-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend
Carboxylgruppen tragende Benzophenon- oder Benzoesäureanilid-Derivate,
die als Proteaseinhibitoren wirken und somit geeignete Enzymstabilisatoren
sind.
-
Der
Einsatz von Enzymen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist seit Jahrzehnten
im Stand der Technik etabliert. Sie dienen dazu, das Leistungsspektrum
der betreffenden Mittel entsprechend ihren speziellen Aktivitäten
zu erweitern. Hierzu gehören insbesondere hydrolytische
Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen und Cellulasen. Die ersten
drei genannten hydrolysieren Proteine, Stärke und Fette
und tragen somit unmittelbar zur Schmutzentfernung bei. Cellulasen
werden insbesondere wegen ihrer Gewebewirkung eingesetzt. Eine weitere
Gruppe von Wasch- und Reinigungsmittelenzymen sind oxidative Enzyme,
insbesondere Oxidasen, die ggf. im Zusammenspiel mit anderen Komponenten
vorzugsweise dazu dienen, Anschmutzungen zu bleichen oder die bleichenden
Agentien in situ zu erzeugen. Neben diesen Enzymen, die einer fortwährenden Optimierung
unterworfen werden, werden laufend weitere Enzyme für den
Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln bereitgestellt, um insbesondere
spezielle Anschmutzungen optimal angehen zu können, wie
beispielsweise Pektinasen, β-Glucanasen, Mannanasen oder
weitere Hemicellulasen zur Hydrolyse insbesondere spezieller pflanzlicher
Polymere.
-
Die
am längsten etablierten und in praktisch allen modernen,
leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen
Enzyme sind Proteasen und hierunter insbesondere Serin-Proteasen,
zu denen erfindungsgemäß auch die Subtilasen gerechnet
werden. Sie dienen dem Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf
dem Reinigungsgut. Allerdings hydrolysieren sie auch sich selbst
(Autoproteolyse) und alle anderen in den betreffenden Mitteln enthaltenen
Proteine, d. h. insbesondere Enzyme. Dies geschieht besonders während
des Reinigungsvorgangs, d. h. in der wäßrigen
Waschflotte, wenn vergleichsweise günstige Reaktionsbedingungen
vorliegen. Dies geschieht in geringerem Ausmaße aber auch
während der Lagerung der betreffenden Mittel, weshalb im
Laufe einer langen Lagerung immer auch ein gewisser Verlust der
Proteaseaktivität sowie der Aktivitäten der anderen
Enzyme einhergeht. Besonders problematisch ist dies in gelförmigen
oder flüssigen und insbesondere in wasserhaltigen Rezepturen,
weil in diesem mit dem enthaltenen Wasser sowohl das Reaktionsmedium
als auch das Hydrolyse-Reagenz zur Verfügung stehen.
-
Ein
Ziel bei der Entwicklung von Wasch- und Reinigungsmittelrezepturen
besteht darin, die enthaltenen Enzyme besonders während
der Lagerung zu stabilisieren. Darunter wird der Schutz gegen verschiedene ungünstige
Einflüsse verstanden, wie beispielsweise gegen Denaturierung
oder Zerfall durch physikalische Einflüsse oder Oxidation.
Ein Schwerpunkt dieser Entwicklungen besteht im Schutz der enthaltenen
Proteine und/oder Enzyme gegen proteolytische Spaltung. Diese kann
durch den Aufbau physikalischer Barrieren erfolgen, etwa durch Verkapselung
der Enzyme in speziellen Enzymgranulaten oder durch Konfektionierung
der Mittel in Zwei- oder Mehrkammersystemen. Der andere vielfach
beschrittene Weg besteht darin, chemische Verbindungen zuzusetzen,
die die Proteasen inhibieren und somit insgesamt als Stabilisatoren
für Proteasen und die anderen enthaltenen Proteine und
Enzyme wirken. Es muß sich dabei um reversible Proteaseinhibitoren
handeln, da die Proteaseaktivität nur vorübergehend,
insbesondere während der Lagrung, nicht aber mehr während
des Reinigungsprozesses unterbunden werden soll.
-
Als
reversible Proteaseinhibitoren sind im Stand der Technik Polyole,
insbesondere Glycerin und 1,2-Propylenglycol, Benzamidin-Hydrochlorid,
Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze
oder Ester etabliert. Darunter sind vor allem Derivate mit aromatischen
Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren
zu erwähnen, insbesondere 4-Formylphenyl-Boronsäure,
beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen
(s. u.). Ein besonders guter Schutz ergibt sich, wenn Borsäurederivate zusammen
mit Polyolen eingesetzt werden, da sie dann einen das Enzym stabilisierenden
Komplex bilden können. Auch Peptidaldehyde, das heißt
Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2
bis 50 Monomeren sind zu diesem Zweck beschrieben. Zu den peptidischen
reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid
und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren sowie
Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren
werden hierfür eingesetzt.
