DE102008010429A1

DE102008010429A1 - Harnstoff-Derivate als Enzymstabilisatoren

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Publication number: DE102008010429A1
Application number: DE200810010429
Authority: DE
Inventors: Ursula Dr. Huchel; Timothy Dr. O'connell; Robin Dr. Ghosh; Dirk Dr. Freitag-Stechl; Andreas Dr. Michels
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2008-02-21
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2009-08-27

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend Harnstoff-Derivate, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit geeignete Enzymstabilisatoren sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend Harnstoff-Derivate, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit geeignete Enzymstabilisatoren sind.
Der Einsatz von Enzymen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist seit Jahrzehnten im Stand der Technik etabliert. Sie dienen dazu, das Leistungsspektrum der betreffenden Mittel entsprechend ihren speziellen Aktivitäten zu erweitern. Hierzu gehören insbesondere hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen und Cellulasen. Die ersten drei genannten hydrolysieren Proteine, Stärke und Fette und tragen somit unmittelbar zur Schmutzentfernung bei. Cellulasen werden insbesondere wegen ihrer Gewebewirkung eingesetzt. Eine weitere Gruppe von Wasch- und Reinigungsmittelenzymen sind oxidative Enzyme, insbesondere Oxidasen, die ggf. im Zusammenspiel mit anderen Komponenten vorzugsweise dazu dienen, Anschmutzungen zu bleichen oder die bleichenden Agentien in situ zu erzeugen. Neben diesen Enzymen, die einer fortwährenden Optimierung unterworfen werden, werden laufend weitere Enzyme für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln bereitgestellt, um insbesondere spezielle Anschmutzungen optimal angehen zu können, wie beispielsweise Pektinasen, β-Glucanasen, Mannanasen oder weitere Hemicellulasen (Glykosidasen) zur Hydrolyse insbesondere spezieller pflanzlicher Polymere.
Die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme sind Proteasen und hierunter insbesondere Serin-Proteasen, zu denen erfindungsgemäß auch die Subtilasen gerechnet werden. Sie dienen dem Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Allerdings hydrolysieren sie auch sich selbst (Autoproteolyse) und alle anderen in den betreffenden Mitteln enthaltenen Proteine, d. h. insbesondere Enzyme. Dies geschieht besonders während des Reinigungsvorgangs, d. h. in der wäßrigen Waschflotte, wenn vergleichsweise günstige Reaktionsbedingungen vorliegen. Dies geschieht in geringerem Ausmaße aber auch während der Lagerung der betreffenden Mittel, weshalb im Laufe einer langen Lagerung immer auch ein gewisser Verlust der Proteaseaktivität sowie der Aktivitäten der anderen Enzyme einhergeht. Besonders problematisch ist dies in gelförmigen oder flüssigen und insbesondere in wasserhaltigen Rezepturen, weil in diesem mit dem enthaltenen Wasser sowohl das Reaktionsmedium als auch das Hydrolyse-Reagenz zur Verfügung stehen.
Ein Ziel bei der Entwicklung von Wasch- und Reinigungsmittelrezepturen besteht darin, die enthaltenen Enzyme besonders während der Lagerung zu stabilisieren. Darunter wird der Schutz gegen verschiedene ungünstige Einflüsse verstanden, wie beispielsweise gegen Denaturierung oder Zerfall durch physikalische Einflüsse oder Oxidation. Ein Schwerpunkt dieser Entwicklungen besteht im Schutz der enthaltenen Proteine und/oder Enzyme gegen proteolytische Spaltung. Diese kann durch den Aufbau physikalischer Barrieren erfolgen, etwa durch Verkapselung der Enzyme in speziellen Enzymgranulaten oder durch Konfektionierung der Mittel in Zwei- oder Mehrkammersystemen. Der andere vielfach beschrittene Weg besteht darin, chemische Verbindungen zuzusetzen, die die Proteasen inhibieren und somit insgesamt als Stabilisatoren für Proteasen und die anderen enthaltenen Proteine und Enzyme wirken. Es muß sich dabei um reversible Proteaseinhibitoren handeln, da die Proteaseaktivität nur vorübergehend, insbesondere während der Lagrung, nicht aber mehr während des Reinigungsprozesses unterbunden werden soll.
Als reversible Proteaseinhibitoren sind im Stand der Technik Polyole, insbesondere Glycerin und 1,2-Propylenglycol, Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester etabliert. Darunter sind vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren zu erwähnen, insbesondere 4-Formylphenyl-Boronsäure, beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen (s. u.). Ein besonders guter Schutz ergibt sich, wenn Borsäurederivate zusammen mit Polyolen eingesetzt werden, da sie dann einen das Enzym stabilisierenden Komplex bilden können. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren sind zu diesem Zweck beschrieben. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren werden hierfür eingesetzt.
Weitere etablierte Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -Propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C₁₂, wie beispielsweise Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Auch endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate sind für diesen Zweck etabliert. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich zu ihrer Builder-Funktion auch ein Enzym zu stabilisieren.
Als Wasch- und Reinigungsmittelproteasen sind verschiedene Protease-Klassen etabliert, beispielsweise Metalloproteasen. Unter den Wasch- und Reinigungsmittelproteasen nehmen Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) aufgrund ihrer günstigen enzymatischen Eigenschaften wie Stabilität oder pH-Optimum allerdings eine herausragende Stellung ein. Sie werden aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen zugerechnet. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt, sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen.
Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel „Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75–95 in „Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen gebildet; hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten und sekretierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.
Es wird deshalb besonders daran gearbeitet, reversible Inhibitoren gerade dieser Enzymklasse zur Verfügung zu stellen. Dabei haben sich Polyole wie Glycerin und 1,2-Propylenglycol aufgrund ihrer hohen notwendigen Einsatzkonzentrationen als unvorteilhaft erwiesen, weil die übrigen Wirkstoffe der betreffenden Mittel damit nur noch in entsprechend geringeren Anteilen enthalten sein können.
Unter den bereits in vergleichsweise niedriger Konzentration wirksamen Serin-Protease-Inhibitoren nehmen Borsäurederivate eine herausragende Stellung ein. Als Beispiele dafür gehen aus WO 92/19707 A1 meta-substituierte Phenylboronsäuren hervor. Para-substituierte Phenylboronsäuren als Protease-Inhibitoren offenbart EP 478050 A1 . Die Protease-inhibierende Wirkung von Komplexen von Borsäuren und Borsäure-Derivaten mit aromatischen Verbindungen offenbart EP 511456 A1 . Protease-inhibierende Derivate von Boronsäuren und Borinsäuren, darunter auch aromatische Verbindungen, offenbart WO 95/02046 A1 . WO 95/29223 A1 offenbart dieselbe Wirkung von substituierten Naphthalenboronsäuren.
Ferner sind die Anmeldungen WO 96/21716 A1 und WO 96/41859 A1 zu erwähnen. WO 96/21716 A1 zitiert die fünf soeben zitierten Anmeldungen und offenbart, daß alle darin aufgeführten Proteaseinhibitoren auch für den speziellen Zweck geeignet sind, Enzyme in Wasch- und Reinigungsmitteln zu stabilisieren. Eine Auswahl besonders leistungsfähiger Stabilisatoren hieraus offenbart WO 96/41859 A1 .
Ferner gibt es Stand der Technik zur weiteren Steigerung der Wirkung dieser Stabilisatoren. So beschreibt die Anmeldung WO 93/11215 A1 den kombinierten Einsatz von 1,2-Propandiol und Borsäure oder verschiedenen Borsäure-Derivaten zum Stabilisieren flüssiger Waschmittelrezepturen, und EP 451924 A2 offenbart flüssige Waschmittelrezepturen, die durch den kombinierten Einsatz von Hydroxypolycarboxylsäuren, Calciumsalz und speziellen Borverbindungen stabilisiert werden.
Unabhängig von ihrer stabilisierenden Wirkung weisen die Borsäurederivate jedoch einen entscheidenden Nachteil auf: Viele davon, wie beispielsweise Borat, bilden mit einigen anderen Wasch- bzw. Reinigungsmittelinhaltsstoffen unerwünschte Nebenprodukte, so daß diese in den betreffenden Mitteln nicht mehr für den erwünschten Reinigungsszweck zur Verfügung stehen oder sogar als Verunreinigung auf dem Waschgut zurückbleiben.
