CN110312794A - 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的污垢去除性的一种或多种吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体。

Description

吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶
本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的污垢去除性的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。含有丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于多种工业应用。
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作为ASCII文本文件(名称：20171219_NB41228WOPCT_ST25；大小：15.3KB；创建日期：2017年12月19日)以电子方式与申请一起提交的序列表的内容形成本申请的一部分，并且通过援引以其全文并入本文。
丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(EC编号3.4.21)。基于它们的结构，存在两大类丝氨酸蛋白酶：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶及其同源物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员。S8家族的成员在其氨基酸序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体。
尽管在工业酶领域很久以来就已经知道丝氨酸蛋白酶，但是仍然需要适合于特定条件和用途的另外的丝氨酸蛋白酶。
本发明的变体、组合物和方法涉及重组丝氨酸蛋白酶变体、包含此类变体的组合物和与其相关的方法。含有本文公开的吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)进化枝丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于多种工业应用。
一些实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：(i)99、126、127、128、和54；(ii)99、126、127、和128；(iii)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T/V、S126A/D/E/F/G/H/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W、和P54E/G/I/L/Q/S/T/V；(iv)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T、S126A/D/E/G/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W；(v)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W、和P54T；(vi)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W；(vii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W、和P54T；(viii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、和F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W；(ix)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W、和P54T；(x)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、和F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W；(xi)S99M、S126A/G、D127E、和F128C/D/E/G；(xii)S126A/G、D127E、和F128E/G；或(xiii)S99M、S126A、D127E、和F128C/D/E；并且其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
另一个实施例涉及用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法，所述方法包括：(a)向宿主细胞中引入编码枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的一个或多个位置处包含一个或多个取代，其中对应于SEQ ID NO:1的N242的位置被天冬氨酸(D)取代(N242D)，和(b)在适于生产经编码的枯草杆菌蛋白酶变体的条件下使所述宿主细胞生长，其中相对于相同属、种和遗传背景的革兰氏阳性宿主细胞，所述宿主细胞生产增加量的(a)的枯草杆菌蛋白酶变体，所述相同属、种和遗传背景的革兰氏阳性宿主细胞包含引入的、编码枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的N242的位置处不包含取代；并且其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
在另一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体(i)是吉氏芽孢杆菌进化枝的成员；(ii)是分离的，(iii)具有蛋白水解活性；或包含(i)至(iii)的组合。在仍另外的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:1或8的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；(ii)与SEQ ID NO:1或8的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；(iii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；(iv)与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；或(v)与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在又仍另外的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体当与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的HDL、蛋污渍、和/或法式焦糖布丁(crème )污渍清洁活性相比时，具有增加的HDL、蛋污渍、和/或法式焦糖布丁污渍清洁活性。
另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。一些实施例涉及清洁方法，所述方法包括使表面或物品与本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或本文描述的一种或多种组合物接触。在另外的实施例中，清洁方法涉及清洁法式焦糖布丁污渍或蛋黄污渍或两者的方法。其他的实施例涉及用于生产本文描述的变体的方法，所述方法包括用包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的表达载体稳定地转化宿主细胞。仍另外的实施例涉及包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列的多核苷酸。
本文描述了与重组丝氨酸蛋白酶有关的变体、组合物和方法。含有本文公开的丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于多种工业应用，例如像纺织品、皮革和羽毛处理。本文公开的至少一种丝氨酸蛋白酶也非常适合包含在用于蛋白质降解的组合物中，所述组合物包括但不限于衣物和餐具洗涤剂；个人护理组合物；和人类食物和动物饲料。
在详细地描述本发明的组合物和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有指示，本公开的实践涉及通常用于分子生物学、蛋白质工程和微生物学的常规技术。尽管与本文所述方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践，但是本文描述了一些合适的方法和材料。把说明书作为一个整体参考时，以下即将定义的术语得以更全面地定义。
除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有指示，核酸序列从左至右以5’至3’方向书写；并且氨基酸序列从左向右以氨基至羧基方向书写。应当理解的是，在没有相反指示的情况下，本公开不限于本文描述的特定方法、方案和试剂。
在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
如本文所使用的，关于数值，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非该术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非该pH值另有具体定义。
本文描述的氨基酸取代使用以下命名法中的一个或多个：位置；位置：一种或多种氨基酸取代；或起始氨基酸：位置：一种或多种氨基酸取代。对仅一个位置(即5、8、17、22等)的提及涵盖可以存在于参比多肽、亲本或野生型分子中在该位置处的任何起始氨基酸，以及此类起始氨基酸可以被其取代的任何氨基酸(即，氨基酸取代排除了此类参比多肽、亲本或野生型分子的起始氨基酸)。对位置的提及可以列举若干种形式，例如，位置003也可以称为位置3。对氨基酸取代的提及可以进一步表示为由斜线(“/”)分开的若干个经取代的氨基酸。例如，D275S/K指示位置275被丝氨酸(S)或赖氨酸(K)取代。通过另外的实例，S101F/G/H/T/V代表在位置101处的五个可能的取代，其中所述起始氨基酸丝氨酸(S)可以被苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、或缬氨酸(V)取代。对X作为位置上的氨基酸的提及是指所列举位置处的任何氨基酸。
给定的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。即，SEQ ID NO:1的氨基酸序列用作参比序列。例如，使用如本文描述的比对算法将吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶(其进一步描述于2016年6月17日提交的国际专利申请号PCT/US2014/070107中)或本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行比对，并且与SEQ ID NO:1中的氨基酸残基比对(优选地，最佳比对)的给定的氨基酸序列中的每个氨基酸残基通过参考相应氨基酸残基的数字位置而方便地编号。当与查询序列比较时，例如像本文描述的序列比对算法将鉴定在主题序列中发生插入或缺失的位置。
术语“突变”是指氨基酸序列中的任何变化或改变，包括用与起始氨基酸不同的氨基酸对氨基酸序列的鉴定位置处的氨基酸进行的取代、在氨基酸序列的鉴定位置处的氨基酸的缺失、在氨基酸序列的鉴定位置处的氨基酸的插入、在氨基酸序列中的氨基酸侧链的替换、和/或氨基酸序列的化学修饰。
关于多肽，术语“野生型”或“亲本”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多肽。相似地，关于多核苷酸，术语“野生型”或“亲本”是指在一个或多个核苷处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多核苷酸。然而，编码野生型或亲本多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型或亲本多肽的任何多核苷酸。
术语“天然存在的”是指，例如，自然界中发现的序列和其中含有的残基(例如，多肽序列和其中含有的氨基酸或核酸序列和其中含有的核酸)。相反，术语“非天然存在的”是指，例如，自然界中未发现的序列和其中含有的残基(例如，多肽序列和其中含有的氨基酸或核酸序列和其中含有的核酸)。
除非另有指示，关于本公开的多肽，术语“参比”是指具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。在一个实施例中，给定的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在其他的实施例中，SEQ ID NO:1的多肽用作参比多肽，用于在稳定性和性能测定法中与本公开的枯草杆菌蛋白酶变体进行比较。
术语“蛋白酶”(protease)和“朊酶”(proteinase)是指具有分解蛋白质和肽的能力的酶。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解进行“蛋白水解”的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在许多熟知的程序用于测量蛋白水解活性。例如，蛋白水解活性可以通过分析各自蛋白酶水解合适底物的能力的比较测定法来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(Sigma)C-9801)、牛胶原(西格玛公司(Sigma)C-9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司(Sigma)E-1625)和牛角蛋白(ICN生物医学公司(ICNBiomedical)902111)。使用这些底物的比色测定法是本领域熟知的(参见例如WO 99/34011和USPN 6,376,450)。pNA肽基测定法(参见例如，Del Mar等人,Anal Biochem[分析生物化学],99:316-320,1979)还发现可用于确定活性酶浓度。该测定法测量当酶水解可溶性合成底物例如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上在410nm下测量来自水解反应的黄色的生成速率并且该速率与活性酶浓度成正比。另外，在280纳米(nm)处的吸光度测量可以用于确定纯化的蛋白质样品中的总蛋白质浓度。底物/蛋白质浓度的活性给出了酶比活性。
短语“枯草杆菌蛋白酶变体”是指通过取代、插入或缺失一个或多个氨基酸衍生自亲本多肽或参比多肽的重组多肽。
短语“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属中的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、吉氏芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属不断进行分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的生产被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
术语“载体”是指用于将一个或多个核酸引入或转移到靶细胞或靶组织中的核酸构建体。典型地，载体用于将外源DNA引入细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、黏粒、表达载体、穿梭载体等。典型地，载体包括复制起点、多克隆位点和可选择标记。典型地，将载体插入靶细胞的过程被称为转化。在一些实施例中，本发明包括：包含有效地连接到合适的前导序列(例如分泌、信号肽序列等)的编码丝氨酸蛋白酶多肽(例如，前体或成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的DNA序列的载体，所述载体能够在合适的宿主中实现DNA序列的表达，以及重组多肽链的折叠和易位。
术语“表达”是指衍生自本公开的核酸分子的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可指将mRNA翻译成多肽。因此，术语“表达”包括涉及“多肽的生产”的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、分泌等。
短语“枯草杆菌蛋白酶变体的增加的表达”、“枯草杆菌蛋白酶变体的增加的生产”和“枯草杆菌蛋白酶变体的增加的生产率”可互换地使用，并且是指从重组宿主细胞分离或分泌的枯草杆菌蛋白酶(变体)多肽的产率增加，在所述重组宿主细胞中已经引入(例如，经由转化)了编码枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸。更特别地，如本文所使用的，短语“枯草杆菌蛋白酶变体的增加的表达”或“枯草杆菌蛋白酶变体的增加的生产”是指从重组宿主细胞(即，向其中已经引入了编码枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸)分离或分泌的具体枯草杆菌蛋白酶变体(多肽)的产率(即，蛋白生产率)增加，其中枯草杆菌蛋白酶变体多肽的产率“增加”是相对(相比)于从类似的重组宿主细胞(向其中已经引入了编码参比(对照)枯草杆菌蛋白酶多肽的多核苷酸)分离或分泌的参比(对照)枯草杆菌蛋白酶多肽而言的。例如，编码本公开的枯草杆菌蛋白酶变体多肽的第一多核苷酸和编码参比(对照)枯草杆菌蛋白酶的第二多核苷酸可以转化到宿主细胞群(即，相同属、种和遗传背景的宿主细胞群)中。随后，在相同条件下生长/培养包含第一多核苷酸的宿主细胞转化体和包含第二多核苷酸的宿主细胞转化体，并且将从宿主细胞表达/产生的枯草杆菌蛋白酶变体多肽的量和参比(对照)枯草杆菌蛋白酶多肽的量相对于彼此进行比较(例如，经由蛋白浓度或枯草杆菌蛋白酶活性测量)。
术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指重组或合成产生的用于在靶细胞中表达目的核酸的核酸构建体或载体。典型地，表达载体或表达盒包含驱动外源核酸表达的启动子核苷酸序列。典型地，表达载体或盒还包括任何其他的允许靶细胞中特定核酸转录的指定核酸元件。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。许多原核和真核表达载体是可商购的。
术语“质粒”是指能够独立于染色体DNA进行复制的染色体外DNA分子。质粒是双链的(ds)，可以是环状的，并且通常被用作克隆载体。
如本文所使用的，在将核酸序列引入细胞中的上下文中，术语“引入”是指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类引入方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、轭合和转导。转化是指由摄取、任选的基因组掺入和遗传物质(例如，DNA)的表达引起的细胞的遗传改变。
如本文所使用的，当将核酸与另一个核酸序列一起置于功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“有效地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子或增强子有效地连接到核苷酸编码序列。如果核糖体结合位点被定位以便促进编码序列的翻译，该核糖体结合位点可以有效地连接到编码序列。典型地，“有效地连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不必需是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果此类位点不存在，则可以按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
术语“基因”是指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域的多核苷酸(例如，DNA区段)。在一些情况下，基因包括个体编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
当关于细胞使用时，术语“重组”典型地指示细胞已经通过引入外源核酸序列而被修饰，或者细胞衍生自已如此修饰的细胞。例如，重组细胞可以包含天然(非重组)形式的细胞中不以相同形式存在的基因，或者重组细胞可以包含已经被修饰并且重新引入细胞中的天然基因(发现于细胞的天然形式中)。重组细胞可以包含细胞内源的核酸，该核酸已经被修饰而不从细胞中除去该核酸；此类修饰包括通过基因置换、位点特异性突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的那些。重组DNA技术包括用于在体外生产重组DNA并且将该重组DNA转移到其可以被表达或传播的细胞中从而生产重组多肽的技术。多核苷酸或核酸的“重组(recombination和recombining)”通常是指装配或组合两个或更多个核酸或多核苷酸链或片段以产生新的多核苷酸或核酸。
如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员已知的方法操纵时，核酸或多核苷酸可以被转录和/或翻译以生产多肽或其片段，那么称该核酸或多核苷酸“编码”该多肽。此类核酸的反义链也被称为编码该序列。
术语“宿主菌株”和“宿主细胞”是指对于包含目的DNA序列的表达载体而言合适的宿主。
“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(JointCommission on Biochemical Nomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。
术语“前导序列”或“前肽序列”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前导序列或前肽序列的切割产生成熟的活性蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶通常表示为前酶。例如，在WO 2016/205710中提供了经修饰的前肽的实例。
术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。典型地，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。
当用于描述蛋白质、多肽或肽时，术语“成熟”是指没有信号肽序列和前肽序列的功能形式的蛋白质、多肽或肽。
当用于描述蛋白质或肽时，术语“前体”是指具有有效地连接到所述蛋白质的氨基或羰基末端的前导序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到前导序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。
如本文所使用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文所使用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。
术语“衍生自”涵盖术语“起源于”、“获自”、“可获自”、“分离自”和“产生自”，并且通常指示指定的材料来自另一种指定的材料或具有可以参考其他指定的材料来描述的特征。
术语“衍生自”和“获自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，所述术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。举例来说，“衍生自芽孢杆菌属的蛋白酶”是指具有由芽孢杆菌属天然生产的蛋白水解活性的那些酶，以及丝氨酸蛋白酶，如由芽孢杆菌属来源生产但是通过使用遗传工程技术由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的其他宿主细胞生产的那些。
在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”是指在两个序列中的核酸或氨基酸在比对最大对应关系时相同，如使用序列比较或分析算法测量的。
术语“％同一性”、“百分比同一性”和“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见Altschul等人,JMol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul,Proc Natl AcadSci USA[美国科学院院报],90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于小于20个残基的查询序列(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-3402,1997和Schaffer等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵(ScoringMatrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。
短语“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指直链氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,LipmanDJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database searchprograms[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序],Nucleic Acids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发育树。可以在例如Vector NTI Advance套件等程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(Neighbor Joining(NJ))法创建引导树(Saitou和Nei,Mol BiolEvol[分子生物学与进化],4:406-425,1987)。可以使用针对序列距离的Kimura校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序例如AlignX可以在系统发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。
了解分子之间的同源性可以揭示分子的进化历史以及它们的功能信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。两个实体之间最基本的关系是同源性；如果两个分子衍生自共同的祖先，则它们被称为是同源的。同源分子或同源物可以分为两类：旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一个物种内的同源物。旁系同源物在它们的详细生物化学功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物种内并且具有非常相似或完全相同功能的同源物。蛋白质超家族是可以推断出共同祖先的蛋白质的最大分组(进化枝)。通常这个共同祖先是基于序列比对和机械相似性。典型地，超家族含有若干个在该家族内显示序列相似性的蛋白质家族。基于MEROPS蛋白酶分类系统，术语“蛋白质宗族”通常用于蛋白酶超家族。如本文所使用的，术语“枯草杆菌蛋白酶”包括如在MEROPS-肽酶数据库中描述的S8丝氨酸蛋白酶家族的任何成员(Rawlings等人,MEROPS:the peptidase database[MEROPS：肽酶数据库],Nucl.Acids Res[核酸研究],数据库第34期,D270-272,2006)。
CLUSTAL W算法是序列比对算法的另一个实例(参见Thompson等人,NucleicAcids Res[核酸研究]22:4673-4680,1994)。CLUSTAL W算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质权重矩阵＝BLOSUM系列；DNA权重矩阵＝IUB；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；DNA转换权重＝0.50；列表亲水残基＝GPSNDQEKR；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在CLUSTAL算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，在500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有五个氨基酸缺失的变体相对于“参比”多肽具有99％(495/500个同一的残基×100)的百分比序列同一性。此类变体将被与所述多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体所涵盖。MUSCLE程序(Robert C.Edgar,MUSCLE:multiple sequence alignmentwith high accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)是多重序列比对算法的又另一个实例。
当核酸或多核苷酸至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。相似地，当多肽、蛋白质或肽至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，在组合物中分离的物种比其他物种更丰富。例如，分离的物种可以占存在的所有大分子物种的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％(以摩尔计)。优选地，将目的物种纯化至基本均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物物种)。可以分别使用本领域熟知的许多技术例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技术例如高效液相色谱法(HPLC)或相似方法来纯化物质。
术语“纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
短语“一种或多种基本上不含硼的组合物”或“一种或多种基本上不含硼的洗涤剂”分别是指一种或多种含有痕量硼(例如，小于约1000ppm(1mg/kg或1mg/L等于1ppm)、小于约100ppm、小于约50ppm、小于约10ppm、或小于约5ppm、或小于约1ppm)的组合物或洗涤剂，所述硼可能来自其他组合物或洗涤剂成分。
如本文所使用的，术语“功能测定法”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，所述术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定法系统。例如，在蛋白酶的情况下，功能测定法涉及确定蛋白酶水解蛋白质底物的有效性。
术语“清洁活性”是指在本公开的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件下由丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶的清洁性能可以通过使用用于清洁在物品或表面上的一种或多种不同酶敏感性污渍(例如，由食物、草地、血液、墨汁、奶、油、法式焦糖布丁和/或卵蛋白引起的污渍)的多种测定法来确定。变体或参比蛋白酶的清洁性能可以通过使在物品或表面上的污渍经受一个或多个标准洗涤条件并且通过使用多种色谱、分光光度计或其他定量方法来评估污渍除去的程度来确定。示例性清洁测定法和方法是本领域已知的，并且包括但不限于在WO99/34011和US 6,605,458(这两者都通过援引并入本文)中描述的那些，以及包括在下面所提供的实例中的那些清洁测定法和方法。
术语丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶的“清洁有效量”是指在具体清洁组合物中达到希望的酶活性水平的蛋白酶的量。此类有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定，并且基于许多因素，例如所使用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、片剂、棒状)组合物等。
术语“清洁辅助材料”是指除了本公开的丝氨酸蛋白酶多肽之外在清洁组合物中包括的任何液体、固体或气体物质。在一些实施例中，本公开的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。典型地，取决于清洁组合物的特定类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、棒状、糊剂、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁辅助材料。优选地，每种清洁辅助材料与在组合物中使用的蛋白酶相容。
清洁组合物和清洁制剂包括适合于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体、物品和/或表面的任何组合物。此类组合物和制剂包括但不限于例如液体和/或固体组合物，所述液体和/或固体组合物包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片剂、凝胶、棒状、颗粒和/或固体衣物清洁剂或洗涤剂组合物)和精细织物洗涤剂组合物；硬表面清洁组合物和制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔顺剂；以及纺织品、衣物增效清洁或洗涤剂组合物，衣物添加剂清洁组合物和衣物预去污(pre-spotter)清洁组合物；餐具洗涤组合物，包括手洗或手动餐具洗涤组合物(例如“手洗”或“手动”餐具洗涤剂)和自动餐具洗涤组合物(例如“自动餐具洗涤剂”)。本发明还可使用单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片(gelcap)或其他单一剂量单位例如预先测量的粉末或液体。