-
Weitere
etablierte Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-,
Triethanol- und -Propanolamin und deren Mischungen, aliphatische
Carbonsäuren bis zu C
12, wie beispielsweise
Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze
der genannten Säuren. Auch endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate
sind für diesen Zweck etabliert. Bestimmte als Builder
eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in
WO 97/18287 offenbart,
zusätzlich zu ihrer Builder-Funktion auch ein Enzym zu
stabilisieren.
-
Als
Wasch- und Reinigungsmittelproteasen sind verschiedene Protease-Klassen
etabliert, beispielsweise Metalloproteasen. Unter den Wasch- und
Reinigungsmittelproteasen nehmen Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen,
Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) aufgrund ihrer günstigen
enzymatischen Eigenschaften wie Stabilität oder pH-Optimum
allerdings eine herausragende Stellung ein. Sie werden aufgrund
der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen
zugerechnet. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt,
sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im
Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt
meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über
diese Familie bietet beispielsweise der Artikel „Subtilases:
Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75–95 in „Subtilisin
enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996.
Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen
gebildet; hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten
und sekretierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der
Subtilasen zu erwähnen.
-
Es
wird deshalb besonders daran gearbeitet, reversible Inhibitoren
gerade dieser Enzymklasse zur Verfügung zu stellen. Dabei
haben sich Polyole wie Glycerin und 1,2-Propylenglycol aufgrund
iherer hohen notwendingen Einsatzkonzentrationen als unvorteilhaft
erwiesen, weil die übrigen Wirkstoffe der betreffenden Mittel
damit nur noch in entsprechend geringeren Anteilen enthalten sein
können.
-
Unter
den bereits in vergleichsweise niedriger Konzentration wirksamen
Serin-Protease-Inhibitoren nehmen Borsäurederivate eine
herausragende Stellung ein. Als Beispiele dafür gehen aus
WO 92/19707 A1 meta-substituierte
Phenylboronsäuren hervor. Para-substituierte Phenylboronsäuren
als Protease-Inhibitoren offenbart
EP 478050 A1 . Die Protease-inhibierende Wirkung
von Komplexen von Borsäuren und Borsäure-Derivaten
mit aromatischen Verbindungen offenbart
EP 511456 A1 . Protease-inhibierende
Derivate von Boronsäuren und Borinsäuren, darunter
auch aromatische Verbindungen, offenbart
WO 95/02046 A1 .
WO 95/29223 A1 offenbart
dieselbe Wirkung von substituierten Naphthalenboronsäuren.
-
Ferner
sind die Anmeldungen
WO
96/21716 A1 und
WO
96/41859 A1 zu erwähnen.
WO 96/21716 A1 zitiert
die fünf soeben zitierten Anmeldungen und offenbart, daß alle
darin aufgeführten Proteaseinhibitoren auch für
den speziellen Zweck geeignet sind, Enzyme in Wasch- und Reinigungsmitteln
zu stabilisieren. Eine Auswahl besonders leistungsfähiger
Stabilisatoren hieraus offenbart
WO 96/41859 A1 .
-
Ferner
gibt es Stand der Technik zur weiteren Steigerung der Wirkung dieser
Stabilisatoren. So beschreibt die Anmeldung
WO 93/11215 A1 den kombinierten
Einsatz von 1,2-Propandiol und Borsäure oder verschiedenen
Borsäure-Derivaten zum Stabilisieren flüssiger
Waschmittelrezepturen, und
EP
451924 A2 offenbart flüssige Waschmittelrezepturen,
die durch den kombinierten Einsatz von Hydroxypolycarboxylsäuren,
Calciumsalz und speziellen Borverbindungen stabilisiert werden.
-
Unabhängig
von ihrer stabilisierenden Wirkung weisen die Borsäurederivate
jedoch einen entscheidenden Nachteil auf: Viele davon, wie beispielsweise
Borat, bilden mit einigen anderen Wasch- bzw. Reinigungsmittelinhaltsstoffen
unerwünschte Nebenprodukte, so daß diese in den
betreffenden Mitteln nicht mehr für den erwünschten
Reinigungsszweck zur Verfügung stehen oder sogar als Verunreinigung
auf dem Waschgut zurückbleiben.
-
Es
stellte sich somit die Aufgabe, borfreie chemische Verbindungen
zu identifizieren, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit
als Enzymstabilisatoren in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet
sind.