Es stellte sich somit die Aufgabe, borfreie chemische Verbindungen zu identifizieren, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit als Enzymstabilisatoren in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet sind.
Hierbei war der Einsatz in insgesamt flüssigen, gelförmigen oder pastösen Wasch- und Reinigungsmitteln von besonderem Interesse, und darunter insbesondere in solchen, die Wasser enthalten.
Diese Aufgabe wird durch folgende Mittel gelöst:
Wasch- oder Reinigungsmittel, enthaltend mindestens eine Protease und mindestens ein Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivat. In einer bevorzugten Ausführungsform ist hierbei an mindestens einem Stickstoff-Atom der Harnstoff- oder Thioharnstoff-Gruppe mindestens eine Verbindung mit negativem mesomeren Effekt gebunden.
Bei dem erfindungsgemäß einzusetzenden Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivat handelt es sich vorzugsweise um einen Sulfonylharnstoff, Sulfonylthioharnstoff, Acylharnstoff oder Acylthioharnstoff.
Bei dem Sulfonylharnstoff handelt es sich um eine Verbindung mit dem Strukturelement
bei dem Acylharnstoff handelt es sich um eine Verbindung mit dem Strukturelement
bei dem Sulfonylthioharnstoff handelt es sich um eine Verbindung mit dem Strukturelement
und bei dem Acylthioharnstoff handelt es sich vorzugsweise um eine Verbindung mit dem Strukturelement
Es handelt sich vorzugsweise bei dem Sulfonylharnstoff um eine Verbindung mit der allgemeinen Formel R¹-SO₂-NX-C(O)-NY-R², bei dem Acylharnstoff um eine Verbindung der allgemeinen Formel R¹-C(O)-NX-C(O)-NY-R², bei dem Sulfonylthioharnstoff um eine Verbindung der allgemeinen Formel R¹-SO₂-NX-C(S)-NY-R² und bei dem Acylthioharnstoff um eine Verbindung der allgemeinen Formel R¹-C(O)-NX-C(S)-NY-R², jeweils dadurch gekennzeichnet, dass X, Y, R¹ und R² unabhängig voneinander für Trifluormethyl, Wasserstoff, Alkyl, insbesondere C_1-22-Alkyl, vorzugsweise C_1-18-Alkyl, Cycloalkyl, insbesondere C_3-8-Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, insbesondere C_3-8-Cycloalkyl-C_1-12-alkyl, Alkenyl, insbesondere C_2-18-Alkenyl, Alkinyl, insbesondere C_2-18-Alkinyl, Heteroalkyl, Heterocycloalkyl, Alkoxy, insbesondere C_1-18-Alkoxy, Alkoxyalkyl, insbesondere C_1-18-Alkoxy-C_1-18-alkyl, Alkylsulfanyl, insbesondere C_1-18-Alkylsulfanyl, Alkylsulfinyl, insbesondere C_1-18-Alkylsulfinyl, Alkylsulfonyl, insbesondere C_1-18-Alkylsulfonyl, Alkanoyl, insbesondere C_1-18-Alkanoyl, Alkanoyloxy, insbesondere C_1-18-Alkanoyloxy, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, insbesondere C_1-18-Alkoxycarbonyl, Alkylaminocarbonyl, insbesondere C_1-18-Alkylaminocarbonyl, Alkylsulfanylcarbonyl, insbesondere C_1-18-Alkylsulfanylcarbonyl, Hydroxy, Hydroxyalkyl, insbesondere Hydroxy-C_1-18-alkyl, Amino, Alkylamino, insbesondere (C_1-18-Alkyl)NH oder Di-(C_1-18-Alkyl)N, Aryl, insbesondere C_6-10-Aryl, Arylalkyl, insbesondere C_6-10-Aryl-C_1-12-alkyl, Aryloxy, insbesondere C_6-10-Aryloxy, Arylamino, insbesondere C_6-10-Arylamino, Arylsulfanyl, insbesondere C_6-10-Arylsulfanyl, Arylsulfinyl, insbesondere C_6-10-Arylsulfinyl, Arylsulfonyl, insbesondere C_6-10-Arylsulfonyl, Arylcarbonyl, insbesondere C_6-10-Arylcarbonyl, Arylcarbonyloxy, insbesondere C_6-10-Arylcarbonyloxy, Aryloxycarbonyl, insbesondere C_6-10-Aryloxycarbonyl, Arylaminocarbonyl, insbesondere C_6-10-Arylaminocarbonyl, Arylsulfanylcarbonyl, insbesondere C_6-10-Arylsulfanylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl, insbesondere Heteroaryl-C_1-12-alkyl, Heteroaryloxy, Heteroarylamino, Heteroarylsulfanyl, Heteroarylsulfonyl, Heteroarylsulfoxidyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroarylcarbonyloxy, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroarylaminocarbonyl, Heteroarylsulfanylcarbonyl, Alkoxysulfonyl, insbesondere C_1-18-Alkoxysulfonyl, Alkoxycarbinol, insbesondere C_7-12-Alkoxycarbinol, Sulfo, Sulfino, Sulfeno, Formyl oder Thioformyl stehen, wobei alle Reste des sich so ergebenden Moleküls, insbesondere die aliphatischen und aromatischen Reste jeweils unabhängig voneinander gegebenenfalls auch ein- oder mehrfach, insbesondere ein-, zwei- oder dreifach, vorzugsweise einfach, substituiert sein können, insbesondere durch Substituenten ausgewählt aus den zuvor genannten Resten sowie ausgewählt aus Halogen, insbesondere Chlor, Brom, Iod oder Fluor, und Nitro.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stehen X für Wasserstoff und Y, R¹ und R² unabhängig voneinander für Trifluormethyl, Alkyl, insbesondere C_1-22-Alkyl, vorzugsweise C_1-18-Alkyl, Cycloalkyl, insbesondere C_3-8-Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, insbesondere C_3-8-Cycloalkyl-C_1-12-alkyl, Alkenyl, insbesondere C_2-18-Alkenyl, Alkinyl, insbesondere C_2-18-Alkinyl, Heteroalkyl, Heterocycloalkyl, Alkanoyl, insbesondere C_1-18-Alkanoyl, Hydroxycarbonyl, Alkoxycarbonyl, insbesondere C_1-18-Alkoxycarbonyl, Alkylaminocarbonyl, insbesondere C_1-18-Alkylaminocarbonyl, Alkylsulfanylcarbonyl, insbesondere C_1-18-Alkylsulfanylcarbonyl, Aryl, insbesondere C_6-10-Aryl, Arylalkyl, insbesondere C_6-10-Aryl-C_1-12-alkyl, Arylcarbonyl, insbesondere C_6-10-Arylcarbonyl, Aryloxycarbonyl, insbesondere C_6-10-Aryloxycarbonyl, Arylaminocarbonyl, insbesondere C_6-10-Arylaminocarbonyl, Arylsulfanylcarbonyl, insbesondere C_6-10-Arylsulfanylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl, insbesondere Heteroaryl-C_1-12-alkyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroarylaminocarbonyl, Heteroarylsulfanylcarbonyl oder Formyl, wobei vorzugsweise auch Y für Wasserstoff steht, und wobei alle Reste des sich so ergebenden Moleküls, insbesondere die aliphatischen und aromatischen Reste jeweils unabhängig voneinander gegebenenfalls auch ein- oder mehrfach, insbesondere ein-, zwei- oder dreifach, vorzugsweise einfach, substituiert sein können, insbesondere durch Substituenten ausgewählt aus den zuvor genannten Resten sowie ausgewählt aus Halogen, insbesondere Chlor, Brom, Iod oder Fluor, Hydroxy, Hydroxyalkyl, insbesondere Hydroxy-C_1-18-alkyl, Hydroxycarbonyl, Hydroxycarbonylalkyl, insbesondere Hydroxycarbonyl-C_1-18-alkyl, Alkoxy, insbesondere C_1-18-Alkoxy, Alkoxyalkyl, insbesondere C_1-18-Alkoxy-C_1-18-alkyl, Alkoxycarbonyl, insbesondere C_1-18-Alkoxycarbonyl, Alkoxycarbonylalkyl, insbesondere C_1-18-Alkoxy-carbonyl-C_1-18-alkyl, Amino, Alkylamino, insbesondere (C_1-18-Alkyl)NH oder Di-(C_1-18-Alkyl)N, Alkanoyloxy, insbesondere C_1-18-Alkanoyloxy, Alkylsulfonyl, insbesondere C_1-18-Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, insbesondere C_6-10-Arylsulfonyl, Nitro oder Sulfo.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform stehen X und Y unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl, vorzugsweise für Wasserstoff, und R¹ und R² unabhängig voneinander für Alkyl, insbesondere C_1-18-Alkyl, Aryl, insbesondere Phenyl, oder Arylalkyl, insbesondere Phenyl-C_1-6-alkyl, wobei die genannten Reste gegebenenfalls auch ein- oder mehrfach substituiert sein können, insbesondere durch Reste ausgewählt aus Alkyl, insbesondere C_1-18-Alkyl, Halogen, insbesondere Chlor, Brom oder Fluor, Hydroxy, Hydroxyalkyl, insbesondere Hydroxy-C_1-18-alkyl, Hydroxycarbonyl, Hydroxycarbonylalkyl, insbesondere Hydroxycarbonyl-C_1-18-alkyl, Alkoxy, insbesondere C_1-18-Alkoxy, Alkoxyalkyl, insbesondere C_1-18-Alkoxy-C_1-18-alkyl, Alkoxycarbonyl, insbesondere C_1-18-Alkoxycarbonyl, Alkoxycarbonylalkyl, insbesondere C_1-18-Alkoxy-carbonyl-C_1-18-alkyl, Amino, Alkylamino, insbesondere (C_1-18-Alkyl)NH oder Di-(C_1-18-Alkyl)N, Alkanoyloxy, insbesondere C_1-18-Alkanoyloxy, Alkylsulfonyl, insbesondere C_1-18-Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, insbesondere C_6-10-Arylsulfonyl, Nitro oder Sulfo.