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N am besten ab.

Beispiel 14 Beitrag der ß. lentus DSM 5483-Alkalischen Protease S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N zur Reinigungsleistung bei niedriger Temperatur

Gefäße mit harten, glatten Oberflächen wurden standardisiert mit Weichei (E) und Ei/Milch (F versehen und mit handelsüblichen Haushaltsgeschirrspülmaschinen gespült, und zwar bei 45°C mit dem Normalprogramm der Geschirrspülmaschine Typ Miele^® G 676. Pro Spülgang wurden jeweils 24,5 g Spülmittel verwendet. Die Wasserhärte betrug 16° deutscher Härte. Als Spülmittel diente folgende Basis-Rezeptur (alle Angaben jeweils in Gewichts- Prozent): 55 % Natriumtripolyphosphat (berechnet als wasserfrei), 4 % amorphes Natriumdisilikat (berechnet als wasserfrei), 22 % Natriumcarbonat, 9 % Natriumperborat, 2 % TAED, 2 % nichtionisches Tensid, Rest: Wasser, Farbstoffe, Parfüm. Diese Basis- Rezeptur wurde für die verschiedenen Versuche aktivitätsgleich so mit den verschiedenen Proteasen ß. fenri/s-Alkalische Protease F49, beziehungsweise der erfindungsgemäßen Variante DSM 5483-Alkalische Protease S3TΛ/4I/L211 D/A224V/S250G/S253N versetzt, daß sich jeweils eine Aktivität von 10.000 PE pro Spülgang ergab.

Nach dem Spülen wurde der Abtrag der Anschmutzungen gravimetrisch in Prozent ermittelt. Dafür wurde die Differenz aus dem Gewicht des verschmutzten und anschließend gespülten Gefäßes und dem Anfangsgewicht des Gefäßes in Relation zu der Gewichtsdifferenz des nicht gespülten Gefäßes zum Anfangsgewicht gesetzt. Diese Relation kann als Prozent Abtrag angesehen werden. Die erhaltenen Ergebnisse werden in folgender Tabelle 7 zusammengestellt. Angegeben sind dort die Mittelwerte aus jeweils 8 Messungen. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluß auf den Beitrag des enthaltenen Enzyms auf die Reinigungsleistung des verwendeten Mittels.

Tabelle 7: Beitrag der erfindungsgemäßen Variante S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N zur Reinigungsleistung bei einer Temperatur von 45°C.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße ß. lentus DSM 5483-Alkalische Protease S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N hinsichtlich ihrer Leistung in maschinellen Geschirrspülmitteln der für diesen Zweck etablierten ß. enrus-Alkalischen Protease F49 zumindest unter diesen untersuchten Bedingungen überlegen ist; und dies bereits bei einer vergleichsweise niedrigen Temperatur. Beispiel 15 Beitrag der ß. lentus DSM 5483-Alkalischen Protease S3T/V4l/L211D/A224V/S250G/S253 zur Reinigungsleistung bei höherer Temperatur

Der Versuch des vorangegangenen Beispiels wurde identisch wiederholt; der einzige Unterschied bestand darin, daß anstatt bei 45°C bei 55°C gespült wurde, und zwar mit dem Normalprogramm der Geschirrspülmaschine Typ Bosch^® SGS 4002. Die erhaltenen Ergebnisse sind in folgender Tabelle 8 zusammengestellt.

Tabelle 8: Beitrag der erfindungsgemäßen Variante S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N zur Reinigungsleistung bei einer Temperatur von 55°C.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße ß. lentus DSM 5483-Alkalische Protease S3T/V4I/L211 D/A224V/S250G/S253N hinsichtlich ihrer Leistung in maschinellen Geschirrspülmitteln auch bei höheren Temperaturen der für diesen Zweck etablierten ß. /enrt/s-Alkalischen Protease F49 zumindest unter diesen untersuchten Bedingungen überlegen ist.

Beispiel 16 Beitrag der Varianten S3T/V4I/L211 N/A224V/S250G/S253N, S3T/V4I/L211Q/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/L211 E/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung eines Textilwaschmittels

Für dieses wie Beispiel 9 durchgeführte Beispiel wurde wiederum auf die Anschmutzung Blut/Milch/Tusche auf einem Polyester-Baumwolle-Mischgewebe (EMPA) getestet. Es wurde unter ansonsten identischen Bedingungen für 60 min bei einer Temperatur von 30°C gewaschen.