除非另有指示，否则如本文所使用的清洁组合物或清洁制剂包括颗粒或粉末形式的通用的或重垢洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂、糊剂或单位剂型的通用洗涤剂，特别是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢干洗(HDD)洗涤剂类型；液体精细织物洗涤剂；手洗或手动餐具洗涤剂，包括高起泡类型的那些；手洗或手动餐具洗涤剂、自动餐具洗涤剂、或餐具或桌面器具洗涤剂，包括用于家庭和机构使用的多种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、漱口水、假牙清洁剂、洗车香波、地毯香波、浴室清洁剂；用于人类和其他动物的毛发香波和/或毛发染发剂；沐浴露和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒组合物是呈“紧密”形式；在一些实施例中，液体组合物是呈“浓缩”形式。
如本文所使用的，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包括衣物添加剂组合物和适合用于带有污渍的织物(例如衣服、亚麻制品和其他纺织材料)的浸泡和/或预处理的组合物。
如本文所使用的，“非织物清洁组合物”包括非纺织品(即非织物)表面清洁组合物，所述非纺织品表面清洁组合物包括但不限于例如手洗或手动或自动餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、贴眼透镜清洁组合物、伤口清创组合物和个人清洁组合物。
关于旨在用于清洁污染或肮脏物体(包括特定织物和/或非织物物体或物品)的洗涤介质中的组合物，使用短语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂配制品”。本公开的此类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或配制品。实际上，在一些实施例中，本公开的洗涤剂包含本公开的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽，另外还包含一种或多种表面活性剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶稳定剂、钙、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐(例如三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如偏硅酸钠)。本公开的一些组合物，例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物，不含有任何磷酸盐(例如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
术语“漂白”是指处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增白(即变白)和/或清洁。适合于漂白的化学品的实例包括但不限于例如ClO2、H2O2、过酸、NO2等。漂白剂还包括酶促漂白剂例如过水解酶和芳基酯酶。另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种过水解酶的组合物，例如像描述于WO2005/056782、WO 2007/106293、WO2008/063400、WO 2008/106214、和WO 2008/106215中的过水解酶。
短语蛋白酶(例如，本公开的丝氨酸蛋白酶多肽)的“洗涤性能”是指与不添加丝氨酸蛋白酶多肽至组合物的洗涤剂相比，丝氨酸蛋白酶多肽对洗涤提供另外的清洁性能的贡献。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。在一些测试系统中，其他相关因素，例如洗涤剂组合物、泡沫浓度(sud concentration)、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度能按以下这样的方式进行控制：模仿在某些细分市场(例如手洗或手动餐具洗涤、自动餐具洗涤、餐具清洁、桌面器具清洁、织物清洁等)中对于家庭应用典型的一种或多种条件。
本文中使用的术语“相关洗涤条件”指示在手洗餐具洗涤、自动餐具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中实际用于家庭中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
术语“消毒”是指从表面去除污染物，以及在物品表面上抑制或杀死微生物。
本文清洁组合物的“紧密”形式最好通过密度来反映，并且就组合物而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以相当大的量存在，典型地为按总组合物的重量计约17％至约35％。相比之下，在紧密的组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以按组合物的重量计不超过约10％、或更优选地约5％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自硫酸盐和氯化物的碱盐和碱土金属盐。在一些实施例中，填料盐是硫酸钠。
本文公开了可用于清洁应用和清洁方法以及多种工业应用的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一个实施例中，本文描述的一种或多种丝氨酸蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶变体是吉氏芽孢杆菌进化枝的成员。在另一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是分离的、重组的、基本上纯的和/或非天然存在的多肽。在一些实施例中，可以将本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体掺入一种或多种清洁组合物中，所述清洁组合物可用于一种或多种清洁对其有需要的物品或表面的方法中。
一些实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：(i)99、126、127、128、和54；(ii)99、126、127、和128；(iii)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T、S126A/D/E/G/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W、和P54T；(iv)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T、S126A/D/E/G/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W；(v)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W、和P54T；(vi)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W；(vii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W、和P54T；(viii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、和F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W；(ix)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W、和P54T；(x)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、和F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W；(xi)S99M、S126A/G、D127E、和F128C/D/E/G；(xii)S126A/G、D127E、和F128E/G；或(xiii)S99M、S126A、D127E、和F128C/D/E；并且其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:1的氨基酸序列相对应来编号。又其他的实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：(i)99、126、127、128、和54；(ii)99、126、127、和128；(iii)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T、S126A/D/E/G/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W、和P54T；(iv)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T、S126A/D/E/G/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W；(v)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W、和P54T；(vi)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W；(vii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W、和P54T；(viii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、和F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W；(ix)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W、和P54T；(x)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、和F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W；(xi)S99M、S126A/G、D127E、和F128C/D/E/G；(xii)S126A/G、D127E、和F128E/G；或(xiii)S99M、S126A、D127E、和F128C/D/E；条件是所述变体不含有对应于以下的取代：(a)当所述变体含有对应于SEQ ID NO:1中的S126T或F128A的取代时，SEQ ID NO:1中的S99R，(b)当所述变体含有对应于SEQ ID NO:1中的S99R或F128A的取代时，SEQ ID NO:1中的S126T，或者(c)当所述变体含有对应于SEQ ID NO:1中的S99R或S126T的取代时，SEQ ID NO:1中的F128A，并且其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ IDNO:1的氨基酸序列相对应来编号。
其他的实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：(i)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/T、S126A/D/E/G/I/L/M/N/Q/R/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W、和P54T；(ii)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/T、S126D/E/G/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W；(iii)S99E/H/I/K/M/Q/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W、和P54T；(iv)S99E/H/I/K/M/Q/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W；(v)S99E/H/I/K/M/T、S126A/G/M/N/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、F128C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W、和P54T；(vi)S99E/H/I/K/M/T、S126A/G/M/N/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、和F128C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W；(vii)S99E/H/I/M/T、S126A/G/M、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、F128C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W、和P54T；(viii)S99E/H/I/M/T、S126A/G/M、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、和F128C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W；(ix)S99M、S126A/G、D127E、和F128C/D/E/G；(x)S126A/G、D127E、和F128E/G；或(xi)S99M、S126A、D127E、和F128C/D/E；其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
仍其他的实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处进一步包含一个、两个、三个、四个或更多个取代：(i)37、39、43、47、56、80、85、87、114、和242；(ii)37、39、47、56、80、85、87、114、和242；(iii)与对应于选自37、47、56、80、85、87、114、和242的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的39；(iv)与对应于选自37、39、47、80、85、87、114、和242的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的56；(v)与对应于选自37、39、47、56、80、85、87、和242的SEQ IDNO:1位置的一个或多个位置相组合的114；(vi)与对应于选自37、39、47、56、80、85、87、和114的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的242；(vii)与对应于选自37、47、56、80、85、87、和114的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的39+242；(viii)与对应于选自37、47、56、80、85、87、114、和242的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的39+99+128；或(ix)39、242、39+242、37+39+242、37+39+47+56+80+85+87+114+242、和37+39+43+47+56+80+85+87+114+242；其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。又另一个实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处进一步包含一个、两个、三个、四个或更多个取代：(i)A37T、S39E、I43V、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、T114Q、和N242D；(ii)A37T、S39E、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、T114Q、和N242D；(iii)与对应于选自A37T、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、T114Q、和N242D的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的S39E；(iv)与对应于选自A37T、S39E、A47V、I80V、N85S、E87D、T114Q、和N242D的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的T56Y；(v)与对应于选自A37T、S39E、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、和N242D的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的T114Q；(vi)与对应于选自A37T、S39E、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、和T114Q的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的N242D；(vii)与对应于选自A37T、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、和T114Q的SEQ IDNO:1位置的一个或多个位置相组合的S39E+N242D；或(viii)S39E、N242D、S39E+N242D、A37T+S39E+N242D、A37T+S39E+A47V+T56Y+I80V+N85S+E87D+T114Q+N242D、和A37T+S39E+I43V+A47V+T56Y+I80V+N85S+E87D+T114Q+N242D；其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
又另一个实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：(i)A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126T-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126V-D127G-A128E-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99I-T114Q-S126T-D127E-F128I-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127S-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99N-T114Q-S126T-D127Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127Q-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126G-D127G-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99K-T114Q-S126G-D127G-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127L-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99M-T114Q-D127G-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99K-T114Q-D127L-F128C-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99M-T114Q-S126E-D127A-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127P-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99A-T114Q-S126M-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127G-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126V-D127E-F128K-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126G-D127G-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99Q-T114Q-S126T-D127V-F128D-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126T-D127L-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126T-D127G-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126R-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127G-F128L-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127A-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127G-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127A-F128W-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127H-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127T-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127V-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127L-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127Q-F128M-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127T-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127Q-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127N-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127L-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127V-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127V-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127V-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127G-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126L-D127F-F128R-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127V-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126V-D127M-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127W-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127S-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127S-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127A-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126Q-D127L-F128H-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126M-D127P-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-D127H-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126M-D127L-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127E-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126E-D127A-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126Q-D127V-F128C-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126N-D127G-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126T-D127E-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126D-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126W-D127N-F128D-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127A-F128C-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126T-D127E-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127I-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-D127G-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126V-D127A-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-F128H-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126Q-D127A-F128D-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-D127T-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-D127P-F128G-N2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另一个实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：A037C-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037D-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037G-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037H-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037N-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037P-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037Q-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039D-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-A047V-I080V-N085S-S099R-N242D、A037T-S039E-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-A047V-T056Y-E087D-S099R-T114A-F128A-N242D、A037T-S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047D-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047E-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047F-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047H-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047I-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047M-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047N-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047Q-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047S-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V、A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-N085S-E087D-S099R-T114Q-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054E-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054G-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054I-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054L-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054Q-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054S-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056A-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056C-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056E-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056F-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056H-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056I-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056K-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056L-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056M-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056N-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056P-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Q-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056S-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056W-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080C-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080L-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085A-