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform stehen X und Y für Wasserstoff, R¹ für einen gegebenenfalls substituierten Rest ausgewählt aus Alkyl, insbesondere C_1-18-Alkyl, Aryl, insbesondere Phenyl, und Arylalkyl, insbesondere Phenyl-C_1-6-alkyl, und R² für durch mindestens eine Hydroxy-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-Gruppe, Hydroxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxycarbonyl-Gruppe oder C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe sowie gegebenenfalls durch weitere Reste substituiertes Alkyl, insbesondere C_1-18-Alkyl, Aryl, insbesondere Phenyl, oder Arylalkyl, insbesondere Phenyl-C_1-6-alkyl, wobei die Substituenten bzw. weiteren Reste vorzugsweise ausgewählt sind aus C_1-6-Alkyl, insbesondere Methyl, Halogen, insbesondere Chlor, Brom oder Fluor, sowie weiteren Hydroxy-, C_1-6-Alkoxy-, Hydroxy-C_1-6-alkyl-, C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl-, Hydroxycarbonyl-, Hydroxycarbonyl-C_1-6-alkyl, C_1-6-Alkoxycarbonyl- oder C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppen.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform stehen X und Y für Wasserstoff, R¹ für gegebenenfalls substituiertes Phenyl und R² für durch mindestens eine Hydroxy-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-Gruppe, Hydroxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxycarbonyl-Gruppe oder C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe sowie gegebenenfalls durch weitere Reste substituiertes Phenyl, wobei die Substituenten bzw. weiteren Substituenten vorzugsweise ausgewählt sind aus C_1-6-Alkyl, insbesondere Methyl, Halogen, insbesondere Chlor, Brom oder Fluor, sowie weiteren Hydroxy-, C_1-6-Alkoxy-, Hydroxy-C_1-6-alkyl-, C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl-, Hydroxycarbonyl-, Hydroxycarbonyl-C_1-6-alkyl, C_1-6-Alkoxycarbonyl- oder C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppen.
In dieser ganz besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Harnstoff-Derivat um einen Sulfonylharnstoff gemäß Formel (I) oder (II)
oder um einen Sulfonylthioharnstoff gemäß Formel (III) oder (IV)
oder um Mischungen davon,
mit jeweils R = Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl und wobei die Alkyl- und Arylgruppen der zuvor genannten Verbindungen der Formeln (I), (II), (III) und (IV) jeweils gegebenenfalls weitere Substituenten, insbesondere ausgewählt aus den bereits zuvor genannten, vor allem ausgewählt aus C_1-6-Alkyl, insbesondere Methyl, Halogen, insbesondere Chlor, Brom oder Fluor, sowie weiteren Hydroxy-, C_1-6-Alkoxy-, Hydroxy-C_1-6-alkyl-, C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl-, Hydroxycarbonyl-, Hydroxycarbonyl-C_1-6-alkyl, C_1-6-Alkoxycarbonyl- oder C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppen tragen können.
C_1-18-Alkyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, wobei C_1-6-Alkyl-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkyl steht erfindungsgemäß für alle gesättigten linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, insbesondere für Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, t-Butyl sowie alle Isomere des Pentyl und des Hexyl.
C_3-8-Cycloalkyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle cyclischen Alkyl-Reste mit 3 bis 8 C-Atomen, vorzugsweise mit 5 bis 6 C-Atomen, wobei die Reste gesättigt oder ungesättigt sein können, insbesondere für Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cyclopentadienyl.
C_2-18-Alkenyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die mindestens eine Doppelbindung enthalten, wobei C_2-6-Alkenyl-Reste bevorzugt sind. C_2-6-Alkenyl steht erfindungsgemäß für alle linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die mindestens eine Doppelbindung enthalten, insbesondere für Ethenyl, Propenyl, i-Propenyl sowie alle Isomere des Butenyl, Pentenyl und Hexenyl.
C_2-18-Alkinyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle linearen und unverzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die mindestens eine Dreifachbindung enthalten, wobei C_2-6-Alkinyl-Reste bevorzugt sind. C_2-6-Alkinyl steht erfindungsgemäß für alle linearen und unverzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die mindestens eine Dreifachbindung enthalten, insbesondere für Ethinyl, Propinyl, i-Propinyl sowie alle Isomere des Butinyl, Pentinyl und Hexinyl.
Heteroalkyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ein- oder mehrfach ungesättigten, linearen oder verzweigten Alkyl-Reste, die mindestens ein, bevorzugt genau ein Heteroatom, insbesondere ausgewählt aus O, S und N, enthalten, wobei die Summe aus C- und Hetero-Atomen bevorzugt bis zu 18, besonders bevorzugt bis zu 6, beträgt.
Heterocycloalkyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle cyclischen Alkyl-Reste, die mindestens ein, bevorzugt genau ein, Heteroatom, insbesondere ausgewählt aus O, S oder N, enthalten, wobei der Ring vorzugsweise drei- bis achtgliederig, besonders bevorzugt fünf- bis sechsgliedrig ist. Beispiele hierfür sind Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothiophenyl, Pyrrolidinyl, 2-Thiazolinyl, Tetrahydrothiazolyl, Tetrahydrooxazolyl, Piperidinyl, Piperazinyl, Morpholinyl und Thiomorpholinyl.
C_1-18-Alkoxy steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die über ein Sauerstoff-Atom gebunden sind, wobei C_1-6-Alkoxy-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkoxy steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über ein Sauerstoff-Atom gebunden sind, insbesondere für Methoxy und Ethoxy.
C_1-18-Alkylsulfanyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die über ein Schwefel-Atom gebunden sind, wobei C_1-6-Alkylsulfanyl-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkylsulfanyl steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über ein Schwefel-Atom gebunden sind, insbesondere für Methysulfanyl und Ethylsulfanyl.
C_1-18-Alkylsulfinyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die über eine SO-Gruppe gebunden sind, wobei C_1-6-Alkylsulfonyl-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkylsulfinyl steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über eine SO-Gruppe gebunden sind, insbesondere für Methylsulfinyl und Ethylsulfinyl.
C_1-18-Alkylsulfonyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die über eine SO₂-Gruppe gebunden sind, wobei C_1-6-Alkylsulfoxidyl-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkylsulfonyl steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über eine SO₂-Gruppe gebunden sind, insbesondere für Methylsulfonyl und Ethylsulfonyl.
C_1-18-Alkanoyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die über eine Carbonyl-Gruppe gebunden sind, wobei C_1-6-Alkanoyl-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkanoyl steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über eine Carbonyl-Gruppe gebunden sind, insbesondere für Methycarbonyl und Ethylcarbonyl.