Dieselbe Waschmittel-Basis-Rezeptur wie in Beispiel 9 wurde in parallelen Ansätzen jeweils aktivitätsgleich mit einer der erfindungsgemäßen oder einer Kontroll-Protease versetzt. Zur Kontrolle diente wiederum die ß. /e/7ftvs-Alkalische Protease F49, mit einer spezifischen Aktivität von ca. 200.000 PE/g, wodurch sich mit 0,25 Gew.-% eine F49- Konzentration von ca. 50.000 PE pro 100 g des Mittels und eine Aktivität von ca. 3.000 PE pro I Waschflotte ergaben. Die erfindungsgemäßen Proteasevarianten wurden derselben Basisrezeptur in derselben Aktivitäts-Konzentration zugesetzt. Insofern sind die in der nachfolgenden Tabelle 9 angegebenen Gew.-%-Werte für F49 korrekt und gelten für die untersuchten Varianten näherungsweise.

Nach dem Waschen wurde der Weißgrad der gewaschenen Textilien gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d, Lichtart D65, 10°. Das Gerät wird zuvor mit einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen Ergebnisse werden als Prozent Remission, das heißt als Prozentangaben im Vergleich zum Weißstandard zusammen mit den jeweiligen Anfangswerten in folgender Tabelle 9 zusammengestellt. Angegeben sind die Mittelwerte aus jeweils vier Messungen. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluss auf den Beitrag des enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels.

Tabelle 9: Beitrag der erfindungsgemäßen ß. /en ws-Alkalischen Proteasen S3T/V4I/L211 N/A224V/S250G/S253N, S3T/V4I/L211 Q/A224V/S250G/S253N und S3T/V4I/L211E/A224V/S250G/S253N zur Waschleistung bei 30°C

Die Meßreihe belegt, daß die erfindungsgemäßen Proteasen gegenüber proteasefreien Waschmitteln eine Verbesserung der Waschleistung an proteinhaltigen Anschmutzungen erbringt. Das heißt, sie entfalten auch in Gegenwart denaturierender Agentien wie etwa Tensiden eine proteolytische Aktivität. Die ermittelten Werte für die ß. /enfus-Alkalische Protease F49, einem für dieses Einsatzgebiet über Punktmutagenese optimierten Molekül, belegen die Korrektheit der Versuchsdurchführung.

Gegenüber der Kontrolle ohne Protease haben die Varianten mit den Austauschen L211E, L211N und L211Q zu einer um die Werte 11,9, 14,9 beziehungsweise 14,6 höheren Remission und dementsprechend verbesserten Anschmutzungsentfernung geführt. Demgegenüber lag die Verbesserung bei der für diese Zwecke im Stand der Technik etablierten ß. /eπ t/s-Alkalischen Protease F49 (mit den Aminosäureaustauschen S3T, V4I, A188P, V193M, V199I und L211D) lediglich um 9,4 höher. Auch hierdurch zeigt sich unter Anwendungsbedingungen die erhebliche Leistungsverbesserung, die auf die erfindungsgemäßen Punktmutationen, insbesondere in den Positionen 224, 250 und 253 zurückzuführen ist.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 : Alignment der Sequenzen der Alkalischen Proteasen aus Bacillus sp. (DSM 14390) und Bacillus lentus DSM 5483 mit denen der in den Beispielen beschriebenen Varianten. Darin bedeuten:

B5: Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390; SEQ ID NO. 18);

BLAP: Alkalische Protease Bacillus lentus DSM 5483 (SEQ ID NO. 2);

Var.: ß. /eπ ι/s-Alkalische Protease S3TΛ/4I/A224V/S250G/S253N, hergestellt nach den Beispielen 1 und 2 (SEQ ID NO. 12). Grau unterlegt: Die Aminosäurepositionen, in denen sich die Sequenzen von B5 und BLAP unterscheiden. Fett gedruckt: Die jeweils erste Aminosäure des maturen Proteins. Unterstrichen: - Die beiden Austausche S3T/V4I, in denen sich die erfindungsgemäße ß. /eπrt/s-Alkalische Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N zusätzlich vom Wiltyp unterscheidet; - die Positionen 43 und 211, in die nach den Beispielen 4 und 5 die Austausche L211 D beziehungsweise I43V eingeführt werden können.