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085D-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085E-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V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-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-I043V-A047W-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047Y-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q、A037T-S039E-I043V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-N242D、A037T-S039E-I043V-N085S-E087D-S099R-T114Q、A037T-S039E-I043V-N085S-E087D-S099R-T114Q-N242D、A037T-S039E-I043V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-S099R-T114Q-N242D、A037T-S039E-I043V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、A037V-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037W-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037Y-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、I021V-A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、I043V-A047V-N242D、I043V-A047V-S099R-F128A-N242D、I043V-A047V-S099R-S126T-N242D、I043V-A047V-T056Y-T114Q、I043V-A047V-T056Y-T114Q-N242D、N242D、S039E-A047V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-N085S-S099R-T114Q-N242D、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-S099R-T114Q、S039E-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114Q、S039E-A047V-T056Y-N085S-S099R-T114Q-F128A-N242D、S039E-E087D-N242D、S039E-E087D-S099R-F128A-N242D、S039E-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-E087D-S099R-S126T-N242D、S039E-I043V-A047V-E087D-N242D、S039E-I043V-A047V-E087D-S099R、S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-I043V-A047V-S099R-T114Q-N242D、S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-E087D-S099R-T114Q-S126T-N242D、S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-I043V-E087D-S099R-T114Q、S039E-I043V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I043V-N085S-E087D-S099R-T114Q-N242D、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-I043V-T056Y-E087D-S099R-N242D、S039E-I043V-T056Y-E087D-S099R-T114Q、S039E-I043V-T056Y-I080V-N085S-S099R-T114Q-N242D、S039E-I043V-T056Y-S099R-T114Q-F128A-N242D、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-I080V-S099R-T114Q-N242D、S039E-N042R-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-N074D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-P054T-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N253D、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q200L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q256E、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-S255W、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-V199I、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Y203W、S039E-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-T056Y-E087D-T114Q-N242D、S039E-T056Y-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S099R-F128A-N242D、S099R-S126T-N242D、T009E-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、T056Y-S099R-T114Q-F128A-N242D、T056Y-S099R-T114Q-S126T-N242D、和T056Y-T114Q-N242D。
在另一个实施例中，本文提供的变体包含一种或多种具有氨基酸取代的变体，所述氨基酸取代选自由以下组成的组：表6、7、8、9、10、11、12和13中列出的在一个或多个清洁测定法或稳定性测定法(包括衣物、BMI、蛋、法式焦糖布丁测定法或EDTA稳定性测定法)中具有PI≥1.1的那些，或者在EDTA稳定性测定法中具有大于40％残余活性的那些。
在另一个实施例中，本文提供的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含一种或多种另外的取代、缺失或插入，或其组合。在一个实例中，具有一个或多个另外的取代的变体是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％同一性的变体，并且所述变体包含至少一个另外的取代(使用SEQ ID NO:1编号)，所述取代选自由以下组成的组：T3V、T9R、A15T、V66A、N74D、N97A/D/G/S、S99G/M、S101A、V102E/I、N116V/R、S126F、D127Q、F128A、G157S、Y161A、R164S、T188P、V199I、Q200C/E/I/K/T/V/W/L、Y203W、M211C、N212D、M216S/F、Q239R和T249R。在又另一个实例中，具有一个或多个另外的取代的变体是与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少90％同一性的变体，并且所述变体包含至少一个另外的取代(使用SEQ ID NO:13编号)，所述取代选自由以下组成的组：S3V、S9R、A15T、V66A、N74D、S97A/D/E/G、S99G/M、S101A、V102E/I、G116V/R、S126F、P127Q、S128A、G157S、Y161A、R164S、A188P、V199I、Q200C/E/I/K/T/V/W/L、Y203W、L211C/M、N212D、M216S/F、Q239R和T249R。
又仍另一个实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，条件是所述两个、三个或四个或多个取代是非天然存在的。又甚至仍另外的实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体(i)是吉氏芽孢杆菌进化枝的成员；(ii)是分离的；(iii)具有蛋白水解活性；或(iv)包含(i)至(iii)的组合。仍又另一个实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体衍生自亲本多肽或参比多肽，所述亲本多肽或参比多肽(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性；或者(ii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有100％氨基酸序列同一性。甚至另外的实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；(ii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；或者(iii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性。
一些实施例涉及清洁方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或有效量的本文描述的一种或多种组合物接触。在另外的实施例中，本文描述的清洁方法涉及清洁法式焦糖布丁污渍的方法。在仍其他的实施例中，本文提供的清洁方法涉及清洁蛋污渍的方法。
在仍另一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有酶活性(例如，蛋白酶活性)并且因此可用于清洁应用中，所述清洁应用包括但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)的方法。一些实施例涉及一种或多种清洁组合物，所述清洁组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的酶活性(例如，蛋白酶活性)可以容易地通过本领域普通技术人员熟知的程序来确定。下面提供的实例描述了用于评估清洁性能的方法。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在表面活性剂的存在下具有蛋白酶活性。在其他的实施例中，所述表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其组合。在一些实施例中，所述蛋白酶活性包含酪蛋白水解活性。在一些实施例中，所述蛋白酶活性包含二甲基酪蛋白水解活性。
在一些实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体表现出至少一种改善的性质。在一些此类实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体表现出改善的清洁性能、改善的稳定性、或改善的清洁性能和改善的稳定性两者。
在氧化、螯合剂、变性剂、表面活性剂、热和/或pH稳定的蛋白酶的上下文中，术语“增强的稳定性”或“改善的稳定性”是指与参比蛋白酶(例如，野生型蛋白酶或亲本蛋白酶)相比，随时间推移的较高地保留的蛋白水解活性。自溶已经被鉴定为液体洗涤剂中枯草杆菌蛋白酶活性丧失的一种模式。(Stoner等人,2004Protease autolysis in heavy-dutyliquid detergent formulations:effects of thermodynamic stabilizers andprotease inhibitors[重垢液体洗涤剂制剂中的蛋白酶自溶：热力学稳定剂和蛋白酶抑制剂的作用],Enzyme and Microbial Technology[酶和微生物技术]34:114-125)。
关于蛋白酶变体的术语“热稳定(thermally stable)”和“热稳定的(thermostable)”和“热稳定性(thermostability)”是指在蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件(或“应激条件”)下、在给定的时间段暴露于鉴定的温度后、同时暴露于改变的温度下，蛋白酶保留指定量的酶活性。“改变的温度”涵盖温度升高或降低。
在一些实施例中，本文提供的变体蛋白酶在给定的时间段(例如，至少约20分钟、至少约60分钟、约90分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟、约360分钟、约420分钟、约480分钟、约540分钟、约600分钟、约660分钟、约720分钟、约780分钟、约840分钟、约900分钟、约960分钟、约1020分钟、约1080分钟、约1140分钟、或约1200分钟)、暴露于50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、58℃、59℃、或60℃的温度后，保留至少约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％蛋白水解活性。
在一些实施例中，具有改善的稳定性的一种或多种变体选自表8、10和11中列出的变体的组。
仍另外的实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中当与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的法式焦糖布丁污渍清洁性能相比时，所述变体具有法式焦糖布丁污渍清洁PI>1。另一个实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中当与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的法式焦糖布丁污渍清洁性能相比时，所述变体具有法式焦糖布丁污渍清洁PI>1，其中所述变体和具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的法式焦糖布丁污渍清洁性能根据实例2中描述的法式焦糖布丁测定法进行测量。在一些此类实施例中，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体(当与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的法式焦糖布丁污渍清洁性能相比时，具有法式焦糖布丁污渍清洁PI>1)选自表7和9提供的变体。
仍另外的实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中当与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的蛋黄污渍清洁性能相比时，所述变体具有蛋黄污渍清洁PI>1。另一个实施例涉及本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其中当与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的蛋黄污渍清洁性能相比时，所述变体具有蛋黄污渍清洁PI>1，其中所述变体和具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的蛋黄污渍清洁性能根据实例2中描述的蛋黄污渍测定法进行测量。在一些此类实施例中，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体(当与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶的蛋污渍清洁性能相比时，具有蛋污渍清洁PI>1)选自表8、10和11提供的变体。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在清洁组合物中表现出清洁性能。清洁组合物通常包括对酶的稳定性和性能有害的成分，这些成分使清洁组合物成为了对于酶例如丝氨酸蛋白酶保留功能而言的恶劣环境。因此，将酶置于清洁组合物中并且期望发挥酶功能(例如丝氨酸蛋白酶活性，例如通过清洁性能表现的)是重要的。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物中表现出清洁性能。在一些此类实施例中，所述一种或多种变体选自表7、8、9、10和11中列出的变体的组。在一些实施例中，在自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁蛋黄污渍。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在衣物洗涤剂组合物中表现出清洁性能。在一些实施例中，在衣物洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁血液/奶/墨汁污渍。在本文描述的一种或多种清洁组合物中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在具有或不具有漂白组分情况下表现出清洁性能。
在甚至仍另外的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体当与参比枯草杆菌蛋白酶相比时具有一种或多种改善的性质；其中所述改善的性质选自改善的洗涤剂清洁性能、改善的稳定性；及其组合。在另一个实施例中，参比枯草杆菌蛋白酶包含SEQID NO:1的氨基酸序列。在又另一个实施例中，所述改善的性质是(i)改善的洗涤剂清洁性能，其中所述变体具有BMI、法式焦糖布丁和/或蛋污渍清洁PI>1；和/或(ii)改善的稳定性，其中所述变体具有大于参比枯草杆菌蛋白酶的残余活性。在仍又另一个实施例中，洗涤剂清洁性能根据实例2的衣物(HDL)和ADW洗涤剂测定法中的清洁性能进行测量；和/或稳定性根据实例2的稳定性测定法进行测量。在一些此类实施例中，所述一种或多种变体选自表7、8、9、10、11、12和13中列出的变体的组。
可以使本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体经受多种变化，例如一个或多个氨基酸插入、缺失、和/或取代(保守或非保守的)，包括此类变化基本上不改变多肽的酶活性的情况。相似地，也可以使本文描述的一种或多种核酸经受多种变化，例如在一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸的一个或多个取代(这样使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，当编码的氨基酸不被核苷酸突变改变时)或非沉默变异、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或插入、和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的切割或一个或多个截短。与由原始核酸序列编码的多肽酶相比，所述核酸序列中的许多此类变化基本上不会改变所得的编码的多肽酶的酶活性。还可以对本文描述的一个或多个核酸序列进行修饰以便包括一个或多个密码子，所述一个或多个密码子在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供了最佳表达，同时，若希望，所述一个或多个密码子仍编码一个或多个相同的氨基酸。
一些实施例涉及具有所希望的酶活性(例如蛋白酶活性或清洁性能活性)的一种或多种多肽，所述多肽包含具有本文描述的氨基酸取代和/或变异的序列，并且还包含一个或多个另外的氨基酸取代或变异，例如保守的和非保守的取代或变异，其中所述多肽显示、维持或近似维持所希望的酶活性(例如蛋白水解活性)。在一些实施例中，所述蛋白水解活性反映在本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的清洁活性或性能上。例如，氨基酸取代可以包括但不限于一个或多个非保守取代和/或一个或多个保守氨基酸取代。典型地，保守氨基酸残基取代涉及将在氨基酸残基的一个功能类别内的成员交换属于相同功能类别的残基(在计算百分比功能同源性时，保守的氨基酸残基被认为是功能同源的或保守的)。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、和苏氨酸在功能上相似，因此可以相互用作保守氨基酸取代。天冬氨酸和谷氨酸可以相互用作保守取代。天冬酰胺和谷氨酰胺可以相互用作保守取代。精氨酸、赖氨酸、和组氨酸可以相互用作保守取代。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸可以相互用作保守取代。苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸可以相互用作保守取代。
可以设想其他保守氨基酸取代组。例如，氨基酸可以通过相似的功能或化学结构或组成(例如酸性的、碱性的、脂肪族的、芳香族的、含硫的)进行分组。例如，脂肪族分组可以包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。含有被认为相互为保守取代的氨基酸的其他组包括：芳香族的：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性的：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带电残基，半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、和脯氨酸(P)；亲水性不带电残基：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组是本领域技术人员所熟知并描述于多种标准教科书中。本文的多肽序列表(结合上述取代组)，提供了所有保守取代的多肽序列的表达列表。
在上述氨基酸残基类别中存在更保守的取代，其也或可替代地可以是合适的。更保守的取代的保守组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的保守取代或变异包括小百分比、有时小于5％、4％、3％、2％、或1％，或小于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸的取代或变异(被相同保守取代组的保守选择的氨基酸取代或变异)。
一些实施例涉及一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列。在甚至另外的实施例中，本文描述的一种或多种多核苷酸或核酸是分离的、重组的、基本上纯的和/或非天然存在的多核苷酸或核酸。
一些实施例涉及合成衍生的核酸，所述核酸包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核苷酸序列。在一些实施例中，重组表达具有同源前肽序列(例如Bgi02446前肽)的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。
本发明的核酸可以通过使用任何合适的合成、操作和/或分离技术或其组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准核酸合成技术、例如固相合成技术来生产。在此类技术中，典型地合成高至50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法)以基本上形成任何希望的连续核酸序列。还可以通过本领域已知的任何合适的方法来促进本发明的核酸的合成，包括但不限于使用以下方法的化学合成：经典的亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage等人,Tetrahedron Letters[四面体快报]22:1859-69[1981])；或Matthes等人描述的方法(参见Matthes等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:801-805[1984])，如典型地在自动合成方法中所实践的。本发明的核酸还可以通过使用自动DNA合成仪来产生。可以从多种商业来源订购定制的核酸(例如，米德兰认证试剂公司(The Midland Certified Reagent Company)、大美国基因公司(GreatAmerican Gene Company)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)和DNA2.0)。用于合成核酸的其他技术和相关原理是本领域已知的(参见例如，Itakura等人,Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]53:323[1984]；和Itakura等人,Science[科学]198:1056[1984])。
在另一个实施例中，本文描述的一种或多种多核苷酸编码枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体在对应于SEQ ID NO:1的位置N242的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代，其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在仍另一个实施例中，本文描述的一种或多种多核苷酸编码包含242D取代的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体包含大于1.0的生产率性能指数(PI)，所述生产率PI是相对于枯草杆菌蛋白酶变体多肽(其在对应于SEQ ID NO:1的位置N242的位置处不包含天冬氨酸(D)氨基酸取代)而言的，其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在又仍另一个实施例中，本文描述的一种或多种多核苷酸是表达构建体，所述表达构建体按5’至3’方向包含：启动子序列，其位于信号肽序列的上游(5’)并与信号肽序列有效地连接；前肽序列，其位于5’信号肽序列的下游(3’)并与5’信号肽序列有效地连接；编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体的核酸序列，所述核酸序列位于5’前肽序列的下游(3’)并且与5’前肽序列有效地连接；和任选的终止子序列，其位于所述核酸序列的下游(3’)并且与所述核酸序列有效地连接，所述核酸序列编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体；其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在甚至又仍另一个实施例中，本文描述的一种或多种多核苷酸是表达构建体，所述表达构建体按5’至3’方向包含：启动子序列，其位于信号肽序列的上游(5’)并与信号肽序列有效地连接；前肽序列，其位于5’信号肽序列的下游(3’)并与5’信号肽序列有效地连接；编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体的核酸序列，所述核酸序列位于5’前肽序列的下游(3’)并且与5’前肽序列有效地连接；和任选的终止子序列，其位于所述核酸序列的下游(3’)并且与所述核酸序列有效地连接，所述核酸序列编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体，其中(i)所述启动子序列包含芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)核糖体RNA启动子，其中芽孢杆菌属物种核糖体RNA启动子是枯草芽孢杆菌rrnI启动子；(ii)所述信号肽序列包含SEQ ID NO:3；(iii)所述前肽序列包含SEQ ID NO:4；(iv)编码所述变体的核酸序列编码包含选自本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列的多肽，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的242的位置处具有天冬氨酸(D)氨基酸取代；和/或(v)所述任选的终止子序列包含SEQ ID NO:6，其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
如上所述，可用于核酸修饰的重组DNA技术是本领域熟知的。例如，技术例如限制性内切核酸酶消化、连接、逆转录和cDNA生产以及聚合酶链反应(例如PCR)是本领域技术人员已知和容易使用的。本文描述的一种或多种核苷酸还可以通过使用一个或多个寡核苷酸探针来筛选cDNA文库而获得，所述探针可以与编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸杂交或对其进行PCR扩增。用于筛选并分离cDNA克隆的方法以及PCR扩增方法是本领域技术人员熟知的并且描述于本领域技术人员已知的标准参考文献中。本文描述的一些核酸可以通过例如已知的诱变程序(例如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)改变天然存在的多核苷酸主链(例如，编码酶或亲本蛋白酶的多核苷酸主链)来获得。适合于产生可以编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经修饰的多核苷酸的多种方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化、以及多种其他重组方法。
一些实施例提供了一种或多种载体，所述载体包含本文描述的一种或多种多核苷酸；一种或多种表达载体或表达盒，所述表达载体或表达盒包含本文描述的一种或多种核酸或多核苷酸；一种或多种分离的、基本上纯的、或重组的DNA构建体，所述构建体包含本文描述的一种或多种核酸或多核苷酸；一种或多种分离的或重组的细胞，所述细胞包含本文描述的一种或多种多核苷酸；以及一种或多种组合物，所述组合物包含一种或多种此类载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或其任何组合或混合物。
一些实施例提供了一种或多种重组细胞，所述重组细胞包含本文描述的一种或多种载体(例如表达载体或DNA构建体)，所述载体包含本文描述的一种或多种核酸或多核苷酸。将一些此类重组细胞用此类一种或多种载体进行转化或转染，但是其他方法在本领域中是可获得且已知的。此类细胞典型地称为宿主细胞。一些此类细胞包含细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供了包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。
其他实施例提供了一种或多种载体，所述载体包含本文描述的一种或多种核酸或多核苷酸。在一些实施例中，所述载体是表达载体或表达盒，其中本文描述的一种或多种多核苷酸序列有效地连接到有效的基因表达所需的一种或多种另外的核酸区段上(例如，有效地连接到本文描述的多核苷酸的启动子)。载体可以包括转录终止子和/或能够通过在含有抗菌剂的培养基中生长来实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持的选择基因，例如抗生素抗性基因。
另一个实施例涉及用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法，所述方法包括：(a)向宿主细胞中引入编码枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的一个或多个位置处包含一个或多个取代，其中对应于SEQ ID NO:1的N242的位置被天冬氨酸(D)取代(N242D)，和(b)在适于生产经编码的枯草杆菌蛋白酶变体的条件下使所述宿主细胞生长，其中相对于相同属、种和遗传背景的革兰氏阳性宿主细胞，所述宿主细胞生产增加量的(a)的枯草杆菌蛋白酶变体，所述相同属、种和遗传背景的革兰氏阳性宿主细胞包含引入的、编码枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的N242的位置处不包含取代；并且其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在仍另一个实施例中，上文描述的用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法使(a)的枯草杆菌蛋白酶变体的产率提高至少2.5％。在仍另一个实施例中，在上文描述的用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法中(a)的枯草杆菌蛋白酶变体相对于在对应于SEQ ID NO:1的N242的位置处不具有天冬氨酸(D)取代的枯草杆菌蛋白酶变体具有生产率性能指数(PI)>1.0。在仍另一个实施例中，上文描述的用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法中的多核苷酸构建体是表达构建体，所述表达构建体按5’至3’方向包含：启动子序列，其位于信号肽序列的上游(5’)并与信号肽序列有效地连接；前肽序列，其位于5’信号肽序列的下游(3’)并与5’信号肽序列有效地连接；编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体的核酸序列，所述核酸序列位于5’前肽序列的下游(3’)并且与5’前肽序列有效地连接；和任选的终止子序列，其位于所述核酸序列的下游(3’)并且与所述核酸序列有效地连接，所述核酸序列编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体；其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在甚至仍另外的实施例中，上文描述的用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法中的多核苷酸构建体是表达构建体，所述表达构建体按5’至3’方向包含：启动子序列，其位于信号肽序列的上游(5’)并与信号肽序列有效地连接；前肽序列，其位于5’信号肽序列的下游(3’)并与5’信号肽序列有效地连接；编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体的核酸序列，所述核酸序列位于5’前肽序列的下游(3’)并且与5’前肽序列有效地连接；和任选的终止子序列，其位于所述核酸序列的下游(3’)并且与所述核酸序列有效地连接，所述核酸序列编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体，其中(i)所述启动子序列包含芽孢杆菌属物种核糖体RNA启动子，其中芽孢杆菌属物种核糖体RNA启动子是枯草芽孢杆菌rrnI启动子；(ii)所述信号肽序列包含SEQ ID NO:3；(iii)所述前肽序列包含SEQ ID NO:4；(iv)编码所述变体的核酸序列编码包含选自本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列的多肽，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的242的位置处具有天冬氨酸(D)氨基酸取代；和/或(v)所述任选的终止子序列包含SEQ ID NO:6，其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