C_1-18-Alkanoyloxy steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die über eine Carbonyloxy-Gruppe gebunden sind, wobei C_1-6-Alkanoyloxy-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkanoyloxy steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über eine Carbonyloxy-Gruppe gebunden sind, insbesondere für Methanoyloxy, Ethanoyloxy, n-Propanoyloxy und i-Propanoyloxy.
C_1-18-Alkoxycarbonyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die über eine Oxycarbonyl-Gruppe gebunden sind, wobei C_1-6-Alkoxycarbonyl-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkoxycarbonyl steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über eine Oxycarbonyl-Gruppe gebunden sind, insbesondere für Methoxycarbonyl und Ethoxycarbonyl.
C_1-18-Alkylaminocarbonyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für eine Aminocarbonyl-Gruppe, die ein- oder zweifach durch einen gesättigten oder ungesättigten, linearen oder verzweigten Alkyl-Rest mit bis zu 18 C-Atomen substituiert ist, wobei ein- oder zweifach durch C_1-6-Alkyl-Gruppen substituierte Aminocarbonyl-Reste, insbesondere Monomethylaminocarbonyl, Diemethylaminocarbonyl, Monoethylaminocarbonyl und Diethylaminocarbonyl, bevorzugt sind.
C_1-18-Alkylsulfanylcarbonyl steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 18 C-Atomen, die über eine Thiocarbonyl-Gruppe gebunden sind, wobei C_1-6-Alkylsulfanylcarbonyl-Reste bevorzugt sind. C_1-6-Alkylsulfanylcarbonyl steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über eine Thiocarbonyl-Gruppe gebunden sind, insbesondere für Methylthiocarbonyl und Ethylthiocarbonyl.
(C_1-18-Alkyl)NH steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkylreste mit bis zu 18 C-Atomen, die über eine Hydrogenamino-Gruppe gebunden sind, wobei (C_1-6-Alkyl)NH bevorzugt ist. (C_1-6-Alkyl)NH steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkyl-Reste mit bis zu 6 C-Atomen, die über eine Hydrogenamino-Gruppe gebunden sind, insbesondere für CH₃NH und C₂H₅NH.
Di-(C_1-18-Alkyl)N steht erfindungsgemäß jeweils unabhängig voneinander für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkylreste mit bis zu 18 C-Atomen, die über eine (C_1-18-Alkyl)amino-Gruppe gebunden sind, wobei Di-(C_1-6-Alkyl)N bevorzugt ist. Die beiden Alkyl-Reste können hierbei gleich oder unterschiedlich voneinander sein. Di-(C_1-6-Alkyl)N steht erfindungsgemäß für alle gesättigten und ungesättigten, linearen und verzweigten Alkylreste mit bis zu 6 C-Atomen, die über eine (C_1-6-Alkyl)amino-Gruppe gebunden sind, insbesondere für (CH₃)₂N und (C₂H₅)₂N.
C_6-10-Aryl steht erfindungsgemäß, insbesondere auch in C_6-10-Aryl-C_1-12-alkyl, C_6-10-Aryloxy, C_6-10-Arylamino, C_6-10-Arylsulfanyl, C_6-10-Arylsulfonyl, C_6-10-Arylsulfoxidyl, C_6-10-Arylcarbonyl, C_6-10-Arylcarbonyloxy, C_6-10-Aryloxycarbonyl, C_6-10-Arylaminocarbonyl und C_6-10-Arylsulfanylcarbonyl, vorzugsweise für Phenyl oder Naphthyl, besonders bevorzugt für Phenyl.
Heteroaryl steht erfindungsgemäß, insbesondere auch in Heteroaryl-C_1-12-alkyl, Heteroaryloxy, Heteroarylamino, Heteroarylsulfanyl, Heteroarylsulfonyl, Heteroarylsulfoxidyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroarylcarbonyloxy, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroarylaminocarbonyl und Heteroarylsulfanylcarbonyl, sofern nicht anders angegeben, für einen mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus O, S und N enthaltenden aromatischen Rest mit 5 bis 10, vorzugsweise 5 oder 6, Ringgliedern, vorzugsweise ausgewählt aus Furanyl, Thienyl, Thiophenyl, Pyrrolyl, Isopyrrolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Triazinyl, Benzofuranyl, Benzothiophenyl, Indolyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Benzimidazolyl, Indazolyl, Pyridofuranyl und Pyridothienyl.
In C_6-10-Aryl-C_1-12-alkyl und Heteroarylalkyl kann der Alkyl-Rest gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein. Bevorzugte Reste sind Benzyl, Phenylethyl, Naphthylmethyl und Naphthylethyl.
Erfindungsgemäß einzusetzende Harnstoff-Derivate sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in einer Menge von bis zu 20 Gew.-%, besonders bevorzugt in Mengen von 0,001 bis 10 Gew.-%, insbesondere von 0,01 bis 5 Gew.-%, vor allem von 0,1 bis 2 Gew.-% enthalten.
Unter einem Wasch- oder Reinigungsmittel sind erfindungsgemäß alle Mittel zu verstehen, die sich zum Waschen oder Reinigen von insbesondere Textilien und/oder festen Oberflächen eignen. Hierfür geeignete Inhaltsstoffe werden weiter unten detailliert ausgeführt.
Unter einer Protease sind erfindungsgemäß alle Enzyme zu verstehen, die in der Lage sind, Säureamidverknüpfungen von Proteinen zu hydrolysieren. Auch die Proteasen werden weiter unten detailliert ausgeführt.
Ohne an diese Theorie gebunden sein wollen, wird erfindungsgemäß davon ausgegangen, daß die erfindungsrelevanten Verbindungen mit der erfindungsgemäß zu inhibierenden/stabilisierenden Protease einen Komplex ausbilden. Dieser sieht wahrscheinlich so aus, daß sich die erfindungsrelevante Verbindung in die Substratbindungstasche der Protease einlagert und dort nicht-kovalent gebunden wird. Auf diese Weise wird das aktive Zentrum der Protease durch eine nicht durch dieses Enzym hydrolysierbare Verbindung blockiert und steht nicht für eine Hydrolyse anderer zugegener Proteine zur Verfügung. Hierbei handelt es sich um eine reversible Bindung, d. h. um ein Gleichgewicht zwischen Assoziation und Dissoziation. Der Gleichgewichtskoeffizient dieser Reaktion wird als Inhibitionskonstante oder K_i bezeichnet.
Der erste Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik besteht neben ihrem gegenüber den Polyolen geringeren Volumenbedarf darin, daß sie günstige Inhibitionskonstanten bezüglich der in Wasch- und Reinigungsmitteln einsetzbaren Proteasen aufweisen. Dies gilt beispielsweise für Serin-Proteasen, aber auch für Metalloproteasen. Die Inhibitoren binden somit reversibel, d. h. sie gehen nicht zu feste und nicht zu lose vorübergehende Wechselwirkungen mit dem Enzym ein. Vorteilhafterweise liegt damit während der Lagerung der Großteil der erfindungsrelevanten Protease in Form eines Protease-Inhibitor-Komplexes vor. Die Protease und ggf. weitere enthaltene Proteine, insbesondere weitere Enzyme werden auf diese Weise gegenüber einer Proteolyse durch dieses Enzym geschützt (gegen Proteolyse stabilisiert). Andererseits wird im Augenblick der Verdünnung des erfindungsgemäßen Mittels mit Wasser zur Herstellung einer wäßrigen Wasch- bzw. Reinigungsflotte während des Reinigungsvorgangs das Bindungsgleichgewicht in Richtung Dissoziation verschoben, so daß sich der Komplex auflöst und der Großteil der erfindungsrelevanten Protease proteolytisch aktiv wird. Es handelt sich bei den erfindungsrelevanten Verbindungen also gemäß der formulierten Aufgabe um funktionierende Protease-Inhibitoren und somit Enzym-Stabilisatoren für Wasch- und Reinigungsmittel.
Der zweite Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, daß sie als Elemente lediglich C, H, N und O und gegebenenfalls Halogenide und/oder Schwefel aufweisen und insbesondere frei von Bor sind. Sie bilden somit nicht die unerwünschten, auf Bor zurückzuführenden Nebenprodukte mit anderen Wasch- oder Reinigungsmittelinhaltsstoffen.