-
Hierbei
war der Einsatz in insgesamt flüssigen, gelförmigen
oder pastösen Wasch- und Reinigungsmitteln von besonderem
Interesse, und darunter insbesondere in solchen, die Wasser enthalten.
-
Diese
Aufgabe wird durch folgende Mittel gelöst:
Wasch-
oder Reinigungsmittel, enthaltend eine Protease und eine Verbindung
der allgemeinen Strukturformel:
in der
- (a)
X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe
(NHCO) steht,
- (b) R1, R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1) für Wasserstoff
(H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3),
eine Ethyl- (C2H5),
eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH),
eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen
stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH)
vorliegt,
- (c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff
(H), eine Carboxyl(COOH), eine Methyl- (CH3),
eine Ethyl- (C2H5),
eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH),
eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen
stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH)
vorliegt, und
- (d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander
orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte
obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH)
und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder
optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und
somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges
Lacton darstellen.
-
Unter
einem Wasch- oder Reinigungsmittel sind erfindungsgemäß alle
Mittel zu verstehen, die sich zum Waschen oder Reinigen von insbesondere
Textilien und/oder festen Oberflächen eignen. Hierfür
geeignete Inhaltsstoffe werden weiter unten detailliert ausgeführt.
-
Unter
einer Protease sind erfindungsgemäß alle Enzyme
zu verstehen, die in der Lage sind, Säureamidverknüpfungen
von Proteinen zu hydrolysieren. Auch die Proteasen werden weiter
unten detailliert ausgeführt.
-
Bei
der in der allgemeinen Strukturformel dargestellten Verbindung handelt
es sich um eine aromatische Verbindung mit zwei Benzolringen, die
gemäß Merkmal (a) über eine Keto- oder
eine Säureamidgruppe verknüpft sind. Es handelt
sich somit um ein Benzophenon- oder ein Benzoesäureanilid-Derivat.
-
Dieses
Benzophenon-Derivat kann gemäß den Merkmalen (b)
und (c) in beiden Ringen als Reste R1, R2, R3, R4 und R5 (in Ring
1) bzw. R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) Wasserstoff (H), eine
Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine
Ethyl- (C2H5), eine
Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH),
eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen
tragen. Voraussetzung ist, daß in jedem der beiden Ringe
mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt.
-
Das
gleiche gilt für ein derartiges Benzoesäureanilid-Derivat.
Hierbei können die Ringe 1 und 2 unterschieden werden,
wobei Ring 1 derjenige ist, der sich auf die Benzoesäure
bzw. deren Substitutionsprodukt zurückführen läßt,
und Ring 2 derjenige, der sich auf das Anilin bzw. dessen Substitutionsprodukt
zurückführen läßt. Auch dieses
Benzoesäureanilid-Derivat kann als R1, R2, R3, R4 und R5
(in Ring 1) bzw. R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) Wasserstoff
(H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3),
eine Ethyl- (C2H5),
eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH),
eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen
tragen. Voraussetzung ist wiederum, daß in jedem der beiden
Ringe mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt.
-
Erfindungsrelevant
ist gemäß Merkmal (d) auch ein derartiges Benzophenon-
oder Benzoesäureanilid-Derivat, welches in einem der beiden
Ringe 1 oder 2 als mögliche Substituenten zwei der Reste
R1 bis R10 (A) und (B) aufweist, die zueinander orthoständig
sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls
weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind,
die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit
den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges
Lacton darstellen.
-
Es
ist also möglich, dass zwei der gemäß (b)
und (c) möglichen Substituenten (A) und (B) eine Carboxylgruppe
(COOH) bzw. eine Hydroxymethylgruppe sind, in einem Ring unmittelbar
benachbart, d. h. zueinander orthoständig sind und in Form
der Hydroxylgruppe und der Carboxymethlgruppe nebeneinander vorliegen.
In diesem Fall kann es dazu kommen, dass diese beiden Gruppen miteinander
ein Lacton ausbilden und In Lactonform an die zu inhibierende Protease
binden. Es ist auch möglich, dass die Bindung ohne vorherige Ausbildung
der Lactonform stattfindet. Es ist zur Verwirklichung der vorliegenden
Erfindung auch möglich, bereits bei der Synthese die Lactonform
vorzugeben und das bereits gebildete Lacton als Stabilisator dem
betreffenden Mittel zuzugeben. Die am besten geeignete Form ist
anhand der zu inhibierenden Protease und des ins Auge gefassten
Stabilisators experimentell zu ermitteln, was dem Fachmann keine
grundlegenden Schwierigkeiten bereitet.