在又另一个实施例中，在上文描述的用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法中(a)的枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含在对应于选自9、37、39、42、43、47、54、56、74、80、85、87、99、114、126、127、128、199、200、203、211、253、255和256的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置处的一个或多个取代，其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在仍又另外的实施例中，在上文描述的用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法中(a)的枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置包含一个或多个取代的氨基酸序列：I043V-A047V-T056Y-T114Q、S039E-I043V-E087D-S099R-T114Q、S039E-I043V-A047V-E087D-S099R、S039E-I043V-T056Y-E087D-S099R-T114Q、S039E-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114Q、S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-S099R-T114Q、A037T-S039E-I043V-N085S-E087D-S099R-T114Q、T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-N042R-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Y203W、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-V199I、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N253D、T009E-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-S255W、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q256E、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q200L、S039E-N074D-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-I043V-A047V、S039E-P054T-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I043V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-T056Y-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-N042R-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Y203W、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-V199I、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N253D、T009E-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-S255W、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q256E、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q200L、S039E-N074D-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-I043V-A047V、S039E-P054T-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I043V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、和S039E-T056Y-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、及其组合；其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。在甚至仍又另外的实施例中，在上文描述的用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法中(a)的枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；(ii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；或者(iii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性。
表达载体可以衍生自质粒或病毒DNA，或在替代性实施例中，含有这两者的元件。示例性载体包括但不限于pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑],第3章,Molecular Biological Methods for Bacillus[用于芽孢杆菌的分子生物学方法],约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)[1990]；针对枯草芽孢杆菌的合适的复制质粒包括第92页列出的那些)。还参见，Perego,Integrational Vectors for Genetic Manipulationsin B.subtilis[在枯草芽孢杆菌中用于遗传操作的整合载体]，在：Sonenshein等人,[编辑]B.subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,Physiology andMolecular Genetic[枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学],American Society for Microbiology[美国微生物学会],华盛顿特区[1993],第615-624页)和p2JM103BBI中。
为了在细胞中表达和生产目的蛋白(例如，丝氨酸蛋白酶多肽)，包含编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸的至少一个拷贝(并且在一些情况下包含多个拷贝)的至少一种表达载体在适合于丝氨酸蛋白酶表达的条件下被转化到细胞中。在一些实施例中，将本文描述的一种或多种多核苷酸序列(以及包括在载体中的其他序列)整合到宿主细胞的基因组中；然而在其他实施例中，包含本文描述的一种或多种多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合到宿主细胞基因组中的进入的核苷酸序列。本文描述的一种或多种载体可用于生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体存在于能够将该多核苷酸整合到宿主染色体中并且任选地在宿主染色体中扩增的整合载体上。整合位点的实例是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，本文描述的一种或多种多核苷酸的转录通过如下启动子来实现，所述启动子是所选前体蛋白酶的野生型启动子。在其他的实施例中，所述启动子与前体蛋白酶是异源的，但是在宿主细胞中发挥功能。用于细菌宿主细胞的合适的启动子的实例包括但不限于amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子；嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌(B.pumilis)木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA的启动子、和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子，以及噬菌体λPR或PL启动子以及大肠杆菌lac、trp或tac启动子。
本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中生产。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在革兰氏阳性细菌中生产。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌属物种、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、木霉属物种(Trichoderma spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)或毕赤酵母属物种(Pichia spp.)。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体由芽孢杆菌属物种宿主细胞生产。芽孢杆菌属物种宿主细胞的实例包括但不限于：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、Myceliopthera属物种(Myceliopthera spp)和亚罗酵母属物种(Yarrowia spp)，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞被用于生产丝氨酸蛋白酶多肽。USPN 5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了可以用于生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多种芽孢杆菌属宿主菌株，但是可以使用其他合适的菌株。
可以用于生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的若干种细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属物种菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码目的多肽的多核苷酸已经被引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110、和PEP 211菌株(参见例如Hoch等人,Genetics[遗传学]73:215-228[1973]；还参见USPN 4,450,235和4,302,544，以及EP0134048)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如，Palva等人,Gene[基因]19:81-87[1982]；Fahnestock和Fischer,J.Bacteriol.[细菌学杂志],165:796-804[1986]；和Wang等人,Gene[基因]69:39-47[1988])。
在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞是在以下基因中的至少一个中包括突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。在一些实施例中，突变是在degU基因中，并且在一些实施例中，突变为degU(Hy)32(参见例如，Msadek等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志]172:824-834[1990]；以及Olmos等人,Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]253:562-567[1997])。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主在scoC4(参见例如，Caldwell等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志]183:7329-7340[2001])；spoIIE(参见例如，Arigoni等人,Mol.Microbiol.[分子微生物学]31:1407-1415[1999])；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如，Perego等人,Mol.Microbiol.[分子微生物学]5:173-185[1991])中包含突变或缺失。实际上，预期引起与oppA基因中的突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本发明的经改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独发生，而在其他的实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可以用于生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经改变的芽孢杆菌属宿主细胞菌株是已经包含上述基因中的一个或多个的突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的一个或多个突变和/或缺失的芽孢杆菌属物种宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他的实施例中，芽孢杆菌属物种宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他的实施例中，芽孢杆菌属物种宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，US 2005/0202535)。
使用本领域已知的任何合适的方法用本文描述的一种或多种核酸转化宿主细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如DNA)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞并且将此类质粒DNA构建体或载体转化到这样的细胞中的方法是熟知的。在一些实施例中，质粒随后从大肠杆菌细胞中分离并且转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，没有必要使用介入微生物例如大肠杆菌，并且在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌属宿主中。
本领域技术人员非常了解将本文描述的一种或多种核酸序列引入芽孢杆菌属细胞的合适方法(参见例如，Ferrari等人,“Genetics[遗传学]”,在Hardwood等人[编辑],Bacillus[芽孢杆菌属],Plenum Publishing Corp.(普莱南出版公司)[1989],第57-72页；Saunders等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志],157:718-726[1984]；Hoch等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志],93:1925-1937[1967]；Mann等人,Current Microbiol.[现代微生物学],13:131-135[1986]；Holubova,Folia Microbiol.[福里亚微生物学],30:97[1985]；Chang等人,Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学],168:11-115[1979]；Vorobjeva等人,FEMSMicrobiol.Lett.[FEMS微生物学快报],7:261-263[1980]；Smith等人,Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物学],51:634[1986]；Fisher等人,Arch.Microbiol.[微生物学档案],139:213-217[1981]；以及McDonald,J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志],130:203[1984])。实际上，包括原生质体转化和转染、转导和原生质体融合在内的此类转化方法是熟知的并且适用于本文。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括例如质粒标记拯救转化等方法，其涉及通过携带部分同源的驻留质粒的感受态细胞摄取供体质粒(参见，Contente等人,Plasmid[质粒]2:555-571[1979]；Haima等人,Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学],223:185-191[1990]；Weinrauch等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志],154:1077-1087[1983]；以及Weinrauch等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志],169:1205-1211[1987])。在该方法中，输入性供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留的“辅助”质粒的同源区重组。
除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含本文描述的一种或多种核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理DNA构建体或载体)。将本文描述的一种或多种DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的将核酸序列(例如DNA序列)引入宿主细胞而不插入宿主基因组中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的实施例中，DNA构建体或载体与质粒一起共转化而不插入质粒。在另外的实施例中，通过本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌属菌株中缺失选择性标记(参见Stahl等人,J.Bacteriol.[细菌学杂志]158:411-418[1984]；以及Palmeros等人,Gene[基因]247:255-264[2000])。
在一些实施例中，将本文描述的转化细胞在常规营养培养基中培养。合适的具体培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且详细描述于科学文献中。在一些实施例中，本发明提供包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或本文描述的一种或多种核酸的培养物(例如细胞培养物)。
在一些实施例中，将用本文描述的一种或多种多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体表达的条件下在合适的营养培养基中培养，其后从该培养物中回收所得的变体。在一些实施例中，通过常规程序从培养基中回收由细胞生产的变体，该常规程序包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、借助于盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分、层析法纯化(例如离子交换、凝胶过滤、亲和等)。
在一些实施例中，由重组宿主细胞生产的丝氨酸蛋白酶多肽被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可以用于促进蛋白质的纯化。包含编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸序列的载体或DNA构建体可以进一步包含编码促进丝氨酸蛋白酶多肽纯化的纯化促进结构域的核酸序列(参见例如，Kroll等人,DNA Cell Biol.[DNA细胞生物学]12:441-53[1993])。此类纯化促进结构域包括但不限于例如金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath,Protein Expr.Purif.[蛋白质表达与纯化]3:263-281[1992])，允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域，以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统中利用的结构域。还发现在纯化结构域和异源蛋白之间包含可切割的接头序列例如因子XA或肠激酶(例如，可获自加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen)的序列)可用于促进纯化。
用于检测和测量酶(例如本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)的酶活性的测定法是熟知的。用于检测和测量蛋白酶(例如本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)的活性的多种测定法也是本领域普通技术人员已知的。特别地，测定法可用于测量基于酪蛋白或血红蛋白的酸可溶性肽的释放的蛋白酶活性，其作为280nm下的吸光度测量或使用Folin方法进行比色测定法。其他示例性测定法涉及显色底物的溶解(参见例如，Ward,“Proteinases[蛋白酶]”,在：Fogarty(编辑),Microbial Enzymes and Biotechnology[微生物酶与生物技术],Applied Science[应用科学出版社],伦敦,[1983],第251页-第317页)。其他示例性测定法包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定法(suc-AAPF-pNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定法(TNBS测定法)。本领域技术人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，Wells等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]11:7911-7925[1983]；Christianson等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]223:119-129[1994]；以及Hsia等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]242:221-227[1999])。
可以使用多种方法来确定宿主细胞中成熟蛋白酶(例如，本文描述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体)的生产水平。此类方法包括但不限于例如利用对蛋白酶特异的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。这些和其他测定法是本领域熟知的(参见例如，Maddox等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]158:1211[1983])。
一些其他的实施例提供了用于制备或生产本文描述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体的方法。成熟的丝氨酸蛋白酶多肽不包括信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞(例如像芽孢杆菌属物种细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞))中制备或生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。一些实施例提供了生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，所述方法包括在有助于生产所述变体的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，所述重组表达载体包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸。一些此类方法进一步包括从培养物中回收所述变体。
一些实施例提供了生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，所述方法包括：(a)将包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸的重组表达载体引入细胞群体(例如细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞)中；以及(b)在有助于生产由所述表达载体编码的变体的条件下在培养基中培养细胞。一些此类方法进一步包括：(c)从细胞或培养基中分离变体。
除非另外指出，本文提供的所有组分或组合物水平参考所述组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购的来源中的杂质，例如残余溶剂或副产物。酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另有指示，所有百分比和比率均按重量计算。除非另有指示，所有百分比和比率均基于总组合物计算。本发明的组合物包括清洁组合物，例如洗涤剂组合物。在示例的洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表达酶水平并且除非另外指定，按总组合物的重量计表达洗涤剂成分。
虽然对于本发明的目的不是必需的，但是下文所示的辅助剂的非限制性列表适合用于即时清洁组合物。在一些实施例中，掺入这些辅助剂例如以便辅助或增强清洁性能(用于处理待清洁的基材)，或者以便改变清洁组合物的美观性(例如用香料、色素、染料等的情况)。一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种辅助材料和一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在任何特定组合物中重新使用的辅助材料的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将使用组合物的清洁操作的性质。
合适的辅助材料包括但不限于漂白催化剂、另外的酶、酶稳定剂(包括，例如酶稳定系统)、螯合剂、光亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、色素、填料盐、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、和pH控制剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、附加的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢来源、预成型过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增白剂、泡沫抑制剂、染料、香料、结构弹性剂、织物柔顺剂、载体、助水溶物、加工助剂和/或颜料。其他辅助材料和使用水平的合适实例发现于USPN 5,576,282；6,306,812；6,326,348；6,610,642；6,605,458；5,705,464；5,710,115；5,698,504；5,695,679；5,686,014；和5,646,101中。在一种或多种辅助材料与本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体不相容的实施例中，可以使用将一种或多种辅助材料和一种或多种变体保持分离(即彼此不接触)的合适方法，直到两种组分的组合合适为止。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片、包封、片剂、物理分离等)。上述辅助材料可以构成本文描述的清洁组合物的余量。
本文描述的一种或多种清洁组合物有利地用于例如洗衣应用、硬表面清洁应用、餐具洗涤应用(包括自动餐具洗涤和手洗餐具洗涤)、以及装饰品应用(例如假牙、牙齿、头发和皮肤清洁)和消毒应用(例如但不限于消毒自动餐具洗涤机或洗衣机)。本发明的酶还适合用于贴眼透镜清洁和伤口清创应用。另外，由于在较低温度溶液中增加有效性的独特优点，本发明的酶理想地适合于洗衣应用。此外，本发明的酶可用于颗粒和液体组合物。
另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，所述组合物是清洁组合物。在其他的实施例中，所述组合物是洗涤剂组合物。在又其他的实施例中，所述组合物选自衣物洗涤剂组合物、自动餐具洗涤(ADW)组合物、手洗(手动)餐具洗涤剂组合物、硬表面清洁组合物、眼镜清洁组合物、医疗器械清洁组合物、消毒剂(例如，恶臭或微生物)组合物、和个人护理清洁组合物。在仍其他的实施例中，所述组合物是衣物洗涤剂组合物、ADW组合物、或手洗(手动)餐具洗涤剂组合物。甚至仍另外的实施例涉及织物清洁组合物，而其他的实施例涉及非织物清洁组合物。在一些实施例中，所述清洁组合物不含硼。在其他的实施例中，所述清洁组合物不含磷酸盐。在仍其他的实施例中，所述组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种赋形剂、辅助材料、和/或另外的酶。
在又仍另外的实施例中，本文描述的组合物含有磷酸盐、不含磷酸盐、含有硼、不含硼、或是其组合。在其他的实施例中，所述组合物是无硼组合物。在一些实施例中，无硼组合物是未添加硼酸盐稳定剂的组合物。在另一个实施例中，无硼组合物是含有小于5.5％硼的组合物。在仍另外的实施例中，无硼组合物是含有小于4.5％硼的组合物。在又仍另一个实施例中，无硼组合物是含有小于3.5％硼的组合物。在又仍另外的实施例中，无硼组合物是含有小于2.5％硼的组合物。在甚至另外的实施例中，无硼组合物是含有小于1.5％硼的组合物。在另一个实施例中，无硼组合物是含有小于1.0％硼的组合物。在仍另外的实施例中，无硼组合物是含有小于0.5％硼的组合物。在仍另外的实施例中，无硼组合物是基本上不含硼的组合物。在其他的实施例中，所述组合物是不含或基本上不含酶稳定剂或肽抑制剂的组合物。
本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体也可用于清洁添加剂产品。在一些实施例中，可使用低温溶液清洁应用。一些实施例提供了包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的清洁添加剂产品，当希望得到另外的漂白效果时，所述添加剂理想地适合于包含在洗涤过程中。此类情况包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品处于其最简单的形式，即本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，所述添加剂被包封于剂型中用于添加至清洁过程中。在一些实施例中，所述添加剂被包封于剂型中用于添加至使用过氧化物来源并且希望得到增加的漂白效果的清洁过程中。
用于颗粒组合物的示例性填料或载体包括但不限于例如硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的多种盐；滑石；和黏土。用于液体组合物的示例性填料或载体包括但不限于例如水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇)。在一些实施例中，所述组合物含有约5％至约90％的此类填料或载体。在此类组合物中可包括酸性填料以降低清洁方法或应用中所得溶液的pH。