Ferner verfügen sie insbesondere aufgrund der in jedem aromatischen Ring enthaltenen Carboxylgruppen über eine gute Wasserlöslichkeit, so daß sie in entsprechende Mittel einfach eingearbeitet werden können und ein Ausfällen während der Lagerung vermieden wird.
Grundsätzlich wirken die genannten Verbindungen vermutlich deshalb als reversible Inhibitoren, weil sie ähnlich dem Substrat der Proteasen, strukturell an die Bedingungen der Bindungstasche angepasst sind. Umgekehrt lassen sich also grundsätzlich alle Proteasen durch die erfindungsrelevanten Verbindungen inhibieren, so diese erfindungsgemäß als Protease-Inhibitoren geeignet sind. Dies gilt insbesondere für Serin-Proteasen, wie anhand der Beispiele zur vorliegenden Anmeldung mit der positiven Wirkung der dort experimentell beschriebenen Verbindungen anhand von Serin-Proteasen, konkret Subtilasen, noch spezieller Subtilisinen gezeigt worden ist, und zwar anhand einer Variante des Subtilisins aus Bacillus lentus DSM 5483.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen:

– die Verwendung einer oben beschriebenen Verbindung als reversibler Inhibitor und/oder Stabilisator einer Protease, im Rahmen einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur;
– Wasch- oder Reinigungsverfahren, in dem eine Protease zur Wirkung kommt, die mit einer oben beschriebenen Verbindung inhibiert und/oder stabilisiert ist;
– die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels zum Waschen und/oder Reinigen von Textilien und/oder harten Oberflächen; sowie
– die Verwendung einer Protease und einer oben beschriebenen Verbindung zur Herstellung eines Wasch- oder Reinigungsmittels.

Erfindungsgemäß sind solche Wasch- oder Reinigungsmittel bevorzugt, in denen die stabilisierende Verbindung bezüglich der enthaltenen Protease eine Inhibitionskonstante (Ki) von 0,01 bis 10 mM, vorzugsweise 0,1 bis 5, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 aufweist.
Die Inhibitionskonstante K_i kann auf folgende Weise ermittelt werden:
Für die Charakterisierung eines reversiblen Inhibitors der enzymatischen Aktivität, ist die Inhibitionskonstante K_i eine charakteristische und entscheidende Größe. K_i beschreibt das Gleichgewicht zwischen Enzym, Inhibitor und Enzym-Inhibitor Komplex für eine reversible Bindung. Der Enzym-Inhibitor Komplex ist dabei katalytisch nicht aktiv und inhibiert die Reaktion durch Herabsetzung der Konzentration von freiem Enzym, das noch zur Bindung von Substrat zur Verfügung steht. Der Ki ist dementsprechend definiert als: Ki = [I] × [E]/[EI]
Darin bedeuten [E], [I] und [EI] die jeweiligen molaren Gleichgewichtskonzentrationen von Enzym (E), Inhibitor (I) und dem Enzym-Inhibitor-Komplex (EI). Dieser Definition entsprechend ist eine Substanz mit einem kleinen Ki unter den jeweiligen Testbedingungen ein guter Inhibitor.
Die Bestimmung des K_i erfolgt auf der Grundlage des Aktivitätstests der Protease in Anwesenheit des entsprechenden Inhibitors. Über die etablierte Michaelis-Menten-Kinetik werden die enzymatischen Parameter K_m, und k_cat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors bestimmt. Durch die Bestimmung der Anfangshydrolyse-Rate (v_Anf.) bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] und Einpassung der experimentellen Daten in Gleichung 1 erhält man K_i. vAnf. = kcat × [S] × E0/(Km × (1 + [I]/Ki) + S) Gleichung 1
Hierin steht [I] wiederum für die Inhibitor-Konzentration.
Alternativ kann K_i unter Verwendung der Cheng-Prusoff-Gleichung (Gleichung 2) über den IC₅₀-Wert bestimmt werden. Die Bestimmung des IC₅₀-Werts erfolgt über die Bestimmung der proteolytischen Aktivität an einem Substrat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors und Anpassung der experimentellen Daten an eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Gleichung mit variabler Steigung (Pseudo-Hill-Steigungen). Es handelt sich dabei um den Wert der Hälfte der Inhibitor-Konzentration, die nötig wäre, um eine vollständige Inhibition zu erzielen.
K_i ergibt sich damit aus folgender Gleichung 2: Ki = IC50/(1 + [S]/Kd) Gleichung 2
Darin bedeuten [S] die Substratkonzentration im Test und K_d die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante für das Substrat, die bei IC₅₀ als identisch zu Km für das Substrat gesetzt werden kann.
Die auf diese Weise bestimmbaren K_i-Werte kennzeichnen die untersuchte Verbindung in bezug auf die im Versuch eingesetzte Protease. In Beispiel 2 wurde dies für die Bacillus lentus-Alkalische Protease F49 (gemäß WO 95/23221 A1 ) durchgeführt. Da es sich dabei um eine typische Subtilisin-Protease handelt, sind die mit diesem Enzym erhaltenen Werte auch für andere Serin-Proteasen, insbesondere andere Subtilisin-Proteasen typisch. Der exakte Wert für eine interessierende Protease muß im Zweifel anhand der jeweils konkreten Protease ermittelt werden.
In erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln, die in einer bevorzugten Ausführung in überwiegend fester Form vorliegen und in einer zweiten Ausführung in überwiegend flüssiger, pastöser oder Gelform vorliegen, ist die Protease insbesondere in einem Gehalt von 2 μg bis 20 mg pro g des Mittels, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 μg des Mittels enthalten.
Der Stabilisator ist in erfindungsgemäßen Mitteln insbesondere in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt bis zu 5 mg pro g des Mittels enthalten. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Stabilisator in einem Gehalt von 0,01 bis 100 × K_i (bezogen auf die enthaltene Protease), vorzugsweise 0,1 bis 10 × K_i besonders bevorzugt 1 bis 5 × K_i enthalten ist.
Vorzugsweise liegt das molare Verhältnis von Stabilisator zur Protease im Bereich von 1:1 bis 1.000:1, insbesondere von 1:1 bis 500:1, besonders bevorzugt von 1:1 bis 100:1, ganz besonders bevorzugt von 1:1 bis 20:1.
Neben dem Stabilisator gemäß der oben angegebenen allgemeinen Formel kann ein erfindungsgemäßes Mittel mindestens einen weiteren Stabilisator, insbesondere ein Polyol, wie Glycerin oder 1,2-Ethylenglycol, und/oder ein Antioxidans, enthalten.
Bei der erfindungsgemäß stabilisierten beziehungsweise reversibel inhibierten Protease handelt es sich vorzugsweise um eine Serin-Protease, insbesondere um eine Subtilase, besonders bevorzugt um ein Subtilisin. Subtilisin kann dabei ein Wildtypenzym oder eine Subtilisin-Variante sein, wobei das Wildtypenzym bzw. das Ausgangsenzym der Variante vorzugsweise aus einer der folgenden ausgewählt ist:

– Die Alkalische Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN'),
– Die Alkalische Protease aus Bacillus licheniformis (Subtilisin Carlsberg),
– Die Alkalische Protease PB92,
– Subtilisin 147 und/oder 309 (Savinase)
– Die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise aus Bacillus lentus (DSM 5483),
– Die Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233),
– die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease,
– die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) oder eine hierzu mindestens zu 98,5% identische Alkalische Protease,
– die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) oder eine hierzu mindestens zu 98,1% identische Alkalische Protease,
– die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease,
– die in SEQ ID NO. 4 der Anmeldung WO 2005/063974 A1 beschriebene Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 40% identische Alkalische Protease,
– die in SEQ ID NO. 4 der Anmeldung WO 2005/103244 A1 beschriebene Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 80% identische Alkalische Protease,
– die in SEQ ID NO. 7 der Anmeldung WO 2005/103244 A1 beschriebene Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 80% identische Alkalische Protease und
– die in SEQ ID NO. 2 der Anmeldung DE 10 2005 028 295.4 beschriebene Protease oder eine hierzu mindestens zu 66% identische Protease.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Punktmutation in dem Bereich der Positonen 95 bis 103 (Zählung gemäß Subtilisin 309) handelt, vorzugsweise mit einer Insertion einer einzelnen Aminosäure zwischen Position 99 und 100, besonders bevorzugt ausgehend von Subtilisin 147 und/oder 309 (Subtilisin 309), bzw. einer Variante davon. Insbesondere handelt es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Punktmutation in Positon 217 (Zählung gemäß der Wildtyp-Protease aus Bacillus amyloliquefaciens; BPN') handelt, vorzugsweise mit einer Substitution einer einzelnen Aminosäure in dieser Position, besonders bevorzugt mit der Aminosäuresubstitution X217L, ganz besonders bevorzugt ausgehend von der Wildtyp-Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), bzw. einer Variante davon. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Aminosäureänderung gegenüber einer mit der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus homologisierbaren Ausgangs-Protease in einer oder mehreren der folgenden Positionen: 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268, in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise mit einer Aminosäureänderung gegenüber dem Ausgangsmolekül in einer oder mehreren der folgenden Positionen: 3, 4, 43, 61, 188, 193, 199, 211, 224, 250 und 253, besonders bevorzugt mit einem oder mehreren der Aminosäureaustausche X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X199I, X211D, X211E, X211G, X211N oder X211Q, X224V, X250G und X253N, ganz besonders bevorzugt ausgehend von der Alkalische Protease aus Bacillus lentus DSM 5483, bzw. einer Variante davon.