-
Bei
der Zählung der Carboxylgruppen gemäß den
Merkmalen (b) und (c) und den bevorzugten Ausführungsformen,
die auf die Anzahl der pro Molekül enthaltenen Carboxylgruppen
bezug nehmen, wird diese Lacton-Carboxylgruppe als Carboxylgruppe
gemäß Merkmal (b) bzw. (c) mitgezählt,
kann aber auch zusätzlich neben einer weiteren, Carboxylgruppe
vorliegen.
-
In
einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
kann anstelle eines der beiden Bonzolringe auch ein Thiophenring
vorliegen. Die Belegung der darin möglichen Substituenten
1', 2', 3' ist analog den oben gemachten Ausführungen zu
den Merkmalen (b), (c) und (d) möglich.
-
Diese
Ausführungsform ermöglicht über den aromatischen
Thiophenring eine ähnliche, in Einzelfällen sogar
bessere nicht-kovalente Wechselwirkung mit der zu inhibierenden
Protease. Zudem ermöglicht das enthaltene Schwefel-Atom,
insbesondere über die freien Elektronenpaare weitere Wechselwirkungen,
die im Einzelfall vorteilhaft sein können. Die hierunter
besonders geeigneten Verbindungen sind anhand der konkret zu inhibierenden
Protease auf ihre kinetischen Parameter zu untersuchen und über
eine geeignete Auswahl und Anordnung der Substituenten zu optimieren.
Hierfür kann auf die anhand der Verbindungen mit Benzolringen gemachten
Erfahrungen zurückgegriffen werden.
-
Die
vorliegende Erfindung umfaßt die genannten Verbindungen
in allen protonierten und/oder deprotonierten Formen. Insbesondere
die Carboxylgruppe(n) (COOH) und ggf. die Aminogruppe(n) (NH2) liegen je nach pH-Wert des umgebenden
Mediums als Carboxylat- (COO–)
bzw. als Ammoniumgruppen (NH3 +)
vor. Gegebenenfalls sind entgegengesetzt geladene Kationen (H+, Na+, K+ oder ähnliche) bzw. Anionen (Cl–, Br–,
Formiat, Acetat etc.) anwesend. In all diesen Formen kann die vorliegende
Erfindung verwirklicht werden. Entscheidend ist jeweils die Wechselwirkung
zwischen der erfindungsrelevanten Verbindung und der erfindungsgemäß zu
inhibierenden/stabilisierenden Protease.
-
Ohne
an diese Theorie gebunden sein wollen, wird erfindungsgemäß davon
ausgegangen, daß die erfindungsrelevanten Verbindungen
mit der erfindungsgemäß zu inhibierenden/stabilisierenden
Protease einen Komplex ausbilden. Dieser sieht wahrscheinlich so
aus, daß sich die erfindungsrelevante Verbindung in die
Substratbindungstasche der Protease einlagert und dort nicht-kovalent
gebunden wird. Auf diese Weise wird das aktive Zentrum der Protease
durch eine nicht durch dieses Enzym hydrolysierbare Verbindung blockiert
und steht nicht für eine Hydrolyse anderer zugegener Proteine
zur Verfügung. Hierbei handelt es sich um eine reversible
Bindung, d. h. um ein Gleichgewicht zwischen Assoziation und Dissoziation.
Der Gleichgewichtskoeffizient dieser Reaktion wird als Inhibitionskonstante
oder Ki bezeichnet.
-
Der
erste Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber
dem Stand der Technik besteht neben ihrem gegenüber den
Polyolen geringeren Volumenbedarf darin, daß sie günstige
Inhibitionskonstanten bezüglich der in Wasch- und Reinigungsmitteln
einsetzbaren Proteasen aufweisen. Dies gilt beispielsweise für Serin-Proteasen,
aber auch für Metalloproteasen. Die Inhibitoren binden
somit reversibel, d. h. sie gehen nicht zu feste und nicht zu lose
vorübergehende Wechselwirkungen mit dem Enzym ein. Vorteilhafterweise
liegt damit während der Lagerung der Großteil
der erfindungsrelevanten Protease in Form eines Protease-Inhibitor-Komplexes
vor. Die Protease und ggf. weitere enthaltene Proteine, insbesondere
weitere Enzyme werden auf diese Weise gegenüber einer Proteolyse
durch dieses Enzym geschützt (gegen Proteolyse stabilisiert).