在另一个实施例中，本文描述的一种或多种组合物是呈选自凝胶、片剂、粉末、颗粒、固体、液体、单位剂量及其组合的形式。在又另一个实施例中，本文描述的一种或多种组合物是呈选自低水紧密配方、低水HDL或UD、或高水配方或HDL的形式。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物是呈单位剂型。在其他的实施例中，所述单位剂型选自丸剂、片剂、胶囊、囊形片、小药囊、小袋、多隔室小袋和预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，单位剂型被设计成在多隔室小袋(或其他单位剂型)内提供对成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式描述于例如EP 2100949；WO 02/102955；US 4,765,916；US 4,972,017；和WO04/111178中。在一些实施例中，所述单位剂型是包含在水溶性膜或小袋中的片剂或粉末。
本发明的清洁组合物或清洁添加剂包含有效量的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体是单独的或与一种或多种另外的酶组合的。典型地本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量百分比、从约0.0001至约10重量百分比、从约0.001至约1重量百分比、或从约0.01至约0.1重量百分比的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在另一个实施例中，本文描述的一种或多种清洁组合物包含从约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约2mg、约0.01至约1mg、约0.05至约1mg、约0.5至约10mg、约0.5至约5mg、约0.5至约4mg、约0.5至约4mg、约0.5至约3mg、约0.5至约2mg、约0.5至约1mg、约0.1至约10mg、约0.1至约5mg、约0.1至约4mg、约0.1至约3mg、约0.1至约2mg、约0.1至约2mg、约0.1至约1mg、或约0.1至约0.5mg的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体/克组合物。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在低温下清洁。在其他的实施例中，本文描述的一种或多种组合物在低温下清洁。在其他的实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含有效量的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体对于清洁需要去除蛋白质污渍的表面有用或有效。
典型地配制本文的清洁组合物使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有从约4.0至约11.5、或甚至从约5.0至约11.5、或甚至从约5.0至约8.0、或甚至从约7.5至约10.5的pH。液体产品制剂典型地被配制成具有从约3.0至约9.0或甚至从约3至约5的pH。颗粒洗衣产品典型地被配制成具有从约8至约11的pH。一些实施例提供了一种或多种清洁组合物，所述清洁组合物被配制成在洗涤条件下具有碱性pH，例如从约8.0至约12.0、或从约8.5至约11.0、或从约9.0至约11.0的pH。在一些实施例中，本文描述的一种或多种清洁组合物被配制成在洗涤条件下具有中性pH，例如从约5.0至约8.0、或从约5.5至约8.0、或从约6.0至约8.0、或从约6.0至约7.5的pH。在一些实施例中，当清洁组合物在20℃以1:100(wt:wt)溶解于去离子水中时，可以测量中性pH条件，使用常规pH计进行测量。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。
在一些实施例中，当本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体应用于颗粒组合物或液体中时，令人希望的是所述变体将处于包封的颗粒的形式以便在储存期间保护该变体免受颗粒组合物的其他组分的影响。另外，包封还是在清洁过程中控制所述变体的可用性的手段。在一些实施例中，包封增强了变体和/或另外的酶的性能。就这一点而言，将本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体用本领域已知的任何合适的包封材料进行包封。在一些实施例中，所述包封材料典型地包封所述变体的至少一部分。典型地，所述包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些实施例中，所述包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。Tg在WO 97/11151中有更详细的描述。所述包封材料典型地选自：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。当所述包封材料是碳水化合物时，其典型地选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些典型的实施例中，所述包封材料是淀粉(参见例如EP 0922499；US 4,977,252；US 5,354,559；和US 5,935,826)。在一些实施例中，所述包封材料是由塑料(例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球；可使用的可商购的微球包括但不限于由(Stockviksverken，瑞典)、以及PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和(PQ公司，宾夕法尼亚州福吉谷市(Valley Forge,PA))供应的那些。
存在多种洗涤条件，包括洗涤中涉及的蛋白酶所暴露的不同的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间的长短。低洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中洗涤水中存在小于约800ppm的洗涤剂组分。中洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm和约2000ppm之间的洗涤剂组分。高洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”使用适合于在从约10℃至约50℃、或从约20℃至约40℃、或从约15℃至约25℃、以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合、和在10℃至50℃之间所有范围的温度下洗涤的“冷水洗涤剂”。
典型地，不同的地理位置具有不同的水硬度。通常按照每加仑混合Ca2+/Mg2+的颗粒数来描述水硬度。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。在美国，大部分水都是硬水，但是硬度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181百万分率。
水 颗粒/加仑 百万分率
软 小于1.0 小于17
略硬 1.0至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
非常硬 大于10.5 大于180
典型地，欧洲水硬度大于约10.5(例如约10.5至约20.0)颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2 +(例如约15颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2+)。典型地，北美水硬度大于日本水硬度、但低于欧洲水硬度。例如，北美水硬度可以在约3至约10颗粒之间、约3至约8颗粒或约6颗粒。典型地，日本水硬度低于北美水硬度，通常小于约4，例如约3颗粒/加仑混合的Ca2+/Mg2+。
其他的实施例涉及一种或多种清洁组合物，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.999％至约90.0％的一种或多种辅助材料。在另一个实施例中，所述清洁组合物包含按组合物重量计从约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.9999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％的一种或多种辅助材料。
在其他的实施例中，本文描述的组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的酶。所述一种或多种另外的酶选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。一些实施例涉及包含常规酶(像淀粉酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶)的酶的组合(即“混合物”)，所述酶的组合与本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和/或一种或多种另外的蛋白酶结合。
在另一个实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的蛋白酶。在一个实施例中，另外的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。合适的另外的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。在一些实施例中，另外的蛋白酶是微生物蛋白酶。在其他的实施例中，另外的蛋白酶是化学或遗传修饰的突变体。在另一个实施例中，另外的蛋白酶是金属蛋白酶、真菌枯草杆菌蛋白酶、碱性微生物蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。示例性碱性蛋白酶包括衍生自例如芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。示例性另外的蛋白酶包括但不限于描述于WO 92/21760、WO 95/23221、WO 2008010925、WO 09/149200、WO 09/149144、WO 09/149145、WO 10/056640、WO 10/056653、WO 2010 0566356、WO11/072099、WO 2011013022、WO 11/140364、WO 12/151534、WO 2015038792、WO2015089447、WO 2015089441、WO 2015143360、WO 2016061438、WO 2016069548、WO2016069544、WO 2016069557、WO 2016069563、WO 2016069569、WO 2016069552、WO 2016145428、WO 2016183509、美国公开号2008/0090747、US5801039、US5340735、US5500364、US5855625、RE34606、US5955340、US5700676、US6312936、US6482628、US8530219、美国临时申请号62/331282、62/332417、62/343618、和62/351649，以及国际申请号PCT/US2016/038245中的那些，以及描述于WO 1999014341、WO 1999033960、WO 1999014342、WO1999034003、WO 2007044993、WO 2009058303、WO 2009 058661、WO 2014071410、WO2014194032、WO 2014194034、WO 2014194054、和WO 2014194117中的金属蛋白酶。示例性另外的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和描述于WO 89/06270中的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。
示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXACALTM、MAXAPEMTM、 OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM、PREFERENZTM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZTM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZTM蛋白酶(例如P1000)、和PURAFASTTM(杜邦公司(DuPont))； ULTRA、 variants、 16L、 ULTRA、 DURAZYMTM、 LIQUANASE PROGRESS 和(诺维信公司(Novozymes))；BLAPTM和BLAPTM变体(汉高公司(Henkel))；LAVERGYTM PRO 104L(BASF)、KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(花王公司))和(AB酶制剂公司(ABEnzymes))。
另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种脂肪酶的组合物。在一些实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的脂肪酶。示例性脂肪酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性脂肪酶包括但不限于例如细菌或真菌来源的那些，例如像绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP258068和EP 305216)、疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶(参见例如WO 2014/059360和WO 2015/010009)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP238023)、假丝酵母属(Candida)脂肪酶例如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B)(参见例如EP 214761)、假单胞菌属脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如，GB 1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等人,Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1131:253-260(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如，JP 64/744992)、和短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如，WO 91/16422))。示例性经克隆的脂肪酶包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人,Gene[基因]103:61-67(1991))；白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人,J.Biochem.[生物化学杂志],106:383-388(1989))；以及多种根霉属(Rhizopus)脂肪酶，例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等人,Gene[基因]109:117-113(1991))，雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人,Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]56:716-719(1992))和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。其他脂肪分解酶(例如角质酶)也可用于本文描述的一种或多种组合物中，包括但不限于例如衍生自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(参见WO 88/09367)和/或豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solanipisi)(参见WO 90/09446)的角质酶。示例性商业脂肪酶包括但不限于M1LIPASETM、LUMAFASTTM、和LIPOMAXTM(杜邦公司)； 和ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE PTM(天野药业有限公司(AmanoPharmaceutical Co.Ltd))。
仍另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种淀粉酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的淀粉酶。适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)可以用于包括在此类组合物中。示例性淀粉酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些，例如像描述于GB 1,296,839、WO 9100353、WO9402597、WO 94183314、WO 9510603、WO 9526397、WO 9535382、WO 9605295、WO 9623873、WO9623874、WO 9630481、WO 9710342、WO 9741213、WO 9743424、WO 9813481、WO 9826078、WO9902702、WO 9909183、WO 9919467、WO 9923211、WO 9929876、WO 9942567、WO 9943793、WO9943794、WO 9946399、WO 0029560、WO 0060058、WO 0060059、WO 0060060、WO 0114532、WO0134784、WO 0164852、WO 0166712、WO 0188107、WO 0196537、WO 02092797、WO 0210355、WO0231124、WO 2004055178、WO 2004113551、WO 2005001064、WO 2005003311、WO2005018336、WO 2005019443、WO 2005066338、WO 2006002643、WO 2006012899、WO2006012902、WO 2006031554、WO 2006063594、WO 2006066594、WO 2006066596、WO2006136161、WO 2008000825、WO 2008088493、WO 2008092919、WO 2008101894、WO2008/112459、WO 2009061380、WO 2009061381、WO 2009100102、WO 2009140504、WO 2009149419、WO 2010/059413、WO 2010088447、WO 2010091221、WO 2010104675、WO 2010115021、WO10115028、WO 2010117511、WO 2011076123、WO 2011076897、WO 2011080352、WO2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO 2011082429、WO 2011087836、WO2011098531、WO 2013063460、WO 2013184577、WO 2014099523、WO 2014164777、和WO2015077126中的淀粉酶。示例性商业淀粉酶包括但不限于AMPLIFYBANTM、 ULTRA、STAINZYME STAINZYME和STAINZYME(诺维信公司)；EFFECTENZTM S 1000、POWERASETM、PREFERENZTM S 100、PREFERENZTM S 110、EXCELLENZTM S 2000、和P(杜邦公司)。
又仍另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种纤维素酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的纤维素酶。任何合适的纤维素酶可以用于本文描述的组合物中。示例性纤维素酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性纤维素酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些，例如像描述于WO 2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307、EP 0495257和美国临时申请号62/296,678中的那些。示例性商业纤维素酶包括但不限于 和PREMIUM(诺维信公司)；REVITALENZTM 100、REVITALENZTM 200/220、和2000(杜邦公司)；和KAC-500(B)TM(花王公司(Kao Corporation))。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶(其中N-末端的一部分缺失)的部分或片段掺入(参见例如，US 5,874,276)。
甚至仍另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种甘露聚糖酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。示例性甘露聚糖酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性甘露聚糖酶包括但不限于：细菌或真菌来源的那些，例如像WO 2016007929；USPN6566114、6602842、和6440991，以及国际申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所述的。示例性商业甘露聚糖酶包括但不限于(诺维信公司)和EFFECTENZTM M 1000、M 100、和PURABRITETM(杜邦公司)。
又甚至仍另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种过氧化物酶和/或氧化酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的过氧化物酶或氧化酶。过氧化物酶可以与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合使用，并且氧化酶可以与氧气组合使用。将单独的或与增效剂组合的过氧化物酶和氧化酶用于“溶液漂白”(即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)(参见例如WO 94/12621和WO95/01426)。示例性过氧化物酶和/或氧化酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些。
另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种过水解酶的组合物，例如像描述于WO 2005/056782、WO 2007/106293、WO 2008/063400、WO 2008/106214、和WO 2008/106215中的过水解酶。
在又另一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及在本文描述的一种或多种组合物中含有的一种或多种另外的酶可以各自独立地变动至约10％，其中所述清洁组合物的余量为一种或多种辅助材料。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物可发现用作洗涤剂添加剂，其中所述添加剂为固体或液体形式。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施例中，衣物洗涤剂组合物的密度范围为从约400至约1200g/升，而在其他实施例中，其范围为在20℃测量的约500至约950g/升的组合物。
一些实施例涉及衣物洗涤剂组合物，其包含一种或多种本文描述的枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种选自以下的辅助材料：表面活性剂、酶稳定剂、助洗剂化合物、聚合化合物、漂白剂、另外的酶、泡沫抑制剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮剂、抗再沉积剂、腐蚀抑制剂及其组合。在一些实施例中，所述洗衣组合物还含有柔顺剂。
另外的实施例涉及手动餐具洗涤组合物，所述组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种选自以下的辅助材料：表面活性剂、有机聚合化合物、增泡剂、II族金属离子、溶剂、助水溶物和另外的酶。
其他的实施例涉及本文描述的一种或多种组合物，其中所述组合物是用于有色织物洗涤或通过洗涤容量提供柔顺的紧密颗粒状织物清洁组合物，或者是重垢液体(HDL)织物清洁组合物。示例性织物清洁组合物和/或制备方法描述于USPN 6,610,642和6,376,450中。其他示例性清洁组合物描述于例如USPN 6,605,458；6,294,514；5,929,022；5,879,584；5,691,297；5,565,145；5,574,005；5,569,645；5,565,422；5,516,448；5,489,392；和5,486,303；4,968,451；4,597,898；4,561,998；4,550,862；4,537,706；4,515,707；和4,515,705中。
在一些实施例中，所述清洁组合物包含酸化颗粒或氨基羧酸助洗剂。氨基羧酸助洗剂的实例包括氨基羧酸、其盐和衍生物。在一些实施例中，所述氨基羧酸助洗剂是氨基多羧酸助洗剂，例如甘氨酸-N,N-二乙酸或具有通式MOOC-CHR-N(CH2COOM)2(其中R是C1-12烷基并且M是碱金属)的衍生物。在一些实施例中，所述氨基羧酸助洗剂可以是甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺基甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺基乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺基甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺基乙基)谷氨酸(SEGL)、IDS(亚氨基二乙酸)及其盐和衍生物例如N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺基甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、以及其碱金属盐和衍生物。在一些实施例中，酸化颗粒的重量几何平均粒度为从约400μ至约1200μ，并且体积密度为至少550g/L。在一些实施例中，酸化颗粒包含至少约5％的助洗剂。
在一些实施例中，酸化颗粒可以包含任何酸，包括有机酸和无机酸。有机酸可以具有一个或两个羧基，并且在一些情况下可以具有多达15个碳，尤其是多达10个碳，例如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、琥珀酸、己二酸、马来酸、富马酸、癸二酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和水合乙醛酸。在一些实施例中，所述酸是柠檬酸。无机酸包括盐酸和硫酸。在一些情况下，酸化颗粒是包含高水平氨基羧酸助洗剂的高活性颗粒。也已经发现硫酸进一步有助于最终颗粒的稳定性。
另外的实施例涉及清洁组合物，其包含一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一些实施例中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以从约0.1％至约60％的水平存在，而在替代性实施例中，该水平为从约1％至约50％，而在又另外的实施例中，该水平为从约5％至约40％。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计约1％、从约0.1％至约80％、从约3％至约60％、从约5％至约40％、或从约10％至约50％的助洗剂。示例性助洗剂包括但不限于聚磷酸盐的碱金属、铵和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸化合物；醚羟基聚羧酸酯；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的铵和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；聚羧酸酯，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸；及其可溶性盐。在一些此类组合物中，所述助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐，例如三聚磷酸钠、三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾。示例性助洗剂描述于例如EP 2100949。在一些实施例中，所述助洗剂包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，所述助洗剂是磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，所述助洗剂是非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，所述助洗剂包含磷酸盐和非磷酸盐助洗剂的混合物。示例性磷酸盐助洗剂包括但不限于单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚多磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施例中，助洗剂可以是三聚磷酸钠(STPP)。另外，所述组合物可以包含碳酸盐和/或柠檬酸盐。其他合适的非磷酸盐助洗剂包括多元羧酸及其部分或完全中和盐、单体型多羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物。在一些实施例中，上述化合物的盐包括铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。合适的多元羧酸包括无环的、脂环族的、杂环的和芳香族的羧酸，其中在一些实施例中，它们可以包含至少两个羧基基团，这些羧基基团在每种情况下彼此分离，在某些情况下被不超过两个碳原子分离。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种螯合剂。在一个实施例中，所述组合物包含以组合物重量计从约0.1％至约15％或约3％至约10％的螯合剂。示例性螯合剂包括但不限于例如铜、铁、锰及其混合物。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种沉积助剂。示例性沉积助剂包括但不限于例如聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；污垢释放聚合物，例如像聚对苯二甲酸；黏土，例如像高岭石、蒙脱石、硅镁土、伊利石、膨润土和多水高岭土；及其混合物。
在其他的实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种抗再沉积剂或非离子表面活性剂(其可以防止污垢的再沉积)(参见，例如，EP 2100949)。例如，在ADW组合物中，非离子表面活性剂可用于表面改性目的(特别是对于薄片)以避免成膜和沾上污渍并且改善光泽。这些非离子表面活性剂还可用于防止污垢的再沉积。在一些实施例中，非离子表面活性剂可以是乙氧基化非离子表面活性剂、环氧树脂封端的聚(烷氧基化)醇和氧化胺表面活性剂。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。示例性聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯咪唑及其混合物。在一个实施例中，所述组合物包含以组合物重量计从约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％、或约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种硅酸盐。示例性硅酸盐包括但不限于硅酸钠，例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐。在一些实施例中，硅酸盐以按所述组合物的重量计从约1％至约20％或约5％至约15％的水平存在。
在一些仍另外的实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种分散剂。示例性水溶性有机材料包括但不限于例如均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。