Erfindungsgemäße Mittel können neben der Protease ein oder mehrere weitere Enzyme enthalten, insbesondere aus folgender Gruppe: eine oder mehrere weitere Proteasen, Amylasen, Hemicellulasen, Cellulasen, Lipasen und Oxidoreduktasen. Bei der Amylase handelt es sich vorzugsweise um eine α-Amylase. Bei der Hemicellulase handelt es sich vorzugsweise um eine β-Glucanase, eine Pektinase, eine Pullulanase und/oder eine Mannanase. Bei der Cellulase handelt es sich vorzugsweise um ein Cellulase-Gemisch oder eine Einkomponentencellulase, vorzugsweise bzw. überwiegend um eine Endoglucanase und/oder eine Cellobiohydrolase. Bei der Oxidoreduktase handelt es sich vorzugsweise um eine Oxidase, insbesondere eine Cholin-Oxidase, oder um eine Perhydrolase.
Erfindungsgemäße Mittel enthalten vorzugsweise mindestens einen Komplexbildner und/oder Buildersubstanzen, wobei es sich bei dem Builder insbesondere um einen Zeolith-Builder handelt, und/oder ein nichtionisches Tensid, wobei es sich bei dem nichtionischen Tensid vorzugsweise um einen Hydroxymischether handelt, und/oder optischen Aufheller, wobei es sich bei dem optischen Aufheller um Diphenylverbindungen, insbesondere um Distyryl-Biphenylderivate, und/oder um Stilbentriazin-Derivate handelt.
Beispiele
Beispiel 1: Synthese erfindungsgemäßer Harnstoff-Derivate
Allgemeine Synthesevorschrift zur Darstellung von Sulfonylharnstoffen AA1: Reaktionsschema, beispielhaft für aromatische Sulfonylharnstoffe:
4 g (20.28 mmol) Tosylisocyanat oder Tosylthioisocyanat werden in 40 mL wasserfreiem Dioxan gelöst und mit 60.84 mmol (3 Äquivalente) Amin bei Raumtemperatur versetzt. Die Mischung wird unter Rückfluss für 3 h erhitzt, abgekühlt und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wird mit 60 mL 2 N HCl versetzt und mit 100 mL Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wird mit 60 mL 2 N HCl gewaschen, die Phasen werden getrennt und die organische mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Einengen am Rotationsverdampfer werden die Produkte säulenchromatographischen an Silicagel (Laufmittel: Essigsäureethylester) gereinigt.
Verseifung des Methylesters AA2:
50 mmol des Methylesters wird in 50 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 5 ml 2 N NaOH versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf T = 70–80°C für ein 1 h. Nach beendeter Reaktion wird mit sauren Ionentauscher neutralisiert, dieser mit viel Methanol gewaschen und einrotiert. Umkristallisation des Rohprodukts in Essigsäuremethylester/Methanol 10:1 liefert die freie Säure a) Synthese von 2-[({[(4-methylphenyl)sulfonyl]amino}carbonyl)amino]benzoic acid (2)
Methyl 2-[({[(4-methylphenyl)sulfonyl]amino}carbonyl)amino]benzoate 1 wird nach AA1 dargestellt.
DC (Toluol/Ethylacetat 3:1): R_f = 0.17-0.23
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, TMS): δ = 8.30 (d, 1H, H-2), 8.03 (d, 1H, H-5), 7.95 (d, 2H, H-8), 7.50 (t, 1H, H-4), 7.30 (d, 2H, H-9), 7.10 (t, 1H, H-3), 4.00 (s, 3H, H-1), 2.42 (s, 3H, H-10).
b) Verseifung von Sulfonylharnstoff 1 zur freien Säure 2.
Sulfonylharnstoff 2 wird nach AA2 hergestellt.
DC (Toluol/Ethylacetat 3:1): R_f = 0
¹H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 10.35 (br. S, 1H, COOH), 8.39 (d, 1H, Ar-H), 7.86 (d, 1H, Ar-H), 7.70 (d, 2H, Ar-H), 7.36 (t, 1H, Ar-H), 7.22 (d, 2H, Ar-H), 6.83 (t, 1H, Ar-H), 2.33 (s, 3H, Ar-CH₃).
c) Synthese von 4-{[({[2-(hydroxymethyl)phenyl]amino}carbonyl)-4-methylbenzenesulfonamide (3)
Sulfonylharnstoff 3 wird nach AA1 dargestellt.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 11.30 (br. S, 1H, NH), 8.48 (s, 1H, NH), 7.85 (d, 2H, Ar-H), 7.63 (d, 1H, Ar-H), 7.44 (d, 2H, Ar-H), 7.26 (d, 1H, Ar-H), 7.18 (t, 1H, Ar-H), 7.04 (t, 1H, Ar-H), 5.39 (s, 1H, OH), 4.43 (s, 2H, CH₂), 2.39 (s, 3H, CH₃).
d) Synthese von 4-{[({[2-(hydroxyethyl)phenyl]amino}carbonyl)-4-methylbenzenesulfonamide (4)
Sulfonylharnstoff 4 wird nach AA1 dargestellt.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 11.28 (br. S, 1H, NH), 8.44 (s, 1H, NH), 7.81 (d, 2H, Ar-H), 7.58 (d, 1H, Ar-H), 7.40 (d, 2H, Ar-H), 7.20 (d, 1H, Ar-H), 7.14 (t, 1H, Ar-H), 7.00 (t, 1H, Ar-H), 5.33 (s, 1H, OH), 4.38 (s, 2H, CH₂), 2.35 (s, 3H, CH₃).
e) Synthese von {2-[({[(4-methylphenyl)sulfonyl]amino}carbonyl)amino]phenyl}acetic acid (5)
f) Synthese von Dimethyl 4-[({[(4-methylphenyl)sulfonyl]amino}carbonyl)amino]isophthalate (6):
Sulfonylharnstoff 6 wird nach AA1 dargestellt. g) Verseifung von Sulfonylharnstoff (6) zur freien Säure (7):
Sulfonylharnstoff 7 wird nach AA2 hergestellt. h) Synthese von Methyl 4-[({[(4-methylphenyl)sulfonyl]amino}carbonyl)amino]benzoate (8)
Sulfonylharnstoff 8 wird nach AA1 hergestellt i) Verseifung von Sulfonylharnstoff (9) zur freien Säure (9):
Sulfonylharnstoff 9 wird nach AA2 hergestellt. j) Synthese Methyl [({[(4-methylphenyl)sulfonyl]amino}carbonyl)amino]acetate (10)
Sulfonylharnstoff 10 wird nach AA1 hergestellt. k) Verseifung von Sulfonylharnstoff 10 zur freien Säure 11:
Sulfonylharnstoff 11 wird nach AA2 hergestellt.
Beispiel 2: Untersuchung der Protease-Restaktivität in Gegenwart eines Inhibitors
Zum Nachweis, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen eine die Protease-Aktivität inhibierende Wirkung ausüben, wird die proteolytische Restaktivität der Bacillus lentus-Alkalische Protease F49 (gemäß WO 95/23221 A1 ) in Anwesenheit dieser Verbindungen ermittelt.