Andererseits wird im Augenblick der Verdünnung des erfindungsgemäßen
Mittels mit Wasser zur Herstellung einer wäßrigen
Wasch- bzw. Reinigungsflotte während des Reinigungsvorgangs
das Bindungsgleichgewicht in Richtung Dissoziation verschoben, so
daß sich der Komplex auflöst und der Großteil
der erfindungsrelevanten Protease proteolytisch aktiv wird. Es handelt
sich bei den erfindungsrelevanten Verbindungen also gemäß der formulierten
Aufgabe um funktionierende Protease-Inhibitoren und somit Enzym-Stabilisatoren
für Wasch- und Reinigungsmittel.
-
Der
zweite Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber
dem Stand der Technik besteht darin, daß sie als Elemente
lediglich C, H, N und O und gegebenenfalls Halogenide und/oder Schwefel
aufweisen und insbesondere frei von Bor sind. Sie bilden somit nicht
die unerwünschten, auf Bor zurückzuführenden
Nebenprodukte mit anderen Wasch- oder Reinigungsmittelinhaltsstoffen.
-
Ferner
verfügen sie insbesondere aufgrund der in jedem aromatischen
Ring enthaltenen Carboxylgruppen über eine gute Wasserlöslichkeit,
so daß sie in entsprechende Mittel einfach eingearbeitet
werden können und ein Ausfällen während
der Lagerung vermieden wird.
-
Grundsätzlich
wirken die genannten Verbindungen vermutlich deshalb als reversible
Inhibitoren, weil sie dem Substrat der Proteasen, insbesondere hinsichtlich
der zu hydrolysierenden Säureamidbindung, strukturell gleichen.
Umgekehrt lassen sich also grundsätzlich alle Proteasen
durch die erfindungsrelevanten Verbindungen inhibieren, so diese
erfindungsgemäß als Protease-Inhibitoren geeignet
sind. Dies gilt insbesondere für Serin-Proteasen, wie anhand
der Beispiele zur vorliegenden Anmeldung mit der positiven Wirkung
der dort experimentell beschriebenen Verbindungen anhand von Serin-Proteasen,
konkret Subtilasen, noch spezieller Subtilisinen gezeigt worden
ist, und zwar anhand einer Variante des Subtilisins aus Bacillus
lentus DSM 5483.
-
Weitere
Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen:
- – die Verwendung einer oben beschriebenen
Verbindung als reversibler Inhibitor und/oder Stabilisator einer Protease,
im Rahmen einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur;
- – Wasch- oder Reinigungsverfahren, in dem eine Protease
zur Wirkung kommt, die mit einer oben beschriebenen Verbindung inhibiert
und/oder stabilisiert ist;
- – die Verwendung eines erfindungsgemäßen
Wasch- oder Reinigungsmittels zum Waschen und/oder Reinigen von
Textilien und/oder harten Oberflächen; sowie
- – die Verwendung einer Protease und einer oben beschriebenen
Verbindung zur Herstellung eines Wasch- oder Reinigungsmittels.
-
Besonders
bevorzugt wird in allen erfindungsgemäßen Aspekten
die stabilisierende Verbindung aus einem der folgenden Stabilisatoren
ausgewählt:
-
Erfindungsgemäß sind
solche Wasch- oder Reinigungsmittel bevorzugt, in denen die stabilisierende Verbindung
bezüglich der enthaltenen Protease eine Inhibitionskonstante
(Ki) von 0,01 bis 10 mM, vorzugsweise 0,1 bis 5, besonders bevorzugt
0,5 bis 2 aufweist.
-
Die
Inhibitionskonstante Ki kann auf folgende
Weise ermittelt werden:
-
Für
die Charakterisierung eines reversiblen Inhibitors der enzymatischen
Aktivität, ist die Inhibitionskonstante Ki eine
charakteristische und entscheidende Größe. Ki beschreibt das Gleichgewicht zwischen Enzym,
Inhibitor und Enzym-Inhibitor Komplex für eine reversible
Bindung. Der Enzym-Inhibitor Komplex ist dabei katalytisch nicht
aktiv und inhibiert die Reaktion durch Herabsetzung der Konzentration
von freiem Enzym, das noch zur Bindung von Substrat zur Verfügung
steht. Der Ki ist dementsprechend definiert als: Ki = [I]×[E]/[EI]
-
Darin
bedeuten [E], [I] und [EI] die jeweiligen molaren Gleichgewichtskonzentrationen
von Enzym (E), Inhibitor (I) und dem Enzym-Inhibitor-Komplex (EI).
Dieser Definition entsprechend ist eine Substanz mit einem kleinen
Ki unter den jeweiligen Testbedingungen ein guter Inhibitor.