Figur 2: Alignment der DNA-Sequenzen der Alkalischen Proteasen aus Bacillus sp. (DSM 14390) und Bacillus lentus DSM 5483 mit denen der in den Beispielen beschriebenen Varianten. Darin bedeuten: B5: Gen der Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390; SEQ ID NO. 17); BLAP: Gen der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (SEQ ID NO. 1); Var.: Gen der ß. fenfus-Alkalischen Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N, hergestellt nach den Beispielen 1 und 2 (SEQ ID NO. 11). Grau unterlegt: Die Positionen, in denen sich die Nukleotidsequenzen von B5 und BLAP voneinander unterscheiden. Fett gedruckt: Das jeweils erste für das mature Protein codierende Codon. Unterstrichen: - Die Codons für die beiden Austausche S3T/V4I, in denen sich die ß. terϊ us-Alkalische Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N zusätzlich vom Wiltyp unterscheidet; - die Codons für die Positionen 43 und 211 , in die nach den Beispielen 4 und 5 die Austausche L211D beziehungsweise I43V eingeführt werden können.

Claims

Patentansprüche

1. Alkalische Protease-Variante vom Subtilisin-Typ mit den Aminosäureaustauschen 224V, 250G und 253N in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gegenüber dem Ausgangsmolekül oder mit zwei oder einem dieser Aminosäureaustausche, wenn bereits im Ausgangsmolekül natürlicherweise die jeweils anderen Aminosäurepositionen 224V, 250G und/oder 253N vorhanden sind, und/oder mit dem Aminosäureaustausch 43V in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gegenüber dem Ausgangsmolekül.

2. Alkalische Protease-Variante nach Anspruch 1 mit zusätzlich einer oder zunehmend bevorzugt mehreren der Aminosäurepositionen 97D, 99R, 101A, 1021 und 157S.

3. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 1 oder 2 mit weiteren Aminosäureaustauschen gegenüber der unmutierten Wildtyp-Alkalischen Protease.

4. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 3, mit den weiteren Aminosäureaustauschen in einer oder mehreren der Positionen 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus.

5. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 4 mit den weiteren Aminosäureaustauschen in einer oder mehreren der Positionen 3, 4, 43, 61 , 188, 193, 199, 211 , 224, 250 und 253.

6. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 5, wobei es sich um einen oder mehrere der Aminosäureaustausche S3T, V4I, I43V, G61A, A188P, V193M, V199I, L211D, L211E, L211G, L211N oder L211Q, A224V, S250G und S253N handelt.

7. Alkalische Protease-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Ausgangsmolekül die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise aus Bacillus lentus DSM 5483, oder eine Variante davon ist.

8. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 7, wobei es sich um die Variante ß. feπft/s-Alkalische Protease S3T/V4I/A224V/S250G/S253N handelt, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 12 oder 38 angegebene Variante.

9. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 7, wobei es sich um die Variante ß. /enfus-Alkalische Protease S3T/V4I/L211D/A224V/S250G/S253N handelt, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 16 angegebene Variante.

10. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 7, wobei es sich um die Variante ß. /eπrus-Alkalische Protease S3T/V4I/I43V/A224V/S250G/S253N handelt, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 22 angegebene Variante.

11. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 7, wobei es sich um die Variante ß. ten i/s-Alkalische Protease S3T/V4I/L211N/A224V/S250G/S253N handelt, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 26 angegebene Variante.

12. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 7, wobei es sich um die Variante ß. /enfus-Alkalische Protease S3T/V4I/L211Q/A224V/S250G/S253N handelt, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 30 angegebene Variante.

13. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 7, wobei es sich um die Variante ß. fenfus-Alkalische Protease S3T/V4I/L211 E/A224V/S250G/S253N handelt, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 34 angegebene Variante.

14. Alkalische Protease-Variante nach Anpruch 7, wobei es sich um die Variante ß. /enrws-Alkalische Protease S3TΛ/4I/I43V/L211D/A224V/S250G/S253N handelt, vorzugsweise um die in SEQ ID NO. 36 angegebene Variante.

15. Mature Alkalische Protease-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

16. Von einer Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 15 durch Fragmentierung oder Deletionsmutagenese abgeleitetes Protein, umfassend mindestens eine und zunehmend bevorzugt mehrere Aminosäuren, die mit denen der Positionen 43, 97, 99, 101, 102, 157, 224, 250 und 253 des Ausgangsmoleküls in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 identisch sind, vorzugsweise mit proteolytischer Aktivität.