In parallelen Reaktionsansätzen werden in 100 mM Tris-Puffer, pH 6,8, 0,1% (w/v) BrijTM35 das Substrat Succinyl Alanin-Alanin-Prolin-Phenylalanin-para-Nitroanilid (AAPFpNA; Bachem L-1400) und 5 × 10^–9 bzw. 1 × 10^–8 M der Protease vorgelegt. Hinzu kommen die zu testenden Verbindungen in einer Endkonzentration von 10 mM. Sie werden jeweils in wasserfreiem DMSO gelöst, wobei Effekte von DMSO auf die enzymatische Aktivität über die entsprechende Referenz mit derselben Menge DMSO, aber ohne die betreffende Verbindung korrigiert werden. Die Inkubation erfolgte für 5 min bei pH 8,6 und 25°C. Dabei entspricht 1 U 1 μmol gespaltenem Substrat pro Minute.
Mit Verbindung (a)
mit R = H wurde hierbei bei einer Einsatzkonzentration von 10 mM die proteolytische Aktivität der Protease auf eine Restaktivität von 58% reduziert.
Mit Verbindung (b)
mit R = H wurde bei einer Einsatzkonzentration von 10 mM die proteolytische Aktivität der Protease auf eine Restaktivität von 58% reduziert und mit Verbindung (c)
mit R = Methyl wurde bei einer Einsatzkonzentration von 10 mM die proteolytische Aktivität der Protease auf eine Restaktivität von 36% reduziert.
Beispiel 3: Untersuchung der Lagerstabilität proteasehaltiger Wasch- und Reinigungsmittel in Gegenwart von Protease-Inhibitoren
Als Basisrezeptur wird ein Flüssigwaschmittel mit folgender Zusammensetzung angesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3–0,5% Xanthan Gum, 0,2–0,4% Anti-Schaummittel, 6–7% Glycerin, 0,3–0,5% Ethanol, 4–7% FAEOS, 24–28% Nichtionische Tenside, 1% Borsäure, 1–2% Natriumcitrat (Dihydrat), 2–4% Soda, 14–16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP, 0–0,4% PVP, 0–0,05% optischer Aufheller, 0–0,001% Farbstoff, Rest: demineralisiertes Wasser.
Diese Rezeptur wird mit den zu testenden, inhibierenden Verbindungen und 1.275.000 HPE/l B. lentus-Alkalische Protease F49 versetzt. Die in HPE angegebene Protease-Aktivität (Henkel-Protease-Einheiten) wird nach van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffentlichung „Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), Band 7, S. 125–132, bestimmt.
Die Lagerung erfolgt über verschieden lange Zeiträume in luftdicht verschlossenen Gefäßen bei 30°C.
Zur Auswertung werden die Anfangswerte für die proteolytische Aktivität des betreffenden Mittels mit den nach der Lagerung bestimmten Werten verglichen. Je höher die nach der Lagerung verbleibende Aktivität ist, desto besser ist die enthaltene Protease während der Lagerung inaktiviert und desto besser eignet sich die betreffende Verbindung als erfindungsgemäßer Stabilisator.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 97/18287 [0006]
- WO 92/19707 A1 [0010]
- EP 478050 A1 [0010]
- EP 511456 A1 [0010]
- WO 95/02046 A1 [0010]
- WO 95/29223 A1 [0010]
- WO 96/21716 A1 [0011, 0011]
- WO 96/41859 A1 [0011, 0011]
- WO 93/11215 A1 [0012]
- EP 451924 A2 [0012]
- WO 95/23221 A1 [0062, 0083]
- WO 2005/063974 A1 [0067]
- WO 2005/103244 A1 [0067, 0067]
- DE 102005028295 [0067]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- „Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75–95 in „Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996 [0008]
- „Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), Band 7, S. 125–132 [0088]

Claims

Wasch- oder Reinigungsmittel, enthaltend eine Protease und als Enzymstabilisator mindestens ein Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivat.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens ein Stickstoff-Atom der Harnstoff- oder Thioharnstoff-Gruppe mindestens eine Verbindung mit negativem mesomeren Effekt gebunden ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivat ausgewählt ist aus Sulfonylharnstoffen, Acylharnstoffen, Sulfonylthioharnstoffen und Acylthioharnstoffen.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfonylharnstoffe, Acylharnstoffe, Sulfonylthioharnstoffe und Acylthioharnstoffe ausgewählt sind aus Verbindungen der allgemeinen Formeln R¹-SO₂-NX-C(O)-NY-R², R¹-C(O)-NX-C(O)-NY-R², R¹-SO₂-NX-C(S)-NY-R² und R¹-C(O)-NX-C(S)-NY-R², jeweils dadurch gekennzeichnet, dass X, Y, R¹ und R² unabhängig voneinander für Trifluormethyl, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Heteroalkyl, Heterocycloalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkylsulfanyl, Alkylsulfinyl, Alkylsulfonyl, Alkanoyl, Alkanoyloxy, Alkoxycarbonyl, Alkylaminocarbonyl, Alkylsulfanylcarbonyl, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Amino, Alkylamino, Aryl, Arylalkyl, Aryloxy, Arylamino, Arylsulfanyl, Arylsulfinyl, Arylsulfonyl, Arylcarbonyl, Arylcarbonyloxy, Aryloxycarbonyl, Arylaminocarbonyl, Arylsulfanylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl, Heteroaryloxy, Heteroarylamino, Heteroarylsulfanyl, Heteroarylsulfonyl, Heteroarylsulfoxidyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroarylcarbonyloxy, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroarylaminocarbonyl, Heteroarylsulfanylcarbonyl, Alkoxysulfonyl, Alkoxycarbinol, Sulfo, Sulfino, Sulfeno, Formyl oder Thioformyl stehen, wobei alle Reste des sich so ergebenden Moleküls jeweils unabhängig voneinander gegebenenfalls auch ein- oder mehrfach substituiert sein können.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass X für Wasserstoff und Y, R¹ und R² unabhängig voneinander für Trifluormethyl, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Heteroalkyl, Heterocycloalkyl, Alkanoyl, Alkoxycarbonyl, Alkylaminocarbonyl, Alkylsulfanylcarbonyl, Aryl, Arylalkyl, Arylcarbonyl, Aryloxycarbonyl, Arylaminocarbonyl, Arylsulfanylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl, Heteroarylcarbonyl, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroarylaminocarbonyl, Heteroarylsulfanylcarbonyl oder Formyl stehen, wobei alle Reste des sich so ergebenden Moleküls auch ein- oder mehrfach substituiert sein können.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass X und Y unabhängig voneinander für Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl und R¹ und R² unabhängig voneinander für Alkyl, Aryl oder Arylalkyl stehen, wobei die genannten Reste gegebenenfalls auch ein- oder mehrfach substituiert sein können.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass X und Y für Wasserstoff stehen.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten ausgewählt sind aus Alkyl, Halogen, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Hydroxycarbonyl, Hydroxycarbonylalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxycarbonyl, Alkoxycarbonylalkyl, Amino, Alkylamino, Alkanoyloxy, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Nitro und Sulfo.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass X und Y für Wasserstoff, R¹ für gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Arylalkyl und R² für durch mindestens eine Hydroxy-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-Gruppe, Hydroxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxycarbonyl-Gruppe oder C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe sowie gegebenenfalls durch weitere Reste substituiertes Alkyl, Aryl oder Arylalkyl steht.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass X und Y für Wasserstoff, R¹ für gegebenenfalls substituiertes Phenyl oder Phenyl-C_1-6-alkyl und R² für durch mindestens eine Hydroxy-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-Gruppe, Hydroxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxycarbonyl-Gruppe oder C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe sowie gegebenenfalls durch weitere Reste substituiertes C_1-12-Alkyl, Phenyl oder Phenyl-C_1-6-alkyl steht.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ und R² für gegebenenfalls substituiertes Phenyl stehen.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass X und Y für Wasserstoff, R¹ für gegebenenfalls substituiertes Phenyl und R² für durch mindestens eine Hydroxy-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-Gruppe, Hydroxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-Gruppe, Hydroxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe, C_1-6-Alkoxycarbonyl-Gruppe oder C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-6-alkyl-Gruppe sowie gegebenenfalls durch weitere Reste substituiertes Phenyl steht.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Harnstoff-Derivat um einen Sulfonylharnstoff gemäß Formel (I) oder (II)
oder um einen Sulfonylthioharnstoff gemäß Formel (III) oder (IV)