-
Die
Bestimmung des Ki erfolgt auf der Grundlage
des Aktivitätstests der Protease in Anwesenheit des entsprechenden
Inhibitors. Über die etablierte Michaelis-Menten-Kinetik
werden die enzymatischen Parameter Km, und
kcat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen
des Inhibitors bestimmt. Durch die Bestimmung der Anfangshydrolyse-Rate
(vAnf.) bei verschiedenen Substratkonzentrationen
[S] und Einpassung der experimentellen Daten in Gleichung 1 erhält
man Ki. vAnf. = kcat × [S] × E0/(Km × (1
+ [I]/Ki) + S) Gleichung 1
-
Hierin
steht [I] wiederum für die Inhibitor-Konzentration.
-
Alternativ
kann Ki unter Verwendung der Cheng-Prusoff-Gleichung
(Gleichung 2) über den IC50-Wert bestimmt
werden. Die Bestimmung des IC50-Werts erfolgt über
die Bestimmung der proteolytischen Aktivität an einem Substrat
in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors und
Anpassung der experimentellen Daten an eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Gleichung
mit variabler Steigung (Pseudo-Hill-Steigungen). Es handelt sich
dabei um den Wert der Hälfte der Inhibitor-Konzentration,
die nötig wäre, um eine vollständige
Inhibition zu erzielen.
-
Ki ergibt sich damit aus folgender Gleichung
2: Ki = IC50/(1+ [S]/Kd) Gleichung 2
-
Darin
bedeuten [S] die Substratkonzentration im Test und Kd die
Gleichgewichts-Dissoziationskonstante für das Substrat,
die bei IC50 als identisch zu Km für
das Substrat gesetzt werden kann.
-
Die
auf diese Weise bestimmbaren K
i-Werte kennzeichnen
die untersuchte Verbindung in bezug auf die im Versuch eingesetzte
Protease. In Beispiel 2 wurde dies für die Bacillus lentus-Alkalische
Protease F49 (gemäß
WO 95/23221 A1 ) durchgeführt.
Da es sich dabei um eine typische Subtilisin-Protease handelt, sind die
mit diesem Enzym erhaltenen Werte auch für andere Serin-Proteasen,
insbesondere andere Subtilisin-Proteasen typisch. Der exakte Wert
für eine interessierende Protease muß im Zweifel
anhand der jeweils konkreten Protease ermittelt werden.
-
In
erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln,
die in einer bevorzugten Ausführung in überwiegend
fester Form vorliegen und in einer zweiten Ausführung in überwiegend
flüssiger, pastöser oder Gelform vorliegen, ist
die Protease insbesondere in einem Gehalt von 2 μg bis
20 mg pro g des Mittels, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5
mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 μg bis
15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 μg
bis 10 μg des Mittels enthalten.
-
Der
Stabilisator ist in erfindungsgemäßen Mitteln
insbesondere in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise
bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt
bis zu 5 mg pro g des Mittels enthalten. Weiterhin ist bevorzugt,
dass der Stabilisator in einem Gehalt von 0,01 bis 100 × Ki (bezogen auf die enthaltene Protease),
vorzugsweise 0,1 bis 10 × Ki besonders
bevorzugt 1 bis 5 × Ki enthalten
ist.
-
Vorzugsweise
liegt das molare Verhältnis von Stabilisator zur Protease
im Bereich von 1:1 bis 1.000:1, insbesondere von 1:1 bis 500:1,
besonders bevorzugt von 1:1 bis 100:1, ganz besonders bevorzugt
von 1:1 bis 20:1.
-
Neben
dem Stabilisator gemäß der oben angegebenen allgemeinen
Formel kann ein erfindungsgemäßes Mittel mindestens
einen weiteren Stabilisator, insbesondere ein Polyol, wie Glycerin
oder 1,2-Ethylenglycol, und/oder ein Antioxidans, enthalten.