在一些另外的实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种非肽酶稳定剂。在一些实施例中，所述酶稳定剂是钙和/或镁离子的水溶性来源。在一些实施例中，所述酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐(包括碱土金属盐，例如钙盐)。在一些实施例中，本文使用的酶通过存在于为这些酶提供以下此类离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于一些实施例中。示例性寡糖和多糖(例如，糊精)描述于例如WO 07/145964中。在一些实施例中，可逆蛋白酶抑制剂也可用于例如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、和苯基硼酸衍生物(例如在WO 96/41859中描述的那些))和/或肽醛(例如像在WO 2009/118375和WO 2013004636中进一步描述的)中。
如前所述(WO 199813458、WO 2011036153、US 20140228274)，肽醛可用作洗涤剂制剂中的蛋白酶稳定剂。肽醛稳定剂的实例是肽醛、酮或卤代甲基酮，并且可以是“N-封端的”，例如具有脲基(EP 2358857B1)、氨基甲酸酯或脲部分，或“双N-封端的”，例如具有羰基、脲基、草酰胺、硫脲基、二硫代草酰胺或硫代草酰胺部分。这些抑制剂与蛋白酶的摩尔比可以是0.1:1至100:1，例如0.5:1-50:1、1:1-25:1或2:1-10:1。蛋白酶稳定剂的其他实例是二苯甲酮或苯甲酸苯胺衍生物，其可含有羧基基团(US 7,968,508B2)。这些稳定剂与蛋白酶的摩尔比优选地是在1:1至1000:1的范围内，特别是1:1至500:1，尤其优选地从1:1至100:1，最尤其优选地从1:1至20:1。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种漂白剂、漂白活化剂、和/或漂白催化剂。在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。示例性无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐，例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括为结晶固体但没有额外保护的无机过氧化氢合物盐，但是在一些其他的实施例中，所述盐被包衣。漂白活化剂典型地为有机过酸前体，其在60℃及以下的温度下在清洁过程中增强漂白作用。示例性漂白活化剂包括如下化合物，所述化合物在过水解条件下给出具有从约1至约10个碳原子或从约2至约4个碳原子的脂肪族过氧羧酸、和/或任选地取代的过氧苯甲酸。示例性漂白活化剂描述于例如EP 2100949中。示例性漂白催化剂包括但不限于锰三氮杂环壬烷和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的示例性漂白催化剂描述于例如US 4,246,612；US 5,227,084；US 4,810,410；WO 99/06521；和EP 2100949中。
在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些实施例中，所述金属漂白催化剂包含一种催化体系，所述催化体系包括：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如，锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见例如，US 4,430,243)。在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物借助于锰化合物来催化。此类化合物和使用水平描述于例如US 5,576,282中。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于并包括于本文描述的一种或多种组合物中。多种钴漂白催化剂描述于例如USPN 5,597,936和5,595,967中。
在一些另外的实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为实际问题而并非进行限制，在一些实施例中，对本文描述的组合物和清洁方法进行调节以提供至少一亿分之一数量级的，在洗涤液中约0.005ppm至约25ppm、约0.05ppm至约10ppm、或约0.1ppm至约5ppm的活性MRL。示例性MRL包括但不限于交联桥接的特殊超刚性配体，例如像5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环(6.6.2)十六烷。示例性金属MRL描述于例如WO 2000/32601和US 6,225,464中。
在另一个实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种金属护理剂。在一些实施例中，所述组合物包含按组合物的重量计从约0.1％至约5％的金属护理剂。示例性金属护理剂包括例如铝、不锈钢和非铁金属(例如，银和铜)。其他示例性金属护理剂描述于例如EP 2100949、WO 94/26860和WO 94/26859中。在一些组合物中，所述金属护理剂是锌盐。
在一些实施例中，所述清洁组合物是包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的重垢液体(HDL)组合物。所述HDL液体衣物洗涤剂可以包含清洁型表面活性剂(10％-40％)，所述清洁型表面活性剂包含选自下组的阴离子清洁型表面活性剂：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或其混合物；以及任选地选自下组的非离子表面活性剂：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物，任选地其中阴离子清洁型表面活性剂(亲水指数(HIc)为从6.0至9)与非离子清洁型表面活性剂的重量比大于1:1。合适的去污表面活性剂还包括阳离子去污表面活性剂(选自烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物、和/或其混合物)；兼性离子和/或两性清洁型表面活性剂(选自链烷醇胺磺基-甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂；及其混合物。
在另一个实施例中，所述清洁组合物是液体或凝胶洗涤剂(其不是单位剂量的)，所述液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，通常含有按重量计至少20％和高至95％的水，例如按重量计高至约70％的水，按重量计高至约65％的水，按重量计高至约55％的水，按重量计高至约45％的水，或按重量计高至约35％的水。在水性液体或凝胶中可包括其他类型的液体(包括但不限于烷醇、胺、二醇、醚和多元醇)。水性液体或凝胶洗涤剂可包含从0至30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
所述组合物可以任选地包含由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物，所述两亲烷氧基化油脂清洁聚合物选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物(例如在0.05wt％-10wt％范围内的烷氧基化聚亚烷基亚胺)和/或无规接枝聚合物(典型地包含亲水主链和一个或多个疏水侧链，所述亲水主链包含选自下组的单体，该组由以下组成：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物；所述一个或多个疏水侧链选自下组，该组由以下组成：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C2-C6单羧酸的乙烯酯，丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯及其混合物)。
所述组合物可以包含另外的聚合物，例如去污聚合物，所述去污聚合物包含例如阴离子封端的聚酯，例如SRP1；处于无规或嵌段构型的、含有至少一种单体单元的聚合物，该单体单元选自糖类、二羧酸、多元醇及其组合；处于无规或嵌段构型的、基于对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物及其共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6；Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325；Marloquest SL；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括例如羧酸盐聚合物，例如包含至少一种选自以下的单体的聚合物：丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或具有在500至100,000Da范围的分子量的聚乙二醇)；纤维素聚合物(包括例如烷基纤维素；烷基烷氧基烷基纤维素；羧基烷基纤维素；烷基羧基烷基纤维素；它们的实例包括羧基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧基甲基纤维素及其混合物)；以及聚合羧酸酯(例如像马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。
所述组合物可以进一步包含：饱和或不饱和的脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0-10wt％)；沉积助剂(包括例如，多糖，纤维素聚合物，聚联丙烯二甲基卤化铵(DADMAC)，以及DADMAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物及其混合物的共聚物(呈无规或嵌段构型))；阳离子瓜耳胶；阳离子纤维素，例如阳离子羟乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺；及其混合物。
所述组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)；二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)；羟基乙烷二膦酸(HEDP)；乙二胺N,N’-二琥珀酸(EDDS)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；丙二胺四乙酸(PDT A)；2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)；或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；次氮基三乙酸(NTA)；4,5-二羟基间苯二磺酸；柠檬酸及其任何盐；N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)及其衍生物。
所述组合物可以进一步包含基于硅酮或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；酶稳定剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％-5wt％)，所述结构剂/增稠剂选自下组，该组由以下组成：甘油二酸酯、甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物。
在一些实施例中，所述清洁组合物是包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的重垢粉末(HDD)组合物。所述HDD粉末衣物洗涤剂可以包含清洁型表面活性剂，所述清洁型表面活性剂包括阴离子清洁型表面活性剂(选自直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)；非离子清洁型表面活性剂(选自直链或支链或无规链、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)；阳离子清洁型表面活性剂(选自烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性清洁型表面活性剂(选自链烷醇胺磺基-甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物；助洗剂(无磷酸盐助洗剂，例如沸石助洗剂，其实例包括在0至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)；磷酸盐助洗剂，例如在0至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠；在小于15wt％范围内的柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐；硅酸盐(在0至小于10wt％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(在0至小于10wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂(光漂白剂，例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；疏水或亲水漂白活化剂(例如，十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、和壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐(nitrilequats)、及其混合物)；过氧化氢；过氧化氢源(无机过氧化氢合物盐，例如过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预成型的亲水和/或疏水性过酸(选自过羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚胺酸和盐、过氧单硫酸和盐及其混合物)；和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂，例如亚胺阳离子和聚离子、亚胺兼性离子、改性胺、改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮及其混合物)；含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)和螯合剂(例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、及其水溶性盐))。
所述组合物可以进一步包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、酶稳定剂、调色剂、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔顺剂、增亮剂(例如C.I.荧光增亮剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。
在一些实施例中，所述清洁组合物是包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的ADW洗涤剂组合物。所述ADW洗涤剂组合物可以包含两种或更多种选自以下的非离子表面活性剂：乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇和胺氧化物表面活性剂，它们按重量计以0-10％的量存在；在按重量计5％-60％范围内的助洗剂，所述助洗剂包括：磷酸盐助洗剂(单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚磷酸盐)，三聚磷酸钠-STPP或无磷酸盐助洗剂(基于氨基酸的化合物，例如MGDA(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其盐和衍生物、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)及其盐和衍生物、IDS(亚氨基二琥珀酸)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物及其混合物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、和B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐)，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐(它们按重量计在0.5％-50％的范围内)；磺化/羧化聚合物(为产品提供尺寸稳定性)，其按重量计在约0.1％至约50％的范围内；按重量计在约0.1％至约10％的范围内的干燥助剂(选自聚酯，尤其是任选地与有助于缩聚作用的具有3-6个官能团(具体是酸、醇或酯官能团)的另外的单体一起的阴离子聚酯，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其反应性环状碳酸酯和尿素型的前体化合物)；按重量计在从约1％至约20％的范围内的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如，过氧化氢合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸、和二过氧十六烷二酸)；漂白活化剂-有机过酸前体，其按重量计在从约0.1％至约10％的范围内；漂白催化剂(选自锰三氮杂环壬烷及相关络合物，Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物、以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；按重量计在约0.1％-5％的范围内的金属护理剂(选自苯并三氮唑、金属盐和络合物、和硅酸盐)；在约0.01-5.0mg活性酶/克ADW洗涤剂组合物范围内的酶(酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。
更多实施例涉及使用本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域中熟知的(参见例如，US 6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的本文描述的变体接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。
可以在纺织品的编织期间或之后、在脱浆阶段期间或一个或多个另外的织物加工步骤中应用本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在纺织品的编织期间，线暴露于相当大的机械应变。在机械织机上编织之前，通常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可在编织期间或之后应用本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以除去上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用该变体来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为清洁剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于服装生产而言，织物可被裁剪和缝制成服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整加工通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉水解酶的作用以为织物提供柔软性，并且使棉更易于进行随后的酶促精整加工步骤。本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于下列方法中：精整牛仔衣服(例如“生物磨砂方法”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整方法。
本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于从动物中去除蛋白质(例如羽毛、皮肤、毛发和兽皮)及用于其随后的降解或处置。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛工艺中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的溶液中可以起到保护皮肤免受损伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽毛退化的条件下用本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进行喷雾。在一些实施例中，所述变体可以与氧化剂组合使用。
在一些实施例中，可以通过本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来辅助与未加工的羽毛相关的油或脂肪的去除。在一些实施例中，将本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤维进行消毒和部分脱水。在又其他的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于从羽毛中回收蛋白质。在一些其他的实施例中，在具有或没有约0.5％(v/v)的表面活性剂的情况下，将本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与95％乙醇或其他极性有机溶剂组合应用于洗涤溶液中。在其他的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以单独使用或与合适的羽毛加工和蛋白水解方法(例如在PCT/EP2013/065362、PCT/EP2013/065363和PCT/EP2013/065364中公开的那些)组合使用。在一些实施例中，回收的蛋白质随后可以用于动物或鱼类饲料中。
在仍另一个实施例中，一种或多种动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。其他的实施例涉及制备这样的动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，所述方法包括将本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分进行混合。
术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在特定的实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于：猪(pig和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、小鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
在本发明上下文中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下的食物：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，例如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料(feedstuff)”和“喂养料(fodder)”可互换地使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料原料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)来自谷类的副产品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers Dried Grain Solubles)(DDGS)(特别是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；以及e)矿物质和维生素。
本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于纸浆(例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。一般来说，将纸浆与本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在适合于漂白纸浆的条件下一起孵育。
在一些实施例中，纸浆是不含氯的纸浆，该纸浆经氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸进行漂白。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体用于展示出低木质素含量的纸浆的酶辅助漂白，所述纸浆是通过经改良的制浆方法或连续制浆方法生产的。在一些其他的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体单独地应用或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。
在其他的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于组织的酶辅助清创。这涉及去除死亡或受损的组织，例如从伤口去除以帮助愈合。
在甚至另外的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于组织培养。特别地，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以用于(例如在收获细胞过程中)悬浮或再悬浮附着于细胞培养壁的细胞。在另一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以用于切割培养细胞与培养皿之间的蛋白质结合，从而允许细胞悬浮于溶液中。
在又另一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用作食品添加剂、消化助剂和/或食品加工助剂。
在仍又另一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进一步通过从动物兽皮中除去毛发、浸泡、脱脂或软化(这是涉及皮革制造期间非结构蛋白质降解的过程)来用于皮革加工。
实例
提供以下实例以证明和说明本公开的某些优选实施例和方面，并且不应被解释为限制性的。
实例1
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的表达
使用常规分子生物学技术进行产生吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的DNA操作(参见，例如Sambrook等人,Molecular Cloning[分子克隆]:冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。产生一系列人工DNA序列，所述人工DNA序列编码将多个氨基酸修饰引入野生型吉氏芽孢杆菌进化枝Bgi02446蛋白酶(登录号AGS78407.1)的序列中的成熟吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶序列。如下所述，表达并回收所有枯草杆菌蛋白酶变体。所述吉氏芽孢杆菌进化枝在2016年6月17日提交的国际专利申请号PCT/US2014/070107中更全面地描述。
如下所述，产生编码成熟野生型吉氏芽孢杆菌进化枝Bgi02446蛋白酶(SEQ IDNO:1)的人工DNA序列，并在合适的枯草芽孢杆菌菌株中表达。
为了表达WALBSP-2983枯草杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:8)，DNA片段包含：5’AprE侧翼区，其含有枯草芽孢杆菌P1rrnI启动子序列(SEQ ID NO:2)(所述枯草芽孢杆菌P1rrnI启动子更全面地描述于US-2014-0329309中)；aprE信号肽序列(SEQ ID NO:3)；来自迟缓芽孢杆菌的前导序列(SEQ ID NO:4)；对应于吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体WALBSP-2983的基因的序列(SEQ ID NO:5)；BPN’终止子(SEQ ID NO:6)；来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因表达盒(SEQ ID NO:7)以及3’AprE侧翼序列(SEQ ID NO:9)；按连续的顺序使用标准分子技术组装。由SEQ ID NO:3编码的枯草芽孢杆菌aprE信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。由SEQ ID NO:4编码的前导序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。由WALBSP-2983基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示。该线性WALBSP-2983表达盒用于转化200uL的合适菌株的感受态枯草芽孢杆菌细胞。将已转化的细胞在37℃孵育1小时同时以250rpm振荡。将转化混合物铺板到含有1.6％脱脂奶和5ppm氯霉素(CMP)的LA板上，并在37℃孵育过夜。挑取单菌落并使其在Luria肉汤+5ppm CMP中于37℃生长。将菌株样品在-80℃用20％甘油冷冻储存。通过使用适当的目的基因代替(SEQ ID NO:5)来表达其他吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体。
为了表达某些吉氏芽孢杆菌进化枝变体，对表达WALBSP-2983的枯草芽孢杆菌菌株的基因组DNA进行分离，并将其用作模板以产生WALBSP-2983成熟蛋白酶区域的变体。使用具有合适引物对、DNA模板、和Q5聚合酶的聚合酶链式反应(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs))产生含有特定氨基酸取代的变体文库。将这些组装的片段用于转化感受态枯草芽孢杆菌细胞，并如上所述处理转化体。
在一些情况下，所述吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶是使用如下表达盒在枯草芽孢杆菌中生产的，该表达盒由以下组成：枯草芽孢杆菌aprE启动子(SEQ ID NO:12)、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列(SEQ ID NO:3)、迟缓芽孢杆菌前导序列(SEQ ID NO:4)、每种人工序列的成熟蛋白酶序列和BPN’终止子(SEQ ID NO:6)。将表达盒克隆到复制穿梭载体中并转化到合适的枯草芽孢杆菌菌株中。如WO 2016205755专利申请中描述的，将用多种pHYT质粒转化的枯草芽孢杆菌宿主菌株在基于MOP缓冲液的富集的半定义培养基(以尿素为主要氮源、葡萄糖为主要碳源、并补充有1％大豆胨用于稳健的细胞生长)中培养。孵育后，通过离心和过滤从生长培养基中分离分泌的蛋白酶。如下所述，将澄清的培养物上清液用于测定法和纯化。
通过DNA序列分析确认了每种吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的序列。通过在96孔MTP中的选择性生长培养基中于31℃培养细胞68小时来产生用于以下描述的研究的蛋白酶样品。通过离心和过滤制备培养物上清液。
实例2
测定法
蛋白质测定法
通过UHPLC使用Zorbax 300SB-C3柱以及0.1％三氟乙酸(缓冲液A)和在乙腈中的0.07％三氟乙酸(缓冲液B)的线性梯度，并在220nm处检测，确定吉氏芽孢杆菌进化枝蛋白酶在培养物上清液中的浓度。将培养物上清液稀释于10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％Tween80中以加载到柱上。使用纯化的亲本酶的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
蛋白酶活性
通过测量AAPF-pNA合成肽底物或二甲基酪蛋白(DMC)的水解来测试亲本及其变体的蛋白酶活性。
对于AAPF测定法，使用的试剂溶液是：100mM Tris pH 8.6，10mM CalCl2，0.005％(Tris/Ca缓冲液)和在DMSO中的160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA原液)(西格玛：S-7388)。为了制备工作溶液，将1mL suc-AAPF-pNA原液添加到100mL Tris/Ca缓冲液中并混合。将酶样品添加到含有1mg/mL suc-AAPF-pNA工作溶液的微量滴定板(MTP)中，并且使用SpectraMax板读数器以动力学方式在RT下经3-5min在405nm下测量活性。将蛋白酶活性表达为mOD/min。
用于DMC测定法的试剂溶液是：在100mM碳酸钠缓冲液(pH 9.5)中的2.5％w/v DMC(西格玛C-9801)、在试剂A中的0.075％TNBSA(赛默科技公司(Thermo Scientific))。试剂A：在15mL 4N NaOH中的45.4g Na2B4O7.10H2O，在去离子水中达到1000mL的最终体积。将相同体积的DMS底物和试剂A中的TNBSA在MTP中混合，并在缓慢混合下添加蛋白酶样品。使用SpectraMax板读数器以动力学方式在RT下经3min在405nm下测量活性。
Tris-EDTA中的稳定性测定法
在Tris-EDTA(50mM Tris pH 9；1-5mM EDTA；0.005％Tween)缓冲的条件下测量酶稳定性。残余活性百分比是通过取胁迫活性与非胁迫活性的比率并乘以100来计算的。稳定性PI通过将吉氏芽孢杆菌进化枝变体蛋白酶的残余活性除以亲本蛋白酶Bgi02446的残余活性而获得。