oder um Mischungen davon handelt, mit jeweils R = Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl und wobei die genannten Verbindungen gegebenenfalls auch weitere Substituenten tragen können.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die stabilisierende Verbindung bezüglich der enthaltenen Protease eine Inhibitionskonstante (K_i) von 0,01 bis 10 mM, vorzugsweise 0,1 bis 5, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 aufweist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es in überwiegend fester Form vorliegt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es in überwiegend flüssiger oder pastöser Form oder überwiegend in Gelform vorliegt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Protease in einem Gehalt von 2 μg bis 20 mg pro g des Mittels, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 μg des Mittels enthalten ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Stabilisator in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt bis zu 5 mg pro g des Mittels enthalten ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das molare Verhältnis von Stabilisator zur Protease im Bereich von 1:1 bis 1.000:1, insbesondere von 1:1 bis 500:1, besonders bevorzugt von 1:1 bis 100:1, ganz besonders bevorzugt von 1:1 bis 20:1 liegt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei der Stabilisator in einem Gehalt von 0,01 bis 100 × K_i (bezogen auf die enthaltene Protease), vorzugsweise 0,1 bis 10 × K_i besonders bevorzugt 1 bis 5 × K_i enthalten ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei es sich bei der Protease um eine Serin-Protease, vorzugsweise um eine Subtilase, besonders bevorzugt um ein Subtilisin handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem Subtilisin um ein Wildtypenzym oder um eine Subtilisin-Variante handelt, wobei das Wildtypenzym bzw. das Ausgangsenzym der Variante aus einer der folgenden ausgewählt ist: – Die Alkalische Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), – Die Alkalische Protease aus Bacillus licheniformis (Subtilisin Carlsberg), – Die Alkalische Protease PB92, – Subtilisin 147 und/oder 309 (Savinase) – Die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise aus Bacillus lentus (DSM 5483), – Die Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233), – die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease, – die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) oder eine hierzu mindestens zu 98,5% identische Alkalische Protease, – die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) oder eine hierzu mindestens zu 98,1% identische Alkalische Protease, – die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease, – die in SEQ ID NO. 4 der Anmeldung WO 2005/063974 A1 beschriebene Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 40% identische Alkalische Protease, – die in SEQ ID NO. 4 der Anmeldung WO 2005/103244 A1 beschriebene Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 80% identische Alkalische Protease, – die in SEQ ID NO. 7 der Anmeldung WO 2005/103244 A1 beschriebene Alkalische Protease oder eine hierzu mindestens zu 80% identische Alkalische Protease und – die in SEQ ID NO. 2 der Anmeldung DE 10 2005 028 295.4 beschriebene Protease oder eine hierzu mindestens zu 66% identische Protease.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei es sich bei der Protease um eine Variante handelt, die zu der Ausgangsprotease auf Aminosäureebene über die Gesamtlänge der Variante eine Sequenzidentität von mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 92,5%, besonders bevorzugt mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97,5% aufweist, unabhängig davon, ob sie von dieser selbst oder von einem anderen Enzym abgeleitet worden ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Punktmutation in dem Bereich der Positonen 95 bis 103 (Zählung gemäß Subtilisin 309) handelt, vorzugsweise mit einer Insertion einer einzelnen Aminosäure zwischen Position 99 und 100, besonders bevorzugt ausgehend von Subtilisin 147 und/oder 309 (Subtilisin 309), bzw. einer Variante davon.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Punktmutation in Positon 217 (Zählung gemäß der Wildtyp-Protease aus Bacillus amyloliquefaciens; BPN') handelt, vorzugsweise mit einer Substitution einer einzelnen Aminosäure in dieser Position, besonders bevorzugt mit der Aminosäuresubstitution X217L, ganz besonders bevorzugt ausgehend von der Wildtyp-Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN'), bzw. einer Variante davon.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Aminosäureänderung gegenüber einer mit der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus homologisierbaren Ausgangs-Protease in einer oder mehreren der folgenden Positionen handelt: 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268, in der Zählung der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise mit einer Aminosäureänderung gegenüber dem Ausgangsmolekül in einer oder mehreren der folgenden Positionen: 3, 4, 43, 61, 188, 193, 199, 211, 224, 250 und 253, besonders bevorzugt mit einem oder mehreren der Aminosäureaustausche X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X199I, X211D, X211E, X211G, X211N oder X211Q, X224V, X250G und X253N, ganz besonders bevorzugt ausgehend von der Alkalische Protease aus Bacillus lentus DSM 5483, bzw. einer Variante davon.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 26, enthaltend mindestens einen weiteren Stabilisator.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem mindestens einen weiteren Stabilisator um ein Polyol, insbesondere Glycerin oder 1,2-Ethylenglycol, und/oder um ein Antioxidans handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 28, enthaltend ein oder mehrere weitere Enzyme ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Amylasen, Hemicellulasen, Cellulasen, Lipasen und Oxidoreduktasen.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 29, wobei es sich bei der Amylase um eine α-Amylase handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 29 oder 30, wobei es sich bei der Hemicellulase um eine β-Glucanase, eine Pektinase, eine Pullulanase und/oder eine Mannanase handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 29 bis 31, wobei es sich bei der Cellulase um ein Cellulase-Gemisch oder eine Einkomponentencellulase, vorzugsweise bzw. überwiegend um eine Endoglucanase und/oder eine Cellobiohydrolase handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei es sich bei der Oxidoreduktase um eine Oxidase, insbesondere eine Cholin-Oxidase, oder um eine Perhydrolase handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 33, enthaltend mindestens einen Komplexbildner und/oder Buildersubstanzen.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 34, wobei es sich bei dem Builder um einen Zeolith-Builder handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 35, enthaltend ein nichtionisches Tensid.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 36, wobei es sich bei dem nichtionischen Tensid um einen Hydroxymischether handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 37, enthaltend optischen Aufheller.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem optischen Aufheller um Diphenylverbindungen, insbesondere um Distyryl-Biphenylderivate, und/oder um Stilbentriazin-Derivate handelt.
Verwendung eines Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivats als reversiblen Inhibitor einer Protease im Rahmen einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur.
Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivat um einen Sulfonylharnstoff, Acylharnstoff, Solfonylthioharnstoff oder Acylthioharnstoff handelt.
Verwendung nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass dass es sich bei dem Harnstoff-Derivat um einen Sulfonylharnstoff gemäß Formel (I) oder (II)
oder um einen Sulfonylthioharnstoff gemäß Formel (III) oder (IV)
oder um Mischungen davon handelt, mit jeweils R = Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl und wobei die genannten Verbindungen gegebenenfalls auch weitere Substituenten tragen können.
Wasch- oder Reinigungsverfahren, in dem eine Protease zur Wirkung kommt, die mit einem Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivat inhibiert und/oder stabilisiert worden ist.
Wasch- oder Reinigungsverfahren nach Anspruch 43, wobei ein Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 40 zum Einsatz kommt.
Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 39 zum Waschen und/oder Reinigen von Textilien und/oder harten Oberflächen.
Verwendung einer Protease und eines Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivats zur Herstellung eines Wasch- oder Reinigungsmittels.
Verwendung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Harnstoff- oder Thioharnstoff-Derivat um einen Sulfonylharnstoff, Acylharnstoff, Solfonylthioharnstoff oder Acylthioharnstoff handelt.
Verwendung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass dass es sich bei dem Harnstoff-Derivat um einen Sulfonylharnstoff gemäß Formel (I) oder (II)
oder um einen Sulfonylthioharnstoff gemäß Formel (III) oder (IV)
oder um Mischungen davon handelt, mit jeweils R = Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl und wobei die genannten Verbindungen gegebenenfalls auch weitere Substituenten tragen können.
Sulfonylharnstoffe gemäß Formel (I)
und Sulfonylthioharnstoffe gemäß Formel (III)
oder Mischungen davon, mit jeweils R = Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl, wobei die genannten Verbindungen gegebenenfalls auch weitere Substituenten tragen können.
Sulfonylharnstoffe gemäß Formel (II)
und Sulfonylthioharnstoffe gemäß Formel (IV)
oder Mischungen davon, mit jeweils R = C_1-6-Alkyl, wobei die genannten Verbindungen gegebenenfalls auch weitere Substituenten tragen können.