-
Bei
der erfindungsgemäß stabilisierten beziehungsweise
reversibel inhibierten Protease handelt es sich vorzugsweise um
eine Serin-Protease, insbesondere um eine Subtilase, besonders bevorzugt
um ein Subtilisin. Subtilisin kann dabei ein Wildtypenzym oder eine
Subtilisin-Variante sein, wobei das Wildtypenzym bzw. das Ausgangsenzym
der Variante vorzugsweise aus einer der folgenden ausgewählt
ist:
- – Die Alkalische Protease aus
Bacillus amyloliquefaciens (BPN'),
- – Die Alkalische Protease aus Bacillus licheniformis
(Subtilisin Carlsberg),
- – Die Alkalische Protease PB92,
- – Subtilisin 147 und/oder 309 (Savinase)
- – Die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise
aus Bacillus lentus (DSM 5483),
- – Die Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus
(DSM 11233),
- – die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM
14391) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische
Protease,
- – die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390)
oder eine hierzu mindestens zu 98,5% identische Alkalische Protease,
- – die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392)
oder eine hierzu mindestens zu 98,1% identische Alkalische Protease,
- – die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM
14393) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische
Protease,
- – die in SEQ ID NO. 4 der Anmeldung WO 2005/063974 A1 beschriebene
Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 40% identische
Alkalische Protease,
- – die in SEQ ID NO. 4 der Anmeldung WO 2005/103244 A1 beschriebene
Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 80% identische
Alkalische Protease,
- – die in SEQ ID NO. 7 der Anmeldung WO 2005/103244 A1 beschriebene
Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 80% identische
Alkalische Protease und
- – die in SEQ ID NO. 2 der Anmeldung DE 102005028295.4 beschriebene
Protease oder eine hierzu mindestens zu 66% identische Protease.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der
Protease um eine Variante mit einer Punktmutation in dem Bereich
der Positonen 95 bis 103 (Zählung gemäß Subtilisin
309) handelt, vorzugsweise mit einer Insertion einer einzelnen Aminosäure zwischen
Position 99 und 100, besonders bevorzugt ausgehend von Subtilisin
147 und/oder 309 (Subtilisin 309), bzw. einer Variante davon. Insbesondere
handelt es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Punktmutation
in Positon 217 (Zählung gemäß der Wildtyp-Protease
aus Bacillus amyloliquefaciens; BPN') handelt, vorzugsweise mit
einer Substitution einer einzelnen Aminosäure in dieser
Position, besonders bevorzugt mit der Aminosäuresubstitution
X217L, ganz besonders bevorzugt ausgehend von der Wildtyp-Protease
aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), bzw. einer Variante davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei
der Protease um eine Variante mit einer Aminosäureänderung
gegenüber einer mit der Alkalischen Protease aus Bacillus
lentus homologisierbaren Ausgangs-Protease in einer oder mehreren
der folgenden Positionen: 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87,
96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157,
188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253,
255 und 268, in der Zählung der Alkalischen Protease aus
Bacillus lentus, vorzugsweise mit einer Aminosäureänderung
gegenüber dem Ausgangsmolekül in einer oder mehreren
der folgenden Positionen: 3, 4, 43, 61, 188, 193, 199, 211, 224,
250 und 253, besonders bevorzugt mit einem oder mehreren der Aminosäureaustausche
X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X1991, X211D, X211E, X211G,
X211N oder X211Q, X224V, X250G und X253N, ganz besonders bevorzugt
ausgehend von der Alkalische Protease aus Bacillus lentus DSM 5483,
bzw. einer Variante davon.
-
Erfindungsgemäße
Mittel können neben der Protease ein oder mehrere weitere
Enzyme enthalten, insbesondere aus folgender Gruppe: eine oder mehrere
weitere Proteasen, Amylasen, Hemicellulasen, Cellulasen, Lipasen
und Oxidoreduktasen. Bei der Amylase handelt es sich vorzugsweise
um eine α-Amylase. Bei der Hemicellulase handelt es sich
vorzugsweise um eine β-Glucanase, eine Pektinase, eine
Pullulanase und/oder eine Mannanase. Bei der Cellulase handelt es
sich vorzugsweise um ein Cellulase-Gemisch oder eine Einkomponentencellulase,
vorzugsweise bzw. überwiegend um eine Endoglucanase und/oder
eine Cellobiohydrolase. Bei der Oxidoreduktase handelt es sich vorzugsweise
um eine Oxidase, insbesondere eine Cholin-Oxidase, oder um eine
Perhydrolase.
-
Erfindungsgemäße
Mittel enthalten vorzugsweise mindestens einen Komplexbildner und/oder
Buildersubstanzen, wobei es sich bei dem Builder insbesondere um
einen Zeolith-Builder handelt, und/oder ein nichtionisches Tensid,
wobei es sich bei dem nichtionischen Tensid vorzugsweise um einen
Hydroxymischether handelt, und/oder optischen Aufheller, wobei es
sich bei dem optischen Aufheller um Diphenylverbindungen, insbesondere
um Distyryl-Biphenylderivate, und/oder um Stilbentriazin-Derivate
handelt.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
Untersuchung der Protease-Restaktivität
in Gegenwart eines Inhibitors
-
Zum
Nachweis, dass die unten aufgeführten Verbindungen eine
die Protease-Aktivität inhibierende Wirkung ausüben,
wurde die proteolytische Restaktivität der Bacillus lentus-Alkalische
Protease F49 (gemäß
WO 95/23221 A1 ) in Anwesenheit
dieser Verbindungen ermittelt.