自动餐具洗涤清洁测定法
法式焦糖布丁污渍：如本文所述，通过使用由CFT(在符拉尔丁根(Vlaardingen)，荷兰)制备的DM10三聚氰胺砖测试吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体对法式焦糖布丁污渍的清洁性能。根据在“Recommendations for the Quality Assessment of theCleaning Performance of Dishwasher Detergents(Part B,Update 2015)”[关于洗碗机洗涤剂清洁性能质量评估的建议(B部分，2015年更新)],9.Crème [法式焦糖布丁],IKW,第46页,Sofw Journal[Sofw期刊]-142-06/16(参见，http://www.ikw.org/fileadmin/content/downloads/Haushaltspflege/2016_EQ_Dishwasher_Detergents_Part_B__Update_2015.p df(上次访问时间为2016年12月14日))中所述的IKW方法，使用1.7g或2.5g材料/砖由CFT制备三聚氰胺砖上的法式焦糖布丁。
将三聚氰胺砖用作盖子并紧紧压在微量滴定板(MTP)上。将3g/L的ADW洗涤剂溶液调节至374ppm水硬度，并在将三聚氰胺砖盖附着于MTP之前，将每种酶样品添加到MTP中。MTP的体积容量以及因此添加到其中的溶液体积可以变化，其中应将最小体积的溶液添加到MTP中，所述最小体积的溶液使溶液与污渍表面之间能够发生接触。在该实例中，将300μL体积的含有酶的洗涤剂添加到铝96孔MTP的每个孔中。将MTP在Infors热振荡器中在40℃，除非另外指定，在250rpm下孵育45min。孵育后，将砖从MTP中去除并风干。
在一些情况下，使用扫描仪(MiCrotek Scan Maker 900)进行的红色、绿色和蓝色(RGB)测量来量化污渍去除。使用来自Reindeer Graphics的IPTK 5.0软件将图像导入Photoshop CSII以提取来自污渍区域的RGB值。在其他情况下，通过拍摄这些板并使用定制软件测量来自每个污渍区域的RGB值来量化污渍去除。
通过使用以下公式中的RGB值计算经洗涤的砖的污垢去除百分比(％SRI)值：
％SRI＝(ΔE/ΔE初始)*100
其中ΔE＝SQR((R之后-R之前)2+(G之后-G之前)2+(B之后-B之前)2)
其中ΔE初始＝SQR((R白色-R之前)2+(G白色-G之前)2+(B白色-B之前)2)
通过从每个样品值中减去空白对照(无酶)的值来获得清洁性能(以下为“减去空白的清洁度”)。对于每种条件和吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体，通过将减去空白的清洁度除以相同浓度的亲本蛋白酶的清洁度来计算性能指数(PI)。从亲本蛋白酶的标准曲线确定亲本蛋白酶PI的值，所述亲本蛋白酶包括在该测试中并拟合至朗缪尔(Langmuir)拟合或希尔(Hill)S形拟合。
蛋黄污渍：在预漂洗过或未漂洗过的样本上测量吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体对蛋黄微型样本(PAS-38，测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV)，符拉尔丁根，荷兰)的清洁性能。为了制备漂洗过的PAS38样本，将180μl的10mM CAPS缓冲液(pH 11)添加到含有PAS38微型样本的MTP中。将板密封并在iEMS培养箱中在60℃和1100rpm摇动下孵育30min。此次孵育后，除去缓冲液，并用去离子水漂洗样本以除去任何残余的缓冲液。然后，用于性能测定法之前将板风干。在酶添加之前，在374ppm水硬度下，用3g/l的ADW洗涤剂溶液装填微型样本板，最终酶浓度为0.05与10ppm之间。
将PAS-38样本与洗涤剂和酶在40℃孵育30分钟后，使用SpectraMax板读数器在405nm下读取吸光度。通过从每个样品值中减去空白对照(无酶)的值来获得吸光度结果(以下为“减去空白的吸光度”)。对于每种条件和吉氏芽孢杆菌进化枝蛋白酶，通过将减去空白的吸光度除以相同浓度的Bgi02446亲本蛋白酶的吸光度来计算性能指数(PI)。
液体衣物清洁测定法
针对多种技术污垢：BMI(EMPA-116，棉花上的血液/奶/墨汁)污渍，测试变体相对于亲本的清洁性能。将BMI样本用去离子水预漂洗20分钟并在室温下干燥过夜。通过荷兰符拉尔丁根的测试材料BV中心制备MTP板(Costar 9017或Greiner 655101)中的预先穿孔样本。在酶添加之前，将这些含有微型样本的板用洗涤剂装填。将酶的等分试样添加到含有微型样本的洗涤剂装填的MTP中，达到最终体积为180微升，用于进行最终酶浓度在0.05与10ppm之间的衣物洗涤测定法。衣物清洁测定法在25℃下进行20min。在孵育后，将100-150uL的上清液转移到新鲜的MTP中，并使用SpectraMax板读数器在600nm下读取吸光度。通过从每个样品值中减去空白对照(无酶)的值来获得吸光度结果。通过将给定变体的吸光度值除以相同浓度测试的亲本的吸光度值来获得每种测定法条件下的清洁PI。通过将纯化的亲本样品的标准曲线拟合成朗缪尔拟合来确定亲本PI值。
洗涤剂
使用如下所列的多种洗涤剂配方。使用下列洗涤剂进行自动餐具洗涤(ADW)清洁测定法，最终浓度显示在括号中：GSM-B洗涤剂(3g/L)(GSM-B无磷酸盐ADW洗涤剂(购买时无酶，购自德国布鲁伊根(Brüggen)的WFK Testgewebe GmbH(www.testgewebe.de)，组成示于表1中)、MGDA洗涤剂(3g/L)(组成示于表2中)、ADW模式洗涤剂A(3.34g/L)(组成示于表3中)、ADW模式洗涤剂B(3.18g/L)(组成示于表4中)、以及ADW模式洗涤剂C(3.26g/L)(组成示于表5中)。
使用于2014年购自当地超市的宝莹Small&Mighty非生物液体洗涤剂“宝莹非生物”(PNB，联合利华)进行衣物(HDL)清洁测定法。HDL洗涤剂宝莹非生物(Persil Non-Bio)和CNS被认为是无硼的，因为当测试硼元素含量时，它们含有≤5mg/Kg的硼。HDL测定法在最终洗涤剂浓度为2.7g/L，水硬度为200-500ppm下进行，并使用5mM HEPES缓冲液将pH调节至8.2。
实例3
多种吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的生产率
下表6中列出的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体如实例1中针对WALBSP-2983所示的进行生产。变体的氨基酸取代相对于吉氏芽孢杆菌进化枝Bgi02446野生型(SEQID NO:1)所示。如上文实例2中所述，通过UHPLC确定培养物上清液中每种变体的浓度。基于纯化的亲本酶(Bgi02446野生型)的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。含有N242D突变的每种变体的蛋白质浓度列于表6中，表示为PI值。通过将含有N242D突变的变体的蛋白质浓度除以没有N242D突变的变体的蛋白质浓度来计算PI值。
实例4
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的自动餐具清洁性能和稳定性
使用实例2中描述的洗涤剂和测定法测量吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶变体的ADW清洁性能和稳定性，并报告于表7、8、9、10和11中，其中清洁益处表示为相对于亲本酶Bgi02446野生型的PI值并且稳定性报告为剩余活性百分比或相对于亲本酶Bgi02446野生型的PI值。ND表示结果未确定的情况。表7中报告的性能测试在40℃下进行。
使用预漂洗过或未漂洗过的PAS-38样本在40℃下进行表8中报告的性能测试，并且如实例2所述，在含有1mM EDTA的Tris缓冲液上测量酶稳定性，其中将样品在52℃下孵育5分钟。
使用MGDA和GSM-B洗涤剂，使用如实例2所述的DM10三聚氰胺砖，在40℃下进行表9中报告的性能测试。
在40℃下用GSM-B洗涤剂，并且在50℃下用ADW配方A、B和C，或使用如实例2所述的DM10污渍和GSM-B洗涤剂，使用未漂洗过的PAS-38样本进行表10中报告的性能测试。如实例2所述，在含有5mM EDTA的Tris缓冲液上测量表10中报告的稳定性，其中将样品在56℃下孵育5分钟。
如实例2所述，用GSM-B洗涤剂，使用未漂洗过的PAS-38样本或DM10砖均在40℃下进行表11中报告的性能测试。如实例2所述，在含有1mM EDTA的Tris缓冲液上测量表11中报告的稳定性，其中将样品在54℃下孵育5分钟，并且结果报告为剩余活性百分比。
实例5
吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的衣物清洁性能
如实例2所述，在BMI样本和宝莹非生物(无硼)洗涤剂上测量吉氏芽孢杆菌进化枝变体的液体衣物(HDL)清洁性能。结果报告为与Bgi02446野生型亲本相比的PI(性能指数)，并显示在表12和13中。

Claims (39)

1.一种枯草杆菌蛋白酶变体，其包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：
(i)99、126、127、128、和54；
(ii)99、126、127、和128；
(iii)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T/V、S126A/D/E/F/G/H/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W、和P54E/G/I/L/Q/S/T/V；
(iv)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T/V、S126A/D/E/F/G/H/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W；
(v)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W、和P54T；
(vi)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W；
(vii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W、和P54T；
(viii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、和F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W；
(ix)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W、和P54T；
(x)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、和F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W；
(xi)S99M、S126A/G、D127E、和F128C/D/E/G；
(xii)S126A/G、D127E、和F128E/G；或
(xiii)S99M、S126A、D127E、和F128C/D/E；
条件是所述变体不含有对应于以下的取代：
(a)当所述变体含有对应于SEQ ID NO:1中的S126T或F128A的取代时，SEQ ID NO:1中的S99R，
(b)当所述变体含有对应于SEQ ID NO:1中的S99R或F128A的取代时，SEQ ID NO:1中的S126T，或者
(c)当所述变体含有对应于SEQ ID NO:1中的S99R或S126T的取代时，SEQ ID NO:1中的F128A，并且
其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
2.一种枯草杆菌蛋白酶变体，其包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：
(i)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T/V、S126A/D/E/F/G/H/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W、和P54E/G/I/L/Q/S/T/V；
(ii)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/T/V、S126D/E/F/G/H/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W；
(iii)S99E/H/I/K/M/Q/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W、和P54T；
(iv)S99E/H/I/K/M/Q/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W；
(v)S99E/H/I/K/M/T、S126A/G/M/N/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、F128C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W、和P54T；
(vi)S99E/H/I/K/M/T、S126A/G/M/N/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、和F128C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W；
(vii)S99E/H/I/M/T、S126A/G/M、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、F128C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W、和P54T；
(viii)S99E/H/I/M/T、S126A/G/M、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、和F128C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W；
(ix)S99M、S126A/G、D127E、和F128C/D/E/G；
(x)S126A/G、D127E、和F128E/G；或
(xi)S99M、S126A、D127E、和F128C/D/E；
其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
3.一种枯草杆菌蛋白酶变体，其包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处包含两个、三个或四个或更多个取代的氨基酸序列：
(i)99、126、127、128、和54；
(ii)99、126、127、和128；
(iii)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T/V、S126A/D/E/F/G/H/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W、和P54E/G/I/L/Q/S/T/V；
(iv)S99A/E/H/I/K/M/N/Q/R/T、S126A/D/E/G/I/L/M/N/Q/R/T/V/W/Y、D127A/E/F/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W；
(v)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W、和P54T；
(vi)S99E/H/I/K/M/Q/R/T、S126A/D/E/G/L/M/Q/V/Y、D127A/E/G/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y、和F128A/C/D/E/G/H/I/L/M/N/P/Q/S/T/V/W；
(vii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W、和P54T；
(viii)S99E/H/I/K/M/R/T、S126A/G/M/N/T/V/Y、D127A/E/G/L/N/P/Q/S/T/V/W、和F128A/C/D/E/G/I/L/M/N/Q/S/T/V/W；
(ix)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W、和P54T；
(x)S99E/H/I/M/R/T、S126A/G/M/T、D127A/E/G/L/N/P/S/T/V、和F128A/C/D/E/G/I/N/Q/S/T/W；
(xi)S99M、S126A/G、D127E、和F128C/D/E/G；
(xii)S126A/G、D127E、和F128E/G；或
(xiii)S99M、S126A、D127E、和F128C/D/E；并且
其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
4.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其进一步包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处的一个、两个、三个、四个或更多个取代：
(i)9、21、37、39、42、43、47、56、74、80、85、87、97、101、102、114、116、117、122、126、157、199、200、203、211、242、253、255、和256；
(ii)37、39、47、56、80、85、87、114、和242；
(iii)与对应于选自37、47、56、80、85、87、114、和242的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的39；
(iv)与对应于选自37、39、47、80、85、87、114、和242的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的56；
(v)与对应于选自37、39、47、56、80、85、87、和242的SEQ IDNO:1位置的一个或多个位置相组合的114；
(vi)与对应于选自37、39、47、56、80、85、87、和114的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的242；
(vii)与对应于选自37、47、56、80、85、87、和114的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的39+242；
(viii)与对应于选自37、47、56、80、85、87、114、和242的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的39+99+128；或
(ix)39、242、39+242、37+39+242、37+39+47+56+80+85+87+114+242、和37+39+43+47+56+80+85+87+114+242。
5.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其进一步包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处的一个、两个、三个、四个或更多个取代：
(i)T009E、I021V、A037C/D/G/H/N/P/Q/T/V/W/Y、S039D/E、N042R、I43V、A047D/E/F/H/I/M/N/Q/S/W/V/Y、P054E/G/I/L/Q/S/V、T056A/C/D/E/F/H/I/K/L/M/N/P/Q/S/V/W/Y、N074C/D/E/H/S/T、I080C/L/V、N085A/D/E/H/L/P/Q/S/T/V/W、E87D、N097A/G/S、S099V、S101A、V102E/I、T114D/E/F/G/H/I/L/Q/V、N116R、M117I、M122L、S126F/H、G157S、V199I、Q200L、Y203W、M211L、N242D、N253D、S255W、和Q256E；
(ii)A37T、S39E、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、T114Q、和N242D；
(iii)与对应于选自A37T、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、T114Q、和N242D的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的S39E；
(iv)与对应于选自A37T、S39E、A47V、I80V、N85S、E87D、T114Q、和N242D的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的T56Y；
(v)与对应于选自A37T、S39E、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、和N242D的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的T114Q；
(vi)与对应于选自A37T、S39E、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、和T114Q的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的N242D；
(vii)与对应于选自A37T、A47V、T56Y、I80V、N85S、E87D、和T114Q的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置相组合的S39E+N242D；或
(viii)S39E、N242D、S39E+N242D、A37T+S39E+N242D、A37T+S39E+A47V+T56Y+I80V+N85S+E87D+T114Q+N242D、和A37T+S39E+I43V+A47V+T56Y+I80V+N85S+E87D+T114Q+N242D。
6.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述氨基酸序列包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处的两个、三个或四个或更多个取代：
(i)
A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126T-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126V-D127G-A128E-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99I-T114Q-S126T-D127E-F128I-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127S-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99N-T114Q-S126T-D127Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127Q-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126G-D127G-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99K-T114Q-S126G-D127G-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127L-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99M-T114Q-D127G-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99K-T114Q-D127L-F128C-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99M-T114Q-S126E-D127A-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127P-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99A-T114Q-S126M-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127G-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126V-D127E-F128K-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126G-D127G-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99Q-T114Q-S126T-D127V-F128D-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126T-D127L-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126T-D127G-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126R-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127G-F128L-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127A-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127G-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127A-F128W-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127H-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127T-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127V-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127L-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127Q-F128M-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127T-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127Q-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127N-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127L-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127V-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127V-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127V-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127G-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126L-D127F-F128R-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127V-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126V-D127M-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127W-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127S-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127S-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127A-F128V-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126Q-D127L-F128H-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126M-D127P-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-D127H-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126M-D127L-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127E-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126E-D127A-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126Q-D127V-F128C-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126N-D127G-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126T-D127E-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126D-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126W-D127N-F128D-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127A-F128C-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126T-D127E-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127I-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-D127G-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126V-D127A-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-F128H-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126Q-D127A-F128D-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-D127T-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126L-D127P-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I8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(ii)
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(iv)
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(v)
A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127S-F128A-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127A-F128C-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126T-D127E-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127P-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127T-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99T-T114Q-S126G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127E-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127G-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127N-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127V-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99I-T114Q-S126T-D127E-F128I-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127G-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127L-F128N-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127G-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127S-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99M-T114Q-D127G-F128S-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126A-D127V-F128T-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126M-D127A-F128W-N242D、和A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99E-T114Q-D127E-F128G-N242D；