17. Von einer Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 16 durch Insertionsmutagenese, durch Substitutionsmutagenese und/oder durch Fusion mit mindestens einem anderen Protein oder Proteinfragment abgeleitetes Protein, umfassend mindestens eine und zunehmend bevorzugt mehrere Aminosäuren, die mit denen der Positionen 43, 97, 99, 101, 102, 157, 224, 250 und 253 des Ausgangsmoleküls in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 identisch sind, vorzugsweise mit proteolytischer Aktivität.

18. Protein oder Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 17 mit mindestens einer zusätzlichen Stabilisierung, vorzugsweise über Punktmutagenese.

19. Protein oder Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 18 mit mindestens einer zusätzlichen Derivatisierung.

20. Protein oder Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ mit wenigstens einer antigenen Determinante eines der in den Ansprüchen 1 bis 19 bezeichneten Proteine oder Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ, zunehmend bevorzugt über eine oder mehrere der Epitop-Regionen, innerhalb derer die Positionen 43, 97, 99, 101 , 102, 157, 224, 250 und 253 in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 liegen.

21. Für eine Alkalische Protease-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 20 codierende Nukleinsäure.

22. Nukleinsäure nach Anspruch 21 , dargestellt in SEQ ID NO. 11 , 15, 21 , 25, 29, 33, 35 oder 37, vorzugsweise enthaltend einen Teil, der den Positionen 346 bis 1152 gemäß SEQ ID NO. 1, 11, 15, 21, 25, 29, 33 und 35 beziehungsweise 334 bis 1140 gemäß SEQ ID NO. 37 entspricht.

23. Vektor, der einen in den Ansprüchen 21 oder 22 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält.

24. Klonierungsvektor nach Anspruch 23.

25. Expressionsvektor nach Anspruch 23.

26. Zelle, die (aufgrund gentechnischer Modifizierung) einen in den Ansprüchen 21 oder 22 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält.

27. Zelle nach Anspruch 26, wobei der genannte Nukleinsäurebereich Teil eines Vektors ist, insbesondere eines Vektors nach einem der Ansprüche 24 oder 25.

28. Zelle nach Anspruch 26 oder 27, die eines der in den Ansprüchen 1 bis 20 bezeichneten Proteine oder Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ exprimiert.

29. Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 28, bei der es sich um ein Bakterium handelt.

30. Zelle nach Anspruch 29, bei der es sich um ein gramnegatives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. co/ZXL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).

31. Zelle nach Anspruch 29, bei der es sich um ein grampositives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, ß. globigii oder ß. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum.

32. Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 28, bei der es sich um eine eukaryontische Zelle handelt, vorzugsweise eine der Gattung Saccharomyces.

33. Verfahren zur Herstellung eines der in einem der Ansprüche 1 bis 20 bezeichneten Proteine oder Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ.

34. Verfahren nach Anspruch 33, unter Einsatz einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 21 oder 22, vorzugsweise eines Vektors nach einem der Ansprüche 23 bis 25, besonders bevorzugt unter Einsatz einer Zelle nach einem der Ansprüche 26 bis 32.

35. Mittel, enthaltend eine Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 20.

36. Mittel nach Anspruch 35, wobei es sich um ein Wasch- oder Reinigungsmittel handelt.

37. Mittel nach Anspruch 36, welches die Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.

38. Mittel nach Anspruch 36 oder 37, welches zusätzlich weitere Enzyme, insbesondere andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Oxidoreduktasen und/oder Lipasen enthält.

39. Mittel nach Anspruch 35, wobei es sich um ein Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege handelt.

40. Mittel nach Anspruch 39 zur Behandlung von Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere von solchen mit Wolle oder Seide.

41. Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, wobei in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 20 aktiv wird.

42. Verfahren nach Anspruch 41 , wobei die Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt wird.

43. Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, wobei in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine Alkalische Protease vom Subtilisin- Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 20 aktiv wird.

44. Verfahren nach Anspruch 43 für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.

45. Verwendung einer Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.

46. Verwendung nach Anspruch 45, wobei die Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt wird.

47. Verwendung einer Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln.

48. Verwendung einer Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung

49. Verwendung nach Anspruch 48 zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben.

50. Verwendung einer Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege.

51. Verwendung nach Anspruch 50 für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.

52. Mittel nach Anspruch 35, wobei es sich um ein Kosmetikum handelt.