-
In
parallelen Reaktionsansätzen wurden in 100 mM Tris-Puffer,
pH 6,8, 0,1% (w/v) BrijTM35 das Substrat Succinyl Alanin-Alanin-Prolin-Phenylalanin-para-Nitroanilid
(AAPFpNA; Bachem L-1400) und 5 × 10–9 bzw.
1 × 10–8 M der Protease
vorgelegt. Hinzu kamen die in Tabelle 1 aufgeführten zu
testenden Verbindungen in einer Endkonzentration von 10 mM. Sie
waren jeweils in wasserfreiem DMSO gelöst, wobei Effekte
von DMSO auf die enzymatische Aktivität über die
entsprechende Referenz mit derselben Menge DMSO, aber ohne die betreffende
Verbindung korrigiert wurden. Die Inkubation erfolgte für
5 min bei pH 8,6 und 25°C. Dabei entspricht 1 U 1 μmol
gespaltenem Substrat pro Minute.
-
Auf
diese Weise wurden folgende Verbindungen untersucht:
V1: 2-[[(3-carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
V2:
2-[(2-carboxybenzoyl)amino]-Benzoesäure
V3: 2-[[(4-carboxyphenylamino]carbonyl]-Benzoesäure
V4:
2-(4-carboxybenzoyl)-Benzoesäure
V5: 4-(2-carboxybenzoyl)-1,2-Benzoldicarboxylsäure
-
Sie
führten alle zu einer Restaktivität der Protease
von 50% oder weniger. Hierunter ist V1 der stärkste und
damit am besten geeigente Protease-Inhibitor bzw. Stabilisator,
gefolgt von V2, V3, V4 (praktisch genauso gut wie V3) und V5.
-
Aufgrund
dieser Ergebnisse sind diese Verbindungen auch dazu geeignet, die
enzymatischen Aktivitäten in Protease enthaltenden Wasch-
und Reinigungsmitteln während der Lagerung zu stabilisieren.
-
Beispiel 2
-
Untersuchung der Lagerstabilität
proteasehaltiger Wasch- und Reinigungsmittel in Gegenwart von Protease-Inhibitoren
-
Als
Basisrezeptur wurde ein Flüssigwaschmittel mit folgender
Zusammensetzung angesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3–0,5%
Xanthan Gum, 0,2–0,4% Anti-Schaummittel, 6–7%
Glycerin, 0,3–0,5% Ethanol, 4-7% FASOS, 24–28%
Nichtionische Tenside, 1% Borsäure, 1–2% Natriumcitrat
(Dihydrat), 2–4% Soda, 14–16% Kokosnuss-Fettsäuren,
0,5% HEDP, 0–0,4% PVP, 0–0,05% optischer Aufheller,
0–0,001% Farbstoff, Rest: demineralisiertes Wasser.
-
Diese
Rezeptur wurde mit den zu testenden, inhibierenden Verbindungen
und 1.275.000 HPE/I B. lentus-Alkalische Protease F 49 versetzt.
Die in HPE angegebene Protease-Aktivität (Henkel-Protease-Einheiten) wurde
nach van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffenlichung „Zur
Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten
und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln"
in Tenside (1970), Band 7, S. 125–132, bestimmt.
-
Die
Lagerung erfolgte über verschieden lange Zeiträume
in luftdicht verschlossenen Gefäßen bei 30°C.
-
Zur
Auswertung wurden die Anfangswerte für die proteolytische
Aktivität des betreffenden Mittels mit den nach der Lagerung
bestimmten Werten verglichen. Je höher die nach der Lagerung
verbleibende Aktivität war, desto besser war die enthaltene
Protease während der Lagerung inaktiviert und desto besser
eignet sich die betreffende Verbindung als erfindungsgemäßer
Stabilisator.
-
Alle
untersuchten Verbindungen zeigten eine eindeutig stabilisierende
Wirkung.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 97/18287 [0006]
- - WO 92/19707 A1 [0009]
- - EP 478050 A1 [0009]
- - EP 511456 A1 [0009]
- - WO 95/02046 A1 [0009]
- - WO 95/29223 A1 [0009]
- - WO 96/21716 A1 [0010, 0010]
- - WO 96/41859 A1 [0010, 0010]
- - WO 93/11215 A1 [0011]
- - EP 451924 A2 [0011]
- - WO 95/23221 A1 [0043, 0052]
- - WO 2005/063974 A1 [0048]
- - WO 2005/103244 A1 [0048, 0048]
- - DE 102005028295 [0048]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - „Subtilases:
Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75–95 [0007]
- - „Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott
und C. Betzel, New York, 1996 [0007]
- - „Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität
in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und
Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), Band 7, S. 125–132 [0058]