(vi)
A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99H-T114Q-D127S-F128Q-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-D127P-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-T114Q-S126G-D127T-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-D127E-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126T-D127E-F128E-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126A-F128G-N242D、A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-F128E-N242D、和A37T-S39E-I43V-A47V-P54T-T56Y-I80V-N85S-E87D-S99R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D；或
(vii)(i)-(vi)的组合。
7.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述氨基酸序列包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置的位置处的两个、三个或四个或更多个取代：A037C-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037D-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037G-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037H-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037N-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037P-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037Q-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039D-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-A047V-I080V-N085S-S099R-N242D、A037T-S039E-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-A047V-T056Y-E087D-S099R-T114A-F128A-N242D、A037T-S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047D-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047E-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047F-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047H-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047I-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047M-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047N-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047Q-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047S-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V、A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-N085S-E087D-S099R-T114Q-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054E-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054G-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054I-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054L-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054Q-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054S-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056A-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056C-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056D-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056E-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056F-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056H-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056I-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056K-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056L-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056M-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056N-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056P-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Q-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056S-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056W-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080C-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080L-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085A-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085D-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085E-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-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S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-I043V-A047V-T056Y-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-I043V-A047W-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-A047Y-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q、A037T-S039E-I043V-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-N242D、A037T-S039E-I043V-N085S-E087D-S099R-T114Q、A037T-S039E-I043V-N085S-E087D-S099R-T114Q-N242D、A037T-S039E-I043V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-S099R-T114Q-N242D、A037T-S039E-I043V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-I043V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、A037V-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037W-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、A037Y-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、I021V-A037T-S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、I043V-A047V-N242D、I043V-A047V-S099R-F128A-N242D、I043V-A047V-S099R-S126T-N242D、I043V-A047V-T056Y-T114Q、I043V-A047V-T056Y-T114Q-N242D、N242D、S039E-A047V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-N085S-S099R-T114Q-N242D、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-S099R-T114Q、S039E-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114Q、S039E-A047V-T056Y-N085S-S099R-T114Q-F128A-N242D、S039E-E087D-N242D、S039E-E087D-S099R-F128A-N242D、S039E-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-E087D-S099R-S126T-N242D、S039E-I043V-A047V-E087D-N242D、S039E-I043V-A047V-E087D-S099R、S039E-I043V-A047V-P054T-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-I043V-A047V-S099R-T114Q-N242D、S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-E087D-S099R-T114Q-S126T-N242D、S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-I043V-A047V-T056Y-I080V-N085S-E087D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-I043V-E087D-S099R-T114Q、S039E-I043V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I043V-N085S-E087D-S099R-T114Q-N242D、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-I043V-T056Y-E087D-S099R-N242D、S039E-I043V-T056Y-E087D-S099R-T114Q、S039E-I043V-T056Y-I080V-N085S-S099R-T114Q-N242D、S039E-I043V-T056Y-S099R-T114Q-F128A-N242D、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-I080V-S099R-T114Q-N242D、S039E-N042R-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-N074D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-P054T-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N242D、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N253D、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q200L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q256E、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-S255W、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-V199I、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Y203W、S039E-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-T056Y-E087D-T114Q-N242D、S039E-T056Y-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S099R-F128A-N242D、S099R-S126T-N242D、T009E-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、T056Y-S099R-T114Q-F128A-N242D、T056Y-S099R-T114Q-S126T-N242D、和T056Y-T114Q-N242D。
8.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体选自：
(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％同一性的变体，并且所述变体包含至少一个取代(使用SEQ ID NO:1编号)，所述取代选自由以下组成的组：T3V、T9R、A15T、V66A、N74D、N97NS、N97AD、N97D/G、S99G/M、S101A、V102E/I、N116V/R、S126F、D127Q、F128A、G157S、Y161A、R164S、T188P、V199I、Q200C/E/I/K/T/V/W/L、Y203W、M211C、N212D、M216S/F、Q239R和T249R；以及
(ii)与亲本蛋白酶的氨基酸序列具有至少90％同一性的变体，所述亲本蛋白酶具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述变体包含至少一个对应于SEQ ID NO:13编号的取代，所述取代选自由以下组成的组：S3V、S9R、A15T、V66A、N74D、S97SE、S97AD、S97D/G、S99G/M、S101A、V102E/I、G116V/R、S126F、P127Q、S128A、G157S、Y161A、R164S、A188P、V199I、Q200C/E/I/K/T/V/W/L、Y203W、L211C/M、N212D、M216S/F、Q239R和T249R。
9.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体
(i)是吉氏芽孢杆菌(Bacillus Gibsonii)进化枝的成员；
(ii)是分离的；
(iii)具有蛋白水解活性；或
(iv)包含(i)至(iii)的组合。
10.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体衍生自亲本多肽或参比多肽，所述亲本多肽或参比多肽
(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性；或
(ii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有100％氨基酸序列同一性。
11.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列
(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；
(ii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；或
(iii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性。
12.根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中当与SEQ ID NO:1相比时，所述变体具有BMI、蛋、和/或法式焦糖布丁污渍清洁PI>1，当与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶相比时，所述变体具有改善的稳定性，或其组合。
13.根据权利要求12所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体的BMI、蛋、和/或法式焦糖布丁污渍清洁性能或稳定性根据实例2中描述的测定法进行测量。
14.一种组合物，所述组合物包含一种或多种根据任一项前述权利要求所述的枯草杆菌蛋白酶变体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物选自酶组合物和洗涤剂组合物。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、织物柔顺洗涤剂、餐具洗涤剂、和硬表面清洁洗涤剂。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含(i)一种或多种其他酶，所述酶选自：酰基转移酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、软骨素酶、角质酶、内切β-甘露聚糖酶、外切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪分解酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚酯酶、聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、短梗霉多糖酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶和木糖苷酶；(ii)一种或多种表面活性剂；(iii)选自钙和锌的一种或多种离子；(iv)一种或多种辅助材料；(v)一种或多种稳定剂；(vi)从约0.001％至约1.0重量％的根据权利要求1-13中任一项所述的变体；(vii)一种或多种漂白剂；和/或(viii)其组合。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的组合物，其中所述组合物不含磷酸盐或含有磷酸盐和/或不含硼或含有硼。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、糊剂和/或单位剂量组合物。
20.一种清洁方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的根据权利要求1-13中任一项所述的变体或根据权利要求14-19中任一项所述的组合物接触；并且所述方法任选地进一步包括在使所述表面或物品与所述变体或组合物接触之后漂洗所述表面或物品的步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法是清洁法式焦糖布丁污渍的方法。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述物品是餐具或织物。
23.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1-13中任一项所述的变体的核酸序列，其中所述多核苷酸是任选地分离的。
24.根据权利要求23所述的多核苷酸，其中所述核酸序列有效地连接到启动子。
25.根据权利要求23或24所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的变体在对应于SEQ ID NO:1的位置N242的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代。
26.根据权利要求25所述的多核苷酸，其中所述变体包含大于1.0的生产率性能指数(PI)，其中生产率PI是相对于在对应于SEQ ID NO:1的位置N242的位置处不包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的枯草杆菌蛋白酶变体多肽而言的。
27.根据权利要求25或26所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是表达构建体，所述表达构建体按5’至3’方向包含：启动子序列，其位于信号肽序列的上游(5’)并与信号肽序列有效地连接；前肽序列，其位于5’信号肽序列的下游(3’)并与5’信号肽序列有效地连接；编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体的核酸序列，所述核酸序列位于5’前肽序列的下游(3’)并且与5’前肽序列有效地连接；和任选的终止子序列，其位于所述核酸序列的下游(3’)并且与所述核酸序列有效地连接，所述核酸序列编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体。
28.根据权利要求27所述的多核苷酸，其中(i)所述启动子序列包含芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)核糖体RNA启动子，其中芽孢杆菌属物种核糖体RNA启动子是枯草芽孢杆菌rrnI启动子；(ii)所述信号肽序列包含SEQ ID NO:3；(iii)所述前肽序列包含SEQ IDNO:4；(iv)编码所述变体的核酸序列编码包含选自本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列的多肽，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的242的位置处具有天冬氨酸(D)氨基酸取代；和/或(v)所述任选的终止子序列包含SEQ ID NO:6。
29.一种表达载体或盒，其包含权利要求23-28中任一项所述的多核苷酸。
30.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含权利要求23-28中任一项所述的多核苷酸或权利要求29所述的载体或盒。
31.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-12中任一项所述的变体，其中所述组合物是消毒剂组合物、医疗器械清洁组合物、动物饲料组合物、贴眼透镜清洁组合物、伤口清洁组合物、或纺织品加工组合物、皮革加工组合物或羽毛加工组合物。
32.一种用于增加革兰氏阳性细菌宿主细胞中枯草杆菌蛋白酶变体生产的方法，所述方法包括：
(a)向宿主细胞中引入编码枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的一个或多个位置处包含一个或多个取代，其中对应于SEQ ID NO:1的N242的位置被天冬氨酸(D)取代(N242D)，和
(b)在适于生产经编码的枯草杆菌蛋白酶变体的条件下使所述宿主细胞生长，
其中相对于相同属、种和遗传背景的革兰氏阳性宿主细胞，所述宿主细胞生产增加量的(a)的枯草杆菌蛋白酶变体，所述相同属、种和遗传背景的革兰氏阳性宿主细胞包含引入的、编码枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的N242的位置处不包含取代；并且
其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法使(a)所述的枯草杆菌蛋白酶变体的产率提高至少2.5％。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中(a)所述的枯草杆菌蛋白酶变体相对于在对应于SEQ ID NO:1的N242的位置处不具有天冬氨酸(D)取代的枯草杆菌蛋白酶变体具有生产率性能指数(PI)>1.0。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中(a)所述的枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含在对应于选自9、37、39、42、43、47、54、56、74、80、85、87、99、114、126、127、128、199、200、203、211、253、255和256的SEQ ID NO:1位置的一个或多个位置处的一个或多个取代。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中(a)所述的枯草杆菌蛋白酶变体进一步包含在对应于选自以下的SEQ ID NO:1位置包含一个或多个取代的氨基酸序列：I043V-A047V-T056Y-T114Q、S039E-I043V-E087D-S099R-T114Q、S039E-I043V-A047V-E087D-S099R、S039E-I043V-T056Y-E087D-S099R-T114Q、S039E-A047V-T056Y-N085S-E087D-S099R-T114Q、S039E-A047V-T056Y-I080V-N085S-S099R-T114Q、A037T-S039E-I043V-N085S-E087D-S099R-T114Q、T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-N042R-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Y203W、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-V199I、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N253D、T009E-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-S255W、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q256E、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q200L、S039E-N074D-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-I043V-A047V、S039E-P054T-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I043V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-T056Y-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-N042R-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Y203W、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-M211L、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-V199I、S039E-I043V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-N253D、T009E-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-S255W、S039E-T056Y-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-P054T-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q256E、S039E-S099R-S126A-D127E-F128G-Q200L、S039E-N074D-I080V-S099R-S126A-D127E-F128G、A037T-S039E-I043V-A047V、S039E-P054T-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-A047V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-S099R-T114Q-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-N085S-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-N074D-E087D-S099R-S126A-D127E-F128G、S039E-I043V-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、和S039E-T056Y-N074D-S099R-S126A-D127E-F128G、及其组合。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中(a)所述的枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列
(i)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；
(ii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性；或
(iii)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％氨基酸序列同一性。
38.根据权利要求32-37中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是表达构建体，所述表达构建体按5’至3’方向包含：启动子序列，其位于信号肽序列的上游(5’)并与信号肽序列有效地连接；前肽序列，其位于5’信号肽序列的下游(3’)并与5’信号肽序列有效地连接；编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体的核酸序列，所述核酸序列位于5’前肽序列的下游(3’)并且与5’前肽序列有效地连接；和任选的终止子序列，其位于所述核酸序列的下游(3’)并且与所述核酸序列有效地连接，所述核酸序列编码在对应于SEQ ID NO:1的N242位置的位置处包含天冬氨酸(D)氨基酸取代的变体。
39.如权利要求38所述的方法，其中(i)所述启动子序列包含芽孢杆菌属物种核糖体RNA启动子，其中芽孢杆菌属物种核糖体RNA启动子是枯草芽孢杆菌rrnI启动子；(ii)所述信号肽序列包含SEQ ID NO:3；(iii)所述前肽序列包含SEQ ID NO:4；(iv)编码所述变体的核酸序列编码包含选自本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列的多肽，所述变体在对应于SEQ ID NO:1的242的位置处具有天冬氨酸(D)氨基酸取代；和/或(v)所述任选的终止子序列包含SEQ ID NO:6。
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